ES2636962T3 - Uso de benzoxaboroles como agentes antimicrobianos volátiles en carnes, plantas o partes de plantas - Google Patents

Abstract

Un método de uso de un compuesto volátil antimicrobiano contra agentes patógenos que afectan a carnes, plantas o partes de plantas, que comprende proporcionar un compuesto volátil antimicrobiano de fórmula (IV): **(Ver fórmula)** en la que A y D junto con los átomos de carbono a los que están unidos forman un anillo condensado de 5, 6 o 7 miembros que puede estar sustituido con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, hidroxi, halógeno, nitro, nitrilo, amino, amino sustituido con uno o más grupos alquilo C1-C6, carboxi, acilo, ariloxi, carbonamido, carbonamido sustituido con alquilo C1-C6, sulfonamido o trifluorometilo o el anillo condensado puede unir dos anillos oxaboroles; X es un grupo -CR7R8 en el que R7 y R8 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6, nitrilo, nitro, arilo, arilalquilo o R7 y R8 junto con el átomo de carbono a los que están unidos forman un anillo alicíclico; y R6 es hidrógeno, alquilo C1-C18, alquilo C1-C18 sustituido con alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, hidroxi, amino, amino sustituido con alquilo C1-C18, carboxi, arilo, ariloxi, carbonamido, carbonamido sustituido con alquilo C1-C6, arilo o arilalquilo, arilalquilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, alquilenoamino C1-C18, alquilenoamino C1-C18 sustituido con fenilo, alcoxi C1-C6 o alquiltio C1-C6, carbonil alquilenoamino o un radical de fórmula (V): **(Ver fórmula)** en la que A, D y X son como se definen en este documento anteriormente, excepto para boronoftalida; y sus sales agrícolamente aceptables; y poner en contacto una carne, planta o parte de la planta con una cantidad eficaz del compuesto volátil antimicrobiano, en el que dicho contacto comprende aplicar el compuesto volátil antimicrobiano por medio de tratamiento con gas.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

grupo carbonilo o grupo sulfonilo; ejemplos de tales grupos R1, R2, R3 y R4 son heterocicliloxi, heterociclilcarbonilo, diheterociclilamino, y diheterociclilaminosulfonilo.

También entre los grupos R1, R2, R3 y R4 apropiados están, por ejemplo, grupos heterocíclicos sustituidos y no sustituidos que están conectados al compuesto ciclopropeno a través de un grupo oxi intermedio, grupo amino, grupo carbonilo, grupo sulfonilo, grupo tioalquilo, o un grupo aminosulfonilo; ejemplos de tales grupos R1, R2, R3 y R4 son diheteroarilamino, heteroariltioalquilo, y diheteroarilaminosulfonilo.

También entre los grupos R1, R2, R3 y R4 apropiados están, por ejemplo, hidrógeno, fluoro, cloro, bromo, yodo, ciano, nitro, nitroso, azido, clorato, bromato, yodato, isocianato, isocianido, isotiocianato, pentafluorotio, acetoxi, carboetoxi, cianato, nitrato, nitrito, perclorato, alenilo, butilmercapto, dietilfosfonato, dimetilfenilsililo, isoquinolilo, mercapto, naftilo, fenoxi, fenilo, piperidino, piridilo, quinolilo, trietilsililo, trimetilsililo, y análogos sustituidos de los mismos.

Como se utiliza en este documento, el grupo químico G es un sistema de anillos de 3 a 14 miembros. Los sistemas de anillos apropiados como grupo químico G pueden estar sustituidos o no sustituidos; pueden ser aromáticos (incluyendo, por ejemplo, fenilo y naftilo) o alifáticos (incluyendo alifáticos insaturados, alifáticos parcialmente saturados o alifáticos saturados); y pueden ser carbocíclicos o heterocíclicos. Entre los grupos heterocíclicos G, algunos heteroátomos apropiados son, por ejemplo, nitrógeno, azufre, oxígeno y combinaciones de los mismos. Los sistemas de anillos apropiados como grupo químico G pueden ser monocíclicos, bicíclicos, tricíclicos, policíclicos, espiro o condensados; entre los sistemas de anillo G apropiados del grupo químico que son bicíclicos, tricíclicos o condensados, los diversos anillos en un único grupo químico G pueden ser del mismo tipo o pueden ser de dos o más tipos (por ejemplo, un anillo aromático puede fundirse con un anillo alifático).

En una realización, uno o más de R1, R2, R3 y R4 es hidrógeno o alquilo (C1-C10). En otra realización, cada uno de R1, R2, R3 y R4 es hidrógeno o alquilo (C1-C8). En otra realización, cada uno de R1, R2, R3 y R4 es hidrógeno o alquilo (C1-C4). En otra realización, cada uno de R1, R2, R3 y R4 es hidrógeno o metilo. En otra realización, R1 es alquilo (C1-C4) y cada uno de R2, R3 y R4 es hidrógeno. En otra realización, R1 es metilo y cada uno de R2, R3, y R4 es hidrógeno, y el compuesto ciclopropeno se conoce en este documento como 1-metilciclopropeno o "1-MCP."

En otra realización, el ciclopropeno tiene la fórmula:

imagen7

en la que R es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o naftilo sustituido o no sustituido; en la que los sustituyentes son independientemente halógeno, alcoxi, o fenoxi sustituido o no sustituido. En una realización, R es alquilo C1-C8. En otra realización, R es metilo.

En otra realización, el ciclopropeno tiene la fórmula:

imagen8

en la que R1 es un grupo alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C1-C4, alquinilo C1-C4, cicloalquilo C1-C4, cicloalquilalquilo, fenilo o naftilo; y R2, R3, y R4 son hidrógeno. En otra realización, el ciclopropeno comprende 1metilciclopropeno (1-MCP).

Como se usa en este documento, la frase "vector transgénico" se refiere a un vector que contiene un segmento insertado de ácido desoxirribonucleico (ADN), el “transgén” que se transcribe en ácido ribonucleico mensajero (ARNm) o replicado como ácido ribonucleico (ARN) dentro de una célula huésped. La frase "transgén" se refiere no sólo a la porción de ADN insertado que se convierte en ARN, sino también a aquellas porciones del vector que son necesarias para la transcripción o replicación del ARN. Un transgén comprende por lo general un gen de interés, pero no necesariamente comprende una secuencia polinucleotídica que contiene un marco de lectura abierto capaz de producir una proteína.

Las carnes, plantas o partes de plantas se pueden tratar en la práctica de la presente invención. Un ejemplo es el tratamiento de plantas enteras; otro ejemplo es el tratamiento de plantas enteras mientras se plantan en el suelo, antes de la recolección de partes útiles de la planta.

imagen9

producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de 14 días de almacenamiento a 4°C, los cultivos se evalúan para el crecimiento porcentual con respecto al control. Independientemente de si las esporas habían germinado durante 5 días, o si el tratamiento comenzó poco después de la inoculación de las placas (∼15 minutos); hay un 100% de control del agente patógeno fúngico hasta 0.005 mg. Los resultados experimentales se

5 resumen en la tabla 1. Los resultados sugieren que el compuesto A es capaz de matar las esporas de Botrytis cinérea e inhibir el crecimiento micelial en la misma concentración. De este modo, el compuesto A (Figura 1) muestra una eficacia del 100% en la inhibición in vitro del crecimiento de hongos a una velocidad de 0.005 mg/disco.

Ejemplo 2

Se ensayan un total de 14 compuestos antimicrobianos usando el ensayo de inhibición in vitro descrito en el ejemplo 1. 10 Todos los 14 compuestos se aplican a los discos de Whatman, por duplicado, de una manera dependiente de la dosis

(0.31 a 0.0006 mg/disco). Los resultados muestran que el compuesto A proporciona el mejor control de Botrytis cinerea, con un control del 100% hasta 0.005 mg/disco. Otros compuestos, tales como el compuesto C, el compuesto D y el compuesto E conferían un control del 100% hasta 0.023, 0.04 y 0.08 mg/disco, respectivamente. Los compuestos probados se muestran en la figura 3. Los resultados de nueve compuestos se resumen en la tabla 2, donde los otros

15 cinco compuestos no muestran actividad detectada en los intervalos probados.

Tabla 2. Resultados del ensayo in vitro para el fungicida volátil en % de inhibición de Botrytis

Velocidad (mg/disco)

Comp. A Comp. C Comp. D Comp. E Comp. F Comp. G Comp. H Comp. J Comp. K

0.31

100% 100% 100% 100% 70% 100% 85% 50% 48%

0.16

100% 100% 100% 100% 53% 78% 80% 13% 29%

0.08

100% 100% 100% 100% 40% 43% 55% 8% 5%

0.04

100% 100% 100% 79% 18% 13% 38% 5% 0%

0.023

100% 100% 80% 79% 10% 3% 18% 0% 0%

0.01

100% 83% 70% 69% 8% 0% 3% 0% 0%

0.005

100% 63% 38% 38% 8% 0% 0% 0% 0%

0.0024

85% 43% 15% 28% 0% 0% 0% 0% 0%

0.001

69% 15% 0% 13% 0% 0% 0% 0% 0%

0.0006

46% 0% 0% 13% 0% 0% 0% 0% 0%

Control

0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

Ejemplo 3

El compuesto B (Figura 2; monoéster cíclico de ácido 2-(hidroximetil)fenilborónico, un análogo desfluoro del compuesto A), se evalúa de una manera similar a la descrita en los ejemplos 1 y 2 anteriores. El compuesto se aplica al papel de 20 filtro Whatman a velocidades de 0.5 mg a 0.0039 mg/disco. Los resultados muestran que el compuesto B inhibe el 100% de Botrytis cinerea a una velocidad de 0.0078 mg/disco.

Ejemplo 4

Con el fin de evaluar la actividad in vivo de los compuestos antimicrobianos volátiles, se desarrolla un bioensayo volátil usando uva de mesa verde. Los frutos se colocan individualmente en un vial de centelleo de 20 mL, con la herida del 25 vástago hacia arriba. La herida fresca del vástago se inocula con 10 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. El papel de filtro Whatman (No. de Cat. 1822-024) se coloca dentro de las tapas de los viales por duplicado. Para la determinación de la MIC, el compuesto A (Figura 1) se diluye en acetona, y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los discos de una manera dependiente de la dosis (2.5 a 0.0024 mg/disco). Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. A continuación, se tapan los viales con las tapas que contienen el fungicida y se colocan 30 durante 14 días a 4ºC. Después del almacenamiento, se evalúan los frutos para determinar la incidencia de la

imagen10

0.16

0% 25%

0.32

0% 0%

0.64

0% 0%

1.25

0% 0%

2.5

0% 0%

Ejemplo 6

Con el fin de evaluar la dosis in vivo de la actividad temporal de compuestos antimicrobianos volátiles, se desarrolla un bioensayo volátil usando fresa. Dos frutas se colocan dentro de un frasco de 240 mL, con el cáliz hacia abajo. Se 5 inocula una lesión nueva con 20 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. El papel de filtro Whatman (No. de Cat. 1822-024) se coloca dentro de las tapas de los frascos por duplicado. El compuesto A (benzoxaborol, figura 1) se diluye en acetona, y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los discos a dos velocidades 0.008 o 0.125 mg. Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. Los frascos se tapan con las tapas que contienen el fungicida, y se incuban con el fungicida volátil durante 1, 3, 6, 24 o 72 horas. Después de la incubación, las 10 tapas que contienen el disco con el compuesto A se reemplazan con nuevas tapas sin compuesto A. Todas las muestras se mantienen a 21ºC, durante 3 días, y después se retiran las tapas y se mantienen durante 48 horas adicionales, todas al 90% de humedad relativa (H.R.). Los frutos se evalúan para determinar la incidencia y severidad de la enfermedad y el aspecto de la fitotoxicidad. Los resultados se resumen en la tabla 5. Hay 100% de control de Botrytis cinerea a 0.125 mg/disco para el compuesto A, después de 6 horas de exposición, y no hay evidencia de 15 fitotoxicidad. 0.125 mg de compuesto A muestra una inhibición in vivo del 100% en comparación con el control de

acetona solamente. Un resultado de representación también se muestra en la figura 5.

Tabla 5. Incidencia (%) y severidad de Botrytis cinerea en las fresas con el tiempo

Compuesto A

Incidencia (%) Severidad (0 a 3)

Velocidad (mg/disco)

0.008 0.125 0.008 0.125

Tiempo (h)

1

100% 67% 4.0 2.3

3

0% 33% 0.0 1.3

6

33% 0% 1.0 0.0

24

67% 0% 2.3 0.0

72

33% 0% 1.0 0.0

Severidad: 0 = no hay crecimiento de hongos 1 = infección leve (<5 milímetros (mm) de diámetro) 2 = infección moderada (<1 centímetro (cm) de diámetro) 3 = alta infección (> 1 cm de diámetro) 4 = infección extrema (> media longitud de la fruta)

Ejemplo 7

5

10

15

20

25

30

Se usan placas de microtitulación de 12 pozos (7 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro de compuestos antimicrobianos volátiles. Se adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar de LB a máxima potencia. Después de enfriar, 15 L de Escherichia coli, se ajustaron a una densidad óptica de 0.02 a 0.035, y diluidos adicionalmente 1/10 se pipetean en el centro del agar y se inclinan para distribuir de manera uniforme. Los discos pequeños de filtro Whatman # 1 (No. de Cat. 1001 a 0155) se colocan, por duplicado, en la parte inferior de una película de sellado de la placa de reacción en cadena de polietileno de la polimerasa (PCR). Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC), el compuesto A (benzoxaborol; figura 1) se diluye en acetona y se adicionan 5 mg de compuesto a los discos. Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. El espacio de cabeza alrededor del inóculo de Escherichia coli se sella entonces dentro del pozo por la película con el disco adherente que contiene el fungicida. Las placas se invierten, colocadas sobre los discos tratados y selladas para evitar que cualquier producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de 3 días de almacenamiento a 4ºC, los cultivos se transfirieron a 23ºC, durante 2 días adicionales, y a continuación se evaluaron el crecimiento de colonias en relación con el control. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 6. Los resultados sugieren que el compuesto A es capaz de inhibir Escherichia coli.

Tabla 6. Resultados del ensayo in vitro para el fungicida volátil

Velocidad del compuesto A (mg por disco)

Clasificación de colonia

5.00

1

Sin tratar

3

No inoculado

0

Clasificación de colonia:

0 = No hay colonias

1 = Micro colonias no conectadas

2 = Pequeñas colonias con alguna fusión

3 = Grandes colonias que se fusionan

Ejemplo 8

Se usan placas de microtitulación de 12 pozos (6.5 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro de compuestos antimicrobianos volátiles. Se adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar de dextrosa de patata (PDA) a máxima potencia. Después del enfriamiento, se localiza con pipeta en el centro del agar 1 L de 1 X 105 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea, Penicillium expansum, Alternaria alternata, Monilinia fructicola o Glomerella cingulate. Las placas se inoculan inmediatamente antes del tratamiento con fungicida volátil. Un disco de filtro Whatman # 1 (No. de Cat. 1001-0155) se coloca, por duplicado, en la cara inferior de una película de sellado de placa de PCR de polietileno. Para la determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC), los compuestos se diluyen en acetona y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los discos de una manera dependiente de la dosis para alcanzar una concentración final en el espacio de cabeza de 1142.9 a 0.6 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. El espacio de cabeza alrededor del inóculo se sella entonces dentro del pozo por la película con el disco adherente que contiene el fungicida invirtiendo las placas sobre los discos tratados y sellando para evitar que cualquier producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de 3 días de almacenamiento a 23°C, se evalúan los cultivos para determinar el crecimiento porcentual con respecto al control basado en la medición del diámetro de la colonia de hongos. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 7. Los resultados indican que los compuestos de benzoxaborol tienen una excelente actividad in vitro contra cinco agentes patógenos fúngicos de plantas seleccionados.

Tabla 7. MIC (mg/L, concentración de espacio de cabeza) de numerosos compuestos de benzoxaborol aplicados como tratamiento volátil contra numerosos agentes patógenos fúngicos de plantas (el compuesto 10 es el mismo que el compuesto A, y el compuesto 11 es el mismo que el compuesto B).

Estructura

Comp. # MIC (mg/L)

BOTRCI

PENIEX ALTEAL MONIFC GLOMCI

6

2.2 17.9 4.5 8.9 17.9

7

2.2 17.9 8.9 8.9 71.4

8

2.2 35.7 8.9 4.5 71.4

9

2.2 8.9 8.9 8.9 35.7

10

2.2 2.2 <0.6 <0.6 <0.6

11

4.5 17.9 4.5 2.2 35.7

30

2.2 8.9 2.2 2.2 n/a

34

<0.6 2.2 2.2 n/a n/a

200

10.6 68.3 7.3 6.3 n/a

201

3.8 29.5 16.1 8.5 9.3

BOTRCI = Botrytis cinerea (moho gris) PENIEX = Penicillium expansum (moho azul de manzana) ALTEAL = Alternaria alternata (mancha marrón del tabaco) MONIFC = Monilinia fructicola (pudrición parda de la manzana) GLOMCI = Glomerella cingulata (antracnosis de pimienta)

Ejemplo 9

Se usan placas de microtitulación de 12 pozos (6.5 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro de compuestos antimicrobianos volátiles. Se adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar de dextrosa de patata 5 (PDA) a máxima potencia. Después de enfriar, se localiza con pipeta 1 mL de 1 X 105 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea y Penicillium expansum en el centro del agar. Las placas se inoculan inmediatamente antes del tratamiento con fungicida volátil. Se coloca un disco de filtro Whatman # 1 (No. de Cat. 1001-0155), por duplicado, en la cara inferior de una película de sellado de placa de PCR de polietileno. Para la determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC), los compuestos se diluyen en acetona, y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los 10 discos de una manera dependiente de la dosis para conseguir una concentración final de espacio de cabeza de 35.7 a

0.03 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. El espacio de cabeza alrededor del inóculo se sella entonces dentro del pozo por la película con el disco adherente que contiene el fungicida invirtiendo las placas sobre los discos tratados y sellando para evitar que cualquier producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de 3 días de almacenamiento a 23°C, se evalúan los cultivos para determinar el crecimiento

15 porcentual con respecto al control basado en la medición del diámetro de la colonia de hongos. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 8. Los resultados indican que numerosos compuestos de benzoxaborol tienen una excelente actividad in vitro contra dos agentes patógenos fúngicos de plantas seleccionados.

Tabla 8. MIC (mg/L) de numerosos compuestos de benzoxaborol aplicados como tratamiento volátil contra agentes patógenos fúngicos de plantas de Botrytis cinerea y Penicillium expansum.

Estructura

Comp. # MIC (mg/L)

BOTRCI

PENIEX

imagen11

21 1.1 35.7

22

4.5 35.7

38

0.6 8.9

imagen12

39 0.6 8.9

imagen13

54 0.6 4.5

55

4.5 >35.7

62

2.2 8.9

imagen14

63 1.1 17.9

imagen15

64 1.1 8.9

72

35.7 >35.7

73

35.7 >35.7

74

2.2 35.7

imagen16

86 0.6 8.9

87

0.6 8.9

105

0.6 4.5

114

17.9 >35.7

115

0.6 8.9

116

1.1 8.9

121

4.5 17.9

122

2.2 17.9

124

4.5 8.9

127

2.2 4.5

129

4.5 8.9

130

1.1 4.5

132

1.1 4.5

133

8.9 35.7

134

17.9 >35.7

135

17.9 >35.7

136

8.9 >35.7

imagen17

137 0.3 1.1

imagen18

202 35.7 142.9

imagen19

203 8.9 142.9

204

8.9 >35.7

BOTRCI = Botrytis cinerea (moho gris)

PENIEX = Penicillium expansum (moho azul de manzana)

Ejemplo 10

Se usan placas de microtitulación de 12 pozos (6.5 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro de compuestos antimicrobianos volátiles A y B (Figura 1) contra numerosos agentes patógenos fúngicos de plantas. Se 5 adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar de dextrosa de patata (PDA) a máxima potencia. Después de enfriar, 1 L de 1 X 105 suspensión de esporas por mL de Botrytis cinerea, Penicillium expansum, Alternaria alternata, Glomerella cingulata, Penicillium digitatum, Monilinia fruticola, Aspergillus brasiliensis, Colletotrichum acutatum, Fusarium sambucinum, Phytophthora capsici, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Diplodia gossypina o Diaporthe citrii se localiza con pipeta en el centro del agar. Un disco de filtro Whatman #1 (No. de Cat. 1001-0155) se coloca, por 10 duplicado, en la cara inferior de una película de sellado de placa de PCR de polietileno. Para la determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC), los compuestos de ensayo se diluyen en acetona, y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los discos de una manera dependiente de la dosis para alcanzar una concentración final de espacio de cabeza de 35.7 a 0.03 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante cinco minutos. El espacio de cabeza alrededor del inóculo se sella entonces dentro del pozo por la película con el disco adherente que contiene el fungicida

15 invirtiendo las placas sobre los discos tratados y sellando para evitar que cualquier producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de 3 días de almacenamiento a 23°C, los cultivos se evalúan para el crecimiento porcentual con respecto al control. Los resultados mostrados en la tabla 9 demuestran la capacidad de los compuestos de benzoxaborol A y B para controlar el crecimiento de numerosos agentes patógenos fúngicos de las plantas a través de la actividad volátil.

Tabla 9 MIC (mg/L) de los compuestos A y B aplicados como volátiles contra numerosos agentes patógenos fúngicos de las plantas

Patógenos

Compuesto A Compuesto B

MIC

MIC

B. cinerea

2.2 4.5

P. expansum

1.1 8.9

M. fruticola

2.2 1.1

A. alternata

2.2 2.2

G. cingulata

17.9 35.7

P. digitatum

2.2 4.5

A. brasiliensis

2.2 0.6

C. acutatum

4.4 8.9

F. sambucinum

1.1 4.5

P. capsici

1.1 n/a

G. candidum

8.9 8.9

A. niger

2.2 1.1

M. piriformis

1.1 2.2

D. gossypina

1.1 4.5

D. citrii

2.2 17.9

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 11

Se usan placas de microtitulación de 12 pozos (6.5 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro del compuesto A volátil antimicrobiano (figura 1) contra numerosos agentes patógenos bacterianos. Se adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar nutriente y se deja secar antes de introducir el agente patógeno. Las suspensiones de células de Escherichia coli, Pectobacterium carotovorum, Xanthomonas axonopodis y Salmonella enterica se ajustan a una densidad óptica de 0.2 a 0.35 y se diluyen adicionalmente 1/10, y se pipetean 15 L en el centro de cada pozo y se inclinan para distribuir uniformemente. Un papel de filtro Whatman # 1 (CAT 1001-0155) se coloca en la parte inferior de una película de sellado de placa de PCR de polietileno. Para la determinación de la concentración bactericida mínima (MBC), el compuesto A se diluye en acetona, y se aplican 50 L a los discos, por duplicado, de una manera dependiente de la dosis para alcanzar una concentración final en el espacio de cabeza de 71.4 a 0.03 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante 5 minutos. A continuación, las películas con los discos tratados se aplican sobre las placas inoculadas y se sellan. Las placas se invierten, y se incuban a 23°C, durante 48 horas. Después del período de incubación, las colonias de bacterias se desalojan en agua estéril que contiene tween 80 (0.001%) y se determina la densidad óptica (OD, 600 nm). Los resultados se resumen en la tabla 10, donde se indica la concentración de espacio de cabeza necesaria para controlar al menos el 80% del crecimiento bacteriano. El compuesto A muestra una buena actividad antimicrobiana frente a numerosas bacterias en este ensayo in vitro.

Tabla 10. Velocidad (mg/L) del compuesto A que ofrece al menos un 80% de control contra agentes patógenos bacterianos

E coli

P. carotovorum X. axonopodis S. enterica

35.7

2.2 4.5 17.9

Ejemplo 12

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano, se desarrolla un bioensayo volátil para evaluar el control de Escherichia coli y Salmonella enterica en carne de vacuno fresca. La carne de vacuno se lava para eliminar cualquier inóculo natural enjuagando en agua tibia durante 2 minutos. Dos tiras, de una sola capa, se colocan en un contenedor hermético SnapWare estéril de 10.8 tazas (Modelo # 109842).

Tabla 11. Unidad formadora de colonias (CFU/mL) y reducciones logarítmicas de E. coli y S. enterica de carne de vacuno después de un tratamiento volátil con el compuesto A.

Patógenos

Tratamientos Log CFU/mL Log reducción

E. coli

Control 8.27 3.17

Compuesto A

5.09

S. enterica

Control 7.38 2.43

Compuesto A

4.95

Cada tira se inocula en la superficie colocando 20 L de ya sea suspensiones de células de E. coli o S. enterica que se ajustan a una densidad óptica de 0.35 (600 nm) y se diluyen adicionalmente 1/10. Para la determinación de la eficacia, el polvo del compuesto A se introduce en el contenedor con un dispositivo de sublimación (tubo de cobre calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 litros por minuto (L/min)) a una velocidad requerida para conseguir una concentración final de espacio de cabeza de 100 mg/L. Los contenedores y sus contenidos se incuban después durante 2 días a 21°C. Después del tratamiento, se lava la carne de vacuno, se recoge el lavado, se diluye en serie, se siembra en placas sobre agar nutriente y después se incuba durante 24 horas adicionales a 37ºC. Las colonias bacterianas se cuentan y se expresan como unidades formadoras de colonias (CFU/mL), con la reducción logarítmica calculada en relación con el control. Los resultados enumerados en la tabla 11 muestran una buena actividad antimicrobiana del compuesto A frente a E. coli y S. enterica en este ensayo in vivo usando carne vacuna. El compuesto A demuestra una reducción logarítmica de 3.17 log (> 99.9%) de E. coli y una reducción de 2 log para S. enterica.

Ejemplo 13

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano en el control de Botrytis cinerea en flores ornamentales, se desarrolla un bioensayo volátil usando claveles blancos.

Tabla 12. Incidencia de Botrytis cinerea en claveles tratados con el compuesto A

Compuesto A

Incidencia de enfermedad (%) en pétalos

Velocidad (mg/L)

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 8

1

0 0 0 4 16

0.2

0 8 20 16 36

0.04

0 0 16 40 92

Control

0 68 92 96 100

Se colocan cinco claveles en un frasco de 800 mL que contiene 200 mL de un conservante de flores comercial común. Cinco frascos se colocan entonces en una caja de almacenamiento Rubbermaid de 117 L (Cat # 2244). Los pétalos se inoculan uniformemente con pulverización con 5 mL de 1x105 esporas/mL de suspensión de Botrytis cinerea. El envase 5 está bien cerrado. Para la aplicación del tratamiento, el compuesto A se disuelve en una solución acuosa de 1,2propilenglicol (3:1) y 5 mL de la solución se volatiliza en el contenedor usando un sistema ES-100-H SmartFog (Reno, NV) a través de un puerto lateral ½" que se sella inmediatamente después de la aplicación. Las flores se incuban durante 3 días a 21°C. Después del almacenamiento, las flores se evalúan para la incidencia basada en la presencia de la enfermedad en pétalos de flores en relación con las flores control no tratadas de hasta 8 días a 21°C, y los resultados

10 se resumen en la tabla 12. El compuesto A a 1 mg/L muestra una incidencia del 0% 2 días después de la eliminación del tratamiento y sólo una incidencia del 16% después de 8 días, y demuestra generalmente una buena actividad antimicrobiana volátil contra Botrytis cinerea en este análisis in vivo de la infección en una flor ornamental.

Ejemplo 14

Una prueba similar a la descrita anteriormente se realiza también sobre claveles blancos (tratados con o sin el tiosulfato

15 de plata comercial compuesto anti-etileno, STS) con inóculo natural. El compuesto A se disuelve ya sea en una solución acuosa de 1,2-propilenglicol (3:1) y 5 mL de la solución se volatilizan usando un sistema ES-100-H SmartFog (Reno, NV) a través de un puerto lateral ½" se sella inmediatamente después de la aplicación, o se disolvió en acetona y se aplicó a un disco de filtro Whatman #1 de 42.5 milímetros (mm) (No. de Cat. 1001-042), y se colocó en un vidrio de reloj después de dejar que la acetona se evaporara durante 5 minutos. Las flores se incuban durante 3 días a 21°C. Después

20 del almacenamiento, las flores se evalúan por un adicional de 8 días para la severidad de la enfermedad basada en el número de lesiones presentes en pétalos y sépalos de flores. Los resultados enumerados en la tabla 13 muestran una buena actividad antimicrobiana contra Botrytis cinerea en este análisis in vivo.

Tabla 13. Severidad de Botrytis cinerea después de 8 días de vida útil, basándose en el número de lesiones en pétalos y sépalos después de una niebla activa o tratamiento volátil pasivo con el compuesto A.

Severidad (número promedio de lesiones)

Compuesto A

Sin STS STS

Parte de la planta

Velocidad (mg/L) Niebla Volátil Niebla Volátil

Pétalos

1 0 1.5 0 0.1

0.2

0 1.8 0 0.1

0.04

0.4 3.1 0.3 0.5

0

2.1 18.8 7.7 43.2

Sépalos

1 0.04 1 0.04 0.2

0.2

0.04 1.6 0.1 0.3

0.04

0.3 2.1 0.6 1.1

0

4.5 4.8 6.8 3.6

Ejemplo 15

Una prueba similar a la descrita anteriormente también se realiza sobre rosas blancas con inóculo natural. Se colocan cinco rosas blancas en un frasco de 800 mL que contiene 200 mL de un conservante comercial común de flores.

Tabla 14. Incidencia y severidad de Botrytis cinerea basada en la infección en pétalos y sépalos de rosas blancas después de un tratamiento volátil de tres días del compuesto A a 21°C y dos días adicionales a 21°C.

Compuesto A

Aplicado mediante sublimación Volatilizado de filtro Whatman

Velocidad (mg/L)

Incidencia (%) Severidad (0-4) * Incidencia (%) Severidad (0-4) *

1

0 0 53.3 1.6

0.2

13.3 0.5 66.7 1.8

0.04

46.7 1.7 46.7 1.1

Control-Acetona

80 2.9 86.7 2.4

Control

100 3.1 100 3.1

* Grado de severidad

0 = Sin enfermedad

1 = Ennegrecimiento y pequeñas lesiones en los sépalos o pétalos

2 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos

3 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos, algunas gotas de pétalos 4 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos, algunas flores abortadas

5

Después se colocan tres frascos en una caja de almacenamiento Rubbermaid de 117 L (No. de Cat. 2244). Se colocan

dos pequeños ventiladores en los extremos opuestos del contenedor para ayudar con la distribución volátil del

compuesto A. El envase se cierra herméticamente y luego se diluye el compuesto A en acetona y luego se pipetea

sobre una tira de algodón de 1.5 pulgadas x 1 pulgada. La acetona se deja evaporar durante cinco minutos. El 10 compuesto A se introduce entonces en los contenedores mediante un dispositivo de sublimación (tubo de cobre

calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 L/min) para conseguir una concentración final de espacio de cabeza de

0.04, 0.2, 1 mg/L, a través de un puerto lateral ½" que se sella inmediatamente después de la aplicación.

Alternativamente, se pipetea el compuesto A en un disco de filtro Whatman # 1 de 42.5 mm (Núm. Cat. 1001-042),

soportado por un cristal de reloj, donde la acetona se deja evaporar durante cinco minutos antes de sellar el contenedor.15 Las flores se incuban durante tres días a 21°C. Después del tratamiento, las flores se evalúan durante dos días

adicionales para la incidencia y la severidad de la enfermedad de los pétalos de las flores. La aplicación de un

tratamiento a 1 mg/L a través de los resultados de sublimación en la incidencia del 0%. Los pétalos de rosa después del

tratamiento con el compuesto A no tienen incidencia de enfermedad, retención de color blanco, y las rosas no tuvieron

gota de pétalo. Los resultados enumerados en la tabla 14 muestran una buena actividad antimicrobiana contra la 20 infección de Botrytis cinerea de rosas blancas, y que la mejora de la velocidad de volatilización por sublimación resultó

en un mayor control de la enfermedad.

Ejemplo 16

Para probar el efecto del compuesto A (Figura 1) en vegetales, se obtuvieron patatas, cebollas y calabazas a partir de

un almacén local, y la superficie se esterilizó con hipoclorito de sodio al 0.825% (NaOCl). Se colocó una rodaja de papa25 o dos hojas de cebolla en una placa de Petri estéril, al mismo tiempo la calabaza entera se colocó en un contenedor

hermético SnapWare estéril de 10.8 tazas (Modelo # 109842). Cada rodaja de patata se inoculó con 20 L de una

suspensión de 1x105 esporas/mL de Fusarium sambucinum, mientras que las cebollas se inocularon con 20 L de una

suspensión de 1x106 esporas/mL de Botrytis cinerea. Para la inoculación de la calabaza, se retiró un núcleo pequeño y

se insertó un tapón micelial de Phytophthora capsici y se tapó con el núcleo. El compuesto A se diluyó en acetona y se 30 adicionó a un disco de filtro Whatman # 1 de 42.5 mm (No. de Cat. 1001-042) unido al lado interno de la tapa a una

imagen20

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano en la fruta, se desarrolla un bioensayo volátil usando fresa, uva y arándano. Ocho fresas, 16 uvas o 30 arándanos (por repetición) se colocan en una caja en forma de concha de PET de tamaño comercialmente relevante, con el extremo del tallo hacia arriba para los arándanos y las uvas, y hacia abajo para las fresas. Una lesión nueva se inocula con 20 L (fresa y uva) o 10 L (arándano) de 1 X5 106 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. Las cajas en forma de concha se colocan dentro de un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842). Se coloca un disco de filtro Whatman # 1 de 42.5 mm (No. de Cat. 1001-042) sobre un cristal de reloj. El compuesto A se disuelve en acetona y se adiciona a los discos de una manera dependiente de la dosis para producir una concentración de espacio de cabeza final de 0.4, 2 o 10 mg/L. Se deja evaporar la acetona durante cinco minutos. Los contenedores se cierran entonces con tapas y se colocan

10 durante tres días a 21°C. Después del almacenamiento, se evalúan los frutos para determinar la incidencia y severidad (0 a 4) de la enfermedad durante otros tres días a 21ºC, y los resultados se resumen en la tabla 17. Los resultados demuestran un buen control antimicrobiano volátil in vivo de Botrytis cinerea con aproximadamente 50% de incidencia y severidad dramáticamente más baja para la fresa, la uva y el arándano después de tres días de vida útil.

Tabla 17. Efecto de un tratamiento volátil de tres días del compuesto A (0.4, 2 o 10 mg/L) en el control de la incidencia y severidad de la infección por B. cinerea de fresa, uva y arándano durante un periodo de evaluación de tres días después del tratamiento en 21°C.

Fresa

Uva Arándano

Compuesto A

Evaluación Incidencia Severidad Incidencia Severidad Incidencia Severidad

Velocidad (mg/L)

Días (%) (0-4) (%) (0-4) (%) (0-4)

10

0 7.1 0 0 0 12.9 0.1

2

0 14.3 0.1 0 0 9.7 0

0.4

0 0 0 3.1 0 21 0.1

Control

0 50 0.4 100 2.3 95.2 1.2

10

1 35.7 0.2 0 0 12.9 0.1

2

1 50 0.3 0 0 9.7 0

0.4

1 21.4 0.1 3.1 0 21 0.2

Control

1 100 1 100 2.5 100 1.7

10

2 42.9 0.5 3.1 0 12.9 0.2

2

2

50 0.3 0 0 9.7 0.1

0.4

2 21.4 0.1 15.6 0.2 40.3 0.5

Control

2 100 2.2 100 2.7 100 1.9

10

3 42.9 0.8 56.3 0.4 41.9 0.6

2

3 64.3 0.5 56.3 0.3 40.3 0.6

0.4

3 28.6 0.5 62.5 0.5 62.9 1

Control

3 100 2.7 100 3.8 100 2.1

*Severidad 0 = no hay crecimiento de hongos

25

5

10

15

20

25

1 = infección leve (sólo visible dentro de la lesión con microscopio)

2 = infección moderada (crecimiento visible en el punto de inoculación)

3 = infección alta (cono de 1 cm de diámetro de Botrytis)

4 = infección extrema (> media longitud de la fruta)

Ejemplo 19

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano en la fruta, se desarrolla un bioensayo volátil usando fruta de naranja. Dos naranjas se colocan dentro de una caja en forma de concha de PET. Se inoculan tres lesiones nuevas por naranja con 30 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Penicillium digitatum. Las cajas en forma de concha se colocan dentro de un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842). Se coloca un disco de filtro Whatman # 1 de 42.5 mm (No. de Cat. 1001-042) sobre un cristal de reloj. El compuesto A se disuelve en acetona y se adiciona a los discos de una manera dependiente de la dosis para producir una concentración de espacio de cabeza final de 2, 10 o 50 mg/L. Se deja evaporar la acetona durante cinco minutos. Los contenedores se cierran entonces con las tapas y se colocan durante tres días a 21°C. Después del almacenamiento, se evalúan los frutos para determinar la incidencia de la enfermedad (mm de diámetro de la Pudrición) y la esporulación del agente patógeno (mm de diámetro) en la superficie de los frutos durante dos días adicionales a 21°C, con los resultados resumidos en la tabla 18. Los resultados demuestran buen control volátil antimicrobiano in vivo de P. digitatum en naranjas inoculadas, especialmente a velocidades superiores a 10 mg/L.

Tabla 18. Incidencia y severidad de Penicillium digitatum sobre las naranjas, tal como está representado por la lesión empapado en agua y las esporas de hongos en la superficie de los frutos

Compuesto A

Lesiones empapadas en agua (mm) Esporulación (mm)

Velocidad (mg/L)

Día 0 Día 1 Día 2 Día 0 Día 1 Día 2

50

0 0 5 0 0 1.2

10

0 0 9 0.5 0.4 2.5

2

0 0 13.4 0 0.4 2.7

Control

17.8 31.2 52.4 5 15.1 35.6

Ejemplo 20

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano en la fruta, se desarrolla un bioensayo volátil usando manzana. Dos manzanas se colocan dentro de una caja en forma de concha de PET. Se inoculan tres lesiones nuevas por manzana con 30 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Penicillium expansum. Las cajas en forma de concha se colocan dentro de un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842). Se coloca un disco de filtro Whatman # 1 de 42.5 mm (No. de Cat. 1001-042) sobre un cristal de reloj. El compuesto A se disuelve en acetona y se adiciona a los discos de una manera que produzca una concentración final en el espacio de cabeza de 50 mg/L. Se deja evaporar la acetona durante cinco minutos. Los contenedores se cierran entonces con las tapas y se colocan durante tres días a 21°C. Después del almacenamiento, se evalúan los frutos para determinar la incidencia de la enfermedad (mm de diámetro de la Pudrición) y la esporulación del agente patógeno (mm de diámetro) en la superficie de los frutos durante otros tres días a 21°C, con los resultados resumidos en la tabla 19. Los resultados demostraron control volátil antimicrobiano in vivo del 100% del moho P. expansum de manzana hasta 3 días después del tratamiento.

Tabla 19. Incidencia y severidad de Penicillium expansum sobre las manzanas como se muestra por una pudrición parda y las esporas de hongos en la superficie de los frutos

Compuesto A

Pudrición (mm) Esporulación (mm)

Velocidad (mg/L)

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3

5

10

15

20

25

30

50

0 0 0 0 0 0 0 0

Control

15.9 20.1 25.7 30 3.5 3.9 3.9 6.5

Ejemplo 21

Con el fin de evaluar la actividad in vivo del compuesto volátil antimicrobiano B en la fruta, se desarrolla un bioensayo volátil usando naranja. Dos naranjas por réplica se colocan dentro de una caja en forma de concha. Se inoculan tres lesiones nuevas por naranja con 30 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Penicillium digitatum. Las cajas en forma de concha se colocan dentro de un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842). El polvo del compuesto B se introduce en los contenedores mediante un dispositivo de sublimación (tubo de cobre calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 L/min) para conseguir una concentración final de espacio de cabeza de 0.4, 2, 10 o 50 mg/L. Los contenedores se cierran entonces con las tapas y se colocan durante tres días a 21°C. Después del almacenamiento, se evalúan los frutos para determinar la incidencia de la enfermedad (mm de diámetro de la Pudrición) y la esporulación del agente patógeno (mm de diámetro) en la superficie de los frutos durante otros tres días a 21°C, con los resultados resumidos en la tabla 20. Los resultados demostraron buena inhibición volátil in vivo de

P. digitatum en naranja a velocidades de 0.4 mg/L e inhibición completa a 10 mg/L.

Tabla 20. Incidencia y severidad de Penicillium digitatum sobre naranjas, como se muestra por lesión empapada en agua y esporas de hongos en la superficie de los frutos después de un tratamiento con el compuesto B.

Compuesto B

Pudrición (mm) Esporulación (mm)

Velocidad (mg/L)

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3

50

0 0 0 0 0 0 0 0

10

0 0 0 0.8 0 0 0 0

2

0.5 7.8 30.7 42.6 0 0.3 2.8 5.7

0.4

5.7 29.4 49.3 63.4 0.7 1.4 8.1 27.2

Control

12.3 35.5 61.1 83.2 0.3 2.7 8.5 44.5

Ejemplo 22

Para evaluar la actividad in vivo del compuesto A volátil antimicrobiano (Figura 1) en fruta, se desarrolla un bioensayo volátil usando manzana, pera, naranja, fresa, uva y arándano. Dos manzanas, 2 naranjas, 2 peras, 8 fresas, 16 uvas o 30 arándanos para repetición, por duplicado) se colocan en una caja en forma de concha con el extremo del tallo hacia arriba para todas las frutas, excepto la fresa (extremo del tallo hacia abajo). Se inocula una lesión nueva con 20 L 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Penicillium expansum (manzana y pera), 20 L 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Penicillium digitatum (naranja) y 20 L (fresa y uva) o 10 L (arándano) de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. Las cajas en forma de concha se colocan dentro de una caja de almacenamiento Rubbermaid de 117 L (Cat # 2244) con tapas cerradas. El compuesto A, disuelto en acetona, se pipetea sobre una tira de algodón, donde la acetona se deja evaporar durante cinco minutos, y luego se introduce en el contenedor por un dispositivo de sublimación (tubo de cobre calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 L/min) para lograr una concentración de espacio de cabeza final de 10 mg/L. Los contenedores se mantienen entonces durante tres días a 21 °C. Después del tratamiento, los frutos se mantienen durante tres días adicionales a 21°C, luego se evalúan la incidencia de la enfermedad (mm de diámetro de ennegrecimiento o lesiones de empapado en agua) y la esporulación del agente patógeno (mm de diámetro) para manzana, pera y naranja, así como la incidencia (%) y la severidad (0 a 4) de la enfermedad de Botrytis cinérea para la fresa, la uva y el arándano, con los resultados resumidos en la tabla 21. Los resultados demostraron un buen control antimicrobiano in vivo de al menos tres agentes patógenos fúngicos en al menos seis huéspedes diferentes cuando se aplican como un fungicida volátil.

Tabla 21: Efectos de la sublimación del compuesto A según se refleja en la incidencia y severidad de B. cinerea en la fresa, la uva y el arándano, y la severidad en naranjas, manzanas y peras como se muestra en las lesiones empapadas en agua, ennegrecimiento y esporulación después de un tratamiento de tres días más tres días adicionales a 21°C.

Tratamiento

Incidencia (%) Severidad (0-4)

(10 mg/L)

Fresa Arándano Uva Fresa Arándano Uva

Compuesto A

18.8 5 26.7 0.09 0.03 0.1

Control

100 100 80 3.6 2.2 0.9

Lesiones empapadas

en Ennegrecimiento (mm) Esporulación (mm)

agua

Naranja

Manzana Pera Naranja Manzana Pera

Compuesto A

3.04 5.4 2.7 0 8.55 0

Control

50.5 11.5 23.3 4.8 33.2 15.5

Ejemplo 23

Para comparar la capacidad del compuesto A cuando se volatiliza activamente mediante diferentes mecanismos, se realiza un ensayo in vivo usando fresa. Ocho fresas se colocan en una caja en forma de concha con el extremo del tallo 5 hacia abajo. Se inocula una lesión nueva con 20 L de 1 X 105 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. La caja en forma de concha se coloca en un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842) y se cierra con las tapas. El compuesto A se disuelve en acetona y se volatiliza a través de un puerto lateral de ½ pulgada sellable mediante un sistema SmartFog ES-100-H (Reno, NV). Alternativamente, se pipetea el compuesto A, disuelto en acetona, sobre una tira de algodón, donde la acetona se deja evaporar durante cinco minutos, y luego se introduce en el 10 contenedor por un dispositivo de sublimación (tubo de cobre calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 L/min) para lograr una concentración final en el espacio de cabeza de 10 mg/L. Los frutos se almacenan durante tres días a 21°C. Después de los tres días de tratamiento, los frutos se almacenan durante tres días adicionales a 21°C, y luego se evalúan la incidencia (%) y la severidad de la enfermedad (0 a 4). Los resultados se resumen en la tabla 22 y demuestran una buena actividad antimicrobiana contra Botrytis cinerea en este análisis in vivo, lo que indica que el

15 compuesto A es un antimicrobiano volátil eficaz.

Tabla 22. Efectos de diferentes métodos de aplicación volátil del compuesto A según se refleja por la incidencia y severidad de Botrytis cinerea en fresa después de un tratamiento de tres días más tres días adicionales a 21ºC.

Tratamientos

Incidencia (%) Severidad (0 a 4)

Niebla, 10 mg/L del compuesto A

6.3 0.03

Niebla, control

62.5 1.6

Sublimación, 10 mg/L del compuesto A

0.0 0.0

Sublimación, control

100.0 3.7

Ejemplo 24

Se usa un ensayo in vivo para evaluar la capacidad del compuesto A de volatilizarse a partir de diferentes materiales y controlar agentes patógenos fúngicos. Ocho fresas se colocan en una caja en forma de concha con el extremo del tallo20 hacia abajo. Se inocula una lesión nueva con 20 L de 1 X 106 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. Las cajas en forma de concha se colocan luego en un contenedor hermético SnapWare de 10.8 tazas (Modelo # 109842). El compuesto A se disuelve en acetona y después se pulveriza uniformemente sobre papel de celulosa y tejido Tyvek® a una velocidad de 200 miligramos por metro cuadrado (mg/m2). Se deja evaporar la acetona. Igualmente, el compuesto A se disuelve en propilenglicol y se pulveriza uniformemente sobre papel de celulosa y tejido Tyvek®. No se

25 intenta evaporar en este caso.

Tabla 23. Efectos de diferentes películas y posterior liberación del compuesto A sobre la incidencia y severidad de

imagen21

0.4

Papel de filtro 56.3 2.5

Control

Papel de filtro 100 2.5

Ejemplo 26

Se utiliza un ensayo in vitro para evaluar la capacidad del compuesto A (Figura 1) de volatilizarse a partir de diferentes materiales y controlar el crecimiento de hongos.

Tabla 25. Efectos de diferentes materiales sobre la liberación volátil del compuesto A y la posterior inhibición in vitro (MIC) de Botrytis cinerea.

Material

MIC (mg/L)

Polietileno

0.28

Fibra de vidrio revestida con PTFE

0.56

Fibra de vidrio

0.56

Celulosa

0.56

Sílica

0.56

Aramida y fibra de vidrio

0.56

Poliéster recubierto de vinilo

0.56

Fibra de vidrio recubierta con acrílico

0.56

Fibra de vidrio recubierta de silicona

0.56

PTFE

1.1

Cartón

2.2

Aramida

2.2

5

Recubierto de PTFE (8577K81), fibra de vidrio (8816k1), sílica (8799K3), aramida y fibra de vidrio (8821K4), poliéster recubierto de vinilo (8843K31), fibra de vidrio recubierta con acrílico (8838K2), fibra de vidrio recubierta de silicona (87815K1), aramida (McMaster-Carr, Santa Fe Springs, CA-1206T1), película de sellado de PCR de polietileno, celulosa (Whatman # 1, Cat No. 1001-0155), y cartón se cortan en discos de 15 mm de diámetro. Se usan placas de 10 microtitulación de 12 pozos (6.5 mL de volumen por pozo) para el ensayo de inhibición in vitro de los compuestos antimicrobianos volátiles. Se adiciona a cada pozo un volumen de 3 mL de agar de dextrosa de patata (PDA) a máxima potencia. Después de enfriar, se localiza con pipeta en el centro del agar 1 L de 1 X 105 por mL de suspensión de esporas de Botrytis cinerea. Las placas se inoculan inmediatamente antes del tratamiento con fungicida volátil. Los diversos materiales se colocan, por duplicado, en la cara inferior de una película de sellado de placa de PCR de 15 polietileno. Para la determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC), los compuestos se diluyen en acetona, y la cantidad apropiada de compuesto se adiciona a los materiales de una manera dependiente de la dosis para conseguir una concentración final de espacio de cabeza de 35.7 a 0.03 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante cinco minutos. El espacio de cabeza alrededor del inóculo de Botrytis cinerea se sella entonces dentro del pozo por la película con el disco adherente de material que contiene el fungicida. Las placas se invierten, colocadas sobre los discos tratados y

20 selladas para evitar que cualquier producto químico se desprenda del disco y caiga sobre el agar inoculado. Después de tres días de almacenamiento a 23°C, los cultivos se evalúan para el crecimiento porcentual con respecto al control basado en la medición del diámetro de la colonia de hongos. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 25. Los resultados indican que el compuesto A se puede volatizar a partir de numerosos materiales para inhibir el crecimiento in vitro de Botrytis cinerea con niveles similares de control.

25 Ejemplo 27

Se usa un ensayo in vivo para evaluar la capacidad del compuesto A para controlar el crecimiento de hongos de las semillas.

Tabla 26. Efecto de un tratamiento de espacio de cabeza de 10 mg/L del compuesto A en el control del crecimiento de Aspergillus brasiliensis en granos.

Granos

Crecimiento fúngico en PDA (mm)

Compuesto A

Control-Acetona Control-No Acetona

Cebada

0 12.8 21.7

Maíz seco

0 10.1 22.8

Mijo

0 7.2 19.1

Arroz

0 7.5 21.6

Centeno

0 8.4 21

Trigo

0 8.1 22.4

5 Los granos que constan de maíz, trigo, arroz, centeno, mijo y cebada se esterilizan la superficie con 0.825% de NaOCl durante 1 minuto y se aclaró tres veces con agua destilada estéril. Los granos se inoculan remojándolos en una suspensión de 1 X 106 esporas/mL de Aspergillus brasiliensis durante 1 minuto. El exceso de inóculo se borra con una toalla de papel estéril antes de depositar cinco semillas en una placa de Petri que contiene 25 mL de PDA. Para la determinación de la eficacia, el compuesto A se diluye en acetona y se adiciona a discos de filtro Whatman # 1 de 42.5

10 mm (No. de Cat. 1001-042) unido al lado interior de la tapa de una manera dependiente de la dosis para conseguir una concentración final del espacio de cabeza 0.4, 2 o 10 mg/L. Se deja evaporar la acetona, durante cinco minutos antes de cerrar la placa y sellarla con parafilm. Las placas se incuban a 23°C, durante tres días. Después del almacenamiento, los granos se evalúan para el diámetro del micelio colonia (mm), con los resultados resumidos en la tabla 26. Los resultados demostraron el control del 100% de Aspergillus brasiliensis en este análisis in vivo.

15 Ejemplo 28

Para evaluar un tratamiento de combinación del compuesto A con 1-metilciclopropeno (1-MCP), se realiza un experimento in vivo sobre rosas blancas.

Tabla 27: Incidencia y severidad de Botrytis cinerea basada en la infección en pétalos y sépalos de rosas blancas después de un tratamiento de 24 horas con 1-MCP seguido de un tratamiento volátil de tres días del compuesto A a 21ºC y cinco días adicionales a 21ºC.

Tratamientos Incidencia (%) Severidad * (0-4)

Control 66.7 2.0 1-MCP 33.3 0.4 0.008 mg/L 20.0 0.2 0.04 mg/L 20.0 0.03 0.2 mg/L 0.0 0.0 0.008 mg/L+1-MCP 6.7 0.9 0.04 mg/L+1-MCP 0.0 0.0 0.2 mg/L+1-MCP 0.0 0.0

* Grado de severidad

0 = Sin enfermedad

1 = Ennegrecimiento y pequeñas lesiones en los sépalos o pétalos

2 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos

3 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos, algunas gotas de pétalos

4 = Ennegrecimiento, pétalos cubiertos con esporas de hongos, algunas flores abortadas

Se colocan cinco rosas blancas en un frasco de 800 mL que contiene 200 mL de un conservante de flores comercial común. Tres frascos se colocan entonces en una caja de almacenamiento Rubbermaid de 117 L (Cat # 2244). Se colocan dos pequeños ventiladores en extremos opuestos del contenedor para ayudar con la distribución de los dos volátiles. Se aplica un tratamiento con 1-MCP de 500 partes por billón (ppb) de volumen por volumen (v/v) (AgroFresh, 5 Springhouse, PA), durante 24 horas a 21°C. Después de terminar el tratamiento con 1-MCP, se ventilan los contenedores y se aplica polvo de Compuesto A de una manera dependiente de la dosis para alcanzar una concentración final de espacio de cabeza de 0.2, 0.04 o 0.008 mg/L con un dispositivo de sublimación (tubo de cobre calentado a 200°C con flujo de ventilador a 0.5 L/min), con el extremo del tubo penetrando a través de un puerto lateral de ½ pulgadas en el contenedor que se sella inmediatamente después de la aplicación. Las flores se incuban durante

10 tres días a 21°C. Después del tratamiento, las flores se evalúan durante siete días adicionales a 21°C para la incidencia y la severidad de la enfermedad de los pétalos de las flores. Los resultados enumerados en la tabla 27 muestran una buena actividad antimicrobiana contra la infección por Botrytis cinerea de rosas blancas y que el aumento de la velocidad de volatilización a través de la sublimación resultó en un mayor control de la enfermedad. También el tratamiento con 1-MCP muestra gota reducida de pétalos como se refleja en las puntuaciones de severidad.

15 Ejemplo 29

Para evaluar un tratamiento de combinación del compuesto A con 1-metilciclopropeno (1-MCP), se realiza un experimento in vivo sobre brócoli.

Tabla 28. Efectos del compuesto A y 1-MCP en el control de la pudrición de Alternaria y el amarillamiento del brócoli, respectivamente, cinco o tres días de tratamiento a 10 o 21ºC con dos días adicionales a 21ºC

Tratamientos (mg/L)

21°C 11°C

Severidad

Puntuación de color * Severidad Puntuación de color *

Control

1.5 2.39 0.18 1.55

1-MCP

0.61 1.79 0.18 1.50

0.4 mg/L

0.29 1.32 0.00 1.75

2 mg/L

0.07 1.89 0.00 2.11

0.4 mg/L+1-MCP

0.21 0.93 0.00 1.39

2 mg/L+1-MCP

0.07 1.93 0.00 2.23

Puntuación de calificación del color 0 = brócoli de aspecto regular, verde 1 = Pocos puntos verdes claros 2 = Manchas verdes y amarillas claras 3 = Verde claro, amarillo y algo marrón

32

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2