ES2634015T3

ES2634015T3 - Compuestos brasinoesteroides antiangiogénicos

Info

Publication number: ES2634015T3
Application number: ES12819024.6T
Authority: ES
Inventors: Javier Alberto RAMIREZ; Flavia Mariana MICHELINI; Lydia Raquel GALAGOVSKY; Alejandro Berra; Laura Edith ALCHE
Original assignee: Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CONICET; Inis Biotech LLC
Current assignee: Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CONICET; Inis Biotech LLC
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: EP2790707A1; US9187518B2; WO2013088400A1; EP2790707B1; US20150094288A1

Abstract

Composición que comprende brasinoesteroides de la fórmula general (I) **(Ver fórmula)** en la que **(Ver simbolo)** puede ser un enlace sencillo o doble y las configuraciones de los átomos de carbono C22 y C23 unidos respectivamente a los sustituyentes HO son S para ambos átomos de carbono y un aditivo farmacéuticamente aceptable para su utilización en el tratamiento de un tumor sólido en un mamífero inhibiendo la angiogénesis, en la que el tumor se selecciona de entre el grupo que consiste en carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma de próstata, carcinoma de colon, carcinoma de ovario, neuroblastoma, tumor del sistema nervioso central, glioblastoma multiforme y melanoma.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Anteriormente se ha informado de que los derivados estigmastano polifuncionalizados tienen actividad antivírica contra varios virus patógenos in vitro y, en particular, previenen la multiplicación de HSV-1 y la propagación vírica en líneas de células tanto corneales como conjuntivales humanas, sin citotoxicidad. Uno de estos compuestos, (22S, 23S)-3β-bromo-las 5α,22,23-trihidroxiestigmastan-6-ona, designado también como el Compuesto 6b en la publicación de Wachsman et al. (Curr. Med. Chem., Anti-Infective Agents, Antiviral Activity of Natural and Synthetic Brassinosteroids, 2004, Vol. 3, Núm. 2), disminuye de manera significativa la incidencia de HSK en el modelo murino de la infección corneal por HSV-1, probablemente debido a un efecto inmunomodulador, ya que no ejercen una actividad anti-HSV-1 in vivo.

El Compuesto 6b presenta la siguiente fórmula estructural:

imagen6

Compuesto 6b

Además, este derivado de estigmastano dificulta la producción de TNF-α en macrófagos estimulados con LPS in vitro y modula la secreción de IL-6 y TNF-α en las células epiteliales humanas derivadas de los tejidos oculares. Con el fin de mejorar la actividad inmunomoduladora de este tipo de moléculas, se diseñaron análogos de estigmastano, pero manteniendo la cadena lateral de (22S,23S)-22,23-dihidroxilada de la estructura esteroidea y proporciona anillos A y B, con características estructurales similares a las del fármaco antiinflamatorio comercial Dexametasona (DEX). Se descubrió que uno de estos análogos de estigmastano sintetizados, (22S,23S)-22,23dihidroxiestigmast-4-en-3-ona, designado como el Compuesto 1, también evita la multiplicación y propagación vírica de HSV-1 en células conjuntivales y de la córnea humana, sin citotoxicidad, con índices de selectividad (SI) de 13,2 y 9,3, respectivamente.

Se ha observado que este estigmastano disminuye de manera significativa la incidencia y la gravedad de HSK en el modelo murino de infección corneal por HSV-1, no sólo en la presencia de virus de replicación como lo hace el estigmastano 6b (o el Compuesto 6b), sino también cuando la replicación vírica ya había provocado la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, el Compuesto 1 resultó ser interesante como un futuro fármaco para el tratamiento de HSK dado que su potencial de curación también se debería a un efecto inmunomodulador. Por el contrario, el Compuesto 1 no se comportaría como un fármaco antiinflamatorio esteroideo convencional, como DEX, ya que contiene de manera significativa los signos de queratitis cuando se administra durante los primeros 3 días después de la infección por HSV-1, mientras que DEX exacerba el daño ocular.

En un intento por explicar la mejora de HSK murino mencionado anteriormente, se evaluó el papel del Compuesto 1 tanto como un modulador de la respuesta inmunitaria a la infección vírica y a un estímulo no vírico, y como un fármaco antiangiogénico in vitro.

2. Materiales y métodos

2.1. Células, virus y soluciones de tratamiento

Se cultivó la estirpe celular humana IOBA-NHC en un medio modificado de Dulbecco y una mezcla de nutrientes F12 (DMEM/F12, 1:1), suplementado con 10% de FBS inactivado (DMEM/F12, 10%), y se mantuvo en DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS inactivado (DMEM/F12, 2%).

Las células epiteliales de la córnea-limbo humanas (HCLE) fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Ilene

K. Gipson y el Dr. Pablo Argüeso (The Schepens Eye Research Institute, Harvard Medical School, Boston, USA) y se cultivaron en un medio libre de suero de queratinocitos GIBCO, suplementado con 25 µg/ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), 0,2 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 0,4 mM de CaCl2, y se mantuvieron en DMEM/F12 con bajo calcio.

La estirpe celular de macrófagos murinos J774A.1 fue proporcionada amablemente por el Dr. Osvaldo Zabal (INTA, Castelar, Buenos Aires) y se cultivó en un medio de RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS inactivado

7

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

5

15

25

35

45

55

65

NF-κB (figura 3E). El análisis semicuantitativo de las imágenes mostró una fluorescencia nuclear basal de 33,6 ± 8,7% en los macrófagos no estimulados. Un porcentaje de 79,4 ± 1,2 de las células estimuladas con LPS exhibió un valor de fluorescencia nuclear por encima de la basal, lo que significaba positivo para la translocación de NFκB al núcleo. La activación de NF-κB se evidenció en 87,9 ± 0,2% de los macrófagos inducidos con LPS y tratados con el Compuesto 1.

De manera inesperada, el tratamiento con DEX no tuvo éxito en la prevención de la translocación de NF-κB, dado que el 100% de las células mostró fluorescencia p65 en el núcleo, a diferencia de los resultados descritos por Lavagno et al. (2004) (figura 3F).

Sin embargo, es notable que el p65 localizado en los núcleos, incluso cuando las células estimuladas con LPS fueron tratadas ya sea con el Compuesto 1 o DEX, mostró una reducción en la secreción de ambos mediadores de IL-6 y TNF-α (figura 3G).

3. La expresión de genes en las células epiteliales e inflamatorias resulta afectada por el Compuesto 1

Dado que el compuesto 1 demostró comportarse como un inmunomodulador in vitro de manera independiente de los estímulos utilizados (víricos o no víricos), se investigó si estos hallazgos se correlacionaban con una expresión génica de células alteradas. Para este propósito, células epiteliales infectadas e inflamatorias se procesaron para obtener muestras de ARN. Las células HCLE infectadas por HSV-1 (m.o.i. = 1) y células J774A.1 estimuladas con LPS (100 ng/ml) se trataron o no con 40 µM del Compuesto 1. Para extraer el ARN total, se recolectaron las células con Trizol a las 6 h p.i. y a las 6 h posinducción de LPS. Se obtuvieron ocho réplicas de HSV-1 en las células infectadas y estimuladas con LPS (cuatro de 'control' cada una) y otras ocho, a partir de células infectadas y estimuladas con LPS tratadas con el Compuesto 1 (cuatro 'tratadas' cada uno).

De acuerdo con el análisis de Ontología de Genes llevado a cabo por el programa de Gene Spring, se llegó a la conclusión de que el Compuesto 1 provocó la activación o inhibición de procesos inflamatorios o procesos relacionados con la respuesta inmunitaria innata, evidenciada por los genes expresados de manera diferencial a partir de células epiteliales infectadas por HSV-1 y células inflamatorias estimuladas con LPS. La Tabla 1 ilustra los genes que se encontraron más relevantes para el análisis.

Los resultados mostraron que el Compuesto 1 indujo la sobreexpresión de IL-1α, IL-8 y CXCL-2 en células HCLE infectadas por HSV-1, en comparación con controles infectados y no tratados (Tabla 1).

La infección corneal por HSV-1 induce la secreción de IL-1α. IL-1α, a su vez, induce la producción de CXCL-2 en las células residentes de la córnea. Otras quimiocinas tales como IL-8 (CXCL-8) son secretadas por las células de la córnea después de la infección por HSV-1. Tanto CXCL-2 como IL-8 son potentes quimioatrayentes para PMN. Las PMN son las células inflamatorias predominantes en el infiltrado de la córnea los primeros días después de la infección por HSV-1, y están involucradas en la eliminación del virus infeccioso del ojo. Por lo tanto, el Compuesto 1 favorecería la secreción de citocinas y quimiocinas que estimulan el reclutamiento de PMN después de la infección por HSV-1.

Se ha observado además la sobreexpresión del factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF-2) en células HCLE infectadas tratadas con el Compuesto 1, con respecto a los controles infectados no tratados (Tabla 1). CSF-2 es uno de los reguladores clave de la función efectora tanto de neutrófilos maduros como de macrófagos. Retrasa la apoptosis de estas células e induce la liberación de enzimas proteolíticas y radicales libres de oxígeno en ellos.

Por lo tanto, el efecto proinflamatorio del Compuesto 1 observado in vitro provocaría la respuesta inmunitaria innata responsable de la eliminación del virus in vivo.

Por otro lado, hubo una sobreexpresión de los genes para IL-12, IL-23 y CXCL10, en macrófagos estimulados con LPS tratados con el Compuesto 1, en comparación con macrófagos estimulados no tratados (Tabla 1). Se ha demostrado que la IL-12 inhibe de manera directa la angiogénesis o lo hace de manera indirecta, a través de la inducción de IFN-α, que, a su vez, activa CXCL10, con una actividad antiangiogénica muy conocida. IL-12 e IL23 tienen una de sus subunidades en común, IL-12, p40 o IL-12b. IL-23 utiliza muchos de los mismos componentes de transducción de señales que IL-12. Esto puede explicar las acciones similares de IL-12 e IL-23 en la promoción de la inmunidad celular y las respuestas proliferativas en las células diana. En las células estimuladas con LPS tratadas con el Compuesto 1, la expresión tanto de IL-10 como de Socs2 también aumentó en comparación con el control no tratado (Tabla 1). La proteína Socs2 es un mediador antiinflamatorio que bloquea las vías de NF-κB y JAK-STAT, para inhibir de este modo la liberación de citocinas proinflamatorias tales como TNF-α, IL-6 e IL-8. IL-10 por sí misma exhibe propiedades antiinflamatorias, y uno de sus efectos es la inducción de la expresión de proteínas Socs2.

Además, tanto ATF3 como TLR4 se sobreexpresan en las células J774A.1 estimuladas con LPS y tratadas con el Compuesto 1 (Tabla 1). ATF3 muestra un papel antiinflamatorio. Este factor se activa a través de TLR4 y a

12

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

un carcinoma de colon, un carcinoma de ovario, un neuroblastoma, un tumor del sistema nervioso central, un glioblastoma multiforme y un melanoma comprende (a) brasinoesteroides de la fórmula general (I)

imagen15

en la que

imagen16puede ser un enlace sencillo o doble y las configuraciones de los átomos de carbono C22 y C23, respectivamente unidos a los sustituyentes HO son S para ambos átomos de carbono, y un aditivo farmacéuticamente aceptable, que es un componente del aditivo farmacéuticamente aceptable seleccionado de un vehículo, un aglutinante, un estabilizador, un adyuvante, un diluyente, un excipiente, un tensioactivo, un odorante, o un colorante.

Otra forma de realización de la invención es una formulación para su utilización en el tratamiento de un tumor sólido seleccionado de entre el grupo que consiste en un carcinoma de mama, un carcinoma de pulmón, un carcinoma de próstata, un carcinoma de colon, un carcinoma de ovario, un neuroblastoma, un tumor del sistema nervioso central, un glioblastoma multiforme y un melanoma que comprende (22S,23S)-22,23-dihidroxiestigmast4-en-3-ona (Compuesto 1) y un aditivo farmacéuticamente aceptable, el aditivo farmacéuticamente aceptable puede ser un componente seleccionado de un vehículo, un aglutinante, un estabilizador, un adyuvante, un diluyente, un excipiente, un tensioactivo, un odorante, o un colorante. Otra forma de realización de la invención es una formulación para su utilización en el tratamiento de un tumor sólido seleccionado de entre el grupo que consiste en un carcinoma de mama, un carcinoma de pulmón, un carcinoma de próstata, un carcinoma de colon, un carcinoma de ovario, un neuroblastoma, un tumor del sistema nervioso central, un glioblastoma multiforme y un melanoma comprende (22S,23S)-22,23-dihidroxiestigmasta-1,4-dien-3-ona (Compuesto 2), y un aditivo, el aditivo es un componente seleccionado del entre un vehículo, un aglutinante, un estabilizador, un adyuvante, un diluyente, un excipiente, un tensioactivo, un odorante, o un colorante. Una formulación de acuerdo con la invención puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo seleccionado de agentes antivírico antifúngico, antibacteriano, antiséptico, antiinflamatorio, inmunomodulador, antineoplásico, antiangiogénico y analgésico.

En dicha formulación, el agente antiangiogénico se selecciona de entre el grupo que consiste en vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, 5 FU, cisplatino, carboplatino, irinotecán, topotecán y ciclofosfamida.

La composición de acuerdo con la invención, que comprende brasinoesteroides de la fórmula general (I) como componente activo, en una forma de realización preferida, para su utilización a través de administración oral, por ejemplo, como comprimidos o pastillas o cápsulas, en suspensiones o emulsiones, o en soluciones, en polvos o gránulos, o en jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a la utilización oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente aceptables. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos por medio de técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción. Una composición que comprende un brasinoesteroide de la fórmula general (I) se puede utilizar como un aditivo alimentario. Una baja toxicidad de brasinoesteroides permite utilizar dosis terapéuticas con una seguridad suficientemente alta. Por ejemplo, las dosis orales diarias, para un sujeto adulto, pueden comprender de aproximadamente 10 ug a aproximadamente 1000 mg de brasinoesteroide de la fórmula general (I).

En una composición de acuerdo con la invención, los brasinoesteroides de la fórmula general (I), pueden estar destinados a su utilización a través de la administración oral o parenteral. Por ejemplo, una composición que comprende brasinoesteroides de la fórmula general (I) se puede administrar por vía intramuscular, intraperitoneal, o intravenosa. En una forma de realización, la formulación activa puede ser para su utilización a través de la inserción en el cuerpo de un sujeto en necesidad del tratamiento por inyección subcutánea. En otra forma de realización, la formulación activa puede ser para su utilización a través de un depósito o un implante

17

imagen17

significativa la angiogénesis tumoral en ratones BALB/c.

Bibliografía

5 Davel LE, Rimmaudo L, Español A, de la Torre E, Jasnis MA, Ribeiro ML, Gotoh T, de Lustig ES, Sales ME. Different mechanisms lead to the angiogenic process induced by three adenocarcinoma cell lines. Angiogenesis.

2004; 7(1):45 a 51.

Bueno CA, Lombardi MG, Sales ME, Alché LE. A natural antiviral and immunomodulatory compound with 10 antiangiogenic properties. Microvasc. Res. 2012 Nov.; 84(3):235 a 241.

Conclusión final

Además de su capacidad de modular la respuesta inmunitaria a los estímulos víricos y no víricos, el Compuesto

15 1 se comporta como un fármaco antiangiogénico. In vitro, se demostró que disminuye la expresión de VEGF cuando es inducido por dos estímulos diferentes, LPS e IL-6, e impidió de manera significativa no sólo la formación similar a tubos en las células endoteliales, sino también la migración de estas células, dos eventos importantes que se producen durante la angiogénesis (ver las figuras 4 y 5). In vivo, el Compuesto 1 también reduce de manera significativa la angiogénesis tumoral en ratones BALB/c.

20 El efecto antiangiogénico descrito coloca al Compuesto 1 en ventaja sobre otros compuestos de la misma familia de análogos sintéticos, dado que algunos de ellos, con actividades antivíricas e inmunomoduladoras in vitro, no presentan una actividad antiangiogénica en el ensayo de formación de tubo en células HUVEC. Por lo tanto, la actividad antiangiogénica del Compuesto 1 mostrada in vitro e in vivo no es una consecuencia de sus

25 propiedades inmunomoduladoras. La actividad antiangiogénica nueva del Compuesto 1 estaría asociada con la falta de la neovascularización en la córnea de los ratones durante la enfermedad ocular inducida por HSV-1.

En resumen, el estigmastano sintético diseñado como el Compuesto 1 sería un compuesto prometedor no sólo para curar una inmunopatología de origen vírico como HSK, sino también para mejorar otras enfermedades en

30 las que la angiogénesis es el factor patogénico principal como, es decir, para inhibir la angiogénesis en un mamífero que presenta un tumor sólido seleccionado de entre el grupo que consiste en un carcinoma de mama, un carcinoma de pulmón, un carcinoma de próstata, un carcinoma de colon, un carcinoma de ovario, un neuroblastoma, un tumor del sistema nervioso central, un glioblastoma multiforme y un melanoma.

35

19

Claims

imagen1