ES2636484T3 - Material de separación que comprende derivados de colina de fosforilo - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula general (I)**Fórmula** donde b se selecciona entre 2 y 3; R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11y -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el átomo de nitrógeno al que están conectados un heterociclo seleccionado de:**Fórmula** donde uno o más átomos de hidrógeno pueden ser sustituido por (a) átomo de flúor; X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C ≡ CH, -CH >= CH2, -N3 y -CHO; R3 se selecciona entre: -H, -CH3, -C2H5y -C3H7; -L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld-Lc-Le-, en donde -La se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2-CH2-O)m-CH2-,**Fórmula** -Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2 -; -Ld- se selecciona entre: -(CH2)n-, -(CH2-CH2-O)n-CH2-,**Fórmula** Le- se selecciona entre: -(CH2) p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-,**Fórmula** m, n, p1 y p2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y los enantiómeros, mezclas de enantiómeros, tautómeros, hidratos, solvatos, racematos, formas protonadas y deprotanadas de los compuestos mencionados anteriormente.
Description
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Material de separacion que comprende derivados de colina de fosforilo Descripcion
[0001] La presente invencion proporciona derivados de colina de fosforilo de la formula general (I), que son adecuados para ser inmovilizados sobre un soporte solido para proporcionar un material de separacion de formula general (II), que se unen tanto con alta afinidad como alta especificidad, mas especlficamente a protelna C reactiva y anticuerpos de colina de anti-fosforilo. Dichos materiales de separacion son particularmente utiles en la extraccion extracorporal de la protelna C reactiva y anticuerpos de colina de anti-fosforilo de un fluido biologico de un paciente para profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares. Tambien se proporciona una columna que comprende el material de separacion de formula general (II), as! como un dispositivo que contiene la columna.
Antecedentes de la invencion
[0002] La protelna C reactiva (PCR) es un reactante de fase aguda producida por el hlgado en respuesta a la liberacion de citoquinas durante la inflamacion. Durante mucho tiempo se ha utilizado en la practica cllnica para seguir la inflamacion sistemica, especialmente la infeccion bacteriana. Mas recientemente, la evidencia epidemiologica ha demostrado que los niveles basales de PCR, en ausencia de enfermedad inflamatoria aparente, pueden ser informativos en la prediccion de futuros eventos miocardicos o cerebrovasculares (Ridker et al., 2001, 103, 1813). Tambien es de interes el hecho de que la CRP es un potencial marcador inflamatorio que se cree que es de valor en la prediccion de eventos coronarios (Danesh et al, N. Engl. J. Med. 2004 350, 1387) y que la PCR es un factor causal de los procesos destructivos observados durante las semanas posteriores al infarto de miocardio (Slagman et al., Blood Purif., 2011, 31, 9).
[0003] Varios estudios han demostrado la afinidad de union de colina de fosforilo (PC) para la PCR. Por lo tanto, los derivados de PC inmovilizados sobre un soporte solido se usan ampliamente para aislar protelnas de union a PC de diferentes fuentes biologicas. Sin embargo, la aplicacion cllnica mas importante de los derivados de PC anteriormente mencionados inmovilizados sobre soporte solido es la extraccion extracorporal de la protelna C reactiva y anticuerpos de colina de anti-fosforilo de un fluido biologico.
[0004] WO 90/12632 describe un metodo para eliminar los anticuerpos de colina de PCR y anti-fosforilo a partir de fluidos biologicos para mejorar las respuestas inmunitarias celulares de los mismos, y un metodo para eliminar los anticuerpos de colina de PCR y anti-fosforilo de la circulacion de pacientes con cancer para llevar a la perfusion extracorporal del plasma sangulneo de un paciente a traves de un dispositivo de adsorcion de la matriz de fosforilocolina para mejorar las respuestas inmunes celulares del paciente contra el cancer.
[0005] El documento WO2007/076844 describe un metodo para tratar el riesgo de acumulacion de CRP mediante la realizacion de una perfusion extracorporal del plasma sangulneo de pacientes que presentan un riesgo de enfermedades cardiovasculares o disfunciones inmunes tales como enfermedades autoinmunes por medio de una columna, que contiene material matriz absorbente que incluye derivados de PC para eliminar la PCR de los llquidos biologicos del paciente con el fin de prevenir y/o tratar enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares tales como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, diabetes, reumatismo e insuficiencia renal.
[0006] La slntesis del derivado de PC de albumina de suero bovino (PC-BSA), tambien se describio su inmovilizacion sobre Toyopearl® HW 65 y su uso para la purificacion por afinidad CRP (Stults et al. Anal. Biochem. 1987, 161, 567). En este estudio, la inmovilizacion del derivado de PC en el soporte solido se consiguio mediante la formacion de un enlace fosfodiester. Otros derivados de PC se inmovilizaron de forma similar sobre un soporte solido (Spande TFJ Org. Chem. 1980, 45, 3081, Martin, LM Tetrahedron Lett., 1996, 37, 7921).
[0007] El documento WO2013/176084 A1 da a conocer tambien un compuesto de fosforamidato de sililoalquilo de la formula general (1) para revestir un dispositivo medico con el fin de suprimir la adhesion del material biologico, tal como plaquetas.
[0008] El documento WO2012/160187 A1 proporciona derivados de acido fosfonico para el uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, autoinmune y/o trastorno alergico que contiene amonio. Se postula que los compuestos descritos ejercen su actividad farmacologica mediante la inhibicion de la via de paso fosfoinositida 3-quinasa (PI3K)/Akt
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quinasa.
[0009] El uso de 1-propanamiunium, N,N-dimetilo-3-[(1-oxodecilo)amino]-N-[2-fosfonoxi)etilo] como agente de aceitado en peliculas de poliester (DATABASE CA [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 2013, JIN, YIFENG ET AL: "Oiling agent for industrial polyester filament and its manufacture", XP002732938, obtenido de base de datos STN n° de acceso: 2013: 209183) y como tensioactivo (DATABASE CA [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 1980, "Betaine derivatives", XP002732939, obtenido del numero de acceso a la base de datos STN. 1980: 200147).
[0010] Segun nuestro conocimiento, hasta el presente la inmovilizacion de PC en soporte solido se logro solo a traves de formacion de un enlace fosfodiester. La inmovilizacion de derivados de PC a traves de la formacion de enlaces fosfodiester tiene algunas ventajas, pero tambien inconvenientes graves. El principal inconveniente de este enfoque es que la formacion de enlace fosfodiester cambia la carga global (carga neta) de la molecula de PC y, por tanto, altera la orientacion de PC modificada en un bolsillo de union. Ademas, un enlace fosfodiester puede ser facilmente escindido por fosfodiesterasas no especificas presentes en los fluidos biologicos que conducen a problemas de inestabilidad de las matrices, que fueron sustituidas de tal manera.
[0011] Para eliminar los inconvenientes mencionados anteriormente, es el objetivo de la presente invencion proporcionar compuestos, que pueden ser inmovilizados sobre un soporte solido para proporcionar un material de separacion que se une tanto con alta afinidad como alta especificidad de PCR para la profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares por extraccion extracorporal de CRP y anticuerpos de colina de anti-fosforilo.
[0012] Este objetivo se resuelve mediante los compuestos de formula general (I) segun la reivindicacion independiente 1, el material de separacion de acuerdo con la reivindicacion independiente 5 para uso en la eliminacion extracorporal de anticuerpos de CRP y de colina de anti-fosforilo de un fluido biologico de un paciente para profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares.
[0013] El objetivo de la presente invencion se resuelve mediante la ensenanza de las reivindicaciones independientes. Otras caracteristicas, aspectos y detalles mas ventajosos de la invencion son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la description, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.
Descripcion de la invencion
[0014] Asi, la presente invencion se refiere a un compuesto de formula general (I)
x—L
R1
N
/
\
frO
R2
0
II
—P—O'
1
OH
(i)
donde
b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 son independientemente uno del otro seleccionados entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11 y -C6H13, o R1 y R2 puede formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
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En el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomo de fluor; X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;
R3 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5 y -C3H7;
-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld-Lc-Le-, donde
-La- se selecciona de: -(CH2)m-, -(CH2-CH2-O)m-CH2-,
y
-Lb- y -Lc- son
del otro seleccionados entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -OC(O)-NH- y -SO2 -; -Ld- se selecciona de: -(CH2)n-, -(CH2-CH2-O)n-CH2-,
independientemente uno
-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-,
y
m, n, pi y p2 son independientemente entre si seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;
y enantiomeros, mezclas de enantiomeros, tautomeros, hidratos, solvatos, racematos, formas protonadas y desprotonadas de los compuestos anteriormente mencionados.
[0015] Esta claro para la persona experta que la extremidad izquierda del fragmento -L- esta conectada a X y la extremidad derecha del fragmento -L- esta conectado a
R
\
/
N
Mr
o
o
II
-p-o
OH
[0016] Lo mismo se aplica a los fragmentos: -La-, -Lb-, -Lc-, -Ld- y -Le-.
[0017] Asl, por ejemplo, si -L- representa -La-Lb-Le-con -La- siendo -(CH2)m-, -Lb- siendo -O-C(O)-NH-, y -Le- siendo
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-(CH2)pi-O-(CH2)p2-, entonces el compuesto de formula general (I) es la siguiente:
[0018] La expresion de tautomero tal como se utiliza aqui, se refiere a un compuesto organico que es interconvertible mediante una reaccion quimica llamada tautomerizacion. La tautomerizacion se cataliza mediante bases, acidos u otros compuestos adecuados.
[0019] Los compuestos preferidos de la presente invencion son compuestos de formula general (I):
x—L
Ri
/N\
R2
0
II
—P—0
1
OH
(I)
donde b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 son independientes uno del otro seleccionados entre: -CH3 y -C2H5, o
R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados, un heterociclo seleccionado de:
y
En el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomos de fluor;
X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;
R3 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5 y -C3H7;
-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-L -Ld-Lc-Le-, donde
-La- representa: -(CH2)m- o -(CH2-CH2-O)m-CH2-;
-Lb- y -Lc- son independientes el uno del otro, seleccionados de: -O-,
-NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2 -;
-Ld- representa: -(CH2)n- o -(CH2-CH2-O)n-CH2-;
-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1- y -(CH2)p1-O-(CH2)p2-; y
M, n, p1 yP2 son independientemente entre si seleccionados de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
[0020] Una forma de realizacion preferida segun la presente invencion esta dirigida a compuestos de formula general (I), en la que X se selecciona de: -SH, -NHR3, y -CHO, y mas preferiblemente se selecciona de: -SH y-NHR3.
[0021] Otra realizacion preferida de la presente invencion se refiere a compuestos de formula general (I), en la que X representa: -C = CH, -cH = CH2, o -N3.
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[0022] Los compuestos preferidos de la presente invencion son compuestos de la siguiente formula general (III), (IV), (V) y (VI):
o
X La^ II .
N^^O—P—O
Rl/ R2 OH
O
La "Nt bO-P-O
/ \
R17 R2
I
OH
IV
O
/La^ +J^ II
x Lb r<bO—p—o'
r/ ^R2
OH
V
O
.La /Ld\ /L\ + II
X' ^Lb^ Lc Nv bO—P—O’
/ \
Rt R2
I
OH
VI
donde
-La- representa: -(CH2)m- o -(CH2-CH2-O)m-CH2-;
-Lb- y -Lc- son independientes uno de otro seleccionados entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2-;
-Ld- representa: -(CH2)n- o -(CH2-CH2-OVCH2-;
-Le- se selecciona de: -(CH2)p1- y -(CH2)pi-O-(CH2)p2-,
m, n, pi y p2 son independientemente entre si seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y b, X, R1 y R2 tienen los significados definidos anteriormente.
[0023] Los compuestos especialmente preferidos son compuestos de formulas generales (I), (III), (IV), (V) y (VI), en los que R1 y R2 son independientementes uno de otro seleccionados de: -CH3 y-C2Hs;
X se selecciona de: -SH y -NHR3;
R3 se selecciona de: -H, -CH3, -C2Hsy -C3H7; y -La- representa: -(CH2)m-.
[0024] Una forma de realizacion aun mas preferida se refiere a compuestos de formula general (I)
donde b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11, -C6H13, o R1 y R2
pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
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en el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomos de fluor;
X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;
R3 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7;
-L- se selecciona entre: -(CH2V, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)p1-, -(CH2)m- o -(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)p1-, - (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2-, y-(CH2)m-O- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2-; y m, n, p1 y P2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
[0025] Preferiblemente, los compuestos de formula general (I) se seleccionan de entre:
1 Hidrogenofosfato de 2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dietilo-amonio]etilo
2 Hidrogenofosfato de 2-[4-[2-(2-aminoetoxi)etilo]morfolina-4-io-4-ilo]etilo
0
3 Hidrogenofosfato de 2-[1 -[2-(2-aminoetoxi)etilo]piperidina-1 -io-1-ilo]etilo
0
4 Hidrogenofosfato de 2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio]etilo
5 Hidrogenofosfato de 2-[3-aminopropilo(dimetilo)-amonio]-etilo
6 Hidrogenofosfato de 2-[dimetilo(4-sulfanilbutilo)amonio]etilo
7 Hidrogenofosfato de 2-[4-azidobutil (dimetilo)amonio]etilo
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8 Hidrogenofosfato de 2-[dimetilo(pent-4-inilo)amonio]etilo
9 Fosfato de hidrogeno de 2-[3-(6-aminohexanolloamino)propil-dietilo-amonio]etilo
10 Hidrogenofosfato de 2-[1 -[2-[2-(6-aminohexanolloamino)etoxi]etilo]piperidina-1-io-1-ilo]etilo
11 2-[4-[2-[2-[3-(6-aminohexanolloamino)propanolloamino] etoxi]etilo]morfolina-4-io-4-ilo]etilo
12 Hidrogenofosfato de 2-[1-[2-[2-[6-(6-aminohexanolloamino) hexanolloamino] etoxi]etilo] pirrolidin-1-io-1-ilo]etilo
13 Hidrogenofosfato de 2-[2-aliloxietilo (dimetilo)amonio]etilo
14 Hidrogenofosfato de 2-[2-aliloxietilo (dietilo)amonio]etilo
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15 Hidrogenofosfato de 2-[4-(2-aliloxietilo) morfolina-4-io-4-ilo]etilo
16 Hidrogenofosfato de 2-[1-(2-aliloxietilo) piperidi na-1 -io-1-ilo]etilo
17 Hidrogenofosfato de 2-[2-[2-(6-aminohexanolloamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo
18 Ester metllico del acidO2-[2-[2-[3-(6-aminohexanolloamino)propanolloamino] etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo
19 Hidrogenofosfato de 2-[3-azidopropilo(dimetilo)amonio]etilo
20 Hidrogenofosfato de 2-[dimetilo-[2-[2-(prop-2-inoxicarbonilamino)etoxi]etilo] amonio]etilo
21 Hidrogenofosfato de 2-[2-[2-(aliloxicarbonilamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo
22 Hidrogenofosfato de 2-[2-[2-[6-(aliloxicarbonilamino) hexanolloamino] etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo
23 Hidrogenofosfato de 2-[2-(6-aminohexanolloamino)etilo-dimetilo-amonio]etilo
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24 Hidrogenofosfato de 2-[dimetilo-[3-[6-(prop-2-inoxicarbonilamino) hexanolloamino] propil] amoniojetilo
25 Hidrogenofosfato de 2-[3-(6-aminohexanolloamino)propil-dimetilo-amonio]etilo
o
[0026] Los compuestos de la invencion de la presente invencion fueron disenados de modo que puedan ser inmovilizados en soportes solidos para proporcionar materiales de separacion que presentan mayor estabilidad, mayor afinidad y una mayor selectividad para la PCR en comparacion con los materiales de separacion descritos por la tecnica anterior. Esto se logro reemplazando uno de los sustituyentes alquilo del grupo tri-alquilamonio de la fosforilocolina con el resto -L-X. El resto de -L-X permite la inmovilizacion de los compuestos de formula general (I) a un soporte solido sin modificar la carga total de la molecula de colina de fosforilo y evitando la presencia del enlace fosfodiester inestable en el constructo.
[0027] Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas un material de separacion de formula general (II):
A—L*—Y—Lx + N
O
II
■O 'fro—p—o' / I
OH
Rt R2
(II)
donde
b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11 y -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
en el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomo(s) de fluor;
Y se selecciona entre: -CH (OH)-CH2-N(R4)-, -CH (OH)-CH2-S-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2 -,
y
5
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65
R4 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7y -C(O)-CH3;
-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld-Lc-Le-, en donde -La- se selecciona de: -(CH2)m-, -(CH2-CH2-O)m-CH2-,
y
-Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2 -; -Ld- se selecciona de: -(CH2)n-, -(CH2-CH2-O)n-CH2-,
-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-,
-L *- se selecciona de: L*a-, -L*a* -Le- y -L*a L*b-L*e-, en donde
-L*a- se selecciona de entre: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o -C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2- y -CH2-CH(OH)-CH2-;
-L*e- se selecciona entre: -(CH2)q-, -C2H4-(O-CH2-CH2)q-, y -CH2-(O-CH2-CH2)q-;
-L*b- se selecciona de: -O-(CH2) r -O-, -S-(CH2)r-S-, -SO2 -, -S-, -O-, -NH-C(O), -C(O)-NH- y -S-S-; y m, n, p1, p2, o, r, q son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;
[0028] A es un soporte solido seleccionado del grupo que consiste en: polivinilpirrolidona (PVP), polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), poliacrilato, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(glicidilo- metacrilato), poli(metacrilato de hidroxi), poliestireno (PS), politetrafluoroetiloeno (PTFE), poliacrilamida, poliacrolina, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), poliacrilonitrilo (PAN), poliuretano (PU), eupergit®, polietiloenglicol (PEG), hiperfluorocarbono, agarosa, alginato, carragenano, quitina, almidon, celulosa, nitrocelulosa, sepharose®, vidrio, sllice, kieselguhr, zirconia, alumina, oxido de hierro y mezcla y/o derivados de dichos soportes solidos;
y formas protonadas y desprotonadas de este material de separation.
[0029] Esta claro para la persona experta que la extremidad izquierda del fragmento -L*- esta conectado a A, la
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extremidad derecha del fragmento -L*- esta conectado a la extremidad izquierda del fragmento Y, la extremidad derecha del fragmento Y esta conectada a la extremidad izquierda del fragmento -L-, cuya extremidad derecha esta conectada a
R1
\
/
N
M
o
II
O-P-Cr b OH
[0030] Lo mismo se aplica a los fragmentos: -La-, -Lb-, -Lc-, -Ld-, -Le-, -L*a-, -L*b- y -L*e-.
[0031] Asl, por ejemplo, si -L*- representa -L*a*-L*b-L*e- con -L*a- siendo -CH2-CH(OH)-CH2 -, -L*b- siendo -O-, -L*e-
siendo -(CH2)q-, y representa -CH(Oh)-CH2-N(R4)-, -L- representa -La-Lb-Le- con -La- siendo -(CH2)m-, el material de separacion de formula general -, -Lb- siendo -O- C(O)-NH-, y -Le- siendo -(CH2)pi-O-(CH2) p2 (II) es el siguiente:
[0032] Tal como se usa en este documento, el soporte solido A se refiere a un soporte inerte solido que en prevision de la inmovilizacion covalente de los compuestos de la invencion de formula general (I), (III), (IV), (V) y (VI) se funcionaliza con el resto -L*-FG, en la que FG es un grupo funcional reactivo que es adecuado para reaccionar con el grupo funcional X. Ejemplos de grupos FG incluyen, pero no se limitan a: epoxido, -CHO, -C = Ch, -CH = CH2, -N3, -CH(oH)- CH2-N3,-NH2, -SH, tresilo. La funcionalizacion del soporte solido se consigue a traves de metodos bien conocidos por el experto en la materia (Chin. J. Chem., 2012, 30, 2473, Polim. Int. 2013, 62, 991). Ademas, los soportes solidos funcionalizados ya estan disponibles comercialmente: Toyopearl® AF-epoxi, Toyopearl® AF-amino, Toyopearl® AF- tresyl, TSKgel® tresyl, Sepharose® 6B activado con epoxi (GE Healthcare Life Sciences), Sepharose® 4 de flujo rapido activado por CNBr (GE Healthcare Life Sciences), Sepharose® 4B (GE Healthcare Life Sciences) activado por NHS, Sepharose® 4 de flujo rapido (GE Healthcare Life Sciences), Sepharose® 4 de flujo rapido (Affiland) activado por vinilsulfona terminal, Separopore® aldehldo (Agarosa) 4B, ECH Separopore® (Agarosa) 4B (Separopore).
[0033] El soporte solido puede ser sometido a reticulacion u otros tratamientos para aumentar la estabilidad flsica o qulmica, y se puede formar en varias formas, incluyendo pero no limitado a fibras, laminas, varillas, perlas, y membranas.
[0034] Preferiblemente, el soporte solido A se selecciona de polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos.
[0035] Soportes solidos basados en PS, PES y PAES pueden ser modificados de manera que presenten en su superficie el resto -L*- FG, en donde FG es un grupo funcional reactivo que es adecuado para reaccionar con el grupo funcional X (Chin J Chem. 2012, 30, 2473, Polim. Int. 2013,62, 991). Dicha modificacion da como resultado el aumento de la propiedad anti-incrustante, la biocompatibilidad y otras funciones especlficas.
[0036] Materiales de separacion preferida de la presente invencion son materiales de separacion de formula general (II):
y formas protonadas y desprotonadas, en las que
b se selecciona entre 2 y 3;
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R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, O R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
En el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomos de fluor;
Y se selecciona entre: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2 -,
y
R4 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -C(O)-CH3;
-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-L -Ld-Lc-Le-, donde
-La- representa: -(CH2)m- o -(CH2-CH2-O)m-CH2-;
-Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2 -; -Ld- se selecciona de: -(CH2) n- y -(CH2-CH2-O)n-CH2-,
-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1- y -(CH2)p1-O-(CH2)p2-;
-L*- se selecciona de: L*a-, -L*a* -Le- y -L*a-Lb*-L*e-, en donde
-L*a- se selecciona de entre: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2- y -CH2-CH(OH)-CH2-;
-L*e- se selecciona entre: -(CH2)q-, -C2H4-(O-CH2-CH2)q-, y -CH2-(O-CH2-CH2)q-;
-L*b- se selecciona de: -O-(CH2)r-O-, -S-(CH2)r-S-, -SO2 -, -S-, -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH- y-S-S-; m, n, p1, p2, o, r, q son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y A tiene el significado definido anteriormente, y mas preferiblemente A se selecciona entre polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos.
[0037] Una realizacion preferida segun la presente invencion esta dirigida a materiales de separacion de formula general (II), en donde Y se selecciona de: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-CH2-S-, - S- CH2-CH2-,
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y
y mas preferiblemente seleccionado de: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, y -CH(OH)-CH2-S-.
[0038] Tambien se prefieren los materiales de separacion de formula general (II), en donde Y representa:
o
[0039] Los compuestos preferidos de la presente invencion son compuestos de la siguiente formula general (VII), (VIII), (IX) y (X)
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65
o
A 'O-P-O
R!7 R2 OH
VII
o
I \ ^La\ ^Le +^SL II
A Y Lb sNv bO—P—O
r/ R2 qH
IX
J-a^ /Ldx ^\_e +
O
Nv ' 'b O—P—O
/ \
R1 R2
I
OH
donde
-La- se selecciona de entre: -(CH2)m- y -(CH2-CH2-O)m-CH2-;
-Lb- y -Lc- son independientemente uno de otro seleccionados entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -
SO2-;
-Ld- se selecciona de: -(CH2) n- y -(CH2-CH2-OVCH2-;
-Le- se selecciona de: -(CH2)p1- y -(CH2)-O- p1 (CH2)p2-;
m, n, p1, p2, o, r, q son independientemente uno de otro seleccionados de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y b, A, L *, Y, R1 y R2 tienen los significados definidos anteriormente.
[0040] Materiales de separacion especialmente preferidos son materiales de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) y (X), en donde
-L*- se selecciona entre: -L*a-, -L*a* -Le- y -L*a* -Lb* -L*e-; y -L*a- se selecciona de: -(CH2) o- y -CH2-CH(OH)-CH2-;
-L*e- representa-(CH2)q-;
-L*b- se selecciona de: -O-(CH2)r-O-, -S-(CH2)r-S-, -S- y -O-; Y o, q y r son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
[0041] En las formulas generales (II), (VII), (VIII), (IX) y (X), L* representa preferiblemente -L*a -Lb* -L*e- y A se selecciona preferiblemente de: polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados.
[0042] otra realizacion preferida de la presente invencion se dirige a materiales de separacion de las formulas generales (II), (VII), (VIII), (IX) y (X), en donde
R1 y R2 son independientemente el uno del otro, seleccionados de: -CH3 y -C2H5;
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Y se selecciona entre: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-O-, -CH2-NH -, -S-CH2-CH2- y -CH2-CH2-S-
R4 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7y -C(O)-CH3; y -La- representa-(CH2)m-.
[0043] Una forma de realizacion aun mas preferida se refiere a un material de separacion de formula general (II)
donde
R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11 y -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
y
en el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomos de fluor;
Y se selecciona entre: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -S- CH2-CH2- y -CH2-CH2-S-,
y
R se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7y -C(O)-CH3;
-L- se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2) mOC(O)-NH-(CH2)p1-, -(CH2)m- o -(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)p1-, - (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m-
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C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)pi-O-(CH2) p2- y -(CH2)m- o - C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)pi-O-(CH2)p2-; m, n, pi yP2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y b, A y L* tienen los significados definidos anteriormente y mas preferiblemente A se seleccionan de: polisulfona (PS), polietersulfona (PES), polieilarolesulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos y formas protonadas y desprotonadas de dicho material de separacion.
[0044] otra realizacion preferida se refiere a un material de separacion de formula general (II)
A—L*—Y—U °
hO ^O—P—O" / \ I
R1 R2 OH
(II)
donde b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -CsHny -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
en el que uno o mas atomos de hidrogeno pueden ser sustituidos por (a) atomo de fluor;
Y se selecciona entre: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -S-CH2-CH2- y -CH2-CH2-S-;
R se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7y -C(O)-CH3;
-L- se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)p1-, -(CH2)m- o -(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)p1-, - (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2- y -(CH2)m-O- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2-; y m, n, p1 y p2 independientemente entre si se seleccionan de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;
-L*- se selecciona entre: -(CH2)O-, -(CH2-CH2-O)O-C2H4 -, -(CH2-CH2-O)O-CH2-C(O)-NH-(CH2)q-, -(CH2) o -SO2- (CH2)q-, -CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-, -CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH2)r-O-CH2-, y-(CH2-CH2-O)O-C2H4 -O-CH2-; o, r y q independientemente entre si se seleccionan de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y A tiene el significado definido anteriormente y mas preferiblemente se selecciona de: polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos.
[0045] Otra realizacion preferida se refiere a materiales de separacion de formula general (II)
y sus formas protonadas y desprotonadas donde b se selecciona entre 2 y 3;
R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -CsHny -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
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En el que uno o varios atomos de hidrogeno pueden sustituirse por (a) atomo de fluor; Y se selecciona de:
-L- se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)p1-, -(CH2)m- o -(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)p1-, - (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- o -C(O)-NH-(CH2)n- o -(CH2)p1-, -(CH2)m- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2- y -(CH2)m-O- C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)p1-O-(CH2)p2-; Y m, n, p1 y p2 independientemente entre si se seleccionan de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;
-L*- se selecciona entre: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4 -, -(CH2-CH2-O)o-CH2-C(O)-NH-(CH2)q-, -(CH2) o -SO2- (CH2)q-, -CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-, -CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH2)r-O-CH2-, y-(CH2-CH2-O)o-C2H4 -O-CH2-; o, r y q son independientemente uno de otro seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y A tiene el significado definido anteriormente y mas preferiblemente se selecciona entre polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos.
Indicaciones:
[0046] Sorprendentemente, se encontro que los compuestos mencionados anteriormente de formula general (I), (III), (IV), (V) y (VI), as! como los materiales de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) y (X) son vinculantes con alta afinidad y alta selectividad y anticuerpos de colina anti-fosforilo CRP. Por lo tanto, los compuestos de la invencion y los materiales de separacion son utiles para la eliminacion de CRP y anticuerpos de colina de anti-fosforilo de fluidos biologicos.
[0047] Una realizacion de la presente invencion se refiere a un metodo de eliminacion extracorporal de la PCR a partir de un fluido biologico de un paciente para la profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares que comprenden pasos:
a) proporcionar un material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) o (X); y
b) poner en contacto el fluido biologico del paciente con el material de separacion.
[0048] Para este proposito, el material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) y (X) se carga en una columna, siendo dicha columna util para la eliminacion extracorporal de la PCR a partir de un fluido biologico de un paciente para profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares.
[0049] Tal como se usa aqul, el termino fluido biologico abarca sangre, plasma sangulneo, fluido peritoneal y fluido linfatico.
[0050] Las dimensiones de la columna no son crlticas, y tienen que ser elegidas de modo que esten adaptadas al flujo del fluido biologico extraldo del paciente, que esta altamente asociado al peso corporal del paciente. La columna que comprende el material de separacion de la presente invencion debe esterilizarse, por ejemplo con un gas esterilizante tal como oxido de etiloeno, y se usa inmediatamente o se sella y se almacena para uso posterior. Antes de su uso, la columna debe lavarse con solucion salina normal seguida de un lavado con solucion salina normal que contiene cualquier otro ingrediente preparatorio adecuado. La columna puede ser de diseno de cartucho convencional, lecho fluidizado, lecho expansible o un monolito. La preparacion de tales columnas es bien conocida por el experto en la
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materia. Por ejemplo, la preparacion de una columna de un diseno de cartucho convencional se puede realizar como se describe en la solicitud de patente EP 0237659 A1.
[0051] La regeneracion de la columna es tambien posible. Para los propositos de regeneracion, una solucion salina al 0,9% podrla, por ejemplo, ser utilizada para el lavado de la columna. A continuacion, el valor pH se reduce por el uso de una glicina/HCl (pH 2,8) con el fin de romper la conexion entre la CRP y el material de separation, seguido de un paso de lavado con PBS (Phosphate Buffered Saline) a un valor pH de 7,4 y una paso de lavado final con solucion salina al 0,9%.
[0052] Opcionalmente, la columna que comprende el material de separacion de la presente invention contiene materiales de separacion adicionales adecuados para la elimination de otras sustancias de interes de un fluido biologico de un paciente. Las otras sustancias son protelnas preferibles. Ejemplos de otras sustancias son la interleucina-6, interleucina-1, TNFa, suero amiloide P-componente (SAP), la PTX3, el fibrinogeno, los anticuerpos (tales como IgG, IgE), anticuerpos de anti-fosfollpido y componentes del sistema de complemento tales como C1 q, C3a o C5a.
[0053] La columna de la presente invencion se puede incorporar en un dispositivo para proporcionar un dispositivo apropiado para la eliminacion extracorporal de la PCR a partir de un fluido biologico de un paciente para la profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares.
[0054] Asl, el dispositivo segun la presente invencion comprende:
a) una columna que comprende un material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) y (X); y
b) un aparato para poner en contact ex vivo la columna que comprende el material de separacion con un fluido biologico de un paciente, disminuyendo de ese modo el nivel de CRP en dicho fluido biologico y para devolver el fluido biologico al paciente.
[0055] Debido a la alta afinidad y selectividad de los compuestos de formula general (I), el material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) y (X), la columna que comprende la material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) o (X), y comprendiendo el dispositivo de la columna, que comprende el material de separacion de formula general (II), (VII), (VIII), (IX) o (X) son particularmente utiles en la eliminacion extracorporal de la PCR a partir de un fluido biologico de un paciente para la profilaxis y/o tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares.
[0056] Preferiblemente, el fluido biologico se selecciona de: sangre, plasma sangulneo, llquido peritoneal y llquido linfatico.
[0057] El termino "enfermedades cardiovasculares" como se utiliza aqul incluye, pero no se limita a miocardio, ictus, diabetes, enfermedad renal de etapa final, insuficiencia renal, insuficiencia renal debido a la hipertension, lesiones endoteliales, destruction endotelial, arteriosclerosis, trombosis, aterosclerosis, estenosis, restenosis, enfermedades ateroscleroticas o tromboticas, insuficiencia de flujo de sangre, eventos isquemicos, embolia pulmonar, estable y angina inestable, enfermedades coronarias arteriales, infarto de miocardio, asl como los resultados patologicos de enfermedades arterioscleroticas o tromboticas.
[0058] El termino "disfunciones inmunes" como se utiliza aqul incluye, pero no se limita a enfermedades inmunes, enfermedades autoinmunes, reacciones de rechazo en trasplantes, rechazo de alo-trasplante, rechazo xeno-trasplante, rechazo injerto frente a huesped, rechazo huesped frente a injerto, diabetes mellitus, reumatismo, artritis reumatoide, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, esclerosis multiple, miastenia gravis, psoriasis vulgaris, enfermedad de Graves, slndrome de Goodpasture, purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), anemia aplasica, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn (tambien conocida como slndrome de Crohn), colitis ulcerosa, cardiomiopatla dilatada (DCM), tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, terapia de reemplazo hormonal (TRH), osteoartritis y gota.
Sintesis qufmica
A. Sintesis de compuestos de formula general (I)
[0059] A.1 Los compuestos de la invencion de formula general I, en donde X representa -NHR3, R3 se selecciona de: - H, -CH3, -C2H5, -C3H7 y -L- representa -La-, -La-OLe-, -La-Le-(es decir, compuestos de formula general 6), o X representa -C = CH o -CH = CH2 y -L- representa -La-O-C(O)-NH-Le-o -La-O-C(O)-NH-Ld-O-Le -(es decir, compuestos de la formula general 5, en la que PG1 representa carbonilo de aliloxi o carbonilo de propargiloxi y R3 representa -H) puede ser ensamblado a partir de aminoalcoholes comercialmente disponibles de formula general NHR3-L1-OH (1), en la que L1 representa -La-, -La-OLe-, -La-Le-, -Le-, -Ld-OLe-, o -Ld-Le- de acuerdo con el Esquema 1.
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Esquema 1: Slntesis de compuestos de formula general 5 y 6: a. proteccion grupo amino; b. Conversion grupo de hidroxilo a un grupo saliente LG; c. cuaternizacion; d. fosforilacion; e. desproteccion
[0060] La slntesis implica la proteccion del grupo amino terminal del alcohol amino 1 con un grupo protector PG1, seguido de la conversion del grupo hidroxilo terminal en un grupo saliente LG para proporcionar el intermedio 3. Grupos protectores de amino adecuados PG1 son bien conocidos por la persona experta e incluyen carbamatos, grupo ftaloilo y grupos ftaloilo sustituidos. Los ejemplos de carbamatos incluyen, pero no se limitan a: benciloxicarbonilo (Cbz o Z), 4- nitro-benciloxicarbonilo, 4-cloro-benciloxicarbonilo, 4-metoxi-benciloxicarbonilo, 4-metilo-benciloxicarbonilo, 4-azido- benciloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), carbonilo de aliloxi (Aloc), carbonilo propargiloxi, carbonilo terc- butiloxi (Boc). Ftaloilo y los grupos protectores de ftaloilo sustituidos son particularmente utiles para la proteccion de aminas primarias (R3 representa H). Ejemplos de grupos de ftaloilo sustituidos incluyen, pero no se limitan a 4-nitro- ftaloilo, 3-nitro-ftaloilo y tetracloroftaloilo. Preferiblemente, el grupo protector PG1 se selecciona de carbonilo aliloxi, carbonilo propargiloxi, benciloxicarbonilo y ftaloilo. Grupo saliente LG instalado en el paso b se puede seleccionar del grupo que comprende cloruro, bromuro, yoduro, tosilato, bencenosulfonato, p -nitro-bencenosulfonato, mesilato o grupo triflato. Preferiblemente, el grupo saliente LG es un ester de un acido sulfonico (es decir, un sulfonato), y mas preferiblemente LG es un grupo mesilato. La conversion de la funcionalidad de alcohol en un grupo LG puede lograrse por ejemplo por tratamiento de alcohol 2 con MsCl o TsCl en presencia de trietiloamina, usando dicholorometano como disolvente a 0°C. El intermedio 3 se hace reaccionar adicionalmente con un alcohol amino de formula general NHR1R2- (CH2)b-OH, tales como dimetiloetanolamina, dimetilopropanolamina, N,N-dietiloetanolamina, N-(2-hidroxietilo)morfolina, o /V-(2-hidroxietilo)piperidina para proporcionar amino alcohoL4a traves de una reaccion de cuaternizacion. El tratamiento posterior del alcohoL4con POCb y trietiloamina en acetonitrilo a 0°C resulta en la introduccion del grupo fosfato en la molecula. La desproteccion del grupo amino terminal proporciona los compuestos diana de formula general 6 de acuerdo con la presente invention que estan listos para ser inmovilizado a un soporte solido a traves del grupo amino terminal. Si el grupo protector PG1 es carbonilo de aliloxi o carbonilo de propargiloxi y R3 representa -H, entonces el paso de desproteccion es opcional ya que los compuestos de formula general 5 se pueden inmovilizar directamente al soporte solido a traves de alqueno terminal (quimica tiol-eno, quimica click, metatesis) o alquino (quimica click).
[0061] Una variedad de aminoalcoholes comercialmente disponibles de formula general NHR3-L1-OH (1) puede funcionar como un material de partida para la ruta sintetica descrita en el Esquema 1. Tales alcoholes amino disponibles comercialmente incluyen, pero no estan restringidos a 2-aminoetanol, 3-amino propan-1-ol, 4-amino butan- 1-ol, 5-amino pentan-1-ol, 6-amino hexan-1-ol, 2-(2-aminoetoxi)etanol, 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etanol, 2-(3- aminopropoxi)etanol. 3-(3-aminopropoxi)propan-1-ol, 4-(3-aminopropoxi)butan-1-ol, 2-(metiloamino)etanol, 3- (metiloamino)propan-1-ol, 4-(metiloamino)butan-1-ol, 5-(metiloamino)hexan-1-ol, 6-(metiloamino)hexan-1-ol, 7- (metiloamino)heptan-1-ol, 2-[2-(metiloamino)etoxi]etanol, 2-[2-[2-(metiloamino)etoxi]etoxi]etanol, 2-[3- (metiloamino)propoxi]etanol, 3-[3-(metiloamino)propoxi]etanol, 3-[3-(metiloamino)propoxi]propan-1-ol, 4-[3- (metiloamino)propoxi] butan-1-ol.
[0062] La persona experta apreciara que mediante la aplicacion de los pasos b, c y d del procedimiento de slntesis descrito en el Esquema 1 y si es necesario un paso de desproteccion adecuado a un alcohol de formula general PG2S- L1-OH, HC = C-L1-OH, CH2= CH-L1-OH, Na-U-OH o PG3 = CL1-OH, en la que PG2 es un grupo protector de sulfhidrilo (por ejemplo bencilo) y PG3 es un grupo aldehido protector (por ejemplo ditiano o acetal) se accederan a analogos 6a, 6b, 6c, 6d y 6e.
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hs ;n. b'
Rr R2
P —
P
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OH
■O'
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R1 R2 OH
6b
O
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Rix R2
,o-p-
b i
-O'
OH
6c
N3^ N
Rt R2
3^Sl
o
II
h0-p —
b l
OH
6d
O
o
Y >r
^ Rr R2
ho-p-
b I
OH
6e
[0063] En este caso el alcohol propargllico, 3-azido propan-1-ol, 2-azidoetanol, 4-azidobutan-1-ol, 2-(2- azidoetoxi)etanol, 2-[2-(2-azidoetoxi)etoxi]etanol, 2-[2-[2-(2-azidoetoxi)etoxi]etoxi]etanol, 2-(2-azidoetilosulfonil)etanol, but-3-in-1-ol, pent-4-in-1-ol, 2-prop-2-inoxietanol, 2-(2-prop-2-inoxietoxi)etanol, 2-[2-(2-prop-2-inoxietoxi)etoxi]etanol puede ser utilizado como materiales de partida.
[0064] A.2 Los compuestos de la invencion de formula general I, en donde X representa -NHR3, R3 se selecciona de: - H, -CH3, -C2H5, -C3H7 y -L- representa -La-C(O)-NH-Le- (es decir, compuestos de la formula general 7 y 19) o X representa -C = CH o -CH = CH2 y -L- representa -La-O-C(O)-NH-Ld-C(O)-NH-Le-(es decir, compuestos de la formula general 8 y 18, en el que PG1 representa carbonilo de aliloxi o carbonilo de propargiloxi R3 representa -H) se pueden ensamblar a partir de los aminoacidos 9 de formula general NHR3 -L2-CO2H, en el que -L2- representa -La- o -Ld-, aminoalcoholes 10 de formula general NH2-L1-OH (1), en la que L1 representa -Le- o diaminas 11 de formula general NH2- L3-NR1R2, en el que L3 representa -Le- de acuerdo con el Esquema 2.
[0065] La slntesis comienza con la proteccion del grupo amino en el acido amino 9 con un grupo protector PG1, en el
que PG1 tiene el significado definido en el apartado A.1 para dar el acido carboxllico 12. El acoplamiento del acido carboxllico 12 con el aminoalcohol 10 suministra alcohol primario 13 en el que el grupo hidroxilo se convierte ademas en el grupo saliente LG, en el que el grupo saliente LG tiene el definido en el apartado A.1 para proporcionar el intermedio 14. El tratamiento del intermedio 14 con amino alcohol 10 de formula general NHR1 R2-(CH2)b -OH (por ejemplo, dimetiloetanolamina, dimetilopropanolamina, N,N-dietiloetanolamina, N-(2-hidroxietilo)morfolina, o N-(2-
hidroxietilo)piperidina) da como resultado la formacion de alcohol 15 que se somete a cuaternizacion de reaccion, seguido de desproteccion que implica la escision del grupo protector Pg1 para dar el compuesto objetivo 7. Como anteriormente, el precursor 8 siendo PG1 carbonilo de aliloxi o carbonilo de propargiloxi puede inmovilizarse directamente a un soporte solido.
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Esquema 2: Slntesis de compuestos de formula 7, 8, 18, y 19: a. proteccion grupo amino; b. 10, acoplamiento; c. conversion grupo de hidroxilo a grupo saliente LG; d. cuaternizacion; e. fosforilacion; f. desproteccion; g. 11, acoplamiento; h. cuaternizacion
[0066] Alternativamente, alcohol carboxllico 12 puede ser acoplado con la diamina 11 para proporcionar la amida 16 que se somete posteriormente a cuaternizacion de reaccion por tratamiento con un derivado de 2-hidroxietilo o 3- hidroxipropilo. Derivados de 2-hidroxietilo y 3-hidroxipropilo adecuados incluyen 2-bromo- y 2-yodo-etanol y 3-bromo y 3-yodo propanol. La reaccion de cuaternizacion se lleva a cabo preferiblemente en acetonitrilo, a temperatura ambiente. Finalmente, la reaccion de fosforiloacion, seguido de la reaccion de desproteccion aplicado a alcohol 18 suministra el compuesto diana 19.
[0067] Los aminoacidos 9 de formula general NHR3-L2-CO2H incluyen, pero no se limitan a 7-acido aminoheptanoico, 6- acido aminohexanoico, 5-acido aminopentanoico, 4-acido aminobutanoico, 3-acido aminopropanoico, 2-aminoacido acetico, 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi] [etoxijetoxi 2-[2-[2-(2-aminoetoxi)]acetico, 2-(2-aminoetoxi)acido acetico, 2-(3- aminopropoxi)acido acetico, 3-(3-aminopropoxi)acido propanoico, 4-(3-aminopropoxi)acido butanoico, 2- (metiloamino)acido acetico, 3-(metiloamino)acido propanoico, 4-(metiloamino)acido butanoico, 5-(metiloamino)acido pentanoico, 6-(metiloamino)acido hexanoico, 7-(metiloamino)acido heptanoico, 2-[2-(metiloamino)etoxi]acido acetico, 2- [2-[2-(metiloamino)etoxi]etoxi]acido acetico, 2-[3-(metiloamino)propoxi]acido acetico, 3-[3-(metiloamino)propoxi]acido propanoico, 4-[3-(metiloamino)propoxi]acido butanoico, 2-[2-[2-[2-(metiloamino)etoxi]etoxi]etoxi]acido acetico.
[0068] Los aminoalcoholes 10 de formula general NHR1R2-(CH2)b-OH adecuados para ser utilizados en el esquema sintetico mostrado por el Esquema 2 incluyen, pero no se limitan a: 2-aminoetanol, 3-amino propan-1-ol, 4-amino butan- 1-ol, 5-amino pentan-1-ol, 6-amino hexan-1-ol, 2-(2-aminoetoxi)etanol, 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etanol, 2-(3- aminopropoxi)etanol. 3-(3-aminopropoxi)propan-1-ol, 4-(3-aminopropoxi)butan-1-ol.
[0069] Ejemplo de diaminas 11 de formula general H2NLe-NR1R2 que estan disponibles comercialmente incluyen, pero no estan limitados a etiloendiamina; 1,3 diaminopropano; N -metiloetiloenodiamina; 1,4-diaminobutano; 3-(metiloamino)-
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propilamina; N,N'-dimetiloetiloendiamina; N-etiloetiloenodiamina; 3-(dimetiloamino)-1-propilamina; N-isopropilo-
etilenediamina; N-propiletiloenodiamina; hexametiloendiamina; 1,2-diaminociclohexino; 1,4-diaminociclohexano; y N- hexiletiloenodiamina.
[0070] La persona experta apreciara que mediante la aplicacion de etapas b-e del procedimiento de slntesis descrito en el Esquema 2 y si es necesario un paso de desproteccion apropiado para un acido carboxllico de formula general PG2S-L2-CO2H, HC = C- L2-CO2 H, CH2= CH-L2-CO2 H, N3-L2-CO2H o PG3 = CL2 -CO2H, en la que PG2 es un grupo protector de sulfhidrilo (por ejemplo bencilo) y PG3 es un grupo aldehldo de proteccion (por ejemplo, ditiano o acetal) se accedera a analogos de 7a, 7b, 7c, 7d y 7e.
2 H
/LVN'
HS W 0
r2
^NV^°'
7a
OH
-O'
9 H
°TlTn'
H O
R1 Rz
OH
'NVr°"p'
b 17
O
O"
7e
[0071] Ejemplo de acidos carboxllicos adecuados para ser utilizados como material de partida para la obtencion de analogos de 7a-7e incluyen, pero no se limitan a: 6-acido tiohexanoico, 6-acido azidohexanoico, 5-acido tiopentanoicoo, 5-acido azidopentanoico, 4-acido tiobutanoico, 4-acido azidobutanoico, 3-acido tiopropanoico, 3-acido azidopropanoico, acido tioacetico, 3-acido butinoico, 4-acido pentinoico.
[0072] A.3 Alternativamente, las diaminas de formula general R3HN-L4-NR1R2 (20) pueden ser utilizadas con exito para acceder a compuestos de formula general I, en donde X representa -NHR3, R3 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7 y -L- representa -La- (vease Esquema 3). Diaminas 20 pueden estar disponibles comercialmente (por ejemplo N,N- dimetilo-1,3-propanodiamina) o se pueden obtener facilmente, por ejemplo, partiendo de los derivados halogenados correspondientes por medio de dos pasos sinteticos, incluyendo la conversion de los derivados halogenados de los derivados de azido y reduccion de los derivados de azido a las aminas primarias correspondientes.
[0073] A partir de diaminas 20 de la formula general de la formula general R3HN-L4-NR1R2, se puede acceder a los compuestos de formula generaL 24 en cuatro pasos, incluyendo la proteccion de la amina primaria y secundaria con el grupo protector PG1 en el que PG1 tiene el significado definido en el parrafo A.1, la cuaternizacion de la amina terciaria, por tratamiento con un derivado de 2-hidroxietilo o 3-hidroxipropilo apropiado, seguido por la fosforiloacion y la desproteccion de la amina primaria o secundaria.
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Esquema 3: Slntesis de compuestos de formula general 24: a. proteccion de grupo amino; b. cuaternizacion; c. fosforilacion; d. desproteccion.
B. Preparacion del material de separacion de formula general (II)
[0074] El material de separacion de formula general (II) se puede preparar por acoplamiento de los compuestos de formula general (I) con un soporte solido funcionalizado con un resto -L*-FG, en la que FG es un grupo funcional que es adecuado para reaccionar con los grupos funcionales X. Ejemplos de grupos FG incluyen -CHO, -C = CH, -N3, -CH = CH2, -NH2, -SH, epoxido, tresilo. Esquema 4 resume diferentes metodologlas de acoplamiento que pueden emplearse para acceder a los materiales de separacion de formula general (II). Preferiblemente, los compuestos de formula general (I), en donde X se selecciona entre -SH, -OH y -NHR3 estan acoplados a un soporte solido A por la apertura del anillo epoxido (vease el Esquema 5 a, b).
[0075] En una realizacion de la invencion, el acoplamiento de compuestos de formula general (I), en la que X = -C = CH, -N3, o -CH = CH2 y el soporte solido se lleva a cabo con la formacion de una resto triazol (vease Esquema 5 c, d, e). La formacion de triazoles a partir de una azida y un alquino, tambien conocido como la cicloadicion de azida alquino Huisgen, se lleva a cabo como una 1,3-cicloadicion. Una variante notable de la cicloadicion Huisgen 1,3-dipolar es la de variante catalizada por cobre (I), en la que azidas organicas y alquinos terminales se unen para proporcionar 1,4- regioisomeros de 1, 2, 3-triazoles como productos unicos. Esta reaccion se denomina cicloadicion de azida-alquino catalizada por cobre (I) (CuAAC). La reaccion se puede realizar usando fuentes comerciales de cobre (I) tales como bromuro cuproso o yoduro. Sin embargo, la reaccion funciona mucho mejor usando una mezcla de cobre (por ejemplo sulfato de cobre (II))(II) y un agente reductor (por ejemplo, ascorbato de sodio) para producir in situ Cu (I). Al ser Cu (I) inestable en disolventes acuosos, los ligandos estabilizadores son eficaces para mejorar el resultado de reaccion, especialmente si se utiliza tris-(benciltriazolilmetilo)amina (TBTA). La reaccion se puede ejecutar en una variedad de disolventes y mezclas de agua y una variedad de disolventes organicos (parcialmente) miscibles incluyendo alcoholes, DMSO, DMF, t-BuOH, dioxano, acetona y mezclas de los mismos. Ademas, la reaccion puede ser catalizada por rutenio. La cicloadicion de azida-alquino 1,3-dipolar catalizada por rutenio (RuAAC) da 1,5-triazoles. Por lo tanto, usando materiales de separacion de cicloadicion de azida-alquino de formula general (II), en donde Y se selecciona de:
se pueden obtener facilmente.
[0076] De la misma manera, los materiales de separacion de formula general (II), en donde Y se selecciona de:
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pueden obtenerse a partir de azidas y alquenos.
[0077] Materiales de separacion de formula general (II), en donde Y se selecciona de -CH2-NH-, y -NH-CH2- se pueden preparar por aminacion reductora usando, por ejemplo NaBH4 como reductor, partiendo de compuestos de formula general (I), en donde X es -NH2 o -CH(O) y soportes solidos funcionalizados A con un resto -L*-FG, en el que el grupo funcional FG representa -CH(O)- y NH2, respectivamente (vease el Esquema 4 f, g).
[0078] Los compuestos de formula general (I), en la que X = -CH = CH2 puede ser inmovilizada al soporte solido a traves de metatesis o reaccion de Wittig para proporcionar materiales de separacion de formula general (II), en donde Y se selecciona de:
[0079] Los compuestos de formula general (I), en la que X = -CH = CH2 o -SH pueden inmovilizarse al soporte solido a traves de la qulmica de tiol-eno para proporcionar materiales de separacion de formula general (II), en donde Y representa -S CH2-CH2- o -CH2-CH2-S-.
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Esquema 5. Metodologlas de acoplamiento de los compuestos de formula general (I) a un soporte solido.
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[0080] Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invention. Se debe apreciar por los expertos en la tecnica que las tecnicas descritas en los siguientes ejemplos representan tecnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la invencion, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica deberlan, a la luz de la presente description, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones especlficas que se describen y todavla obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del esplritu y alcance de la invencion.
[0081] Otras modificaciones y realizaciones alternativas de diversos aspectos de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a la vista de esta descripcion. En consecuencia, esta descripcion ha de interpretarse solo como ilustrativa y es para el proposito de ensenar a los expertos en la tecnica la manera general de realizar la invencion. Es de entenderse que las formas de la invencion mostradas y descritas en el presente documento deben ser tomadas como ejemplos de formas de realization. Elementos y materiales se pueden sustituir por los que se ilustran y describen en este documento, las partes y procesos se pueden invertir, y ciertas caracterlsticas de la invencion se pueden utilizar de forma independiente, todo ello como serla evidente para un experto en la tecnica despues de tener el beneficio de esta descripcion de la invencion. Se pueden hacer cambios en los elementos descritos en el presente documento sin apartarse del esplritu y alcance de la invencion como se describe en las siguientes reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Sfntesis de bencilo N-[3-(dimetiloamino)propilo]carbamato (1*).
[0082]
[0083] Se anadio a una solution agitada de N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (68,8 g, 0,276 mol) en cloroformo (300 ml) en atmosfera de argon y a 0°C se anadio gota a gota N',N'-dimetilopropano-1,3 diamina (24,52 g, 0,24 mol) disuelto en cloroformo (150 ml) manteniendo la temperatura de la mezcla de reaction a 0°C. La mezcla de reaction se agito a 0°C durante 2 h, despues se diluyo con cloroformo (400 ml) y se lavo con carbonato de hidrogeno sodio acuoso saturado (3 x 200 ml) y cloruro de sodio saturado (2 x 200 ml). La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro en vaclo para dar 56 g (98,7%) de aceite viscoso como el producto deseado 1*, que se uso como tal para la siguiente reaccion. MS m/z 236,31 (M+H)+ (236,15 calculado).
Ejemplo 2: Sfntesis de 3-(benciloxicarbonilamino)propilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-bromuro de amonio (2*).
[0084]
[0085] A una solucion de aproximadamente 1 M de bencilo N-[3-(dimetiloamino)propilo]carbamato de bencilo (1*, 56 g, 0,237 mol, ejemplo 1) en acetonitrilo, se anadio 2-bromoetanol (32,58 g, 0,261 mol) y la mezcla de reaccion se incubo a temperatura ambiente hasta que todo el carbamato de bencilo N-[3-(dimetiloamino)propilo] consumido (monitorizado por LC/MS y TLC). A la solucion resultante de 3-(benciloxicarbonilamino)propilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio bromuro de cinc se anadieron volumenes de metilo ferc-Butilo eter. Las soluciones de la mezcla se agitaron hasta que se observo separation de fases. La fase organica superior se separo a partir de 3-(benciloxicarbonilamino)propilo-(2-hidroxietilo)- dimetilo-bromuro de amonio por decantation y la precipitation se repitio de nuevo tres veces mas. Finalmente, se obtuvo el compuesto diana despues de bombear hacia fuera el disolvente traza en vaclo como un aceite viscoso (76,7 g, 89,6% como sal de bromuro). El producto diana 2* era homogeneo por LC/MS y TLC, y se utilizo en el paso de fosforiloacion sin purification adicional. MS m/z 281,33 M+ (281,19 calculado).
Ejemplo 3: Sfntesis de 6-(benciloxicarbonilamino)acido hexanoico (3*).
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cr°
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(500 ml), gota con
un bano de hielo y se anadio cloroformiato de bencilo (95%, 53,31 g, 0,313 mol). La mezcla resultante se agito en hielo durante 60 min y a temperatura ambiente durante 4 h. Despues de eliminar el disolvente, el residuo se distribuyo entre 1000 ml de 4% (v/p) de carbonato de hidrogeno de sodio y 500 ml de metilo ferc-butilo eter. La capa acuosa se separo, se acidifico a pH 2,0 con acido clorhldrico 2N y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro para dar aceite transparente (62,4 g, 94,1%) que corresponde a diana de acido carboxllico 3* que era homogeneo por LC/MS y TLC, y se utilizo en el siguiente paso sin purification adicional. MS m/z 265,33 (M+1)+ (265,13 calculado).
Ejemplo 4: Sintesis de bencilo N-[6-[3-(dimetiloamino)propilamino]-6-oxohexilo]carbamato de (4*).
[0088]
una suspension agitada de 6-acido aminocaproico finamente pulverizado (32,79 g, 0,25 mol) en diclorometano se anadio trietiloamina (63,24 g, 0,625 mol). Despues, se anadio trimetiloclorosilano (54,32 g, 0,5 mol) gota a agitation vigorosa y la mezcla resultante se calento a reflujo durante 2 h. La mezcla de reaction se enfrio en
[0089] A una solution de 6-(benciloxicarbonilamino)acido hexanoico (3*, 66,3 g, 0,25 mol, ejemplo 3) en diclorometano seco (500 ml), se anadio una cantidad catalltica de dimetiloformamida (1,25 ml) y la mezcla de reaccion se enfrio a 0°C en bano de hielo/sal. Se anadio una solucion de cloruro de oxalilo (38,08 g, 0,3 mol) en diclorometano (150 ml) lentamente manteniendo la temperatura de la mezcla de reaccion a 0°C. La mezcla de reaccion se agito durante 2h a temperatura ambiente. Los volatiles se evaporaron bajo vaclo y el residuo se disolvio en diclorometano seco (500 ml). La solucion resultante se enfrio a 0°C en bano de hielo/sal y una mezcla de N,N-dimetilo-1,3-propanodiamina (25,55 g, 0,25 mol) y trietiloamina (55,65 g, 0,55 mol) se anadio gota a gota con agitacion y enfriamiento durante 2 h. La mezcla de reaccion se agito durante 6 h y el progreso de la reaccion se controlo por TLC y LC-MS. El precipitado se filtro, se lavo con un pequeno volumen de diclorometano. A continuation, la solucion de diclorometano se lavo con hidrogenocarbonato de sodio saturado, cloruro de sodio saturado, se seco sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentro para dar bencilo N-[6-[3-(dimetiloamino)propilamino]-6-oxo-hexil]carbamato (4*, 76,4 g, 87,4%) como un aceite de color amarillento claro. El material en bruto era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 249,13 (M+1)+ (349,24 calculado).
Ejemplo 5: Sintesis de 3-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanofloamino]propilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-bromuro de amonio (5*).
[0090]
[0091] A aproximadamente 1 M de solucion de bencilo N-[6-[3-(dimetiloamino)propilamino]-6-oxo-hexil]carbamato (4*, 56 g, 0,16 mol, Ejemplo 4) en acetonitrilo, 2- se anadio bromoetanol (22,03 g, 0,176 mol) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente hasta que todo el bencilo N-[6-[3-(dimetiloamino)propilamino]-6-oxo-hexil]carbamato se consumio (monitorizado por LC/MS y TLC). A la solucion resultante de 3-[6- (benciloxicarbonilamino)hexanolloamino]propilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio bromuro, se anadieron cinco volumenes de metilo ferc-Butilo eter. Las soluciones de la mezcla se agitaron hasta que se observo separation de fases. La fase organica superior se separo a partir de 3-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanolloamino]propilo-(2-hidroxietilo) bromuro de
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dimetilo-amonio por decantacion y el precipitation se repitio de nuevo tres veces mas. Finalmente, se obtuvo el compuesto diana despues de bombear hacia fuera el disolvente traza en vaclo como un aceite viscoso (5*, 66,3 g, 87,2% como sal de bromuro). El producto era homogeneo mediante LC/MS y TLC, y se utilizo en el paso de fosforiloacion sin purification adicional. MS m/z 394,1 M+ (394,27 calculado).
Ejemplo 6: Sfntesis de bencilo N-[2-(2-hidroxietoxi)etilo]carbamato (6*).
[0092]
[0093] 2-(2-aminoetoxi)etanol (25,23 g, 0,240 mol) se disolvio en 530 ml de 10% de trietiloamina en MeOH (48 ml, 0,345 mol de trietiloamina, 480 ml de metanol) y se enfrio a 0°C. Se anadio cloroformiato de bencilo (grado tecnico, 95%, 34,4 ml, 0,229 mol) de una vez, y la reaction se dejo calentar a temperatura ambiente. Despues de 12 h, el disolvente se elimino por evaporation, y el producto se purifico usando cromatografla en columna de sllice (acetato de etilo/hexano), resultando en un aceite incoloro (6*, 52 g, 0,163 mol, 95% basado en cloroformato de bencilo). El material bruto se anallticamente puro como se analizo por LC/MS y TLC, y se uso en la siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 239,17 (M+1)+ (239,12 calculado).
Ejemplo 7: Sfntesis de bencilo N-[6-[2-(2-hidroxietoxi)etiloamino]-6-oxo-hexil]carbamato (7*).
[0094]
[0095] Una solution de fosfito de trimetilo (12,5 g, 0,101 mol) en diclorometano (290 ml) se enfrio en bano de hielo/sal. Despues, se anadio yodo en polvo (25,6 g, 0,101 mol) en porciones mientras que se mantenla la temperatura de la mezcla de reaccion a 0°C. Despues de que el yodo solido se disolvio completamente, 6-(benciloxicarbonilamino)acido hexanoico (3*, 25,5 g, 0,096 mol, ejemplo 3) y trietiloamina (23,3 g, 0,23 mol) se anadieron en orden secuencial, y la solucion resultante se agito durante 20 min en el bano de enfriamiento a 0°C. Se anadio 2-(2-aminoetoxi)etanol (10,6 g, 0,101 mol) disuelto en diclorometano (50 ml) y la mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 30 min. Despues de retirar el bano de enfriamiento, la mezcla de reaccion se agito durante la noche a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por TLC y LC/MS. Despues, la mezcla de reaccion se lavo secuencialmente con 10% (v/p) de hidrogeno sulfato de sodio, cloruro de sodio saturado, hidrogeno carbonato de sodio saturado y se seco sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se elimino por evaporacion, y el producto se purifico usando cromatografla en columna de sllice (acetato de etilo/hexano), resultando en un aceite incoloro (34,7 g, 0,091 mol, 95,1% basado en 6- (benciloxicarbonilamino)acido hexanoico). El producto en bruto de material 7* era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 352,42 (M+H)+ (352,20 calculado).
Ejemplo 8: Sfntesis de 2-[2-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanofloamino]etoxi]etilo metanosulfonato (8*).
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[0097] Una solucion de bencilo N-[6-[2-(2-hidroxietoxi)etiloamino]-6-oxo-hexil]carbamato (7*, 17,25 g, 0,049 mol, ejemplo 7) en cloruro de metiloeno (115 ml) en atmosfera de argon se enfrio en un bano de hielo-sal a -5°C. Se anadio trietiloamina (8,2 ml, 0,059 mol) y la solucion resultante se agito a -5°C durante 10 min. Se anadio cloruro de
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metanosulfonilo (4,5 ml, 0,059 mol) gota a gota mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la reaccion se calento a temperatura ambiente. Despues de 4 h, la mezcla de reaccion se lavo con agua, cloruro de sodio saturado, y de nuevo con agua. La fase organica se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro en vaclo. El producto en bruto de material 8* era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 430,52 (M+H)+ (430,18 calculado).
Ejemplo 9: Sintesis de 2-[2-[6-(bencNoxicarbonilamino)hexanonoamino]etoxi]etMo-(2-hidroxietNo)-dimetNo- amonio sal de acido metanosulfonico (9*).
[0098]
[0099] A una solucion 1 M de 2-[2-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanolloamino]etoxi]etilo metanosulfonato (8*, 18,6 g, 0,043 mol, ejemplo 8) en acetonitrilo, 2-(dimetiloamino)etanol (4,24 g, 0,048 mol) se anadio durante 20-30 minutos. Despues que se completo la adicion, la solucion resultante se sometio a reflujo con agitacion continua hasta que se consumio todo el mesilato de alquilo. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. Despues de 12 h, la mezcla de reaccion se enfrio y se evaporo el acetonitrilo en vaclo. La mezcla resultante se disolvio en 200 ml de metilo caliente ferc-butilo eter. La solucion se dejo enfriar lentamente a temperatura ambiente y luego se dejo reposar 12 h a 0- 5°C hasta que se completo la cristalizacion. Aproximadamente 19,7 g (87,7% como sal de acido metanosulfonico) de un solido blanco que corresponde al objetivo alcohol 9* se recupero. El material en bruto era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 424,55 M+ (424,28 calculado).
Ejemplo 10: Sintesis de 6-(1,3-dioxoisoindolin-2-ilo)acido hexanoico (10 *).
[0100]
[0101] Una mezcla agitada de 6-acido aminocaproico (65,6 g, 0,5 mol), anhldrido ftalico (74,1 g, 0,5 mol), y acido acetico (115 ml) se calento a reflujo durante 9 h. El producto que se cristalizo en el enfriamiento se aislo por filtracion, se lavo varias veces con agua, y se seco en vaclo a 100°C para obtener 124,2 g (95,1%) de 6-(1,3-dioxoisoindolina-2- ilo)acido hexanoico 10* que era homogeneo por LC/MS y TLC, y se utilizo en la siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 261,24 (M+H)+ (261,10 calculado).
Ejemplo 11:Sfntesis de 2-[2-(2-hidroxietoxi)etilo]isoindolina-1,3-diona (11*).
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[0103] Un matraz de fondo redondo de 1 L de tres bocas equipado con un agitador mecanico, una entrada-salida de nitrogeno, y una trampa Dean-Stark coronada por un condensador de reflujo, se cargo una solucion de anhldrido ftalico (88,87 g, 0,6 mol) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (63,08 g, 0,6 mol) en tolueno (540 ml). La mezcla de reaccion se sometio a reflujo hasta que se recogio 1 equiv de agua en la trampa Dean-Stark (aproximadamente 24 h). Despues de 24 h se elimino el tolueno a vaclo y el residuo se disolvio en acetato de etilo (550 ml) y se lavo secuencialmente con 10% (v/p) de hidrogeno sulfato de sodio, cloruro de sodio saturado, hidrogeno carbonato de sodio saturado y se seco sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se elimino a vaclo y el residuo se cristalizo en metilo ferc-butilo eter.
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Aproximadamente 130 g (92,1%) de un solido blanco que corresponde al objetivo alcohol 11* se recupero. El material en bruto era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 235,27 (M+H)+ (235,08 calculado).
Ejemplo 12: Sfntesis de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolina-2-ilo)etoxi]etilo metanosulfonato (12*).
[0104] Este ejemplo ilustra un metodo para la preparacion de ester de metanosulfonato de N-protegido 2-(2- aminoetoxi)etanol.
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[0105] Una solucion de 2-[2-(2-hidroxietoxi)etilo]isoindolina-1,3-diona (11*, 47,05 g, 0,2 mol, ejemplo 11) en cloruro de metiloeno (300 ml) en atmosfera de argon se enfrio en un bano de hielo-sal a -5°C. Se anadio trietiloamina (33,4 ml, 0,24 mol) y la solucion resultante se agito a -5°C durante 10 min. Cloruro de metanosulfonilo (18,6 ml, 0,24 mol) se anadio gota a gota mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la reaccion se calento a temperatura ambiente. Despues de 4 h, la mezcla de reaccion se lavo con agua, cloruro de sodio saturado, y de nuevo con agua. La fase organica se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro en vaclo. El material en bruto era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 313,17 (M+H)+ (313,06 calculado).
Ejemplo 13: Sfntesis de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolina-2-ilo)etoxi]etilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio sal de acido metanosulfonico (13*):
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[0107] A una solucion aproximadamente 1 M de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolin-2-ilo)etoxi]etilo metanosulfonato (12*, 32,53 g, 0,104 mol, ejemplo 12) en acetonitrilo 2-(dimetiloamino)etanol (10,18 g, 0,114 mol) se anadio durante 20-30 minutos. Despues que se completo la adicion, la solucion resultante se sometio a reflujo con agitacion continua hasta que se consumio todo el mesilato de alquilo. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. Despues de 12 h, la mezcla de reaccion se enfrio y el acetonitrilo se evaporo en vaclo. La mezcla resultante se disolvio en 150 ml de acetonitrilo caliente y a la solucion resultante se anadio posteriormente 200 ml de metilo caliente ferc-butilo eter. La solucion se dejo enfriar lentamente a temperatura ambiente y despues se dejo reposar durante la noche a 0-5°C hasta que se completo la cristalizacion. Se recupero aproximadamente 50,7 g (92,6% como sal de acido metanosulfonico) de un solido blanco. El material en bruto correspondiente en el compuesto diana 13* era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 307,07 M+ (307,17 calculado).
Ejemplo 14: Sfntesis de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolin-2-ilo)etoxi]etilo-(3-hidroxipropilo)-dimetilo-amonio sal de acido metanosulfonico (14 *).
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[0109] A una solucion de aproximadamente 1 M de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolin-2-ilo)etoxi]etilo metanosulfonato (12*, 30,41 g, 0,097 mol, ejemplo 12) en acetonitrilo 3-(dimetiloamino) se anadio propan-1-ol (11,01 g, 0,107 mol). La adicion de 3- (dimetiloamino)propan-1-ol fue tomada en algun lugar entre 20-30 minutos. Cuando se anadio todo, la solucion resultante se sometio a reflujo con agitacion continua hasta que se consumio todo el mesilato de alquilo. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. Despues de 12 h, la mezcla de reaccion se enfrio y el acetonitrilo se evaporo en vaclo. La mezcla resultante se disolvio en 120 ml de acetonitrilo caliente y a la solucion resultante se anadio posteriormente 200 ml de metilo caliente ferc-butilo eter. La solucion se dejo enfriar lentamente a temperatura ambiente y despues se dejo reposar durante la noche a 0-5°C hasta que se completo la cristalizacion. Se recuperaron aproximadamente 46,1 g (88,1%) de un solido blanco. El material en bruto correspondiente a compuesto diana 14 * era puro por LC/MS y TLC, y se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. MS m/z 321,11 M+ (321,18 calculado).
Ejemplo 15: Epoxi-activacion de Sepharose 6B.
[0110]
[0111] Sepharose 6B (GE Healthcare Life Sciences) se lavo sobre un vidrio de filtro de embudo con 3 x 1000 ml porciones de agua y secado por succion. Entonces cien gramos de secado por succion Sefarosa 6B se mezclo con 100 ml de 1,4-butanodiol diglicidilo eter (CAS N°2425-79-8) y 100 ml de solucion de hidroxido de sodio 0,6 M que contienen 2 mg de borohidruro de sodio por mililitro. La suspension se mezclo por rotacion durante 8 h a temperatura ambiente y se detuvo la reaccion mediante lavado del gel sobre un vidrio de filtro de embudo con 10 x 400 ml porciones de agua caliente (40-60°C) agua. El contenido de oxirano del gel fue de 67 pmol/g de gel secado por succion.
Ejemplo 16: Ensayo para determinar el numero de grupos epoxi.
[0112]
[0113] Sefarosa 6B activada por epoxi se hace reaccionar con acido mercaptoacetico y el numero de grupos acidos introducidos se determina por valoracion de acuerdo con un metodo descrito en Scoble, JA y Scopes, RK Journal of Chromatography A, 1996,752, 67.
Ejemplo 17: Sfntesis de Sefarosa 6B funcionalizada con azida
[0114]
[0115] Diez gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) se anadio en una solucion de 50 ml 1 M de azida de sodio en agua. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 18: Ensayo para determinar el numero de azido-grupos.
[0116]
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30
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50
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65
TNBS enlazado
TNBS libre
[0117] Grupos de azido de Sefarosa 6B de azido se redujeron cuantitativamente a grupos amino mediante la reaccion con DTT (Handlon, AL y oppenheimer, NJ, Pharmaceutical Research 1988, 5, 297.) y los grupos de amino resultantes se cuantificaron con TNBS de acuerdo con el procedimiento publicado (Antoni, G et al. Analytical Biochemistry 1983, 129, 60). El metodo se basa en la reaccion de la matriz con un exceso de 2,4,6-acido trinitrobencenosulfonico (TNBS) y la posterior determinacion cuantitativa de TNBS sin reaccionar por reaccion con glicina.
Ejemplo 19: Determinacion de grupos de amino primarios libres por el metodo espectrofotometrico.
[0118] La cantidad de grupos amino primarios se cuantifico directamente usando una curva estandar generada despues de la reaccion de acido L-glutamico con o-ftaldehldo y N-acetilo-L-cistelna en la temperatura ambiente y pH 9,5 (Medina Hernandez, MJ et al. microqulmico Diario 1990, 42, 288). Derivados de N-acetilo-L-cistelna son altamente estables y que no requieren un estricto control del tiempo de reaccion a diferencia de 2-metcaptoetanol. La relacion entre la absorbancia de UV a 335 nm y la concentracion de grupos amino se encontro que era lineal.
Ejemplo 20: Determinacion de grupos amino secundarios libres por metodo espectrofotometrico.
[0119] La cantidad de grupos amino secundarios era directamente cuantitativa estimada utilizando la reaccion de este grupo de compuestos con nitroprusiato de sodio y acetaldehldo (Lin, CML y Wagner, C Analytical Biochemistry 1974, 60, 278).
Ejemplo 21: Inmovilizacion de 2-[3-aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno en Sefarosa 6B activada por epoxi (material de separacion 1).
[0120]
Fosforiloacion.
[0121] A una solucion de oxicloruro de fosforo (3,7 g) en acetonitrilo seco 0,2 M, se mantuvo entre 0°C y -10°C se anadio trietiloamina (2,68 g). Despues de la adicion de trietiloamina, una solucion de aproximadamente 0,2 M de 3- (benciloxicarbonilamino)propilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio bromuro (2*, 5,81 g, Ejemplo 2) se anadio gota a gota durante un intervalo de tiempo de 30 min, mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de que la adicion se termino, la suspension se incubo durante 24 h adicionales a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. El precipitado de hidrocloruro de trietiloamina se filtro y a la solucion resultante se anadio agua (1,8 ml) con agitacion, manteniendo la temperatura a 0-5°C. La eliminacion de la mezcla de agua-disolvente en vaclo dio el producto fosforiloado, que era lo suficientemente puro para la desproteccion y la inmovilizacion subsiguiente.
Proteccion de escision de grupo.
[0122] A una solucion agitada de producto fosforiloado en agua (50 ml) se anadio 10% de paladio sobre carbon activado (10% en moles) a 25°C. La mezcla resultante se agito durante 24 h a 25°C bajo H2 (1 atm) y luego se filtro. El catalizador se lavo con agua (2 x 10 ml) y la solucion transparente se concentro a presion reducida para dar 2-[3- aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno de alta pureza despues de la filtracion.
Inmovilizacion.
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[0123] Veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) se anadieron a una solucion de 2-[3-aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno (40 ml). El pH de la suspension resultante se ajusto a
11,0 con una solucion de 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 22: Inmovilizacion de 2-[3-(6aminohexanofloamino)propilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno en Sefarosa 6B activada por epoxi (material de separacion 2).
[0124]
Fosforiloacion.
[0125] A una solucion de aproximadamente 0,2 M de oxicloruro de fosforo (3,7 g) en acetonitrilo seco, se mantuvo a trietiloamina entre 0°C y -10°C, se anadio (2,68 g). Despues de la adicion de trietiloamina, una solucion aproximadamente 0,2 M de acido 3-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanolloamino]propilo-(2-hidroxietilo) bromuro de dimetilo-amonio (5*, 7,63 g, ejemplo 5) se anadio gota a gota sobre un intervalo de tiempo de 30 min mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la suspension se incubo durante 24 h adicionales a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. El precipitado de hidrocloruro de trietiloamina se filtro y la solucion resultante se anadio agua (1,8 ml) con agitacion, manteniendo la temperatura a 0-5°C. La eliminacion de mezcla de agua-disolvente en vaclo dio el producto fosforiloado, que era lo suficientemente puro para la desproteccion y la inmovilizacion subsiguiente.
Proteccion de la escision del grupo.
[0126] A una solucion agitada de producto fosforiloado en agua (50 ml) se anadio 10% de paladio sobre carbon activado (10% en moles) a 25°C. La mezcla resultante se agito durante 24 h a 25°C bajo H2 (1 atm) y luego se filtro. El catalizador se lavo con agua (2 x 10 ml) y la solucion transparente se concentro a presion reducida para dar 2-[3- aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno de alta pureza despues de la filtracion.
Inmovilizacion.
[0127] Veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) se anadieron a una solucion de 2-[3-(6aminohexanolloamino)propilo-dimetilo-amonio]etilo de fosfato de hidrogeno (40 ml). pH de la suspension resultante se ajusto a 11,0 con una solucion de 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 23: Inmovilizacion de 2-[2-[2-(6-aminohexanofloamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo de fosfato de hidrogeno (material de separacion 3) en Sefarosa 6B activada con epoxi.
[0128]
Fosforiloacion.
[0129] A una solucion de aproximadamente 0,2 M de oxicloruro de fosforo (3,7 g) en acetonitrilo seco, se mantuvo entre 0°C y -10°C, se anadio trietiloamina, (2,68 g). Despues de la adicion de trietiloamina, una solucion de aproximadamente 0,2 M de 2-[2-[6-(benciloxicarbonilamino)hexanolloamino]etoxi]etilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio sal de acido metanosulfonico (9*, 8,36 g, ejemplo 9) se anadio gota a gota durante un intervalo de tiempo de 30 min mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la suspension se incubo durante 24 h adicionales a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. El precipitado de hidrocloruro de trietiloamina se filtro y la solucion resultante se anadio agua (1,8 ml) con agitacion, manteniendo la temperatura a 0-5°C. La eliminacion de la mezcla de agua-disolvente en vaclo dio el producto
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fosforiloado, que era lo suficientemente puro para la desproteccion y la inmovilizacion subsiguiente.
Proteccion de la escision del grupo.
[0130] A una solucion agitada de producto fosforiloado en agua (50 ml) se anadio 10% de paladio sobre carbon activado (10% en moles) a 25°C. La mezcla resultante se agito durante 24 h a 25°C bajo H2 (1 atm) y luego se filtro. El catalizador se lavo con agua (2 x 10 ml) y la solucion transparente se concentro a presion reducida para dar 2-[3- aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno de alta pureza despues de la filtracion.
Inmovilizacion.
[0131] Se anadieron veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) en una solucion de 2-[2-[2-(6-aminohexanolloamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio] fosfato de hidrogeno de etilo (40 ml). El pH de la suspension resultante se ajusto a 11,0 con una solucion de 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 24: Inmovilizacion de 2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio] acetato de fosfato de hidrogeno en Sefarosa 6B activada por epoxi (material de separacion 4).
[0132]
Fosforiloacion.
[0133] A una solucion de aproximadamente 0,2 M de oxicloruro de fosforo (3,7 g) en acetonitrilo seco, se mantuvo entre 0°C y -10°C, se anadio trietiloamina (2,68 g). Despues de la adicion de trietiloamina, una solucion de aproximadamente 0,2 M de 2-[2-(1,3-dioxoisoindolina-2-ilo)etoxi]etilo-(2-hidroxietilo)-dimetilo-amonio sal de acido metanosulfonico (6,47 g, ejemplo 13) se anadio gota a gota durante un intervalo de tiempo de 30 min mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la suspension se incubo durante 24 h adicionales a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. El precipitado de hidrocloruro de trietiloamina se filtro y la solucion resultante se anadio agua (1,8 ml) con agitacion, manteniendo la temperatura a 0-5°C. La eliminacion de mezcla de agua-disolvente en vaclo dio el producto fosforiloado, que era lo suficientemente puro para la desproteccion y la inmovilizacion subsiguiente.
Proteccion de la escision del grupo.
[0134] A una solucion agitada de producto fosforiloado anteriormente en agua (50 ml) se anadio hidroxido de sodio 1 M hasta que el pH de la solucion alcanzo 11,5. La mezcla resultante se agito durante 1h a 25°C y luego se anadio acido clorhldrico 6M hasta que el pH de la solucion alcanzo 2. La mezcla resultante se agito durante 12 h a 25°C y luego se ajusto el pH de la mezcla de reaccion a 7.
Inmovilizacion.
[0135] Veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) se anadio a una solucion de 2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio] de fosfato acido de etilo (40 ml). pH de la suspension resultante se ajusto a
11,0 con una solucion de 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 25: Inmovilizacion de 3-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio]propilo fosfato de hidrogeno en Sefarosa 6B activada por epoxi (material de separacion 5).
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Fosforiloacion.
[0137] A una solucion de aproximadamente 0,2 M de oxicloruro de fosforo (3,7 g) en acetonitrilo seco, se mantuvo entre 0°C y -10°C, se anadio trietiloamina (2,68 g). Despues de la adicion de trietiloamina, una solucion de aproximadamente 0,2 M de 2-[2-( 1,3-dioxoisoindolina-2-ilo)etoxi]etilo-(3-hidroxipropilo) sal de acido metanosulfonico-dimetilo amonio (14 *, 6,7 g, ejemplo 14) se anadio gota a gota durante un intervalo de tiempo de 30 min mientras que se mantiene la temperatura de la mezcla de reaccion entre 0°C y -5°C. Despues de terminarse la adicion, la suspension se incubo durante 24 h adicionales a temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se controlo por LC/MS y TLC. El precipitado de hidrocloruro de trietiloamina se filtro y la solucion resultante se anadio agua (1,8 ml) con agitacion, manteniendo la temperatura a 0-5°C. La elimination de la mezcla de agua-disolvente en vaclo dio el producto fosforiloado, que era lo suficientemente puro para la desproteccion y la inmovilizacion subsiguiente.
Protection de la escision del grupo.
[0138] A una solucion agitada de producto fosforiloado anteriormente en agua (50 ml) se anadio 1 M de hidroxido de sodio hasta que el pH de la solucion alcanzo 11,5. La mezcla resultante se agito durante 1h a 25°C y luego se anadio acido clorhldrico 6M hasta que el pH de la solucion alcanzo 2. La mezcla resultante se agito durante 12 h a 25°C y luego el pH de la mezcla de reaccion se ajusto a 7.
Inmovilizacion.
[0139] Veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por suction (ejemplo 15) se anadio a una solucion de 3-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio]propilo fosfato de hidrogeno (40 ml). pH de la suspension resultante se ajusto a
11,0 con una solucion 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotation del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 26: Ejemplo comparativo
Inmovilizacion de (4-aminofenilo) 2-(trimetiloamonio)etilo fosfato en Sefarosa 6B activada de epoxi (material de separacion 6).
[0140]
Sefarosa
Inmovilizacion.
[0141] Veinte gramos de Sefarosa 6B activada por epoxi secada por succion (ejemplo 15) se anadio en una solucion de (4-aminofenilo) 2-(trimetiloamonio)etilo fosfato (4,41 g en 40 ml de agua). pH de la suspension resultante se ajusto a 11,5 con una solucion de 1 M de hidroxido de sodio. La mezcla se incubo en un laboratorio de rotacion del mezclador 24 h a temperatura ambiente. El gel se lavo con 4 x 100 ml de agua en autoclave y se mantiene en 20% (v/v) de etanol hasta su uso posterior.
Ejemplo 27: Determinacion de la afinidad de union
[0142] La union y tampon de lavado: 100 mM Tris, pH 8,0, cloruro de sodio 200 mM, cloruro de calcio 2 mM.
[0143] Tampon de elucion: Tris 100 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 200 mM, 2 mM EDTA.
[0144] Todas las operaciones cromatograficas se realizaron a temperatura ambiente.
[0145] 0,5 g de cada material de separacion se envaso en una pequena columna y se equilibro con 12 volumenes de lecho de resina (6 ml) de tampon de union. Se aplicaron 50 ml de suero humano o plasma (PCR> 0,1 mg/ml) en cada columna a 1,2 ml/min-40. El material no unido se elimino por lavado con 60 volumenes de lecho de resina de tampon de union (30 ml) hasta que la lectura de OD280 se acerco a una llnea de base de cero. Las protelnas unidas a resina de afinidad se eluyeron con tampon de elucion a una velocidad de 1,2 ml/min y se recogieron fracciones de 3,6 ml. Las fracciones recogidas se almacenaron a 4°C hasta que se analizaron por SDS-PAGE. Una determinacion cuantitativa de
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la protelna humana C-reactiva (CRP) se realizo por ELISA.
[0146] Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1.
- Material de separactin g
- Seta rose- OH * c. 9.1
- (EJemsio 26)
Claims (12)
- 51015202530354045505560Reivindicaciones1. Un compuesto de formula general (I)
imagen1 dondeb se selecciona entre 2 y 3;R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5Hny -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:imagen2 imagen3 donde uno o mas atomos de hidrogeno pueden ser sustituido por (a) atomo de fluor; X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;R3 se selecciona entre: -H, -CH3, -C2H5y -C3H7;-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld-Lc-Le-, en donde -La se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2-CH2-O)m-CH2-,imagen4 imagen5 y-Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2 -; -Ld- se selecciona entre: -(CH2)n-, -(CH2-CH2-O)n-CH2-,imagen6 yimagen7 -Le- se selecciona entre: -(CH2) p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-,5101520253035404550556065imagen8 imagen9 m, n, pi y p2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; y los enantiomeros, mezclas de enantiomeros, tautomeros, hidratos, solvatos, racematos, formas protonadas y deprotanadas de los compuestos mencionados anteriormente. - 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que B se selecciona de 2 y 3;R1 y R2 son independientemente el uno del otro, seleccionados de: -CH3 y -C2H5, o R1 y R2 pueden formar junto con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:
imagen10 imagen11 donde uno o mas atomo(s) de hidrogeno puede(n) sustituirse por (a) atomo(s) de fluor;X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;R3 se selecciona entre: -H, -CH3, -C2H5 y -C3H7;-L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld-Lc-Le-, en donde -La se selecciona entre: -(CH2)m- y -(CH2-CH2-O)m-CH2-;-Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2-; -Ld- se selecciona de entre: -(CH2)n- y -(CH2-CH2-OVCH2-;-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1- y -(CH2)p1-O-(CH2)p2-; ym, n, p1 y p2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. - 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que B se selecciona de 2 y 3; R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11 y -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterocicl o seleccionado de:
imagen12 donde uno o mas atomos de hidrogeno pueden ser sustituidos por (a) atomo(s) de fluor;X se selecciona de: -SH, -NHR3, -C = CH, -CH = CH2, -N3 y -CHO;R3 se selecciona entre: -H, -CH3, -C2Hsy -C3H7;-L- se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2)m-O-C(O)-NH-(CH2)p1-, -(CH2) o-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)p1-, - (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)n-O-(CH2)p1-, -(CH2)m-O-C(O)-NH-(CH2)n-O-(CH2)p1-, -(CH2)m-C(O)-51015202530354045505560NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)pi-O-(CH2)p2-, y-(CH2)m- o - C(O)-NH-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)pi-O-(CH2)p2-; y m, n, p11 y p2 son independientemente uno de otro seleccionados de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. - 4. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 seleccionado de:2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dietilo-amonio] fosfato de hidrogeno de etilo; 2-[4-[2-(2-aminoetoxi)etilo]morfolina-4-io-4-ilo]etilo fosfato de hidrogeno;2-[1 -[2-(2-aminoetoxi)etilo]piperidina-1-io-1 -ilo]etilo fosfato de hidrogeno;2-[2-(2-aminoetoxi)etilo-dimetilo-amonio] fosfato de hidrogeno de etilo;2-[3-aminopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[dimetilo(4-sulfanilbutilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[4-azidobutilo (dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[dimetilo(pent-4-inilo)amonio] acetato de fosfato de hidrogeno; 2-[3-(6-aminohexanolloamino)propilo-dietilo-amonio] fosfato de hidrogeno de etilo;2-[1-[2-[2-(6-aminohexanolloamino)etoxi]etilo]piperidina-1-io-1-ilo]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[4-[2-[2-[3-(6-aminohexanolloamino)propanolloamino]etoxi]etilo]morfolina-4-io-4-ilo]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[1-[2-[2-[6-(6-aminohexanolloamino)hexanolloamino]etoxi]etilo]pirrolidina-1-io-1-ilo]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-aliloxietilo (dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[2-aliloxietilo (dietilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[4-(2-aliloxietilo)morfolina-4-io-4-ilo]etilo fosfato de hidrogeno;2-[1-(2-aliloxietilo)piperidina-1-io-1-ilo]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-[2-(6-aminohexanolloamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-[2-[3-(6-aminohexanolloamino)propanolloamino]etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[3-azidopropilo(dimetilo)amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[dimetilo-[2-[2-(prop-2-ynoxicarbonilamino)etoxi]etilo]amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-[2-(aliloxicarbonilamino)etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-[2-[6-(aliloxicarbonilamino)hexanolloamino]etoxi]etilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[2-(6-aminohexanolloamino)etilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno;2-[dimetilo-[3-[6-(prop-2-inoxicarbonilamino)hexanolloamino]propilo]amonio]etilo fosfato de hidrogeno; 2-[3-(6-aminohexanolloamino)propilo-dimetilo-amonio]etilo fosfato de hidrogeno. 5
- 5. Un material de separation de formula general (II):
imagen13 dondeb se selecciona entre 2 y 3;R1 y R2 independientemente uno del otro se seleccionan entre: -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9, -C5H11 y -C6H13, o R1 y R2 pueden formarse juntos con el atomo de nitrogeno al que estan conectados un heterociclo seleccionado de:imagen14 imagen15 donde uno o mas atomo(s) de hidrogeno puede(n) ser sustituido(s) por (a) atomo de fluor;Y se selecciona entre: -CH(OH)-CH2-N(R4)-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-,5101520253035404550556065imagen16 imagen17 Jimagen18 yimagen19 R4 se selecciona de: -H, -CH3, -C2H5, -C3H7 y -C(O)-CH3; -L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Lb-Ld- Lc-Le, en el que-La se selecciona entre: -(CH2)m-, -(CH2-CH2-O)m-CH2-,imagen20 -Lb- y -Lc- independientemente uno del otro se seleccionan entre: -O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -O-C(O)-NH- y -SO2- -Ld- se selecciona entre: -(CH2)n-, -(CH2-CH2-OVCH2-,imagen21 -Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-5101520253035404550556065imagen22 -L*- se selecciona de: L*a-, -L*a -L*e- y -L*a, -L*b -L*e-, en el que -L*a- se selecciona de: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4 -, -(CH2-CH2-0)o-CH2- y -CH2-CH(OH)-CH2-; -L*e- se selecciona entre: -(CH2)q-, -C2H4-(O- CH2-CH2)q-, y -CH2-(O-CH2- CH2)q-;-L*b- se selecciona de: -O-(CH2)r-O-, -S-(CH2)r-S-, -SO2 -, -S-, -O-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH- y -S-S-; y m, n, p1, p2, o, r, q independientemente uno de otro se seleccionan de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;A es un soporte solido seleccionado del grupo que consiste en: polivinilpirrolidona (PVP), polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), poliacrilato, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de glicidilo) (PGMA), poli(metacrilato de hidroxi), poliestireno (PS), politetrafluoroetiloeno (PTFE), poliacrilamida, poliacrolelna, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), poliacrilonitrilo (PAN), poliuretano (PU), eupergit®, polietiloenglicol (PEG), hiperfluorocarbono, agarosa, alginato, carragenano, quitina, almidon, celulosa, nitrocelulosa, Sefarose®, vidrio, sllice, superficie de diatomeas, oxido de circonio, alumina, oxido de hierro y mezclas y/o derivados de dichos soportes solidos; formas protonadas y desprotonadas de este material de separacion. - 6. El material de separacion de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado porque el soporte solido A se selecciona del grupo que consiste en polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), mezclas y/o derivados de los mismos.
- 7. Una columna que comprende el material de separacion de acuerdo con la reivindicacion 5O 6.
- 8. Un dispositivo que comprende la columna de acuerdo con la reivindicacion 7.
- 9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 4 o un material de separacion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6 para su uso en la eliminacion extracorporal de la PCR a partir de un fluido biologico para la profilaxis y/o el tratamiento de disfunciones inmunes y enfermedades cardiovasculares.
- 10. El compuesto para uso o el material de separacion para uso de acuero con la reivindicacion 9, en el que el fluido biologico se selecciona de: sangre, plasma sangulneo, llquido peritoneal y llquido linfatico.
- 11. El compuesto para uso o el material de separacion para su uso segun la reivindicacion 9, en el que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo que comprende miocardio, ictus, diabetes, enfermedad renal en paso terminal, insuficiencia renal, insuficiencia renal debido a la hipertension, lesiones endoteliales, destruction endotelial, arteriosclerosis, trombosis, aterosclerosis, estenosis, restenosis, aterosclerosis o enfermedades tromboticas, insuficiencia de flujo de sangre, eventos isquemicos, embolia pulmonar, angina de pecho estable e inestable, enfermedades arteriales coronarias, infarto de miocardio, as! como los resultados patologicos de enfermedades arterioscleroticas o tromboticas.
- 12. El compuesto para uso o el material de separacion para su uso segun la reivindicacion 9, en el que las disfunciones inmunes se seleccionan entre el grupo que comprende enfermedades inmunes, enfermedades autoinmunes, reacciones de rechazo en transplantes, rechazo de alo-trasplante, rechazo de xeno-trasplante, rechazo de injerto contra huesped, rechazo de huesped contra injerto, diabetes mellitus, reumatismo, artritis reumatoide, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, esclerosis multiple, miastenia gravis, psoriasis vulgaris, enfermedad de Graves, slndrome de Goodpasture, purpura de trombocitopenia idiopatica (ITP), anemia aplasica, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (tambien conocido como slndrome de Crohn),colitis ulcerosa, cardiomiopatla dilatada (DCM), tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, terapia de reemplazo hormonal (TRH), osteoartritis y gota.
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