ES2636470T3 - Marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia - Google Patents

Abstract

Un método para predecir la probabilidad de respuesta a la quimioterapia de un paciente humano diagnosticado de cáncer de mama, comprendiendo; medir el nivel de expresión de un transcrito de ARN de GBP1 en una muestra comprendiendo células cancerosas obtenidas de dicho paciente antes de la quimioterapia, y normalizar el nivel del transcrito de ARN de GBP1 para obtener un nivel de expresión de GBP1 normalizado, donde el nivel de expresión de GBP1 normalizado del paciente va asociado a una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia, si el nivel de expresión de GBP1 normalizado del paciente es mayor 10 comparado con el nivel de expresión de GBP1 normalizado en pacientes con cáncer de mama, de muestras sin posterior respuesta patológica a la quimioterapia .

Description

Marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia

La presente invención proporciona conjuntos de genes cuya expresión es importante en el pronóstico del cáncer. En particular, la invención proporciona información sobre expresión génica, útil para predecir si los pacientes con cáncer tendrán probablemente una respuesta positiva al tratamiento con quimioterapia. Los oncólogos disponen de diversas opciones de tratamientos, incluyendo distintas combinaciones de fármacos quimioterapéuticos que son considerados como “protocolo de tratamiento”, y diversos fármacos no identificados para tratar un cáncer en particular, pero de los que hay evidencia de eficacia en ese cáncer. La mayor probabilidad de un buen resultado del tratamiento requiere que los pacientes sean asignados al tratamiento contra el cáncer óptimo disponible, y que esta asignación se haga lo antes posible tras el diagnóstico. En particular, es importante determinar la probabilidad de respuesta del paciente a la quimioterapia “protocolo de tratamiento”, porque los fármacos quimioterapéuticos, tales como antraciclinas y taxanos, tienen una eficacia limitada y son tóxicos. La identificación de los pacientes con la mayor o menor probabilidad de respuesta podría incrementar el beneficio neto que pueden ofrecer esos fármacos, y reducir la morbilidad y toxicidad netas, a través de una selección de pacientes más inteligente. En la actualidad, las pruebas diagnósticas utilizadas en la práctica clínica son de analito único, y por consiguiente no captan el potencial valor de conocer las relaciones entre docenas de marcadores distintos. Además, frecuentemente las pruebas diagnósticas no son cuantitativas, apoyándose en la inmunohistoquímica. A menudo este método proporciona distintos resultados en diferentes laboratorios, en parte debido a que los reactivos no están estandarizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no se pueden cuantificar fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no son utilizadas frecuentemente por el problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo, y porque resulta difícil obtener de los pacientes muestras de tejido fresco para su análisis. El tejido embebido en parafina fijado es más fácil de obtener y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. No obstante, en general estos métodos no permiten estudiar grandes números de genes (ADN o ARN) en pequeñas cantidades de material. Por ello, tradicionalmente el tejido fijado se ha utilizado con poca frecuencia, aparte de para la detección inmunohistoquímica de proteínas. En los últimos años, varios grupos han publicado estudios sobre la clasificación de diversos tipos de cáncer por análisis de expresión génica de microarrays (ver, ej. Golub et al, Science286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al, Bioinformatics 17 (Suppl. 1):S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001)). También se han presentado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basadas en patrones de expresión génica(Martin et al, Cancer Res. 60:2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11462-11467 (2001); Sorlie et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10869-10874 (2001); Yan et al, Cancer Res. 61:8375-8380 (2001). No obstante, estos estudios van en su mayoría enfocados a mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama, y en general no aportan nuevos conocimientos sobre las relaciones de de los genes expresados diferencialmente, y no vinculan los resultados a estrategias de tratamiento para mejorar el resultado clínico de la terapia contra el cáncer. Aunque la moderna biología y bioquímica molecular ha descubierto centenares de genes cuya actividad influye en la conducta de las células tumorales, su estado de diferenciación y su sensibilidad o resistencia a determinados fármacos terapéuticos, con algunas excepciones, el estado de esos genes no ha sido explotado con la finalidad de tomar decisiones clínicas rutinarias sobre tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de proteínas de receptores estrogénicos (RE) en el carcinoma de mama para seleccionar a las pacientes para ser tratadas con fármacos antiestrógenos, como el tamoxifen. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en los carcinomas de mama para seleccionar a pacientes para el fármaco antagonista Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA). A pesar de los recientes avances, el problema en el tratamiento del cáncer sigue siendo identificar regímenes de tratamiento específicos para tipos de tumores patogénicamente distintos, y por último personalizar el tratamiento del tumor para optimizar los resultados. Por tanto, se necesitan tests que proporcionen simultáneamente información predictiva sobre la respuesta del paciente a las diversas opciones de tratamiento. Esto es especialmente patente en el caso del cáncer de mama, cuya biología es poco conocida. Es evidente que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, como el subgrupo ErbB2 positivo,y subgrupos caracterizados por la baja o ausente expresión génica del receptor estrogénico (RE) y unos cuantos factores transcripcionales adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000)), no refleja la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite diseñar estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente.

El cáncer de mama es el tipo de cáncer más frecuente entre las mujeres en los Estados Unidos, y es la principal causa de muertes por cáncer entre las mujeres de 40 – 59 años. En consecuencia, existe una necesidad particularmente importante de disponer de un test para el cáncer de mama clínicamente validado, predictivo de la respuesta de la paciente a la quimioterapia. La presente invención proporciona conjuntos de genes útiles para predecir la respuesta del cáncer a la

quimioterapia, por ej. pacientes con cáncer de mama. Además, la invención proporciona un test clínicamente validado para el cáncer, por ej. cáncer de mama, predictivo de la respuesta del paciente a la quimioterapia, utilizando análisis multigen de ARN. La presente invención permite el uso de material de biopsia embebido en parafina guardado para el ensayo de todos los marcadores en los conjuntos de genes pertinentes, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible. En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la predicción de la respuesta a la quimioterapia en un sujeto diagnosticado de cáncer, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de una o más transcritos de ARN de pronóstico o sus productos de expresión en una muestra biológica conteniendo células cancerosas obtenidas de dicho sujeto, donde el transcrito de ARN predictivo es el transcrito de uno o más genes seleccionados del grupo compuesto por TBP; ILT2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER 1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt5a; PTPD1; RAB6C; TK1, ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2, CD68, GSTM1, BCL2, ESR1 donde

(a)

por cada unidad de expresión aumentada de uno o más de ILT2; CD18;GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12;CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; ERBB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68; o el correspondiente producto de expresión, se pronostica que dicho sujeto tendrá una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia, y

(b)

por cada unidad de expresión aumentada de uno o más de TBP; ABCC5;GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4;FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKTl; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2,ESR1; o el correspondiente producto de expresión, se pronostica que dicho sujeto tendrá una menor probabilidad de respuesta a la quimioterapia.

En una realización particular, en el método anterior el transcrito de ARN predictivo es el transcrito de uno

o más genes seleccionados del grupo compuesto por TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G,Catenina; FBX05; FHTT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt5a; PTPD1; RAB6C; y TK1. En otra realización, la respuesta es una respuesta patológica completa. En una realización preferente, el sujeto es un paciente humano. El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, pero de preferencia es un tumor sólido, como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. Si el tumor es cáncer de mama, puede ser, por ejemplo, cáncer de mama invasivo, o cáncer de mama estadio II o estadio III. En una realización particular, la quimioterapia es quimioterapia adyuvante. En otra realización, la quimioterapia es quimioterapia neoadyuvante.

La quimioterapia neoadyuvante puede comprender, por ejemplo, la administración de un derivado de taxano, como docetaxel y/o paclitaxel, y/u otros agentes anticancerígenos, como los que pertenecen a la clase de las antraciclinas, doxorubicina, inhibidores de la topoisomerasa, etc. El método puede implicar la determinación de los niveles de expresión de por lo menos dos, o por lo menos cinco, o por lo menos diez, o por lo menos 15 de los transcritos de pronóstico que se enumeran más arriba, o sus productos de expresión. La muestra biológica puede ser, ej. una muestra de tejido comprendiendo células cancerosas, donde el tejido puede ser fijado, embebido en parafina, o fresco o congelado. En una realización particular, el tejido procede de una biopsia por aspiración con aguja fina, punción conaguja gruesa u otros tipos de biopsia. En otra realización, la muestra de tejido se obtiene por biopsia de aspiración con aguja fina, lavado bronquial o transbronquial. El nivel de expresión de dicho transcrito o transcritos de ARN de pronóstico puede ser determinados, por ejemplo, por RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real) u otro método basado en

PCR, inmunohistoquímica, técnicas proteómicas, o cualquier otro método conocido por los expertos, o su combinación. En una realización, el ensayo para la medición de dichos transcritos de ARN de pronóstico o susproductos de expresión, se proporciona en forma de un kit o kits. En otro aspecto, la invención se refiere a un conjunto que comprende polinucleótidos hibridando conla mayoría de los siguientes genes: TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3;IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; TK1, ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2, CD68, GSTM1, BCL2, ESR1. En una realización, la serie comprende polinucleótidos que hibridan conla mayoría de los siguientes genes: TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G. Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2;SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; TK1. En otra realización, la serie comprende polinucleótidos que hibridan conla mayoría de los siguientes genes: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1;FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; ERBB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68. Y en otra realización, la serie comprende polinucleótidos que hibridan conla mayoría de los siguientes genes: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1 Y aún en otra realización, la serie comprende polinucleótidos quehibridan conla mayoría de los siguientes genes: TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHTT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2, ESR1. En otra realización, la serie comprende polinucleótidos que hibridan conla mayoría de los siguientes genes: TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a;PTPD1;RAB6C. En varias realizaciones, el conjunto comprende como mínimo cinco, o como mínimo 10, o como mínimo 15, o como mínimo 10 de tales polinucleótidos. En una realización particular, la serie comprende polinucleótidos que hibridan con todos los genes enumerados más arriba. En otra realización particular, la serie comprende más de un polinucleótido que hibrida con el mismo gen. En otra realización, por lo menos uno de los nucleótidos comprende una secuencia basada en intrón cuya expresión se correlaciona con la expresión de una secuencia exón correspondiente. En varias realizaciones, los polinucleótidos pueden ser ADNc u oligonucleótidos. En otro aspecto, la invención se refiere a un método de preparación de un perfil genómico personalizado para un paciente, comprendiendo los pasos de:

(a)

determinar los niveles de expresión normalizados de los transcritos de ARN, o los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo compuesto por TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009;MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R;CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLADPB1;SGCB; GGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1;AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; TK1, ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6,MKI67, MYBL2, MMP11, GTSL2, CD68, GSTM1, BCL2, ESR1, en una célula cancerosa obtenida de dicho paciente; y

(b)

crear un informe resumiendo los datos obtenidos por el análisis de expresión génica.

En una realización específica, si se determina una expresión aumentada de uno o más de ELT.2; CD18;

GBP1;CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; ERBB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68; o el correspondiente producto de expresión, el informe incluye la predicción de que dicho sujeto tiene una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia. En este caso, en una realización particular, el método incluye el paso adicional de tratar al paciente con un agente quimioterapéutico. En el anterior método, si se determina una expresión aumentada de uno o más de TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2, ESR1; o el correspondiente producto de expresión, el informe incluye una predicción de que dicho sujeto tiene una menor probabilidad de respuesta a la quimioterapia. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para determinar la probabilidad de respuesta de un paciente a la quimioterapia, comprendiendo:

(a)

determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de los siguientes genes,ACTB, BAG1, BCL2, CCNB1, CD68, SCUBE2, CTSL2, ESR1, GAPD, GRB7, GSTM1, GUSB, ERBB2, MKI67, MYBL2, PGR, RPLPO, STK6, MMP11, BIRC5, TFRC, o sus productos de expresión, y

(b)

calcular la puntuación de recurrencia (Recurrence Score, RS). En una realización, los pacientes con una RS > 50 están en el percentil 50 superior de los pacientes con probable respuesta a la quimioterapia. En otra realización, los pacientes con una RS < 35 están en el percentil 50 inferior de los pacientes con probable respuesta a la quimioterapia. En aún otra realización, se determina la RS creando los siguientes subconjuntos de genes:

(I)subconjunto de factor del crecimiento: GRB7 y HER2; (II)subconjunto de receptor estrogénico: ER, PR, Bc12, y CEGP1; (III)subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, y STK15; y (IV)subconjunto de invasión: CTSL2, y STMY3;.

donde un gen en cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede ser sustituido por un gen sustituto que coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de Pearson≥0,40; y

(c) calcular la puntuación de recurrencia (RS) de dicho sujeto, ponderando las contribuciones de cada uno de los subconjuntos (i) -(iv), a la recurrencia del cáncer de mama.

El anterior método puede comprender además la determinación de los transcritos de ARN de CD68,GSTM1 y BAG1 o sus productos de expresión, o los correspondientes genes sustitutos o sus productos de expresión, e incluyendo la contribución de dichos genes o genes sustitutos a la recurrencia del cáncer de mama en el cálculo de la RS. La RS puede ser determinada, por ejemplo, aplicando la siguiente ecuación:

RS = (0,23 a 0,70) x umbr ejeGRB7 -(0,17 a 0,55) x eje ER + (0,52 a 1,56) x umbr eje prolif + (0,07 a 0,21) x eje invasión + (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1 donde

(I)eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2; (II)si eje GRB7< -2, umbr eje GRB7 = -2, y si eje GRB7 ≥ -2, umbr eje GRB7 = eje GRB7; (III)eje ER -(Est1 + PR + Bc12 + CEGP1)/4; (IV)eje prolif = (SURV + Ki.67 + MYBL2 + CCNB1 + STK15)/5; (V)si eje prolif < -3.5, umbr eje prolif = -3.5, si eje prolif≥ -3,5, umbr eje prolif = eje prolif ; y (VI)eje invasión = (CTSL2 + STMY3)/2,

donde las contribuciones individuales de los genes en (iii), (iv) y (vi) son ponderadas por un factor de 0,5 a 1,5, y donde una RS mayor representa una mayor probabilidad de recurrencia del cáncer de mama. En otra realización, se determina la RS aplicando la siguiente ecuación:

RS (rango, 0 -+ 0,47 x Puntuación de Grupo HER2 100) = -0,34x Puntuación de Grupo ER +1,04 x Puntuación de Grupo Proliferación

+

0,10 x Puntuación de Grupo Invasión

+

0,05 x CD68 0,08 x GSTM1 0,07 x BAG1

La Figura 1 muestra la relación entre la puntuación de recurrencia (RS) y la probabilidad de respuesta del

paciente a la quimioterapia, basado en resultados de un ensayo clínico con la variable de respuesta patológica completa. La Tabla 1 muestra una lista de genes, cuya expresión se correlaciona positiva o negativamente con la respuesta del cáncer de mama a la quimioterapia neoadyuvante con adriamicina y taxano. Resultados de un ensayo clínico con la variable de respuesta patológica completa. El análisis estadístico utilizó modelos lineales generalizados univariados con una función de enlace probit. La Tabla 2 presenta una lista de genes, cuya expresión predice la respuesta del cáncer de mama a la quimioterapia. Resultados de un ensayo clínico retrospectivo.La tabla incluye los números de accesión de los genes, las secuencias de cebadores directos e inversos (designados con “f” y “r”, respectivamente), y sondas (designadas con “p”) utilizadas para la amplificación PCR. La Tabla 3 muestra las secuencias de amplicón utilizadas en la amplificación PCR de los genes indicados.

A.Definiciones

Salvo que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente alguien con conocimientos ordinarios en la técnica al que pertenece la presente invención. Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,

J. Wiley&Sons (New York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992), proporcionan a los expertos en la técnica una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud. Un experto en la técnica entenderá que existen muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, que podrían ser utilizados en la práctica de la presente invención. Sin duda, la presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. A los efectos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación. El término "microarray" se refiere a una disposición ordenada de elementos de unconjuntohibridizable, de preferencia sondas de polinucleótidos, sobre un sustrato. El término “polinucleótido”, utilizado en singular o plural, se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Así, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen aquí incluyen, sin limitación, ADN de cadena simple y doble, ADN incluyendo regiones de cadena simple y doble, ARN de cadena simple y doble, y ARN incluyendo regiones de cadena simple y doble, moléculas híbridas comprendiendo ADN y ARN que pueden ser de cadena simple o, más típicamente, de cadena doble, o incluyendo regiones de cadena simple y doble. Además, el término “polinucleótido”, como se utiliza aquí, se refiere a regiones de cadena triple, comprendiendo ARN o ADN, o ARN y ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas distintas. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente incluyen solamente una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es frecuentemente un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente ADNc. El término incluye ADN (incluyendo ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por tanto, ADN o ARN con espina troncal modificada para mayor estabilidad o por otras razones, son “polinucleótidos” según se entiende aquí el término. Además, ADN o ARN que comprenden bases inusuales, como iosina, o bases modificadas, como bases tritiadas, están incluidos en el término “polinucleótidos” como se define aquí. En general, el término “polinucleótido” engloba todas las formas modificadas ya sea química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas. El término “oligonucleótido” se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos de cadena simple, ribonucleótidos de cadena simple o doble, híbridos RNA:DNA y ADN de cadena doble. Los oligonucleótidos, como los oligonucleótidos sonda de ADN de cadena simple, son con frecuencia sintetizados por métodos químicos, por ejemplo utilizando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos, que pueden obtenerse en el comercio. No obstante, los oligonucleótidos pueden hacerse mediante diversos métodos, incluyendo técnicas in vitromediadas por ADN recombinante, y por expresión de ADN en células y organismos. Los términos “gen expresado diferencialmente”, “expresión génica diferencial” y sus sinónimos, que son utilizados de forma intercambiable, se refieren a un gen cuya expresión es activada a un nivel superior o inferior en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente un cáncer, como cáncer de mama, en relación con su expresión en un sujeto normal o control. Los términos incluyen también genes cuya expresión es activadaa un nivel superior o inferior en diferentes estadios de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado diferencialmente puede ser activado o inhibido más bien a nivel de ácido nucleico o nivel proteico, o puede ser sometido a empalme alternativo dando un producto polipeptídico distinto. Tales diferencias pueden evidenciarse por un cambio en los niveles de ARNtn, expresión de superficie, secreción u otra división de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génicadiferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de los cocientes de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos del mismo gen procesados de forma distinta, que difieren entre sujetos normales y sujetos con una enfermedad, específicamente cáncer, o entre varios estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias, tanto cuantitativas como cualitativas, en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o susproductos de expresión entre,

por ejemplo, células normales o enfermas, o entre células que han pasado por distintos episodios o estadios de la enfermedad. A efectos de la presente invención, se considera presencia de “expresión génica diferencial” cuando hay una diferencia de por lo menos unas dos veces, de preferencia por lo menos unas cuatro veces, y mejor de por lomenos unas seis veces, y aún mejor de por lo menos diez veces entre la expresión de un gen determinado en sujetos normales y enfermos, o en varios estadios de la evolución de la enfermedad en un sujeto enfermo.

El término “normalizado” respecto a un transcrito de gen o un producto de expresión génica se refiere al nivel del transcrito o producto de expresión génica en relación a los niveles medios de transcritos/ productos de un conjunto de genes de referencia, donde los genes de referencia son seleccionados en base a su variación mínima entre pacientes, tejidos o tratamientos (“genes de limpieza”), o los genes de referencia son la totalidad de los genes comprobados. En este último caso, que se denomina generalmente “normalización global”, es importante que el número total de genes comprobados sea relativamente amplio, de preferencia superior a 50. Específicamente, el término “normalizado” respecto a un transcrito de ARN se refiere al nivel de transcrito en relación con la media de niveles de transcrito de un conjunto de genes de referencia. Más específicamente, el nivel medio de un transcrito de ARN medido con TaqMan® RT-PCR se refiere al valor Ct menos los valores Ct medios de un conjunto de transcritos génicos de referencia. Los términos “umbral de expresión” y “umbral de expresión definido” se utilizan de forma intercambiable, y se refieren al nivel de un gen o producto génico en cuestión por encima del cual el gen o producto génico sirven como marcador predictivo de la respuesta o resistencia de un paciente a un fármaco. Típicamente, el umbral se define experimentalmente en estudios clínicos. El umbral de expresión puede ser seleccionado para sensibilidad máxima (por ejemplo, para detectar todos los respondedores a un fármaco), o para selectividad máxima (por ejemplo, para detectar solamente los respondedores a un fármaco), o para un error mínimo. La frase “amplificación génica” se refiere a un proceso por el que se forman múltiples copias de un gen o fragmento génico en una célula o línea celular determinadas. La región duplicada (un segmento de ADN amplificado) es denominada frecuentemente "amplicón." Con frecuencia, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producida,es decir,el nivel de expresión génica, aumenta también en proporción al número de copias hechas del gen concreto. El término “pronóstico” se utiliza aquí en relación con la predicción de la probabilidad de muerte atribuible al cáncer o progresión, incluyendo recurrencia, diseminación metastásica y resistencia farmacológica de una enfermedad neoplásica, como el cáncer de mama. El término “predicción” se utiliza aquí respecto a la probabilidad de que un paciente responda favorable o desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también al grado de tales respuestas, o que un paciente sobreviva, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia, durante determinado periodo de tiempo sin recurrencia del cáncer. Los métodos de predicción de la presente invención pueden utilizarse clínicamente para tomar decisiones de tratamientos, al elegir las modalidades de tratamiento para un paciente determinado. Los métodos de predicción de la presente invención constituyen valiosas herramientas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, como una intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco o combinación de fármacos determinados, y/o radioterapia, o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, tras la cirugía y/o finalización del ciclo de quimioterapia u otras modalidades de tratamiento. El término supervivencia “a largo plazo” se utiliza aquí en referencia a una supervivencia de cómo mínimo 3 años, de preferencia un mínimo de 8 años, y más preferiblemente de cómo mínimo 10 años tras la cirugía u otro tratamiento. El término “tumor”, como se utiliza aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación neoplásica, maligna o benigna, y toda célula o tejido precancerosos y cancerosos. Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, y cáncer cerebral. La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que ponen en peligro el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, las metástasis, la interferencia en el funcionamiento normal de las células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos de secreción a niveles anormales, la supresión o agravación de la respuesta inflamatoria o inmune, neoplasia, lesión premaligna, lesión maligna, la invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, como nódulos linfáticos, etc. La "respuesta del paciente" puede ser evaluada utilizando cualquier variable que indique un beneficio para el paciente, incluyendo, sin limitación, (1) la inhibición, hasta cierta medida, del crecimiento tumoral, incluyendo el enlentecimiento o la completa detención del crecimiento; (2) la reducción del número de células tumorales; (3) la reducción del tamaño del tumor; (4) la inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o parada total) de la infiltración de células tumorales en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) la inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o parada total) de metástasis; (6) el incremento de la respuesta inmune antitumoral, que puede, pero no tiene que resultar en la regresión o rechazo del tumor; (7) el alivio, hasta cierta medida, de uno o más de los síntomas asociados al tumor; (8)

el aumento de la supervivencia tras el tratamiento; y/o (9) el descenso en la mortalidad en un momento determinado tras el tratamiento.

La "terapia neoadyuvante" es terapia adicional o adyuvante administrada antes de la terapia primaria (principal). La terapia neoadyuvante incluye, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia y hormonoterapia. Así, se puede administrar quimioterapia antes de la cirugía para reducir el tamaño del tumor, de forma que la cirugía pueda resultar más efectiva, o posible, en el caso de tumores previamente inoperables. El "rigor" de las reacciones de hibridación puede ser determinado fácilmente por alguien con conocimientos ordinarios de la técnica, y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. Generalmente, sondas más largas requieren temperaturas superiores para un adecuado templado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para un segundo templado cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, tanto mayor es la temperatura relativa que se puede aplicar. El resultado es que se entiende que temperaturas relativas superiores tenderán a hacer más rigurosas las condiciones de reacción, mientras que con temperaturas inferiores lo son menos. Para detalles adicionales sobre explicación del rigor de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current ProtocolsinMolecular Biology. Wiley Interscience Publishers, (1995). "Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se definen aquí, típicamente: (1) se emplea baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/ citrato sódico 0,0015 M/ dodecil sulfato sódico 1% a 50°C; (2) se emplea durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, formamida 50% (v/v) con albúmina de suero bovino 1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1% /tampón fosfato sódico 50mM a pH 6.5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42°C; o(3) se emplea formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH6.8), pirofosfato sódico 0,1%, 5 x solución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml),SDS0,1%y sulfato dextrano 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida 50% a 55°C, seguido de un lavado de alta rigurosidad consistente en 0,1 x SSC conteniendo EDTA a 55°C. Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describen Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (ej., temperatura, fuerza iónica y %SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución con: formamida 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7.6), 5 x Solución Denhardt, sulfato dextrano 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. Los expertos sabrán como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para tener en cuenta factores tales como la longitud de la sonda y semejantes. En el contexto de la presente invención, la referencia a “por lo menos uno”, “por lo menos dos”, “por lo menos cinco”, etc. de los genes enumerados en cualquier conjunto de genes específico significa uno cualquiera, o cualquiera y todas las combinaciones de los genes enumerados.

B. Descripción detallada

En la práctica de la presente invención se emplearán, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, y bioquímica que son parte conocida del procedimiento. Tales técnicas se explican ampliamente en la literatura, como “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ªedición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Animal CellCulture” (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”, 4ªedición

(D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994).

1.Perfilado de expresión génica

Los métodos de perfilado de expresión génica incluyen métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos, y métodos basados en proteómica. Los métodos más habitualmente usados y conocidos por los técnicos para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen northern blotting e hibridaciónin situ (Parker & Baines,Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNsc (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, como la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al, Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los métodos representativos para el análisis de expresión génica basado en la secuenciación incluyen el Análisis Serial

de Expresión Génica (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE), y el análisis de expresión génica por secuenciación de firma paralela masiva (MPSS).

2. Métodos de perfilado de expresión génica basados en PCR

a.PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)

Uno de los métodos de perfilado de expresión génica cuantitativos basados en PCR más sensibles y flexibles es la RT-PCR, que puede ser utilizado para comparar los niveles de ARNm en distintas poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, discriminar entre ARNm estrechamente relacionados y analizar la estructura de ARN. El primer paso es aislar el ARNm de una muestra diana. El material de partida es típicamente ARN total aislado de tumores humanos olíneas de células tumorales, y los correspondientes tejidos o líneas celulares normales, respectivamente. En consecuencia, se puede aislar ARN de diversos tumores primarios, incluyendo tumores o líneas de células tumorales de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo, ovario, útero, etc., con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, se puede extraer ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o embebidas en parafina y fijadas (ej. fijadas con formalina) guardadas. Los métodos generales de extracción del ARNm son bien conocidos por los expertos y se divulgan en libros de texto estándar de biología molecular, incluyendo Ausubel et al.,Current Protocols ofMolecular Biology. John Wiley and Sons (1997). Se divulgan métodos para la extracción de ARN de tejidos embebidos en parafina, por ejemplo, en Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), y De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En especial, el aislamiento de ARN puede realizarse utilizando un kit de purificación, serie de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, como Qiagen, según las instrucciones del fabricante.Por ejemplo, se puede aislar ARN total de células en cultivo utilizando minicolumnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles en el comercio son MasterPure™ Complete DNA y RNA Purification Kit(EPICENTRE®, 10 Madison, WI), y Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). ARN total de muestras de tejido puede aislarse utilizando RNA Stat-60 (Tel-Test). ARN preparado de tumor puede ser aislado, por ejemplo, por centrifugado de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Como el ARN no puede servir de plantilla para PCR, el primer paso en el perfilado de expresión génica por RT-PCR es la transcripción inversa de la plantilla de ARN en ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente usadas son la transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV-RT) , y la transcriptasa inversa de virus de leucemia murina Moloney (MMLV-RT). El paso de la transcripción inversa es cebado típicamente utilizando cebadores específicos, hexámeros aleatorios, o cebadores oligo dt, dependiendo de las circunstancias y el objetivo del perfilado de expresión. Por ejemplo, ARN extraído puede ser transcrito inversamente utilizando un kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado puede ser usado entonces como plantilla en la posterior reacción PCR. Aunque en el paso de PCR se puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termostable, típicamente se emplea Taq ADN polimerasa, que tiene una actividad 5’-3’ nucleasa, pero carece de actividad de endonucleasa lectura de prueba (proofreading) 3 ’-5 ’. Así, TaqMan® PCR utiliza típicamente la actividad de nucleasa 5’, de polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero se puede usar cualquier enzima con actividad de nucleasa5’ equivalente. Dos cebadores oligonucleótidos son utilizados para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar una secuencia de nucleótido localizada entre los dos cebadores PCR.La sonda no es extensible por el enzima Taq ADN polimerasa, y es marcada con uncolorante fluorescente reporter, y uncolorante fluorescente inhibidor. Toda emisión inducida por láser del colorante reporter es inhibida por el colorante inhibidor cuando los dos colorantes se colocan juntos en la sonda. Durante la reacción de amplificación, el enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de modo dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante reporter liberado está libre del efecto inhibidor del segundo fluoroforo. Una molécula de colorante reporter es liberada para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reporter no inhibido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos. Se puede realizar TaqMan® RT-PCR utilizando equipo disponible en el comercio, como por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE UU), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferente, el procedimiento de la nucleasa 5’ se desarrolla en un dispositivo PCR cuantitativo de tiempo real como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema está compuesto por un termociclador, láser, dispositivo con carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recogida en tiempo real por cables de fibra óptica para todos los 96 pocillos, y es detectada en el CCD. El sistema incluye software para operar el instrumento y para analizar los datos. Los datos del ensayo nucleasa 5' son expresados inicialmente como Ct, o ciclo umbral. Como se ha comentado más arriba, los valores de fluorescencia son registrados durante cada ciclo, y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto cuando la señal fluorescente es registrada por primera vez como estadísticamente significativa es el ciclo umbral

(Ct). Para minimizar los errores y el efecto de variación entre muestras, se realiza habitualmente RT-PCR utilizando un ARN de referencia que idealmente se expresa a un nivel constante entre distintos tejidos, y no resulta afectado por el tratamiento experimental. Los ARN usados más frecuentemente para normalizar patrones de expresión génica son ARNmde los genes de limpieza gliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPD) y β-actina(ACTB). Una variación más reciente de la técnica RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto PCR mediante una sonda fluorigénica de doble marcado (es decir, sonda TaqMan®). La PCR de tiempo real es compatible con la PCR cuantitativa competitiva, donde se utiliza el competidor interno de cada secuencia diana para la normalización, y con la PCR comparativa cuantitativa utilizando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen limpiador para RT-PCR. Para más detalles ver, ej. Held et al, Genome Research 6:986-994 (1996).

b. Sistema MassARRAY

En el método de perfilado de expresión génica basado en MassARRAY, desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA), tras aislar el ARN y la transcripción inversa, el ADNc obtenido es unidoa una molécula de ADN sintético (competidor), que coincide con la región de ADNc diana en todas las posiciones, excepto en una sola base, y sirve de estándar interno. La mezcla de ADNc/competidores amplificada PCR y sometida a un tratamiento post-PCR con enzima de fosfatasa alcalina de camarón (SAP), lo que resulta en la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos PCR del competidor y del ADNc son sometidos a extensión de cebador,lo que genera distintas señales de masa para los productos PCR derivados del competidor y del ADNc.Tras la purificación, estos productos se disponen en una matriz de chips, precargada con los componentes necesarios para el análisis con espectrometría de masas TOF láser (Tiempo de vuelo) de desorción/ionizaciónasistido por matriz (MALDI-TOF MS). El ADNc presente en la reacción es entonces cuantificado analizando las relaciones de las áreas pico en el espectro de masas generado. Para más detalles ver, ej. Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003).

c.Otros métodos basados en PCR

Otras técnicas basadas en PCR incluyen, por ejemplo , display diferencial (Liang and Pardee, Science 257:967-971 (1992)); polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (iAFLP) (Kawamotoet al., Genome Res. 12:1305-1312 (1999));tecnología de BeadArray™ (Illumina, San Diego, CA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray for Detection of Gene Expression (BADGE), utilizar el sistema disponible en el comercio Luminex100 LabMAP y microesferas múltiples codificadas por color (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido de expresión génica (Yang et al., Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y análisis de perfilado de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al., Nucl.Acids. Res. 31(16) e94 (2003)).

3. Microarrays

La expresión génica diferencial puede ser también identificada o confirmada utilizando la técnica de microarrays. Así, el perfil de expresión de los genes asociados al cáncer de mama puede ser medido en tejido tumoral fresco o embebido en parafina, utilizando la tecnología de microarray. En este método, secuencias de nucleótidos de interés (incluyendo ADNc y oligonucleótidos) se colocan en placas o se disponensobre un sustrato de microchip. Las secuencias dispuestas son entonces hibridadas con sondas de ADN específicas procedentes de células o tejidos de interés. Igual que en el método RT-PCR, típicamente la fuente de ARNm es ARN total aislado de tumores o líneas celulares tumorales humanas, y los correspondientes tejidos o líneas celulares normales. Así, se puede aislar ARN de diversos tumores primarios o líneas celulares tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, se puede extraer ARNm, por ejemplo, de muestras de tejidos congeladas o embebidas en parafina y fijadas (ej., fijadas en formalina) guardadas, que son preparadas y conservadas rutinariamente en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de microarray, se aplican inserciones amplificadas por PCR de clones de ADNc a un sustrato en una matriz densa. De preferencia, se aplican por lo menos 10 000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes en microarray, inmovilizados sobre el microchip a 10 000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Se pueden generar sondas de ADNc marcadas con fluorescente mediante incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Sondas marcadas de ADNc aplicadas al chip se hibridan con especificidaden cada punto de ADN sobre la matriz. Tras el riguroso lavado para eliminar sondas unidas no específicamente, el chip es escaneado con microscopio láser confocal o por otro método de detección, como puede ser una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento en matrizpermite la evaluación de la correspondiente abundancia de ARNm. Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN son hibridadas apareadas a la matriz.La abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes

correspondientes a cada gen especificado es determinada así simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite la cómoda y rápida evaluación del patrón de expresión para grandes números de genes. Tales métodos han demostrado tener la sensibilidad requerida para detectar transcritos raros, que son expresados en unas pocas copias por célula, y detectar de forma reproducible por lo menos aproximadamente diferencias dobles en los niveles de expresión (Schena etal, Proc. Nail Acad. Sci.USA 93(2):106-149 (1996)). El análisis de microarray puede realizarse con los equipos disponibles en el comercio, siguiendo los protocolos del fabricante, como utilizar la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de microarray Ihcyte. El desarrollo de métodos de microarray para el análisis a gran escala de expresión génica hace posible la búsqueda sistemática de marcadores moleculares de clasificación del cáncer y predicción de resultado en diversos tipos tumorales.

4. Análisis en serie de expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos génicos, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcripción. Primero, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 bp) que contiene suficiente información para identificar de forma exclusiva un transcrito, siempre y cuando la etiqueta se obtenga de una posición única en cada transcrito. Entonces se unen juntas muchas transcripciones para formar largas moléculas en serie, que pueden ser secuenciadas, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede ser evaluado cuantitativamente determinando la abundancia de etiquetas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles ver, ej. Velculescu et al„ Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

5. Análisis de expresión génica por secuenciación de firma paralela masiva (MPSS)

Este método, descrito por Brenner etal, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000), es un enfoque secuencial que combina secuenciación de firma no basada en gel, con clonación in vitrode millones de plantillas en microperlas de 5 µm de diámetro separadas. Primero se construye una biblioteca de microperlas de plantillas de ADN mediante clonación in vitro. Sigue a esto el ensamblaje de una matriz plana de las microperlas conteniendo plantillas en una célula de flujo a alta densidad (típicamente superior a 3 x106 microperlas /cm2). Los extremos libres de las plantillas clonadas en cada microperla son analizados simultáneamente, utilizando un método de secuenciación de firma basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Este método ha demostrado proporcionar de forma simultánea y precisa, en una única operación, cientos de miles de secuencias de firmas génicas de una biblioteca de ADNc de levadura.

6. Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son también adecuados para detectar los niveles de expresión de los marcadores pronósticos de la presente invención. Así, se utilizan para detectar la expresión anticuerpos o antisueros, de preferencia antisueros policlonales, y aún más preferible anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador. Los anticuerpos pueden ser detectados por etiquetado directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con etiquetas radiactivas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de hapteno, como biotina, o un enzima, como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo primario no etiquetado junto con un anticuerpo secundario etiquetado, comprendiendo antisueros, anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits de inmunohistoquímica son bien conocidos por los expertos y están disponibles en el comercio.

7. Proteómica

El término “proteoma” se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (ej. tejido, organismo o cultivo celular) en un momento determinado. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (denominada también “proteómica de expresión”). La proteómica comprende típicamente los siguientes pasos: (1) separación de proteínas individuales en una muestra por electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, ej. por espectrometría de masas o secuenciación N terminal, y

(3) análisis de los datos utilizando bioinformática. Los métodos proteómicos son valiosos suplementos de otros métodos de perfilado de expresión génica, y pueden ser utilizados, solos o en combinación con otros métodos, para detectar los productos de los marcadores pronósticos de la presente invención.

8. Descripción general de aislamiento, purificación y amplificación de ARNm

Este paso de un protocolo representativo para el perfilado de expresión génica utilizando tejidos fijados, embebidos en parafina, como fuente de ARN, incluyendo aislamiento, purificación, extensión de cebador y

amplificación, se comenta en varios artículos publicados en revistas (por ejemplo: T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al. Am. J. Pathol 158: 419-29 [2001]). Resumiendo, un proceso representativo comienza cortando secciones de muestras de tejido tumoral de aproximadamente un grosor de 10 µm. Se extrae entonces el ARN, y se eliminan la proteína y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir pasos de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y el ARN se transcribe inversamente utilizando promotores específicos de gen, seguido de RT-PCR. Finalmente, se analizan los datos para identificar la mejor opción u opciones de tratamiento disponibles para el paciente en base al patrón de expresión génica característico identificado en la muestra tumoral examinada.

9. Quimioterapia del cáncer

Los agentes quimioterapéuticos utilizados en el tratamiento del cáncer pueden dividirse en varios grupos, dependiendo de su mecanismo de acción. Algunos agentes quimioterapéuticos dañan directamente el ADN y el ARN. Alterando la replicación del ADN, tales agentes o detienen totalmente la replicación, o tienen como resultado la producción de ADN o ARN carentes de sentido. Esta categoría incluye, por ejemplo, cisplatino (Platinol®), daunorubicina (Cerubidine®), doxorubicina (Adriamycin®), y etopósido (VePesid®). Otro grupo de agentes quimioterapéuticos anticáncer interfieren en la formación de nucleótidos o desoxirribonucleótidos, de forma que se bloquea la síntesis de ARN y la replicación celular. Los ejemplos de fármacos de esta clase incluyen metotrexato (Abitrexate®), mercaptopurina (Purinethol®), fluorouracilo (Adrucil®), e hidroxiurea (Hydrea®). Una tercera clase de agentes quimioterapéuticos afecta a la síntesis o descomposición de los husos mitóticos y, como resultado, interrumpen la división celular. Son ejemplos de fármacos de esta clase vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y taxanos, tales como pacitaxel (Taxol®), y tocetaxel (Taxotere®). Tocetaxel está actualmente autorizado en los Estados Unidos para tratar a pacientes con cáncer de mama localmente avanzado o metastásico, tras el fracaso de quimioterapia previa, y pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña localmente avanzado o metastásico, tras el fracaso de quimioterapia previa basada en platino. Un frecuente problema de la quimioterapia es la elevada toxicidad de los agentes quimioterapéuticos tales como antraciclinas y taxenos, lo que limita los beneficios clínicosde este método de tratamiento. A la mayoría de los pacientes se les administra quimioterapia inmediatamente después de la resección quirúrgica del tumor. Este enfoque es denominado habitualmente terapia adyuvante. No obstante, la quimioterapia se puede administrar también antes de la cirugía, en lo que se denomina tratamiento neoadyuvante. Aunque el uso de quimioterapia neoadyuvante deriva del tratamiento de cáncer de mama avanzado e inoperable, ha ido ganando aceptación también en el tratamiento de otros tipos de cáncer. La eficacia de la quimioterapia neoadyuvante ha sido comprobada en varios ensayos clínicos.En el ensayo multicéntrico National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-18 (NSAB B-18) (Fisher et al., J. Clin. Oncology 15:2002-2004 (1997); Fisher et al., J. Clin. Oncology 16:2672-2685 (1998)) se utilizó terapia neoadyuvante con una combinación de adriamicina y ciclofosfamida ("régimen AC "). En otro ensayo clínico se administró quimioterapia con una combinación de 5-fluorouracilo, epirubicinay ciclofosfamida ("régimen FEC") (van Der Hage et al., J. Clin. Oncol. 19:4224-4237 (2001)). En ensayos clínicos más recientes se han utilizado también pautas de tratamiento neoadyuvante conteniendo taxanos. Ver, ej. Holmes et al., J. Natl. Cancer Inst.83:1797-1805 (1991) y Moliterni et al., Seminars in Oncology, 24:S1710-S-17-14 (1999). Para más información sobre quimioterapia neoadyuvante para cáncer de mama ver, Cleator et al.,Endocrine-Related Cancer 9:183-195 (2002).

10. Conjuntos de genes de cáncer. Subsecuencias génicas ensayadas y aplicación clínica de los datos de expresión génica

Un aspecto importante de la presente invención es usar la expresión medida de ciertos genes en tejido de cáncer de mama para proporcionar información pronóstica. A este efecto es necesario corregir (normalizar) diferencias en la cantidad de ARN ensayado, variabilidad en la calidad del ARN utilizado, y otros factores tales como diferencias en máquinas y operadores. En consecuencia, el ensayo típicamente mide e incorpora el uso de ARN de referencia, incluyendo los transcritos de genes limpiadores bien conocidos, tales como GAPD y ACTB. Se da un método preciso de normalización de datos de expresión génica en “User Bulletin #2” para ABI PRISM 7700Sequence Detection System (Applied Biosystems; 1997). Alternativamente, la normalización puede basarse en la señal media o mediana (Ct) de todos los genes ensayados o un amplio subconjunto de ellos (enfoque de normalización global). En el estudio descrito en el siguiente ejemplo, se utilizó la denominada estrategia de normalización central, donde se empleó un subgrupo de los genes cribados, seleccionados en base a la falta de correlación con el resultado clínico, para normalización.

11. Puntuaciones de recurrencia y respuesta a la terapia y sus aplicaciones

La solicitud en tramitación Nº de serie 60/486.302, presentada el 10 de julio de 2003, describe un test de pronóstico basado en un algoritmo, para determinar la probabilidad de recurrencia del cáncer y/o la probabilidad de que un paciente responda bien a una modalidad de tratamiento. Las características del algoritmo que lo distinguen de otros métodos de pronóstico del cáncer incluyen: 1) un único conjunto de

ARNm de test (o los correspondientes productos de expresión génica) utilizado para determinar la probabilidad de recurrencia, 2) determinados pesos utilizados para combinar en una fórmula los datos de expresión, y 3) los umbrales utilizados para dividir a los pacientes en grupos de distintos niveles de riesgo, como grupos de riesgo bajo, medio y alto. El algoritmo proporciona una puntuación de recurrencia (RS) numérica o, si se evalúa la respuesta al tratamiento, la puntuación de respuesta a la terapia (RTS). El test requiere un ensayo de laboratorio para medir los niveles de los ARNm especificados o sus productos de expresión, pero se pueden utilizar cantidades muy pequeñas de tejido fresco, tejido congelado, o muestras de biopsia de tumor embebidas en parafina y fijadas que haya sido ya necesario obtener de pacientes y se hayan guardado. Por tanto, el test puede no ser invasivo. Es también compatible con distintos métodos de obtención de tejido tumoral, por ejemplo mediante biopsia por punción con aguja gruesa o aspiración con aguja fina. Según este método, la puntuación de recurrencia del cáncer (RS) se determina:

a) sometiendo una muestra biológica conteniendo células cancerosas obtenida de dicho sujeto al perfilado de expresión génica o proteica; b) cuantificando el nivel de expresión de múltiples genes individuales [es decir, niveles de ARNm o proteínas] para determinar un valor de expresión para cada gen; c) creando subconjuntos de los valores de expresión génica, comprendiendo cada subconjunto valores de expresión de genes unidos por una función biológica relacionada con el cáncer y/o por coexpresión; d) multiplicando el nivel de expresión de cada gen de un subconjunto por un coeficiente que refleje su contribución relativa a la recurrencia del cáncer o la respuesta a la terapia dentro de dicho subconjunto, y sumando los productos de la multiplicación para obtener un término para dicho subconjunto; e) multiplicando el término de cada subconjunto por un factor que refleje su contribución a la recurrencia del cáncer o la respuesta a la terapia; y f) procediendo a la suma de términos para cada subconjunto multiplicado por dicho factor para obtener una puntuación de recurrencia (RS), o una puntuación de respuesta a la terapia (RTS),

donde la contribución de cada subconjunto que no muestre una correlación lineal con la recurrencia del cáncer o la respuesta a la terapia se incluye solo por encima de un nivel umbral predeterminado, y donde a los subconjuntos en los que la expresión aumentada de los genes especificados reduce el riesgo de recurrencia del cáncer se les asigna un valor negativo, y a los subconjuntos en los que la expresión de los genes especificados incrementa el riesgo de recurrencia del cáncer se les asigna un valor positivo. En una realización particular, la RS se establece:

a) determinando los niveles de expresión de GRB7, HER2, EstR1, PR, Bcl2, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1, y BAG1, o de sus productos de expresión, en una muestra biológica conteniendo células tumorales obtenidas de dicho sujeto, y b) calculando la puntuación de recurrencia (RS) mediante la siguiente ecuación:

RS = (0,23 a 0,70) x umbr eje GRB7 -(0,17 a 0,51) x eje ER + (0,53 a 1,56) x umbr eje prolif

+ (0,07 a0,21) x eje invasión + (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1

Donde

(I)eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2; (II)si eje GRB7< -2, umbr eje GRB7 = -2, y si eje GRB7 ≥ -2, umbreje GRB7 = eje GRB7; (III)eje ER = (Est1 + PR + Bcl2 + CEGP1)/4; (IV)eje prolif = (SURV + Ki.67 + MYBL2 + CCNB1 + STK15)/5; (V)si eje prolif < -3,5, umbr eje prolif = -3,5, si eje prolif ≥ -3,5, umbr eje prolif = eje prolif; y (VI)eje invasión -(CTSL2 + STMY3)/2

donde los términos de todos los genes individuales para quienes no se muestran específicamente rangos, pueden variar entre aproximadamente 0,5 y 1,5, y donde una RS mayor representa un incremento en la probabilidad de recurrencia del cáncer. Más detalles de la invención se describen en el siguiente ejemplo no limitante.

Ejemplo

A. Un estudio retrospectivo de quimioterapia neoadyuvante en cáncer de mama invasivo: Perfilado de expresión génica de un tejidoextraído de biopsia por punción con aguja gruesaembebido en parafina

Fue un estudio colaborativo implicando a Genomic Health, Inc., (Redwood City California), y el Institute Tumori, Milan, Italia. El objetivo primario del estudio fue explorar la correlación entre los perfiles moleculares pretratamiento y la repuesta patológica completa (pCR) a la quimioterapia neoadyuvante en un cáncer de mama localmente avanzado.

Criterios de inclusión de pacientes:

Diagnóstico histológico de cáncer de mama invasivo (fecha de la cirugía 1998-2002); diagnóstico de cáncer de mama localmente avanzado definido por infiltración de la piel y/o afectación axilar N2, y/o ganglios homolaterales supraclaviculares positivos; biopsia por punción con aguja gruesa, quimioterapia neoadyuvante y resección quirúrgica realizadas en el Istituto Nazionale Tumori, Milan; consentimiento informado firmado de que el material biológico obtenido para diagnóstico histológico o procedimientos diagnósticos puedan ser utilizados para la investigación; y evaluación histopatológica indicando cantidades adecuadas de tejido tumoral para inclusión en este estudio de investigación.

Criterios de exclusión:

Metástasis distantes; sin bloque tumoral disponible de la biopsia por punción con aguja gruesa inicial, o de la resección quirúrgica; o tumor muy pequeño(<5% del tejido total en la placa) en bloque en la medida que se evalúa por examen de la placa H&E por el patólogo.

Diseño del estudio

Ochenta y nueve paciente evaluables (de un conjunto de 96 pacientes clínicamente evaluables) fueron identificadas y estudiadas. Se midieron por RT-PCR los niveles de 384 especies de ARNm, representando a productos de genes relacionados con el cáncer candidatos que fueron seleccionados de la literatura de investigación biomédica. Solo se perdió un gen debido a señal inadecuada. Las características de las pacientes fueron las siguientes: Media de edad : 50 años; Grado tumoral: 24% bien, 55% moderado y 21% malo; 63% de las pacientes fueron ER positivas {por inmunohistoquímica}; 70 % de las pacientes tenían nódulos linfáticos positivos. Se administró a todas las pacientes quimioterapia neoadyuvante primaria: Doxorubicin + Taxol 3 semanas/3 ciclos seguido de Taxol® (paclitaxel) 1 semana/12 ciclos. Extracción quirúrgica del tumor tras finalización de la quimioterapia. Se tomaron muestras de biopsia de tumorextraído por punción con aguja gruesa antes del inicio de la quimioterapia, y sirvieron como fuente de ARN para el ensayo de RT-PCR.

Materiales y métodos

El tejido tumoral embebido en parafina y fijado (PE) se obtuvo por biopsia antes y después de la quimioterapia. Las biopsias por punción con aguja gruesa se tomaron antes de la quimioterapia. En este caso, el patólogo seleccionó el bloque de tumor primario más representativo, y presentó nueve secciones de 10 micraspara el análisis de ARN. Específicamente, se prepararon un total de 9 secciones (de 10 micras de grosor cada una) y se colocaron en tres tubos Costar Brand Microcentrifuge (tubos de polipropileno, 1,7 ml, transparentes; 3 secciones en cada tubo) y se agruparon. Se extrajo el ARN mensajero utilizando el MasterPure ™ RNA Purification Kit (Epicentre Technologies) y cuantificado por el método de fluorescencia RiboGreen® (sondas moleculares). Se realizaron ensayos moleculares de expresión génica cuantitativa por RT-PCR, utilizando el ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE UU). El ABI PRISM 7900™ está compuesto por termociclador, láser, dispositivo con carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos, en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real para todos los 384 pocillos, y detectada en el CCD. El sistema incluye software para operar el instrumento y para analizar los datos.

Análisis y resultados

El tejido tumoral fue analizado respecto a 384 genes. Los valores de ciclo umbral (Ct) de cada paciente fueron normalizados en base a la media de un subconjunto de los genes cribados de esa paciente concreta, seleccionada en base a la falta de correlación con el resultado clínico (estrategia de normalización central). La respuesta positiva a la quimioterapia fue definida como respuesta patológica completa (pCR). Las pacientes fueron evaluadas formalmente en cuanto a la respuesta al finalizar el ciclo de quimioterapia. Una respuesta clínica completa (cCR) requiere la total desaparición de toda enfermedad clínicamente detectable, mediante examen físico o por imagen diagnóstica de mama. Una respuesta patológica completa (pCR) requiere la ausencia de cáncer de mama residual por examen histológico de tejido mamario biopsiado, muestras de lumpectomía o mastectomía tras quimioterapia primaria. Puede haber presencia de carcinoma ductal in situ (CDIS). No puede haber presencia de cáncer residual en nódulos regionales. De las 89 pacientes evaluables 11 (12%) tuvieron respuesta patológica completa (pCR). Siete de esas pacientes fueron ER negativas. Una respuesta clínica parcial fue definida como una reducción >50% del área tumoral (suma de los productos de los diámetros perpendiculares más largos), o una reducción> 50% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares más largos de lesiones múltiples en la mama y la axila. Ningún área de enfermedad puede aumentar > 25% y no pueden aparecer nuevas lesiones. Se realizó un análisis comparando la relación entre la expresión génica normalizada y los resultados

binarios de pCR o no pCR. Se utilizaron modelos generalizados univariados con funciones de enlace probit o logit.Ver, ej. Van K. Borooah, LOGIT and PROBFT, Ordered Multinominal Models, Sage University Paper, 2002. La Tabla 1 muestra correlaciones de la respuesta patológica con la expresión génica, y presenta una lista

5 de los 86 genes en los que el valor p de las diferencias entre los grupos fue <0,1. La segunda columna (con el título “dirección”) muestra si el incremento de la expresión se correlaciona con la reducción o el aumento de la probabilidad de respuesta a la quimioterapia. La significación estadística del valor predictivo de cada gen viene dado por el valor P (columna de la derecha).

10 Enlace probit Gen Dirección Intercept Pendiente Valor P

TBP Reducción 0,0575 2,4354 0,0000 ILT.2 Aumento 0,5273 -0,9489 0,0003 ABCC5 Reducción 0,9872 0,8181 0,0003 CD18 Aumento 3,4735 -1,0787 0,0007 GAT A3 Reducción 0,6175 0,2975 0,0008 DICER1 Reducción -0,9149 1,4875 0,0013 MSH3 Reducción 2,6875 0,9270 0,0013 GBP1 Aumento 1,7649 -0,5410 0,0014 IRS1 Reducción 1,3576 0,5214 0,0016 CD3z Aumento 0,1567 -0,5162 0,0018 Fasl Aumento -0,6351 -0,4050 0,0019 TUBB Reducción 1,2745 0,8267 0,0025 BAD Reducción 0,9993 1,1325 0,0033 ERCC1 Reducción 0,0327 1,0784 0,0039 MCM6 Aumento 0,1371 -0,8008 0,0052 PR Reducción 1,6079 0,1764 0,0054 APC Reducción 0,7264 1,0972 0,0061 GGPS1 Reducción 1,0906 0,8124 0,0062 KRT18 Reducción -0,8029 0,4506 0,0063 ESRRG Reducción 2,0198 0,2262 0,0063 E2F1 Aumento 0,2188 -0,5277 0,0068 AKT2 Reducción -1,3566 1,1902 0,0074 A.Catenina Reducción -0,6859 0,9279 0,0079 CEGP1 Reducción 1,3355 0,1875 0,0091 NPD009 Reducción 1,3996 0,2971 0,0092 MAPK14 Reducción 2,6253 1,6007 0,0093 RUNX1 Reducción -0,4138 0,7214 0,0103 ID 2 Aumento 1,7326 -0,7032 0,0104 G.Catenina Reducción -0,1221 0,5954 0,0110 FBX05 Aumento 0,3421 -0,4935 0,0110 FHIT Reducción 1,9966 0,4989 0,0113 MTA1 Reducción 0,3127 0,6069 0,0133 ERBB4 Reducción 1,4591 0,1436 0,0135 FUS Reducción -0,6150 0,9415 0,0137 BBC3 Reducción 2,4796 0,6495 0,0138 IGF1R Reducción 1,1998 0,3116 0,0147 CD9 Reducción 0,9292 0,5747 0,0156 TP53BP1 Reducción 1,4325 0,8122 0,0169 MUC1 Reducción 0,8881 0,2140 0,0175 IGFBP5 Reducción -0,6180 0,4880 0,0181 rhoC Reducción -0,1726 0,6860 0,0184 RALBP1 Reducción 0,2383 0,9509 0,0185 CDC20 Aumento 1,3204 -0,4390 0,0186 STAT3 Reducción -0,9763 0,7023 0,0194 ERK1 Reducción 0,8577 0,6496 0,0198 HLA.DPB1 Aumento 3,6300 -0,6035 0,0202 SGCB Reducción 0,6171 0,7823 0,0208 CGA Aumento 0,0168 -0,1450 0,0209

Enlace Probit

Gen Dirección Intercept Pendiente Valor P

DHPS Reducción 0,2957 0,7840 0,0216 MGMT Reducción 0,9238 0,6876 0,0226 CRIP2 Reducción 0,5524 0,4394 0,0230 MMP12 Aumento 0,4208 -0,2419 0,0231 ErbB3 Reducción 0,9438 0,2798 0,0233 RAP1GDS1 Reducción 0,2817 0,7672 0,0235 CDC25B Aumento 1,6965 -0,5356 0,0264 IL6 Aumento 0,0592 -0,2388 0,0272 CCND1 Reducción 0,2260 0,2992 0,0272 CYBA Aumento 2,6493 -0,5175 0,0287 PRKCD Reducción 0,2125 0,6745 0,0291 DR4 Aumento 0,3039 -0,5321 0,0316 Hepsina Reducción 1,9211 0,1873 0,0318 CRABP1 Aumento 1,0309 -0,1287 0,0320 AK055699 Reducción 2,0442 0,1765 0,0343 Contig.51037 Aumento 0,7857 -0,1131 0,0346 VCAM1 Aumento 1,1866 -0,3560 0,0346 FYN Aumento 1,5502 -0,5624 0,0359 GRB7 Aumento 1,3592 -0,1646 0,0375 AKAP.2 Aumento 1,7946 -0,7008 0,0382 RASSF1 Aumento 1,1972 -0,0390 0,0384 MCP1 Aumento 1,3700 -0,3805 0,0388 ZNF38 Reducción 1,7957 0,4993 0,0395 MCM2 Aumento 1,0574 -0,4695 0,0426 GBP2 Aumento 1,4095 -0,4559 0,0439 SEMA3F Reducción 1,2706 0,3725 0,0455 CD31 Aumento 1,9913 -0,5955 0,0459 COL1A1 Reducción -1,9861 0,3812 0,0466 ER2 Aumento -0,5204 -0,2617 0,0471 BAG1 Reducción 0,6731 0,5070 0,0472 AKT1 Reducción -0,4467 0,5768 0,0480 COL1A2 Reducción -1,0233 0,3804 0,0490 STAT1 Aumento 1,9447 -0,4062 0,0498 Wnt.5a Reducción 2,2244 0,2983 0,0518 PTPD1 Reducción 1,2950 0,4834 0,0552 RAB6C Reducción 0,4841 0,5635 0,0717 TK1 Aumento 0,6127 -0,3625 0,0886 Bcl2 Reducción 1,1459 0,2509 0,0959

5 En base a los datos presentados en la Tabla 1, la expresión aumentada de los siguientes genes se correlaciona con una mayor probabilidad de respuesta patológica completa al tratamiento: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12;CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; mientras que la expresión aumentada de los siguientes genes se correlaciona con una

10 menor probabilidad de respuesta patológica completa al tratamiento: TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD;Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1;

15 COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; Bcl2. También se investigó la relación entre el algoritmo del riesgo de recurrencia (descrito en la solicitud en trámite USA Nº de Serie 60/486 302) y la pCR. El algoritmo incorpora los niveles medidos de 21 especies de ARNm.16 ARNm(detallados más abajo) fueron marcadores clínicos candidatos, y los restantes 5 (ACTB, GAPD, GUSB, RPLPO, y TFRC) fueron genes de referencia. Las mediciones de expresión

20 normalizada de referencia oscilan de 0 a15, donde un incremento de una unidad refleja un doble incremento en ARN.

La puntuación de recurrencia (RS) se calcula a partir de la expresión cuantitativa de cuatro grupos de genes marcadores (un grupo de 4 genes de receptores estrogénicos —ESR1, PGR, BCL2, y SCUBE2; un grupo de proliferación de 5 genes—MKI67, MYBL2, BIRC5, CCNB1, y STK6; un grupo de 2 genes de HER2 —ERBB2 y GRB7, un grupo de invasión de 2 genes —MMP11 y CTSL2) y 3 otros genes

5 individuales —GSTM1, BAG1, y CD68. Aunque los genes y los factores de multiplicación utilizados en la ecuación pueden variar, en una realización típica se puede aplicar la siguiente ecuación para calcular la RS:

RS (rango, 0 -+ 0,47 x Puntuación Grupo HER2 10 100) =-0,34 x Puntuación Grupo ER +1,04 x Puntuación Grupo Proliferación

+

0,10 x Puntuación Grupo Invasión

+

0,05 x CD68

0,08x GSTM1 15 0,07 x BAG1

La aplicación de este algoritmo para el estudio de los conjuntos de datos clínicos y de expresión génica da una curva continua relacionando la RS con los valores de pCR, como se muestra en la Figura 1. El examen de estos datos demuestra que las pacientes con RS > 50 están situadas en el percentil 50

20 superior de los pacientes en términos de probabilidad de respuesta a la quimioterapia, y que los pacientes con RS < 35 se sitúan en el percentil 50 inferior de los pacientes en términos de probabilidad de respuesta a la quimioterapia. Si bien la invención ha sido descrita poniendo de relieve determinadas realizaciones específicas, resulta evidente para los expertos en la técnica que son posibles variaciones y modificaciones en los métodos y

25 técnicas específicos. Por tanto, esta invención incluye todas las modificaciones comprendidas en el espíritu y el alcance de la invención tal como viene definida por las siguientes reivindicaciones.

TABLA 2

Continuación

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la respuesta a la quimioterapia de un sujeto diagnosticado de cáncer, conteniendo la determinación del nivel de expresión de uno o más transcritosde ARN de pronóstico o sus productos de expresión, en una muestra biológica comprendiendo células cancerosas obtenidas de dicho sujeto, donde el transcrito de ARN predictivo es el

transcrito de uno o más genes seleccionados del grupo compuesto por TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3;GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPSl; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05;FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1;CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STATI; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C;TK1, ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2, CD68, GSTM1,BCL2, ESR1 donde

(a)

por cada unidad de expresión aumentada de uno o más de ILT.2; CD18; GBP1;CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBXO5; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1;MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1 ERBB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68; o el correspondiente producto de expresión, se prevé que dicho sujeto tenga una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia; y

(b)

por cada unidad de expresión aumentada de uno o más de TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1;.TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPSl; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4; FUS;BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK.1; SGCB;DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2,ESR1; o el correspondiente producto de expresión, se prevé que dicho sujeto tenga una menor probabilidad de respuesta a la quimioterapia.

El transcrito de ARN predictivo puede ser el transcrito de uno o más genes seleccionados del grupo compuesto por TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3;DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fesl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2;G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; PUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT;CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAMl; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1;ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STATI; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; y TK1. La respuesta puede ser una respuesta patológica completa. El sujeto puede ser un paciente humano. El cáncer puede ser seleccionado del grupo compuesto por cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. El cáncer puede ser cáncer de mama invasivo. El cáncer puede ser cáncer de mama de estadio II o estadio III. La quimioterapia puede ser quimioterapia adyuvante. La quimioterapia puede ser quimioterapia neoadyuvante. La quimioterapia neoadyuvante puede comprender la administración de un derivado de taxano. El taxano puede ser docetaxel o paclitaxel. La quimioterapia puede comprender además la administración de un agente anticáncer adicional. El agente anticáncer adicional puede ser un miembro de la clase de agentes anticáncer de las antraciclinas. El agente anticáncer adicional puede ser doxorubicina. El agente anticáncer adicional puede ser un inhibidor de la topoisomerasa.

El método puede comprender la determinación de los niveles de expresión de por lo menos dos de dichos transcritos de pronóstico de sus productos de expresión. El método puede comprender la determinación de los niveles de expresión de por lo menos cinco de dichos transcritos de pronóstico de sus productos de expresión. El método puede comprender la determinación de los niveles de expresión de todos los transcritos de pronóstico mencionados, o sus productos de expresión. La muestra biológica puede ser una muestra de tejido comprendiendo células cancerosas. El tejido puede ser fijado, embebido en parafina, o fresco, o congelado. El tejido puede proceder de una biopsia por aspiración con aguja fina, punción con aguja gruesa u otros tipos de biopsia. La muestra de tejido puede obtenerse por aspiración con aguja fina, lavado bronquial o biopsia transbronquial. El nivel de expresión de dicho transcrito o transcritos de ARN de pronóstico puede ser determinado por RT-PCR u otro método basado en PCR. El nivel de expresión de dicho producto o productos de expresión puede ser determinado por inmunohistoquímica. El nivel de expresión de dicho producto o productos de expresión puede ser determinado por técnicas proteómicas. El ensayo para la medición de dichos transcritos de ARN de pronóstico o sus productos de expresión

puede proporcionarse en forma de un kit o kits. El transcrito predictivo puede comprender una secuencia basada en intrón, cuya expresión se correlacione con la expresión de una secuencia de exón correspondiente. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjunto de polinucleótidos que hibridan con varios de los siguientes genes: TBP; 1LT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl;TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPSl; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGPl;NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGFIR; CD9; TP53BP1; MUCl; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAPIGDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSFl; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt5a; PTPD1; RAB6C; TK1,ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2, CD68, GSTM1, BCL2, ESR1. La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con la mayoría de los siguientes genes: TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1; SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt5a; PTPD1; RAB6C; TK1. La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con la mayoría de los siguientes genes: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fesl;.MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; EL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; ERBB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68. La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con la mayoría de los siguientes genes: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1. La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con la mayoría de los siguientes genes: TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHTT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2, ESR1.

La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con la mayoría de los siguientes genes: TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHTT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1;RAB6C. La serie puede comprender por lo menos cinco de dichos polinucleótidos. La serie puede comprender por lo menos 10 de dichos polinucleótidos. La serie puede comprender por lo menos 15 de dichos polinucleótidos. La serie puede comprender polinucleótidos que hibridan con todos los genes mencionados. La serie puede comprender más de un polinucleótido que hibridan con el mismo gen. Por lo menos uno de los polinucleótidos mencionados puede comprender una secuencia basada en intrón, cuya expresión se correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente. Los polinucleótidos pueden ser ADNc. Los polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de preparación de un perfil genómico personalizado para un paciente, comprendiendo los siguientes pasos:

a) determinar los niveles de expresión normalizados de los transcritos de ARN o los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en TBP; ILT.2; ABCC5; CD18; GATA3; DICER1; MSH3; GBP1; IRS1; CD3z; fasl; TUBB; BAD; ERCC1; MCM6; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; E2F1; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; ID2; G.Catenina; FBX05; FHIT; MTA1; ERBB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; CDC20; STAT3; ERK1; HLA.DPB1;SGCB; CGA; DHPS; MGMT; CRIP2; MMP12; ErbB3; RAP1GDS1; CDC25B; IL6; CCND1; CYBA; PRKCD; DR4; Hepsina; CRABP1; AK055699; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; ZNF38; MCM2; GBP2; SEMA3F; CD31; COL1A1; ER2; BAG1; AKT1; COL1A2; STAT1; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; TK1, ErbB2, CCNB1, BIRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2, CD68, GSTM1, BCL2, ESR1, en una célula cancerosa obtenida de dicho paciente, y b) crear un informe que recoja los datos obtenidos por dicho análisis de expresión génica.

La célula cancerosa puede obtenerse de un tumor sólido. El tumor sólido puede ser seleccionado de entre un grupo compuesto por cáncer de mama, cáncer de

ovario, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. La célula cancerosa puede ser obtenida de una muestra de biopsia fijada, embebida enparafina, de dicho tumor. El ARN puede ser fragmentado. El informe puede incluir la recomendación de una modalidad de tratamiento para dicho paciente. En una realización del método, si se determina la expresión aumentada de uno o más de ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ED2; FBX05; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2;RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; ERBB2, CCNB1, BJRC5, STK6, MKI67, MYBL2, MMP11, CTSL2 y CD68; o el correspondiente producto de expresión, dicho informe incluye la predicción de que dicho sujeto tiene una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia. El método puede comprender el paso de tratar a dicho paciente con un agente quimioterapéutico. El paciente puede ser sometido a quimioterapia adyuvante. El paciente puede ser sometido a quimioterapia neoadyuvante. La quimioterapia neoadyuvante puede comprender la administración de un derivado de taxano. El taxano puede ser docetaxel o paclitaxel. La quimioterapia puede comprender además la administración de un agente anticáncer adicional. El agente anticáncer adicional puede ser un miembro de la clase de agentes anticáncer de las antraciclinas. El agente anticáncer es doxorubicina. El agente anticáncer adicional puede ser un inhibidor de la topoisomerasa. En una realización del método si se determina una expresión aumentada de uno o más de TBP; ABCC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; BSRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; EibB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRIP2; ErbB3; RAPIGDSI; CCND1; PRKCD; Hepsina; AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; GSTM1, BCL2, ESR1; o el correspondiente producto de expresión, dicho informe incluye la predicción de que dicho sujeto tiene una menor probabilidad de respuesta a la quimioterapia. El transcrito de ARN puede comprender una secuencia basada en intrón, cuya expresión se correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar la probabilidad de respuesta de un paciente a la quimioterapia, comprendiendo:

(a)

determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de los siguientes genes ACTB, BAG1, BCL2, CCNB1, CD68, SCUBE2, CTSL2, ESR1, GAPD, GRB7, GSTM1, GUSB, ERBB2, MKI67, MYBL2, PGR, RPLPO, STK6, MMP11, BIRC5, TFRC, o sus productos de expresión, y

(b)

calcular la puntuación de recurrencia (RS).

En una realización, los pacientes con una RS > 50 están situados en el percentil 50 superior de los pacientes con probabilidad de respuesta a la quimioterapia. En una realización, los pacientes con una RS < 35 se sitúan en el percentil 50 inferior de los pacientes con probabilidad de respuesta a la quimioterapia. La RS puede ser determinada por los siguientes subconjuntos de genes:

(i)

subconjunto de factor de crecimiento: GRB7 y HER2;

(ii)

subconjunto de receptor estrogénico: ER, PR, Bcl2, y CEGP1;

(iii) subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, y STK15; y

(iv) subconjunto de invasión: CTSL2, y STMY3;

donde un gen en cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede ser sustituido por un gen sustituto que coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson ≥ 0,40; y calcular la puntuación de recurrencia (RS) para dicho sujeto ponderando las contribuciones de cada uno de los subconjuntos (i) -(iv), a la recurrencia del cáncer de mama. El método puede comprender además la determinación de los transcritos de ARN de CD68, GSTM1 y BAG1 o sus productos de expresión, o los genes sustitutos correspondientes o sus productos de expresión, incluyendo la contribución de tales genes o genes sustitutos a la recurrencia del cáncer de mama en el cálculo de la RS. La RS puede determinarse aplicando la siguiente ecuación:

RS = (0,23 a 0,70) x umbr eje GRB7 -(0,17 a 0,55) x eje ER + (0,52 a 1,56) x umbr eje prolif. + (0,07 a 0,21) x eje invasión + (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1

Donde

I) eje GKB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2;

II) si eje GRB7 < -2, umbr eje GRB7 =-2, y si eje GRB7 > -2, umbr eje GRB7 = eje GRB7; III) eje ER = (Est1 +PR + Bcl2 + CEGP1)/4; IV) eje prolif = (SURV + Ki.67 + MYBL2 + CCNB1 + STK15)/5; V) si eje prolif < -3,5, umbr eje prolif = -3,5, si eje prolif ≥ -3,5, umbr eje prolif = eje prolif; y

(VI) eje invasión = (CTSL2 + STMY3)/2,3

donde las contribuciones individuales de los genes de (iii), (iv) y (vi) son ponderados por un factor de ponderación de 0,5 a 1,5, y donde una RS mayor representa una mayor probabilidad de recurrencia del cáncer de mama. La RS se puede determinar aplicando la siguiente ecuación:

RS (rango, 0 -100) =+0,47x Puntuación Grupo HER2 -0,34 x Puntuación Grupo ER

+

1,04 x Puntuación Grupo Proliferación

+

0,10 x Puntuación Grupo Invasión

+

0,05 x CD68 -0,08 x GSTM1 -0,07 x BAG1

El transcrito de ARN puede comprender una secuencia basada en intrón, cuya expresión correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la respuesta a la quimioterapia de un sujeto diagnosticado de cáncer, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de un transcrito de ARN de pronóstico o su producto de expresión, en una muestra biológica conteniendo células cancerosas obtenidas de dicho sujeto, donde el transcrito de ARN predictivo es el transcrito de BAG1, donde por cada unidad de expresión aumentada de BAG1 o el producto de expresión correspondiente, se prevé que dicho sujeto tenga una menor probabilidad de respuesta a la quimioterapia. El cáncer puede ser cáncer de mama y/o el sujeto puede ser un paciente humano. La quimioterapia puede ser quimioterapia neoadyuvante, especialmente donde dicha quimioterapia neoadyuvante comprende la administración de un miembro o miembros de la clase de agentes anticáncer de las antraciclinas. La quimioterapia neoadyuvante puede comprender la administración de doxorubicina. La quimioterapia neoadyuvante puede comprender la administración de un derivado del taxano, en especial donde el taxano es docetaxel y/o paclitaxel. La muestra biológica puede ser fijada, embebida en parafina, o fresca o congelada. El ARN puede ser aislado de una muestra de tejido de cáncer de mama fijada, embebida en parafina, de dicho paciente. La respuesta positiva puede ser una respuesta clínica completa. La respuesta positiva puede ser una respuesta patológica completa. El nivel de expresión de dicho transcrito de ARN puede ser determinado por RT-PCR. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la determinación de la probabilidad de respuesta de un paciente a la quimioterapia, comprendiendo:

(a) determinación de los niveles de expresión de los transcritos de ARN de los siguientes genes BAG1, ACTB, BCL2, CCNB1, CD68, SCUBE2, CTSL2, ESR1, GAPD, GRB7, GSTM1,GUSB, ERBB2, MKI67, MYBL2, PGR, RPLPO, STK6, MMP11, BIRC5, TFRC, o sus productos de expresión, y b) cálculo de la puntuación de recurrencia (RS).

La RS puede determinarse creando los siguientes subconjuntos de genes:

I) subconjunto de factor de crecimiento: GRB7 y HER2;

(II) subconjunto de receptor estrogénico: ER, PR, Bcl2, y CEGPl;

(III) subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, y STK15; y

(IV) subconjunto de invasión: CTSL2, y STMY3;

donde un gen en cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede ser sustituido por un gen sustituto que coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson de > 0,40; y calcular la RS de dicho sujeto ponderando las contribuciones de cada subconjunto (i)-(iv) a la recurrencia del cáncer de mama. El método puede comprender además la determinación de los transcritos de ARN de CD68, GSTM1 y BAG1, o sus productos de expresión, o los correspondientes genes sustituto o sus productos de expresión, e incluyendo la contribución de dichos genes o genes sustituto a la recurrencia del cáncer de mama en el cálculo de la RS. La RS puede determinarse aplicando la siguiente ecuación:

RS = (0,23 a 0,70) x umbr eje GRB7 -(0,17 a 0,55) x eje ER + (0,52 a 1,56) x umbr eje prolif + (0,07 a 0,21) x eje invasión + (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1

Donde

(I)

eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2;

(II)

si eje GRB7 < -2, umbr eje GRB7 = -2, y si eje GRB7 > -2, umbr eje GRB7 = eje GRB7;

(III) eje ER = (Est1 +PR + Bcl2 + CEGP1)/4;

(IV)

eje prolif = (SURV + Ki.67 + MYBL2 +CCNB1 + STK15)/5;

(V)

si eje prolif< -3,5, umbr eje prolif = -3,5,sieje prolif> -3,5, umbr eje prolif = eje prolif; y

(VI) eje invasión = (CTSL2 + STMY3)/2, donde las contribuciones individuales de los genes en (iii), (iv) y (vi) son ponderadas por un factor de 0,5 a 1,5, y donde una RS mayor representa una mayor probabilidad de recurrencia del cáncer de mama. La RS puede ser determinada aplicando la siguiente ecuación:

RS (rango, 0 -100) =+ 0,47 x Puntuación Grupo HER2 -0,34 x PuntuaciónGrupo ER +1,04 x Puntuación Grupo Proliferación

+

0,10 x Puntuación Grupo Invasión

+

0,05 x CD68 -0,08 x GSTM1 -0,07 x BAG1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GENOMIC HEALTH, INC. FONDAZIONE IRCCS ISTITUTO NAZIONALE DEI TUMORI

<120> MARCADORES DE EXPRESIÓN GÉNICA PARA LA PREDICCIÓN DE RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA

<130> KE/N32061

<140> Divisional de 09014283.7

<141> 2005-04-07

<150> EE UU 60/561,035

<151> 2004-04-09

<160> 340

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210>2 <211>22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 3

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 4 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 7

<211> 27

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> <223>Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 9

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Sonda sintética de oligonucleótido

<210>10 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210>11 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 12

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Synthetic Oligonucleotide Reverse Primer

<210> 15

<211> 24

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 17 20 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 18 30 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Sonda sintética de oligonucleótido

<211> 20

<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 21

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

30 <210> 24

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 25 40 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 26

<211> 24 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 27

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 28

<211> 20 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 29

<211> 19

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 30

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 31

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 34

<211> 21 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 35

<211> 22

<212>

ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 36

<211> 23

<212>

ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 37

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 38

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 39

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 40

<211> 25 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 41

<211> 23

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 42

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<400> 43

<210> 44

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 45

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 47

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 48

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 49

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 50

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 51

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

15 <210> 52

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 53 25 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 54

<211> 24 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido 40

<210> 55

<211> 21

<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 57

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 58 15 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 59

<211> 20 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 60

<211> 22

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 61

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 62

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 63 5 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 64

<211> 24 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador directo de oligonucleótido sintético

<223>

Cebador inverso de oligonucleótido sintético

30 <210> 66

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

45 <210> 68

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 69

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 70

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 72

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 73

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 74

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 75

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 76

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 77

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 78

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 79

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 80

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 81

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 83

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 85

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 86

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 87

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

15 <210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

25 <210> 90

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

35 <210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

45 <210> 92

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 93 55 <211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 94

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 95

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 96

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 97

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 98

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 99

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210>100 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 102

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 103

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 104

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 105

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 106

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<400> 106

<210> 107

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 109

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210>110

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210>111

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 112

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 113

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 114

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 115

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 116

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 117

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 118

<211> 26

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 121

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 122

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 123

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 124

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 125

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 127

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 128

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 129

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 130

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 131

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 132

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 133

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 134

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 135

<211> 30 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido 10

<210> 136

<211> 18 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético 20

<210> 137

<211> 23 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético 30

<210> 138

<211> 25 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido 40

<210> 139

<211> 20 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético 50

<210> 140

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 141

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 142

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 143

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 144

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 145

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 146

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 147

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 148

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 149

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 150

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 151

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 152

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 153

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 154

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 155

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 156

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 157

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 158

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 159

<211> 22

<212>

ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 160

<211> 20

<212>

ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador directo de oligonucleótido sintético

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

40 <210> 162

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 163 50 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 164

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

15 <210> 165

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

25 <210> 166

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

35 <210> 167

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210>

168 45 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210>

169 55 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<400> 169

<210> 170

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 171

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 172

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 173

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 174

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 175

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 176

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 177

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 178

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 179

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 180

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 181

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 182

<211>

24 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 183

<211>

24 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 184

<211>

21 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 185

<211>

20 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 186

<211>

24 55 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 187

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 188

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 190

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

45 <210> 191

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 192 55 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 193

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 194

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 195

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 196

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 197

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 198

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 199

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210>200 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 201

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 202

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 203

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 204

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 205

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 206

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 207

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 208

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 209

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 210

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210>211 <211>20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 212

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 213

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 214

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 215

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223>Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 216

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 217

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 218

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 219

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 220

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 221

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 222

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 223

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 224

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 225

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 226

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 228

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 229

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 230

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 231

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 232

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<400> 232

<210> 233

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 234

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 235

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 236

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 237

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 238

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 239

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 240

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 241

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 242

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 243

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 244

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 245

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 246

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 247

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 248

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 249

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 250

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 251

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 252

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda sintética de oligonucleótido

<210> 253

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de oligonucleótido sintético

<210> 254

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de oligonucleótido sintético

<210> 255

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<210> 256

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 257

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 258

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 260

<211> 71

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 261

<211> 71

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 262

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 263

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 264

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 265

<211> 83

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 266

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 267

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 268

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 269

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 270

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 271

<211> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 272 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 273

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 274

<211> 77

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 275

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 276 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<400> 276

<210> 277

<211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 278

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 279

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 280

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 281

<211> 77

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 282

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 283 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 284

<211> 83

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 285

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 286

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 287

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 288

<211> 86

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 289

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 290

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 291

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 292

<211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 293

<211> 90

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 294

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 295

<211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 296

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 297 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<400> 297

<210> 298

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 299

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 300

<211> 83

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 301

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 302

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 303

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 304

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 305

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 306

<211> 83

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 307

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 308

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 309

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 310 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 311

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 312

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 313

<211> 82

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 314

<211> 71

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 315

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 316

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 317

<211> 82

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 318

<211> 77

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<400> 318

<210> 319

<211> 71

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 320

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 321

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 322 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 323

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 324

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 325

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 326

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 327

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 328 <211>68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 329

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 330

<211> 86

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 331

<211> 77

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 332

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon <210> 333

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 334

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<223> Amplicon

<210> 335

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 336

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 337

<211> 66

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 338

<211> 89

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<210> 339

<211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

<400> 399

<210> 340

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Amplicon

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para predecir la probabilidad de respuesta a la quimioterapia de un paciente humano diagnosticado de cáncer de mama, comprendiendo; medir el nivel de expresión de un transcrito de ARN de GBP1 en una muestra comprendiendo células cancerosas obtenidas de dicho paciente antes de la quimioterapia, y normalizar el nivel del transcrito de ARN de GBP1 para obtener un nivel de expresión de GBP1 normalizado, donde el nivel de expresión de GBP1 normalizado del paciente va asociado a una mayor probabilidad de respuesta a la quimioterapia, si el nivel de expresión de GBP1 normalizado del paciente es mayor comparado con el nivel de expresión de GBP1 normalizado en pacientes con cáncer de mama, de muestras sin posterior respuesta patológica a la quimioterapia .

2. 2.

   El método, como se expone en la reivindicación 1, donde el cáncer es cáncer de mama invasivo.

3. 3.

   El método como se expone en la reivindicación 1 o 2, donde la quimioterapia es quimioterapia adyuvante.

4. 4.

   El método como se expone en la reivindicación 1, 2 o 3, donde la quimioterapia es quimioterapia neoadyuvante.

5. 5.

   El método como se expone en la reivindicación 4, donde la quimioterapia neoadyuvante comprende la administración de un derivado del taxano.

6. 6.

   El método como se expone en la reivindicación 5, donde el derivado de taxano es docetaxel o paclitaxel.

7. 7.

   El método como se expone en la reivindicación 1 o 2, donde la quimioterapia comprende además la administración de un agente anticáncer adicional.

8. 8.

   El método como se expone en la reivindicación 7, donde el agente anticáncer adicional es un miembro de la clase de agentes anticáncer de las antraciclinas.

9. 9.

   El método como se expone en la reivindicación 8, donde el agente anticáncer adicional es doxorubicina.

10. 10.

    El método como se expone en la reivindicación 7, donde el agente anticáncer adicional es un inhibidor de la topoisomerasa.

11. 11.

    El método como se expone en cualquier reivindicación precedente, donde la muestra es tejido fijado, embebido en parafina (PET).

12. 12.

    El método como se expone en cualquier reivindicación precedente, donde el nivel de expresión del transcrito de ARN es determinado por un método basado en PCR.

13. 13.

    El método como se expone en la reivindicación 12, donde el nivel de expresión del tanscrito de ARN es determinado por RT-PCR.

    FIG. 1