ES2634795T3 - Sorgo resistente a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia a la inhibición de la acetil-CoA carboxilasa por herbicidas, en la que dicha secuencia comprende: (i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos un 95% homóloga a la misma que además comprende la sustitución de nucleótidos de guanina sustituida por citosina en la posición 220 de la SEQ ID NO: 1; o (ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.º PTA-8033, ATCC. n.º PYA-8034 o una secuencia al menos un 95% homóloga a las mismas, que además comprende la sustitución de nucleótidos de guanina sustituida por citosina en la posición 220 de la SEQ ID NO: 1.
Description
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DESCRIPCION
Sorgo resistente a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos N.° 60/880.125 presentada el 12 de enero de 2007.
Campo de la invencion
La presente invencion proporciona composiciones y metodos para producir plantas de cultivo que sean resistentes a los herbicidas. En particular, la presente invencion proporciona plantas de sorgo, tejidos vegetales y semillas de plantas que contienen genes y protemas alterados de acetil-CoA-carboxilasa (ACC) que son resistentes a la inhibicion por herbicidas que inhiben normalmente la actividad de la protema ACC.
Antecedentes de la invencion
El sorgo es el segundo grano de cereales para piensos mas importante cultivado en Estados Unidos. La produccion es economicamente fundamental para granjas situadas en zonas de escasa pluviosidad debido a la capacidad del sorgo para tolerar la seqrna y el calor. Tanto las industrias ganaderas como de bio-energfa utilizan sorgo como sustrato energetico, convirtiendolo asf en un cultivo versatil.
A nivel mundial, el sorgo es el quinto grano de cereal en importancia. Como tolera tanto la seqrna como el calor, es facilmente el grano para piensos mas ampliamente cultivado en las regiones semiaridas del Africa subsahariana y en la region peninsular central seca de la India. Como tal, el sorgo se utiliza para consumo humano en la mayona de las regiones mas secas del mundo, convirtiendose por ello en un cultivo alimentario fundamentalmente importante en estos lugares.
El desarrollo de resistencia a herbicidas en las plantas ofrece ventajas significativas de produccion y economicas; en este sentido, el uso de herbicidas inhibidores para controlar malas hierbas o plantas en los cultivos se ha convertido en una practica casi universal. Sin embargo, la aplicacion de dichos herbicidas tambien puede dar como resultado la muerte o la reduccion del crecimiento de la planta de cultivo deseada, haciendo que el tiempo y el metodo de aplicacion de herbicidas sean cnticos o en algunos casos inviables.
Para los agricultores es particularmente interesante el uso de herbicidas con mayor potencia, eficacia de amplio espectro para malas hierbas y rapida degradacion en el suelo. Las plantas, los tejidos vegetales y las semillas con resistencia a estos compuestos proporcionanan una solucion atractiva al permitir la utilizacion de herbicidas inhibidores para controlar el crecimiento de malas hierbas, sin riesgo de dano al cultivo. Una de dichas clases de herbicidas de amplio espectro son los compuestos que inhiben la actividad de la enzima acetil-CoA-carboxilasa (ACC) en una planta. Estos herbicidas estan incluidos en las familias qmmicas ariloxifenoxipropionato (FOP) y ciclohexanodiona (DIM). Por ejemplo, el sorgo es sensible a muchos herbicidas inhibidores de aCc que tienen como objetivo las especies monocotiledoneas, haciendo que el uso de estos herbicidas inhibidores para controlar las malas hierbas grammeas sea casi imposible.
Se ha observado que ciertas especies de malas hierbas grammeas presentan una sensibilidad alterada a los herbicidas de FOP y DIM. Una especie de grammea, la cola de zorra (A. myosuroides [Huds.]), es una de las principales malas hierbas grammeas en Europa. Se han observado varias mutaciones en el genoma de algunas plantas de cola de zorra que le confieren resistencia a algunos, pero no a todos, los herbicidas de FOP y DIM (Delye, et al., 2005, Plant Phys. 137:794-806; Delye, et al., 2002, Theor. Appl. Genet. 104:1114-1120). Se observaron hallazgos similares en malas hierbas grammeas mutantes como ballico anual (L. rigidum [Gaud.]; Delye, et al., 2002, Pest Manag. Sci. 58:474-478), almorejo (S. viridis [L. Beauv.]; Zhang y Devine, 2000, Weed Sci. Soc. Am. 40:33; Delye, et al., 2002, Planta 214:421-427) y avena loca (A. fatua [L.]; Christoffers et al., 2002, Genome 45:1049-1056). Un hfbrido de mafz resistente a los herbicidas (DK592 de Dekalb) tiene una mutacion en la enzima ACC similar a la encontrada en las malas hierbas grammeas (Zagnitko et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:6617-22).
Debido a la importancia del sorgo como planta de cultivo en el ambito mundial, lo que se necesita son tnbridos de sorgo que sean resistentes a los efectos inhibidores de los herbicidas inhibidores de ACC, permitiendo con ello un mayor rendimiento de los cultivos cuando se usan estos herbicidas inhibidores para controlar las malas hierbas grammeas.
Sumario de la invencion
Las realizaciones de la presente invencion se definen en las reivindicaciones. En particular, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a la inhibicion por uno o mas herbicidas para acetil-CoA carboxilasa, en la que dicha secuencia comprende:
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(i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos un 95% homologa a la misma que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1; o
(ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.° PTA-8033, ATCC. n.° PYA-8034 o una secuencia al menos un 95% homologa a las mismas, que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la sEq ID NO: 1.
Preferentemente, dicha secuencia de acido nucleico comprende:
(i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1, que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1; o
(ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.° PTA-8033, ATCC. n.° PYA-8034 que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1.
La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende la molecula de acido nucleico definida anteriormente unida operablemente a un promotor y otras secuencias reguladoras.
La presente invencion tambien se refiere a una molecula de ADN recombinante que comprende la molecula de acido nucleico definida anteriormente unida operablemente a un promotor.
La presente invencion tambien se refiere a una celula que comprende el vector definido anteriormente o la molecula de ADN definida anteriormente, en la que la celula es una celula vegetal.
La presente invencion tambien se refiere a un virus de ARN (+) de plantas que comprende la molecula de acido nucleico definida anteriormente.
La presente invencion tambien se refiere a una parte de planta de sorgo que comprende la molecula de acido nucleico definida anteriormente. Preferentemente, la parte de planta es una semilla o un tejido vegetal.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para transformar una celula vegetal que comprende transformar dicha celula vegetal con el vector definido anteriormente o la molecula de ADN definida anteriormente. Preferentemente, el metodo comprende ademas la etapa de regenerar una planta transgenica a partir de la celula vegetal transformada.
La presente invencion tambien se refiere a un polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico, comprendiendo dicha molecula de acido nucleico:
(i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1, que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1; o
(ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.° PTA-8033, ATCC. n.° PYA-8034 que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1.
En las realizaciones, la secuencia de aminoacidos o el polipeptido codificado es una acetil-CoA carboxilasa resistente a herbicidas y dicha sustitucion de secuencia de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1 da como resultado la sustitucion de aminoacidos de triptofano a cistema.
En el presente documento se divulgan composiciones y metodos para producir variedades cultivadas de sorgo que son resistentes a los herbicidas. La presente invencion proporciona tejidos vegetales y semillas de plantas que contienen genes y protemas alterados de acetil-CoA-carboxilasa (ACC) descritos anteriormente que son resistentes a la inhibicion por herbicidas que inhiben normalmente la actividad de la protema ACC.
El sorgo cultivado [Sorghum bicolor (L.) Moench] es sensible a muchos herbicidas que inhiben la ACC que tienen como objetivo las especies de malas hierbas monocotiledoneas o grammeas. Sin embargo, como se describe en el presente documento, se encontro un genotipo de sorgo que presenta tolerancia a los herbicidas inhibidores de ACC. El analisis genetico ha identificado diferencias geneticas dentro de un germoplasma de sorgo silvestre que da como resultado un fenotipo de resistencia a herbicidas inhibidores de ACC.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una o mas partes de plantas de sorgo cuyo germoplasma comprende una mutacion de la invencion que hace a la planta tolerante a los herbicidas inhibidores de ACC.
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En el presente documento se divulga la descendencia (por ejemplo, F1, F2, F3, etc.) de un cruce de dicha planta en el que el germoplasma de dicha descendencia tiene la misma mutacion que la planta progenitora. Por tanto, las realizaciones de la presente invencion proporcionan partes de plantas de sorgo cuyo germoplasma contiene una mutacion de la invencion, de tal modo que el fenotipo de las plantas sea resistente a herbicidas inhibidores de ACC.
En el presente documento se divulga que dicha descendencia (por ejemplo, F1, F2, F3, etc.) es el resultado de un cruce entre las lmeas de sorgo de elite, al menos una de las cuales contiene un germoplasma que comprende una mutacion que hace a la planta tolerante a herbicidas inhibidores de ACC.
En el presente documento se divulga un tnbrido de sorgo en el que dicho germoplasma del tnbrido de sorgo confiere resistencia a la inhibicion por uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa a niveles de dichos uno o mas herbicidas que inhibinan normalmente el crecimiento de un tnbrido de sorgo. En algunas realizaciones, dicho uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa son de las familias qrnmicas ariloxifenoxipropionato (FOP) y ciclohexanodiona (DIM). En algunas realizaciones, dicho germoplasma de tnbrido de sorgo que confiere resistencia a la inhibicion por uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa comprende una o mas mutaciones en el gen de acetil-CoA-carboxilasa como las encontradas en ATCC n.° PTA-8033 o como las encontradas en ATCC n.° PYA-8034.
En el presente documento se describe un metodo para controlar malas hierbas en la proximidad de un tnbrido de sorgo, que comprende proporcionar uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa, aplicar dichos uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa a un campo que contiene un tnbrido de sorgo y controlar las malas hierbas en la proximidad de dicho tnbrido de sorgo de tal modo que el crecimiento de las malas hierbas se vea afectado adversamente por la aplicacion de dicho uno o mas herbicidas y el crecimiento de dicho tnbrido de sorgo no se vea afectado adversamente. En el presente documento se divulga que dichos uno o mas herbicidas Inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa son de las familias qrnmicas ariloxifenoxipropionato (FOP) y ciclohexanodiona (DIM). En algunas realizaciones, dicho tnbrido de sorgo comprende una o mas mutaciones en el gen de acetil-CoA-carboxilasa como las encontradas en ATCC n.° PTA-8033 o aTcC n.° PYA-8034.
En el presente documento se divulga un tnbrido de sorgo en el que dicho tnbrido de sorgo comprende un germoplasma que contiene una o mas mutaciones en el gen de acetil-CoA-carboxilasa tales que la resistencia a uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa es conferida a dicho tnbrido. En el presente documento se divulga que el tnbrido de sorgo se crea por introgresion de un germoplasma de sorgo que contiene dicha una o mas mutaciones para conferir resistencia a uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa.
En el presente documento se divulga que el tnbrido de sorgo se crea por incorporacion de un gen heterologo que contiene una o mas mutaciones para conferir resistencia a uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA carboxilasa.
En el presente documento se divulga metodo para producir una lmea de plantas de tnbrido de sorgo resistente a uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa que comprende identificar un germoplasma que confiere dicha resistencia a dichos herbicidas, en el que dicho germoplasma resistente a dichos herbicidas procede de una planta de sorgo la invencion resistente a herbicidas e introducir de dicho germoplasma en una lmea de plantas de sorgo de elite. Tambien se describe en el presente documento que dicha introduccion de dicho germoplasma en dicha lmea de plantas de sorgo de elite se realiza por introgresion. Tambien se divulga en el presente documento que dicha introduccion de dicho germoplasma en dicha lmea de plantas de sorgo de elite sea mediante la introduccion de un gen heterologo.
En el presente documento se divulga un tnbrido de sorgo en el que el germoplasma de dicho tnbrido comprende resistencia conferida a uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa y resistencia a uno o mas compuestos de uno o mas grupos de herbicidas que no son inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa.
En el presente documento se divulga un metodo para identificar lmeas de plantas de sorgo resistentes a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa que comprende suministrar una muestra de acidos nucleicos de una planta de sorgo, proporcionar cebadores de amplificacion para amplificar una region de la planta de sorgo que corresponde a un gen de acetil-CoA-carboxilasa presente en dicha muestra de acidos nucleicos, aplicar dichos cebadores de amplificacion a dicha muestra de acidos nucleicos de tal forma que tenga lugar la amplificacion de dicha reglon de dicho gen de acetil-CoA-carboxilasa e identificar plantas de sorgo resistentes a herbicidas inhibidores de acetil-CoA- carboxilasa basandose en la presencia de una o mas mutaciones que confieren resistencia a los herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa presentes en dicha muestra de acidos nucleicos amplificados.
En una realizacion, la presente invencion proporciona semillas de sorgo en las que dicho germoplasma de dichas semillas comprende un gen mutante de acetil-CoA-carboxilasa de la presente invencion de tal modo que dicha mutacion confiere resistencia a la inhibicion por herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa. En algunas realizaciones, el germoplasma de dichas semillas de sorgo comprende un gen mutante de acetil-CoA-carboxilasa como el encontrado en ATCC n.° PTA-8033 o ATCC n.° PYA-8034. La presente divulgacion proporciona plantas de sorgo que crecen a partir de dichas semillas y otras partes de las plantas que comprenden dichas plantas de sorgo que crecen a partir de dichas semillas. En algunas realizaciones, el gen mutante de acetil-CoA-carboxilasa es un
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fragmento funcional del gen como el encontrado en ATCC n.° PTA-8033 o ATCC n.° PYA-8034, de tal modo que el fragmento de gen codifica un fragmento de protema que es suficiente para conferir resistencia a la inhibicion por herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa a una planta de sorgo.
La presente divulgacion proporciona un tnbrido de sorgo que comprende un gen que es al menos un 70% homologo, al menos un 80% homologo, al menos un 85% homologo, al menos un 90% homologo, al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo al gen de acetil-CoA carboxilasa hallado en ATCC n.° PTA-8033 o ATCC n.° PYA.8034. En algunas realizaciones, el gen de resistencia a herbicidas de acetil-CoA carboxilasa es al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo a la SEQ ID NO: 1, tal como se encuentra en ATCC n.° PTA-8033 y/o ATCC n.° PYA-8034 y comprende la sustitucion de aminoacidos Trp2027Cys, tal como se observa en la SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se divulgan plantas de tnbrido de sorgo que tienen todas las caractensticas fisiologicas y morfologicas de dicha planta de sorgo que crece a partir de dicha semilla de sorgo. En otras realizaciones, la presente invencion proporciona cultivos de tejidos y cultivos de tejidos regenerados que surgen de dicha semilla de sorgo o dicha parte de la planta de sorgo que contiene una mutacion en dicho gen de acetil-CoA-carboxilasa de la presente invencion, como la encontrada en ATCC n.° PTA-8033 o ATCC n.° PYA-8034.
En el presente documento se describe un metodo para producir semilla de sorgo que comprende cruzar una planta que comprende un gen mutante de acetil-CoA-carboxilasa como el encontrado en ATCC n.° PTA-8033 o ATCc n.° PYA-8034 consigo misma o con una segunda planta de sorgo y recoger dicha semilla de dicho cruce. En el presente documento se divulga que los metodos para producir dicha semilla de sorgo que comprenden plantar una lmea de sorgo de semillas progenitoras en la que dicha lmea de semillas progenitoras comprende un germoplasma que confiere resistencia a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa con una lmea de sorgo polinizador progenitora en el que dicho polinizador y/o germoplasma de la lmea de semillas comprende un germoplasma que confiere resistencia a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa, dejar crecer juntas dichas plantas de semillas progenitoras y de sorgo polinizador, permitir que dichas plantas de semillas progenitoras sean polinizadas por dichas plantas polinizadoras progenitoras y cosechar semilla que resulta de dicha polinizacion.
Descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la mutacion de triptofano (TGG) a cistema (TGC) en el gen de ACC de sorgo que se encuentra asociado con la resistencia a herbicidas inhibidores de ACC.
Definiciones
Como se usan en el presente documento, los terminos "variedad" y "variedad cultivada" se refieren a plantas que estan definidas por la expresion de las caractensticas resultantes de un genotipo dado de una combinacion de genotipos, distinguiendose de cualquier otro grupo de plantas por la expresion de al menos una de las caractensticas y siendo consideradas como una unidad con relacion a su idoneidad para propagarse sin cambios.
Como se usa en el presente documento, el termino "tnbrido" se refiere a la descendencia o progenie de progenitoras o pies de plantas geneticamente diferentes producidos como resultado de la polinizacion cruzada controlada contrariamente a una semilla no tnbrida producida como resultado de la polinizacion natural.
Como se usa en el presente documento, el termino "progenie" se refiere a las generaciones de una planta, en las que puede rastrearse la ascendencia de la generacion hasta dicha planta.
Como se usa en el presente documento, el termino "derivada" de una planta resistente a herbicidas incluye tanto la progenie de dicha planta resistente a herbicidas como cualquier mutante, recombinante o derivado obtenido por ingeniena genetica de dicha planta, tanto de la misma especie o de una especie diferente, donde se han transferido las caractensticas de resistencia a herbicidas de la planta resistente a herbicidas original a dicha planta derivada.
Como se usa en el presente documento, el termino "tejido vegetal" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas, incluyendo los presentes en rames, brotes, hojas, polen, semillas y tumores, asf como celulas en cultivo (por ejemplo, celulas individuales, protoplastos, embriones, callos, etc.). El tejido vegetal puede estar en plantas, en cultivo de organos, cultivo tisular o cultivo celular.
Como se usa en el presente documento, el termino "parte de la planta" se refiere a una estructura vegetal o un tejido vegetal, por ejemplo, polen, un ovulo, un tejido, una vaina, una semilla y una celula. En algunas realizaciones de la presente invencion plantas transgenicas son plantas de cultivo.
Como se usan en el presente documento, los terminos "cultivo" y "planta de cultivo" se utilizan en su sentido mas amplio. El termino incluye, aunque sin limitacion, cualquier especie de planta comestible por los seres humanos o utilizada como pienso para animales o peces o animales marinos, o consumida por seres humanos, o utilizada por seres humanos, o vista por seres humanos, o cualquier planta usada en la industria o el comercio o la educacion.
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Como se usan en el presente documento, los terminos "generacion F" y "generacion filial" se refieren a cualquiera de las sucesivas generaciones de plantas, celulas, tejidos u organismos despues de un cruce biparental. La generacion resultante de un apareamiento de un cruce biparental (es decir, dos progenitores) es la primera generacion filial (designada como "F1" y "F1") con referencia a una semilla y su planta, mientras que la resultante del cruce del individuo F1 es la segunda generacion filial (designada como "F2" o "F2") con referencia a una semilla y su planta.
Por ejemplo, una semilla F2 y su planta resultante son producidas por autopolinizacion o polinizacion cruzada de F1, mientras que las generaciones F posteriores se producen por autopolinizacion o polinizacion cruzada de la generacion anterior inmediata.
Como se usa en el presente documento, el termino "germoplasma" se refiere a cualquier material genetico de las plantas que contiene unidades funcionales de la herencia.
Como se usa en el presente documento, el termino "germoplasma de elite" con referencia a una planta se refiere a material hereditario de superioridad genetica demostrada.
Como se usa en el presente documento, el termino "planta de elite," se refiere a cualquier planta que ha resultado del cultivo y la seleccion para un rendimiento agronomico superior.
Como se usa en el presente documento, el termino "rasgo" se refiere a una caractenstica observable y/o medible de un organismo. Por ejemplo, la presente invencion describe plantas que son resistentes a herbicidas de FOP y DIM.
Como se usan en el presente documento, los terminos "marcador" y "marcador de ADN" y "marcador molecular" con referencia a un "marcador seleccionable" se refieren a un rasgo fisiologico o morfologico que se puede determinar como marcador para su propia seleccion o para la seleccion de otros rasgos estrechamente relacionados con ese marcador. Por ejemplo, dicho marcador podna ser un gen o rasgo que se asocie con la tolerancia a los herbicidas incluyendo, aunque sin limitacion, repeticion de secuencias simples (SSR), polimorfismo de un solo nucleotido (SNP), inserciones y/o deleciones geneticas y similares.
Como se usan en el presente documento, los terminos "introgresar" e "introgresion" se refieren a tecnicas de reproduccion por polinizacion convencional (es decir, clasicas) para incorporar material genetico extrano en una lmea de pie reproductor. Por ejemplo, la presente invencion proporciona plantas de sorgo para cultivo introgresadas con un gen mutante de ACC para la tolerancia a herbicidas por el cruce de dos generaciones de plantas.
Como se usa en el presente documento, el termino "de tipo natural" cuando se hace en referencia a un gen se refiere a un gen funcional comun en una poblacion de plantas. Un gen de tipo natural funcional es el que se observa con mayor frecuencia en una poblacion y por lo tanto se designa arbitrariamente la forma "normal" o "de tipo natural" del gen.
Como se usan en el presente documento, los terminos "modificado" o "mutante" o "mutante funcional" cuando hacen referencia a un gen o a un producto genico se refieren, respectivamente, a un gen o a un producto genico que muestra modificaciones en las propiedades de las secuencias y/o funcionales (es decir, caractensticas alteradas) en comparacion con el gen o producto genico de tipo natural. Por tanto, los terminos "modificado" y "mutante" cuando se usan con referencia a una secuencia de nucleotidos se refieren a una secuencia de acidos nucleicos que difiere en uno o mas nucleotidos de otra secuencia de acidos nucleicos normalmente relacionada y el termino "mutante funcional" cuando se utiliza con referencia a un polipeptido codificado por dicho acido nucleico "modificado" o "mutante" se refiere a la protema o polipeptido que retiene la actividad. En la presente solicitud, la protema mutante ACC, o su "mutante funcional" es la expresada por un gen de ACC que retiene su actividad natural para crear aminoacidos esenciales. Ademas, una secuencia de nucleotidos "modificada" se interpreta como la secuencia que se encuentra en el codigo genetico degenerado conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el codigo genetico esta degenerado cuando hay casos en los que diferentes codones especifican el mismo aminoacido; un codigo genetico en el que algunos aminoacidos pueden cada uno ser codificado por mas de un codon. Se considera que la presente invencion puede comprender tal degeneracion (por ejemplo, cuando un hforido de sorgo comprende un gen de ACC que es al menos al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo a la SEQ ID NO:1) como el encontrado, por ejemplo, en el germoplasma de sorgo.
Como se usa en el presente documento, el termino "heterologo" cuando se utiliza con referencia a un gen o acido nucleico se refiere a un gen que ha sido de algun modo manipulado.
Como se usa en el presente documento, el termino "porcion" o "fragmento funcional" cuando se usa con referencia a una protema (como en "un fragmento de una protema dada", "un fragmento de protema", una "porcion de una protema") se refiere a fragmentos de dicha protema. Los fragmentos pueden variar de tamano desde cuatro residuos de aminoacidos hasta toda la secuencia de aminoacidos menos un aminoacido. En la presente invencion, el fragmento de protema es preferiblemente funcional, de tal modo que el fragmento de protema confiera resistencia a la inhibicion de herbicidas inhibidores de ACC a una planta dada.
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Descripcion detallada de la invencion
La acetil-CoA-carboxilasa (ACC) es una enzima biotinilada que cataliza la carboxilacion de acetil-CoA produciendo malonil-CoA. Esta carboxilacion es una reaccion reversible en dos etapas que consiste en la carboxilacion dependiente de ATP del grupo biotina en el dominio del portador de carboxilo por la actividad de biotina-carboxilasa seguido por la transferencia del grupo carboxilo de la biotina a acetil-CoA por la actividad de carboxil-transferasa (Nikolau et al., 2003, Arch. Biochem. Biophys. 414:211-22). La acetil-CoA-carboxilasa es no solo una enzima clave en las plantas para la biosmtesis de acidos grasos, un proceso que se produce en los cloroplastos y las mitocondrias, sino que la ACC tambien desempena un papel en la formacion de acidos grasos de cadena larga y flavonoides y en la malonilacion que tiene lugar en el citoplasma. Existen dos isoformas de ACC, siendo la ACC cloroplastica responsable de mas del 80% de la actividad total de ACC (Herbert et al., 1996, Biochem. J. 318:9971006). El ariloxifenoxipropionato (FOP) y la ciclohexanodiona (DIM) son dos clases de productos qmmicos que se sabe que inhiben selectivamente la ACC cloroplastica en las grammeas (Rendina et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38:1282-1287).
Se plantaron semillas de 83 poblaciones de sorgo silvestre de Bolivia y se evaluo la tolerancia a los herbicidas inhibidores de ACC. Uno de los genotipos de sorgo silvestre, Bol-71, expreso altos niveles de tolerancia a cada uno de los herbicidas ensayados. Se demuestra en el presente documento que cruzando el sorgo silvestre Bol-71 con lmeas de plantas de sorgo progenitoras de elite se obtiene un buen conjunto de semillas y resistencia al herbicida inhibidor de ACC en los hnbridos F1. Por ejemplo, las semillas del cruce de Bol-71 y ATx623, designadas KSU 06GHATx623x174 (por ejemplo, la progenie F1), se depositaron en ATCC como se describe en el presente documento.
En este sentido, la presente divulgacion proporciona un germoplasma de sorgo que contiene genes y protemas alterados de ACC de la presente invencion. En el presente documento se divulga el uso de herbicidas Inhibidores de ACC en campos de plantas de cultivo de sorgo hnbrido para reducir la cantidad de plantas de malas hierbas monocotiledoneas presentes en dicho campo de cultivo, en el que dicho germoplasma de sorgo tnbrido comprende una enzima alterada de ACC que confiere resistencia a los herbicidas inhibidores de ACC y dichas plantas de malas hierbas son sensibles a los herbicidas inhibidores de ACC.
La presente divulgacion proporciona un germoplasma de sorgo definido anteriormente que confiere resistencia a la inhibicion por herbicidas inhibidores de ACC, sola o junto con otros rasgos de resistencia, por ejemplo, resistencia a los insectos contra el barrenador manchado del tallo Chilo partellus (Girijashankar et al., 2005, Plant Cell Rep. 24:513-522). En el presente documento se divulga un hnbrido de sorgo cuyo germoplasma que comprende un gen cryl Ac sintetico de Bacillus thuringiensis (Bt) se introgresiona en una lmea de sorgo, cuyo germoplasma confiere resistencia a los herbicidas inhibidores de ACC. La incorporacion de la resistencia a herbicidas inhibidores de ACC y la resistencia a los insectos se realiza a traves de la transgenesis vegetal en el mismo hnbrido de sorgo. Un experto en la tecnica reconocera que los diversos metodos descritos en el presente documento son aplicables a la incorporacion de dos o mas rasgos de resistencia en el mismo hnbrido de sorgo.
En el presente documento se divulga la resistencia de ACC a los herbicidas en plantas de sorgo que comprenden, por ejemplo, un germoplasma de ACC denominado KSU 06GH701-715bk o KsU 06GHATx623x714 depositado en ATCC con los numeros de referencia: PTA-8033 y PYA-8034, respectivamente, incorporado en las variedades de sorgo de elite mediante la reproduccion y la seleccion de plantas, proporcionando de este modo el desarrollo de hnbridos de cultivos de sorgo tolerantes a herbicidas que toleraran el uso de herbicidas inhibidores de ACC para el control de malas hierbas. El desarrollo de esta caractenstica de tolerancia a herbicidas en los hnbridos antes mencionados permite el uso de estos herbicidas para controlar las malas hierbas monocotiledoneas que crecen en presencia de estos cultivos.
En el presente documento se divulga que la incorporacion de germoplasma ACC resistente en lmeas de elite es mediante introgresion o metodos de reproduccion y seleccion clasicos. En algunas realizaciones, la incorporacion del gen de resistencia de ACC en lmeas de elite se realiza por medio de transgenesis de genes heterologos. En el presente documento se divulga un hnbrido de sorgo, en el que al menos un antepasado del hnbrido de sorgo comprende un gen de ACC resistente procedente del germoplasma denominado KSU 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 depositado en ATCC con los numeros de referencia: PTA-8033 y PYA-8034, respectivamente. En algunas realizaciones, el gen de ACC resistente a los herbicidas es al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo al gen de resistencia a herbicidas de ACC que se encuentra en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714. En algunas realizaciones, el gen de resistencia a herbicidas de ACC es al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo al gen de ACC resistente a los herbicidas encontrado en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 que comprende una sustitucion de aminoacido Trp2027Cys.
En el presente documento se divulga que el germoplasma de ACC resistente a los herbicidas se introgresiona en una lmea de sorgo de elite usando tecnicas de reproduccion y seleccion clasicas. Los ejemplos de metodos de reproduccion y seleccion clasicos para el sorgo pueden hallarse, por ejemplo, en Sleper y Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, quita edicion, Blackwell Publishing.
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En el presente documento se divulga que el germoplasma de ACC resistente a los herbicidas se introgresiona en una planta de sorgo que proporciona alimento para consumo humano. En el presente documento se divulga que el germoplasma de ACC resistente a los herbicidas se introgresiona en plantas de sorgo que proporcionan pienso para animales de granja (por ejemplo, aves, ganado vacuno, cerdos, ovejas, etc.). En el presente documento se divulga que el germoplasma de ACC resistente a los herbicidas se introgresiona en plantas de sorgo que se usan en procesos industriales, tales como la produccion de etanol. En una realizacion, el gen de ACC resistente a los herbicidas se introduce en el genoma de la planta por medio de transgenesis usando vectores y tecnologfas conocidos en latecnica.
En el presente documento se divulga un germoplasma de ACC resistente de una parte de la planta de sorgo de la lmea Bol-71 y Atx623, en el que la semilla de dicha planta de sorgo ha sido depositada en ATCC con los numeros de referencia: PTA-8033 y PYA-8034, respectivamente, y dicha parte de planta de sorgo es uno o mas de un polen, un ovulo, un tejido, una vaina, una semilla y una celula. En el presente documento se divulga un tubrido F1 cuyo germoplasma comprende un gen de ACC resistente de la invencion. En algunas realizaciones, el tubrido F1 es un cruce entre dos lmeas de sorgo de elite, al menos una de las cuales contiene un germoplasma que comprende un gen de ACC resistente, como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulgan metodos para controlar malas hierbas en un campo de plantas de cultivo de sorgo tubrido. En el presente documento se divulga que el control de las malas hierbas comprende aplicar un herbicida inhibidor de ACC a dicho campo de plantas de sorgo, de tal modo que se inhiba el crecimiento de las malas hierbas pero que no se vea afectado adversamente el crecimiento del sorgo. En algunas realizaciones, el herbicida inhibidor de ACC que se aplica es de la familia de herbicidas ariloxifenoxipropionato (FOP) incluyendo, aunque sin limitacion, los compuestos clodinafop-propargilo, cihalofop-butilo, diclofop-metilo, fenoxaprop-P-etilo, fluazifop-P-butilo, haloxifop-etoxietilo, haloxifop-etotilo, haloxifop-R-metilo, propaquizafop, quizalofop-P-etilo y quizalofop-P-tefurilo. En algunas realizaciones, el herbicida inhibidor de ACC que se aplica es de la familia de herbicidas ciclohexanodionas (DIM) incluyendo, aunque sin limitacion, los compuestos aloxidim, butroxidim, clefoxidim, cletodim, cicloxidim, profoxidim, setoxidim, tepraloxidim y tralcoxidim. En algunas realizaciones, el herbicida inhibidor de ACC que se aplica comprende una combinacion de compuestos de familias de herbicidas inhibidores de ACC tanto FOP como DIM.
En el presente documento se divulga un hfbrido de sorgo (por ejemplo, F1, F2, F3, F4, etc.), cuyo germoplasma confiere resistencia a los herbicidas inhibidores de ACC y resistencia a uno o mas herbicidas adicionales de uno o mas grupos diferentes de herbicidas. Por ejemplo, otros grupos de herbicidas usados para inhibir el crecimiento de malas hierbas incluyen, aunque sin limitacion, inhibidores de la smtesis de lfpidos (por ejemplo, arlloxlfenoxipropionatos, ciclohexanodionas, benzofuranos, acidos cloro-carbonicos, fosforoditioatos, tiocarbamatos), inhibidores de la fotosmtesis en el fotosistema II (por ejemplo, fenil-carbamatos, piridazinonas, triazinas, triazinonas, triazolinonas, uracilos, amidas, ureas, benzotiadiazinonas, nitrilos, fenil-piridinas), inhibidores de la fotosmtesis en el fotosistema I (por ejemplo, bipiridilios), inhibidores de la protoporfirinogeno-oxidasa (por ejemplo, difenileteres, N- fenilftalimidas, oxadiazoles, oxizolidindionas, fenilpirazoles, pirimidindionas, tiadiazoles), inhibidores de la biosmtesls de carotenoides (por ejemplo, piridazinonas, piridincarboxamidas, isoxazolidinonas, triazoles), inhibidores de 4- hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (por ejemplo, calistemonas, isoxazoles, pirazoles, tricetonas), inhibidores de la EPSP-sintasa (por ejemplo, glicinas), inhibidores de la glutamina-sintetasa (por ejemplo, acidos fosfmicos), inhibidores de ja dihidropteroato-sintasa (por ejemplo, carbamatos), inhibidores del sistema de microtubulos (por ejemplo, benzamidas, acidos benzoicos, dinitroanilinas, fosforamidatos, piridinas), inhibidores de la division celular (por ejemplo, acetamidas, cloroacetamidas, oxlacetamidas), inhibidores de la smtesis de la pared celular (por ejemplo, nitrilos, triazolocarboxamidas) e inhibidores del transporte de auxinas (por ejemplo, ftalamatos, semicarbazonas). En el presente documento se divulgan hfbridos F1 de las lmeas de sorgo de elite que comprenden resistencia a uno o mas herbicidas inhibidores de ACC solos, o junto con, resistencia a los herbicidas de uno o mas de los grupos de herbicidas antes mencionados.
En una realizacion, la presente invencion proporciona el uso de un transgen que comprende un gen heterologo de la invencion que codifica una protema ACC mutante para proporcionar el rasgo agronomico seleccionado de resistencia a los herbicidas inhibidores de ACC. En una realizacion, el transgen comprende un gen mutante de ACC como el encontrado en el germoplasma denominado KSU 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 depositado en ATCC con los numeros de referencia: PTA-8033 y PYA-8034, respectivamente. En algunas realizaciones, el transgen es al menos un 95% homologo, es al menos un 97% homologo o es al menos un 99% homologo al gen de ACC resistente a los herbicidas que se encuentra en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el gen de ACC resistente a los herbicidas es al menos un 95% homologo, es al menos un 97% homologo o es al menos un 99% homologo al gen de ACC resistente a los herbicidas que se encuentra en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 que comprende una sustitucion de aminoacido Trp2027Cys.
Reproduccion clasica de Sorgo
Los cultivos agncolas se han reproducido clasicamente por tecnicas que aprovechan el(los) metodo(s) de polinizacion de las plantas. Una planta se considera "autopolinizante" si el polen de una flor puede ser transmitido a
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la misma o a otra flor, mientras que las plantas se consideran de "polinizacion cruzada" si el polen precede de una flor de una planta diferente con el fin de que se produzca la polinizacion.
Las plantas que son auto-polinizadas y seleccionadas durante muchas generaciones llegan a ser homocigoticas en la mayona, sino todos, los locus de sus genes, produciendo de este modo una poblacion uniforme de progenie reproductora verdadera. Un cruce entre dos plantas homocigoticas de antecedentes diferentes o dos lmeas homocigoticas diferentes producira una poblacion uniforme de plantas tubridas que seran mas probablemente heterocigoticas en un numero de los locus de sus genes. Un cruce de dos plantas que son cada una heterocigotica en un numero de locus de sus genes producira una generacion de plantas tubridas que son geneticamente diferentes y no son uniformes.
Las plantas de sorgo son plantas auto-polinizantes, pero tambien se pueden reproducir por polinizacion cruzada. El desarrollo de tubridos de sorgo requiere el desarrollo de progenitores polinizadores (restauradores de la fertilidad) y progenitores de semilla que se reproduzcan endogamicamente utilizando el sistema restaurador de la esterilidad- fertilidad masculina citoplasmica, el cruce de los progenitores de semilla y de los progenitores polinizadores y la evaluacion de los cruces. Los programas de reproduccion de calidad combinan rasgos deseables, siendo en la presente solicitud el rasgo deseable la resistencia de las plantas a los herbicidas Inhibidores de ACC. Este rasgo esta incluido en la mezcla para reproduccion de una o mas lmeas, de tal modo que se creen nuevas lmeas endogamicas por cruce, seguido por la seleccion de plantas con el rasgo deseado, seguido por mas cruce, etc. Nuevas lmeas endogamicas se cruzan con otras lmeas endogamicas (por ejemplo, lmeas de plantas de elite como las descritas en el presente documento).
La reproduccion de calidad comienza con el cruce de dos genotipos, tal como Bol-71 y una lmea de sorgo de elite (por ejemplo, Tx430, 00MN7645, BTx623, ATx623, Wheatland, Tx3042, OK11, QL41 y Tx643, Tx2737, Tx2783 y HP 162). Por ejemplo, el progenitor de sorgo silvestre Bol-71 se cruzo con lmeas progenitoras de sorgo de elite incluyendo Tx430, 00MN7645, BTx623 y ATx623. Si los dos progenitores originales no proporcionan todas las caractensticas deseadas, se pueden incluir entonces otras fuentes en la poblacion reproductora. Por ejemplo, si se requiere un tubrido de tal modo que fuera deseable tanto la resistencia a herbicidas inhibidores de ACC como la resistencia a otro grupo de herbicidas, como se ha descrito en el presente documento, entonces podnan cruzarse plantas con estos atributos utilizando tecnicas de reproduccion clasicas. En el metodo de calidad, las plantas superiores se autofecundan y seleccionan en generaciones sucesivas. En las generaciones venideras, la condicion heterocigotica da paso a lmeas homogeneas, como resultado de la autopolinizacion y la seleccion. Tfpicamente, en el metodo de calidad, se ensayan cinco o mas generaciones de autofecundacion y seleccion (por ejemplo, S1, S2, S3, S4, S5, etc.).
Se utiliza retrocruzamiento para mejorar una lmea de plantas. El retrocruzamiento transfiere un rasgo deseable espedfico de una fuente a otra que carece de dicho rasgo. Esto se logra, por ejemplo, cruzando un donante (por ejemplo, Bol-71) con una lmea endogamica (por ejemplo, una lmea de elite como se describe en el presente documento). La progenie de este cruce se cruza de nuevo (es decir, retrocruzamiento) con la lmea endogamica de elite, seguido por seleccion en la progenie resultante del rasgo deseado (por ejemplo, resistencia a los herbicidas Inhibidores de ACC). Despues de cinco o mas generaciones de retrocruzamiento con seleccion del rasgo deseado, la progenie es tfpicamente heterocigotica para el locus (los locus) que controla el fenotipo deseado, pero sera similar al progenitor de elite en cuanto a los otros rasgos geneticos. El ultimo retrocruzamiento es entonces tfpicamente auto-fecundado con el fin de obtener una progenie reproductora pura para el gen que se esta transfiriendo.
En los actuales programas de reproduccion de sorgo hfbrido, se desarrollan nuevas lmeas progenitoras para lmeas progenitoras de semillas (por ejemplo, Wheatland, Tx3042, OK11, QL41 y Tx643) o lmeas progenitoras de polen (por ejemplo, Tx430, Tx2737, Tx2783, 00MN7645 y HP162) dependiendo de si contienen o no genes restauradores de la fertilidad; las lmeas progenitoras de semillas no tienen genes restauradores de la fertilidad y son androesteriles en ciertos citoplasmas (tambien conocidas como plantas de la lmea "A") y androfertiles en otros citoplasmas (tambien conocidas como plantas de la lmea "B"), mientras que las lmeas progenitoras de polen no son androesteriles y contienen genes restauradores de la fertilidad (tambien conocidas como plantas de la lmea "R"). Las lmeas progenitoras de semillas se crean tfpicamente para ser citoplasmaticamente androesterlles, de tal modo que las anteras sean mmimas o inexistentes en estas plantas por lo que requieren polinizacion cruzada. Las lmeas progenitoras de semillas solo produciran semillas y el citoplasma se transmite unicamente a traves del huevo. El polen para la polinizacion cruzada es suministrado por las lmeas progenitoras de polen que contienen los genes necesarios para la restauracion completa de la fertilidad en el hubrido F1, y el cruce se combina con el progenitor de semilla androesteril para producir un hfbrido de un solo cruce de alto rendimiento con buena calidad de grano.
Tfpicamente, este sistema restaurador de la esterilidad-fertilidad masculina citoplasmica se realiza para la produccion de semillas hfbridas mediante la plantacion de bloques de filas de plantas androesteriles (progenitoras de semillas) y bloques de filas de plantas restauradoras de la fertilidad (progenitoras de polen), de tal modo que las plantas progenitoras de semillas sean polinizadas por el viento con el polen de la planta progenitora de polen. Este proceso produce un hfbrido vigoroso de un solo cruce que es cosechado y sembrado por el consumidor.
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Las plantas progenitoras de semillas androesteriles tambien pueden ser creadas reproduciendo geneticamente genes nucleares androesteriles recesivos en una poblacion particular, sin embargo, el sistema restaurador de la esterilidad-fertilidad masculina citoplasmica es tipicamente el sistema utilizado para reproducir sorgo hforido. Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, quinta Ed., Blackwell Publishing proporcionan una buena revision de los procedimientos actuales de reproduccion de sorgo.
Transgenicos vegetales
Los genes heterologos destinados a la expresion en plantas se ensamblan en primer lugar en vectores de expresion que contienen un gen heterologo y elementos de control de la transcripcion y la traduccion apropiados, siendo muy conocidos dichos metodos por los expertos en la tecnica. Los metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. Metodos Ilustrativos estan ampliamente descritos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY., y Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY).
En general, estos vectores comprenden una secuencia de acidos nucleicos que codifica un gen heterologo unido operablemente a un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores, senales de poliadenilacion, etc.) requeridas para la expresion en una planta.
Los promotores incluyen, aunque sin limitacion, promotores constitutivos, promotores espedficos de tejidos, organos y del desarrollo y promotores inducibles. Ejemplos de promotores incluyen, aunque sin limitacion: el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor; un promotor inducible por herida del tomate, leucina-amino- peptidasa (Chao et al., 1999, Plant Physiol 120:979-992); un promotor qmmicamente inducible del tabaco, relacionado con la patogenesis 1 (inducido por acido salidlico y ester S-metilico del acido benzotiadiazol-7- carbotioico); un promotor de choque termico (Patente de los Estados Unidos n.° 5.187.267); un promotor inducible portetraciclina (Patente de los Estados Unidos n.° 5.057.422); y promotores espedficos de semillas.
Los casetes de expresion pueden comprender ademas cualquiera de las secuencias requeridas para la expresion de mRNA. Dichas secuencias incluyen, aunque sin limitacion, terminadores de la transcripcion, potenciadores, tales como intrones, secuencias virales y secuencias destinadas al direccionamiento del producto genico a organulos espedficos y compartimentos celulares.
Una variedad de terminadores de la transcripcion esta disponible para su uso en la expresion de secuencias que usan promotores tales como los descritos en el presente documento. Los terminadores de la transcripcion son responsables de la terminacion de la transcripcion mas alla del transcrito y de su correcta poliadenilacion. Terminadores de la transcripcion apropiados y los que se sabe que actuan en plantas incluyen, aunque sin limitacion, el terminador 35S del CaMV, el terminador tml, el terminador rbcS E9 del guisante y el terminador de nopalina- y octopina-sintasa (Odell et al., 1985, Nature 313:810; Rosenberg et al., 1987, Gene, 56:125; Guerineau et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot, 1991, Cell, 64:671; Sanfacon et al., 1990, Genes Dev. 5:141; Mogen et al., 1990, Plant Cell, 2:1261; Munroe et al., 1990, Gene, 91:151; Bailas et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:7891; Joshi etal., 1987, Nucleic Acid Res., 15:9627).
En algunas realizaciones, las construcciones para la expresion del gen heterologo de interes incluyen una o mas de las secuencias encontradas para potenciar la expresion genica desde dentro de la unidad transcripcional. Estas secuencias se pueden utilizar junto con la secuencia de acidos nucleicos de interes para aumentar la expresion en las plantas. Se ha demostrado que varias secuencias intronicas potencian la expresion, particularmente en celulas monocotiledoneas. Habitualmente se han incorporado secuencias intronicas en vectores de transformacion de plantas, tfpicamente dentro de la secuencia delantera no traducida.
En algunas realizaciones, una construccion para la expresion de la secuencia de acidos nucleicos heterologa de interes incluye tambien un regulador, tal como una senal de localizacion nuclear (Kalderon et al., 1984, Cell 39:499; Lassner et al., 1991, Plant Molecular Biology 17:229), una secuencia de consenso de la traduccion para plantas (Joshi, 1987, Nucleic Acids Research 15:6643), un intron (Luehrsen and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225:81) y similares, unido operablemente a la secuencia de acidos nucleicos que codifica un gen heterologo.
En la preparacion de la construccion que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica un gen heterologo, o que codifica una secuencia disenada para disminuir la expresion de genes heterologos, se pueden manipular varios fragmentos de ADN con el fin de proporcionar las secuencias de ADN en la orientacion deseada (por ejemplo, sentido o antisentido) y, segun proceda, en el marco de lectura deseado. Por ejemplo, se pueden emplear adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o se pueden utilizar otras manipulaciones para proporcionar sitios de restriccion convenientes, eliminacion de ADN superfluo, eliminacion de sitios de restriccion y similares. Para este fin, se emplean preferiblemente mutagenesis in vitro, reparacion con cebadores, restriccion, asociacion, reseccion, ligamiento y similares, cuando estan implicadas inserciones, deleciones o sustituciones (por ejemplo, transiciones y transversiones).
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Para la transformacion de plantas estan disponibles numerosos vectores de transformacion. La seleccion de un vector para su uso dependera de la tecnica de transformacion preferida y la especie diana para la transformacion. Para ciertas especies diana, se prefieren diferentes marcadores de seleccion de antibioticos o herbicidas. Los marcadores de seleccion usados habitualmente en la transformacion incluyen el gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina y a los antibioticos relacionados (Messing y Vierra, 1982, Gene 19:259; Bevan et al., 1983, Nature 304:184), el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., 1990. Nucl Acids Res. 18:1062; Spencer et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 79:625), el gen hph que confiere resistencia al antibiotico higromicina (Blochlinger y Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2929) y el gen dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis etal., 1983, EMBOJ, 2:1099).
En algunas realizaciones, el vector plasmfdico Ti (T-ADN) se adapta para su uso en un proceso de transfeccion mediado por Agrobacterium, tal como en la Patente de los Estados Unidos 6.369.298 (sorgo) y en las Patentes de los Estados Unidos 5.981.839, 6.051.757, 5.981.840, 5.824.877 y 4.940.838. La construccion de los plasmidos Ti y Ri recombinantes aplica en general metodos usados tipicamente con los vectores mas comunes, tales como pBR322. Pueden realizarse otros usos de elementos geneticos accesorios encontrados algunas veces en los plasmidos naturales y algunas veces construidos a partir de secuencias extranas. Estos pueden incluir como genes de seleccion, aunque sin limitacion, genes estructurales para resistencia a los antibioticos.
Actualmente se usan dos sistemas de vectores plasmfdicos Ti y Ri recombinantes. El primer sistema se denomina sistema "cointegrado". En este sistema, el vector lanzadera que contiene el gen de interes se inserta por recombinacion genetica en un plasmido Ti no oncogenico que contiene tanto los elementos que actuan en cis como los que actuan en trans requeridos para la transformacion de plantas como, por ejemplo, en el vector lanzadera pMLJ1 y el plasmido Ti no oncogenico pGV3850. El uso de T-ADN como una region flanqueante en una construccion para la integracion en un plasmido Ti o Ri ha sido descrito en la Patente Europea n.° 116718 y las Solicitudes PCT Nos. WO 84/02913, 02919 y 02920; Herrera-Estrella, 1983, Nature 303:209-213; Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807; Horsch et al., 1984, Science 223:496-498; y DeBlock et al., 1984, EMBO J. 3:1681-1689.
El segundo sistema se denomina el sistema "binario" en el que se utilizan dos plasmidos y el gen de interes se inserta en un vector lanzadera que contiene los elementos que actuan en cis requeridos para la transformacion de plantas. Las otras funciones necesarias son proporcionadas en trans por el plasmido Ti no oncogenico ilustrado por el vector lanzadera pBIN19 y el plasmido Ti no oncogenico PAL4404. Algunos de estos vectores estan disponibles comercialmente.
En algunas realizaciones, la secuencia de acidos nucleicos de interes es dirigida a un locus particular en el genoma de la planta. La integracion dirigida al sitio de la secuencia de acidos nucleicos de interes en el genoma de la celula vegetal puede lograrse mediante, por ejemplo, recombinacion homologa utilizando secuencias derivadas de Agrobacterium. Generalmente, las celulas vegetales se incuban con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de direccionamiento en el que las secuencias que son homologas a una secuencia de ADN del interior del locus diana estan flanqueadas por secuencias del ADN transferido (T-ADN) de Agrobacterium, como ha sido descrito previamente (Patente de los Estados Unidos n.° 5.501.967). Los expertos en la tecnica saben que la recombinacion homologa puede conseguirse usando vectores de direccionamiento que contienen secuencias que son homologas a cualquier parte del gen vegetal diana, siempre que pertenezcan a los elementos reguladores del gen o a las regiones codificadoras del gen. La recombinacion homologa se puede lograr en cualquier region de un gen vegetal siempre y cuando se conozca la secuencia de acidos nucleicos de las regiones que flanquean el sitio diana. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria comun del suelo que causa la enfermedad tumor del cuello transfiriendo alguno de sus ADN a la planta hospedante. El ADN transferido (T-ADN) se integra de modo estable en el genoma de la planta, donde su expresion conduce a la smtesis de hormonas vegetales y por lo tanto al crecimiento tumoral de las celulas. Se forma un supuesto complejo macromolecular en el proceso de transferencia de T-ADN fuera de la celula bacteriana en la celula vegetal.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos descritos en el presente documento se utilizan para construir vectores derivados de virus (+) RNA de plantas (por ejemplo, virus del mosaico del bromo, virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del pepino, virus del mosaico del tomate y sus combinaciones e tubridos). Generalmente, el polinucleotido heterologo insertado puede ser expresado a partir de estos vectores como una protema de fusion (por ejemplo, protema de fusion de protemas de recubrimiento) o a partir de su propio promotor subgenomico u otro promotor. Los metodos para la construccion y el uso de dichos virus estan descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.846.795; 5.500.360; 5.173.410; 5.965.794; 5.977.438; y 5.866.785.
En algunas realizaciones, una secuencia heterologa de acidos nucleicos de interes que comprende un transgen mutante de ACC, por ejemplo, como el encontrado en el germoplasma denominado KSU 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 depositado en ATCC con los numeros de referencia: PTA-8033 y PYA-8034, respectivamente, se introduce directamente en una planta. En algunas realizaciones, el transgen es al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo al gen de ACC resistente a los herbicidas hallado en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el transgen es al menos un 95% homologo, al menos un 97% homologo o al menos un 99% homologo al gen de
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ACC resistente a herbicidas hallado en el germoplasma 06GH701-715bk o KSU 06GHATx623x714 que comprende una sustitucion de aminoacidos Trp2027CyS.
Un vector util para las tecnicas de transferencia directa de genes en combinacion con la seleccion por el herbicida Basta (o fosfinotricina) es una version modificada del plasmido pCIB246, con un promotor 35S de CaMV en fusion operativa con el gen GUS de E. coli y el terminador de la transcripcion 35S de CaMV (documento de patente WO 93/07278).
Una vez que una secuencia de acidos nucleicos que codifica el gen heterologo esta unida operativamente a un promotor apropiado e insertada en un vector adecuado para la tecnica de transformacion particular utilizada (por ejemplo, uno de los vectores descritos anteriormente), el ADN recombinante antes descrito se puede introducir en la celula vegetal por un numero de metodos reconocidos en la tecnica. Los expertos en la tecnica apreciaran que la eleccion del metodo depende del tipo de planta diana para la transformacion. En algunas realizaciones, el vector se mantiene en el episoma. En algunas realizaciones, el vector se integra en el genoma. En algunas realizaciones, se usa la transformacion directa en el genoma del plasto para introducir el vector en la celula vegetal (por ejemplo, veanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.451.513; 5.545.817; 5.545.818; y la solicitud de patente pCt Wo 95/16783).
La tecnica basica para la transformacion de cloroplastos implica la introduccion de regiones del ADN clonado de plastas que flanquean un marcador seleccionable junto con el acido nucleico que codifica las secuencias de interes en un tejido diana adecuado (por ejemplo, usando biolfstica o transformacion de protoplastos con cloruro de calcio o PEG). Las regiones flanqueantes de 1 a 1,5 kb, denominadas secuencias de direccionamiento facilitan la recombinacion homologa con el genoma del plasto y por lo tanto permiten la sustitucion o modificacion de regiones espedficas del plastoma. Inicialmente, se utilizan mutaciones puntuales en el ARNr de 16S de cloroplastos y en genes rps12 que confieren resistencia a la espectinomicina y/o estreptomicina como marcadores seleccionares para la transformacion (Svab et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8526; Staub y Maliga, 1992, Plant Cell, 4:39). La presencia de sitios de clonacion entre estos marcadores permite la creacion de un vector de direccionamiento de plastas para la introduccion de moleculas de ADN extranas (Staub y Maliga, 1993, EMBO J., 12:601). Se obtienen aumentos sustanciales en la frecuencia de transformacion por sustitucion de los genes recesivos de resistencia a antibioticos ARNr o r-protema por un marcador seleccionable dominante, el gen aadA bacteriano que codifica la enzima destoxificante de espectinomicina, aminoglicosido-3'-adeniltransferasa (Svab and Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:913). Se conocen en la tecnica otros marcadores seleccionables utiles para la transformacion de plastos que estan abarcados por el alcance de la presente invencion. Se obtienen plantas homoplasmicas para genomas de plastes que contienen las dos secuencias de acidos nucleicos separadas por un promotor de la presente invencion, y son preferiblemente capaces de una alta expresion de los ARN codificados por la molecula de ADN.
En una realizacion, los vectores utiles en la practica de la presente invencion se microinyectan directamente en celulas vegetales (Crossway, 1985, Mol. Gen. Genet, 202:179). En algunas realizaciones, el vector se transfiere a la celula vegetal usando polietilenglicol (Krens et al., 1982, Nature, 296:72; Crossway et al., 1986, Biotechniques, 4:320); fusion de protoplastos con otras entidades, tales como minicelulas, celulas, lisosomas u otros cuerpos con superficie lipfdica fusible (Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:1859) y transformacion de protoplastos (EP 0292435); transferencia directa de genes (Paszkowski et al., 1984, EMBO J., 3:2717; Hayashimoto et al., 1990, Plant Physiol. 93:857).
En algunas realizaciones, el vector tambien puede ser introducido en las celulas vegetales por electroporacion (Fromm, et al., 1985, Proc. Nati Acad. Sci. USA 82:5824; Riggs et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:5602). En esta tecnica, los protoplastos vegetales se someten a electroporacion en presencia de plasmidos que contienen la construccion genica. Los impulsos electricos de alta intensidad de campo permeabilizan reversiblemente las biomembranas permitiendo la introduccion de los plasmidos. Los protoplastos vegetales que han sido sometidos a electroporacion reforman la pared celular, se dividen y forman callos vegetales.
Ademas de la transformacion directa, en algunas realizaciones, los vectores que comprenden una secuencia de acidos nucleicos que codifica un gen heterologo se transfieren utilizando transformacion mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., 1988, Biotechnology, 6:915; Ishida et al., 1996, Nature Biotechnology 14:745). El Agrobacterium es un genero representativo de la familia gram negativa Rhizobiaceae. Sus especies son responsables de los tumores de plantas, tales como las enfermedades tumor del cuello y rafz pilosa. En la caractenstica de tejido indiferenciado de los tumores, se producen y catabolizan derivados de aminoacidos conocidos como opinas. Los genes bacterianos responsables de la expresion de las opinas son una fuente conveniente de elementos de control para casetes de expresion quimericos. Se pueden introducir en celulas vegetales apropiadas secuencias geneticas heterologas (por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos unidas operativamente a un promotor de la presente invencion) por medio del plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (descrito anteriormente). El plasmido Ti se transmite a las celulas vegetales mediante la infeccion por Agrobacterium tumefaciens y se integra de forma estable en el genoma de la planta (Schell, 1987, Science, 237:1176). Las especies que son sensibles a la Infeccion por Agrobacterium pueden ser transformadas in vitro. Los metodos de transformacion para producir plantas de sorgo transgenicas utilizando la transformacion mediada por Agrobacterium estan descritos en la Patente de los Estados Unidos 6.369.298.
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En algunas realizaciones, el vector se introduce a traves de la aceleracion baKstica de partmulas (Patente de los Estados Unidos n.° 4.945.050; Casas etal., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212).
En algunas realizaciones, despues de seleccionar el material vegetal transformado que puede expresar un gen heterologo que codifica una protema heterologa o su variante, se regeneran las plantas completas. La regeneracion de plantas a partir de protoplastos cultivados esta descrita por Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co. Nueva York, (1983); Vasil IR (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, vol. I (1984) y Vol. III, (1986)). Se sabe que muchas plantas pueden ser regeneradas a partir de celulas o tejidos cultivados, incluyendo, aunque sin limitacion, todas las especies principales de cana de azucar, remolacha azucarera, algodon, frutas y otros arboles, legumbres y verduras, y monocotiledoneas (por ejemplo, las plantas descritas anteriormente). Los medios para la regeneracion vanan entre especies de plantas, pero generalmente se proporciona en primer lugar una suspension de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterologo. Se forma el tejido del callo y a partir del callo se pueden inducir brotes y posteriormente provocar el arraigo.
Alternativamente, se puede inducir la formacion de embriones a partir de la suspension de protoplastos. Estos embriones germinan y forman plantas maduras. Los medios de cultivo contendran generalmente varios aminoacidos y hormonas, tales como auxina y citoquininas. Normalmente se desarrollan de forma simultanea los brotes y las rafces. La regeneracion eficaz dependera del medio, del genotipo y de los antecedentes del cultivo. La reproducibilidad de la regeneracion depende del control de estas variables.
Ejemplos
Ejemplo 1.- Resistencia a herbicidas en el genotipo de sorgo silvestre.
Se plantaron en un invernadero semillas de 83 poblaciones de sorgo silvestre de Bolivia para comparacion con Tx2783, un genotipo de sorgo de elite sensible a herbicidas. Se plantaron genotipos de sorgo silvestre en bandejas planas que conteman tierra para tiestos Metromix 360 (Sun Gro) y se dejaron crecer en el Invernadero. Se planto Tx2783 con plantas silvestres en cada bandeja plana para comparacion. En una seleccion usando cletodim, 18 dfas despues de la siembra, las plantas se pulverizaron con 0,10 kg del ingrediente activo cletodim/hectarea (0,09 libras/acre). Tx2783 y muchos de los sorgos silvestres murieron, pero las plantas tolerantes al herbicida se trasplantaron a tiestos para aumento de las semillas. En una seleccion usando fluoazifop-P, bandejas planas con Tx2783 y plantas silvestres, 18 dfas despues de la siembra se pulverizaron con una tasa de 0,13 kg de fluazifop- P/hectarea (0,12 libras/acre) y 32 dfas despues de la siembra con 0,40 kg de fluazifop-P/hectarea (0,36 libras/acre). Tx2783 y muchos de los sorgos silvestres murieron, pero las plantas tolerantes al herbicida se trasplantaron a tiestos para aumento de semillas. En un tercer experimento, 18 dfas despues de la siembra las plantas se pulverizaron con una tasa de 0,06 kg de quizalofop/hectarea (0,05 libras/acre) y 32 dfas despues de la siembra con 0,12 kg de quizalofop/hectarea (0,11 libras/acre). Tx2783 y muchos de los sorgos silvestres murieron, pero las plantas tolerantes al herbicida se trasplantaron a tiestos para aumento de semillas. Uno de los genotipos de sorgo silvestre, Bol-71, expreso altos niveles detolerancia para cada uno de los herbicidas.
Ejemplo 2.- Cruces del genotipo de sorgo silvestre Bol-71 con lmeas de sorgo de elite y determinacion de la herencia
Se cruzo Bol-71 con lmeas progenitoras de sorgo de elite incluyendo Tx430, 00MN7645, BTx623 y ATx623. El conjunto de semillas fue excelente en cada cruce lo que indica que el genotipo silvestre era sexualmente compatible con el sorgo cultivado y podfa ser utilizado en un programa de reproduccion de plantas para producir variedades de sorgo tolerantes a herbicidas.
El modo de herencia de la tolerancia a herbicidas se determino plantando semillas de Bol-71, la generacion F1 del cruce ATx623 x Bol-71 y Pioneer 84G62 (control sensible a herbicidas) en bandejas planas que conteman tierra para tiestos Metromix 360 en un invernadero utilizando un diseno de bloques completo al azar (n = 3). Las plantas se pulverizaron, 14 dfas despues de la siembra, con 0,504 kg de fluazifop-P/hectarea (0,045 libras/acre). La variedad Pioneer 84G62 murio entre los dfas 12 y 16 dfas despues de la pulverizacion. Los genotipos ATx623xBol-71 y Bol-71 no mostraron danos por el herbicida, lo que indica que el rasgo de tolerancia a herbicidas se transmitio al sorgo cultivado y que la tolerancia a herbicidas era al menos parcialmente dominante en los tnbridos F1.
Ejemplo 3.- Secuenciacion genica del gen de resistencia a ACC
Se iniciaron esfuerzos de secuenciacion de genes para determinar si una mutacion genetica podfa explicar el fenotipo de tolerancia a herbicidas. Se extrajo ADN de los genotipos tolerantes a herbicidas Bol-71 y r91 y los genotipos sensibles a herbicidas Bol-36, ATx623 y Tx430. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores descritos por Delye and Michel (Weed Research, 2005, 45: 323-330) se utilizo para amplificar las regiones del gen ACC asociadas a la expresion de la tolerancia a herbicidas. La secuenciacion del ADN (instalacion de secuenciacion de ADN de la Universidad del Estado de Kansas (Kansas State University)) de los productos resultantes de la PCR de genotipos de sorgo tolerantes y sensibles a herbicidas revelo que los genotipos sensibles
conteman la secuencia de tipo natural para el gen ACC como la indicada para sorgo (secuencia de la base de datos The Institute for Genomic Research (TIGR) Plant Transcript Assemblies denominada TA3768_4558; vease tambien la Tabla 1 siguiente) y otras especies de cultivos de cereales; sin embargo, los genotipos tolerantes a herbicidas conteman una mutacion genetica de TGG a TGC que da como resultado una conversion del aminoacido 5 Trp2027Cys (SEQ ID NO: 1) en la enzima (Fig. 1; vease Delye and Michel, Weed Research 2005 para la numeracion de los aminoacidos). Esta mutacion es similar a la descrita en la cola de zorra (Alopecurus myosuroides Huds.) tolerante a herbicidas por Delye et al. Plant Physiology 2005). La cola de zorra es una especie de mala hierba y el unico lugar en la naturaleza donde esta documentada de esta mutacion, y la mutacion no ha sido descrita en el sorgo ni en otras especies de cultivo, ni se ha descrito como una diana para desarrollar cultivos tolerantes a 10 herbicidas.
Tabla 1.- Secuencia de la ACC-carboxilasa de sorgo (SEQ ID NO:1)
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SEQ ID NO: 2.- Secuencia de la ACC-carboxilasa de sorgo que incorpora la mutacion TGC que confiere resistencia a herbicidas
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TGGCAGAGCAAANCTTGGAGGAATTCCTGTGGGTGTCATAGCTGTGGAGACACAGAC
CATGATGCAGCTTGTCCCTGCTGATCCAGGTCAGCTTGATTCCCATGAGCGATCCGT
TCCTCGGGCTGGACAAGTGTGGTTCCCAGATTCTGCAACCAAGACAGCTCAGGCATT
ATTAGACTTCAACCGTGAAGGATTGCCTCTGTTTATCCTGGCTAACTGCAGAGGTTT
CTCTGGTGGACAGAGAGATCTCTTTGAAGGAATTCTTCAGGCTGGGTCAACAATTGT
CGAGAACCTTAGGACATATAATCAGCCTGCGTTTGTCTACATTCCTATGGCTGGAGA
GCTTCGTGGAGGAGCTTGGGTTGTGGTCGATAGCAAAATAAATCCAGACCGCATTGA
GTGTTATGCTGAGAGGACTGCCAAAGGTAATGTTCTCGAACCTCAAGGGTTAATTGA
AATCAAGTTCAGGTCAGAGGAACTCCAAGACTGTATGGGTAGGCTTGACCCCGAGTT
GATAAATCTGAAAGCAAAACTCCAAGATGTAAAGCATGGAAATGGAAGTCTACCAGA
CATAGAATCCCTTCAGAAGAGTATAGAAGCACGTACGAAACAG'rTGCTGCGTTTATA
TACCCAGATTGCAATACGGTTTGCTGAATTGCATGATACTTCCCTAAGAATGGCAGC
TAAAGGCGTGATTAAGAAAGTTGTAGACTGGGAAGAATCACGCTCTTTCTTCTATAA
AAGGCTACGGAGAAGGATCTCTGAAGATGTTCTTGCAAAAGAAATAAGACATATAGT
CGGTGACAACTTCACTCACCAATCAGCAATGGAGCTCATCAAGGAATGGTACCTGGC
TTCTCCAGCCACAGCAGGAAGCACTGGATGGGATGACGATGATGCATTTGTTGCCTG
GAAGGACAGTCCTGAAAACTACAATGGATATATCCAAGAGCTAAGGGCTCAAAAAGT
GTCTCAGTCGCTCTCTGATCTCACTGACTCCAGTTCAGATCTACAAGCATTCTCGCA
GGGTCTTTCTACGCTATTAGATAAGATGGATCCCTCTCAAAGAGCGAAGTTTGTTCA
GGAAGTCAAGAAGGTCCTTGGTTGATGATATGATACCAACACATCCAACACTATGTG
CATGCTACATGTTTTTGTTCAAGTACATACATAGAAGGATATTGCTTGGCCTCGTTT
GCTTGGCCGTTTGATCATGTCTGATCTAAGTCGACCATTATTTGTTGAAACTTCCTT
tttggacctggtgctatggttgatgaatgtatattggacgtgtgcgactgtgcgttc
TGCCAGGTGTAAGCTCAAATGTTTAGACAGACCGAGTTATGGTTAGGAAGAGCACGA
GTGAACATGTTCTGGTTTTGCAGTGGTTCAGGAAGGCAGAAAGTTGTTTCACTGTAG
TTCTGAGATGTACTACCAGCGGCCCCCTGCTGTAATTTTAGGGTGTATAATGCGGAT
ACTAGTAAAACAATTGAGTGGTTCATTAAATTTTGAACTCGAATAATGTTTTTCTAG
GCATATGTACCGTACCTCTACGTGAAATAAATGCTGTTGAAATAGCATTCGACACCA
GAATATATGTACCTTACCTAAGAGCTAAGTATTATAATACAACAAGTTGCTGGCCGT
AAGATTTCTTT
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Kansas State University Research Foundation
<120> Sorgo resistente a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa
<130> 69.67.102834/01
<150> EP08705880.6 <151>
<150> PCT/US2008/050856 <151>
<150> US 60/880.125 <151>
<160>2
<170> Patent In version 3.5
<210> 1 <211>1664 <212> ADN
<213> Sorghum bicolor <220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13)
<223> n es desconocido
<400> 1
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- tggcagagca
- aancttggag gaattcctgt gggtgtcata gctgtggaga cacagaccat 60
- gatgcagctt
- gtccctgctg atccaggtca gcttgattcc catgagcgat ccgttcctcg 120
- ggctggacaa
- gtgtggttcc cagattctgc aaccaagaca gctcaggcat tattagactt 130
- caaccgtgaa
- ggattgcctc tgtttatcct ggctaactgg agaggtttct ctggtggaca 240
- gagagatctc
- tttgaaggaa ttcttcaggc tgggtcaaca attgtcgaga accttaggac 300
- atataatcag
- cctgcgtttg tctacattcc tatggctgga gagcttcgtg gaggagcttg 360
- ggttgtggtc
- gatagcaaaa taaatccaga ccgcattgag tgttatgctg agaggactgc 420
- caaaggtaat
- gttctcgaac ctcaagggtt aattgaaatc aagttcaggt cagaggaact 480
- ccaagactgt
- atgggtaggc ttgaccccga gttgataaat ctgaaagcaa aactccaaga 540
- tgtaaagcat
- ggaaatggaa gtctaccaga catagaatcc cttcagaaga gtatagaagc 600
- acgtacgaaa
- cagttgctgc ctttatatac ccagattgca atacggtttg ctgaattgca 660
- tgatacttcc
- ctaagaatgg cagctaaagg cgtgattaag aaagttgtag actgggaaga 720
- atcacgctct
- ttcttctata aaaggctacg gagaaggatc tctgaagatg ttcttgcaaa 780
- agaaataaga
- catatagtcg gtgacaactt cactcaccaa tcagcaatgg agctcatcaa 840
- ggaatggtac
- ctggcttctc cagccacagc aggaagcact ggatgggatg acgatgatgc 900
- atttgttgcc
- tggaaggaca gtcctgaaaa ctacaatgga tatatccaag agctaagggc 960
- tcaaaaagtg
- tctcagtcgc tctctgatct cactgactcc agttcagatc tacaagcatt 1020
- ctcgcagggt
- ctttctacgc tattagataa gatggatccc tctcaaagag cgaagtttgt 1080
- tcaggaagtc
- aagaaggtcc ttggttgatg atatgatacc aacacatcca acactatgtg 1140
- catgctacat
- gtttttgttc aagtacatac atagaaggat attgcttggc ctcgtttgct 1200
- tggccgtttg
- atcatgtctg atctaagtcg accattattt gttgaaactt cctttttgga 1260
- cctggtgcta
- tggttgatga atgtatattg gacgtgtgcg actgtgcgtt ctgccaggtg 1320
- taagctcaaa
- tgtttagaca gaccgagtta tggttaggaa gagcacgagt gaacatgttc 1380
- tggttttgca
- gtggttcagg aaggcagaaa gttgtttcac tgtagttctg agatgtacta 1440
- ccagcggccc
- cctgctgtaa ttttagggtg tataatgcgg atactagtaa aacaattgag 1500
- tggttcatta
- aattttgaac tcgaataatg tttttctagg catatgtacc gtacctctac 1560
- gtgaaataaa
- tgctgttgaa atagcattcg acaccagaat atatgtacct tacctaagag 1620
- ctaagtatta
- taatacaaca agttgctggc cgtaagattt cttt 1664
<210>2 <211> 1664 <212> ADN
<213> Sorghum bicolor <220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13)
<223> n es desconocido
<400> 2
Claims (14)
- 510152025303540455055REIVINDICACIONES1. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a la inhibicion de la acetil-CoA carboxilasa por herbicidas, en la que dicha secuencia comprende:(i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos un 95% homologa a la misma que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1; o(ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.° PTA-8033, ATCC. n.° PYA-8034 o una secuencia al menos un 95% homologa a las mismas, que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la sEq ID NO: 1.
- 2. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que la secuencia de aminoacidos codificada es una acetil-CoA carboxilasa resistente a los herbicidas y en la que dicha sustitucion de secuencia de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1 da como resultado la sustitucion de aminoacidos de triptofano a cistema.
- 3. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 unida operablemente a un promotor y otras secuencias reguladoras.
- 4. Una molecula de ADN recombinante que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 unida operablemente a un promotor.
- 5. Una celula que comprende el vector de la reivindicacion 3 o la molecula de ADN recombinante de la reivindicacion 4, en la que la celula es una celula vegetal.
- 6. Un virus de plantas de ARN (+) que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
- 7. Una parte de planta de Sorghum bicolor que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
- 8. La parte de planta de sorgo de la reivindicacion 7, en la que la parte de planta es una semilla o un tejido vegetal.
- 9. Un metodo para transformar una celula vegetal que comprende transformar dicha celula con el vector de la reivindicacion 3 o la molecula de ADN de la reivindicacion 4.
- 10. El metodo de la reivindicacion 9, que demas comprende la etapa de regenerar una plana transgenica a partir de la celula vegetal transformada.
- 11. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que dicha secuencia de acido nucleico comprende:(i) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1, que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1; o(ii) un gen resistente de la acetil-CoA carboxilasa tal como se encuentra en ATCC. n.° PTA-8033, ATCC. n.° PYA-8034 que ademas comprende la sustitucion de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1.
- 12. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 11, en la que la secuencia de aminoacidos codificada es una acetil-CoA carboxilasa resistente a los herbicidas y en la que dicha sustitucion de secuencia de nucleotido de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1 da como resultado la sustitucion de aminoacidos de triptofano a cistema.
- 13. El polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 11 o 12.
- 14. El polipeptido de la reivindicacion 13, en el que el polipeptido es una acetil-CoA carboxilasa resistente a los herbicidas y en el que dicha sustitucion de secuencia de nucleotidos de guanina sustituida por citosina en la posicion 220 de la SEQ ID NO: 1 da como resultado la sustitucion de aminoacidos de triptofano a cistema.FIGURA 1Bol-71: tolerant® a herbicides Inhibidores de ACC R91: tolerante a herbicides Inhibidores de ACCBol-36: sensible a herblcldas inhibidores de ACC ATx623: sensible a herblcldas Inhibidores de ACCTx430: sensible a herblcldas Inhibidores de ACC Bol-36: sensible a herblcldas inhibidores de ACC R91: tolerante a herblcldas Inhibidores de ACC Bol-71: tolerante a herblcidas Inhibidores de ACC R91: tolerante a herbicides Inhibidores de ACC ATx623: sensible a herblcldas inhibidores de ACC
- 990 1000 1010
- y c u
- TGC AGAGGTTTCTCTGGTGGACAGAGAGATCTCT
- QPP p lX 7\ p
- TGC AGAGGTTTCTC TGGTGGACAGAGAGATCTCT
- P P P “I 7\ 7*. p
- TGG 7s p 7s p pi p|||ff||§fj pp p pptp p p p 7, p 7> p. a pp! iff®§®
- TGG AGAGG11IC1GIGGIGGAl AGAGAGAIG1C1
- pppp&^VP
- IGG i 118gB9BSi IS 8SS 1 r i i 11® i * i m mi p
- GGCT AA
- TGG AGAGGTTTCTCTGGTGGACAGAGAGATCTCT
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