ES2636649T3 - Composiciones y métodos para aumentar la biomasa y tolerancia a patógenos en plantas - Google Patents

Composiciones y métodos para aumentar la biomasa y tolerancia a patógenos en plantas Download PDF

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Abstract

Un método para potenciar una característica de una planta, comprendiendo el método administrar FB17 de Bacillus subtilis a la semilla de una planta en una cantidad eficaz para (a) producir una mayor biomasa en la planta en comparación con una planta no tratada; (b) producir una mayor tolerancia a la sequía en la planta en comparación con una planta no tratada; (c) inhibir la infección de la planta por un patógeno fúngico en comparación con una planta no tratada; y/o (d) aumentar la tolerancia a patógenos de planta.

Description

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EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se germinaron Brachypodium distachyon y plantas de maíz y se cultivaron durante 21 días. Una vez cada 5 días (3 veces), se añadieron 5 ml de FB17 de B. subtilis de DO 0,5 por maceta. Para el control, se añadieron 5 ml de OP50 de E. coli de DO 0,5 por maceta. FB17 y OP50 se habían cultivado durante la noche en medio LB y la densidad óptica (DO) a la longitud de onda (600 nm) se tomó usando el espectrofotómetro SmartSpec (Bio Rad). Diez días después del tratamiento final, se analizaron las plantas. Los controles descritos en todos los experimentos en el presente documento se refieren a plantas que no se trataron con bacterias o que se trataron con OP50 de E. coli.
Se cultivaron Brachypodium distachyon (Bd2-1) y plantas de maíz tratadas con FB17 de B. subtilis, E. coli de control bacteriano, o tratamiento simulado, en macetas de 4x4 pulgadas en condiciones estándar (22-25 ºC, 60 % de humedad, fotoperiodo de 16 h de luz-8 h de oscuridad) durante 30 días después del tratamiento. La biomasa aérea y de raíz del cultivo energético de B. distachyon aumentó con el tratamiento con FB17. La Figura 1 muestra que la biomasa de B. distachyon tratado con FB17 se potenció a un nivel estadístico. La Figura 2 representa un aumento en la eficiencia fotosintética observada en B. distachyon tratado con FB17. B. distachyon tratado con FB17 contuvo más clorofila y carotenoides totales que los controles, demostrando una salud de la planta robusta. La Figura 3 muestra cantidades de FB17 recuperadas de tierra que rodea a las raíces de B. distachyon. La figura revela que FB17 está asociado mucho más fuertemente a raíces de B. distachyon en comparación con E. coli, que sugiere la naturaleza rizobacteriana verdadera de FB17.
Las plantas de maíz también presentaron un aumento en la biomasa aérea y de raíz después de cultivar durante 30 días tras el tratamiento con FB17 de B. subtilis, OP50 de E. coli de control bacteriano, o tratamiento simulado.
Ejemplo 2
Se germinaron y cultivaron semillas de Arabidopsis thaliana durante 21 días. Una vez cada 5 días (3 veces), se añadieron 5 ml de FB17 de B. subtilis de DO 0,50 por maceta. Para el control, se añadieron 5 ml de OP50 de E. coli de DO 0,5 por maceta. FB17 y OP50 se habían cultivado durante la noche en medio LB y la densidad óptica (DO) a la longitud de onda (600 nm) se tomó usando el espectrofotómetro SmartSpec (Bio Rad). Diez días después del tratamiento final, las plantas se sometieron a sequía (es decir, no se añadió agua) a 25 ºC con 40 % de humedad durante 4 semanas. Treinta días después del tratamiento, la sequía se evaluó mediante la pérdida de fenotipo de permanencia verde en las plantas no tratadas en comparación con las plantas tratadas con FB17, que indica que FB17 confiere tolerancia a la sequía mejorada en Arabidopsis.
Ejemplo 3
El tratamiento de semilla con FB17 de B. subtilis promueve la mejora de biomasa en Mo17, CML258, CML10 de maíz, Zinnia y Brachypodium distachyon.
Para probar el efecto de FB17 de B. subtilis sobre la mejora de biomasa en maíz (Mo17, CML258, CML10), soja (Will-82), tomate (Solanum lycopersicum), Zinnia y Brachypodium distachyon (un modelo de cultivo energético), se trataron 50 semillas (n= 50) por especie de planta con FB17 de B. subtilis (aproximadamente 1X107 UFC/semilla o 12,5 ml/kg de FB17 de Bacillus subtilis de densidad óptica (DO) 0,5 cultivado durante la noche en medio LB, a longitud de onda 600 nm como se mide usando un espectrofotómetro SmartSpec Bio Rad). Después del tratamiento de semilla, las semillas se sembraron individualmente en macetas (4x4 pulgadas) con una mezcla de tierra para estudios de germinación y biomasa. De forma interesante, el tratamiento de semilla de FB17 de B. subtilis promovió el crecimiento de raíz y brotes para todas las especies de cultivo probadas. Se tomaron mediciones 15 días después del tratamiento.
Las plantas de semilla tratada promovieron la elevada biomasa de raíz produciendo sistemas de raíces más densos que el aumento de longitud de raíz. Resulta un sistema de raíces más denso del aumento de raíces laterales y pelos de raíces que proporcionan captación más disponible de agua y nutrientes.
Zea mays var. CML258 produjo aproximadamente el 16 % de aumento en la biomasa aérea (g de DW) con respecto al control. Zea mays var. CML10 produjo aproximadamente el 9 % de aumento en la biomasa aérea (g de DW) con respecto al control. Zea mays var. Mo-17 produjo aproximadamente el 38 % de aumento en la biomasa aérea (g de DW) con respecto al control. Brachypodium produjo aproximadamente el 40 % de aumento en la biomasa aérea (g de DW) con respecto al control. Se observó un aumento significativo de aproximadamente el 28 % en biomasa aérea y de raíz total con Z. mays (MO17) con respecto al control. La Figura 4 ilustra el aumento de biomasa total en plantas tratadas con FB17 de B. subtilis.
La Figura 5 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de biomasa de raíz y de brotes en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de plantas Mo-17. La Figura 6 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de los números de hojas en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de plantas de Brachypodium distachyon (genotipo Bd2-1) de cultivo bioenergético. La Figura 7 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de biomasa de raíz y de brotes en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de plantas de Brachypodium distachyon
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(genotipo Bd2-1) de cultivo bioenergético. Las Figuras 8 y 9 ilustran datos cuantitativos que muestran el aumento de biomasa de raíz y de brotes en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de Zinnia sp. 'Red Spider'.
Ejemplo 4
El tratamiento de semillas con FB17 de B. subtilis promueve la eficiencia fotosintética en maíz y tomate.
Para probar el efecto de FB17 de B. subtilis sobre la eficiencia fotosintética en maíz (Mo17, CML258, CML10), soja (Will-82), tomate (Solanum lycopersicum), Zinnia y Brachypodium (un modelo de cultivo energético), se trataron 50 semillas (n= 50) por especie de planta con FB17 de B. subtilis (12,5 ml/kg o 1e7 UFC/semilla). Se recogieron las hojas después de 15-32 días de tratamiento y se analizaron para el contenido de clorofila total. Los resultados mostraron que las plantas de maíz y tomate inoculadas con FB17 de B. subtilis (tomate y líneas de maíz exótico CML258 y CML10) mostraron contenido de clorofila y carotenoide mejorado en comparación con las muestras no tratadas, como se representa en las Figuras 10 y 11.
El aumento de los valores de clorofila total tiene el potencial de promover el aumento de vigor y biomasa como se observa con CML258 y CML10. El contenido de clorofila total de las semillas de tomate inoculadas con FB17 de B. subtilis produjo un aumento de aproximadamente el 14 %. Incluso más significativas son las líneas de maíz exótico CML258 y CML10 con un aumento de aproximadamente el 87 % y aumento de aproximadamente el 72 %, respectivamente.
Aunque hay aumentos en el contenido de clorofila total, eso no significa que el contenido de carotenoide total también se corresponderá con un aumento del valor. Tomate y Zinnia tuvieron porcentaje de carotenoide total significativamente reducido cuando se inocularon con FB17 de B. subtilis y se compararon con semillas no tratadas. CML258 y CML10 de maíz tuvieron porcentajes de carotenoide total significativamente elevados, mientras que soja, maíz Mo17 y Brachypodium no mostraron diferencia estadísticamente significativas entre semillas tratadas y no tratadas.
La Figura 12 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de la eficiencia fotosintética en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de plantas Mo-17. La Figura 13 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de la eficiencia fotosintética en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de plantas de cultivo bioenergético de Brachypodium distachyon (genotipo Bd2-1). La Figura 14 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de la eficiencia fotosintética en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis de Zinnia sp. 'Red Spider'. La Figura 15 ilustra datos cuantitativos que muestran el aumento de la eficiencia fotosintética en las semillas tratadas con FB17 de B. subtilis del maíz exótico CML 10 y CML 258.
Ejemplo 5
El tratamiento de semilla con FB17 de B. subtilis promueve la germinación en plantas de maíz y de tomate.
Para probar el efecto de FB17 de B. subtilis sobre el aumento en el porcentaje de germinación en maíz (Mo17, CML258, CML10), soja (Will-82), tomate (Solanum lycopersicum), Zinnia y Brachypodium (un modelo de cultivo energético), se trataron 50 semillas (n= 50) por especie de planta con FB17 de B. subtilis (12,5 ml/kg o 1e7 UFC/semilla). Los porcentajes de germinación finales se puntuaron 8 días después de la fecha de siembra. Los resultados mostraron que el tratamiento con FB17 de B. subtilis promovió la respuesta de germinación estadísticamente significativa en tomate y maíz, como se representa en la Figura 16.
Las semillas de tomate tratadas con FB17 de B. subtilis y la línea de maíz exótico CML 258 tuvieron un 5,9 % y 14 % de aumento en el porcentaje de germinación, respectivamente.
El tratamiento de semillas con FB17 de B. subtilis tuvo efectos neutros y positivos para todas las especies de cultivo probadas. No hubo una respuesta estadísticamente negativa al porcentaje de germinación cuando se aplicaron los tratamientos de semilla.
Ejemplo 6
Para probar el efecto de FB17 de B. subtilis en maíz (Mo17, CML258, CML10), soja (Will-82), tomate (Solanum lycopersicum), Zinnia y Brachypodium (un modelo de cultivo energético), se trataron 50 semillas (n= 50) por especie de planta con FB17 de B. subtilis (1e7 UFC/semilla o 12,5 ml/kg de FB17 de Bacillus subtilis de densidad óptica (DO) 0,5 cultivado durante la noche en medio LB, a longitud de onda 600 nm como se mide usando un espectrofotómetro SmartSpec Bio Rad). Después del tratamiento de semilla, las semillas se sembraron individualmente en macetas (4x4 pulgadas). Se hicieron mediciones después de 15 días de tratamiento. La Figura 17 ilustra la velocidad de crecimiento en Zea mays tras el tratamiento con FB17 de B. subtilis. La Figura 18 ilustra la capacidad de retención de agua en plantas tratadas con FB17 de B. subtilis. Se observó un aumento significativo en la capacidad de retención de agua total y la retención en tomate (2,1 %) y MO17 de Z. mays (3,5 %) después del tratamiento con FB17. La Figura 19 ilustra la tolerancia a la sequía en plantas tratadas con FB17 de B. subtilis. Se observó un aumento significativo en la velocidad de crecimiento bajo tratamientos de sequía en MO17 (37,5 % de aumento con respecto al control de tratamiento sin agua) después del tratamiento con FB17. La Figura 20 ilustra que el
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