ES2633894T3 - Procedimiento para producir moléculas monoméricas y multiméricas y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la producción de un polipéptido que es biológicamente activo como 2-mérico o 3-mérico y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada que comprende las siguientes etapas a) cultivar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de acuerdo con la fórmula II (fórmula II) en la que B designa un polipéptido que es biológicamente activo como 2-mérico o 3-mérico y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada, FC1 denota un primer polipéptido de la región Fc de la cadena pesada, FC2 indica un segundo polipéptido de la región Fc de la cadena pesada, CS denota un sitio de escisión e I denota una secuencia de aminoácidos intercalada, en la que n >= 1 y m >= 0, o n >= 0 y m >= 1, en la que si n >= 1 entonces o >= 0 o 1, y si o >= 0 entonces p >= 0 o 1, y si o >= 1 entonces p >= 0 y s >= 0 o 1 y q >= 0 y t >= 0 y r >= 0, en la que si m >= 1 entonces q >= 0 o 1, y si q >= 0 entonces r >= 0 o 1, y si q >= 1 entonces r >= 0 y t >= 0 o 1 y o >= 0 y s >= 0, y p >= 0, en la que FC1 y FC2 están unidos covalentemente por uno o más enlaces disulfuro (:), en la que FC1 y FC2 no se unen sustancialmente a un receptor Fc, b) recuperar el polipéptido de fusión de la célula o del medio de cultivo, c) escindir el polipéptido de fusión con una proteasa, y producir de este modo un polipéptido que es biológicamente activo como 2-mérico o 3-mérico y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada.

Description

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definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada.
En un aspecto el procedimiento como se informa en el presente documento es para la producción de un polipéptido que es biológicamente activo como 3-mérico (trímero) y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada y comprende las siguientes etapas
a) cultivar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de acuerdo con la fórmula II
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en la que
B designa un polipéptido que es biológicamente activo como 3-mérico y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada, 15 FC1 denota un primer polipéptido de la región Fc de la cadena pesada,
FC2 indica un segundo polipéptido de la región Fc de la cadena pesada,
20 CS denota un sitio de escisión e
I denota una secuencia de aminoácidos intercalada,
en laquen =1 y m =0, on =0 y m = 1,
25 en la que si n =1 entonces o= 0 o 1, y si o =0 entonces p= 0 o 1, y si o =1 entonces p= 0 y s =0 o 1 y q =0 y t =0 y r = 0,
en la que si m = 1 entonces q= 0 o 1, y si q= 0 entonces r =0 o 1, y si q =1 entonces r=0 y t =0 o 1 y o =0 y s = 0, y 30 p=0,
en la que FC1 y FC2 están unidos covalentemente por uno o más enlaces disulfuro (:),
en la que FC1 y FC2 no se unen sustancialmente a un receptor Fc, 35 b) recuperar el polipéptido de fusión de la célula o del medio de cultivo,
c) opcionalmente escindir el polipéptido de fusión con una proteasa,
40 y producir de este modo un polipéptido que es biológicamente activo como 3-mérico y forma agregados/multímeros no definidos tras la expresión en ausencia de una región Fc fusionada.
En un modo de realización la secuencia de aminoácidos intercalada se selecciona de un primer grupo que comprende (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, (G5S)4, y cualquier combinación de los mismos, o
45 de un segundo grupo que comprende Arg-tag, Avi-tag, His-Avi-tag, His-tag, Flag-tag, 3xFlag-tag, Strep-tag, Nano-tag, SBP-tag, c-myc-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a la quitina, marcado GST o marcado MBP, o de las combinaciones de dos elementos de estos grupos.
En un modo de realización el sitio de escisión se selecciona entre el sitio de escisión de la proteasa de la proteasa de
50 IgA, el sitio de escisión de la proteasa grancima B, el sitio de escisión de la proteasa Tev, el sitio de escisión de la proteasa PreScission, el sitio de escisión de la trombina, el sitio de la proteasa del factor 10a, el sitio de escisión de la proteasa Ides, el sitio de escisión de la enterocinasa o un sitio de escisión de la proteasa SUMO (U1p1 (proteasa 1 específica de Ubl) de Saccharomyces cerevisiae).
55 En un modo de realización el polipéptido de fusión no comprende un sitio de escisión de la proteasa adicional, sino un sitio de escisión de la proteasa inherente, tal como, por ejemplo, un sitio de escisión de la papaína, un sitio de escisión de la pepsina o un sitio de escisión de la proteasa Ides.
En un modo de realización se ha suprimido el residuo de lisina C-terminal en la(s) región(ones) FC. Esto reduce la 60 cantidad de productos secundarios de la escisión de la proteasa (eliminación del sitio de escisión de la proteasa artificial).
Un aspecto como se informa en el presente documento es el uso de un polipéptido de fusión inmovilizado como se informa en el presente documento o de un polipéptido 2-mérico o 3-mérico como se informa en el presente documento 65 como ligando en cromatografía de afinidad.
7
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Tabla: Rendimiento de fermentación y purificación de diferentes polipéptidos de fusión que comprenden FcgammaRIIIa VI58.
polipéptido de fusión
peso molecular [kDa] rendimiento después de la captura [mg/l sobrenadante] Contenido monómero (SEC) [%] de Rendimiento después de SEC [mg/l sobrenadante] Rendimiento después de la escisión y posterior purificación [mg/l sobrenadante]
FcgammaRII IaV158-HisAvi (201)
25,4 3,5 70 1,4 -
FcgammaRII IaV158Avi-Fc LALA P329G (0,51)
39 14 70 3 (no activo)
FcgammaRII IaV158Avi-Fc LALA P329G (0,51)
49 80 95 78 21 (sin Avi-tag)
FcgammaRII IaV158Avi-PP-Fc LALA P329G (0,51)
50 24 50 no determinado no determinado
FcgammaRII IaV158Avi-IgAP-Fc LALA P329G (9,21)
50 46 90 36 16 (con Avi-tag)
5
Ejemplo 7
Preparación de columna de afinidad con FcgammaRIIIaV158
10 Se preparó una columna de afinidad con FcgammaRIIIaV158 mediante biotinilación in vitro del marcador Avi-tag y posterior acoplamiento a Streptavidin sepharose. Esto se puede hacer con el polipéptido de fusión intacto así como con el receptor después de haberse escindido de la región Fc. Es un procedimiento muy rápido y eficiente para preparar una columna de afinidad para propósitos analíticos y preparativos.
15 Biotinilación del receptor
Un dominio extracelular soluble de FcgammaRIIIaV158 con marcador Avi-Tag expresado en células HEK293 se biotiniló después de la purificación de acuerdo con el siguiente protocolo: entre 1,2 y 12 mg de FcgammaRIIIaV158 o entre 2,4 y 24 mg de polipéptido de fusión región Fc-FcgammaRIIIaV158 marcado en MOPS 2 mM, NaCl 125 mM pH 7,2, Tween al
20 0,02 % y 1 comprimido. El inhibidor de proteasa completo (Roche) en 3 ml de PBS se biotiniló usando el kit de biotinilación de Avidity de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de biotinilación se realizó a temperatura ambiente durante la noche. El polipéptido modificado se dializó frente a tampón de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,5 a 4 °C durante la noche para eliminar el exceso de biotina.
25 Acoplamiento a Streptavidin sepharose
Se añadió 1 g de Streptavidin sepharose (GE Healthcare) al receptor biotinilado y dializado, se incubó durante 2 horas mientras se agitaba y finalmente se llenó en una columna XK de 1 ml (GE Healthcare).
30 Ejemplo 8 Procedimientos de cromatografía que usan un receptor Fc obtenido por expresión de un polipéptido de fusión que contiene un receptor Fc
35 Condiciones generales:
Tampón de equilibrado A: Ácido cítrico 20 mM/NaCl 150 mM pH 6,0 Tampón de elución B: Ácido cítrico 20 mM/NaCl 150 mM pH 3,0 Elución: 5 min 100 % de A
40 en 60 min hasta 100 % de B,
0.1 min100%deB,
0.2 6min100%deA
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Claims (1)

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