ES2634232T3 - Uso de inhibidores de biosíntesis de melanina a partir de ginseng para el blanqueo de la piel - Google Patents

Abstract

Uso no terapéutico de ginsenósido F1 (20-O-b-D-glucopiranosil-20(s)-protopanaxatriol), para el blanqueo de la piel.

Description

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DESCRIPCION

Uso de inhibidores de biosfntesis de melanina a partir de ginseng para el blanqueo de la piel Campo tecnico

La presente invencion se refiere al uso de ginsenosido F1 obtenido a partir de un extracto de ginseng usando un acido, una base, una enzima o un microorganismo que produce la enzima, para el blanqueo de la piel.

Antecedentes de la tecnica

Diversos factores estan implicados en determinar el color de la piel humana y, entre ellos, factores como la actividad de los melanocitos, que producen pigmentos de melanina, la distribucion de vasos sanguineos, el grosor de la piel y la presencia o ausencia de pigmentos (por ejemplo, carotenoide, bilirrubina, etc.) en el cuerpo humano son de importancia. El factor mas importante entre ellos es la melanina de pigmento negro, que es producida por la accion de diversas enzimas como tirosinasa en melanocitos humanos. La formacion del pigmento de melanina esta influencia por factores geneticos, secrecion de hormonas, factores fisiologicos asociados con el estres y factores medioambientales como la irradiacion de luz UV.

El pigmento melanina, que es producido en celulas de melanina por la piel del cuerpo, es un polimero fenolico que tiene un complejo de un pigmento negro y una proteina. Bloquea los rayos ultravioletas del sol para proteger los organos de la piel bajo a dermis y, al mismo tiempo, suprime los radicales libres generados en los tejidos de la piel con el fin de proteger las proteinas y genes en la piel. Sin embargo la melanina, producida por estimalos de tensiones internas o externas en la piel, es una sustancia estable, que no es suprimida incluso cuando desaparecen las tensiones, hasta que es desechada al exterior por la queratinizacion de la piel. Por tanto, cuando la melanina es producida en una cantidad innecesariamente grande, se produciran hiperpigmentaciones, como decoloracion, pecas y manchas, que son desfavorables en terminos de belleza. A medida que las personas que les gusta las actividades al aire libre han aumentado, con un aumento de la poblacion con ocio, ha aumentado la necesidad de prevenir la pigmentacion de melanina provocada por la luz UV. Con el fin de satisfacer esta necesidad, se han usado acido ascorbico, acido kojico, albutina, hidroquinona, glutation o sus derivados o sustancias que tienen una actividad inhibidora de tirosinasa en productos cosmeticos o farmacos. Sin embargo, su uso ha estado limitado debido a unos insuficientes efectos blanqueadores y diversos problemas, como problemas de seguridad para la piel y problemas de formulacion y estabilidad que se producen cuando son anadidos a productos cosmeticos.

Divulgacion

Problema tecnico

Consecuentemente, los presentes inventores han realizado muchos estudios para preparar una composicion cosmetica blanqueadora que es derivada de sustancias que se producen de forma natural, que sea segura para la piel y, al mismo tiempo, que tenga un excelente efecto blanqueador y una excelente estabilidad del producto. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que el ginsenosido F1 obtenido permitiendo que un extracto de plantas, particularmente extracto de ginseng, reacciones con un acido, un alcali o una enzima, tiene un efecto excelente para reducir la biosintisis de melanina, completando asi la presente invencion.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invencion examinar el efecto inhibidor de la biosfntesis de melanina de ginsenosido F1 obtenido permitiendo que el extracto de planta reaccione con un acido, un alcali o una enzima.

Solucion tecnica

La presente invencion proporciona el uso de ginsenosido F1 representado por la siguiente formula 1 para el blanqueo de la piel:

[Formula 1]

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En lo que sigue, se describira en detalle la presente invencion.

El ginsenosido F1 se obtiene a partir de extracto de plantas. Particularmente, el ginsenosido F1 se obtiene a partir de ginseng, ginseng rojo, ginseng blanco, ginseng fresco, tallos de ginseng, hojas de ginseng o frutos de ginseng.

El extracto que se usa en la presente invencion puede ser preparado de la siguiente manera. Se anade un

disolvente organico a una planta en una cantidad de aproximadamente 1-6 veces y, preferentemente, aproximadamente 3 veces el peso de la planta, y la planta es desgrasada en una cantidad de aproximadamente 1-8 veces y, preferentemente, aproximadamente 4 veces el peso de la planta desgrasada, y la planta desgrasada es extraida 1-5 veces bajo reflujo. El extracto es incubado a 10-20°C durante 1-3 dias y seguidamente es separado en forma de un residuo y un filtrado mediante filtracion y centrifugacion. El filtrado separado se concentra bajo presion reducida y el concentrado se pone en suspension en agua y seguidamente se trata, por ejemplo, con etanol, para separar pigmentos del mismo. Seguidamente, la capa acuosa se extrae 1-5 veces con un disolvente organico y seguidamente la capa de disolvente organico obtenida se concentra bajo presion reducida para obtener un extracto de disolvente organico. El extracto de disolvente organico se disuelve en una pequena cantidad de metanol o similar y seguidamente se le anade una gran cantidad de acetato de etilo. El precipitado producido se seca, obteniendose asi el extracto de la presente invencion. El disolvente organico que se usa en la presente invencion es

preferentemente un disolvente unico seleccionado entre el grupo que consiste en metanol anhidro, metanol

hidratado, etanol anhidro y etanol hidratado, o un disolvente mixto de uno de los metanoles anteriormente mencionados y uno de los etanoles anteriormente mencionados.

El extracto es hidrolizado usando un acido, una base, una enzima o un microorganismo que produzca la enzima, preparando asi el ginsenosido F1.

Cuando se usa el acido, puede ser al menos un acido seleccionado entre el grupo que consiste en acido clorhidrico, acido sulfurico y acido nitrico o una mezcla de dicho acido con al menos un alcohol seleccionado entre el grupo que consiste en etanol, metanol y butanol. El alcohol que se usa en la mezcla acido-alcohol es preferentemente etanol a. 50%. Al extracto, se anade una solucion de acido 0,1-2 N (preferentemente una solucion de acido 1 N) o la mezcla acido-alcohol, si se anade, y seguidamente el extracto se hidroliza calentando bajo reflujo en un bano con agua a una temperatura de 50-100°C (preferentemente 80°C) durante 0,5-2 horas.

Cuando se usa una base, puede ser al menos una base seleccionada entre el grupo que consiste en hidroxido de sodio e hidroxido de potasio, o una mezcla de dicha base con al menos un alcohol seleccionado entre el grupo que consiste en etanol, metanol y butanol. El alcohol que se usa en la mezcla de base-alcohol es preferentemente butanol a. 50%. %. Al extracto, se anade una solucion de acido 0,1-2 N (preferentemente una solucion de acido 1 N) o la mezcla acido-alcohol, si se anade, y seguidamente el extracto se hidroliza calentando bajo reflujo en un bano con agua a una temperatura de 50-100°C (preferentemente 100°C) durante 1-12 horas.

Cuando se usa la enzima, puede ser al menos una seleccionada entre el grupo que consiste en p-glucosidasa, a,p- arabinosidasa, a,p-ramnosidasa, p-glucuronisasa, p-galactosidasa y amiloglucosidasa. El extracto se disuelve en un volumen de 5-20 veces (preferentemente de forma aproximada un volumen de 10 veces) de una solucion tamponante acida y seguidamente se le anade la enzima. Seguidamente, el extracto es agitado en un bano con agua a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 1-60 horas y, al mismo tiempo, se examina la velocidad de eliminacion del sustrato mediante cromatografia de capa fina. Cuando es sustrato esta completamente eliminado, el extracto se calienta en agua caliente a 80-100°C durante 5-15 minutos. Seguidamente se termina la reaccion de hidrolisis y se recoge la solucion de la reaccion.

Cuando se usa el microorganismo, puede ser un microorganismo que produce dicha enzima. Mas especificamente, el microorganismo puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en aspergillus sp, bacillus sp, pinicillium sp., rhizopus sp., rhizomucor sp., talaromyces sp., bifidobacterium sp., mortierella sp., Cryptococcus sp., microbacterium sp., etc. El extracto se disuelve en un volumen de 5-10 veces (preferentemente un volumen de aproximadamente 10 veces) de agua ionizada y seguidamente se esteriliza a 121 °C durante 30 minutos y se enfria a 30°C. Los microorganismos previamente cultivados son inoculados en la solucion de extracto en una cantidad de 5-10% en peso basado en el peso de la solucion de extracto y se cultivan a 30°C durante 2-5 dias. Seguidamente, se examina la velocidad de depuracion del sustrato mediante cromatografia de capa fina y, cuando el sustrato esta completamente eliminado, se completa la reaccion y seguidamente la solucion de la reaccion se centrifuga a 5.00010.000 rpm. El precipitado recogido se lava tres veces con agua destilada, obteniendose asi un precipitado.

Despues de que se lleva a cabo la reaccion de hidrolisis como se describe anteriormente usando un acido, una base, una enzima o un microorganismo que produce la enzima, la solucion de la reaccion se concentra bajo presion reducida para separar el disolvente. Al residuo se le anade un alcohol seleccionado entre el grupo que consiste en metanol, etanol y butanol y la solucion se agita 1-5 veces. Seguidamente, las sales precipitadas se separan por filtracion y el filtrado se concentra bajo presion reducida, obteniendose asi ginsenosido F1.

Efectos ventajosos

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El ginsenosido F1 derivado de ginseng F1 (20-O-p-D-glucopiranosil-20(s)-protopanaxatriol) que es proporcionado segun la presente invencion tiene los efectos de inhibir la produccion de melanina y mejorar la pigmentacion. Debido a estos efectos, el ginsenosido F1 (20-O-p-D-glucopiranosil-20(s)-protopanaxatriol) puede ser usado ventajosamente en composiciones cosmeticas para inhibir la produccion de melanina y mejorar la pigmentacion producida por la luz UV.

Mejor modo

En lo que sigue, se describira la presente invencion mas en detalle haciendo referencia a ejemplos y ejemplos de ensayo.

Ejemplo de referencia 1: Preparacion de extracto de ginseng

Se anadieron 2 kg de ginseng a 4 l de solucion acuosa de metanol y se extrajeron 3 veces bajo reflujo, seguido de incubacion a 15°C durante 1 dia. Seguidamente, la planta extraida se separo en forma de un residuo y un filtrado a traves de filtracion mediante tela filtrante y centrifugacion y el filtrado se concentro bajo presion reducida. El concentrado se puso en suspension en agua y seguidamente se extrajo cinco veces con 1 l de etanol para separar pigmentos del mismo y la capa acuosa se extrajo tres veces con 500 ml de 1-butanol. La capa de 1-butanol total resultante se concentro bajo presion reducida para obtener un extracto de 1-butanol que seguidamente se disolvio en una cantidad pequena de metanol y se anadio a una gran cantidad de acetato de etilo. El precipitado producido se seco, proporcionando asi 100 ge de un extracto de ginseng.

Ejemplo 1: Preparacion de ginsenosido F1 mediante hidrolisis acida

Se anadieron 10 g del extracto de ginseng obtenido en el ejemplo de referencia 1 a un volumen de 20 veces (v/p) de una solucion de HCl 1 N-metanol al 50% (v/v) y se hidrolizo calentando bajo reflujo en un bano con agua a 80°C durante 8 horas. Seguidamente, la solucion de la reaccion se concentro bajo presion reducida para separar el disolvente y el residuo se anadio a 100 ml de etanol y se agito tres veces. Seguidamente las sales precipitadas se separaron por filtracion y el filtrado se concentro bajo presion reducida, obteniendose asi un producto en bruto. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia de columna de gel de silice (cloroformo:metanol = 8:1 -4:1), obteniendose asi 1,25 g de ginsenosido F1.

Ejemplo 2: Preparacion de ginsenosido F1 mediante hidrolisis basica

Se disolvieron 10 g del extracto de ginseng obtenido en el ejemplo de referencia 1 en 500 ml de piridina seca y se le anadieron 10 g de polvo de metoxido de sodio. Seguidamente, la solucion se hidrolizo calentando bajo reflujo en un bano con agua durante 8 horas y la solucion de reaccion se concentro bajo presion reducida para separar el disolvente. Rl residuo se anadio a 200 ml de etanol y se agito tres veces. Las sales precipitadas se separaron por filtracion. El filtrado se concentro bajo presion reducida, obteniendose asi un producto en bruto. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia de columna de gel de silice (cloroformo:metanol = 8:1-4:1), obteniendose asi 0,85 g de ginsenosido F1.

Ejemplo 3: Preparacion de ginsenosido F1 mediante hidrolisis enzimatica

Se disolvieron 10 g de extracto de ginseng obtenido en el ejemplo de referencia 1 en 100 ml de una solucion 0,1 M de acido acetico (pH 4,5) y 2,5 g de enzimas (0,5 g de hesperidinasa, 0,5 g de naringinasa, 0,5 g de celulosa, 0,2 g de p-glucuronidasa y 0,3 g de amiloglucosidasa; fabricadas por la empresa Sigma). Seguidamente, la solucion se agito en un bano con agua a 37°C durante 48 horas y se calento en agua caliente a 80-100°C durante 10 minutos. Tras completarse la reaccion, la solucion de la reaccion se concentro bajo presion reducida para separar el disolvente y el residuo se anadio a 200 ml de etanol y se agito tres veces. El precipitado se separo por filtracion y el filtrado se concentro bajo presion reducida, obteniendose asi un producto en bruto. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia de columna de gel de silice (cloroformo:metanol = 8:1-4:1), obteniendose asi 0,91 g de ginsenosido F1.

Ejemplo 4: Preparacion de ginsenosido F1 usando microorganismos

Se disolvieron 10 g de extracto de ginseng obtenido en el ejemplo 1 en 100 ml de agua ionizada y esterilizada a 121 °C durante 30 minutos, seguido de enfriamiento a 30°C. Seguidamente se inoculo Aspergillus niger KCCM 11885 previamente cultivado en la solucion de extracto en una cantidad de 5-10% p basada en el peso de la solucion de extracto y se cultivo a 30°C durante 5 dias. Seguidamente, se examino la velocidad de eliminacion del sustrato mediante cromatografia de capa fina y, cuando el sustrato estuvo completamente eliminado, se completo la reaccion. El cultivo se centrifugo a 5.000-10.000 rpm y el precipitado recogido se lavo tres veces con agua destilada y seguidamente se centrifugo para recoger la solucion de la reaccion en forma de un precipitado. Seguidamente, el precipitado se anadio a 200 ml de etanol y se agito tres veces. Seguidamente, el precipitado se separo por filtracion y el filtrado se concentro bajo presion reducida, obteniendose asi un producto en bruto. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia de columna de gel de silice (cloroformo:metanol = 8:1 -4:1), obteniendose asi 0,62 g

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de ginsenosido.

Ejemplo de ensayo 1: Medicion del efecto inhibidor de la produccion de melanina usando melanocitos de raton

Melanocitos de raton (celulas Mel-Ab) derivados de ratones C57BL/6 fueron cultivados en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) que contenia 10% de suero bovino fetal, 2-O-tetradecanoilforbol-13-acetato 10 nM y toxina del colera 1 nM, en condiciones de 37°C y 5% de CO2. Las celulas Mel-Ab cultivadas fueron desprendidas usando tripsina-EDTA al 0,25% y se cultivaron en una placa de 24 pocillos a una concentracion de 105 celulas/pocillo. Durante 3 dias desde 2 dias despues del comienzo del cultivo, se anadieron 10 ppm de cada una de las sustancias del ensayo (acido kojico, ejemplo de referencia 1 y ejemplos 1 a 4) a las celulas que estaban siendo cultivadas. En este caso, el acido kojico se uso como un grupo testigo con el fin de examinar el efecto inhibidor de produccion de melanina de ginsenosido F1 de la presente invencion.

El medio se separo y las celulas se lavaron con PBS y se lisaron con hidroxido de sodio 1 N. La absorbancia de las celulas se midio a 400 nm y seguidamente se calculo la proporcion inhibidora de produccion de melanina (%) de cada muestra del ensayo segun la ecuacion resultante 1. Los resultados del calculo se muestran en la Tabla 1 siguiente (metodo de Dooley).

[Ecuacion 1]

Proporcion inhibidora de la produccion de melanina (%) = 100 - (absorbancia de cada muestra de ensayo/absorbancia de grupo testigo x 100)

[Tabla 1]

Efecto inhibidor de la produccion de melanina

Muestras de ensayo

Velocidad inhibidora de produccion de melanina (%)

Ejemplo de referencia 1

21,3

Ejemplo 1

35,1

Ejemplo 2

33,6

Ejemplo 3

34,2

Ejemplo 4

34,9

Acido kojico

30,5

Como se puede observar en la Tabla 1 anterior, el ginsenosido F1 segun la presente invencion mostro una excelente velocidad inhibidora de produccion de melanina (%) en comparacion con el acido kojico del agente blanqueador existente. Ademas, se puede observar que la proporcion inhibidora de produccion de melanina (%) era casi similar entre los metodos de hidrolisis para preparar ginsenosido F1 a partir del extracto de ginseng.

Ejemplo de ensayo 2: Ensayo del efecto blanqueador sobre la piel humana

Una cinta opaca que tenia un orificio perforado de 1,5 cm de diametro fue unida al brazo superior de cada uno de 12 hombres sanos. Seguidamente se irradiaron rayos UV (UVB) a cada uno de los sujetos a una dosis 1,5-2 veces mayor que la dosis de eritema minima, induciendo asi el blanqueo de la piel.

Despues de la irradiacion UV, se aplico una solucion al 1% p de cada una de las muestras de ensayo (1,3- butilenglicol:etanol = 7:3, como vehiculo) a la piel de cada sujeto. Como grupos testigos negativo y positivo, se aplico una solucion al 3% de cada uno de acido kojico y un vehiculo a la piel de cada sujeto. No se aplico un grupo testigo con algo, y se observo el cambio en el estado de la piel del sujeto durante 10 dias. El color de la piel se midio con un colorimetro (Minolta, Japon) a un intervalo de 1 semana. Seguidamente se calculo la diferencia (AL*) en el color de la piel entre el punto de tiempo de aplicacion y el punto de tiempo de complecion de la aplicacion de cada muestra se calculo segun la siguiente ecuacion 2, y los resultados de los calculos se muestran en la Tabla 2 siguiente. Mientras tanto, el efecto blanqueador de cada muestra se evaluo comparando AL* entre el sitio aplicado con cada muestra y el sitio testigo. En la evaluacion, un valor de AL* de aproximadamente 1,5 indica que la muestra tiene un efecto blanqueador.

[Ecuacion 2]

AL* = Valor de L* en el punto de tiempo de complecion de la aplicacion - valor de L* en el punto de tiempo de comienzo de la aplicacion

[Tabla 2]

Efecto blanqueador sobre la piel humana

Muestras de ensayo

Claridad (AL*) del color de la piel

Grupo testigo

0,45 ± 0,13

Vehiculo

0,50 ± 0,15

Acido kojico

1,56 ± 0,11

Ejemplo de referencia 1

1,26 ± 0,13

Ejemplo 1

1,60 ± 0,13

Ejemplo 2

1,67 ± 0,17

Ejemplo 3

1,71 ± 0,13

Ejemplo 4

1,64 ± 0,21

Como se puede observar en la Tabla 2, el ginsenosido F1 segun la presente invencion tenia un valor de AL mayor 5 que 1,6, sugiriendo que tenia un excelente efecto blanqueador. Ademas, se puede observar que el ginsenosido F1 segun la presente invencion tenia un excelente efecto blanqueador en comparacion con el acido kojico que se conoce que tiene un excelente efecto blanqueador.

Aplicacion industrial

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Como se describio anteriormente, el ginsenosido F1 extraido de ginseng tiene excelentes efectos de inhibir la produccion de melanina y mejorar la pigmentacion producido por la luz UV.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso no terapeutico de ginsenosido F1 (20-O-p-D-glucopiranosil-20(s)-protopanaxatriol), para el blanqueo de la piel.
2. 2. El uso de la reivindicacion 1, en que el ginsenosido F1 (20-O-p-D-glucopiranosil-20(s)-protopanaxatriol) es obtenido a partir de un extracto de ginseng, ginseng rojo, ginseng blanco, ginseng fresco, tallos de ginseng, hojas de ginseng o frutos de ginseng.
3. 3. El uso de la reivindicacion 2, en que el ginsenosido F1 es obtenido permitiendo que el extracto reaccione con un acido, una base, una enzima o un microorganismo que produce la enzima.
4. 4. El uso de la reivindicacion 3, en que el acido es al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en acido clorhidrico, acido sulfurico y acido nitrico, o una mezcla del acido con al menos un alcohol seleccionado entre el grupo que consiste en etanol, metanol y butanol.
5. 5. El uso de la reivindicacion 3, en que la base es al menos una base seleccionada entre el grupo que consiste en hidroxido de sodio e hidroxido de potasio, o una mezcla de la base con al menos un alcohol seleccionado entre el grupo que consiste en etanol, metanol y butanol.
6. 6. El uso de la reivindicacion 3, en que la enzima es al menos una seleccionada entre el grupo que consiste en p- glucosidasa, a,p-arabinosidasa, a,p-ramnosidasa, p-glucoronidasa, p-galactosidasa y amiloglucosidasa.
7. 7. El uso de la reivindicacion 3, en que el microorganismo es al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en aspergillus sp, bacillus sp, pinicillium sp., rhizopus sp., rhizomucor sp., talaromyces sp., bifidobacterium sp., mortierella sp., Cryptococcus sp. y microbacterium sp.
8. 8. El uso de la reivindicacion 1, en que el ginsenosido F1 inhibe la produccion de melanina.
9. 9. El uso de la reivindicacion 1, en que el ginsenosido F1 mejora la pigmentacion producida por la luz UV.