ES2637032B1 - Composición para promover la recuperación cardiaca tras un infarto de miocardio (IM) - Google Patents
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Abstract
Composición para promover la recuperación cardiaca tras un infarto de miocardio (im).#La presente invención ofrece una solución a la falta de compuestos capaces de evitar de manera eficiente el deterioro del músculo cardiaco tras un IM, y de mejorar el pronóstico a largo plazo de pacientes que han sufrido un IM. La presente invención reivindica compuestos capaces de inhibir la expresión del factor de transcripción Yy1 en células cardiacas, reduciendo así la expresión del gen ST2s y permitiendo la activación de la cadena de señalización cardioprotectora IL33/ST2L. La presente invención también describe un método de cribado que permite identificar compuestos capaces de mejorar el pronóstico a largo plazo de pacientes que han sufrido un IM. Este método se basa en identificar los compuestos capaces de inhibir la expresión de Yy1 y/o de activar la cadena de señalización cardioprotectora IL33/ST2L en células cardiacas.
Description
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DESCRIPCIÓN
COMPOSICIÓN PARA PROMOVER LA RECUPERACIÓN CARDIACA TRAS UN INFARTO DE MIOCARDIO
ÍÍML
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de compuestos, y métodos para identificar compuestos, capaces de mejorar la recuperación cardiaca de pacientes que han sufrido un Infarto de Miocardio (IM).
Antecedentes de la invención v estado de la técnica
Las enfermedades cardiovasculares provocan más muertes que cualquier otra condición en Occidente, y el IM es todavía un problema sanitario de primer rango. Lo provoca el bloqueo repentino del suministro coronario de sangre, lo que lleva a la irreversible muerte de cardiomiocitos. A pesar de que los niveles de supervivencia de los pacientes que han sufrido IM han aumentado en los líltimos años, el pronóstico a largo plazo aún es malo debido a los efectos estructurales y funcionales provocados por la necrosis de los cardiomiocitos. Tras el IM, se ponen en marcha una serie de mecanismos de reparación local en el tejido infartado, fundamentalmente inflamación y fibrosis, que conllevan un riesgo de arritmia ventricular y de deterioro de la función miocárdica sistólica y diastólica. Es por ello que el IM conlleva un elevado riesgo de muerte y evolución a la insuficiencia cardiaca.
El tratamiento de los pacientes que han sufrido un IM depende del tamaño del infarto, pero a grandes rasgos suele basarse en los siguientes tipos de fármacos:
- Acido acetilsalicílico, heparina, clopidogrel, prasugrel o ticagrelor para inhibir la agregación plaquetaria.
- Betabloqueantes para inhibir el efecto estimulante de la adrenalina en el corazón, regulando así el ritmo cardiaco, disminuyendo así la necesidad de oxígeno por parte del músculo cardíaco.
- Medicamentos reductores del colesterol (estatinas).
- Fármacos para bloquear los efectos nocivos de la angiotensina y la aldosterona (inhibidores ECA o antagonistas de los receptores de la angiotensina ARA II, y antagonistas del receptor mineralocorticoide de la aldosterona).
Estos tratamientos están enfocados principalmente a evitar el riesgo de sufrir un nuevo infarto, y a evitar la aparición de complicaciones, arritmias ventriculares e insuficiencia cardiaca. Sin embargo, tal y como se menciona más arriba, hoy en día el pronóstico a largo plazo sigue siendo malo debido al
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deterioro progresivo de la función cardiaca. Por tanto, son necesarios nuevos tratamientos y nuevas estrategias para identificar nuevos medicamentos y/o dosis de administración más eficaces y capaces de evitar el deterioro del músculo cardiaco tras un infarto y así prolongar la vida de estos pacientes.
La proteína Suppression of Tumorigenicity-2 (ST2) pertenece a la familia de receptores de la ¡nterleucina I (ILI). Existe la isoforma transmembrana ST2-ligand (ST2L) y la isofomia soluble ST2s. Recientemente, se ha identificado a la Interleucina 33 (1L33) como un ligando específico de ST2L. La interacción de IL33 con ST2L activa una respuesta cardioprotectora. La isoforma ST2s también puede unirse a IL33, pero la interacción ST2s/IL33 provoca la inhibición de la interacción de ST2L/IL33 (Pascual-Figal DA et al., Clinical relevance of ST2s in cardiac diseases. Clin Chem Lab Med CCLM FESCC 2015; Kakkar R, Lee RT, The IL-33/ST2 pathvvay: therapeutic target and novel biomarker. Nal Rev Drug Discov. 2008). Estudios in vitro han demostrado que la expresión de ST2s está relacionada con hipertrofia cardiaca, fibrosis y disfunción ventricular (Sanada S et al., IL-33 and ST2 comprise a critical biomechanically induced and cardioprotective signaling system.J Clin Invesi. 2007). También se ha propuesto que tanto IL33 como ST2s puedan ser posibles dianas en tratamientos de la remodelación adversa tras un IM (Sánchez Más, J. et al., Moduiation of IL-33/ST2 system in postinfarction heart failure: correlation with cardiac remodelling niarkers, European Journal of Clinical Investigation, 2014).
Los mecanismos de regulación de la expresión de las dos isofonnas de ST2 se desconocen. Por ahora parece que sólo se ha demostrado que están reguladas por dos regiones promotoras diferentes que contienen zonas consenso para varios factores de transcripción.
El factor de transcripción Yin Yang 1 (Yyl) es una proteína “zinc finger” multifúncional que pertenece a la familia GLI-Kruppel de proteínas nucleares. Yyl puede iniciar, activar o reprimir la transcripción de genes dependiendo de su interacción con otros factores. Se ha observado que está sobre-expresada en pacientes con hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca (Sucharov C.C. et al., Yin Yang I is increased in human heart failure and represses the activity of the human a-myosin heavy chain promoter. The Journal of biológicaI chemistry, 2003; Mariner P.D.. Yin yang 1 represses a-myosin heavy chain gene expression in pathologic cardiac hypertrophy, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004; Glenn D.J. et al., Endothelin-stimulated human b-type natriuretic peptide gene expression is mediated by Yin yang 1 in association with histone deacetylase 2, Hypertension, 2009), Sin embargo, no hemos encontrado trabajos que indiquen una relación entre Yyl con infarto de miocardio o con la regulación de ST2s.
En la presente invención, los inventores muestran como Yyl regula la transcripción de ST2s y utilizan éste descubrimiento para tratar los problemas cardiacos que surgen tras un 1M. Proponen utilizar compuestos que reducen la cantidad de proteína Yyl en células para así reducir la expresión de ST2s y así mejorar la recuperación de los pacientes que han sufrido un IM. evitando el deterioro progresivo
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del músculo cardiaco. Esta estrategia permite tratar, e identificar compuestos capaces de tratar, el deterioro del corazón tras un 1M.
Breve descripción de la invención
En la presente invención, los inventores muestran como la inhibición de Yyl resulta en una inhibición de la expresión de ST2s. Dado que ST2s compite con ST2L para interaccionar con la 1L33, la inhibición de ST2s se asocia con una activación de la cascada cardioprotectora ST2L/1L33.
En efecto, tras un IM, se observa un incremento en la expresión de Yyl y de ST2s. Pero la inhibición de Yyl mediante siRNAs en células H9C2 expuestas a estrés biomecánico, resulta en una reducción de los niveles del ARNm codificante de ST2s y de la proteína ST2s.
Los inventores también muestran como la metformina, conocida por su capacidad terapéutica tras un IM (Yin M et al., Metformin improves cardiac function in a nondiabetic rat model of post-MI heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011; Bhamra GS et al., Metformin protects the ischemic heart by the Akt-mediated inhibition of mitochondrial perineability transition pore opening. Basic Res Cardiol. 2008; Calvert JW et al., Acute metformin therapy confers cardioprotection against myocardial infarction via AMPK-eNOS-mediated signaling. Diabetes. 2008,Paiva M et al., Metformin prevenís myocardial reperfusion injury by activating the adenosine receptor. JCardiovasc Pharmacol. 2009; Gundewar S. et al., Activation of AMP-activated protein kinase by metformin improves left ventricular function and survival in heart failure. Circ Res. 2009) tiene un efecto parecido a la inhibición de Yyl mediante siRNAs en la cascada cardioprotectora IL33/ST2L. En efecto, la metformina reduce los niveles de expresión Yyl y de ST2s. Sin embargo, en este caso el efecto parece estar mediado, al menos en parte, por un aumento de los niveles de expresión de HDAC4 y por una disminución de los niveles de fosforilación de HDAC4, resultando en un incremento de HDAC4 en el núcleo de células cardiacas. Un aumento de los niveles de HDAC4 en el núcleo se asocian con una inhibición de la expresión de genes regulados por Yyl (Han S et al.; Recruitment of historie deacetylase 4 by transcription factors represses interleukin-5 transcription. Biochem J. 2006; Mathiyalagan P. et al.. Chromatin modifications remodel cardiac gene expression. Cardiovasc Res. 2014).
En resumen, los inventores han desarrollado un nuevo método para tratar a pacientes que han sufrido un IM, basado en la reducción de la expresión de Yyl, que se traduce en una reducción de la expresión de ST2s tras un IM. Esta invención también permite detectar compuestos con propiedades cardioprotectoras. En efecto, compuestos con efectos similares a los descritos para la metformina en la cascada IL33/ST2L, preferiblemente que resultan en la inhibición de la expresión de Yyl, son potencial mente interesantes para el tratamiento de pacientes que han sufrido un IM.
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Breve descripción de las figuras
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con unos ejemplos preferentes de realizaciones prácticas de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de figuras en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1: La figura 1 muestra como la metformina modula el sistema IL-33/ST2 en el infarto de miocardio.
(A-C), niveles de expresión de moléculas de ARNm implicadas en la señalización IL-33/ST2: IL-33, ST2L y ST2s. Westem-blot representativo de IL-33 (D) y niveles de proteína para ST2s (E) en tejido infartado de rata y datos del análisis densitométrico. Los datos se expresaron como veces el control. ***p<0.001. **p<0.01 comparando con el grupo control. ##p<0,01 comparando con e! grupo IM. MET= metformina; 1M= Infarto de miocardio; IL= Interleucina; ST2L= ST2 ligada; ST2s= ST2 soluble; GAPDH=gliceraldeh¡do 3-fosfato deshidrogenasa.
Figura 2: La Figura 2 muestra como la metformina regula los niveles de ST2s a través de la modulación del factor de transcripción Yyl.
(A) Análisis de la expresión de ARNm de Yyl por RT-PCR. (B) Westem-blot representativo de la proteína Yyl en núcleo y citoplasma de tejido infartado, y análisis densitométrico calculado como ratio de Yyl núcleo/citosol. ***p<0,001 comparando con el grupo control. ###p<0,001 comparando con IM. Yyl= factor de trasncripción Yin-yang 1; Cit= citosol; otras abreviaturas como en la figura 1.
Figura 3: La Figura 3 muestra como la metformina regula la actividad del factor de transcripción Yyl a través de la modulación del factor HDAC4.
(A) Niveles de ARNm para HDAC4. (B) Western-blot representativo de los niveles de proteína para HDAC4 en tejido infartado de ratas y análisis densitométrico. (C) Westem-blot representativo de la proteína fosforilada Ser-632-HDAC4 en las fracciones nuclear y citosólica en tejido infartado y análisis densitométrico calculado como ratio de Ser-632-HDAC4 núcleo/citosol. ***p<0,001 comparando con el grupo control. ##p<0,01; ###p<0,001 comparando con IM. HDAC4= histona deacetilasa 4; Hist H3= proteína histona 3; otras abreviaturas como en figuras anteriores.
Figura 4: La figura 4 muestra que, bajo estrés biomecánico, la metformina previene del incremento de ST2s inducido por Yyl.
(A-D), Análisis por RT-PCR de IL-33, ST2s, Yyl y HDAC4 usando un modelo de estrés biomecánico. (E) Westem-blot representativo de los niveles de ST2s en tejido infartado y análisis densitométrico normalizado a niveles de GAPDH. (F) Western-blot representativo de la proteína fosforilada Ser-632-HDAC4 citosólica en tejido infartado y análisis densitométrico calculado como
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ratio de Ser-632-HDAC4/GAPDH. ***p<0,001 comparando con el grupo control. ##p<0,01, ###p<0.00l comparando con IM. PMA= acetato de forbol miristato; A= lonóforo A23I87; otras abreviaturas como en figuras anteriores.
Figura 5: La figura 5 indica la eficacia inhibitoria de siYyl y su efecto en la expresión de ST2s.
(A, B y D) Análisis por RT-PCR cuantitativa de los niveles de expresión de ARNm de Yyl, ST2s y ST2L usando un modelo celular de estrés biomecánico. (C) Western-blot representativo de niveles proteicos de ST2s y análisis densitométrico. (E) Imágenes de microscopía confocal para caracterización de la expresión de Yyl (rojo) y y-tubulina (verde) por microscopía confocal en células H9c2. Los núcleos en azul (DAPI). Escala de barra: 50 pm. ***p<0,001 comparando con sham, ###p<0,001 comparando con IM. siYyl= ARN pequeño de interferencia; src= scramble como control negativo de silenciamiento mediante siRNA; otras abreviaturas como en figuras anteriores.
Figura 6: La figura 6 muestra como el efecto de cada Yyl siRNA por separado tiene el mismo efecto que los 4 siRNAs en conjunto.
Las células H9c2 fueron preincubadas con scramble siRNA (ser), una combinación de cuatro siRNAs para Yyl (siRNA Yyl_ a+b+c+d) o con un sólo siRNA antes de la inducción de estrés biomecánico, durante 6 horas. Los niveles de ARNm de Yyl (A) y sST2 (B) fueron analizadas mediante RT-PCR. ***p<0,001 vs ser; ###p<0,001 vs estrés biomecánico.
Descripción detallada de la invención Definiciones
- En el contexto de la presente invención, el término "expresión génica" se refiere al proceso por el cual los ácidos nucleicos de un gen se utilizan para dirigir la transcripción resultando en la síntesis de proteínas. El proceso de expresión génica comprende 2 pasos principales:
1) La transcripción: la producción de ARN mensajero (ARNm) por una ARN polimerasa utilizando la secuencia de ADN como molde. Esta etapa continúa con el procesado o maduración de la resultante molécula de ARNm.
2) La traducción: el uso de ARNm para dirigir la síntesis de proteína. Después de esta segunda etapa pueden producirse modificaciones post-traduccionales de la proteína.
Además, en algunos casos, la expresión génica conlleva la producción de otras formas de ARN que no se traducen en proteínas, como ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosomales (ARNr), ARNs largos no codificantes (ARNlnc), o ARNs de interferencia (ARNi).
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- En el contexto de la presente invención, “secuencia reguladora” se refiere a un segmento de una molécula de ácidos nucleicos que es capaz de aumentar o reducir la expresión de genes específicos en un organismo. Algunos ejemplos de secuencias reguladores serían promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, sitios de corte y empalme etc.
- En el contexto de la presente invención, “ARN de interferencia (ARNi)” se entiende como una molécula de ARN que suprime la expresión de genes específicos mediante mecanismos conocidos globalmente como ribointerferencia o interferencia por ARN. Los ARN interferentes son moléculas pequeñas (de 20 a 25 nucléotidos) que se generan por fragmentación de precursores más largos. Se pueden clasificar en tres grandes grupos de moléculas:
- ARN interferente pequeño (o siRNA del inglés small interfering RNA). Son moléculas de ARN bicatenario perfectamente complementarias de aproximadamente 20 ó 21 nucleótidos (nt) con 2 nucleótidos desemparejados en cada extremo 3'. Cada hebra de ARN tiene un grupo fosfato 5' y un grupo hidroxilo (-OH) 3'. Esta estructura proviene del procesamiento llevado a cabo por Dicer, una enzima que corta moléculas largas de ARN bicatenario (dsRNA, double stranded RNA) en varios siRNAs. Una de las hebras del siRNA (la hebra 'antisentido') se ensambla en un complejo proteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex), que utiliza la hebra de siRNA como guía para identificar el ARN mensajero complementario. El complejo RISC cataliza el corte del ARNm complementario en dos mitades, que son degradadas por la maquinaria celular, bloqueando así la expresión del gen. Los siRNA pueden ser también introducidos de forma exógena en las células utilizando métodos de transfección basándose en la secuencia complementaria de un gen en particular, con la finalidad de reducir significativamente su expresión.
- miARN (o miRNA del inglés micro-RNA o miRNA) son pequeños ARNs interferentes que se generan a partir de precursores específicos codificados en el genoma, que al transcribirse se pliegan en horquillas (hairpins) intramoleculares que contienen segmentos de complementariedad imperfecta. El procesamiento de los precursores ocurre generalmente en dos etapas, catalizado por dos enzimas, Drosha en el núcleo y Dicer en el citoplasma. Una de las hebras del miRNA (la hebra 'antisentido'), como ocurre con los siRNA, se incorpora a un complejo similar al RISC (del inglés RNA-induced silencing complex). Dependiendo del grado de complementariedad del miRNA con el ARNm, los miRNAs pueden bien inhibir la traducción del ARNm o bien inducir su degradación. Sin embargo, a diferencia con la vía de los siRNA, la degradación de ARNm mediada por miRNA se inicia con la eliminación enzimática de la cola de poli(A) del ARNm.
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- ARNs asociados a Pivvi (piARNs): se generan a partir de precursores largos monocatenarios, en un proceso que es independiente de Drosha y de Dicer. Estos ARN pequeños se asocian con una subfamilia de las proteínas 'Argonauta' denominada proteínas Piwi.
- En el contexto de la presente invención, el término “oligonucleótido antisentido de ARN” se refiere a una cadena simple de ARN que es complementaria a una secuencia específica. Esta secuencia de ARN antisentido híbrida con un determinado ARNm inhibiendo así su traducción, ya que la traducción del ARNm requiere una cadena simple de ARN. De este modo, el oligonucleótido antisentido de ARN inhibe la síntesis de una proteína determinada. Por otro lado, la ARNasa H degrada complejos de ARN-ADN, de modo que la hibridación del oligonucleótido antisentido de ARN a una secuencia específica de ADN también provocará la degradación de dicha secuencia de ADN.
- En el contexto de la presente invención, el término “plásmido” se entiende como la molécula de ADN extracromosómico circular que se replica y se transmite independientemente del ADN cromosómico. Los plásmidos están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas en ellos. Suelen incluir secuencias reguladoras, como promotores que se utilizan para sintetizar el ARN de interés, que en la mayoría de los casos se acaba traduciendo en una proteína determinada.
- En el contexto de la presente invención, el término “vector’ se refiere a un pequeño fragmento de ADN. obtenido de un virus, de un plásmido, o de una célula de un organismo superior en el que se pueden insertar fragmentos genéticos heterólogos y que se usan habitualmente para transportar de manera artificial este material genético heterólogo a otra célula, donde puede replicarse, expresarse y/o insertarse en el genoma de la célula huésped. En general, el vector mismo es una secuencia de ADN que consiste en un transgen y en una secuencia más larga que sirve de “esqueleto” del vector. Puede ser de simple o de doble cadena. Opcionalmente, puede estar formado, o comprender, ácidos nucleicos modificados, como por ejemplo metilfosfato o cadenas principales de fosforotioato.
- En el contexto de la presente invención, el término “célula cardiaca" se refiere a una célula que forma parte del corazón. Entre las diferentes células cardiacas se encuentran principalmente cardiomiocitos, pero también otras como por ejemplo fibroblastos o células endoteliales del corazón. En el contexto de la presente invención, el término “cardiomiocito” se refiere a una célula del miocardio o músculo cardiaco capaz de contraerse de forma espontánea e individual.
- En el contexto de la presente invención, el término "aumento" o "aumentar" se refiere a aumentos por encima de un nivel de referencia o control. Por ejemplo, los niveles de referencia o control son los
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que se observan antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto activador o de la acción activadora. El aumento se podrá evaluar por una persona experta de en la técnica específica, pero en los aspectos y realizaciones descritas en esta invención, se refiere a aumentos de al menos un 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31,32,33,34,35,36,37,
38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60. 61, 62, 63, 64,
65,66, 67. 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75. 76, 77, 78, 79. 80, 81, 82. 83. 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91,
92,93,94,95,96,97,98,99,0 100%, o de 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,20,25,30,
35,40, 45, 50, o más veces respecto del niveles control.
- En el contexto de la presente invención, el término "reducción", "reducir", “inhibir” o “inhibición” se refiere a reducciones por debajo de un nivel de referencia o control. Por ejemplo, los niveles de referencia o control son los que se observan antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto inhibidor. La disminución se podrá evaluar por una persona experta en la técnica, pero en los aspectos y realizaciones descritas en esta invención, se refiere a disminuciones de al menos un 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24,25, 26, 27,28, 29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47. 48. 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56. 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78. 79, 80. 81, 82. 83. 84, 85, 86. 87. 88. 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o de 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35,40,
45, 50, o más veces respecto del niveles control.
- En el contexto de la presente invención, el término “polinucleótido” se refiere a una secuencia de varios nucleótidos, formado por al menos en torno a 20 nucleótidos. Puede estar formada desoxirribonucleótidos o por ribonucleótidos y constituir por tanto moléculas de ADN o de ARN. En la presente invención también pueden estar formados por nucleótidos sintéticos o modificados. Pueden incluir por ejemplo cadenas principales de fosforotioato, o la adición de acridina. Para los fines de la presente invención, se debe entender que los polinucleótidos descritos en este documento pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.
- En el contexto de la presente invención, el término “método de cribado” se entiende como un método que permite seleccionar compuestos capaces de promover un cambio determinado medible por métodos in viíro conocidos en la técnica, en una muestra biológica o en un animal modelo no humano a los que se les ha administrado dicho compuesto, en comparación con una muestra biológica o animal modelo no humano similares y comparables, a los que no se les ha administrado el compuesto. Dicho método de cribado también puede incluir una fase adicional de aislamiento del compuesto seleccionado o de los compuestos seleccionados.
- En el contexto de la presente invención, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere al compuesto que se mezcla de alguna manera con ingredientes activos para estabilizarlos y
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solubilizarlos y administrarlos a animales vivos, incluyendo los seres humanos. Esto incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tal uso en las composiciones está contemplado.
Los inventores identifican una nueva estrategia para promover la recuperación tras un IM. Esta estrategia se basa en reducir los niveles de expresión del factor de transcripción Yyl, que resultará en una reducción de la expresión de la proteína ST2s. La interacción entre la isoforma ST2L y la IL33 activa una cascada de reacciones que promueve la recuperación cardiaca tras un 1M (Sánchez Más, J. et al., Modulation of 1L-33/ST2 system in postinfarction heart failure: correlation with cardiac remodelling markers, European Journal of Clinical Investigation, 2014). Dado que ST2s compite con ST2L para interaccionar con la IL33, la inhibición de ST2s se asocia con un efecto positivo en la activación de la cascada mediada por la interacción IL33/ST2L,
Un primer aspecto de la presente invención, se refiere al uso de una composición que comprende un compuesto capaz de reducir la expresión del gen Yin yang l(Yyl), en células cardiacas, preferiblemente en células cardiacas que han sufrido un estrés biomecánico idéntico o similar al de un infarto de miocardio (IM), de un sujeto humano o animal con respecto a la expresión observada en ausencia del compuesto en dichas células, seleccionado de la lista que consiste en:
- ARN de interferencia (ARNi) del gen Yyl,
- un oligonucleótido antisentido de ARN correspondiente al gen Yyl,
- una secuencia de ácidos nucleicos que se introduce en el gen o secuencias reguladores del gen Yyl inhibiendo su expresión;
para elaborar un medicamento que inhibe la expresión del gen que codifica la proteína soluble suppression of tumorigenicity-2 (ST2s) para promover la recuperación cardiaca tras un infarto de miocardio (IM).
Como se acaba de indicar, la inhibición de la expresión génica de Yyl se puede conseguir utilizando ARN de interferencia (ARNi). Este ARNi comprende una secuencia única y complementaria al ARN mensajero (ARNm) del gen Yyl para inhibir la traducción de dicho ARNm. Alternativamente, se puede utilizar un oligonucleótido antisentido de ARN formado por una secuencia única del gen Yyl complementaria al ARNm Yyl que puede unirse a dicho ARNm y también inhibir su traducción. Esta metodología es conocida en la técnica. Estas construcciones de ARN deben ser capaces de hibridar con una secuencia del ARNm diana Yyl de manera selectiva y específica, de modo que son idénticas
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a una secuencia complementaria de! ARNm Yyl en al menos un 90% de sus nucleótidos, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o un 99.5 %, La secuencia de ARNm Yyl es idéntica a la secuencia SEQlde Yyl del genoma humano (o a la secuencia homologa codificante de una proteína con funciones homologas en otros genomas animales) en al menos un 90% de sus nucleótidos, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o un 99.5 %. Alternativamente, se pueden introducir secuencias de nucleótidos en el genoma de la célula de interés en el gen o secuencias reguladoras del genYyl para inhibir su expresión. Los métodos para introducir estas secuencias en el genoma de la célula son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la técnica de CRISPR-Cas.
Para introducir moléculas de ARN descritas justo arriba en las células diana, se pueden utilizar diferentes estrategias. Por ejemplo, se puede simplemente inyectar los siRNAs u oligonucleótidos antisentido en el entorno de las células para que éstos entren en contacto con las células. El medio en el que se encuentran estos ARNs puede ser cualquier vehículo farmacéutico compatible con la estabilidad de los ARNs y compatible con las células y, en caso de administración a un sujeto, con la salud física del sujeto. Este vehículo es conocido en la técnica, como por ejemplo una solución salina. También se pueden utilizar nanopartículas biodegradables, como liposomas. Los liposomas son vesículas formadas por lípidos que contienen en su interior moléculas de interés (en este caso los siRNAs u oligonucleótidos antisentido) y que pueden fusionarse con una membrana celular y liberar su contenido en dicha célula. Para aumentar la especificidad de las células en que se libera el contenido de los liposomas, se pueden añadir proteínas que mejoren la dirección a célula, como marcadores específicos de las células diana. También se pueden electroporar las células.
Otra opción es introducir en las células la secuencia de ADN correspondiente a la molécula de ARN,, como las descritas anteriormente. Esta secuencia de ADN se podrá transcribir en las células diana. Para ello, se pueden utilizar vectores o plásmidos capaces de introducirse en las células diana. Para introducirse en dichas células se pueden utilizar varias estrategias, que son conocidas en la técnica. Al igual que para introducir el ARN, se pueden utilizar liposomas, también se puede utilizar métodos basados en la electroporación o biobalística. Alternativamente se pueden utilizar vectores virales, como por ejemplo adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vaccinia. virus de la polio, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo entre estos, virus con la estructura del VIH. También se prefieren las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para su uso como vectores. Los retrovirus son virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como un vector. Los vectores retrovirales son capaces de llevar una carga útil genética más grande que otros vectores virales, es decir, un gen y/o transgen marcador, y por esta razón son un vector comúnmente usado. Sin embargo, no son tan útiles en células no proliferativas. Los vectores de adenovirus son relativamente estables y fáciles de utilizar, y pueden ser transfectados en células que no se dividen. Los vectores virales de la viruela son grandes y tienen varios sitios para la inserción de
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genes, son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Los lentivirus son capaces de infectar a todo tipo de células, tanto quiescentes como en división, permiten insertos de tamaño medio y se integran en el genoma de la célula huésped, dando lugar a una expresión a largo plazo. Una realización preferida es un vector viral que ha sido diseñado con el fin de suprimir la respuesta ¡ninimitaria del organismo huésped, provocados por los antígenos virales.
Por tanto, otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere al uso del primer aspecto de la invención, donde dicho compuesto está comprendido en un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar dicho compuesto a las células cardiacas. Preferiblemente, dicho vector es un vector viral. Más preferiblemente, dicho vector viral está seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
Una vez dentro de las células, la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican ios ARNs de interés capaces de silenciar la expresión del gen Yyl se producirá dentro de las células diana, bajo el control de unos promotores pre-determinados y presentes en los vectores o plásmidos utilizados. En otra realización preferida de la invención, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a los ARNs de interés capaces de silenciar la expresión del gen Yyl se inserta en el genoma de la célula cardiaca en la que se ha introducido.
Para cualquiera de las realizaciones preferidas descritas hasta ahora, se puede incluir en los polinucleótidos de la invención nucleótidos sintéticos modificados. Un número de tipos diferentes de modificación de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen por ejemplo cadenas principales de fosforotioato, o la adición de acridina.
El uso de la composición según cualquiera de las realizaciones preferidas descritas hasta ahora está dirigido a reducir el tamaño del infarto de miocardio y/o previene el remodelado cardiaco adverso tras un IM.
Los compuestos se pueden administrar localmente en las células de interés, los cardiomiocitos, o bien de formar parenteral, intravenosa, o intramuscular. También se puede administrar oralmente, siempre y cuando, cualquiera de estas formas de administración permita transportar y suministrar el compuesto descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores a las células cardiacas de interés. Por tanto, en una realización particular del primer aspecto de la invención, la composición se administra de manera local en las células del corazón. En otra realización de la invención, la composición se administra de manera intravenosa.
La composición utilizada en cualquiera de las realizaciones anteriores además puede comprender un vehículo farmacéutico aceptable y opcionalmente un principio activo adicional. En este sentido, el compuesto se puede administrar in vivo junto con un vehículo farmacéutico aceptable. El vehículo,
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naturalmente, se selecciona para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo (o de los ingredientes activos, en caso de contener un principio activo adicional) y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien conocido para un experto en la técnica y tal y como está indicado en las definiciones. Por tanto, en una realización de la invención se refiere al uso según cualquiera de las realizaciones anteriores donde dicha composición además comprende un vehículo farmacéutico aceptable y opcionalmente un principio activo adicional. Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de cribado para identificar compuestos capaces de reducir la expresión del gen que codifica la proteína ST2s que comprende:
a) Obtener una librería de compuestos.
b) Determinar si una administración a células cardiacas, preferiblemente sometidas a un estrés similar o idéntico al que produce un IM, de uno o más de los compuestos del paso a) resulta en una reducción de los niveles intracelulares del factor de transcripción Yyl y/o de la expresión del gen que codifica el factor de transcripción Yyl respecto de las células cardiacas, preferiblemente sometidas a un estrés biomecánico similar o idéntico al que produce un IM, a las que no se les administra/n dicho/s compuesto/s.
c) Seleccionar aquellos compuestos que promueven la reducción descrita en el paso b).
Dicho método de cribado se puede realizar con muestras biológicas in vitro, o con animales modelo no humanos.
En el ejemplo 3, se observa cómo un incremento en la expresión del factor de transcripción Yyl se relaciona con un aumento en la expresión de ST2s y cómo el silenciamiento de Yyl con ARNs de interferencia pequeños (siRNAs) se traduce en una reducción de la expresión de ST2s. Por tanto, es esperable que compuestos capaces de inhibir la expresión de Yyl, de manera similar a los siRNAs, también acaben inhibiendo la expresión de ST2s. Como se ha comentado más arriba, la alta expresión de ST2s se traduce en una inhibición de la interacción entre 1L33 y ST2L, inhibiendo así la cascada cardio-protectora IL33/ST2L y sus efectos beneficiosos en la recuperación tras un infarto de miocardio. Por tanto, los compuestos capaces de reducir la expresión de Yyl, y en consecuencia de ST2s, parecen desencadenar mecanismos moleculares capaces de promover la recuperación cardiaca tras un IM. Por ello, éstos compuestos son seleccionados en el paso c) del método de cribado descrito más arriba. Para medir el efecto que tiene un compuesto en la expresión de Yyl, se cultivan células que expresan el factor de transcripción Yyl, preferiblemente células cardiacas que comprenden cardiomiocitos, que aún más preferiblemente han sufrido un estrés biomecánico idéntico o similar al de un infarto de miocardio (Ml)y se fes administra el compuesto. El estrés biomecánico es conocido en la técnica y preferiblemente consiste en el que se describe en Neshati Z et al. (Neshati Z et al.,
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Development of a new model of cardiac hypertrophy with pro-arrhythmic features to stndy the role of hypertrophy in arrhythmogenesis. Eur HeartJ. 2013).
Alternativamente, para medir el efecto que tiene un compuesto en la expresión de Yyl, se administra el compuesto a animales modelo no humanos, preferiblemente mamíferos no humano, y más preferiblemente, cuyas células cardiacas han sufrido un estrés similar o idéntico al de un IM, y se mide el nivel de expresión de Yyl en las células cardiacas de interés, preferiblemente en cardiomiocitos. La vía de administración tanto en células en cultivo como a animales modelo, dependerá del tipo de compuesto. En caso de tratarse de ARNs de interferencia o de oligonucleótidos antisentido, se pueden encontrar en las mismas formas que se han descrito en el primer aspecto de la invención, e introducirlos en las células cardiacas tal y como se describe en el primer aspecto de la invención. En caso de tratarse de otro tipo de moléculas (como la metformina), se podrá adaptar el método de administración al descrito en la técnica. Para comprobar si el compuesto promueve una disminución de los niveles de proteína Yyl, en células en cultivo o en células cardiacas de animales modelo descritas anteriormente, se medirán estos niveles en las células cardiacas a las que se ha administrado el compuesto (o de animales modelo a los que se les ha administrado el compuesto) y en células cardiacas a las que no se les ha administrado el compuesto (o de animales a los que no se Ies ha administrado el compuesto). En caso de que haya un menor nivel relativo de Yyl en las células cardiacas que sí han recibido el compuesto (o de animales a los que sí se les ha administrado el compuesto), se concluirá que el compuesto promueve una reducción de los niveles intracelulares del factor de transcripción Yyl. Esta reducción se evaluará por una persona experta en la técnica, y se entiende que para considerarse una disminución debe ser como la descrita en las definiciones más arriba. Para medir los niveles de proteína Yyl intracelular, se podrán utilizar diferentes métodos conocidos en la técnica, comparando una muestra control (células cardiacas a las que no se les ha administrado el compuesto o de animales a los que no se les ha administrado el compuesto) con la muestra celular a la que se le ha administrado el compuesto (o de animales a los que se les ha administrado el compuesto), A modo de ejemplo se podrá utilizar la técnica de western blot, immunohistoquímica, o la técnica de "fluorescence-activated cell sorting" (FACS). Otro indicativo, o confirmación, de que hay una reducción en los niveles de proteína Yyl intracelular es que se produzca una reducción en los niveles de expresión génica. Esta reducción se evaluará por una persona experta en la técnica, Se entiende por reducción lo mismo que se ha indicado para el caso en que se miden los niveles de proteína y como se ha indicado en las definiciones. Para medir la expresión génica, se podrán utilizar cualquiera de las metodologías conocidas en la técnica, como por ejemplo la "Real Time - Polymerase Chain reaction” (RT-PCR), la "Real Time - Quantitative Polymerase Chain reaction” (RT-QPCR) o "micro-arrays”.
En los ejemplos 2, 3 y 4, se observa una correlación entre la expresión de HDAC4, su fosforilación, la expresión de Yyl y la expresión de ST2s. Más específicamente, se observa cómo tras inducir un IM o
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un estrés biomecánico a células cardiacas H9C2. la fosforilación de HDAC4 aumenta. Al administrar metformina, se produce un aumento en la expresión del HDAC4, y una disminución de su nivel de fosforilación (fíg 3, 4). Las Figuras 2 y 4 muestran como la metformina reduce los niveles de Yyl y de ST2s que habían aumentado a raíz de un IM o de un estrés biomecánico en células H9C2. Teniendo en cuenta que Yyl activa la transcripción de ST2s tras un IM o estrés biomecánico, los resultados sugieren que HDAC4, que es capaz de interaccionar con Yyl (Han S et al., recruitment of histone deacetylase 4 by transcription factors represses interleukin-5 transcription. Biochem J. 200615; Mathiyalagan P. et al., Chromatin modifications remodel cardiac gene expression. Cardiovasc Res. 2014), impide que Yyl active la transcripción de ST2s. La fosforilación de HDAC4 impide su importación al núcleo celular (Backs J et al., CaM kinase II selectively signáis to histone deacetylase 4 during cardiomyocyte liypertrophy. J Clin Invest. 2006; Walkinshaw DR et al., The tumor suppressor kinase LK.BI activates the downstream kinases SIK.2 and SIK3 to stimulate nuclear export of class Ha histone deacetylases. J Biol Chem. 2013; Wang X. et al., YY1 restrained cell senescence through repressing the transcription of pl 6. Biochim Biophys Acta BBA - Mol Cell Res. 2008), por lo que su defosforilación favorece su importación al núcleo, donde puede interaccionar con Yyl,traduciéndose en la represión de la transcripción de ST2s. En resumen, un compuesto que promueve un aumento en la expresión de HDAC4, y/o reduce su fosforilación, también resulta en una reducción de la expresión de ST2s por la inhibición de la actividad de Yyl. Por tanto, en una realización preferida de la invención, en el método de cribado descrito en el segundo aspecto de la invención, también se incluye, en el paso b) determinar si la administración de dicho/s compuesto/s en comparación con células cardiacas, preferiblemente sometidas a un estrés biomecánico similar o idéntico al que produce un IM, a las que no se les administra/n resulta en:
- un aumento de los niveles de la proteína histona desacetilasa 4 (HDAC4) o de la expresión del gen que codifica la proteína HDAC4 y/o
- una disminución de los niveles de fosforilación de la proteína HDAC4 y/o
- un aumento en la cantidad de proteína Yyl que está unida a HDAC4 y/o
- un aumento de la expresión de la Interleucina 33 (IL33) o de la expresión del gen que codifica la proteína IL33, y/o
- una disminución de los niveles de ST2s o de la expresión del gen que codifica la proteína ST2s, y
c) seleccionar aquellos compuestos que producen uno o varios de los efectos descritos en b).
Los métodos para determinar el aumento o disminución de los niveles de proteína, o de expresión génica de las diferentes proteínas mencionadas en esta realización preferida de la invención, se realizarán de manera similar a la descrita anteriormente en el segundo aspecto de la invención. En
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cuanto a la medición de los niveles de fosforilación de HDAC4, de nuevo se utilizarán los métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo el western blot, la immunohistoquímica o el uso de FACS. Para comparar la cantidad de proteína Yyl unida a HDAC4 en presencia y ausencia del compuesto, se podrán utilizar metodologías conocidas en la técnica, como por ejemplo la ¡mmunoprecipitación de Yyl y seguida por un western blot para detectar proteína HDAC4 unida a Yyl.
Para evaluar o confirmar el efecto terapéutico de los compuestos que producen los cambios descritos en las reivindicaciones anteriores, el compuesto se administra a animales modelo de infarto de miocardio, y se evalúa el tamaño del infarto tal y como se observa por ejemplo en la Figura 6b de trabajo de Yin M et al., Metformin improves cardiac function in a nondiabetic rat model of post-MI heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011. La evaluación del tamaño del infarto se puede hacer utilizando la metodología conocida en la técnica, como la resonancia magnética o especialmente al utilizar animales modelo por cirugía. Los animales modelo podrán ser animales modelo de laboratorio, preferiblemente, ratas, ratones o cerdos, a los que se les realiza un ligamiento de la arteria coronaria descendiente. Por tanto, un tercer aspecto de la invención consiste en un método donde además de los pasos descritos en cualquiera de las realizaciones del segundo aspecto de la invención, se incluye un paso d) en el que se evalúa en animales modelo de infarto de miocardio no humanos, preferiblemente en mamíferos no humanos, si la administración del/de los compuesto/s evaluado/s en los pasos a) y b), o seleccionado/s en el paso c), reducen el tamaño del infarto de miocardio.
El método de cribado también se puede realizar para determinar los rangos de administración más adecuados para conseguir la mayor eficacia del compuesto terapéutico. Por tanto, en otra realización de la invención, se determina un rango de cantidad del/de los compuesto/s administrado/s que provoca con mayor intensidad los efectos descritos en cualquiera de las reivindicaciones de los aspectos 2 y 3, preferiblemente el efecto descrito en el segundo aspecto de la invención que se refiere a los niveles del factor de transcripción Yy 1, en muestras biológicas in vilro, o en animales modelo no humanos.
En cualquier caso, los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes como para producir el deseado efecto de recuperación cardiaca tras un IM. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, o similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la agresividad del IM, la vía de administración, o si se están administrando otros fármacos adicionales. La dosis puede variar, y puede ser administrada en una o más administraciones, pueden ser dosis diarias, durante uno o varios días. Se pueden encontrar orientaciones en la bibliografía para las dosificaciones apropiadas para las clases dadas de productos farmacéuticos.
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La composición que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones anteriores del segundo y tercer aspecto de la invención puede estar formado por el compuesto que se está testando en el método de cribado, y un vehículo farmacéutico aceptable. En este sentido, la composición farmacéutica resultante se puede administrar in vivo a un animal modelo no humano. El vehículo, naturalmente, se selecciona para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien conocido para un experto en la técnica y tal y como está indicado en las definiciones. . La proporción de compuesto y de vehículo farmacéutico adecuadas se podrá determinar haciendo uso del mismo método de cribado descrito anteriormente. Por tanto, en una realización particular de la invención, se determina un rango de cantidad de compuesto testado por el método de cribado y de vehículo que provoca con mayor intensidad cualquiera de los efectos de los aspectos 2 y 3 de la invención, preferiblemente el efecto descrito en el segundo aspecto de la invención que se refiere a los niveles del factor de transcripción Yyl. En otra realización preferida de la invención, se determina el modo de administración del compuesto que provoca con mayor intensidad cualquiera de los efectos de los aspectos 2 y 3 de la invención en animales modelo no humanos, preferiblemente el efecto descrito en el segundo aspecto de la invención que se refiere a los niveles del factor de transcripción Yyl. En una realización preferida, en el método de cualquiera de las realizaciones del segundo y tercer aspecto de la invención, la librería de compuestos está formada por biguanidas. Dado que la metformina es un compuesto bien conocido por su capacidad para tratar la recuperación tras un IM (Yin M et al., Metformin improves cardiac fiinction in a nondiabetic rat model of post-MI heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011; Bhamra GS et al., Metformin protects the ischemic heart by the Akt-mediated inhibition of mitochondrial permeability transition pore opening. Basic Res Cardiol. 2008; Calvert JW et al., Acute metformin therapy confers cardioprotection against myocardial infarction via AMPK-eNOS-mediated signaling. Diabetes. 2008,Paiva M et al., Metformin prevenís myocardial reperfusion injury by activating the adenosine receptor. J Carciiovasc Pharmacol. 2009; Gundewar S. et al., Activation of AMP-activated protein kinase by metformin improves left ventricular function and survival in heart failure. Circ Res. 2009)) y que como se ve en los ejemplos I a 4, reduce la expresión y los niveles de proteína Yyl, aumenta los de HDAC4, reduce la fosforilación de HDAC4 y reduce a expresión de ST2s y, por último, reduce el tamaño del infarto de miocardio (Yin M et al., Metformin improves cardiac function in a nondiabetic rat model of post-MI heart failure. Am JPhysiol Heart Circ Physiol. 2011), este compuesto se puede utilizar como compuesto de referencia, o cómo control positivo, en los métodos de cribado descritos en el segundo y tercer aspecto de la invención. Por tanto, en otra realización particular de la invención, en el método de cualquiera de las realizaciones del segundo y tercer aspecto de la invención, la metformina se utiliza como control positivo.
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Un cuarto aspecto de la invención hace referencia a un producto que contenga ta información de los resultados obtenidos por el método de cribado descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores.
Un quinto aspecto de la invención hace referencia a un método de obtención de uno o más compuestos que comprende la identificación del/de los compuesto/s según cualquiera de las realizaciones del segundo y tercer aspecto de la invención y su aislamiento y/o purificación.
Descripción de un modo de realización preferente de la invención
Materiales v métodos A. Modelo animal.
Animales
Se usaron ratas Wistar macho adultas (con un peso entre 220-250 g, y con 6-8 semanas de edad). Todos los protocolos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad (A13150105). Los animales fueron mantenidos en condiciones estándar de laboratorio, en unas instalaciones libres de patógenos y bajo estricta vigilancia veterinaria. Mantenidos en habitaciones controladas con ciclos de luz/oscuridad de 12h. los animales recibieron dieta comercial de ratas y agua adlibitum.
Inducción del IM experimental en ratas.
El 1M agudo fue inducido mediante ligación permanente de la arteria coronaria anterior descendente izquierda (LAD). Para demostrar la elevación del ST y, por tanto, confirmar el éxito de la cirugía, se utilizó la electrocardiografía. El grupo control fue sometido al mismo procedimiento que los otros grupos excepto a la ligadura de la LAD.
Grupos experimentales y diseño.
Los animales fueron divididos en tres grupos:
- Ratas operadas sin LAD (grupo sham, n=10) y con placebo (0.9% NaCl en gelatina).
- Ratas operadas sin LAD (grupo sham + MET, n=10) y tratamiento con metformina: 250 mg/kg de dosis oral diaria, administrada en gelatina.
- Ratas operadas con LAD y con placebo (grupo MI, n=l 5).
- Ratas operadas con LAD y tratamiento con metformina: 250 mg/kg de dosis oral diaria, administrada en gelatina (grupo IM+MET, n=20).
La administración de metformina comenzó tres días antes de la inducción del IM y se mantuvo hasta el sacrificio, el cual se realizó entre 1 y 4 semanas después de la inducción de IM. La dosis de
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metformina se fue ajustando semanalmente de acuerdo al peso corporal de cada animal. La metformina usada se adquirió de Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO).
El día del sacrificio, el área infartada del ventrículo izquierdo (VI) fue cuidadosamente extraída y procesada para su análisis. Las variables de la función del VI fueron valoradas usando una ecografía transtorácica. En el momento del sacrificio se cuantificó la concentración de metformina en plasma con HPLC (High-performance liquid chromatography).
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa.
Tejido fresco procedente del VI fue lavado usando PBS en frío y triturado en baño de hielo de forma manual usando un bisturí. El aislamiento del ARN y la RT-PCR cuantitativa se llevaron a cabo siguiendo los protocolos usados anteriormente por el grupo (Lax A et al., Mineralocorticoid Receptor Antagonists Modulate Galectin-3 and Lnterleukin-33/ST2 Signaling in Left Ventricular Systolic Dysfunction After Acute Myocardial Infarction. JACC Heart Fail. 2015), sin ninguna modificación significativa.
Fracción proteica y Western blotting.
Aproximadamente 30 mg de miocardio infartado fueron homogeneizados por sonicación y centrifugados a 20.000 xg durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante fue alicuotado y congelado a -80°C. Las fracciones citosólica y nuclear fueron separadas usando el método descrito por Dimauro I. et al. (Dimauro I, et al.. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 2012). La concentración proteica fue determinada por el método del ácido bicinconínico (Smith PK, et al., Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985). El Western blotting se realizó con un sistema de electroforesis con SDS-PAGE.
Las bandas inmunoreactivas se detectaron usando ECL y mediante el uso del sistema ChemiDocTM XRS+ con el software de imagen de BioRad Laboratories Inc. (Berckley, CA). Un análisis cuantitativo se realizó con el programa Gel-Pro Analyzer 3. I de Sigtna.
B. Modelo celular.
Modelo de estrés biomecánico.
Células H9c2 fueron mantenidas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con 2 mM de glutamina y 10% FBS. Para la realización de los ensayos, las células fueron privadas de suero durante 24 h. El estrés biomecánico se llevó a cabo siguiendo el diseño
experimental de Neshati Z et al. (Neshati Z et al., Developmetit of a new model of cardiac hypertrophy with pro-arrhythmic features to study the role of hypertrophy in arrhythmogenesis. Eur Hearl J. 2013).
Inmunofluorescencia.
5 Inicialmente las células fueron fijadas con formaldehido al 4% (v/v), permeabilizadas con Tritón X- 100 y tratadas con el potenciador de señal kit Image-iT™ FX, siguiendo el protocolo experimental descrito por Thermo Fisher Scientific (Molecular Probes, 136933). A continuación, las células se incubaron a 4 °C durante toda la noche con los anticuerpos anti-Yyl (dilución 1:1000) y y-Tubulina (dilución 1:1000) y posteriormente a 37 °C durante 1 hora con anti-lgG de ratón conjugado con Alexa 10 Fluor® 488 (dilución 1:200) o anti-lgG de conejo conjugado a Alexa Fluor 593 (dilución 1:200). La fluorescencia de las células se analizó con un equipo confocal de Leica Mycrosystems seleccionando las ventanas de emisión en 508-550 nm y 610-650 nm. respectivamente. Además, los núcleos fueron teñidos usando DAPI.
Silenciamiento por snuili ¡nterfering RNA (siRNA)
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siRNA específicos de Yyl ó siRNA control (Dharmacon, Lafayette, CO) fueron usados para transfectar células usando Lipofectamina 2000 de acuerdo con el protocolo proporcionado por la casa comercial. Para prevenir efectos off-target, se usó una mezcla comercial de cuatro siRN As específicos (ON-TARGETpIus™ Yyl), descritos previamente (Liu Q. et al„ Prostaglandin F2alpha suppresses 20 rat steroidogenic acute regulatory protein expression via induction of Yin Yang 1 protein and recruitment of histone deacetylase 1 protein. Endocrinology. 2007). El gen estudiado fue Yyl, mientras que GAPDH fue usado como gen de control interno. Las secuencias diana fueron:
- ON-TARGET plus SMARTpool siRNA Yyl
- Secuencia diana (5 -3')
- J-091624-05
- CAUCUUAACACACGCUAAA
- J-091624-06
- AGGGAUAACUCUGCUAUGA
- J-091624-07
- GGGCGACACCCUCUACAUU
- J-091624-08
- GCGCCGACCCGGGUAAUAA
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Se incubaron células H9c2 en placas de seis pocilios en medio completo. Al día siguiente, estas células fueron transfectadas usando 25nM de cada uno de los siRNA durante ocho horas, seguidas de un periodo de recuperación en medio con suero. Tras 24h de la transfección el cultivo celular se lavó dos veces con PBS atemperado a 37 °C, antes de iniciar los tratamientos.
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa.
Las células fueron sedimentadas por centrifugación a 480 xg. durante 10 min a 4 °C. Para el resto del procedimiento ver modelo animal.
Fracción proteica y Western blotting.
Ver modelo animal.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± error estándar o desviación estándar según se indica. Se realizaron análisis para muestras independientes y pareadas, o análisis de la varianza, según correspondiera en cada caso. Los datos fueron analizados mediante el programa estadístico SPSS statistics v. 19 (SPSS Inc,, USA), y los gráficos fueron construidos mediante el programa SigmaPlot v. 11.0. Se consideró como estadísticamente significativo un valor de p <0.05.
Resultados
1- Efectos protectores de la terapia de metformina.
Con el objetivo de encontrar nuevas estrategias terapéuticas para tratar pacientes con 1M, se buscó un mecanismo regulador de la cascada de señalización IL-33/ST2. Para ello se buscó un compuesto capaz de tratar pacientes con IM y que actuara sobre dicha cascada de señalización, para utilizarlo como condición de referencia. La metformina es ampliamente conocida por su capacidad terapéutica tras un IM (Yin M et al., Metforinin improves cardiac function in a nondiabetic rat model of post-MI heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011; Bhamra GS et al., Metfonnin protects the ischemic heart by the Akt-mediated inhibition of mitochondrial permeability transition pore opening. Basic Res Cardiol. 2008; Calvert JW et al., Acute metfonnin therapy confers cardioprotection against myocardial infarction via AMPK-eNOS-mediated signaling. Diabetes. 2008,Paiva M et al., Metfonnin prevents myocardial reperfusion injury by activating the adenosine receptor. J Cardiovasc Pharmacol. 2009; Gundewar S. et al., Activation of AMP-activated protein kinase by metformin improves left ventricular function and survival in heart failure. Circ Res. 2009). En efecto, Yin M. et a!, muestran como el tratamiento con metformina reduce el tamaño del IM en ratas tratadas con metformina (Figura 6B en Yin M et al., Metformin improves cardiac function in a nondiabetic rat
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model of post-MI heart failure. Ant J Physiol Heart Circ Physiol. 2011). Por tanto, se examinó si el efecto terapéutico de la metformina tras un 1M está relacionado con el sistema IL-33/ST2. Para ello analizamos la modulación espacio-temporal de la señalización IL-33/ST2 mediante RT-PCR cuantitativa y Western Blot con (+) y (-) metformina y (+) y (-) IM. Los niveles de expresión de IL- 33, ST2L y de ST2s aumentaron una semana después de provocar un IM y se mantuvieron elevados 4 semanas después, en comparación con el grupo sham (p<0.001) (Figura 1 A-C). La terapia de metformina se asoció con un incremento de IL-33 y una reducción de ST2L y de ST2s a nivel de ARNrn (Figura l A-C). Se obtuvieron resultados parecidos al evaluar los niveles de proteína 1L-33 y ST2s por WB (Figura 1, paneles D y E). En ausencia de IM, la terapia de metformina no cambió los niveles de expresión de ARNrn ni los niveles de proteína. Por tanto, parece que tras un IM. la metformina aumenta los niveles de IL33 y reduce los de ST2L y sST2.
2- Respuesta de los factores que actúan en trans Yyl y HDAC4 al IM y a la terapia de metformina.
Los niveles de expresión del factor de transcripción Yyl mostraron un aumento considerable tras 1 y 4 semanas de haber provocado un IM, de manera similar a los cambios de ST2s (Figura 2A). En efecto, los niveles de expresión de Yyl se correlacionaron positivamente con la expresión de ST2s (rs=0.362, p = 0.018). La terapia de metformina resultó en una reducción de los niveles de expresión de Yyl, al cabo de 4 semanas de haber inducido el IM y tras la prolongación del tratamiento con metformina hasta la semana 4 (p<0.001) (Figura 2A). El análisis del extracto proteico citosólico y nuclear de la zona infartada también mostró un aumento de la acumulación de proteína Yyl en el núcleo, en comparación con el grupo sham (p<0.001, Figura 2B). La administración de metformina también redujo significativamente los niveles de proteína Yyl en el núcleo (pcO.001). En ausencia de IM, la terapia de metformina no modificó la distribución de Yyl en comparación con el grupo sham. Por tanto, el efecto terapéutico de la metformina parece estar relacionado con una regulación de la expresión del factor de transcripción Yyl tras un IM.
Tal y como se muestra en la Figura 3A, no se observó un cambio significativo de HDAC4 a nivel de ARNrn tras un IM en comparación con el grupo sham. Sin embargo, la terapia de metformina indujo un aumento significativo de ARNrn HDAC4 al cabo de 1 semana. Este efecto fue mayor cuando el tiempo de tratamiento se prolongó hasta 4 semanas (p<0.001) (Figure 3A). Las ratas tratadas con metformina en ausencia de IM también mostraron niveles elevados de HDAC4 (p<0.001) en comparación con el grupo sham. Cuando se evaluaron los niveles de proteína HDAC4 al cabo de 4 semanas, los resultados fueron similares (Figura 3B). Para determinar el papel de I1DAC4 en la regulación de la actividad de Yyl, estudiamos los niveles de fosforilación y la distribución de HDAC4 en tejidos infartados (Figura 3C). El análisis por WB de los extractos proteicos citosólicos y nucleares mostraron un aumento en la acumulación de proteína HDAC4 fosforilada en ratas infartadas
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en el citosol (pcO.OOl). El tratamiento de metformina redujo significativamente estos niveles (p<0.001). En ausencia de IM, el tratamiento de metformina no alteró la distribución de HDAC4 fosforilada (Figura 3C). En conclusión, la reducción de la fosforilación de HDAC4 resultado de la administración de metformina induce la translocación de HDAC4 al núcleo, donde al actuar como compresor del factor de transcripción Yyl termina bloqueando la expresión del gen que codifica ST2s.
3- Yyl modula la expresión de ST2s.
Para evaluar si Yyl participa en la modulación de la expresión del gen codificante de ST2s, y para evaluar la implicación de HDAC4, utilizamos un modelo bioquímico de estrés celular. Los patrones de expresión génica resultantes se analizaron por RT-PCR cuantitativa y por WB. Como se muestra en la figura 4, y de manera similar a los resultados obtenidos con tejidos del VI infartados, el estrés biomecánico se asoció con un aumento de 1L-33 (pO.OOl), ST2s (pO.OOl), Yyl (p<0.0l) y no afectó a la expresión del ARNm HDAC4. La terapia de metformina no afectó a la 1L-33 pero redujo de manera significativa los niveles de expresión de ST2s (pO.OOl), Yyl (p<0.001) y aumentó los niveles de expresión del ARNm HDAC4 (p<0.001) (Figura 4 A-D). Se obtuvieron resultados similares al evaluar los niveles de proteína ST2s por WB (Figura 4E). Además, cuando estudiamos la distribución celular de HDAC4 fosforilada, los resultados fueron similares a los obtenidos en el modelo animal (Figura 4F). En ausencia de estrés biomecánico, la terapia de metformina no cambió los niveles citosólicos de la proteína fosfo-HDAC4.
Para evaluar si Yyl está implicado en la modulación de la expresión del gen que codifica ST2s, se utilizaron pequeños ARNs de interferencia (en inglés small interfering RNA, "siRNA") para silenciar Yyl. La eficiencia inhibitoria de siYyl sobre la expresión endógena de Yyl se verificó por RT-PCR cuantitativa, WB e immunofluorescencia por microscopía confocal (Figura 5). Como muestra la figura 5A, el aumento en la expresión del ARNm Yyl inducido por el estrés biomecánico (p<0.001) se bloqueó completamente al silenciar la expresión de Yyl utilizando un grupo de 4 siRNAs específicos (pO.OOl). El silenciamiento de Yyl no tuvo efecto en ausencia de estrés biomecánico. En un ensayo paralelo, descartamos la posibilidad de un efecto “off-targef’, al estudiar individualmente el efecto de cada siRNA sobre los niveles de expresión de los ARNms Yyl y ST2s. Como se muestra en la figura 6, los resultados fueron similares a los obtenidos cuando utilizamos un grupo de 4 siRNAs (Figura 5A). Como muestra la figura 5B, el estrés biomecánico aumentó la expresión de ST2s (p<0.001); sin embargo, en células donde la expresión de Yyl fue silenciada, el estrés biomecánico no resultó en un aumento de ST2s intracelular; y finalmente, el silenciamiento de Yyl en ausencia de daño no tuvo efecto en la expresión de ST2s, en comparación con el respectivo control. Se obtuvieron resultados parecidos cuando se evaluó el nivel de proteína ST2s por WB (Figura 5C). La expresión génica de ST2L no se vio alterada cuando Yyl endógeno se silenció (Figura 5D). Utilizando estos modelos de estrés celular, probamos la activación de Yyl, y la efectividad del silenciamiento génico por immunofluorescencia (Figura 5E). Un incremento en la
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tinción nuclear de Yyl en células bajo estrés biomecánico, en comparación con las condiciones control, corroboró que Yyl se activa en respuesta a estrés biomecánico. Imágenes representativas se muestran en la figura 5E; en este caso, el color violeta en imágenes superpuestas es coherente con la localización nuclear de Yyl. Un análisis de co-localización proporcionó un coeficiente de Pearson de 0.96 ± 0.04 y un coeficiente de Manders de 0.98 ± 0.02. De manera similar, el silenciamiento de Yyl endógeno previno este efecto mediado por estrés biomecánico.
En conclusión, el bloqueo de la expresión de ST2s tras el silenciamiento del factor de transcripción YYI, demuestra que Yyl está implicado en la modulación de la expresión de la isoforma ST2s.
SEO ID 1
YYI (Homo sapiens, humans)
>NC_000014.9:100238765-100279034 Homo sapiens chromosome 14, GRCh38.p7 gene="YYI"
gene_synonym="DELTA; INO80S; NF-E1; UCRBP; YIN-YANG-1" mRNA join(l..1159,23540..23702,35934..35994,37726..37884,
38654..40270)
product=”YYl transcription factor"
5'- AGGGCGAACGGGCGAGTGGCAGCGAGGCGGGGCGGGCTGAGGCCAGCGCGGAAGTCTCGCGAGGCCGGGC
CCGAGCAGAGTGTGGCGGCGGCGGCGAGATCTGGGCTCGGGTTGAGGAGTTGGTATTTGTGTGGAAGGAG
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CCTAATGAGGTTACTGGCAGTCAAAATTAAAAAAAAAGGAACTTATACTACCTTCATCTGATATTAATTC
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GGGCAACATAGTGAGACCTTGTCTCCACAGAAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCAGGCATGGTGGCA
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GACTCCCAATATAGCCAGATCCTAATTCTTGGAACCTGTGGGTGTTAACCTTATTTGCAAGTGTGATTAA
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