ES2636453T3 - Procedimiento de purificación o de detección de una proteína diana - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar específicamente un factor de la coagulación, a partir de una solución biológica que proviene de un animal transgénico no humano que contiene dicho factor de la coagulación y que es susceptible de contener una proteína homóloga a dicho factor de la coagulación, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: a) proporcionar un soporte sólido que comprende un aptámero de ADN inmovilizado a dicho soporte sólido a través de un espaciador, caracterizado por que dicho aptámero inmovilizado se une específicamente a dicho factor de la coagulación, pero no se une a una proteína homóloga a dicho factor de coagulación. b) poner en contacto dicho soporte sólido con dicha solución biológica, y c) recuperar el factor de la coagulación unido a dicho aptámero.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento de purificacion o de deteccion de una protema diana Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de la purificacion segun la reivindicacion 1. La invencion se refiere en particular a la utilizacion de un aptamero para la purificacion o la deteccion espedfica de protemas de interes en unos medios, en particular unas soluciones, susceptibles de comprender tambien unas protemas homologas a las protemas de interes.
Tecnica anterior
Los procedimientos de purificacion y de deteccion de una protema de interes, que puede ser tambien designada como “protema diana”, comprenden generalmente una etapa de puesta en contacto del medio a analizar, susceptible de contener la protema de interes, con unos compuestos que tienen la capacidad de unirse a dicha protema de interes. Estos compuestos capaces de unirse a una protema diana pueden ser de diferentes naturalezas. Puede tratarse (i) de compuestos organicos que comprenden unos grupos qmmicos que poseen unas propiedades de union a protemas (tales como DEAE, amonio cuaternario, cadena alquilo, silanol), (ii) protemas (tales como anticuerpos), glicosaminoglicanos (heparina), colorantes (cibacron blue F3GA) o acidos nucleicos (tales como aptameros).
La eficacia de un procedimiento de purificacion o de deteccion de una protema diana esta relacionada en particular con la afinidad y a la especificidad del compuesto que se une a la protema diana.
Con algunos medios de partida de composicion compleja, en particular con unas soluciones de partida que comprenden numerosas protemas distintas, una protema diana de interes sigue siendo diffcil de purificar y de detectar. Este es el caso, en particular, con los medios complejos de partida en los que la protema diana a purificar o a detectar coexiste con una o varias protemas distintas, pero fuertemente homologas. En efecto, cuando la protema diana se encuentra en solucion con una o varias protemas homologas a esta protema diana, se hace entonces diffcil desarrollar unas herramientas de purificacion o de deteccion que permitan realizar un alto nivel de discriminacion entre la protema de interes y la o las protema(s) homologa(s) indeseable(s), utilizando unos metodos clasicos de purificacion o de deteccion. Incluso los anticuerpos, conocidos por su gran especificidad frente a protemas dianas, reaccionan frecuentemente de manera cruzada (“cross reactivity”) tambien con varias protemas que presentan una homologfa de estructura con las protemas dianas.
La dificultad de purificar o detectar espedficamente unas protemas que presentan una homologfa entre sf representa un inconveniente en numerosos campos de aplicacion, ya sea en el campo de la investigacion academica, que tiene como objetivo estudiar espedficamente una protema diana, independientemente de una eventual protema homologa de la protema diana, o bien en la industria, por ejemplo para el desarrollo de nuevas herramientas de deteccion o de purificacion mas eficaces y, llegado el caso, que tengan una mejor compatibilidad con las exigencias administrativas o reglamentarias que las herramientas de purificacion o de deteccion conocidas.
La dificultad de purificar o detectar espedficamente unas protemas que presentan una homologfa entre sf se encuentra cuando una protema (aqrn denominada protema transgenica) se produce en una forma recombinante en un organismo o un microorganismo transgenico que expresa tambien naturalmente una protema homologa de dicha protema transgenica. Se mencionan en particular las protemas recombinantes producidas en organismos que poseen de manera natural en su genoma un gen denominado “ortologo” que codifica una protema fuertemente homologa a la protema recombinante codificada por un transgen.
Es habitual que una protema transgenica humana o animal expresada en un animal transgenico sea la homologa de una protema endogena expresada naturalmente en el animal transgenico. La produccion de la protema natural endogena homologa representa un inconveniente tecnico importante en situaciones en las que se busca evitar la realizacion de una co-extraccion o de una co-deteccion de la protema transgenica y de la protema natural endogena homologa.
Cuando la protema recombinante transgenica consiste en una protema de interes terapeutico, destinada a la fabricacion de un medicamento, la presencia, en la preparacion purificada de la protema recombinante, de cualquier protema endogena homologa de la protema transgenica puede conllevar unos efectos indeseables para el paciente al que se administra el medicamento, incluyendo la induccion de una respuesta inmunitaria indeseable contra la protema natural contaminante, que es susceptible de reducir la eficacia del tratamiento medico e incluso a veces provocar unas respuestas auto-inmunes de naturaleza como para poner en peligro la vida del paciente. Tales problemas se encuentran cada vez mas a menudo con el uso creciente de la fabricacion de protemas transgenicas terapeuticas en animales transgenicos. A fin de proponer unos productos terapeuticos que tengan una alta inocuidad, las protemas transgenicas deben por lo tanto ser purificadas espedficamente, en presencia de muy bajas cantidades de protemas homologas indeseables, y si es posible en ausencia total de protemas homologas indeseables. Asimismo, los metodos de deteccion de protemas dianas de interes deben ser espedficos, sensibles y
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Los aptameros de tipo ARN, moleculas de acido ribonucleico monocatenario, seleccionados segun un procedimiento conocido bajo el nombre de SELEX, son capaces de unir espedficamente unas protemas de interes. En la publicacion Liu et al. RNA aptamers specific for bovine thrombin, J. Mol. Recognit., 2003: 16, 23-27, el autor presenta un aptamero de tipo ARN que se une a la trombina bovina, pero que no se une a la trombina humana. Este artmulo, aunque aislado, muestra que es posible seleccionar por el procedimiento SELEX unos aptameros ARN de alta especificidad capaces de discriminar unas protemas homologas en solucion.
Sin embargo, hoy en dfa, no se ha descrito en la bibliograffa ningun procedimiento industrial que utiliza unos aptameros de alta especificidad que sirvan para discriminar unas protemas homologas.
La utilizacion de los aptameros de alta especificidad se enfrenta a numerosos problemas tecnicos. En primer lugar, los aptameros se seleccionan en solucion segun el procedimiento SELEX. Para ser utilizado en un procedimiento de purificacion o de deteccion, el aptamero debe ser inmovilizado sobre un soporte solido. Ahora bien, numerosas publicaciones muestran que las propiedades de union del aptamero (afinidad, especificidad, etc.) son alteradas cuando el aptamero es inmovilizado. Ademas, los aptameros de tipo ARN, unico tipo de aptamero de alta especificidad descrito en la tecnica anterior, son unas moleculas muy labiles que se degradan a temperatura ambiente. Los aptameros de ARN no son por lo tanto compatibles con los procedimientos industriales de purificacion o de deteccion. Los ARN qdmicamente modificados podnan constituir una alternativa, pero el coste de smtesis actual para tales moleculas es totalmente incompatible con una utilizacion industrial.
Debido a su gran afinidad y a su especificidad relativamente elevada para protemas de interes, los anticuerpos son ampliamente utilizados en los procedimientos de purificacion o de deteccion de protemas.
Sin embargo, la utilizacion de los anticuerpos no siempre es muy adecuada para la purificacion o la deteccion de una protema diana. En efecto, los anticuerpos son fabricados en sistemas biologicos con todos los inconvenientes que esto comporta, incluyendo los riesgos de contaminacion por agentes patogenos, o tambien la dificultad de purificar los anticuerpos fabricados. Ademas, los anticuerpos son generalmente inmunogenicos y pueden inducir fuertes reacciones inmunitarias si se administran a un paciente. Asf, cuando un anticuerpo se utiliza para purificar una protema terapeutica, existe un riesgo de encontrarse con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en la solucion que contiene la protema terapeutica y, por lo tanto, de generar unos efectos indeseables en el paciente al que se administra tal solucion. Es por ello que la utilizacion de los anticuerpos en procedimientos de purificacion se ha vuelto diffcilmente compatible con algunas exigencias administrativas, en particular en los campos agroalimenticio y farmaceutico. Se puede anadir que, con los anticuerpos, los medios de higienizacion son limitados, debido a su naturaleza proteica fragil, en particular cuando son utilizadas (i) en condiciones desnaturalizantes (por ejemplo en presencia de urea, de DMSO, etc.), (ii) unos pH muy acidos o muy basicos, (iii) algunos disolventes organicos perjudiciales, o tambien (iv) unas temperaturas elevadas. En ultima instancia, se recuerda que la seleccion de anticuerpos es larga (6 meses aproximadamente) y la produccion de un anticuerpo purificado es compleja de realizar, lo que conlleva unos costes de seleccion y de fabricacion relativamente elevados.
Existe por lo tanto una necesidad de desarrollo de nuevas herramientas de purificacion o de deteccion de protemas de interes, que sean eficaces, que sean mas simples de aplicar y que sean mas seguros que los procedimientos conocidos. Tales procedimientos mejorados deben permitir la purificacion o la deteccion selectiva de una protema diana presente en una solucion cuando dicha solucion es susceptible de contener tambien una protema homologa a la protema diana. Mas particularmente, existe una necesidad para el desarrollo de nuevas herramientas de purificacion o de deteccion que permiten mejorar las condiciones de seguridad y de inocuidad para el ser humano de los productos procedentes de la produccion de las protemas transgenicas terapeuticas a partir de organismos transgenicos.
Resumen de la invencion
La presente invencion tiene por objeto un procedimiento para la purificacion segun a reivindicacion 1 de una protema diana presente en una solucion, comprendiendo dicho procedimiento, previamente a la realizacion de la etapa de purificacion, una etapa de puesta en contacto de dicha solucion con un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente a dicha protema diana pero no uniendose a una protema homologa a dicha protema diana susceptible de estar tambien presente en solucion.
La presente invencion se refiere por lo tanto tambien a la utilizacion de un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente a una protema diana, para la purificacion o la deteccion de dicha protema diana presente en una solucion, caracterizada por que dicho aptamero inmovilizado no se une a una protema homologa de dicha protema diana y por que dicha solucion es susceptible de contener al menos una protema homologa de dicha protema diana.
La presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para purificar espedficamente una protema diana a
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partir de una solucion que contiene dicha protema diana y que es susceptible de contener una protema homologa de la protema diana que comprende las etapas de (i) proporcionar un soporte solido que comprende un aptamero de ADN inmovilizado sobre dicho soporte solido a traves de un espaciador, caracterizado por que dicho aptamero inmovilizado se une espedficamente a dicha protema diana, pero no se une a una protema homologa de la protema diana, (ii) poner en contacto dicho soporte solido con dicha solucion, y (iii) recuperar la protema diana unida a dicho aptamero.
Descripcion de las figuras
La figura 1 ilustra la union entre un aptamero que se une espedficamente al FVII humano y al FVII humano plasmatico (FVII HP). La figura 1 representa un grafico que representa la union, en funcion del tiempo, del aptamero anti-FVII humano y del FVII HP a concentraciones en FVII HP comprendidas entre 50 y 400 nM.
La figura 2 ilustra la especificidad de la interaccion entre un aptamero inmovilizado sobre un chip y el FVII HP. La figura 2 representa un grafico que representa la union, en funcion del tiempo, del aptamero que se une espedficamente al FVII humano inmovilizado sobre un chip y del FVII HP en presencia o no de un anticuerpo policlonal anti-FVII.
La figura 3 ilustra la ausencia de union entre el aptamero que se une espedficamente al FVII humano y el FVII de conejo. La figura 3 representa un grafico que representa la union, en funcion del tiempo, del aptamero que se une espedficamente al FVII humano y el FVII de conejo a concentraciones en FVII de conejo comprendidas entre 50 y 400 nM.
La figura 4 ilustra las diferencias de afinidad entre el aptamero que se une espedficamente al FVII humano y el FVII HP, el FVII de conejo o el FVII humano transgenico. La figura 4 representa un grafico que representa la union, en funcion del tiempo, del aptamero que se une espedficamente al FVII humano y el FVII HP, el FVII de conejo o el FVII humano transgenico a una concentracion de 400 nM para cada FVII.
Descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un procedimiento para la purificacion de una protema diana presente en una solucion, comprendiendo dicho procedimiento, previamente a la realizacion de la etapa de purificacion, una etapa de puesta en contacto de dicha solucion con un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente a dicha protema diana pero no uniendose a una protema homologa a dicha protema diana susceptible de estar tambien presente en solucion.
La invencion se refiere tambien a la utilizacion de un ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente a una protema diana, para la purificacion o la deteccion de dicha protema diana presente en una solucion, caracterizada por que dicho aptamero inmovilizado no se une a una protema homologa de la protema diana y por que dicha solucion es susceptible de contener al menos una protema homologa de la protema diana.
En el procedimiento para la purificacion de una protema diana de interes, se forma selectivamente un complejo entre (i) dicho aptamero que reconoce espedficamente una protema diana determinada y (ii) la protema diana, si esta esta contenida en el medio de partida, tfpicamente la solucion de partida. Despues, la protema diana a purificar se recupera por disociacion del complejo previamente formado con dicho aptamero.
En el procedimiento para la deteccion de una protema diana de interes, se forma selectivamente un complejo entre (i) dicho aptamero que reconoce espedficamente una protema diana determinada y (ii) la protema diana, si esta esta contenida en el medio de partida, tfpicamente la solucion de partida. Despues, se detectan en particular (i) o bien los complejos formados entre dicho aptamero y dicha protema de interes, (ii) o bien la protema diana de interes, ya sea complejada a dicho aptamero o en forma libre despues de la disociacion de los complejos previamente formados.
El objeto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para purificar espedficamente una protema diana a partir de una solucion que contiene dicha protema diana y que es susceptible de contener una protema homologa de la protema diana que comprende las etapas de:
a) proporcionar un soporte solido que comprende un aptamero de ADN inmovilizado sobre dicho soporte solido a traves de un espaciador, caracterizado por que dicho aptamero inmovilizado se une espedficamente a dicha protema diana, pero no se une a una protema homologa de la protema diana,
b) poner en contacto dicho soporte solido con dicha solucion, y
c) recuperar la protema diana unida a dicho aptamero.
La presente solicitud divulga tambien un procedimiento para detectar espedficamente una protema diana a partir de
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una solucion que contiene dicha protema diana, y que es susceptible de contener una protema homologa de la protema diana que comprende las etapas de:
a) poner en contacto dicha solucion con un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente a dicha protema diana pero no uniendose a dicha protema homologa de la protema diana, y
b) detectar los complejos formados entre dicho aptamero y dicha protema diana.
El termino “aptamero”, tal como se utiliza aqrn, designa una molecula de acido nucleico monocatenario capaz de unirse de manera espedfica a una protema. Los aptameros comprenden generalmente entre 5 y 120 nucleotidos y pueden ser seleccionados in vitro segun un procedimiento conocido bajo el nombre de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponantial Enrichment). Los aptameros presentan numerosas ventajas. Por su naturaleza oligonucleotidica, los aptameros poseen una baja inmunogenicidad y una resistencia importante en condiciones fisicoqmmicas rigurosas (presencia de urea, de DMSO, de un pH muy acido o muy basico, utilizacion de disolventes organicos o de temperatura elevada) que permiten unas estrategias de higienizacion variadas en el ambito de un uso como ligando de afinidad. Ademas, su selectividad es importante. Finalmente, la produccion de aptameros implica unos costes relativamente limitados.
El termino “aptamero de ADN”, tal como se utiliza aqrn, designa un aptamero constituido de desoxirribonucleotidos, a diferencia de los aptameros de ARN, que estan constituidos de ribonucleotidos. Los aptameros de ADN presentan la ventaja de ser estables en solucion, y por lo tanto explotables industrialmente para la purificacion o la deteccion de una protema diana.
El termino “protema”, tal como se usa aqrn, corresponde a un polfmero de aminoacidos. Esto comprende las protemas, los fragmentos de protema, las protemas modificadas geneticamente, los oligopeptidos y sus analogos. La protema puede ser un anticuerpo, una protema antiviral, una hormona, un factor de crecimiento, un factor de coagulacion, tal como el factor VII (FVII), el factor VIII (FVIII), el factor X (FX), el factor IX (Factor IX), el factor XI (FXI), el factor XII (FXII), el factor XiII (FXIII), el factor II (trombina), la antitrombina III (AT III), el cofactor II de la heparina (HCII), la protema C (PC), la trombomodulina (TM), la protema S (PS), el factor V (FV), el factor de Willlerbrand (FvW) y el inhibidor de la via del factor tisular (TFPI). Preferentemente, la protema es un FVII natural o modificado, o un fragmento de este.
Como ya se ha indicado anteriormente, se utiliza en los procedimientos de la invencion un “aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador” (tambien denominado “aptamero” en lo que sigue de la descripcion) que tiene la capacidad de unirse selectivamente a una protema diana determinada, poseyendo dicho aptamero una capacidad reducida o nula para unirse a unas protemas “homologas” a dicha protema diana determinada. Esto significa que se utilizan, segun la invencion exclusivamente, unos aptameros que tienen excelentes propiedades de discriminacion entre la protema diana de interes y unas protemas distintas de dicha protema diana, a pesar de que poseen una estructura similar a la de dicha protema diana.
En algunos modos de realizacion de la invencion, la capacidad del aptamero utilizado para discriminar la protema diana de las protemas “homologas” a la protema diana es tal que dicho aptamero posee una afinidad para la protema diana de interes definida por un valor de constante de disociacion (Kd), expresado en concentracion molar, que es inferior en al menos un orden de tamano con respecto a la constante de disociacion de dicho aptamero para la protema “homologa” mas similar conocida.
En algunos otros modos de realizacion de la invencion, el aptamero no se une a una protema “homologa” a la protema diana de interes. Segun la invencion, un aptamero no se une a una protema homologa cuando la union de la protema homologa a dicho aptamero no es detectable segun las tecnicas de medicion convencionales, por ejemplo segun la tecnica de deteccion y de medicion de fijacion de tipo Biacore®. A tftulo ilustrativo, se ha mostrado en los ejemplos que el aptamero de secuencias SEC ID n° 1 que se une selectivamente al Factor VII humano no se une de manera detectable al Factor VII de conejo, utilizando la tecnica de medicion de union Biacore®.
La “protema diana” con la que se une selectivamente el aptamero puede ser cualquier tipo de protema. La protema diana puede en particular consistir en una protema de interes terapeutico.
La “protema homologa” o “protema homologa a la protema diana” consiste en una protema que presenta una gran homologfa estructural con la protema diana.
El termino “homologfa” tal como se utiliza en la presente invencion corresponde a homologfas que son esencialmente de dos naturalezas, respectivamente (i) una homologfa que resulta de diferencias en la secuencia de aminoacidos entre la protema diana y la protema homologa, y (ii) una homologfa que resulta de diferencias en los grupos qmmicos adicionales fijados de manera covalente sobre las cadenas laterales de los aminoacidos, incluyendo diferencias en las cadenas osfdicas. El experto en la materia comprende facilmente que la protema de interes y una protema “homologa” pueden distinguirse al mismo tiempo por diferencias en la secuencia de
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aminoacidos y por diferencias en las cadenas os^dicas. A tftulo ilustrativo, la combinacion de los dos tipos de diferencias estructurales se encuentra cuando una diferencia en la secuencia de aminoacidos tiene lugar en un aminoacido que consiste en un sitio de glicosilacion de la protema diana o de la protema homologa.
Segun la invencion, la protema diana determinada y una protema homologa correspondiente tienen unas secuencias que poseen entre sf al menos un 50% de identidad en aminoacidos. Segun la invencion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias en aminoacidos, o entre dos secuencias de nucleotidos, se puede calcular por Emboss matcher, EBLOSUM62 utilizando los parametros por defecto, incluyendo Gap_penalty: 10,0 y Extended_penalty: 0,5.
Preferentemente, la identidad de secuencia en aminoacidos entre la protema diana y la protema homologa es de al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o el 99%.
Como se ha indicado anteriormente, la distincion entre la protema diana de interes y la protema homologa puede resultar de diferencias en la glicosilacion de estas dos protemas. Una diferencia de glicosilacion se refiere a dos protemas que tienen la misma secuencia en aminoacidos o que tienen unas secuencias en aminoacidos similares, pero cuyas estructuras glicanicas difieren. Las estructuras glicanicas son unas cadenas de azucares injertadas a las protemas a nivel de secuencias de consenso de aminoacidos. Las diferencias de glicosulacion pueden referirse a las N- u O-glicosilaciones, asf como a las ramificaciones glicosfdicas que se forman en estas N- u O-glicosilaciones. La diferencia de glicosilacion pude referirse a la presencia o ausencia de tales cadenas o ramificaciones, pero tambien a la presencia o la ausencia de ciertos azucares tales como los restos de fucosa, manosa, glucosamina o galactosamina. La glicosilacion de las protemas se puede analizar de diferentes maneras. Un metodo de analisis de la glicosilacion consiste en desglicosilar una protema con una o varias enzimas (PNGasaF, N-glicosidasa) o qmmicamente (hidrasinolisis, p-eliminacion) despues en analizar directamente los glicanos obtenidos sobre gel, electroforesis capilar o HPLC (con deteccion ultravioleta, fluorescente o de espectrometna de masa) o analizar despues de la despolimerizacion enzimatica (Neuraminidasa y -galactosidasa) o qmmica (hidrasinolisis, p- eliminacion) con el objetivo de secuenciar los glicanos. Otro metodo de analisis consiste en emplear la espectrometna de masa en la protema entera, estas tecnicas son conocidas bajo los nombre de MALDI (Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionisation), MALDI-TOF (Time Of Flight), ESI (Electrospray Ionisation).
En algunos modos de realizacion de la invencion, un aptamero segun la invencion consiste en un aptamero que se une espedficamente a un factor de la coagulacion seleccionado entre el factor VII (FVII), el factor VIII (FVIII), el factor X (FX), el factor IX (Factor IX), el factor XI (FXI), el factor XII (FXII), el factor XIII (FXIII), el factor II (TROMBINA), la antitrombina III (AT III) el cofactor II de la heparina (HCII), la protema C (PC), la trombomodulina (TM), la protema S (PS), el factor V (FV), el factor de Willlerbrand (FvW) y el inhibidor de la via del factor tisular (TFPI). Ventajosamente, el aptamero se une espedficamente al FVII. Preferentemente, el aptamero segun la invencion se une espedficamente al FVII humano pero no se une al FVII de conejo. A la inversa, un aptamero segun la invencion se une al FVII de conejo pero no se une al FVII humano.
Un aptamero que se une espedficamente a un FVII humano pero que no se une a un FVII de conejo puede ser un aptamero que tiene una secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 80% de identidad en nucleotidos con la secuencia SEC ID n°1.
Ventajosamente, el aptamero de la invencion se une a la protema diana con una afinidad caracterizada por un valor de constante de disociacion (Kd) comprendido entre 1 pM y 10 |iM, preferentemente comprendido entre 10 nM y 10 |iM. Ventajosamente, la afinidad del aptamero para la protema diana es de 1000 a 10000 veces superior a la afinidad del aptamero para la protema homologa.
En el procedimiento de purificacion o de deteccion segun la invencion, el aptamero de ADN esta inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador. El aptamero inmovilizado sobre un soporte solido es particularmente muy adecuado para la deteccion o la purificacion de una protema diana presente en una solucion.
El termino “espaciador” tal como se utiliza aqm designa una molecula que esta intercalada entre el aptamero y el soporte solido. Ventajosamente, el espaciador esta unido al mismo tiempo a un extremo del aptamero y al soporte solido. Esta construccion con espaciador tiene como ventaja no inmovilizar directamente el aptamero sobre el soporte solido. La naturaleza del espaciador puede ser seleccionada segun los conocimientos del experto en la materia, preferentemente el espaciador es una secuencia oligonucleotfdica no espedfica o un polietilenglicol (PEG). Cuando se trata de una secuencia oligonucleotfdica no espedfica, dicha secuencia comprende preferentemente al menos 5 nucleotidos, preferentemente entre 5 y 15 nucleotidos.
Para inmovilizar el aptamero sobre un espaciador, el aptamero puede ser modificado qmmicamente con diferentes grupos qmmicos, tales como unos grupos que permiten inmovilizar el aptamero de manera covalente tales como tioles, aminas o cualquier otro grupo capaz de reaccionar con unos grupos qmmicos presentes sobre el soporte, o unos grupos que permiten inmovilizar el aptamero de manera no covalente tales como el sistema biotina- estreptavidina. Estas tecnicas son tambien aplicables para inmovilizar el espaciador sobre el soporte solido.
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Una vez inmovilizado sobre el soporte solido a traves del espaciador, el aptamero es ventajosamente modificado en su extremo libre (extremo no unido al espaciador) gracias a, y sin limitarse a ello, un nucleotido qmmicamente modificado (tal como el 2'ometilo o 2'fluoropirimidina, 2'ribopurina, fosforamidita), un nucleotido invertido o un grupo qmmico (PEG, policationes, colesterol). Estas modificaciones permiten proteger el aptamero de las degradaciones enzimaticas.
El soporte solido puede ser una columna de cromatograffa de afinidad compuesta de un gel derivado de la agarosa, de la celulosa o de un gel sintetico, tal como un derivado de acrilamida, metacrilato o poliestireno; un chip tal como un chip adaptado para la resonancia plasmonica de superficie; una membrana tal como una membrana de poliamida, poliacrilonitrilo o poliester; una perla magnetica o paramagnetica.
Ventajosamente, la solucion que contiene la protema diana y que es susceptible de contener una protema homologa de la protema diana es una solucion biologica tal como un fluido corporal, una celula, un triturado celular, un tejido, un triturado tisular, un organo o un organismo entero. Preferentemente, la solucion es una solucion biologica lfquida que proviene de un animal tal como sangre, un derivado de sangre (derivado sangumeo), leche de mairnfero o un derivado de leche de mamffero. Puede tratarse de plasma, de crioprecipitado de plasma, de leche aclarada o sus derivados. Un animal segun la presente invencion es un organismo vivo pluricelular, eucariota, desprovisto de cloroplastos y no humano. En un modo de realizacion particularmente preferido, la solucion proviene de un animal transgenico. Ventajosamente, la solucion es leche de mamffero transgenico. Segun la invencion, un animal transgenico es un mamffero tal como una vaca, una cabra, una coneja, un cerdo, un simio, una rata, un raton o un ave o un insecto tal como un mosquito, una mosca o un gusano de seda. En un modo de realizacion preferido, el animal transgenico es un mamffero transgenico, preferentemente una coneja transgenica. Ventajosamente, el mamffero transgenico produce una protema transgenica en sus glandulas mamares bajo el control de un promotor espedfico que permite la expresion de dicha protema transgenica en la leche de dicho mamffero transgenico.
Un metodo de produccion de una protema transgenica en la leche de un animal transgenico puede comprender las etapas siguientes: una molecula de ADN, que comprende un gen que codifica la protema transgenica, estando este gen bajo el control de un promotor de una protema segregada naturalmente en la leche (tales como el promotor de la casema, de la beta-casema, de la lactabulmina, de la beta-lactoglobulina o el promotor WAP) esta integrada en un embrion de un mamffero no humano. El embrion se coloca despues en una hembra de mamffero de la misma especie. Una vez que el mamffero procedente del embrion este suficientemente desarrollado, se induce la lactancia del mamffero, y despues se recoge la leche. La leche contiene entonces dicha protema transgenica.
Un ejemplo de procedimiento de preparacion de protema en la leche de una hembra de mamffero distinto del ser humano se da en el documento EP 0 527 063, cuya ensenanza puede ser cogida para la produccion de la protema de la invencion. Un plasmido que contiene el promotor WAP (Whey Acidic Protein) se fabrica por introduccion de una secuencia que comprende el promotor del gen WAP, siendo este plasmido realizado con el fin de poder recibir un gen extrano colocado bajo la dependencia del promotor WAP. El plasmido que contiene el promotor y el gen que codifica para la protema de la invencion se utilizan para obtener unas conejas transgenicas, por microinyeccion en el pronucleo macho de embriones de conejas. Los embriones son despues transferidos en el oviducto de hembras hormonalmente preparadas. La presencia de los transgenes se revela mediante la tecnica de Southern a partir del ADN extrafdo de los gazapos transgenicos obtenidos. Las concentraciones en la leche de los animales se evaluan con la ayuda de ensayos radioinmunologicos espedficos.
Otros documentos describen unos procedimientos de preparacion de protemas en la leche de una hembra de mamffero distinto del ser humano. Se pueden citar, sin limitarse a ello, los documentos US 7,045,676 (raton transgenico) y EP 1 739 170 (produccion de factor von Willebrand en un mam^era transgenico).
Asf, la invencion tiene tambien por objeto la utilizacion de un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente al FVII humano, para la purificacion o la deteccion de dicho FVII humano presente en leche de coneja transgenica, caracterizada por que dicho aptamero inmovilizado no se une al FVII de conejo y que dicha leche de coneja transgenica es susceptible de contener FVII de conejo.
La invencion tiene tambien por objeto la utilizacion de un aptamero de ADN inmovilizado sobre un soporte solido a traves de un espaciador, uniendose dicho aptamero inmovilizado espedficamente al FVII de conejo, para la deteccion de dicho FVII de conejo susceptible de estar presente en leche de coneja transgenica, caracterizada por que dicho aptamero inmovilizado no se une al FVII humano y por que dicha leche de coneja transgenica contiene FVII humano.
El FVII humano y el FVII de conejo tienen una homologfa de secuencias de aminoacidos de aproximadamente un 75% (calculado por BLAST).
Otro objeto de la presente invencion se refiere a un procedimiento de seleccion de un aptamero que se une espedficamente a una protema diana, pero que no se une a una protema homologa de la protema diana que comprende las etapas de:
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a) poner en contacto una mezcla de aptameros con dicha protema homologa de la protema diana en condiciones favorables a la union, y recuperar los aptameros que no se unen a la protema homologa,
b) poner en contacto la mezcla de aptameros obtenida en la etapa a) con dicha protema diana en condiciones favorables a la union,
c) separar los aptameros no unidos de los aptameros que se han unido a dicha protema diana,
d) disociar las pares aptamero-protema diana,
e) amplificar los aptameros disociados para dar una mezcla enriquecida en aptamero que se une a la protema diana, pero que no se une a la protema homologa de la protema diana, y
f) reiterar las etapas a), b), c), d) y e) sobre tantos ciclos como se desee para obtener dicho o dichos aptameros que se unen espedficamente a la molecula diana, pero que no se unen a una protema homologa de la protema diana.
El procedimiento de seleccion de un aptamero de la invencion se parece al procedimiento SELEX descrito en la tecnica anterior con, ademas, una etapa denominada de “sustraccion” (etapa a). Asf, el procedimiento de la invencion se denomina “SELEX por sustraccion”.
El procedimiento SELEX de seleccion de los aptameros consiste en poner en contacto una protema con una biblioteca combinatoria de acidos nucleicos, ADN o ARN (en general 1015 moleculas), los acidos nucleicos que no se unen a la diana se eliminan, los acidos nucleicos que se unen a la diana se afslan y se amplifican. El procedimiento se repite hasta que la solucion sea suficientemente enriquecida con los acidos nucleicos que tienen una buena afinidad para la protema de interes (Tuerk y Gold, “Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase” (1990) Science, 249(4968): 505-10 y Ellington y Szostak, “In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands”, (1990) Nature 3o de agosto; 346(6287):818-22). Otros ejemplos de procedimiento SELEX se dan en los documentos EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978, EP 1 493 825 cuyas ensenanzas pueden ser recogidas en la realizacion del procedimiento de seleccion de un aptamero de la invencion.
La etapa de separacion (etapa c) se puede realizar mediante cualquier procedimiento que permite separar los aptameros unidos a la protema diana, denominados pares aptamero-protema diana, de los aptameros no unidos a la protema diana. La separacion puede efectuarse mediante diferentes procedimientos conocidos en la tecnica anterior. Asf, los pares aptamero-protema diana pueden ser retenidos en unos filtros de nitrocelulosa mientras que los aptameros libres no son retenidos. Para la etapa de separacion, se pueden utilizar tambien unas columnas que retienen espedficamente los pares aptamero-protema diana. Se pueden utilizar tambien otros procedimientos, como la extraccion lfquido-lfquido, la filtracion sobre gel de retardo o la centrifugacion sobre gradiente de densidad. La seleccion del procedimiento de separacion dependera de las propiedades de la protema diana y del par aptamero- protema diana y puede ser realizado en funcion de principios conocidos por el experto en la materia.
La etapa de disociacion (etapa d) se puede realizar mediante unos metodos que permiten disociar unas entidades qrnmicas. Ventajosamente, la disociacion se realiza por un aumento de la fuerza ionica o una modificacion del pH.
La amplificacion realizada en la etapa e) se puede realizar mediante cualquier procedimiento que permita aumentar la cantidad o el numero de copias de un aptamero. Ventajosamente, la amplificacion de un aptamero se realiza mediante la tecnica de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa). Ventajosamente, la amplificacion se obtiene bien por PCR si se trata de ADN, o bien por RT-PCR si se trata de ARN.
El procedimiento “SELEX por sustraccion” se caracteriza por la etapa denominada de “sustraccion” (etapa a) que permite eliminar los aptameros que se unen a la protema homologa de la protema diana. Despues de haber realizado un ciclo que comprende las etapas a), b), c), d) y e), los ciclos siguientes pueden reanudar o bien las etapas a), b), c), d), y e), o bien partir directamente de la etapa b) a partir de un grupo de aptameros amplificados en la etapa e) del ciclo anterior. Asf, la etapa a) de sustraccion se realiza al principio de cada nuevo ciclo o alternativamente despues de haber efectuado al menos un ciclo sin etapa a) y hasta obtener unos aptameros que se unan espedficamente a la protema diana pero que no se unan a la protema homologa de la protema diana. Ventajosamente, cada etapa a) se realiza cada dos o tres ciclos.
Los ejemplos siguientes permiten ilustrar la invencion sin limitar su alcance.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Union del aptamero (SEC n° 1) con el FVII humano
Un aptamero de secuencia SEC n° 1 se ha sintetizado por la comparMa Sigma-Proligo.
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SEC n° 1:
5’PGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGAGCCUAUGUAACAGAUGCAGAUC
CCUAGUCGUCCCAACACCAUAAC-3,-Biotina
Este aptamero se modifica sobre su extremo 3' mediante el injerto de una biotina. Las bases nucleotfdicas marcadas en negrita (SEC n° 1) son 2'O-metiladas, lo que permite estabilizar el aptamero haciendole mas resistente a las nucleasas. El aptamero se ha inmovilizado despues sobre un chip SA (Biacore GE) que contiene avidina. El aptamero se inmoviliza asf de manera orientada por su extremo 3' con un porcentaje de inmovilizacion de 2700 RU (1 RU corresponde aproximadamente a 1 pg de producto inmovilizado por mm2).
Se diluyo un FVII humano purificado a partir del plasma (FVII HP, pureza: 99%) en un tampon de desarrollo (Hepes 20 mM pH=8, NaCl 50 mM, CaCl2 2 mM y un 0,01% de BSA) con el fin de obtener cuatro muestras de concentracion en FVII HP de 50, 100, 200 y 400 nM. Cada muestra se ha inyectado de manera secuencial sobre un mismo chip que contiene el aptamero inmovilizado por una interaccion biotina-estreptavidina. Los controles se obtienen inyectando unos blancos que contienen solo un tampon de desarrollo. Todas las inyecciones se han realizado con un caudal de 20 |il/min. durante 120 s, despues de la inyeccion, se ha inyectado un tampon de desarrollo sobre el chip a un caudal identico durante 240 s. Un tampon de elucion (NaCl, 5M) se ha inyectado despues durante 60 s con un caudal de 30 |il/min para desacoplar el FVII HP del aptamero. Cada inyeccion (muestras y blancos) se realizaron en duplicado. El chip permite estudiar en tiempo real la formacion y la ruptura de las interacciones entre el FVII HP y el aptamero inmovilizado gracias a la resonancia plasmonica de superficie (RPS). Una union sobre el aptamero inmovilizado se traduce por un aumento de la senal en unidad de resonancia (RU) registrado por el aparato (Figura 1). Estos analisis se efectuan con el aparato de RPS Biacore T100® (GE). La modelizacion de las interacciones registradas se efectua con la ayuda del programa Biaevaluation® (GE). Con la ayuda de un modelo de union alosterica, el Kd de union entre el aptamero y el FVII HP se estimo en 1,4 |iM.
Con el fin de verificar que el producto que se une al aptamero inmovilizado es en realidad el FVII, se ha realizado sobre el mismo chip una secuencia de inyeccion que comprende (i) el FVII HP de 200 nM y (ii) un anticuerpo policlonal anti-FVII de 100 nM (Abcam). Las condiciones de inyeccion y de analisis son identicas a las descritas anteriormente. Si el aptamero retiene efectivamente el FVII, la inyeccion de anticuerpo policlonal anti-FVII debe traducirse por un aumento de la senal de RU despues de la union de los anticuerpos sobre el propio FVII unido al aptamero. En los controles, solo se inyectan unos anticuerpos. El aumento de senal de RU muestra claramente que el aptamero reconoce el FVII (figura 2).
Este ejemplo muestra que el aptamero, una vez inmovilizado, se une espedficamente al FVII HP, con una afinidad significativa.
Ejemplo 2: Union del aptamero (SEC n° 1) con FVII de conejo
Se ha diluido FVII plasmatico de conejo (American Diagnostica) en el mismo tampon que en el ejemplo 1 a concentraciones de 50, 100, 200, 400 nM y despues se ha inyectado en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 en el mismo chip que contiene el aptamero inmovilizado.
Las senales registradas de RU, mostradas en la figura 3, muestran la ausencia total de union del aptamero para el FVII de conejo a pesar de una fuerte homologfa de secuencia de aminoacidos entre el FVII de conejo y con el FVII HP (aproximadamente un 75% de homologfa de secuencia de aminoacidos).
Este ejemplo muestra que el aptamero se une espedficamente al FVII HP pero no se une al FVII de conejo.
Ejemplo 3: diferencias de afinidad frente al aptamero (SEC n° 1) entre FVII HP, FVII transgenico y FVII de conejo
Se han realizado unas inyecciones sucesivas de FVII HP, de FVII plasmatico de conejo y de FVII transgenico humano en condiciones identicas a las del ejemplo 1 en un mismo chip. Los datos obtenidos (figura 4) muestran que el aptamero se une al FVII HP y a FVII transgenico, con unas afinidades diferentes, pero no obstante fuertes, pero no se une al FVII de conejo.
Listado de secuencias
<110> LFB-BIOTECHNOLOGIES
<120> Procedimiento de purificacion o de deteccion de una protema diana <130> V361FR <160> 1
<170> PatentIn version 3.1 <210> 1
<211> 68 <212>ARN
<213> secuencia artificial <220>
5 <223> Aptamero
<400> 1
gggagagagg aagagggaug ggagccuaug uaacagaugc agaucccuag ucgucccaac 60 accauaac 68
Claims (12)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Procedimiento para purificar espedficamente un factor de la coagulacion, a partir de una solucion biologica que proviene de un animal transgenico no humano que contiene dicho factor de la coagulacion y que es susceptible de contener una protema homologa a dicho factor de la coagulacion, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:a) proporcionar un soporte solido que comprende un aptamero de ADN inmovilizado a dicho soporte solido a traves de un espaciador, caracterizado por que dicho aptamero inmovilizado se une espedficamente a dicho factor de la coagulacion, pero no se une a una protema homologa a dicho factor de coagulacion.b) poner en contacto dicho soporte solido con dicha solucion biologica, yc) recuperar el factor de la coagulacion unido a dicho aptamero.
- 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el factor de la coagulacion presenta una identidad de secuencia en aminoacidos superior al 50% con dicha protema homologa, preferentemente superior al 60%, preferentemente superior al 70%, preferentemente superior al 80%, preferentemente superior al 90%, con dicha protema homologa.
- 3. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 0 2, caracterizado por que el factor de la coagulacion se selecciona del grupo constituido por el factor VII (FVII), el factor VIII (FVIII), el factor X (FX), el factor IX (Facteur IX), el factor XI (FXI), el factor XII (FXII), el factor XIII (FXIII), el factor II (THROMBINE), la antitrombina III (aT III) el cofactor II de la heparina (HCII), la protema C (PC), la trombomodulina (TM), la protema S (PS), el factor V (FV), el factor de Willebrand (FvW) o el inhibidor de la via del factor tisular (TFPI).
- 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el aptamero tiene una secuencia nucleotfdica al menos un 80% identica a la SEC ID n° 1.
- 5. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicho soporte solido es un chip, una columna de cromatograffa, una bola magnetica o paramagnetica o una membrana.
- 6. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho espaciador es una secuencia oligonucleotfdica no espedfica o una secuencia de tipo polietilenglicol (PEG).
- 7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha solucion es un fluido corporal.
- 8. Proceidmiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion biologica se selecciona del grupo constituido por la leche, un derivado de la leche, sangre o un derivado de sangre.
- 9. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion biologica se selecciona del grupo constituido por un plasma, un crioprecipitado de plasma, una leche clarificada y sus derivados.
- 10. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion biologica se obtiene a partir de un mamffero transgenico no humano.
- 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la solucion biologica es la leche o un derivado de la leche de dicho mairnfero transgenico no humano.
- 12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el factor de la coagulacion es el factor VII humano.
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