JPH085904B2 - 新規ホスホリルコリン誘導体の製造法 - Google Patents
新規ホスホリルコリン誘導体の製造法Info
- Publication number
- JPH085904B2 JPH085904B2 JP10117286A JP10117286A JPH085904B2 JP H085904 B2 JPH085904 B2 JP H085904B2 JP 10117286 A JP10117286 A JP 10117286A JP 10117286 A JP10117286 A JP 10117286A JP H085904 B2 JPH085904 B2 JP H085904B2
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- Japan
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- crp
- producing
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- reaction
- phosphorylcholine derivative
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、分子内にアミノ基をもつ高分子化合物であ
る可溶性蛋白質からなる担体にホスホリルコリンの誘導
体を還元アミノ化反応を利用して固定化する新規ホスホ
リルコリン誘導体の製造法に関するものである。
る可溶性蛋白質からなる担体にホスホリルコリンの誘導
体を還元アミノ化反応を利用して固定化する新規ホスホ
リルコリン誘導体の製造法に関するものである。
（産業上の利用分野） 一般に、Ｃ−反応性蛋白質（C-reactive protein、以
下CRPという）は肺炎双球菌のＣ多糖と反応する蛋白質
として知られ広く細菌感染の際血中に現れる。
下CRPという）は肺炎双球菌のＣ多糖と反応する蛋白質
として知られ広く細菌感染の際血中に現れる。
そこで、体液、特に血中のCRPの濃度の測定は、組織
破壊を伴うような細菌による炎症性疾患の診断に有用な
情報を提供するものであり、又、悪性しゅようの早期診
断にもつながることから、現在臨床検査領域において広
く用いられるようになってきている。
破壊を伴うような細菌による炎症性疾患の診断に有用な
情報を提供するものであり、又、悪性しゅようの早期診
断にもつながることから、現在臨床検査領域において広
く用いられるようになってきている。
そして、その定量法は抗原抗体反応を利用して行なわ
れるのが一般的であるが、この定量法で用いる抗体を作
製する場合には、高純度のCRPが必要であり、又、検量
線を得るための正確なCRP濃度の標準液も必要である。
この標準液は一般に高純度のCRPをCRPを含まない血清に
加えて作製するため、やはり高純度のCRPが必要であ
る。
れるのが一般的であるが、この定量法で用いる抗体を作
製する場合には、高純度のCRPが必要であり、又、検量
線を得るための正確なCRP濃度の標準液も必要である。
この標準液は一般に高純度のCRPをCRPを含まない血清に
加えて作製するため、やはり高純度のCRPが必要であ
る。
CRPの単離方法としては、Woodらの方法（Wood,H.W.,e
t al.（1954）J.Exp.Med.,10,71）やPepysらの方法（Pe
pys,M.B.,（1977）Lancet,１,1029）が知られている
が、いずれの方法も夾雑蛋白質の混入を防ぐことが出来
ず、高純度のCRP標品を単離・精製することが困難であ
る。その他の精製法として、CRPはカルシウム存在下で
ホスホリルコリン（Phosphorylcholine,以下、PCと略記
することもある）と特異的に結合するという知見より、
PCをリガンドとして固定化した高分子担体（以下、PC−
固定化担体と略記することもある）のアフィニティーク
ロマトグラフィーによってCRPを単離する方法も提案さ
れている（01iveira,E.B.et al.（1980）J.Immunol.,12
4,1396.）。これらのPC−固定化担体によるCRPの精製法
には、精製工程の簡略化と、夾雑蛋白質の混入を防止
し、高純度のCRPを得ることが出来るという利点があ
る。しかし、従来のこれらのPC−固定化担体の製造法
は、非常に複雑で反応ステップも多いことから多大の労
力が必要とされ、最終生成物の収量も低いという問題点
がある。
t al.（1954）J.Exp.Med.,10,71）やPepysらの方法（Pe
pys,M.B.,（1977）Lancet,１,1029）が知られている
が、いずれの方法も夾雑蛋白質の混入を防ぐことが出来
ず、高純度のCRP標品を単離・精製することが困難であ
る。その他の精製法として、CRPはカルシウム存在下で
ホスホリルコリン（Phosphorylcholine,以下、PCと略記
することもある）と特異的に結合するという知見より、
PCをリガンドとして固定化した高分子担体（以下、PC−
固定化担体と略記することもある）のアフィニティーク
ロマトグラフィーによってCRPを単離する方法も提案さ
れている（01iveira,E.B.et al.（1980）J.Immunol.,12
4,1396.）。これらのPC−固定化担体によるCRPの精製法
には、精製工程の簡略化と、夾雑蛋白質の混入を防止
し、高純度のCRPを得ることが出来るという利点があ
る。しかし、従来のこれらのPC−固定化担体の製造法
は、非常に複雑で反応ステップも多いことから多大の労
力が必要とされ、最終生成物の収量も低いという問題点
がある。
そこで、本発明者らは、精製工程が簡略化され高純度
のCRPを得ることが出来るマフィニティークロマトグラ
フィーのPC−固定化担体の製造において、上記の問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、市販の物質・試薬等を
用いて容易にPC−固定化担体を製造出来る方法を開発す
ることに成功し、本発明を完成した。
のCRPを得ることが出来るマフィニティークロマトグラ
フィーのPC−固定化担体の製造において、上記の問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、市販の物質・試薬等を
用いて容易にPC−固定化担体を製造出来る方法を開発す
ることに成功し、本発明を完成した。
（従来技術との比較） 従来のPC−固定化担体の製造法は、先にも述べたよう
に非常に反応ステップが多く複雑な合成反応を必要とし
ている。下記に01iveira,E.BらのPC−固定化担体の製造
法の一例を示す。（尚、矢印は一つの反応ステップを意
味する） 上記のように従来法では、多くの反応ステップを必要
とするため、必然的に多大の労力を要し、操作も複雑で
あり、収率も低い。
に非常に反応ステップが多く複雑な合成反応を必要とし
ている。下記に01iveira,E.BらのPC−固定化担体の製造
法の一例を示す。（尚、矢印は一つの反応ステップを意
味する） 上記のように従来法では、多くの反応ステップを必要
とするため、必然的に多大の労力を要し、操作も複雑で
あり、収率も低い。
しかし、本発明におけるPC−誘導体の製造法は例えば
市販のＬ−グリセロホスホリルコリンを過ヨウ素酸で酸
化し、その生成物の高分子担体への固定化も還元アミノ
化反応という一つの反応ステップだけで製造することが
出来るため、従来法にくらべ非常に容易にかつ高収率で
製造することが可能となったのである。
市販のＬ−グリセロホスホリルコリンを過ヨウ素酸で酸
化し、その生成物の高分子担体への固定化も還元アミノ
化反応という一つの反応ステップだけで製造することが
出来るため、従来法にくらべ非常に容易にかつ高収率で
製造することが可能となったのである。
本発明は次の式（Ｉ）に示される化合物と、 （式中Ｒは低級アルキレンを表わす。） 可溶性蛋白質とを、還元アミノ化反応せしめることを特
徴とする新規ホスホリルコリン誘導体の製造法である。
徴とする新規ホスホリルコリン誘導体の製造法である。
式（Ｉ）で示される化合物はその前駆的化合物、即ち
Ｌ−グリセロホスホリルコリン、Ｄ−グリセロホスホリ
ルコリンなどを過ヨウ素酸で酸化すれば容易に得ること
ができる。
Ｌ−グリセロホスホリルコリン、Ｄ−グリセロホスホリ
ルコリンなどを過ヨウ素酸で酸化すれば容易に得ること
ができる。
また、本発明の反応に用いる可溶性蛋白質としては、
分子内にアミノ基をもった可溶性蛋白質であれば各種の
蛋白質が使用され、例えば市販の牛血清アルブミンを使
用するのが好ましい。
分子内にアミノ基をもった可溶性蛋白質であれば各種の
蛋白質が使用され、例えば市販の牛血清アルブミンを使
用するのが好ましい。
反応は式（Ｉ）で示される化合物と緩衝液中で還元ア
ミノ化反応を行なえればよい。還元剤としては、ジメチ
ルアミンボラン、シアノ水素化ほう素ナトリウムなどが
あるが、シアノ水素化ほう素ナトリウムが一般的であ
る。反応は37℃程度に加温し、10〜30時間の反応によっ
て、可溶性蛋白質のアミノ基に式（Ｉ）の化合物が結合
する。
ミノ化反応を行なえればよい。還元剤としては、ジメチ
ルアミンボラン、シアノ水素化ほう素ナトリウムなどが
あるが、シアノ水素化ほう素ナトリウムが一般的であ
る。反応は37℃程度に加温し、10〜30時間の反応によっ
て、可溶性蛋白質のアミノ基に式（Ｉ）の化合物が結合
する。
反応後は、水に対して透析し、未反応低分子化合物を
除去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン誘導
体（PC−誘導体）を粉末で得ることができる。
除去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン誘導
体（PC−誘導体）を粉末で得ることができる。
本発明の製造法で合成されたPC−誘導体はCRPの精製
に用いて高純度のCRPを容易に製造せしめるだけでな
く、CRPの定量にも利用することができる。
に用いて高純度のCRPを容易に製造せしめるだけでな
く、CRPの定量にも利用することができる。
現在、体液中のCRPの定量には、毛細管法、SRID法
（一次元免疫拡散法）、ラテックス凝集反応等の半定量
法、免疫比濁法、レーザーネフェトメトリー法等の定量
法等あるが、これらはずべてCRPの抗原抗体反応が利用
されている。PCは、CRPの抗体ではないが、CRPに対し
て、CRPの抗体に勝るとも劣らない特異性ならびに結合
力を有するものであり、本発明の製造法で製造されたPC
−誘導体も又、CRPに対して同様の性質を有するもので
あり、CRPの抗体の代りに使用することができる。
（一次元免疫拡散法）、ラテックス凝集反応等の半定量
法、免疫比濁法、レーザーネフェトメトリー法等の定量
法等あるが、これらはずべてCRPの抗原抗体反応が利用
されている。PCは、CRPの抗体ではないが、CRPに対し
て、CRPの抗体に勝るとも劣らない特異性ならびに結合
力を有するものであり、本発明の製造法で製造されたPC
−誘導体も又、CRPに対して同様の性質を有するもので
あり、CRPの抗体の代りに使用することができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1. 50mMのＬ−グリセロホスホリルコリン水溶液52mlにメ
タ過コウ素酸ナトリウムを終濃度100mMとなるように溶
解し、室温で30分間放置することにより、コリンホスホ
リルグリコアルデヒドとホルムアルデヒドの混合生成物
を得た。次に、この混合生成物を氷浴中で２時間冷却
し、加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチレングリコール
を加え乾固した。得られた白色の粉末を0.1Mの酢酸10ml
に溶解し0.1M酢酸であらかじめ平衡化しておいたセファ
デックスG-75（ファルマシア社製）カラムでゲルロカを
行なった。ネオカプロイン法で確認したコリンホスホリ
ルグリコアルデヒド溶出画分を集め濃縮した。分子内リ
ン酸残基を定量することによってコリンホスホリルグリ
コアルデヒドのＬ−グルセロホスホリルコリンよりの収
率を求めたところ80％であった。
タ過コウ素酸ナトリウムを終濃度100mMとなるように溶
解し、室温で30分間放置することにより、コリンホスホ
リルグリコアルデヒドとホルムアルデヒドの混合生成物
を得た。次に、この混合生成物を氷浴中で２時間冷却
し、加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチレングリコール
を加え乾固した。得られた白色の粉末を0.1Mの酢酸10ml
に溶解し0.1M酢酸であらかじめ平衡化しておいたセファ
デックスG-75（ファルマシア社製）カラムでゲルロカを
行なった。ネオカプロイン法で確認したコリンホスホリ
ルグリコアルデヒド溶出画分を集め濃縮した。分子内リ
ン酸残基を定量することによってコリンホスホリルグリ
コアルデヒドのＬ−グルセロホスホリルコリンよりの収
率を求めたところ80％であった。
上記のようにして得られたコリンホスホリルグリコア
ルデヒド470mgを0.2Mリン酸緩衝液pH7.0の溶液70mlに溶
解し、さらに牛血清アルブミン（BSA）を800mg加えた。
次に、シアノ水素化ほう素ナトリウム870mgを加え、37
℃で20時間、インキュベートした。インキュベート後、
反応液を水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥するこ
とによりBSA1分子あたり平均24.3分子のPCが結合した新
規PC誘導体を得た。
ルデヒド470mgを0.2Mリン酸緩衝液pH7.0の溶液70mlに溶
解し、さらに牛血清アルブミン（BSA）を800mg加えた。
次に、シアノ水素化ほう素ナトリウム870mgを加え、37
℃で20時間、インキュベートした。インキュベート後、
反応液を水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥するこ
とによりBSA1分子あたり平均24.3分子のPCが結合した新
規PC誘導体を得た。
実施例2. 40mgのBSAと、第１表の番号１〜４に示すそれぞれの
量の実施例１で示した方法と同様にして合成したホスホ
リルコリングリコアルデヒド，シアノ水素化ほう素ナト
リウム,0.2Mリン酸緩衝液pH7.0を使用して実施例１と同
様の操作を行なった。
量の実施例１で示した方法と同様にして合成したホスホ
リルコリングリコアルデヒド，シアノ水素化ほう素ナト
リウム,0.2Mリン酸緩衝液pH7.0を使用して実施例１と同
様の操作を行なった。
以上のようにして製造された新規PC誘導体はBSA1分子
あたり、番号１が3.9分子、２が7.9分子、３が49.4分
子、４が56.3分子のPCを結合していることがわかった。
あたり、番号１が3.9分子、２が7.9分子、３が49.4分
子、４が56.3分子のPCを結合していることがわかった。
Claims (4)
- 【請求項１】次の式（Ｉ）に示される化合物と、 （式中Ｒは低級アルキレンを表わす） 可溶性蛋白質とを、還元アミノ化反応せしめることを特
徴とする新規ホスホリルコリン誘導体の製造法。 - 【請求項２】式（Ｉ）に示される化合物が次の式（II）
に示されるコリンホスホリルグリコアルデヒドである特
許請求の範囲第１項記載の新規ホスホリルコリン誘導体
の製造法。 - 【請求項３】可溶性蛋白質がアルブミンである特許請求
の範囲第１項記載の新規ホスホリルコリン誘導体の製造
法。 - 【請求項４】式（Ｉ）に示される化合物が、式（II）に
示されるコリンホスホリルグリコアルデヒドであり、か
つ可溶性蛋白質がアルブミンである特許請求の範囲第１
項記載の新規ホスホリルコリン誘導体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10117286A JPH085904B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | 新規ホスホリルコリン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10117286A JPH085904B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | 新規ホスホリルコリン誘導体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62258390A JPS62258390A (ja) | 1987-11-10 |
| JPH085904B2 true JPH085904B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=14293590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10117286A Expired - Fee Related JPH085904B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | 新規ホスホリルコリン誘導体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH085904B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2971290B2 (ja) * | 1993-04-27 | 1999-11-02 | オリエンタル酵母工業株式会社 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ |
| AU7781498A (en) * | 1997-06-04 | 1998-12-21 | Biocompatibles Limited | Zwitterionic compounds and their use to cross-link collagenous materials |
| WO2003036297A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-05-01 | Tridelta Development Limited | Non-immunological assays for the detection and determination of c-reactive protein |
| EP2700445B1 (en) * | 2002-11-25 | 2015-07-08 | Shiseido Company Limited | Method of preparing a chromatography packing |
| JP4245336B2 (ja) * | 2002-11-25 | 2009-03-25 | 株式会社資生堂 | ホスホリルコリン基を有するポリシロキサン及びその製造方法 |
| JP3852942B2 (ja) * | 2004-05-24 | 2006-12-06 | 株式会社資生堂 | 水中分散性化粧料用粉体 |
| KR100966627B1 (ko) * | 2006-06-14 | 2010-06-29 | 주식회사 대웅제약 | Ｌ-α-글리세로포스포릴 콜린의 제조방법 |
| JP5173691B2 (ja) * | 2008-09-17 | 2013-04-03 | 株式会社 資生堂 | 親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤 |
| EP2957563A1 (en) * | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Pentracor GmbH | Separation material comprising phosphoryl choline derivatives |
-
1986
- 1986-05-02 JP JP10117286A patent/JPH085904B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62258390A (ja) | 1987-11-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |