ES2637280T3 - Aumento de la disponibilidad de NADPH para la producción de metionina - Google Patents

Aumento de la disponibilidad de NADPH para la producción de metionina Download PDF

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Perrine Vasseur
Cédric BOISART
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Abstract

Un microorganismo modificado para una producción mejorada de metionina, en donde un microorganismo de la familia de Enterobacteriaceae optimizado para la producción de metionina se modifica para potenciar la actividad de la transhidrogenasa de PntAB por sobreexpresión de los genes que codifican PntAB.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
c. la actividad de serina hidroximetiltransferasa, GlyA sobreexpresando la actividad del gen glyA de metiltransferasa, MetH o MetE sobreexpresando el gen metH o metE.
En otra realización preferida de la invención, el microorganismo de la familia Enterobacteriaceae optimizado para la producción de metionina se modifica para mejorar la actividad de la transhidrogenasa de PntAB por sobreexpresión
5 de los genes que codifican PntAB, para atenuar la actividad de transhidrogenasa UdhA eliminando el gen que codifica UdhA y para incrementar el metabolismo de un carbono potenciando por lo menos una de las siguientes actividades:
a. la actividad de metilentetrahidrofolato reductasa, MetF sobreexpresando el gen metF y/u optimizando su
traducción al sobreexpresar el gen metF bajo el control del promotor fuerte que pertenece a los promotores de la 10 familia Ptrc.
b. la actividad del complejo de escisión de glicina, GcvTHP y Lpd sobreexpresando el gen gcvTHP y el gen lpd
c.
la actividad de serina hidroximetiltransferasa, GlyA sobreexpresando el gen glyA
d.
la actividad de metiltransferasa, MetH o MetE sobreexpresando el gen metH o metE.
15 Optimización de la vía de biosíntesis de metionina:
Como se indicó anteriormente, el microorganismo modificado utilizado en la presente invención puede comprender otras modificaciones en la producción de NADPH disponible y del metabolismo C1, modificaciones para una mejor producción de metionina.
Los genes implicados en la producción de metionina en un microorganismo se conocen en la técnica, y comprenden
20 genes implicados en la vía de biosíntesis específica de metionina además de genes implicados en las vías que proporcionan los precursores y genes implicados en las vías de consumo de metionina.
La producción eficiente de metionina requiere la optimización de la vía específica de metionina y varias vías que proporcionan los precursores. Las cepas que producen metionina se han descrito en las solicitudes de patente WO2005/111202, WO2007/077041 y WO2009/043803.
25 La solicitud de patente WO2005/111202 describe una cepa productora de metionina que sobreexpresa alelos de homoserina succiniltransferasa con sensibilidad de retroalimentación reducida a sus inhibidores SAM y metionina. Esta solicitud describe también la combinación de estos alelos con una eliminación del represor de metionina MetJ responsable de la reducción del regulón de metionina. Además, la solicitud describe combinaciones de las dos modificaciones con la sobreexpresión de aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa.
30 Para mejorar la producción de metionina, el microorganismo puede exhibir:
 una mayor expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste en:
 cysU que codifica un componente del transportador de sulfato ABC, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 cysW que codifica una proteína de transporte de sulfato unida a una membrana, como se describe 35 en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 cysA que codifica una sulfato permeasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 cysM que codifica una O-acetil serina sulfhidralasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
40  cysI and cysJ que codifican respectivamente las subunidades alfa y beta de una sulfito reductasa descrita en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803. Preferiblemente cysI y cysJ se sobreexpresan juntos,
 cysH que codifica una adenilsulfato reductasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
45  cysE que codifica una serina aciltransferasa, como se describe en el documento WO2007/077041,
 serA que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 serB que codifica una fosfoserina fosfatasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
5  serC que codifica una fosfoserina aminotransferasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 alelos de metA que codifican una homoserina succinoltransferasa con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina como se describe en el documento WO2005/111202,
10  alelos de thrA o thrA que codifican aspartocinasas/homoserina deshidrogenasa con inhibición de retroalimentación reducida a treonina, como se describe en el documento WO2009/043803 y en el documento WO2005/111202,
 o una inhibición de la expresión de por lo menos uno de los siguientes genes:
 pykA que codifica una piruvato cinasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el 15 documento WO2009/043803,
 pykF que codifica una piruvato cinasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
 purU que codifica una formiltetrahidrofolato desformilasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803.
20  yncA que codifica una N-acetiltransferasa, como se describe en el documento WO 2010/020681
 metJ que codifica un represor de la vía de biosíntesis de metionina, como se describe en el documento WO2005/111202.
En una realización específica de la invención, los genes pueden estar bajo el control de un promotor inducible. La solicitud de patente PCT/FR2009/052520 describe una cepa que produce metionina que expresa el alelo thrA con
25 inhibición de la retroalimentación reducida a treonina y cysE bajo el control de un promotor inducible. En particular, el gen o el alelo thrA está bajo el control de un promotor inducible de temperatura. En una realización más preferida, el promotor inducible de temperatura utilizado pertenece a la familia de promotores PR.
En una realización preferida de la invención, se potencia la actividad de la piruvato carboxilasa. Aumentar la actividad de la piruvato carboxilasa se obtiene sobreexpresando el correspondiente gen o modificando la secuencia 30 nucleica de este gen para expresar una enzima con actividad mejorada. En particular, el gen pyc se introduce en el cromosoma en una o varias copias por recombinación o es portado por un plásmido presente en por lo menos una copia en el microorganismo modificado. El gen pyc se origina de las especies Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis o Corynebacterium En particular, los genes sobreexpresados están en su posición nativa en el cromosoma, o se integran en una posición no nativa. Para una producción de metionina
35 óptima, se pueden requerir varias copias del gen, y estas múltiples copias se integran en locus específicos, cuya modificación no tiene un impacto negativo en la producción de metionina.
Los ejemplos para locus en los que se puede integrar un gen, sin alterar el metabolismo de la célula, son:
Locus
número acceso de función
aaaD
87081759 imagen6 Pseudogén, homólogo de fago terminasa proteína A, fragmento N-terminal
aaaE
1787395 imagen7 Pseudogén homólogo de fago terminasa proteína A, fragmento C-terminal
afuB
1786458 imagen8 Pesudogén permeasa del transportador de la familia ABC férrica; fragmento C-terminal
afuC
87081709 imagen9 pronosticó la subunidad del transportador ABC férrico (componente de unión a ATP)
Locus
número acceso de función
agaA
48994927 imagen10 Pseudogén, fragmento C-terminal, GalNAc-6-P desacetilasa
agaW
1789522 imagen11 Pseudogén, fragmento N-terminal, sistema PTS EIICGalNAc
alpA
1788977 imagen12 proteasa
appY
1786776 imagen13 activador de transcripción de unión al ADN
argF
1786469 imagen14 ornitina carbamoiltransferasa
argU
ninguno imagen15 arginina ARNt
argW
ninguno imagen16 Arginina ARNt (CCU) 5
arpB
87081959 imagen17 Reconstrucción del pseudogén, repeticiones de anquirina
arrD
1786768 imagen18 lisozoma
arrQ
1787836 imagen19 Homólogo de la proteína R del lisozoma del fago lambda
arsB
87082277 imagen20 transportador de arsenita
arsC
1789918 imagen21 arsenato reductasa
arsR
1789916 imagen22 represor de transcripción de unión al ADN
beeE
1787397 imagen23 Pseudogén, fragmento N-terminal, proteína portal
borD
1786770 imagen24 homólogo de la proteína bacteriófago lambda Bor
cohE
1787391 imagen25 Represor tipo CI
croE
87081841 imagen26 Represor tipo Cro
cspB
1787839 imagen27 Proteína de choque frío
cspF
1787840 imagen28 Homólogo de la proteína de choque frío
cspI
1787834 imagen29 Proteína de choque frío
cybC
1790684 imagen30 Pseudogén, fragmento N-terminal, citocromo b562
dicA
1787853 imagen31 Regulador de dicB
dicB
1787857 imagen32 Control de la división celular
dicC
1787852 imagen33 Regulador de dicB
dicF
ninguno imagen34 DicF ARN antisentido
Locus
número acceso de función
eaeH
1786488 imagen35 Pseudogén, homólogo de intimin
efeU
87081821 imagen36 Reconstrucción del pseudogén, permeasa de hierro ferrosa
emrE
1786755 imagen37 bomba resistente a múltiples fármacos
essD
1786767 imagen38 proteína de lisis de fagos pronosticada
essQ
87081934 imagen39 Homólogo de la proteína de lisis del fago lambda S
exoD
1786750 imagen40 Pseudogén, fragmento de exonucleasa C-terminal
eyeA
ninguno imagen41 ARNs nuevo, función desconocida
flu
48994897 imagen42 Anígeno 43
flxA
1787849 imagen43 Desconocida
gapC
87081902 imagen44 Reconstrucción del pseudogén, GAP deshidrogenasa
gatR
87082039 imagen45 Reconstrucción del pseudogén, represor del operón gat
glvC
1790116 imagen46 Reconstrucción del pseudogén
glvG
1790115 imagen47 Reconstrucción del pseudogén, 6-fosfo-beta-glucosidasa
gnsB
87081932 imagen48 Supresor de múltiples copias de secG(Cs) y fabA6(Ts)
gtrA
1788691 imagen49 Glucosa translocasa unida a bactoprenol
gtrB
1788692 imagen50 Bactoprenol glucosil transferasa
gtrS
1788693 imagen51 glucosil transferasa
hokD
1787845 imagen52 Polipéptido tóxido de membrana pequeña
icd
1787381 imagen53 Isocitrato deshidrogenasa
icdC
87081844 imagen54 Pseudogén
ilvG
87082328 imagen55 Reconstrucción del pseudogén, ácido acetohidroxi sintasa II
insA
1786204 imagen56 ge IS1, función de transposición
insA
1786204 imagen57 gen IS1, función de transposición
insB
1786203 imagen58 transposasa de secuencia de inserción IS1
insB
1786203 imagen59 transposasa de secuencia de inserción IS1
Locus
número acceso de función
insC
1786557 imagen60 gen IS2, función de transposición
insD
1786558 imagen61 gen IS2, función de transposición
insD
1786558 imagen62 gen IS2, función de transposición
insE
1786489 imagen63 gen IS3, función de transposición
insF
1786490 imagen64 gen IS3, función de transposición
insH
1786453 imagen65 gen IS5, función de transposición
insH
1786453 imagen66 gen IS5, función de transposición
insH
1786453 imagen67 gen IS5, función de transposición
insI
1786450 imagen68 gen IS30, función de transposición
insI(1)
1786450 imagen69 gen IS30, función de transposición
insM
87082409 imagen70 Pseudogén, IS600 transposasa truncada
insN
1786449 imagen71 Reconstrucción del pseudogén, IS911 transposasa ORFAB
insO
ninguno imagen72 Reconstrucción del pseudogén, IS911 transposasa ORFAB
insX
87081710 imagen73 Pseudogén, transposasa de la familia IS3, fragmento N-terminal
insZ
1787491 imagen74 Reconstrucción del pseudogén, familia de IS4 transposasa, en ISZ'
intA
1788974 imagen75 Gen de integrasa
intB
1790722 imagen76 Reconstrucción del pseudogén, integrasa de tipo P4
intD
1786748 imagen77 integrasa pronosticada
intE
1787386 imagen78 e14 integrasa
intF
2367104 imagen79 fago integrasa pronosticada
intG
1788246 imagen80 Pseudogén, homólogo de integrasa
intK
1787850 imagen81 Pseudogén, fragmento de integrasa
intQ
1787861 imagen82 Pseudogén, fragmento de integrasa
intR
1787607 imagen83 Gen de integrasa
Locus
número acceso de función
intS
1788690 imagen84 Integrasa
intZ
1788783 imagen85 Gen putativo de integrasa
isrC
ninguno imagen86 Nuevo ARNs, función desconocida
jayE
87081842 imagen87 Pseudogén, fragmento C-terminal, placa base
kilR
87081884 imagen88 Función de inactivación del profago Rac
lafU
ninguno imagen89 Pseudogén, fragmento de proteína motora flagelar lateral
1fhA
87081703 imagen90 Pseudogén, fragmento de la proteína de ensamblaje flagelar lateral
lit
1787385 imagen91 Peptidasa de muerte celular
imagen92
imagen93 imagen94 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de lom; membrana externa
lomR
1787632 imagen95 proteína interrumpida por IS5Y, término N ausente
malS
1789995 imagen96 α-amilasa
mcrA
1787406 imagen97 proteína de unión a AND específica de 5-metilcitosina
mdtQ
87082057 imagen98 Reconstrucción del pseudogén, familia OMF de la bomba del fármaco de lipoproteína
melB
1790561 imagen99 melibiosa permeasa
mmuM
1786456 imagen100 homocisteína metiltransferasa
mmuP
870811708 imagen101 S-metilmetionina permeasa
mokA
ninguno imagen102 Pseudogén, péptido regulador de superposición, permite hokB
ninE
1786760 imagen103 desconocida
nmpC
1786765 imagen104 Reconstrucción del pseudogén, OM porina, interrumpida por IS5B
nohD
1786773 imagen105 Proteína de empaque de AND
nohQ
1787830 imagen106 Pseudogén, homólogo del fago lambda Nul, familia de la pequeña subunidad terminasa , proteína de empaque putativa
ogrK
1788398 imagen107 Regulador positivo del crecimiento de P2
ompT
1786777 imagen108 proteasa de la membrana externa VII
oweE
ninguno imagen109 Pseudogén, homólogo O de la proteína de replicación lambda
Locus
número acceso de función
oweS
1788700 imagen110 Pseudogén, homólogo O de la proteína de replicación lambda
pauD
ninguno imagen111 pseudogén argU, sitio de sujeción del profago DLP12
pawZ
ninguno imagen112 sitio de sujeción del profago CPS-53 attR, pseudogén argW
pbl
87082169 imagen113 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de pilT
peaD
87081754 imagen114 Pseudogén, familia P de proteína de replicación fago lambda; fragmento C-terminal
perR
1786448 imagen115 porin de membrana exterior del regulador de transcripción de unión a ADN de poli-β-1,6-Nacetil-D-glucosamina
pgaA
1787261 imagen116 vía de biosíntesis (PGA)
pgaB
1787260 imagen117 PGA N-desacetilasa
pgaC
1787259 imagen118 UDP-N-acetil-D-glucosamina β-1,6-N-acetil-D-glucosaminil transferasa
pgaD
1787258 imagen119 proteína de membrana interna pronosticada
phnE
87082370 imagen120 Reconstrucción del pseudogén, fosfonato permeasa
pinE
1787404 imagen121 ADN invertasa
pinH
1789002 imagen122 Pseudogén, ADN invertasa, recombinación específica del sito
pinQ
1787827 imagen123 ADN invertasa
pinR
1787638 imagen124 ADN invertasa
prfH
1786431 imagen125 Pseudogén, homólogo del factor de liberación de proteínas
psaA
ninguno imagen126 pseudogén ssrA, duplicación del sitio de sujeción de CP4-57
ptwF
ninguno imagen127 pseudogén thrW, sitio de sujeción del profago CP4-6
quuD
1786763 imagen128 proteína de antiterminación pronosticada
quuQ
87081935 imagen129 Homólogo de la proteína de antiterminación de lambda Q
racC
1787614 imagen130 Desconocido
racR
1787619 imagen131 Supresor del profago de Rac, de tipo cI
ralR
1787610 imagen132 Gen de alivio de restricción
rbsA
1790190 imagen133 Subunidad del transportador de D-ribosa ABC (componente de unión a ATP)
Locus
número acceso de función
rbsD
87082327 imagen134 D-ribosa piranasa
recE
1787612 imagen135 RecET recombinasa
recT
1787611 imagen136 RecET recombinasa
relB
1787847 imagen137 Antitoxina para RelE
relE
1787846 imagen138 ARN endorribonucleasa específica de secuencias
rem
1787844 imagen139 desconocido
renD
87081755 imagen140 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de lambda ren, ininterrumpido por IS3C; activador putativo de transcripción de lit
rhsE
1787728 imagen141 Pseudogén, familia rhs, codificado dentro de la repetición de RhsE
rnlA
1788983 imagen142 RNase LS, endorribonucleasa
rph
1790074 imagen143 Reconstrucción del pseudogén, RNase PH
rusA
1786762 imagen144 Endonucleasa
rzoD
87081757 imagen145 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
rzoQ
ninguno imagen146 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
rzoR
87081890 imagen147 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
rzpD
1786769 imagen148 Mureína endopeptidasa pronosticada
rzpQ
1787835 imagen149 equivalente de tipo Rz
rzpR
87081889 imagen150 Pseudogén, homólogo de Rz
sieB
87081885 imagen151 Proteína de exclusión de superinfecciones
sokA
ninguno imagen152 Pseudogén, traducción de ARNs antisentido bloqueante de mokA/hokA
stfE
87081843 imagen153 Cassette variable de Stf C-terminal, proteína de especificidad virión-hospedante alternativa; dominio Tail Collar, pseudogén
stfP
1787400 imagen154 Proteína de la fibra terminal pronosticada
stfR
87081892 imagen155 Proteína de la fibra terminal lateral
tfaD
87081759 imagen156 Pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento C
tfaE
1787402 imagen157 Gen de ensamblaje de la fibra terminal pronosticada
Locus
número acceso de función
tfaP
1787401 imagen158 Gen de ensamblaje de la fibra terminal pronosticada
tfaQ
2367120 imagen159 Homólogo del gen de ensamblaje de la fibra terminal del fago lambda
tfaR
1787637 imagen160 Homólogo del gen de ensamblaje de la fibra terminal del fago lambda
tfaS
87082088 imagen161 Pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento C-terminal
tfaX
2367110 imagen162 Reconstrucción del pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento Cterminal
thrW
ninguno imagen163 treonina ARNt (sitio de sujeción del profago CP4-6)
torI
87082092 imagen164 CPS-53/KpLE1 excisionasa
treB
2367362 imagen165 subunidad de trehalosa PTS permeasa (dominios IIB/IIC)
treC
1790687 imagen166 trehalosa-6-fosfato hidrolasa
trkG
1787626 imagen167 Permeasa de absorción de K+ constitutiva principal
ttcA
1787607 imagen168 Gen de integrasa
ttcC
ninguno imagen169 Pseudogén, duplicación de ttcA del sitio de integración del profago Rac
uidB
1787902 imagen170 Glucurónido permeasa, mutante puntual inactivo
uxaA
1789475 imagen171 altronato hidrolasa
uxaC
2367192 imagen172 uronato isomerasa
wbbL
1788343 imagen173 Reconstrucción de pseudogén, rhamnosil transferasa
wcaM
1788356 imagen174 proteína de biosíntesis de ácido colánico pronosticada
imagen175
imagen176 Pseudogén, fragmento de excisionasa en profago defectuoso
xisD
ninguno imagen177 DLP12
xisE
1787387 imagen178 e14 excisionasa
yabP
1786242 imagen179 Reconstrucción del pseudogén
yafF
87081701 imagen180 Pseudogén, fragmento C-terminal, proteína asociada a la repetición de H
yafU
1786411 imagen181 Pseudogén, fragmento C-terminal
yafW
1786440 imagen182 antitoxina del sistema YkfI-YafW toxina-antitoxina
Locus
número acceso de función
yafX
1786442 imagen183 desconocido
yafY
1786445 imagen184 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado, lipoproteína de membrana interna
yafZ
87081705 imagen185 desconocido
yagA
1786462 imagen186 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado
yagB
87081711 imagen187 Pseudogén, fragmento N-terminal relacionado a la antitoxina
yagE
1786463 imagen188 liasa/sintasa pronosticada
yagF
1786464 imagen189 deshidratasa pronosticada
yagG
1786466 imagen190 symporter de azúcar putativo
yagH
1786467 imagen191 β-xilosidasa putativa
yagI
1786468 imagen192 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado
yagJ
1786472 imagen193 desconocido
yagK
1786473 imagen194 desconocido
yagL
1786474 imagen195 proteína de unión al ADN
yagM
2367101 imagen196 desconocido
yagN
2367102 imagen197 desconocido
yagP
1786476 imagen198 Pseudogén, familia LysR, fragmento
yaiT
1786569 imagen199 Reconstrucción del pseudogén, familia del autotransportador
yaiX
87082443 imagen200 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS2A
ybbD
1786709 imagen201 Reconstrucción del pseudogén, familia conservada nueva
ybcK
1786756 imagen202 recombinasa pronosticada
ybcL
1786757 imagen203 inhibidor de cinasa pronosticada
ybcM
1786758 imagen204 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticada
ybcN
1786759 imagen205 proteína de rotación de base de ADN
ybcO
1786761 imagen206 desconocido
Locus
número acceso de función
ybcV
87081758 imagen207 desconocido
ybcW
1786772 imagen208 desconocido
ybcY
48994878 imagen209 Reconstrucción del pseudogén, familia metiltransferasa
ybeM
1786843 imagen210 Reconstrucción del pseudogén, CN hidrolasa putativa
ybfG
87081771 imagen211 Reconstrucción del pseudogén, nueva familia conservada
ybfI
ninguno imagen212 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de KdpE
ybfL
87081775 imagen213 Reconstrucción del pseudogén, proteína asociada a la repetición H
ybfO
1786921 imagen214 Pseudogén, copia del núcleo Rhs con extensión única
ycgH
87081847 imagen215 Reconstrucción del pseudogén
ycgI
1787421 imagen216 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
ycjV
1787577 imagen217 Reconstrucción del pseudogén, parálogo malK
ydaC
1787609 imagen218 desconocido
ydaE
87081883 imagen219 Metalotioneína
ydaF
87081886 imagen220 desconocido
ydaG
87081887 imagen221 desconocido
ydaQ
87081882 imagen222 Excisionasa putativa
ydaS
1787620 imagen223 desconocido
ydaT
1787621 imagen224 desconocido
ydaU
1787622 imagen225 desconocido
ydaV
1787623 imagen226 desconocido
ydaW
87081888 imagen227 Pseudogén, fragmento N-terminal
ydaY
1787629 imagen228 pseudogén
ydbA
87081898 imagen229 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
yddK
1787745 imagen230 Pseudogén, fragmento C, rico en leucina
yddL
1787746 imagen231 Pseudogén, familia de porin OmpCFN, fragmento N-terminal
Locus
número acceso de función
ydeT
1787782 imagen232 Pseudogén, familia FimD, fragmento C
ydfA
1787854 imagen233 desconocido
ydfB
87081937 imagen234 desconocido
ydfC
1787856 imagen235 desconocido
ydfD
1787858 imagen236 desconocido
ydfE
1787859 imagen237 Pseudogén, fragmento N-terminal
ydfJ
1787824 imagen238 Reconstrucción del pseudogén, familia MFS
ydfK
1787826 imagen239 Gen de choque frío
ydfO
87081931 imagen240 desconocido
ydfR
1787837 imagen241 desconocido
ydfU
87081936 imagen242 desconocido
ydfV
1787848 imagen243 desconocido
ydfX
1787851 imagen244 pseudogén
yedN
87082002 imagen245 Reconstrucción del pseudogén, familia IpaH/YopM
yedS
87082009 imagen246 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de la proteína de membrana externa
yeeH
ninguno imagen247 Pseudogén, fragmento interno
yeeL
87082016 imagen248 Reconstrucción del pseudogén, familia de glicosiltransferasa
yeeP
87082019 imagen249 Pseudogén, proteína de unión a GTP putativa
yeeR
87082020 imagen250 desconocido
yeeS
1788312 imagen251 desconocido
yeeT
1788313 imagen252 desconocido
imagen253
imagen254 Componente antitoxina del par de proteínas antitoxina YeeV
yeeU
1788314 imagen255 YeeU
yeeV
1788315 imagen256 Componente toxina del par de proteínas toxina-antitoxina YeeV-YeeU
yeeW
1788316 imagen257 pseudogén
Locus
número acceso de función
yegZ
ninguno imagen258 Pseudogén, proteína tipo fago P2 gpD D; fragmento C-terminal
yehH
87082046 imagen259 Reconstrucción del pseudogén
yehQ
87082050 imagen260 Reconstrucción del pseudogén
yejO
1788516 imagen261 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
yfaH
1788571 imagen262 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del fragmento C-terminal, LysR
yfaS
87082066 imagen263 Reconstrucción del pseudogén
yfcU
1788678 imagen264 Reconstrucción del pseudogén, familia FimD
yfdK
1788696 imagen265 desconocido
yfdL
1788697 imagen266 Pseudogén, proteína de la fibra terminal
yfdM
87082089 imagen267 Pseudogén, gen intacto que codifica una AND adenina metiltransferasa pronosticada
yfdN
1788699 imagen268 desconocido
yfdP
1788701 imagen269 desconocido
yfdQ
1788702 imagen270 desconocido
yfdR
87082090 imagen271 desconocido
yfdS
1788704 imagen272 desconocido
yfdT
1788705 imagen273 desconocido
yffL
1788784 imagen274 desconocido
yffM
1788785 imagen275 desconocido
yffN
1788786 imagen276 desconocido
yffO
1788787 imagen277 desconocido
yffP
1788788 imagen278 desconocido
yffQ
1788790 imagen279 desconocido
yffR
1788791 imagen280 desconocido
yffS
1788792 imagen281 desconocido
Locus
número acceso de función
yfjH
1788976 imagen282 desconocido
yfjI
1788978 imagen283 desconocido
yfjJ
1788979 imagen284 desconocido
yfjK
1788980 imagen285 desconocido
yfjL
1788981 imagen286 desconocido
yfjM
1788982 imagen287 desconocido
yfjO
87082140 imagen288 desconocido
yfjP
48994902 imagen289 desconocido
yfjQ
1788987 imagen290 desconocido
yfjR
1788988 imagen291 desconocido
yfjS
87082142 imagen292 desconocido
yfjT
1788990 imagen293 desconocido
yfjU
1788991 imagen294 pseudogén
yfjV
1788992 imagen295 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal de tipo arsB
yfjW
2367146 imagen296 desconocido
yfjX
1788996 imagen297 desconocido
yfjY
1788997 imagen298 desconocido
yfjZ
1788998 imagen299 Componente antitoxina de toxina putativa-antitoxina YpjF-YfjZ
ygaQ
1789007 imagen300 Reconstrucción del pseudogén, dominio relacionado con has alfa-amilasa
ygaY
1789035 imagen301 Reconstrucción del pseudogén, familia MFS
ygeF
2367169 imagen302 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remante
ygeK
87082170 imagen303 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
ygeN
1789221 imagen304 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de orgB
ygeO
1789223 imagen305 Pseudogén, homólogo de orgA, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
Locus
número acceso de función
ygeQ
1789226 imagen306 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
yghE
1789340 imagen307 Reconstrucción del pseudogén, familia de la proteína de secreción general
yghF
1789341 imagen308 Pseudogén, proteína de secreción general
yghO
1789354 imagen309 Pseudogén, fragmento C-terminal
yghX
1789373 imagen310 Reconstrucción del pseudogén, familia de S9 peptidasa
yhcE
1789611 imagen311 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS5R
yhdW
1789668 imagen312 Reconstrucción del pseudogén
yhiL
87082275 imagen313 Reconstrucción del pseudogén, regulado por FliA
yhiS
1789920 imagen314 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS5T
yhjQ
1789955 imagen315 Reconstrucción del pseudogén
yibJ
48994952 imagen316 Reconstrucción del pseudogén, familia de Rhs
yibS
ninguno imagen317 Reconstrucción del pseudogén, familia de Rhs, fragmento C-terminal
yibU
ninguno imagen318 Reconstrucción del pseudogén, proteína asociada a la repetición H
yibW
ninguno imagen319 Reconstrucción del pseudogén, unido a rhsA
yicT
ninguno imagen320 Pseudogén, fragmento N-terminal
yifN
2367279 imagen321 Reconstrucción del pseudogén
yjbI
1790471 imagen322 Reconstrucción del pseudogén
yjdQ
ninguno imagen323 Reconstrucción del pseudogén, integrasa de tipo P4 remanente
yjgX
1790726 imagen324 Reconstrucción del pseudogén, familia de EptAB
yjhD
87082406 imagen325 Pseudogén, fragmento C-terminal
yjhE
87082407 imagen326 Pseudogén, transportador putativo remanente
yjhR
1790762 imagen327 Reconstrucción del pseudogén, familia de helicasa, fragmento C-terminal
yjhV
1790738 imagen328 Pseudogén, fragmento C-terminal
yjhY
ninguno imagen329 Reconstrucción del pseudogén, nueva familia del dedo de zinc
yjhZ
ninguno imagen330 Reconstrucción del pseudogén, parálogo de rimK, fragmento C-terminal
Locus
número acceso de función
yjiP
1790795 imagen331 Reconstrucción del pseudogén, familia de transposasa
yjiT
87082428 imagen332 Pseudogén, fragmento N-terminal
yjiV
ninguno imagen333 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal de tipo helicasa
yjjN
87082432 imagen334 oxidorreductasa pronosticada
ykfA
87081706 imagen335 proteína de unión a GTP putativa
ykfB
1786444 imagen336 desconocido
ykfC
87081707 imagen337 Pseudogén, familia de transcriptasa inversa de tipo retrón, fragmento N-terminal
ykfF
1786443 imagen338 desconocido
ykfG
2367100 imagen339 desconocido
ykfH
87081704 imagen340 desconocido
ykfI
1786439 imagen341 toxina del sistema toxina-antitoxina YkfI-YafW
ykfJ
1786430 imagen342 Pseudogén, fragmento N-terminal
ykfK
1786445 imagen343 Pseudogén, fragmento N-terminal
ykfL
ninguno imagen344 Pseudogén, fragmento C-terminal
ykfN
ninguno imagen345 Pseudogén, remanente N-terminal, familia YdiA
ykgA
87081714 imagen346 Pseudogén, fragmento N-terminal, familia AraC
ykgP
ninguno imagen347 Pseudogén, fragmento oxidorreductasa
ykgQ
ninguno imagen348 Pseudogén, fragmento C-terminal de una deshidrogenasa putativa
ykgS
ninguno imagen349 Fragmento interno del pseudogén
ykiA
1786591 imagen350 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal
ylbE
1786730 imagen351 Reconstrucción del pseudogén, parálogo de yahG
ylbG
87081748 imagen352 Reconstrucción del pseudogén, fragmento N-terminal discontinuo
ylbH
1786708 imagen353 Pseudogén, copia del núcleo Rhs con extensión única
ylbI
ninguno imagen354 Pseudogén, fragmento interno, familia Rhs
ylcG
87081756 imagen355 desconocido
Locus
número acceso de función
ylcH
ninguno imagen356 desconocido
ylcI
ninguno imagen357 desconocido
ymdE
87081823 imagen358 Pseudogén, fragmento C-terminal
ymfD
1787383 imagen359 Metiltransferasa dependiente de SAM putativa
ymfE
1787384 imagen360 desconocido
ymfI
87081839 imagen361 desconocido
ymfJ
87081840 imagen362 desconocido
ymfL
1787393 imagen363 desconocido
ymfM
1787394 imagen364 desconocido
ymfQ
1787399 imagen365 Placa base o proteína de la fibra terminal putativa tt
ymfR
1787396 imagen366 desconocido
ymjC
ninguno imagen367 Pseudogén, fragmento N-terminal
ymjD
ninguno imagen368 Proteína remanente de fusión al pseudogén de eliminación expresado
ynaA
1787631 imagen369 Pseudogén, fragmento N-terminal
ynaE
1787639 imagen370 Gen de choque frío
ynaK
1787628 imagen371 desconocido
yncI
1787731 imagen372 Reconstrucción del pseudogén, asociado a la repetición H, unido a RhsE
yncK
ninguno imagen373 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de transposasa,
yneL
1787784 imagen374 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, familia AraC
yneO
1787788 imagen375 Reconstrucción del pseudogén, adhesión del autotransportador OM putativo
ynfN
87081933 imagen376 Gen de choque frío
ynfO
ninguno imagen377 desconocido
yoeA
87082018 imagen378 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS2F
yoeD
ninguno imagen379 Pseudogén, fragmento C-terminal de una transposasa putativa
yoeF
87082021 imagen380 Pseudogén, fragmento C-terminal
Locus
número acceso de función
yoeG
ninguno imagen381 pseudogén, fragmento N-terminal
yoeH
ninguno imagen382 pseudogén, fragmento C-terminal
ypdJ
87082091 imagen383 Pseudogén, fragmento de excisionasa
ypjC
1789003 imagen384 Reconstrucción del pseudogén
ypjF
1788999 imagen385 Componente de toxina del par toxina putativa-antitoxina YpjF-YfjZ
ypjI
ninguno imagen386 Reconstrucción del pseudogén
ypjJ
87082144 imagen387 desconocido
ypjK
87082141 imagen388 desconocido
yqfE
1789281 imagen389 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, familia de LysR
yqiG
48994919 imagen390 Reconstrucción del pseudogén, familia FimD, interrumpido por IS2I
yrdE
ninguno imagen391 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, parálogo de yedZ
yrdF
ninguno imagen392 Pseudogén, fragmento N-terminal
yrhA
87082266 imagen393 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS1E
yrhC
87082273 imagen394 Reconstrucción del pseudogén, fragmento N-terminal
ysaC
ninguno imagen395 Pseudogén, remanente C-terminal
ysaD
ninguno imagen396 Pseudogén, remanente de la secuencia interna
ytfA
1790650 imagen397 Pseudogén, fragmento C-terminal
yzgL
87082264 imagen398 Pseudogén, proteína de unión al soluto periplásmico putativa
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de metionina, que comprende las etapas de:
 cultivar un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae modificado para una producción mejorada de metionina en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una 5 fuente de nitrógeno, y
 recuperar la metionina o uno de sus derivados del medio de cultivo,
en donde dicho microorganismo se modifica para presentar una actividad de transhidrogenasa potenciada de PntAB por sobreexpresión de los genes que codifican PntAB.
• Condiciones de cultivo
10 Las expresiones "proceso fermentativo, 'cultivo' o 'fermentación" se emplean de modo intercambiable para indicar el crecimiento de bacterias en un medio de cultivo apropiado que contiene una fuente de carbono simple, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno.
imagen399
imagen400
 Se añade 1 ml de LB.  Se incuba 1 hora a 37°C con agitación.  Se centrifuga 3 min a 7000 rpm.  Se dispone en una placa de LB + Cm 30 µg/ml o Km 50 µg/ml o Gt 10µg/ml  Se incuba a 37°C durante la noche. Los transductores resistentes a antibióticos se seleccionaron luego y se verificó la estructura cromosómica del locus
mutado por análisis PCR con los cebadores apropiados que se enumeran en la Tabla 2. Tabla 1: Genotipos y números correspondientes de cepas intermedias y cepas productoras que aparecen en los siguientes ejemplos.
Número de cepa
Genotipo
1 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA
2 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE
3 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
4
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17
(comparativo)
metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
5 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA AmaIS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
6 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
7 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 metF::Km Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
8 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC:: TT02-serA-serC :: Gt ΔudhA ::Km
Número de cepa
Genotipo
9
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC:: TT02-serA-serC :: Gt Ptrc01-pntAB :: Cm ΔudhA ::Km
10 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC
11
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm
12
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
13
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE DpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA ::Km
14
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km
15
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::KmpCL1920PgapA-pycRe-TT07
16
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::ΔudhA
Número de cepa
Genotipo
17
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::Cm ΔudhA
18
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapApycRe-TT07
19
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::CmΔudhA
20
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::Cm ΔudhApCL1920-PgapApycRe-TT07
21
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB :: CmΔudhA
22
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapApycRe-TT07
23 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::Km
24 (comparativo)
MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01
Número cepa
de Genotipo
imagen401
thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycRe-TT07
Tabla 2: Cebadores utilizados para verificaciones PCR de las modificaciones cromosómicas anteriormente descritas 5
Nombre del gen
Nombre del cebador SEC ID N° Localización de la homología con la región cromosómica Secuencias
malS
Ome0826-malS-F 1 3734778-3734800 GGTATTCCACGGGATTTTTCGCG
Ome0827-malS-R
2 3738298-3738322 imagen402
pgaABCD
Ome 1691DpgaABCD_verif_F 11 1093002-1093020 GGGCTGATGCTGATTGAAC
Ome-1692DpgaABCD_verif_R
12 1084333-1084354 GTGTTACCGACGCCGTAAACGG
uxaCA
Ome 1612-uxaCA_R3 15 3238676-3238696 GGTGTGGTGGAAAATTCGTCG
Ome 1774-DuxaCA_F
16 3243726-3243707 GCATTACGATTGCCCATACC
CP4-6
Ome 1775-DCP4-6_verif_F 22 259527-259546 GCTCGCAGATGGTTGGCAAC
Ome 1776-DCP4-6_verif_R
23 297672-297691 TGGAGATGATGGGCTCAGGC
treBC
Ome 1595-DtreBverif_F 27 4464951-4464930 GTTGCCGAACATTTGGGAGTGC
Ome1596-DtreB verif_R
28 4462115-4462136 GGAGATCAGATTCACCACATCC
metF
Ome0726-PtrcmetF F 29 4130309-4130337 imagen403
Ome0727 PtrcmetF R
30 4130967-4130940 imagen404
udhA
Oag0055-udhAF2 33 4159070-4159053 GTGAATGAACGGTAACGC
Oag0056-udhAR2
34 4157088-4157107 GATGCTGGAAGATGGTCACT
pntAB
Ome1151-pntAF 37 1676137-1676118 CCACTATCACGGCTGAATCG
10
15
20
25
30
35
40
Nombre del gen
Nombre del cebador SEC ID N° Localización de la homología con la región cromosómica Secuencias
imagen405
Ome1152-pntAR 38 1675668-1675687 GTCCCAGGATTCAGTAACGC
wcaM
Ome1707-DwcaM verif_F 43 2115741-2115762 GCCGTTCAACACTGGCTGGACG
Ome1708DwcaM_verif_R
44 2110888-2110907 TGCCATTGCAGGTGCATCGC
I. Ejemplo 1 (comparativo): Construcción de la cepa 7, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF::Km Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC ::Gt
I.1. Construcción de la cepa 1
La cepa 1 que produce metionina (Tabla 1) se ha descrito en la solicitud de patente WO2007/077041.
I.2. Construcción de la cepa 2
El fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE se insertó en el locus malS en dos etapas. Primero, se construyó el plásmido pUC18-DmalS::TTadc-C1857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km y se introdujo en el cromosoma el segundo fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km que contenía secuencias en dirección 5’ y en dirección 3’ homólogas al locus malS. Posteriormente, se eliminó el cassette de resistencia de acuerdo con el Protocolo 1.
Todas las descripciones de las integraciones en los distintos locus en el cromosoma presentado a continuación siguen el mismo método; 1) construcción del vector de duplicación que contienen la secuencia homóloga en dirección 5’ y en dirección 3’ del locus de interés, el fragmento de ADN y un cassette de resistencia 2) construcción de cepa mínima (MG1655) que contiene la modificación cromosómica de interés y 3) transducción a la cepa del complejo (MG1655 que ya contiene varias modificaciones).
I.2.1. Construcción del plásmido pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km
El plásmido pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE deriva de los plásmidos pSCB-TTadc-cI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE y pUC18-ΔmalS::MCS::Km que se han descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520. En síntesis, el fragmento TTadc-cI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE digerido por ApaI/BamHI se clonó entre los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔmalS::MCS-Km. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km.
I.2.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km (pKD46)
Para reemplazar el gen malS por el fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km ADN, se digirió pUC18-DmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km por ScaI y EcoRV, y el fragmento digerido remanente TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km que contenía la secuencia en dirección 5’ y en dirección 3’ homóloga al locus malS se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1. Se seleccionaron los recombinantes resistentes a la kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km por PCR con los cebadores Ome 0826-malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km.
I.2.3. Transducción de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km en la cepa 1 y eliminación del cassette de resistencia
La modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km se transdujo en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km descrita anteriormente, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km por PCR con los cebadores Ome 0826
5
10
15
20
25
30
35
40
malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2). La cepa resultante posee el genotipo MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km. Finalmente, la resistencia a la kanamicina de la cepa anterior se eliminó de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida del cassette resistente a kanamicina se verificó por PCR usando los cebadores Ome 0826-malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)thrA*1-cysE se denominó cepa 2.
I.3. Construcción de la cepa 3
I.3.1. Construcción del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm
El plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm deriva de los plásmidos pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 y pUC18-ΔpgaABCD::TT02MCS::Cm que se describen a continuación.
Construcción del plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
El plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 deriva del plásmido pCL1920TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520.
Para construir el plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11, se amplió el plásmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 con los cebadores PR-RBS01_F (SEC ID N°3) y TTadc-pCL1920_R (SEC ID N°4). El producto de PCR se digirió por DpnI con el fin de eliminar el molde de ADN parental. El alerón cohesivo remanente se fosforiló y se introdujo en la cepa de E. coli para formar el plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11. El inserto de TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 y especialmente la presencia de la secuencia RBS01 en dirección 5’ del gen thrA se verificaron por secuenciación de ADN, usando los siguientes cebadores.
PR-RBS01_F (SEC ID N°3)
imagen406
con
 secuencia en letra mayúscula homóloga al promotor PR del bacteriófago lambda (PlambdaR*(-35), (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pág 145-148 ; Tsurimoto T, Hase T, Matsubara H, Matsubara K, Mol Gen Genet. 1982;187(1):79-86).
 secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente a la secuencia RBS01 con un sitio de restricción PsiI
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al extremo 5' de thrA (1-20)
imagen407
con
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del terminador de transcripción TTadc (terminador de transcripción del gen adc de Clostridium acetobutylicum, homólogo de 179847 a 179807 del megaplásmido pSLO1),.
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al plásmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
Construcción del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm
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Para construir el fragmento ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm, la región en dirección 5’ de pgaA (uppgaA), el terminador de transcripción TT02, el sitio de clonación múltiple (MCS) y la región en dirección 3’ de pgaD (downpgaD) se unieron por PCR. El cassette de cloranfenicol (Cm) se amplió posteriormente y se añadió al constructo previo.
Primero, se amplió uppgaA-TT02 de ADN genómico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1687ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5) y Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6) por PCR. Luego, el fragmento TT02-MCS-down-pgaD se amplió a partir del ADN genómico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7) y Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8) por PCR. Los cebadores Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6) y Ome 1689ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7) se diseñaron para superponerse en una región de 36 nucleótidos de longitud. Finalmente, el fragmento uppgaA-TT02-MCS-downpgaD se amplió mezclando los productos de ampliación uppgaA-TT02 y TT02-MCS-down-pgaD usando los cebadores Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5) y Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8). El producto de PCR de fusión resultante se digirió por HpaI y se clonó entre HindIII y EcoRI del plásmido pUC18 que se había tratado con el Fragmento Large (Klenow) de ADN Polimerasa I de E. coli. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS.
Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5)
CGTAGTTAACGAATTCGACTAGAAAGTATGTGAGCAACTATCGGCCCCCC con
 secuencia de letra mayúscula en negrita para el sitio de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pgaA en dirección 5’ (1092609-1092576, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6)
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con  secuencia en letra mayúscula en negrita para el sitio de restricción BstZ17I y extrabases,
o secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente al terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaA (1091829-1091851, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7)
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con
 secuencia en letra mayúscula en negrita complementaria a la secuencia del extremo 3' del terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9),  secuencia en letra mayúscula subrayada que contiene un sitio de clonación múltiple MCS: BstZ17I, HindIII,
PacI, ApaI, BamHI,  secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaD (1085325-1085304, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8)
CGTAGTTAACGAATTCAGCTGATATTCGCCACGGGC con  secuencia en letra mayúscula en negrita para los sitios de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaD (1084714-1084733, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Finalmente, los cebadores Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9) y Ome 1604-K7_Cm_ampl HindIII_R (SEC ID N°10) se usaron para ampliar el cassette de cloranfenicol y las secuencias FRT del plásmido 5 pKD3, y el fragmento se clonó entre los sitios BstZ17I y HindIII del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm.
Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Con
10 secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción BstZ17I y SmaI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula correspondiente al cebador del sitio 1 del plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
Ome 1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R (SEC ID N°10)
GCCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAG
15 con
 secuencia en letra mayúscula subrayada HindIII para el sitio de restricción y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula correspondiente al cebador del sitio 2 del plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Construcción de pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Cm
20 Para construir pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, ApaI/BamHI, se clonó el fragmento TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 aislado de pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito, entre los sitios ApaI y BamHI del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm anteriormente descrito. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE
25 PgapA-metA *11::Cm.
I.3.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11::Cm (pKD46)
Para reemplazar el operón pgaABCD por la región TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm, se digirió pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
30 por las enzimas de restricción SapI y AatII y el fragmento digerido remanente ΔpgaABCD:: TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con
35 los cebadores Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11) y Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm (pKD46).
I.3.3. Transducción de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA -metA*11::Cm en la cepa 2
40 La modificación cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm se transdujo a la cepa 2 (Tabla 1), previamente descrita, con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación
45 cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11) y Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF
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CCCACTGGCCTGTAATATGTTCGG, homólogo a la secuencia en dirección 3’ del locus uxaCA (3239021-3239044)
Ome 1516-uxaCA F2 (SEC ID N°18)
ATGCGATATCGACCGTATAAGCAGCAGAATAGGC con
 la secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción EcoRV y extra-bases
 secuencia en letra mayúscula en cursiva homóloga a la secuencia en dirección 5’ del locus uxaCA (3243425-3243402)
Luego, el producto de PCR resultante (obtenido con una ADN polimerasa de extremo romo) se digirió por la enzima de restricción EcoRV y se clonó en el sitio SmaI de pUC18. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km.
Construcción de pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Para construir pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km, el fragmento digerido de TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ApaI/BamH1 de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 previamente descrito se clonó en los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km precedentemente descritos. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA *11::Km
I.4.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 (pKD46)
Para reemplazar el operón uxaCA por la región TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Km, se digirió pUC18-ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km por BamHI y AhdI, y el fragmento digerido remanente ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11::Km se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a la kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km por PCR con los cebadores Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se designó MG1655 metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km (pKD46)
I.4.3. Transducción de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km en la cepa 3
La modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km se transdujo a la cepa 3 (Tabla 1), precedentemente descrita, con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
La modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km se verificó por PCR con Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Finalmente, los cassettes de cloranfenicol y resistentes a la kanamicina de la cepa anteriormente mencionada se eliminaron de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida de los cassettes de cloranfenicol y resistencia a kanamicina se verificaron por PCR con los cebadores Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11), Ome 1692DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12), Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 se denominó cepa 4.
I.5. Construcción de la cepa 5
I.5.1. Construcción del plásmido pMA-DCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thru *1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Plásmido pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km derivado de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito y pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km descrito a continuación.
Construcción del plásmido pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km
Primero se sintetizó pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS mediante GeneArt (http://www.geneart.com/). El fragmento ΔCP4-6::TT02-MCS se clonó en los sitios AscI y PacI del plásmido pMA de GeneArt y contiene la siguiente secuencia identificada como SEC ID N° 19:
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PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 se denominó cepa 5.
I.6. Construcción de la cepa 6
Para insertar la región TT02-serA-serC, que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa de E. coli y una fosfoserina
5 aminotransferasa, respectivamente, en el locus treBC, se empleó un método de dos etapas. Primero, se construyó el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt y luego el fragmento ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt que contiene las regiones en dirección 5’ y en dirección 3’ homólogas al locus treBC se recombinaron en el cromosoma de acuerdo con el Protocolo 1.
I.6.1. Construcción del plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
10 Plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt derivado de pMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gt descrito a continuación, p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág 2710-2715), y pUC18-serA-serC, que se ha descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520.
Primero, el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-MCS se sintetizó mediante GeneArt (http://www.geneart.com/). El fragmento ΔtreBC::TT02-MCS se clonó en los sitios AscI y PacI del plásmido pMA de GeneArt y que contiene la
15 siguiente secuencia, identificada como SEC ID N° 24:
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 letra minúscula correspondiente al sitio de restricción AscI  letra mayúscula subrayada homóloga a la secuencia en dirección 5’ del locus treBC (4460477-4461034).
o letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia del terminador de transcripción TT02
20 del terminador T1 del gen de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
o letra mayúscula en cursiva correspondiente a múltiples sitios de clonación que contienen los sitios de restricción BstZ17I, HindIII, ApaI, SmaI and BamH1
 letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del locus treBC (4464294-4464787) 25  letra minúscula en cursiva correspondiente al sitio de restricción PacI
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Para construir el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-MCS ::Gt, se amplió el cassette de resistencia FRT-Gt-FRT por PCR con los cebadores BstZ17I-FRT-Gt-F (SEC ID N°25) y HindIII-FRT-Gt-R (SEC ID N°26) usando p34S-Gm como molde.
BstZ17I-FRT-Gt-F (SEC ID N°25)
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con  secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SmaI y BstZ17I y extrabases,  secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.,
2000, PNAS, 97: 6640-6645)  secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del gen de gentamicina ubicado en p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág. 2710-2715). HindIII-FRT-Gt-R (SEC ID N°26)
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con
 secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción HindIII y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del gen de gentamicina ubicado en p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág. 2710-2715).
El producto FRT-Gt-FRT PCR se clonó luego entre los sitios BstZ17I y HindIII de pMA-ΔtreB::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt.
Para construir el plásmido final pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt, se digirió pUC18-serA-serC por HindIII y el fragmento digerido de serA-serC se clonó en pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt que se había linealizado por HindIII. El plásmido resultante se verificó por digestión y por secuenciación de ADN y se denominó pMA-ΔtreBC::TT02-serAserC::Gt
I.6.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
Para reemplazar el gen treBC por el fragmento TT02-serA-serC::Gt, se digirió pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt por ApaI y SalI, y el fragmento digerido remanente ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a gentamicina y se verificó la presencia del fragmento ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt por PCR con los cebadores Ome 1595-DtreB_verif_F (SEC ID N°27) y Ome 1596DtreB_verif_R (SEC ID N°28) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt.
I.6.3. Transducción de ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt en la cepa 5
La modificación cromosómica de ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se transdujo luego a la cepa 5 (Tabla 1) con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt anteriormente descrita, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a gentamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de DtreBC::TT02-serA-serC::Gt por PCR con Ome 1595-DtreB_verif_F (SEC ID N°27) y Ome 1596DtreB_verif_R (SEC ID N°28) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA
*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se denominó cepa 6.
I.7. Construcción de la cepa 7 por transducción de Ptrc36-metF::Km en la cepa 6
La sobreexpresión del gen metF a partir del promotor artificial integrado al locus metF en el cromosoma, la cepa 5 MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF::Km, se ha descrito en la solicitud de patente WO 2007/077041.
El constructo del promotor Ptrc36-metF::Km se transdujo a la cepa 6 (Tabla 1) con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF::Km de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina y se verificó la presencia del constructo del promotor Ptrc36-metF::Km por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID
10 N°30) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc36-metF::Km se denominó cepa 7.
15 II. Ejemplo 2: Construcción de la cepa 9, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km
20 II.1. Construcción de la cepa 8
II.1.1. Construcción de MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF por eliminación del cassette de resistencia a kanamicina
La resistencia a la kanamicina de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF::Km, descrita en la solicitud de patente WO2007/077041, se eliminó de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida del cassette resistente a kanamicina
25 se verificó por PCR usando los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R(SEC ID N°30) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF.
II.1.2. Construcción de MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF ΔudhA::Km pKD46
Para eliminar el gen udhA en la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF, se utilizó el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Ome0032-DUdhAF (SEC ID N°31) y Ome0034-DUdhAR (SEC ID N°32) para ampliar el
30 cassette de resistencia a la kanamicina del plásmido pKD4.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a kanamicina. La inserción del cassette de resistencia se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF ΔudhA::Km pKD46.
Ome0032-DUdhAF (SEC ID N°31)
imagen417
con:  secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen udhA (4158729-4158650, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)  secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al sitio del cebador 1 del plásmido pKD4 (Datsenko, K.A. & 40 Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) Ome0034-DUdhAR (SEC ID N°32)
imagen418
con
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen udhA (4157588-4157667, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
 secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al sito del cebador 2 del plásmido pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
5 II.1.3. Co-transducción de Ptrc36-metF ΔudhA:: Km a la cepa 6
Los genes udhA y metF están cercanos en el cromosoma de E. coli, 89,61 min y 89,03 min respectivamente y, dado que el fago P1 puede empaquetar 2 min del cromosoma de E. coli, los genes udhA y metF son co-transducibles. En consecuencia, la modificación del promotor Ptrc36-metF y la eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrito, se co-transdujeron a la cepa 6 (Tabla 1) usando un lisado del fago PI de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF
10 ΔudhA::Km pKD46, anteriormente descrito, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. La presencia de la modificación del promotor Ptrc36metF se verificó por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN. La presencia de la eliminación de DudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante
15 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt ΔudhA ::Km se denominó cepa 8.
20 II.2. Construcción de la cepa 9
II.2.1. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB::Cm
Para aumentar el nivel de expresión de piridina nucleótido transhidrogenasa y subunidades alfa y beta, PntA y PntB, un promotor trc01 constitutivo artificial se añadió en dirección 5’ del operón pntAB a la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Ome1149-Ptrc-pntAF (SEC ID
25 N°35) y Ome 1150-Ptrc-pntAR (SEC ID N°36) para ampliar el cassette de resistencia a cloranfenicol del plásmido pKD3. Se seleccionaron los recombinantes resistentes a cloranfenicol. La presencia del promotor artificial Ptrc01 y la inserción del cassette de resistencia se verificaron por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB:: Cm.
30 Ome 1149-Ptrc-pntAF (SEC ID N°35)
imagen419
con  secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1676002-1675941, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
35  secuencia en letra mayúscula subrayada para la secuencia del terminador de transcripción T7Te del fago T7 (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci EE. UU.. 2001 Abr 24;98(9):5019-24.),  secuencia en letra mayúscula en cursiva correspondiente al sitio del cebador 1 del plásmido pKD3
(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) Ome 1150-Ptrc-pntAR (SEC ID N°36)
imagen420
con  secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1675875-1675940, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) 43
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5
10
15
20
25
30
35
40
con  secuencia en letra mayúscula negrita para el sitio de restricción BstZ17I y extrabases,
o secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen wcaM (2113921-2113950, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/).
Ome 1705 (DwcaM-MCS-BstZ17I-F) (SEC ID N°41)
imagen422
con
 secuencia en letra mayúscula en negrita complementaria a la secuencia del extremo 3' del terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9),
 secuencia en letra mayúscula subrayada que contiene un sitio de clonación múltiple: BstZ17I, HindIII, PacI, ApaI, BamHI,
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen wcaM (2112496-2112525, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1706 (DwcaM-EcoRI-R) (SEC ID N°42)
CGTAGTTAACGAATTCCGCCCCTTCTTTCAGGTTGCGTAGGCCATAC
con
 secuencia en letra mayúscula en negrita para los sitios de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen wcaM (2111497-2111527, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Finalmente, los cebadores Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9) y Ome 1604K7_Cm_ampl_HindIII_R (SEC ID N°10), descritos anteriormente, se usaron para ampliar el cassette de cloranfenicol del plásmido pKD3. El cassette se clonó luego entre los sitios BstZ17I y HindIII del plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm.
III.1.2. Construcción del plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm
Para construir pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ApaIlBamHI se clonó el fragmento digerido de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito entre los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm anteriormente descritos. El plásmido obtenido se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
III.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Cm pKD46
Para reemplazar el gen wcaM por la región, TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, se digirió el plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por BspHI y el fragmento digerido remanente ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de acuerdo con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con los cebadores Ome1707-DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) y Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm (pKD46)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
III.3. Transducción de DwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm a la cepa 6 y eliminación del cassette de resistencia.
La modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm se transdujo a la cepa 6 (Tabla 1) anteriormente descrita con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm anteriormente descrita, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con Ome1707DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) y Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm.
Los cassettes de gentamicina y cloranfenicol de la cepa anterior se eliminaron luego de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida de los cassettes de gentamicina y cloranfenicol se verificó por PCR usando los cebadores Ome 1595DtreB_verif_F (SEC ID N°27) and Ome 1596-DtreB_verif_R (SEC ID N°28) y los Ome1707-DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) and Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2) respectivamente. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC se denominó cepa 10.
IV. Ejemplo 4 : Construcción de la cepa 12, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycre-TT07
IV.1. Construcción de la cepa 11 por transducción de Ptrc01-pntAB::Cm a la cepa 10
La modificación del promotor Ptrc01-pntAB::Cm anteriormente descrito se transdujo a la cepa 10 (Tabla 1) de conformidad con el Protocolo 2, usando un lisado del fago PI de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB::Cm anteriormente descrita.
Se seleccionaron los transductores resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de Ptrc01-pntAB::Cm por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm se denominó cepa 11.
IV.2. Construcción de pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 e introducción a la cepa 11
Con el fin de sobreexpresar el gen de piruvato carboxilasa de Rhizobium etli, se construyó el plásmido pCL1920PgapA-pycRe-TT07, que derivó del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 pág. 4631).
Para construir el inserto PgapA-pycRe-TT07, se empleó PCR de superposición entre el promotor gapA, su sitio de unión al ribosoma (RBS) y el gen pycRe de Rhizobium etli.
Primero, el promotor gapA y la región RBS (correspondiente a la región en dirección 5’ -156 a -1 del codón de inicio de gapA) se amplió a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 por PCR usando los cebadores PgapA-SalI-F (SEC ID N°45) y PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46). Después, el gen pycRe se amplió a partir de ADN genómico de Rhizobium etli CFN 42 usando los cebadores PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) y pycRe-TT07-SmaI-R (SEC ID N°48). Los cebadores PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46) y PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) se diseñaron para superponer una región de 42 nucleótidos de longitud. Finalmente, se amplió el fragmento PgapA-RBSgapA-pycRe-TT07 mezclando el promotor gapA-RBS y los amplicones pycRe usando los cebadores PgapA-SalI-F (SEC ID N°45) y pycRe-TT07
5
10
15
20
25
30
35
SmaI-R (SEC ID N°48).El producto resultante de la fusión PCR se clonó entre los sitios SalI y SmaI del plásmido pCL1920. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pCL1920-PgapA-pycRe-TT07.
PgapA-SalI-F (SEC ID N°45)
imagen423
 secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SalI, ClaI, HindIII y PmeI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga a la secuencia del promotor gapA (1860640-1860658, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46) GTATCTTGGATATGGGCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG con
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al promotor del gen gapA (1860772-1860791, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
 secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pycRe, excepto que el codón de inicio GTG del gen pycRe se reemplazó con ATG (4236889-4236906, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) CTAACAAATAGCTGGTGGAACATATGCCCATATCCAAGATAC con
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al promotor del gen gapA (1860772-1860791, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
 secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pycRe, excepto que el codón de inicio GTG del gen pycRe se reemplazó con ATG (4236889-4236906, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
pycRe-TT07-SmaI-R (SEC ID N°48)
imagen424
con
 secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SmaI, BamHI y EcoRI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula correspondiente a la secuencia del terminador de transcripción T7Te del fago T7 (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2001 Abr 24;98(9):5019-24.),
 secuencia en letra mayúscula cursiva para el sitio de restricción XhoI y extrabases,
 secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen pycRe (42403324240388, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Luego, se introdujo pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 por electroporación en la cepa 11 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 se denominó cepa 12.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
V. Ejemplo 5 : Construcción de la cepa 13, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA::Km
La eliminación de ΔudhA::Km descrita previamente se transdujo a la cepa 11 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF ΔudhA::Km pKD46 anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. Se verificó la presencia de la modificación del promotor Ptrc36-ARNmst17-metF por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN, y la presencia de la eliminación de ΔudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km se denominó cepa 13.
VI. Ejemplo 6 : Construcción de la cepa 14 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serAserC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA ::Km
Los genes udhA y metF están próximos en el cromosoma de E. coli, 89,61 min y 89,03 min respectivamente y, dado que el fago P1 puede empaquetar 2 min del cromosoma de E. coli, los genes udhA y metF son co-transducibles. En consecuencia, la modificación del promotor Ptrc36-metF y la eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrita, se co-transdujeron a la cepa 11 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36metF ΔudhA::Km pKD46, anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. La presencia de la modificación del promotor Ptrc36metF se verificó por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN. La presencia de la eliminación de ΔudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km se denominó cepa 14.
VII. Ejemplo 7 : Construcción de la cepa 15, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC ::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito se introdujo por electroporación en la cepa 13 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 15.
VIII. Ejemplo 8 : Construcción de la cepa 18, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1
imagen425
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5
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20
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45
X. Ejemplo 10 : Construcción de la cepa 22, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC ::TT02serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
X.1. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc55 pntAB::Cm
Para aumentar el nivel de expresión de las subunidades alfa y beta de piridina nucleótido transhidrogenasa, PntA y PntB, se añadió un promotor artificial constitutivo de trc55 en dirección 5’ del operón pntA-pntB en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (SEC ID N°51) y Ome 1150-Ptrc-pntAF (SEC ID N°36) para ampliar el cassette de resistencia a cloranfenicol del plásmido pKD3.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes al cloranfenicol. Se verificaron la presencia del promotor artificial trc55 y la inserción del cassette de resistencia por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 Ptr55-pntAB::Cm.
Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (SEC ID N°51)
imagen427
con
 secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1675875-1675940, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
 secuencia en letra mayúscula subrayada para la secuencia del promotor trc55
 secuencia en letra mayúscula cursiva correspondiente al sitio del cebador 2 del plásmido pKD3 (Datsenko,
K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
X.2. Transducción de Ptrc55 pntAB::Cm a la cepa 16
La modificación del promotor Ptrc55-pntAB::Cm se transdujo a la cepa 16 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc55-pntAB::Cm anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de Ptrc55-pntAB::Cm por PCR con Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2). La cepa verificada y seleccionada MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC::Gt Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA se denominó cepa 21.
X.3. Construcción de la cepa 22 por introducción de pCL1920-PgapA-pycre-TT07 en la cepa 21
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito, se introdujo por electroporación en la cepa 21 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, y la cepa resultante MG1655 metA*11 PtrcmetHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP46::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 22.
XI. Ejemplo 11 : Construcción de la cepa 24, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-C1857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1
5
10
15
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30
35
cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
XI.1. Construcción de la cepa 23 por transducción de ΔudhA::Km a la cepa 10
La eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrita se transdujo a la cepa 10 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF ΔudhA::Km pKD46 anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina. Se verificó la presencia de la modificación del promotor Ptrc36-ARNmst17-metF por PCR (los motivos se explican en el ejemplo 6) con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN, y se verificó la presencia de la eliminación de ΔudhA::Km por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC ΔudhA::Km se denominó cepa 23.
XI.2. Construcción de la cepa 24: introducción de pCL1920-PgapA-pycre-TT07 a la cepa 23
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito, se introdujo por electroporación en la cepa 23 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 24.
XII. Ejemplo 12: Producción de L-metionina por fermentación en matraces de agitación
La producción de cepas se evaluó en matraces Erlenmeyer pequeños. Se desarrolló un precultivo de 5,5 ml a 30°C durante 21 horas en un medio mixto (10% medio LB (Caldo LB Miller 25 g/l) con 2,5 g.l-1 glucosa y 90% medio mínimo PC1). Se usó para inocular un cultivo de 50 ml de medio PC1 hasta un valor OD600 de 0,2. Si fue necesario, se añadieron antibióticos en concentraciones de 50 mg.l-1 para kanamicina y espectinomicina, 30 mg.l-1 para cloranfenicol y 10 mg.l-1 para gentamicina. La temperatura del cultivo se mantuvo a 37°C durante dos horas, 42°C durante dos horas y luego 37°C hasta el final del cultivo. Cuando el cultivo había alcanzado un valor OD600 de 5 a 7, se cuantificaron los aminoácidos extracelulares por HPLC. Después de la derivación de OPA/Fmoc se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación. Para cada cepa, se efectuaron varias repeticiones.
Tabla 3: Composición en medio mínimo (PC1).
Compuesto
Concentración (g.l-1)
ZnSO4.7H2O
0,0040
CuCl2.2H2O
0,0020
MnSO4.H2O
0,0200
CoCl2.6H2O
0,0080
H3BO3
0,0010
Na2MoO4.2H2O
0,0004
MgSO4.7H2O
1,00
Ácido cítrico
6,00
Compuesto
Concentración (g.l-1)
CaCl2.2H2O
0,04
K2HPO4
8,00
Na2HPO4
2,00
(NH4)2HPO4
8,00
NH4Cl
0,13
NaOH 4M
Ajustado a pH 6,8
FeSO4.7H2O
0,04
Tiamina
0,01
Glucosa
15,00
Tiosulfato de amonio
5,60
Vitamina B12
0,01
MOPS
15,00
Tabla 4: Rendimiento de metionina (Ymet), en % g de metionina por g de glucosa producida en cultivo en lotes por las distintas cepas. Para la definición de rendimiento de metionina/glucosa, ver a continuación. SD indica la desviación estándar para los rendimientos que se calculó en base a varias repeticiones (N = número de repeticiones).
Cepa
Ymet SD
Cepa 7 N = 3 (comparativa)
7,27 0,12
Cepa 9 N = 6
9,94 0,90
Cepa 14 N = 6
10,25 0,51
Cepa 10 N = 110 (comparativa)
9,75 1,29
Cepa 13 N = 9
12,09 0,71
Cepa 15 N = 6
12,88 0,54
Cepa 24 N = 3
11,41 0,18
Cepa 12 N = 3
12,65 0,10
La concentración de metionina extracelular se cuantificó por HPLC después de la derivación de OPA/FMOC. La concentración de glucosa residual se analizó usando HPLC con detección refractomérica. El rendimiento de metionina se expresa de la siguiente manera:
imagen428
Como se puede observar en la tabla 4, el rendimiento de metionina/glucosa (Ymet) aumenta tras la sobreexpresión de pntAB y/o la eliminación de udhA (cepas 9 y 14 comparadas con la cepa 7, y cepas 12, 13, 15 y 24 comparadas con la cepa 10).
5 La mejora del rendimiento es incluso mejor tras las sobreexpresión fuerte del gen metF. La cepa 13 que contiene tanto una secuencia de estabilización de ARNm frente al gen de metF y la sobreexpresión de pntAB y la eliminación de udhA exhibe un rendimiento superior que la cepa 14 sin una sobreexpresión fuerte de la vía C1.
XIII. Ejemplo 13: Actividades de transhidrogenasa y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa
Los resultados descritos en el ejemplo 12, tabla 4 se confirmaron por análisis de las actividades de transhidrogenasa
10 y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa llevados a cabo por PntAB y MetF, respectivamente (Tabla 5). En los cultivos de matraces Erlenmeyer pequeños, ambas actividades aumentan tras la sobreexpresión.
Tabla 5: Las actividades de transhidrogenasa (TH, PntAB) y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR, MetF) se determinaron en las cepas anteriormente descritas y se exponen en mUI/mg de proteínas (N = número de cultivos de matraces Erlenmeyer independientes).
Cepa
TH MTHFR
Cepa 7 (N=3) (comparativa)
48 ± 2 8 ± 4
Cepa 9 (N=3)
802 ± 43 15 ± 5
Cepa 14 (N=3)
799 ± 75 5 ± 1
Cepa 10 (N=3) (comparativa)
36 ± 4 69 ± 3
Cepa 13 (N=9)
665 ± 35 94 ± 7
Cepa 15 (N=3)
629 ± 37 75 ± 8
Cepa 24 (N=3) (comparativa)
29 ± 4 ND
Cepa 12 (N=3)
582 ± 27 ND
15
Para la determinación in vitro de las actividades enzimáticas, se cultivaron cepas de E. coli en medio mínimo como se describió anteriormente. En el método de extracción precedente, las células se cosecharon a partir de caldo de cultivo por centrifugación. El sedimento se resuspendió en tampón de fosfato de potasio frío 20 mM (pH 7.2) y las células se lisaron por batido de esferas con un aparato Precellys (Bertin Technologies; 2x10s a 5000rpm, 2 minutos
20 entre las dos etapas) seguido de centrifugación a 12000g (4°C) durante 30 minutos. El sobrenadante se desaló y se usó para análisis. Se determinaron las concentraciones de proteínas usando reactivo de ensayo Bradford.
Se ensayaron las actividades de la transhidrogenasa (TH) como se describió previamente (Yamagushi y Stout, 2003). La actividad de la transhidrogenasa cíclica se ensayó de manera espectrofotométrica durante 30 minutos a 375nm en una mezcla de reacción a 37°C que contenía MES-KOH 50mM (pH 6,0), NADH 0,2 mM, AcPyAD 0,2 mM
25 con o sin NADPH 10 µM y 6 µg de extracto celular bruto. Todos los resultados son el promedio de por lo menos tres mediciones.
Se ensayaron las actividades de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) como se describió previamente (Matthews, 1986) con algunas modificaciones. El método se muestra en la ecuación (1).
(1) Metil-THF + Menadiona → Metileno-THF + Menadiol
30 Se usa metil-THF como el sustrato y la formación de metileno-THF se mide por descomposición de ácido de metileno-THF que produce formaldehído. El formaldehído producido reacciona con el NBDH indicador para formar
un derivado de hidrazona fluorescente a 530 nm. Se ensayó la actividad de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa durante 30 minutos a 37°C en una mezcla de reacción que contenía tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,7), EDTA 0,3 mM, 0,2 % (p/v) albúmina de suero bovino, disolución saturada de menadiona en 20% metanol/80% H2O y 20 µg de extracto celular bruto. Después de la incubación, la reacción finaliza por adición de tampón de acetato de
5 sodio (pH 4,7) y disponiendo el tubo en un bloque calentador a 100°C durante 2 minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos a 10000 g, el formaldehído producido se mide por adición de 0,001% NBDH en 95% etanol/6% ácido fosfórico con una lectora de microplacas de fluorescencia FLx800 (Biotek).
XIV. Ejemplo 14: Producción de L-metionina por fermentación en un biorreactor
Las cepas que produjeron cantidades sustanciales de metabolitos de interés se ensayaron prácticamente bajo las
10 condiciones de producción en fermentadores de 2,5 l (Pierre Guerin) usando una estrategia de lote alimentado (fedbatch).
En síntesis, se usó un cultivo de 24 horas desarrollado en 10 ml de medio LB con 2,5 g.l-1 glucosa para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (B1a). Estas incubaciones se llevaron a cabo en matraces muescados de 500 ml que contenían 50 ml de medio mínimo (B1a) en un agitador rotatorio (200 RPM). El primer cultivo se efectuó
15 a una temperatura de 30°C, el segundo a una temperatura de 34°C.
Se llevó a cabo un tercer precultivo en biorreactores (Sixfors) rellenos con 200 ml de medio mínimo (B1b) inoculado hasta una concentración de biomasas de 1,2 g.l-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura del precultivo se mantuvo constante a 34°C y el pH se ajustó automáticamente hasta un valor de 6,8 usando una disolución al 10% de NH4OH. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente hasta un valor de 30 % de la saturación 20 de aire parcial con suministro de aire y/o agitación. Después del agotamiento de la glucosa del medio del lote, se inició el lote alimentado con un caudal inicial de 0,7 ml.h-1, aumentado en forma exponencial durante 24 horas con un índice de crecimiento de 0,13 h-1 con el fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 18 g.l
1
.
Tabla 6: Composición en medio mineral de lotes de precultivo (B1a y B1b).
Compuesto
Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0130 0,0130
CuCl2.2H2O
0,0015 0,0015
MnCl2.4H2O
0,0150 0,0150
CoCl2.6H2O
0,0025 0,0025
H3BO3
0,0030 0,0030
Na2MoO4.2H2O
0,0025 0,0025
Citrato de Fe(III) H2O
0,1064 0,1064
EDTA
0,0084 0,0084
MgSO4.7H2O
1,00 1,00
CaCl2.2H2O
0,08 0,08
Ácido cítrico
1,70 1,70
KH2PO4
4,57 4,57
K2HPO4.3H2O
2,50 2,50
(NH4)2HPO4
1,10 1,10
(NH4)2SO4
4,90 4,90
(NH4)2S2O3
1,00 1,00
Tiamina
0,01 0,01
Vitamina B 12
0,01 0,01
Glucosa
30,00 5,00
Compuesto
Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
MOPS
30,00 0,00
NH4OH 28%
Ajustada hasta pH 6,8 Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 7: Composición del medio mineral del lote alimentado de precultivo (F1)
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.H2O
0,0104
CuCl2.2H2O
0,0012
MnCl2.4H2O
0,0120
CoCl2.6H2O
0,0020
H3BO3
0,0024
Na2MoO4.2H2O
0,0020
Citrato de Fe(III) H2O
0,0424
EDTA
0,0067
MgSO4
5,00
(NH4)2SO4
8,30
Na2SO4
8,90
(NH4)2S2O3
24,80
Tiamina
0,01
Glucosa
500,00
Vitamina B 12
0,01
NH4OH 28%
Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 8: Composición del medio mineral del lote de cultivo (B2).
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0130
CuCl2.2H2O
0,0015
MnCl2.4H2O
0,0150
CoCl2.6H2O
0,0025
H3BO3
0,0030
Na2MoO4.2H2O
0,0025
Citrato de Fe(III) H2O
0,1064
EDTA
0,0084
MgS2O3.6H2O
1,00
CaCl2.2H2O
0,08
Ácido cítrico
1,70
Compuesto
Concentración (g.l-1)
KH2PO4
2,97
K2HPO4.3H2O
1,65
(NH4)2HPO4
0,72
(NH4)2S2O3
3,74
Tiamina
0,01
Vitamina B12
0,01
Biotina
0,10
Glucosa
10
NH4OH 28%
Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 9: Composición del medio del lote alimentado de cultivo (F2)
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0104
CuCl2.2H2O
0,0012
MnCl2.4H2O
0,0120
CoCl2.6H2O
0,0020
H3BO3
0,0024
Na2MoO4.2H2O
0,0020
Citrato de Fe(III) H2O
0,0524
EDTA
0,0067
MgS2O3.6H2O
10,20
(NH4)2S2O3
55,50
Tiamina
0,01
Vitamina B 12
0,01
Biotina
0,10
Glucosa
500
Posteriormente, se llenaron fermentadores de 2,5 l (Pierre Guerin) con 600 ml de medio mineral (B2) y se inocularon 5 hasta una concentración de biomasa de 2,1 g.l-1 con un volumen de precultivo que osciló entre 55 y 70 ml.
La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37 °C y el pH se mantuvo al valor del tratamiento (6,8) por adición automática de disoluciones de NH4OH (NH4OH 10% durante 9 horas y NH4OH 28% hasta el final del cultivo). La velocidad de agitación inicial se estableció a 200 RPM durante la fase del lote y se aumentó hasta 1000 RPM durante la fase del lote alimentado. La tasa de flujo de aire inicial se fijó a 40 NL.h-1 durante la fase del lote y se
10 aumentó hasta 100 NL.h-1 al comienzo de la fase del lote alimentado. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferiblemente 30% de saturación aumentando la agitación.
Cuando la masa celular alcanzó una concentración cercana a 5 g.l-1, se inició el lote alimentado con un caudal inicial de 5 ml.h-1. La disolución de alimentación se inyectó a un perfil sigmoidal con un caudal en aumento que alcanzó 24 ml.h-1 después de 26 horas de crecimiento. Las condiciones precisas de alimentación se calcularon con la siguiente
ecuación:
imagen429
en donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 para un volumen de lote de 600 ml con p1 = 1,80, p2 = 22,40, p3 = 0,270, p4 = 6,5.
5 Después de 26 horas, la bomba de disolución de alimentación del lote alimentado se detuvo y el cultivo finalizó después del agotamiento de la glucosa.
Se cuantificaron aminoácidos extracelulares por HPLC después de la derivación de OPA/Fmoc, y se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación.
10 Tabla 10: Rendimiento máximo de metionina (Ymet max) en % g de metionina por g de glucosa producido en un cultivo de lote alimentado por las distintas cepas. Para la definición de rendimiento de metionina/glucosa, véase a continuación. SD indica la desviación estándar para los rendimientos que se calculó en base a varias repeticiones (N = número de repeticiones).
Cepa
Ymet max SD
Cepa 10* N=5 (comparativa)
16,94 0,86
Cepa 13* N=3
20,72 0,60
Cepa 12 N=2
22,39 0,46
Cepa 15 N=1
22,27 Nd
Cepa 22 N=1
23,68 Nd
Cepa 18 N=3
23,69 0,52
Cepa 20 N=1
22,57 Nd
* Las cepas 10 y 13 se cultivaron respectivamente con 49,1 y 55,5 g.l-1 de tiosulfato de amonio y con 5 g.l-1 de sulfato de magnesio en lugar de tiosulfato de sodio en el medio del lote alimentado. El medio del lote contenía 1 g.l-1 de sulfato de magnesio en lugar de tiosulfato de magnesio para las dos cepas.
15 Como se observó previamente en los experimentos en matraces, de la misma manera, en un biorreactor, el rendimiento de metionina/glucosa (Ymet max) aumenta tras la sobreexpresión de pntAB y la eliminación de udhA (comparar cepas 10 y 13 de la tabla 10).
Asimismo, demostramos que una regulación ajustada de sobreexpresión de pntAB mejoró la producción de metionina, como se puede observar con las cepas 12, 15, 18, 20 y 22 de la tabla 10 anterior. La producción de
20 metionina se modula por el nivel de expresión de los genes pntAB, y demostramos que es mejor con una sobreexpresión moderada de pntAB.
El volumen del fermentador se calculó añadiendo al volumen inicial la cantidad de disoluciones añadidas para regular el pH y para alimentar el cultivo, y restando el volumen utilizado para muestreo y que se perdió por evaporación.
25 El volumen del lote alimentado se siguió continuamente pesando la carga de alimentación. La cantidad de glucosa inyectada se calculó luego en base al peso inyectado, la densidad de la disolución y la concentración de glucosa determinada por el método de Brix ([Glucosa]). El rendimiento de metionina se expresó de la siguiente manera:
imagen430
El rendimiento máximo obtenido durante el cultivo se presentó aquí para cada cepa.
30 Con metionina0 y metioninat respectivamente, las concentraciones de metionina iniciales y finales y V0 y Vt, los volúmenes t iniciales e instantáneos. La glucosa consumida se calculó de la siguiente manera:
imagen431
Glucosa consumidat = [Glucosa]0 * V0 + Glucosa inyectada -[Glucosa]residual * Vt con [Glucosa]0, [Glucosa], [Glucosa]residual respectivamente, las concentraciones de glucosa inicial, alimentada y residual.
XV. Ejemplo 15: Actividad de transhidrogenasa
5 Los resultados descritos en el ejemplo 14, tabla 10 se confirman por el análisis de las actividades de transhidrogenasa llevadas a cabo por PntAB (Tabla 11). Como se observó previamente en los experimentos en matraces, las actividades de la transhidrogenasa aumentan tras la sobreexpresión de pntAB (véanse las cepas 10 y 13 de la tabla 11). Asimismo, una regulación ajustada de la sobreexpresión de pntAB redujo aproximadamente 10 veces las actividades de la transhidrogenasa, como se puede observar con la cepa 18 de la tabla 11.
10 Tabla 11: Las actividades de transhidrogenasa (TH, PntAB) se determinaron en las cepas anteriormente descritas y se exponen en mUI/mg de proteínas (N = dos puntos mínimos de cultivos de fermentadores independientes).
imagen432
Las actividades de la transhidrogenasa (TH) se ensayaron como se describió previamente en el Ejemplo 13. Todos los resultados son el promedio de por lo menos tres mediciones. 15 Referencias  Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633  Ouzonis, C. A., and Karp, P. D. (2000) Genome Res. 10, 568-576  Verho et al., (2003) Applied and Environmental Microbiology 69, 5892-5897  Chemler et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 77, 797-807 20  Alper, H. et al., (2005) Metab. Eng. 7, 155-164  Kelle T et al., (2005) L-lysine production; In: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of corynebacterium glutamicum. CRC, Boca Raton, pp467-490  Sauer U, Canonaco F, Heri S, Perrenoud A, Fischer E., "The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli. ", 25 2004, JBC, 279: 6613-6619  Jackson JB, "Proton translocation by transhydrogenase.", 2003, FEBS Lett 545:18-24
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imagen433

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