ES2637687T3 - Péptido BAD de dominio BH3 para usar en el tratamiento o retardo de la aparición de la diabetes - Google Patents

Abstract

Un péptido BAD de dominio BH3 de menos de 195 aminoácidos para uso en el tratamiento o retardo del inicio de la diabetes.

Description

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DESCRIPCION

Peptido BAD de dominio BH3 para usar en el tratamiento o retardo de la aparicion de la diabetes Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a metodos para modular la funcion y supervivencia de celulas de islote p y proporciona metodos para tratar la diabetes e inhibir la muerte celular de islotes pancreaticos. Ademas, la invencion describe metodos para controlar las actividades discretas de protemas de solo BH3 individuales mediante la modificacion basada en fosfomimeticos de compuestos peptfdicos de BH3 bioactivos.

Antecedentes de la invencion

La diabetes es una respuesta metabolica alterada a la insulina de nuestro propio cuerpo de modo que las celulas musculares activas no pueden captar glucosa tan facilmente como debenan. Cuando existe diabetes, o sensibilidad reducida a la insulina, el cuerpo intenta superar esta resistencia secretando mas insulina del pancreas. En esa circunstancia patologica, los niveles sangumeos de insulina son cronicamente altos, lo que inhibe a las celulas grasas de liberar sus almacenes de energfa para permitir la perdida de peso. La diabetes esta asociada a obesidad, hipertension, trigliceridos anormales e intolerancia a la glucosa. Las protemas de la familia de BCL-2, tales como bAd, son bien conocidas por desempenar papeles cnticos en la homeostasis del organismo al regular la muerte celular programada o apoptosis. En los ultimos anos, se han identificado funciones no apoptoticas novedosas para miembros de la familia de BCL-2 seleccionados y estos papeles recien identificados son vitales para mantener la homeostasis del organismo. La desregulacion de las funciones apoptoticas de los miembros de la familia de BCL-2 puede conducir a una perdida celular excesiva o a una supervivencia celular excesiva, dando lugar a enfermedades tales como neurodegeneracion y cancer, respectivamente. La desregulacion de las funciones no apoptoticas de los miembros de la familia de bCL-2, tales como BAD, puede producir un fenotipo diabetogenico que no esta relacionado con el papel de BAD en la fisiologfa de la muerte celular. La capacidad de protemas de la familia de BCL-2 seleccionadas de conmutar entre funciones distintas es un aspecto cntico de su actividad fisiologica. Los mecanismos moleculares mediante los que consiguen papeles duales pueden estar mediados por su dominio BH3 bioactivo y, espedficamente, su estado de fosforilacion. Por lo tanto, la capacidad de generar compuestos selectivos que imiten los dominios BH3 fosforilados tiene un potencial terapeutico significativo en el tratamiento de enfermedades humanas.

El documento WO 1999/45128 divulga protemas que comprenden el dominio BH3 utiles para tratar la diabetes. Protemas de la familia de BCL-2: puntos de control intracelulares cnticos de la apoptosis

La muerte celular programada es una ruta conservada geneticamente esencial para un desarrollo embrionario apropiado y el mantenimiento de la homeostasis de tejido (Cory, S. y Adams, J.M. 2002. Nat Rev Cancer 2. 647-56). La regulacion aberrante de esta ruta participa en la genesis de multiples enfermedades humanas, incluyendo cancer, autoinmunidad, trastornos degenerativos y diabetes. La ruta apoptotica de mairnfero proporciona pruebas de la participacion de organulos, especialmente mitocondrias (Green, D.R. y Kroemer, G. 2004. Science 305, 626-9). Ademas de proporcionar la mayona del ATP celular, las mitocondrias participan en la apoptosis al liberar el citocromo c y otros factores apoptogenicos. Una vez liberado, el citocromo c se ensambla junto con APAF-1 y caspasa 9 formando el “apoptosoma”, que a su vez activa las caspasas posteriores, conduciendo en ultima instancia a la muerte celular (Li, P. et al.. 1997. Cell 91: 479-89). Las mitocondrias son tambien responsables de la respiracion celular y coordinan multiples rutas metabolicas, aunque la interrelacion de estas funciones con la apoptosis ha permanecido incierta.

La familia de protemas de BCL-2 constituye un punto de control cntico en la apoptosis al residir inmediatamente anteriores al dano celular irreversible, donde los miembros controlan la liberacion de factores apoptogenicos de las mitocondrias (Danial, N.N. y Korsrneyer, SJ. 2004. Cell 116: 205-19). Varias protemas de Bcl-2 residen en las membranas subcelulares, incluyendo la membrana externa mitocondrial, el RE y las membranas nucleares. La familia consiste tanto en agonistas como antagonistas de la muerte, que comparten homologfa de secuencia en uno o mas segmentos conocidos como dominios de homologfa de BCL-2 (BH) (Figura 1). Todos los miembros antiapoptoticos, tales como BCL-2 y BCL-Xl, y un subconjunto de los miembros de la familia proapoptoticos, tales como BAX y BAK, son protemas “multidominio” que comparten homologfa de secuencia con 3-4 dominios BH. El subconjunto de “solo BH3” de moleculas proapoptoticas, incluyendo BAD, BID, BIM, NOXA y PUMA, muestra homologfa de secuencia solo en un unico segmento de helice a, el dominio BH3, que es tambien conocido como el dominio de muerte cntico (Wang, K. et al.. 1996. Genes Dev 10: 2859-69). BAX y BAK constituyen una via de acceso necesaria a la ruta mitocondrial de la apoptosis porque las celulas doblemente deficientes en estas protemas son resistentes a todos los estfmulos apoptoticos que se senalizan mediante la ruta intnnseca (Lindsten, T. et al.. 2000. Mol.Cell. 6, 1389-99; Wei, M.C. et al.. 2001. Science 292, 727-30). Todas las moleculas de solo BH3 funcionan posteriormente a BAX y BAK, conectando las senales de muerte y supervivencia proximales con la ruta apoptotica central (Figura 2) (Cheng, E.H. et al.. 2001. Mol Cell 8. 705-11; Zong, W.X. et al.. 2001. Genes Dev 15,1481-86). Tras la recepcion de las senales de muerte, BAX y BAK experimentan activacion alosterica en las mitocondrias, dando como resultado la permeabilizacion de la membrana externa y la liberacion de citocromo c (Wei,

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M.C. et al., 2000. Genes Dev 14, 2060-71) (Figura 2).

El equilibrio entre las subclases antiapoptotica y proapoptotica de las moleculas de BCL-2 fija un “reostato” que determina la susceptibilidad a la muerte (Oltvai, Z. et al., 1993. Cell 74, 609-19). Las moleculas proapoptoticas solo de BH3 como BAD, BID y BIM ajustan activamente este “reostato” y su funcion se regula dinamicamente por distintos mecanismos, incluyendo control transcripcional y modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, la BlD citosolica se activa tras escision por caspasa 8, conduciendo a translocacion mitocondrial, activacion de BAX/BAK y liberacion de citocromo c (Li, H. et al.; 1998. Cel] 94, 491-501; Luo, X. et al., 1998. Cel] 94, 481-90, 1998). NOXA y PUMA son dianas transcripcionales de p53 con papeles seleccionados en la apoptosis inducida por estres genotoxico (Nakano, K. et al., 2001. Mol Cell 7, 683-94; #328; Yu, J. et al., 2001. Mol Cell 7, 673-82). Adicionalmente, la actividad proapoptotica de BAD se inhibe por la fosforilacion en respuesta a factores de crecimiento o supervivencia extracelulares (Zha, J. et al., 1996. Cell 87, 619-281996).

Aunque los estudios in vitro muestran que la sobreexpresion de moleculas de solo BH3 conduce a la apoptosis en una variedad de estirpes celulares, los modelos de perdida de funcion en raton indican que las protemas de solo BH3 individuales sirven como iniciadores de la muerte celular que responden a senales seleccionadas en tipos celulares restringidos. El tipo celular y funcion in vivo espedfica de senal de las moleculas de solo BH3 sugieren que o bien la redundancia funcional de estas moleculas es espedfica del tipo de tejido o que las moleculas de solo BH3 pueden tener distintos papeles en otras rutas. Es mas, descubrimientos recientes han desvelado papeles fisiologicos para protemas de la familia de BCL-2 mas alla de la apoptosis. Los siguientes son solo cuatro ejemplos de la integracion de la apoptosis con las rutas homeostaticas celulares.

(i) Las protemas de la familia de BCL-2 y el metabolismo celular. Se realizo anteriormente un analisis proteomico de mitocondrias de Idgado, que revelo que la protema BAD de la familia de BCL-2 reside en un complejo que contiene glucocinasa (GK) que regula la respiracion de celula completa impulsada por glucosa (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6) (Figura 4). El modelo genetico nulo de Bad mostraba que BAD es necesaria para el ensamblaje del complejo y el modelo de raton con insercion genica Bad 3SA no fosforilable proporcionaba pruebas de que se requiere BAD fosforilada para la actividad GK anclada a mitocondria completa. Consistentemente con el papel de BAD en el apoyo a la actividad GK, tanto los animales deficientes en Bad como Bad 3SA exhiben una homeostasis de glucosa anormal marcada por hiperglucemia en ayuno e intolerancia a la glucosa. Debido a que nulo de Bad y Bad3SA representan modelos de perdida y ganancia de la actividad proapoptotica de BAD, respectivamente, las anormalidades metabolicas comunes en estos animales sugenan que el papel de BAD en el metabolismo de la glucosa puede ser distinto de su capacidad de sensibilizar a celulas ante la apoptosis. Es mas, los experimentos presentados en esta solicitud muestran papeles espedficos para BAD tanto en pancreas como en Idgado, cada uno con consecuencias fisiologicas significativas.

(ii) La protema BID de la familia de BCL-2 y la respuesta celular ante el dano de ADN. En respuesta ante dano de ADN, las celulas o bien detienen la proliferacion para permitir un tiempo suficiente de reparacion de su ADN o experimentan apoptosis. La protema proapoptotica BID funciona tanto en los puntos de control de apoptosis como de dano de ADN en las celulas (Zinkel, S. et al., 2006. Cell Death Differ 13, 1351-9). La perdida de BID da como resultado inestabilidad genomica y malignidades mieloides (Zinkel, S. et al., 2003. Genes Dev 17, 229-39). BID es un sustrato para la cinasa de dano al ADN ATM en el nucleo y modula el punto de control intrafase S en las celulas con ADN danado (Zinkel, S. et al., 2005. Cell 122, 579-91; Kamer, I. 2005. Cell 122, 593-603). De forma importante, aunque se requiere el dominio BH3 de BID para su funcion apoptotica en las mitocondrias, es prescindible para su funcion de punto de control del ciclo celular en el nucleo (Zinkel, S. et al., 2005. Cell 122, 579-91) (Figura 68).

(iii) La comunicacion cruzada entre el control de calidad de protema y la apoptosis: El plegamiento apropiado de protemas es esencial para la integridad funcional de las celulas. Por consiguiente, las celulas han concebido mecanismos sofisticados para asegurar una “homeostasis de protema” apropiada (Rutkowski, D.T. y Kaufman, R.J. 2004. Trends Cell Biol 14, 20-8). La acumulacion de protemas mal plegadas en el retmulo endoplasmico (RE), tambien conocido como estres del RE, activa una respuesta adaptativa celular a la que se hace referencia como UPR (respuesta a protema no plegada). El estres de Re esta implicado en la patofisiologfa de multiples enfermedades neurodegenerativas, incluyendo enfermedad de Huntington y enfermedad de Alzheimer (Oakes, S.A. et al., 2006. Curr Mol Med 6, 99-109). Se ha mostrado recientemente que se requieren las protemas BAX y BAK de la familia de BCL-2 para la ejecucion apropiada de las rutas de senalizacion implicadas en la UPR al asociarse ffsicamente con varios componentes de esta ruta (Hetz, C. et al., 2006. Science 312. 572-6). Se ha propuesto que BAX/BAK sirven para ligar la UPR en el RE con la maquinaria apoptotica central en las mitocondrias y por tanto orquestan la respuesta celular ante protemas mal plegadas mediante o bien la ejecucion apropiada de una respuesta adaptativa o la muerte celular.

(iv) Protemas de la familia de BCL-2 y regulacion de la morfolog^a mitocondrial durante la vida y la muerte. La forma mitocondrial y estructura reticular se regulan dinamicamente por procesos de fusion y fision (Griparic, L. y Van der Bliek, A.M. 2001. Traffic 2, 235-44). Esto asegura el intercambio de material entre diferentes mitocondrias y la eliminacion de aquellos organulos inadecuados para la funcion. Los cambios dinamicos en la morfologfa mitocondrial afectan directamente a la adecuacion metabolica de la celula. Durante la apoptosis, las mitocondrias experimentan fragmentacion antes de la activacion de caspasa (Frank, S. et al., 2001. Dev Cell 1, 51525). Varias protemas de la familia de BCL-2 estan implicadas en estos procesos. Las moleculas antiapoptoticas

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BCL-2/BCL-Xl tienen una actividad profusion que parece estar conservada a lo largo de la evolucion. Esto coincide con su capacidad de unirse a mitofusion 2 (Mfn-2), una protema conocida por gobernar la fusion mitocondrial (Delivani, P. et al., 2005. Mol Cell 21, 761-73). La BAX proapoptotica regula la actividad de Mfn-2 directamente (Karbowski, M. et al., 2006. Nature 443, 658-62). Es notable que el papel de los miembros de la familia de BCL-2 en la dinamica mitocondrial sea tambien esencial en celulas sanas que no han recibido un estimulo mortal. Se ha sugerido que se requiere el dominio BH3 de BAX para la regulacion de la dinamica mitocondrial (Karbowski, M. et al., 2006. Nature 443, 658-62). Por tanto, el mismo dominio en BAX tiene la capacidad de regular dos funciones distintas; apoptosis y forma mitocondrial.

Homeostasis de glucosa, diabetes y sindrome metabolico

La diabetes sacarina de tipo 2 (T2DM) es una enfermedad multigenetica que incluye multiples anormalidades metabolicas que se manifiestan comunmente en una tolerancia a la glucosa alterada. Los principios fisiologicos basicos de la T2DM incluyen anormalidades en la produccion y funcion de insulina (Saltiel, A.R. y Kahn, C.R. 2001. Nature 414, 799-806). Esto implica cambios en la funcion de pancreas, musculo, grasa e hngado. Las celulas p pancreaticas y hepatocitos son los principales sensores de glucosa en el cuerpo (Accili, D. 2004. Diabetes 53, 163342). En respuesta ante una fluctuacion de la glucosa sangumea, las celulas p secretan insulina de manera sensible a la dosis. La insulina a su vez estimula la captacion de glucosa por tejidos perifericos tales como musculo y grasa y da pie al almacenamiento apropiado de glucosa como glucogeno en el tngado. Los islotes pancreaticos tienen tambien tendencia a adaptar su masa para satisfacer las demandas secretoras de insulina en el cuerpo (Bell G.I. y Polonsky K.S., 2001. Nature 414, 788-91; Weir G.C. et al., 2001. Diabetes 50 supl. 1, S154-9; DeFronzo R.A., 1988. Diabetes 37, 667-87; Accili D. et al., 2001. Curr Mol Med 1, 9-23). La falta de una sensibilizacion glucosa y/o de una adaptacion de masa por los islotes apropiadas contribuye a la T2DM. Los hepatocitos sienten las fluctuaciones en la glucosa sangumea y ajustan su funcion o bien a producir glucosa durante el ayuno, lo que ayuda a mantener un suministro de glucosa adecuado al cerebro, o a almacenar glucosa como glucogeno cuando los niveles de glucosa sangumea superan su intervalo normal (Cherrington, A.D. 1999. Diabetes 48, 1198-1214). Ademas de la regulacion del metabolismo de carbohidratos, la insulina afecta tambien al metabolismo de las grasas al suprimir la lipolisis en celulas grasas (DeFronzo, R.A. 2004. lnt J Clin Pract Suppl 143, 9-21). La resistencia a la insulina es un estado en que musculo, grasa e hngado son insensibles a la accion de la insulina. El smdrome metabolico se define como una agrupacion de deficiencias metabolicas que incluyen resistencia a la insulina, dislipidemia (incluyendo niveles anormales de trigliceridos plasmaticos), obesidad y diabetes (Reaven, G.M. 2004. Diabetes Care 27, 1011-12).

Metabolismo de glucosa y cancer

Las celulas individuales dependen de la disponibilidad de factores de crecimiento/supervivencia que regulan caractensticamente tanto el metabolismo celular como la supervivencia celular (Plas, D.R. y Thompson, C.B. 2002. Trends Endocrinol Metab 13, 75-8). Metabolismo celular es un termino usado para describir un grupo de reacciones qmmicas que tiene lugar en una celula u organismo vivo, donde los nutrientes como la glucosa se degradan procurando energfa para procesos vitales. La insulina, el factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) y multiples citocinas transducen senales a traves de PI3K mediante la serina/treonina cinasa AKT y cinasas relacionadas para regular el transporte y metabolismo de glucosa (Cheatham, B. y Kahn, C.R. 1995. Endocr Rev 16, 117-42). La senalizacion posterior de AKT afecta al metabolismo de la glucosa al regular los niveles de transportadores de glucosa (Glut 1 y Glut 4) (Figura 3). Por consiguiente, los ratones que carecen de AKT2 exhiben bajos niveles de Glut4 y desarrollan una marcada resistencia a la insulina (Cho, H. et al., 2001. Science 292, 1728-31). Un segundo mecanismo mediante el que la AKT regula el metabolismo de la glucosa es estimulando el agrupamiento de hexocinasa (HK) en las mitocondrias (Robey, R.B. y Hay, N. 2006. Oncogene 25, 4683-96). La hexocinasa es la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo de la glucosa (glucolisis) convirtiendo la glucosa en glucosa 6-fosfato. El mecanismo molecular subyacente en la localizacion mitocondrial de HK no es completamente conocido. Como la hexocinasa asociada a mitocondria tiene un acceso inmediato al ATP mitocondrial y escapa de la inhibicion de producto por la glucosa 6-fosfato (G6P), esto puede explicar como la AKT activada aumenta la actividad 6- fosforilante de glucosa (Bustamante, E. y Pdersern, P.L. 1977. Proc Natl Acad Sci USA 74, 3735-39; Arora, K.K. y Pedersen, P.L. 1988. J Biol Chem 263, 17422-28). La AKT activada promueve ademas la supervivencia al estimular la expresion de varias protemas antiapoptoticas, tales como BCL-Xl y MCL-1 asf como la fosforilacion de varios actores celulares clave, incluyendo los factores de transcripcion Forkhead BAD y NFkB (Datta, S.R. et al., 1999. Genes Dev 13, 2905).

La resistencia a la apoptosis y un metabolismo celular aumentado son caractensticas comunes de los tumores. BCL- 2 se descubrio originalmente debido a su translocacion cromosomica en linfoma folicular. Ademas, los modelos de raton de protemas de la familia de BCL-2 indican claramente que los defectos en la apoptosis pueden ser un evento oncogenico primario (McDonnel, T.J. et al., 1989. Cell 57, 79-88; McDonnel, T.J. et al., Nature 349, 254-56). La translocacion cromosomica en el gen Bcl-2 encontrada en linfoma folicular en seres humanos yuxtapone la secuencia de codificacion de Bcl-2 proxima a las secuencias genicas de inmunoglobulina (Ig). De forma importante, resumir esta translocacion cromosomica usando ratones transgenicos Bcl-2-Ig era suficiente para causar linfoma difuso de celulas grandes con el tiempo. Igualmente, varios hallazgos sugieren que los miembros proapoptoticos de la familia de BCL-2 pueden funcionar como supresores tumorales porque su perdida de funcion contribuye a la malignidad. La incidencia aumentada de tumores del plexo coroideo en ratones nulos de Bax que expresan un antfgeno SV40 T truncado y de leucemia mielomonodtica cronica (LMMC) en ratones deficientes en Bid refleja su

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importancia en la supervivencia celular neuronal y la homeostasis mieloide, respectivamente (Zinkel, S. et al., 2003. Genes Dev 17, 229-39; Yin, C. et al., 1997. Nature 385, 637-40). Los ratones nulos de Bad avanzan hasta linfoma difuso de celulas B grandes (LDCBG) de origen de centro germinal (Ranger, A.M. et al., 2003. Proc Natl Acad Sci USA 100, 9324-29). Esto puede reflejar un papel potencial para BAD en la regulacion de la homeostasis celular de linfocitos B maduros a medida que migran a los centros germinales.

La relevancia del metabolismo celular para la malignidad se reconocio originalmente por Warburg, que senalo que los tumores exhiben a menudo altas tasas glucolfticas. La glucolisis da cuenta de un ~60 % del ATP en las celulas tumorales y proporciona intermedios metabolicos para la smtesis de macromoleculas que incluyen acidos nucleicos necesarios para la smtesis de ADN y su proliferacion rapida. Es mas, varios oncogenes bien caracterizados en canceres humanos, incluyendo Ras, Myc y Akt, son conocidos por orientarse a la ruta glucolftica (Semenza, G.L. 2001. Novartis Found Symp 240, 251-60). La hipotesis de Warburg sugena adicionalmente que las altas tasas glucolfticas podnan ser debidas a una respiracion mitocondrial alterada; sin embargo, este hallazgo se ha probado algo variable en tumores. Estudios recientes han mostrado que incluso en presencia de una capacidad de fosforilacion oxidativa (OXPHOS) totalmente funcional por las mitocondrias, las celulas tumorales respaldan sus demandas bioenergeticas preferentemente mediante la glucolisis (Fantin, V.R. et al., 2006. Cancer Cell 9, 425-34). Se requiere esta alternancia para el mantenimiento tumoral, ya que la interferencia con la glucolisis esta asociada a un aumento compensatorio de la OXPHOS concomitante con una rebaja de la capacidad proliferativa de las celulas tumorales. La posible razon de esta “alternancia glucolftica” en tumores puede ser que, ademas de proporcionar ATP a una tasa mas rapida, los productos glucolfticos (principalmente piruvato) se usan como intermedios para la smtesis de acidos grasos (Figura 3). Esto asegura que las celulas tumorales tengan suficiente suministro de acidos grasos para que la smtesis de membrana nueva siga el ritmo de la alta tasa de proliferacion celular. Ademas, la dependencia de la glucolisis en lugar de la OXPHOS asegura que los tumores puedan crecer en ausencia de oxfgeno (hipoxia) antes de la vascularizacion (Gatenby. R.A. y Gillies, RJ. 2004. Nat Rev Cancer 4, 891-99). En varios tumores humanos, multiples enzimas clave implicadas en el metabolismo de la glucosa exhiben una actividad aumentada cuando se comparan con tejidos normales. Estas incluyen hexocinasa (HK), fosfofructocinasa (PFK), piruvato cinasa (PK) y lactato deshidrogenasa (LDH). Los mecanismos subyacentes de la actividad aumentada se han estudiado mejor en el caso de las enzimas HK e incluyen una expresion aumentada (resultante de la amplificacion genica y/o activacion de promotor), una union aumentada a mitocondrias y/o una alternancia en la expresion genica de isoformas de km alta (hexocinasa IV) a baja (hexocinasa I-III) (Rempel, A, et al., 1994. Biochem J 303, 269-74; Klimek, F. et al., 1993. Carcinogenesis 14, 1857-61; Mazurek, S. et al., 1999. J Cell Phyisol 181, 13646). Estas observaciones subestiman la importancia de orientarse a la glucolisis o el uso de intermedios glucolfticos en rutas espedficas de tumores como una estrategia terapeutica prometedora.

Pruebas recientes sugieren tambien que la obesidad y el smdrome metabolico estan asociados a un alto riesgo de cancer, incluyendo cancer colorrectal (Gunter, MJ. y Leizmann, M.F. 2006. J Nutr Biochem 17, 145-56), cancer de mama (Lorincz, A.M. 2006. Endocr Relat Cancer 13, 279-92) y cancer de prostata (O'Malley, R.L. y Taneja, S.S. 2006. Can J Urol Supl 2, 11-7). Aunque los nexos moleculares entre estas anormalidades metabolicas y el cancer no se entienden totalmente, varios estudios sugieren que los niveles plasmaticos elevados de insulina, como se observan en el estado resistente a la insulina, activan la proliferacion celular en celulas epiteliales. Ademas, la insulina puede aumentar los niveles de factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), una hormona de crecimiento con actividad proliferativa y antiapoptotica significativa (Cowey, S. y Hardy, R.W. 2006. Amer J Pathol 169, 1505-22). La insulina y el IGF-1 regulan tambien los esteroides sexuales, que a su vez modulan la actividad de estrogeno y androgenos y por consiguiente el desarrollo de canceres dependientes de hormonas sexuales, incluyendo canceres de mama y prostata (Calle, E.E. y Kaaks, R. 2004. Nat Rev Cancer 4, 579-91). Ademas, las hormonas producidas por celulas grasas, las adipocinas, tienen efectos proliferativos, angiogenicos y proinflamatorios. Las adipocinas influyen en las celulas cancerosas o bien directamente a traves de estos efectos o indirectamente causando resistencia a la insulina (y por tanto hiperinsulinemia) (Cowey, S. y Hardy, R.W. 2006. Amer J Pathol 169, 1505-22).

Compendio

La presente invencion proporciona un peptido BAD de dominio BH3 de menos de 195 aminoacidos para uso en el tratamiento o el retardo del inicio de la diabetes.

La capacidad de protemas de la familia de BCL-2 seleccionadas de conmutar entre distintas funciones es un aspecto crftico de su actividad fisiologica. La presente invencion esta basada en el descubrimiento de que el miembro proapoptotico BAD de la familia de BCL-2 regula la eficacia de las mitocondrias usando glucosa como combustible a traves de mecanismos que pueden ser blancos e imitarse distintamente por su capacidad de activar la maquinaria apoptotica en las mitocondrias. Tanto en tngado como en pancreas, dos tejidos principales implicados en la regulacion del azucar sangumeo, la BAD modula la actividad de un sensor de glucosa clave en mairftferos, la glucocinasa (hexocinasa IV). Los mecanismos moleculares mediante los que la BAD consigue papeles duales estan mediados por su dominio BH3 bioactivo. Espedficamente, se encuentra que el estado de fosforilacion de un residuo clave, que puede ser imitado y manipulado genetica y qmmicamente, instruye a BAD a asumir una funcion o bien metabolica o apoptotica. La BAD fosforilada o su mimetico regula la actividad glucocinasa, la respiracion mitocondrial impulsada por glucosa y la secrecion de insulina en celulas p del pancreas y simultaneamente las dota de una respuesta adaptativa ventajosa en un estado resistente a la insulina (Figura 4). Este es uno de los muchos ejemplos

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proporcionados en la presente memoria en cuanto a la importancia y los beneficios de la manipulacion genetica y qmmica de las rutas homeostaticas celulares y la supervivencia celular a traves de reguladores de la familia de BCL- 2 conocidos por portar papeles duales en la apoptosis y otras rutas fisiologicas celulares. De forma importante, esta regulacion puede manipularse por un compuesto peptfdico que contenga un resto fosfomimetico y tenga un potencial significativo de tratamiento de enfermedades humanas.

Se describen tanto los metodos profilacticos como terapeuticos de tratamiento de un sujeto con riesgo (o susceptible) de un trastorno o que tiene un trastorno asociado a un metabolismo de glucosa aberrante (p.ej., insuficiente o excesivo) o anormalidades de la ruta apoptotica extrmseca o intrmseca.

Se trata la diabetes (p.ej., de tipo I o de tipo II) o se retarda el inicio administrando a un sujeto necesitado de ello una composicion que contiene un peptido BAD de dominio BH3 o mimetico del mismo. El sujeto es, por ejemplo, hiperglucemico, obeso o resistente a la insulina.

Se aumenta la supervivencia de celulas p poniendo en contacto las celulas p con una composicion que contiene un peptido BAD de dominio BH3 o mimetico del mismo. En diversos aspectos, se ponen en contacto las celulas antes o despues del trasplante a un sujeto.

Se induce la secrecion de insulina o se aumenta la actividad glucocinasa exponiendo, p.ej. poniendo en contacto un tejido (p.ej., tejido de pancreas) o celula (p.ej., celulas p) con un peptido BAD de BH3 o mimetico.

Se modula el crecimiento tumoral o se sensibiliza una celula tumoral ante un agente terapeutico, p.ej. agente quimioterapeutico o radiacion, poniendo en contacto la celula tumoral con un peptido de dominio BH3 o mimetico del mismo.

Se modula el ciclo celular o una ruta homeostatica poniendo en contacto una celula con un peptido de dominio BH3 o mimetico del mismo. La celula es una celula hepatica o una celula neuronal.

Se fosforila el peptido de dominio BH3, peptido BAD de dominio BH3 o mimetico del mismo. Preferiblemente, se estabiliza el peptido de dominio BH3 de estructura de helice alfa o peptido BAD de dominio BH3. Por ejemplo, se estabilizan los peptidos mediante el grapado de hidrocarburos o reticulacion qmmica. El peptido BAD de dominio BH3 comprende la secuencia aminoaddica de SEQ ID NO: 1-3 o fragmentos de la misma.

Se incluye tambien en la invencion un peptido que tiene la secuencia aminoaddica de SEQ ID NO: 1,2 o 3, en la que X3 esta fosforilado y en la que X1 esta fosforilado.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un especialista en la materia a la que pertenece esta invencion.

Resultaran evidentes otros rasgos y ventajas de la invencion a partir de la siguiente descripcion.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra los miembros de la familia de BCL-2 que tienen uno o mas dominios de homologfa con BCL-2 (BH) conservados.

La Figura 2 es una representacion esquematica de la ruta apoptotica intrmseca en que los organulos, incluyendo mitocondrias y retmulo endoplasmico (RE), desempenan papeles principales. Las moleculas de solo BH3 sirven como centinelas anteriores que responden selectivamente ante las senales de muerte espedficas y regulan en ultima instancia la activacion de bAx y BAK directa o indirectamente. Este proceso se inhibe a su vez por los miembros antiapoptoticos de la familia de BCL-2. BAX y BAK sirven como vfas de acceso para la apoptosis al regular tanto la liberacion de citocromo c de las mitocondrias como la liberacion de Ca2+ del RE.

La Figura 3 resalta el metabolismo distinto de las celulas cancerosas, que experimentan una alternancia glucolttica y activan la glucolisis de manera constitutiva. Vease el texto para detalles.

La Figura 4 es un esquema que muestra que el dominio BH3 de BAD puede servir para integrar las senales metabolicas celulares para involucrar a distintos conjuntos de copartfcipes moleculares que determinan el destino de una celula p con respecto a la secrecion de insulina frente a la apoptosis. La fosforilacion de la serina 155 en el dominio BH3 de BAD instruye a la protema a asumir un papel metabolico a traves de su efecto sobre GK, respiracion impulsada por glucosa y secrecion de insulina.

La Figura 5 es una grafica lineal que muestra los niveles plasmaticos de glucosa durante un analisis de pinzamiento hiperglucemico. Se elevaron los niveles de glucosa y se mantuvieron a 300 mg/dl a lo largo del analisis de ratones Bad +/+ (n= 10) y Bad -/-(n= 12).

La Figura 6 es una grafica lineal que muestra los niveles plasmaticos de insulina en ratones Bad +/+ (n= 10) y Bad -/- (n= 12). Asteriscos: p< 0,05; dobles asteriscos, p< 0,01, prueba de t de dos colas no pareada.

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La Figura 7 es una grafica de barras que cuantifica el area bajo la curva (AUC) para la secrecion de insulina a lo largo del experimento (0-120 min), o durante la fases aguda (0-30 min) y tardfa (30-120 min) de secrecion. Asteriscos: p <0,05; dobles asteriscos, p< 0,01, prueba de t de dos colas no pareada.

La Figura 8 es una grafica lineal que representa la secrecion de insulina de islotes perfundidos de ratones Bad +/+ y Bad -/-. Despues de un periodo de preperfusion de 25 min con glucosa 3 mM, se perfundieron 120 islotes de cada genotipo con glucosa 3 mM y 25 mM como se indica. Despues de 40 min, se conmuto la solucion de perfusion a KCl 30 mM para despolarizar la membrana plasmatica y liberar el conjunto total de granulos de insulina. El contenido de ADN por islote era de 12,4 ng y de 14,6 ng para ratones Bad +/+ y Bad -/-, respectivamente. El AUC para la primera fase de liberacion (min 8-15) era de 12,50 frente a 5,98, y para la segunda fase (min 15-40) de 15,05 frente a 8,44, Bad +/+ y Bad -/- respectivamente. Se muestran datos representativos de 3 experimentos independientes.

La Figura 9 es una grafica de barras que demuestra la relacion de ATP/ADP en islotes Bad +/+ y Bad -/- tras un aumento de glucosa de 5,5 mM a 25 mM.

La Figura 10 es una grafica de barras que muestra la liberacion de insulina en islotes Bad +/+ y Bad -/- en respuesta ante secretagogos. Se cultivaron islotes Bad +/+ y Bad -/- en medios que conteman la cantidad indicada de glucosa en presencia o ausencia de acido 2-cetoisocaproico (KIC) 10 mM, tolbutamida 0,25 mM o carbacol 0,25 mM. Se midio la secrecion de insulina usando el metodo de incubacion estatica. n= 8-11 por grupo. El contenido de insulina por islote era de 115,1 ± 4,64 y de 118,49 ± 4,09 ng, Bad +/+ y Bad -/-, respectivamente. Asterisco, p< 0,05, Bad +/+ frente a Bad -/-, prueba de t de dos colas no pareada.

La Figura 11 es una ilustracion que demuestra los cambios en la intensidad de fluorescencia de TMRE de celulas p Bad +/+ y Bad -/- individuales tras el aumento de la concentracion de glucosa de 3 a 8 mM. Las imagenes estan codificadas por color por intensidad de fluorescencia; azul (baja) y rojo (alta).

La Figura 12 es una grafica de barras que muestra los cambios de AV de celulas p Bad +/+ y Bad -/- individuales despues de la adicion de KIC 10 mM en presencia de glucosa 3 mM.

La Figura 13 es una grafica de barras que demuestra la fluorescencia de NADH como indicativo de actividad glucocinasa en homogeneizados de islotes primarios aislados de ratones Bad +/+ y Bad -/-.

La Figura 14 es un diagrama de barras que muestra la secrecion de insulina en islotes Bad +/+ y Bad -/- perfundidos con dosis crecientes de glucosa. Dobles asteriscos, p< 0,01, prueba de t de dos colas no pareada, islotes Bad +/+ frente a Bad -/- para la concentracion de glucosa indicada.

La Figura 15 es un diagrama de barras que demuestra la secrecion de insulina estimulada por glucosa (SIEG) en islotes Bad +/+ y Bad -/- infectados con adenovirus que expresan GFP sola, GFP-BAD o GFP-BAD L^A. n= 10-15 por grupo. Se muestran datos representativos de tres experimentos independientes con dos preparaciones independientes de disoluciones madre vmcas.

La Figura 16 es una grafica de barras que muestra la SIEG en ratones Bad +/+ o animales que expresan mutantes no fosforilables de BAD (Bad 3SA y Bad S155A). n por grupo: Bad +/+ (n= 10), Bad 3SA (n= 8), Bad S155A (n= 12).

La Figura 17 es un diagrama de barras que demuestra la SIEG en islotes Bad +/+ y Bad -/- tratados con 3 pM de helices alfa estabilizadas de dominios bCL-2 (SAHB) indicadas enumeradas en la Figura 18 o control de vehnculo (DMSO). n= 8 por grupo.

La Figura 18 es un diagrama que enumera los compuestos de SAHB usados en 18-2. Los residuos L151 y D156 conservados en los dominios BH3 de BAD y BID y S155 estan marcados con recuadros. Se muestran los residuos alterados en diferentes compuestos de SAHB. Nl en SAHBa de BID: norleucina; *: el aminoacido no natural S5 (vease la Figura 33). Se muestra la coleccion de truncamiento de compuestos BAD de BH3 y su capacidad de unirse a BCL-Xl. Se proporciona la lista completa de derivados de SAHB de BAD generados hasta la fecha, incluyendo los compuestos fosfomimeticos y los compuestos para captura de diana e inmunoprecipitacion basada en SAHB o reticulacion.

La Figura 19 es una grafica de barras que muestra el efecto de los compuestos de SAHB sobre los cambios inducidos por la glucosa en el potencial de membrana mitocondrial (AV).

La Figura 20 es un diagrama de barras que demuestra la fluorescencia de NADH como indicativo de la actividad glucocinasa en homogeneizados preparados a partir de celulas p MIN6 tratadas durante 4 horas con 3 pM de los compuestos indicados. Asterisco: p< 0,05 SAHBA de BAD frente a DMSO, cruz doble: p< 0,01 SAHBa(s^ps) de BAD o sAhBa(s^d) de BAD frente a SaHBa de BAD.

La Figura 21 es una grafica de barras que representa los niveles de ARNm de BAD de islote en ratones de tipo silvestre con dieta rica en grasas (HFD) durante 16 semanas o dieta de control.

La Figura 22 es una grafica lineal que demuestra los niveles sangumeos de glucosa semanales de una cohorte de

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Bad +/+ y Bad -/- (n= 20) dispuestos con HFD durante 16 semanas.

La Figura 23 es un grafico de puntos que representa los pesos corporales semanales de una cohorte de Bad +/+ y Bad -/- (n= 20) dispuestos con HFD durante 16 semanas.

La Figura 24 es una grafica de barras que ilustra el area porcentual de islote en las secciones pancreaticas preparadas a partir de las cohortes con control o HFD. Asterisco: p<0,05, Bad -/- frente a Bad +/+ con hFd.

La Figura 25 es una ilustracion que demuestra el analisis inmunohistoqmmico de secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de las cohortes anteriores reveladas con anticuerpo anti-insulina.

La Figura 26 es un grafico de barras que indica los niveles sangumeos de insulina con alimentacion de Bad +/+ y Bad -/- con control o HFD durante 8 semanas.

La Figura 27 es una grafica lineal que representa los niveles sangumeos de glucosa semanales de una cohorte de Bad +/+ y Bad 3SA (n= 8) dispuestos con HFD durante 16 semanas.

La Figura 28 es un diagrama de puntos que muestra los pesos corporales de una cohorte de Bad +/+ y Bad 3SA (n= 8) dispuestos con HFD durante 16 semanas.

La Figura 29 es una grafica de barras y una fotograffa que muestran el area porcentual de islote en las secciones pancreaticas preparadas a partir de las cohortes mostradas en (27-28) anteriormente.

La Figura 30 es un grafico de barras que demuestra los niveles sangumeos de insulina con alimentacion de Bad +/+ y Bad3SA con control o HFD durante 8 semanas. Asterisco: p< 0,05, Bad 3SA frente a Bad +/+ con HFD.

La Figura 31 es una fotograffa de una transferencia Western que muestra los resultados de incubar anticuerpo anti- glucocinasa (carriles 1-3) o IgG de conejo de control (carriles 4-6) con la fraccion de membrana pesada (HM) enriquecida en mitocondrias solubilizada con CHAPS preparada a partir de celulas p MIN6.

La Figura 32 es una fotograffa de una transferencia Western que muestra los resultados de incubar la fraccion de membrana pesada (HM) enriquecida en mitocondrias solubilizada con CHAPS de celulas p de MIN6 con perlas de agarosa acopladas con microcistina (MC). Se resolvieron las protemas unidas por PAGE-SDS y se inmunotineron con los anticuerpos indicados. Sirven como control perlas no acopladas (ctrl).

La Figura 33 es un esquema de la estrategia sintetica de grapado de hidrocarburos. Se efectuo la smtesis asimetrica de S-N-(carbamato de 9-fluorenilmetilo)-2-(4'-pentenil)alanina ("S5") como se describe anteriormente. Se generaron los compuestos de SAHB reemplazando dos aminoacidos de la secuencia de BH3 por aminoacidos no naturales en localizaciones discretas que flanquean 3 aminoacidos naturales (posiciones i, i+4). Se efectuaron la smtesis peptfdica, la metatesis olefmica, la derivatizacion con FITC, la purificacion por HPLC en fase inversa y el microanalisis como se resena anteriormente para SAHB de BID. Se reemplazo la metionina nativa de BH3 de BID por norleucina (Nl) en SAHB de BID debido a la incompatibilidad del azufre con la reaccion de metatesis catalizada por rutenio.

La Figura 34 es un grafico de puntos que muestra que los espectros de dicrofsmo circular demuestran una helicidad a potenciada de las SAHB en comparacion con sus correspondientes peptidos no modificados.

La Figura 35 es una grafica lineal y un grafico de puntos que ilustran las afinidades de union de los compuestos de SAHB a BCL-XlAC purificada o protema GST de control.

La Figura 36 es un esquema que muestra la estrategia de orientacion a insercion genica. El mapa del locus de BAD marca los sitios de restriccion X, Xba1; B, BamH1; EV, EcoRV; S, Smal; E, EcoRI y los recuadros denotan exones. La mutacion de serina 155 a alanina se ligo a RFLP (EcoRl) y se inserto un modulo PGK-NEO con sitios FRT flanqueados (triangulos azules) posteriormente a la 3' UTR. Se escindio el modulo NEO despues de la generacion de Bad S155A(neo) + por cruzamiento con ratones transgenicos de FlpE.

La Figura 37 es una fotograffa de una transferencia Western que verifica la orientacion apropiada. Se usaron las sondas indicadas en la Fig. 36 para mostrar la insercion del modulo FRT-Neo-FRT (panel izquierdo) y la integracion de RFLP de EcoRI en BAD (panel derecho). Los clones marcados con (*) eran positivos tanto de inserto como de RFLP.

La Figura 38 es una fotograffa que muestra el fragmento de PCR para el marcador de mutacion RFLP de S155A despues de digestion con EcoRI usado para genotipar las progenies de S155A de Bad S155A(neo)/+ cruzados con ratones FlpE.

La Figura 39 es una grafica lineal que demuestra los niveles sangumeos de glucosa despues de una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) en que, despues de una noche de ayuno, se inyecto a los ratones 1 g/kg de glucosa i.p. (tiempo 0). Se midieron los niveles sangumeos de glucosa e insulina antes y a 5, 15 y 30 min en la ipGTT. n por grupo: WT= 10 y Bad S155A= 10. Asteriscos: p< 0,05.

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La Figura 40 es una grafica lineal que representa los niveles sangumeos de insulina despues de una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal como en la Fig. 39. Asteriscos: p< 0,05; dobles asteriscos en (e), p< 0,01, prueba de t de dos colas no pareada, Bad +/+ frente a Bad S155A.

La Figura 41 es una grafica de barras que demuestra el efecto de la exposicion cronica a alta glucosa o STZ en islotes Bad -/-. Se infectaron Bad +/+ Bad +/+ con adenovirus que expresan GFP sola o GFP y BAD, respectivamente. Se recogieron manualmente entonces los islotes que expresan GFP en cada grupo y se cultivaron durante 48 horas en medio que conterna 5,5 mM (glucosa normal), 16,7 mM (glucosa alta) o STZ 5,5 mM y 1,2 mM. Se dispersaron los islotes por tripsinizacion leve y se valoro la viabilidad por exclusion con azul de tripano.

La Figura 42 es una grafica de barras que demuestra el efecto de la exposicion cronica a glucosa alta o STZ. Se expusieron islotes Bad +/+ y Bad 3SA a glucosa alta cronica o STZ y se valoro la viabilidad como anteriormente. Se muestran los resultados de al menos tres experimentos independientes lefdos por triplicado. El asterisco compara Bad -/- frente a Bad +/+, o Bad 3SA frente a Bad +/+.

La Figura 43 es una fotograffa que muestra la microscopia de fluorescencia de secciones pancreaticas preparadas a partir de ratones Bad -/- y Bad +/+ el dfa 0 o el dfa 7 despues de tratamiento con STZ tenidas doblemente con anticuerpos de insulina y glucagon.

La Figura 44 es una fotograffa que muestra la inmunohistoqmmica de secciones pancreaticas del experimento de la Figura 43 tras tincion con anticuerpos de insulina o caspasa 3 activa seguida de contratincion con hematoxilina y eosina.

La Figura 45 es un diagrama de barras que demuestra los niveles sericos de insulina el dfa 0 y el dfa 7 en la misma cohorte de ratones Bad +/+ (n= 7) y Bad -/- (n= 8) usada en las (Fig. 43-44). Asterisco, p< 0,05; dobles asteriscos, p< 0,01, prueba de t de dos colas no apareada.

La Figura 46 es una grafica de barras que muestra los niveles de glucosa el dfa 0 y el dfa 7 en la misma cohorte de ratones Bad +/+ (n= 7) y Bad -I- (n= 8) usada en las (Fig. 43-44). Asterisco. p< 0,05.

La Figura 47 es un histograma que muestra el numero de islotes y su distribucion de tamano en secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de ratones Bad +/+ despues de 16 semanas con HFD. Histograma que muestra el numero de islotes y su distribucion de tamano en secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de ratones Bad +/+ despues de 16 semanas con HFD. Cada rombo representa un islote que se inmunoterffa con anticuerpo anti-insulina. El eje vertical demuestra el area de pfxeles asignada a los islotes rastreada por el programa de software MetaMorph. El eje horizontal denota los islotes. Para cada par representativo de genotipos mostrado (Bad +/+ frente a Bad -/- y Bad +/+ frente a Bad 3SA), era comparable el area de seccion total. Las secciones de Bad -/- contienen significativamente mas islotes para el mismo area de tejido total, mientras que los ratones Bad 3SAtienen significativamente menos islotes. Se analizaron multiples secciones de al menos 3 animales por grupo de forma similar.

La Figura 48 es un histograma que demuestra el numero de islotes y su distribucion de tamano en secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de ratones Bad -/- despues de 16 semanas con HFD.

La Figura 49 es un histograma que muestra el numero de islotes y su distribucion de tamano en secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de ratones Bad +/+ despues de 16 semanas con HFD.

La Figura 50 es un histograma que indica el numero de islotes y su distribucion de tamano en secciones pancreaticas representativas preparadas a partir de ratones Bad 3SA despues de 16 semanas con HFD.

La Figura 51 describe brevemente el metodo de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico y la formula usada para calcular diversos parametros metabolicos.

La Figura 52 es una grafica lineal que documenta que se alcanzaba la euglucemia y se manterna en ratones Bad +/+ (n= 7) y Bad -/- (n= 9) a lo largo del periodo de pinzamiento.

La Figura 53 es una grafica lineal que muestra la tasa de infusion de glucosa (GINF) en ratones Bad +/+ (n= 7) y Bad -/- (n= 9) sometidos a analisis de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico.

La Figura 54 es un diagrama de barras que demuestra la produccion hepatica de glucosa calculada usando la formula de la Figura 51 (PHG).

La Figura 55 es un diagrama de barras que muestra el mdice de sensibilidad a la insulina periferica, que incluye captacion de glucosa, glucolisis y smtesis de glucogeno, todo medido usando la formula proporcionada en la Figura 51.

La Figura 56 es un diagrama de barras que documenta la captacion de glucosa en musculo esqueletico obtenido de animales Bad +/+ y Bad -/- sometidos a analisis de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico.

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La Figura 57 es un diagrama de barras que muestra la captacion de glucosa en tejidos adiposos blancos aislados de animales Bad +/+ y Bad -/- sometidos a analisis de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico.

La Figura 58 es un diagrama de barras que muestra el efecto de la insulina sobre el acido graso libre (FFA) plasmatico en animales Bad +/+ y Bad -/- sometidos a analisis de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico.

La Figura 59 es un diagrama de barras que muestra el efecto de la insulina sobre los ffpidos plasmaticos en animales Bad +/+ y Bad -/- sometidos a analisis de pinzamiento euglucemico-hiperinsulinemico.

La Figura 60 es una fotograffa que muestra el analisis histoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de hffgados extrafdos de ratones Bad -/- alimentados con dieta de control durante 16 semanas.

La Figura 61 es una fotograffa que muestra el analisis inmunohistoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de Iffgados extrafdos de ratones Bad 3SA alimentados con dieta rica en grasas durante 16 semanas.

La Figura 62 es una fotograffa que muestra el analisis inmunohistoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de hffgados extrafdos de ratones Bad +/+ alimentados con dieta de control durante 16 semanas.

La Figura 63 es una fotograffa que muestra el analisis inmunohistoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de hffgados extrafdos de ratones Bad -/- alimentados con dieta rica en grasas durante 16 semanas.

La Figura 64 es una fotograffa que muestra el analisis inmunohistoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de hffgados extrafdos de ratones Bad +/+ alimentados con dieta rica en grasas durante 16 semanas.

La Figura 65 es una fotograffa que muestra el analisis inmunohistoqmmico de una seccion de tejido preparada a partir de hffgados extrafdos de ratones Bad +/+ alimentados con dieta rica en grasas durante 16 semanas.

La Figura 66 representa un modelo para la funcion dual de BID en apoptosis y punto de control del dano de ADN. Ambos papeles se regulan mediante la modificacion postraduccional de BID en distintos residuos. Posteriormente a la senalizacion de receptor de muerte, se escinde BlD por la caspasa 8. Se modifica entonces la BID escindida mediante la adicion de restos lipfdicos (grupos miristefflo) y se transloca a mitocondrias para activar la apoptosis. Por otro lado, posteriormente al dano de ADN, se transloca la BID al nucleo, donde se modifica por fosforilacion por las cinasas de punto de control del ciclo celular ATM/ATR en residuos espedficos cercanos a su dominio BH3. Esta modificacion permite a BID funcionar en la detencion del ciclo celular (punto de control intrafase S), lo que en ultima instancia evita que las celulas reparen su ADN danado antes de la proliferacion.

La Figura 67 enumera los sitios de fosforilacion en las secuencias de BH3 de multiples protemas de la familia de BCL-2 definidos mediante bioinformatica y probados posteriormente. La derivatizacion de estos sitios en compuestos mimeticos de BH3 permitira la manipulacion de las protemas de la familia de BCL-2 que conmutan entre apoptosis y otra funcion homeostatica.

La Figura 68 es una fotograffa de una protema tenida en gel con Coomassie que muestra la metodologfa de reticulacion para ensayos de captura de diana usando la secuencia de BH3 de bAd. Los ensayos de captura de diana usan la metodologfa de reticulacion y la secuencia de BH3 de BAD fotoactivable. Se incubaron 20 pM del derivado de FITC de un peptido BAD de BH3 que contema 4-benzoilfenilalanina (vease el panel de captura de diana en la Figura 18) con 5 pM de BCL-Xl marcada con GST purificada en el paso de luz de 350 nm de un transiluminador TLC durante 135 min. La BCL-Xl tratada con vehffculo (DMSO) serna como control. Se cargaron las protemas en un gel PAGE-SDS y se tineron con Coomasie. La fotoactivacion da como resultado la reticulacion covalente de BCL-Xl y el peptido BH3, dando como resultado un desplazamiento de la movilidad de la protema BCL- Xl como se indica.

La Figura 69 es una fotograffa de una protema en gel sometida a un barrido de gel fluorescente que muestra la metodologfa de reticulacion para ensayos de captura de diana usando la secuencia BH3 de BAD. Se detecta el complejo proteico que contiene BCL-Xl reticulado con el peptido FITC BH3 de BAD.

La Figura 70 es una fotograffa de una inmunotransferencia que muestra la glucocinasa como una diana directa de BH3 de BAD. Se preincubaron 20 pM de compuestos de SAHB de BAD que conteman un resto benzofenona fotoactivable con extractos preparados a partir de celulas INS-1 durante 30 min a 23 °C seguido de exposicion a luz de 350 nm durante 2 h a 4 °C. Se detecto el enlace covalente de las SAHB a GK por inmunoprecipitacion de GK (IP). Se eluyo el material unido, se fracciono en gel y se transfirio (WB) usando anticuerpos anti-GK o anti-FITC.

La Figura 71 es una fotograffa de una inmunotransferencia que muestra la competicion de los compuestos de SAHB de BAD con BAD recombinante de longitud completa por la union a glucocinasa recombinante. Se cotradujeron BAD y GK usando transcripcion-traduccion in vitro (TTIV) en un sistema de lisado de reticulocito de conejo. Se coinmunoprecipitaron GK y BAD en presencia de 30 pM de compuestos de SAHB o DMSO en tampon RIPA usando las columnas de afinidad de GK descritas en la Fig. 31. Se resolvieron los complejos inmunitarios en PAGE-SDS y se sondearon (WB) con anticuerpo anti-BAD.

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Descripcion detallada

La presente invencion esta basada en parte en el descubrimiento de que el miembro proapoptotico BAD de la familia de BCL-2 reside en un complejo que contiene glucocinasa que regula la respiracion impulsada por glucosa. Mas espedficamente, la invencion esta basada en el descubrimiento de un papel fisiologico de BAD en la respiracion mitocondrial estimulada por glucosa, la sensibilizacion ante glucosa y la secrecion de insulina estimulada por glucosa por celulas p pancreaticas mediante la modulacion de la glucocinasa de celulas p. La funcion novedosa de BAD es espedficamente dependiente de la fosforilacion de su secuencia de BH3, definida anteriormente como un dominio de muerte esencial. Se usaron versiones estabilizadas qmmicamente de un peptido BAD con dominio BH3 fosforilado para restaurar la actividad glucocinasa, y se corrigieron la respiracion mitocondrial impulsada por glucosa y la secrecion de insulina en islotes deficientes en BAD. Por tanto, el dominio BH3 de BAD modula dos funciones separadas: apoptosis y metabolismo. De forma importante, la fosforilacion de un residuo de serina definido en la secuencia de BH3 constituye un interruptor molecular que instruye a BAD a asumir un papel metabolico. La senalizacion por factores de crecimiento y supervivencia afecta tanto al metabolismo celular como a la maquinaria apoptotica central. Multiples estudios recientes han asignado papeles novedosos a las protemas de la familia de BCL-2 en rutas homeostaticas normales, tales como metabolismo de la glucosa, homeostasis de Ca2+ en RE y respuesta ante el dano de ADN. Si estos papeles novedosos representan funciones separadas para estas protemas, que son conocidas de otro modo como reguladoras de la muerte celular, esta bajo investigacion activa. La protema proapoptotica BAD pertenece a un subconjunto de miembros de la familia de BCL-2 que comparten un motivo BH3 de helice a anfipatica conservado. La actividad proapoptotica de BAD se regula mediante la fosforilacion mediada por cinasas localizadas en la membrana mitocondrial. Para dilucidar el papel de BAD en la mitocondria, se realizo el analisis proteomico de mitocondrias de tngado, que revelo que BAD reside en un complejo que contiene glucocinasa (GK) que regula la respiracion impulsada por glucosa. El modelo genetico nulo de Bad mostraba que BAD es necesaria para el ensamblaje del complejo y que los ratones con insercion genica Bad 3SA no fosforilable proporcionaban pruebas de que la BAD fosforilada es necesaria para la activacion completa de GK anclada a mitocondria (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6). Consistentemente con un papel de BAD en la modulacion de la actividad GK, tanto los animales deficientes en Bad como Bad 3SA exhidan una homeostasis de glucosa anormal. Debido a que nulo de Badl y Bad 3SA representan modelos de perdida y ganancia de funcion para la actividad proapoptotica de esta molecula, respectivamente, las anormalidades metabolicas comunes en estos animales sugenan que el papel de BAD en el metabolismo de la glucosa puede ser distinto de su capacidad de sensibilizar a celulas ante la apoptosis. La GK se expresa principalmente en hepatocitos y celulas p pancreaticas y constituye un componente clave de la maquinaria de sensibilizacion de glucosa de mairnfero. En el dgado, la gK controla la smtesis de glucogeno y la salida de glucosa, mientras que en el pancreas regula la secrecion de insulina por celulas p. Por tanto, el defecto de homeostasis de glucosa observado en modelos de raton Bad puede derivar de deficiencias en cualquiera o ambos tejidos. Los enfoques geneticos y las herramientas qmmicas novedosas dilucidaban un papel esencial de BAD en la regulacion de la secrecion de insulina estimulada por glucosa (SIEG) por celulas p.

Por consiguiente, la invencion proporciona metodos de tratamiento, alivio de un smtoma o retardo del inicio de diabetes y obesidad mediante la administracion a un sujeto de un peptido BAD con dominio BH3 derivatizado o mimetico del mismo. Ademas, la invencion proporciona metodos de mejora de la supervivencia y la funcion de trasplantes de islote en sujetos que padecen la perdida de masa de celulas p.

PEPTIDOS BH3 Y MIMETICOS

Un peptido BH3 contiene el dominio BH3 de helice a anfipatica de la protema de la familia de Bcl-2. Un peptido BH3 incluye un dominio BH3 de BID, NOXA, BAD, BNIP3, HRK, NIX, SPIKE, BAK, BAX, BOK, BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL-1, PUMA, BIK, BIM y otros homologos que contienen el dominio BH3. No esta implicada una longitud particular por el termino “peptido". Se entiende por el termino “peptido” dos o mas aminoacidos naturales o sinteticos ligados por un enlace covalente (p.ej. un enlace amida).

Un peptido de dominio BH3 es menor de 195 aminoacidos de longitud, p.ej. menor o igual a 150, 100, 75, 50, 35, 25, 15 o 10 aminoacidos de longitud. Preferiblemente, el peptido de dominio BH3 es menor de 25 aminoacidos. El termino “peptido” incluye ademas dos o mas aminoacidos naturales o sinteticos ligados por un enlace covalente (p.ej., un enlace amida). El termino “aminoacido” hace referencia a una molecula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoacidos adecuados incluyen, sin limitacion, ambos isomeros D y L de los 20 aminoacidos comunes de origen natural encontrados en peptidos (p.ej., A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (como se conocen por las abreviaturas de una letra)) asf como los aminoacidos de origen natural y origen no natural preparados por smtesis organica u otras rutas metabolicas.

Los peptidos BH3 estan fosforilados en uno o mas residuos de serina, treonina o tirosina. Como alternativa, los peptidos BH3 son mimeticos de fosfopeptidos. Se entiende por mimetico de fosfopeptido que el mimetico de fosfopeptido se aproxima estrechamente a la funcionalidad del residuo fosforilado natural. Por ejemplo, los aminoacidos fosforilables se reemplazan por aminoacidos que imitan la carga negativa del atomo de fosforo, tales como acido glutamico o acido aspartico. Preferiblemente, el mimetico de fosfopeptido es qmmicamente estable (p.ej., resistente a la desfosforilacion por fosfatasas). Por ejemplo, el mimetico de fosfopeptido contiene un

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ligamiento no hidrolizable entre el esqueleto de carbono y el atomo de fosforo. Esto se consigue con una molecula sintetica que comprende la estructura atomica aminoaddica con un ligamiento no hidrolizable con un resto fosfato, en lugar del puente de oxfgeno de origen natural. Por ejemplo, un grupo CF2 liga el aminoacido con el fosfato. Pueden generarse mediante este enfoque mimeticos de varios aminoacidos que estan fosforilados en la naturaleza. Se generan mimeticos de fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina disponiendo un ligamiento CF2 desde el carbono apropiado al resto fosfato. Opcionalmente, la molecula mimetica acido L-2-amino-4-(dietilfosfono)-4,4- difluorobutanoico sustituye a la fosfoserina (Otaka et al., Tetrahedron Letters 36: 927-930 (1995)), el acido L-2- amino-4-fosfono-4,4-difluoro-3-metilbutanoico sustituye a la fosfotreonina y L-2-amino-4- fosfono(difluorometil)fenilalanina sustituye a la fosfotirosina. Son conocidos por los especialistas en la materia otros metodos de elaboracion de un ligamiento no hidrolizable o fosfomimetico estable de otro modo.

Los fosfomimeticos de serina, treonina y tirosina emplean especies que imitan las propiedades electronicas del grupo fosfato asf como evitan la hidrolisis del grupo fosfato por fosfatasas celulares endogenas, manteniendo por tanto las propiedades biologicas y la actividad del fosfopeptido. Hay dos enfoques que poseen las propiedades anteriores actualmente en uso establecido por la comunidad de investigacion biomedica.

El acido aspartico y el acido glutamico se aproximan ambos a la cadena lateral y la carga negativa neta de fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina, y han encontrado utilidad por su facilidad de incorporacion y simplicidad (Hao, Lowy et al, 1996; Fu, Subramanian et al. 2000; Modrof, Moritz et al. 2001). Las imitaciones mas exactas de mimeticos de fosfoserina/fosfotreonina/fosfotirosina no hidrolizables incluyen fosfonometilenalanina (Pma), (Shapiro, Buechler et al. 1993), fosfonodifluorometilenalanina (Pfa), (Berkowitz, Eggen et al. 1996), fosfonometilenfenilalanina (Pmp), (Burke, Russ et al. 1991) y fosfonodifluorometilenfenilalanina (F2Pmp), (Burke, Smyth et al. 1994), sustituyendo ambos el oxfgeno labil del grupo fosfato por un carbono no labil. Estos fosfomimeticos mas precisos son mas utiles porque mantienen mas del potencial de union por hidrogeno nativo del que sena posible con fosfomimeticos de acido aspartico y acido glutamico.

Un peptido BAD de dominio BH3 incluye un dominio BH3 de helice a de BAD. Un peptido BAD de dominio BH3 ejemplar incluye la secuencia:

fxaa)h YGR ELRXiXjXjDXi [Xbb)n (SEQIDNO:!)

en la que X1 y X2 son cualquier aminoacido no natural, X3 es G, D, E, S, T, Y o fosfomimeticos de los mismos. Por ejemplo, X2 es norleucina.

Xaa y Xbb son independientemente un aminoacido y n es un entero de 0-10.

Son otros ejemplos de BH3 similar a BAD al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas aminoacidos de 1 11 21

NLWAAQRYGR ELRRMSDEFV DSFKK (SEQ ID NO:2);

1 U 21

NLWJWJRYUR SLRRMDDEFV DSFKK I SEQ ID KO : 3 ) 0 |as secuencias mostradas en la Figure 18.

En ocasiones preferidas, X1 es o bien S5 o acido aminobutmco y X2 es preferiblemente norleucina. Cuando X1s es S5, los aminoacidos S5 pueden reaccionar formando una reticulacion toda de hidrocarburo. Preferiblemente, el aminoacido X3 esta modificado de tal modo que contenga una carga negativa neta que imita un resto fosfato o esta modificado de tal modo que se enmascare la carga negativa neta de modo que entre en la celula. Por ejemplo, el aminoacido X3 esta fosforilado, sulfonado, oxigenado, nitrado o fluorado o un equivalente funcional de los mismos. Opcionalmente, el aminoacido X3 ha experimentado esterificacion.

En diversas ocasiones, [Xaa]a es R, QR, AQR, AAQR, WAAQR, LWAAQR o NLWAAQR y [Xbb]a V, VD, VDS, VDSF, VDSFK o VDSFKK.

Un peptido BID de dominio BH3 incluye un dominio BH3 de helice a de BID. Un peptido BID de dominio BH3 ejemplar incluye la secuencia:

imagen1

en la que X1 y/o X4 son G, D, E, S, T o Y y X2 o X3 es cualquier aminoacido natural o no natural. En ocasiones preferidas, X2 y X3 son ambos S5. Cuando X2 y X3 son ambos S5, el aminoacido S5 puede hacerse reaccionar formando una reticulacion toda de hidrocarburo. Preferiblemente, el aminoacido X1 esta modificado de tal modo que contenga una carga negativa que imite un resto fosfato o esta modificado de tal modo que se enmascare la carga negativa de modo que pueda entrar en la celula. Por ejemplo, el aminoacido X1 y/o X4 esta fosforilado, sulfonado, oxigenado, nitrado o fluorado. Por ejemplo, X1 es D, E, S, To Y. En algunas ocasiones, X2 es Q y/o X3 es S, To Y. Opcionalmente, cuando X3 es S, T o Y, el aminoacido esta fosforilado, sulfonado, oxigenado, nitrado o fluorado.

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Se incluyen tambien en la invencion peptidos BH3 derivados de otros peptidos que contienen el dominio BH3; estos peptidos y los fosfomimeticos de los mismos son utiles en la modulacion de actividades enzimaticas (p.ej., cinasas y fosfatasas) e interacciones protema-protema (p.ej., interacciones MCL-I/BAK) y por lo tanto estan implicados en la manipulacion de muchas rutas homeostaticas celulares (vease la Figura 67). Los peptidos de bH3 ejemplares inclman las SEQ ID NO: 5-17 mostradas a continuacion.

0H3deBNIP3 DIERRKEVEXilLKKNX^WIWXiWXiXxRtSEQ ID NO:S>

BHJdeHRK AAQLXiAARLKALGDELHQRXiMWRRRARXj (SEQ ID NO; 6)

BHJdeNJX XiXiQX.EEEWEGEKEVEALKKSADWVX^WXiXxRPENlPPKEFtSEO ID

NO; 7)

BH3 de BID XiQEDIIRNIAHHLAQVGDSMDRXiI (SEQ ID NO:S) BH3deN0XA AELEVECAXiOLRRFGDKLNFRQKLLNLIX!- CSEO ID NO:9> BH3 de SPIKE LEAELDALGDELLADEDXiXjY (SEQ ID NO:lO)

BH3 de BAK LQPX1X1X1MGQVGRQLAIIGDD1NRRX1DX1E (SEQ IDNO:ll) BH3 de BAX QDAX1TKKLX1ECLKRIGDELDX1N (SEQ ID NO: 12)

BH3 de BOK PGRLAEVCAVLLRLGDELEMIRPXi (SEQ ID HO: 13)

BH3 de BCL-2 X1PVPPWELX1RQAGDDFXiRRYRRD{SEQ ID NO: 14)

BH3 de BCL-XLAVKQALREAGDEFELRX/RRAF Xi (SEQ ID NO:15)

BH3 de BCLW HQAMRAAGDEFETRFRRX^X^D (SEQ ID NO: 16)

BH3 de MCL-1 X;X1RKALEX1LRRUGDGVQRHH (SEQ ID N0:17)

en las que Xi es cualquier aminoacido natural o no natural. Preferiblemente, Xi es, E, D S, T o Y.

En estas y otras ocasiones, los aminoacidos no naturales (p.ej., S5) en los peptidos BH3 estan localizados o bien anterior o posteriormente a Xi, permitiendo el grapado de hidrocarburos. Los aminoacidos no naturales estan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoacidos separados entre sf. Por ejemplo, los dos aminoacidos no naturales estan uno o dos giros helicoidales (concretamente, aproximadamente 3, 4 o aproximadamente 7 aminoacidos) separados entre sf. Por consiguiente, los aminoacidos colocados en i e i+3; i e i+4 o i e i+7 son candidatos ideales para modificacion qmmica y reticulacion. Por tanto, por ejemplo, cuando un peptido tiene la secuencia Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, ... las reticulaciones entre Xaai y Xaa4, o entre Xaai y Xaa5, o entre Xaai y Xaas son utiles, asf como las reticulaciones entre Xaa2 y Xaa5 o entre Xaa2 y Xaa6 o entre Xaa2 y Xaa9, etc.

Los peptidos BH3 pueden ser polfmeros de L-aminoacidos, D-aminoacidos o una combinacion de ambos. Por ejemplo, en diversas realizaciones, los peptidos son D-retroinversopeptidos. El termino “isomero retroinverso” hace referencia a un isomero de un peptido lineal en que se invierte la direccion de la secuencia y se invierte la quiralidad de cada residuo aminoaddico. Veanse, p.ej., Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (i994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (i994). El resultado neto de combinar enantiomeros D y smtesis inversa es que las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amida estan intercambiadas, mientras que se conserva la posicion de los grupos de cadena lateral en cada carbono a. A menos que se afirme especfficamente otra cosa, se supone que cualquier secuencia de L-aminoacido dada de la invencion puede elaborarse hasta un D-retroinversopeptido sintetizando una inversion de la secuencia para la correspondiente secuencia de L-aminoacido nativo.

Opcionalmente, los peptidos BH3 incluyen aminoacidos modificados qmmicamente, incluyendo analogos aminoacfdicos (tales como penicilamina, 3-mercapto-D-valina), aminoacidos no proteogenicos de origen natral (tales como por ejemplo norleucina, p-alanina, ornitina, taurina, hidroxiprolina o hidroxilisina) y compuestos sintetizados qmmicamente que tienen propiedades conocidas en la materia por ser caractensticas de un aminoacido. El termino “proteogenico” indica que el aminoacido puede incorporarse a la protema de una celula mediante rutas metabolicas bien conocidas. Adicionalmente, los peptidos BH3 incluyen aminoacidos no naturales tales como los enantiomeros R y S del aminoacido olefrnico en el carbono 5 y el enantiomero S del aminoacido olefrnico en el carbono 8.

Se incluyen tambien en la divulgacion peptidos que son biologica o funcionalmente equivalentes a los peptidos descritos en la presente memoria. El termino “biologicamente equivalente” o “equivalente funcional” pretende

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significar que las composiciones de la presente invencion son capaces de demostrar algunos de o todos los mismos efectos moduladores de la secrecion de insulina estimulada por glucosa o la regulacion de la ruta homeostatica, aunque no necesariamente en el mismo grado que el polipeptido de dominio BH3 deducido de secuencias identificadas en colecciones de ADNc de origen humano, de rata o raton o producidas a partir de sistemas de expresion recombinantes.

Los peptidos BH3 pueden incluir tambien derivados de peptidos BH3 que se pretende que incluyan formas hforidas y modificadas de peptidos BH3, incluyendo protemas de fusion y fragmentos de peptido BH3 y formas modificadas en que se han eliminado o reemplazado ciertos aminoacidos y modificaciones tales como cuando se han cambiado uno o mas aminoacidos por un aminoacido modificado o aminoacido inhabitual y modificaciones tales como glucosilacion, siempre que la forma hforida o modificada retenga la actividad biologica de los peptidos BH3. Los terminos inducido y estimulado se usan intercambiablemente a lo largo de la memoria descriptiva. La actividad biologica de los peptidos BH3 incluye la simulacion de la actividad fisiologica de BAD y la restauracion de la homeostasis de insulina estimulada por glucosa y otras consecuencias de la deficiencia de BAD. La actividad biologica inclrna tambien union a su ligando natural.

Son variantes preferidas aquellas que tienen sustituciones aminoaddicas conservativas realizadas en uno o mas residuos aminoaddicos no esenciales predichos. Una “sustitucion aminoaddica conservativa” es aquella en que se reemplaza el residuo aminoaddico por un residuo aminoaddico que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la materia las familias de residuos aminoaddicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p.ej., acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales de ramificacion beta (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Ademas, pueden incorporarse aminoacidos no naturales. Por tanto, se reemplaza un residuo aminoaddico no esencial predicho en un polipeptido de dominio BH3 por otro residuo aminoaddico de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra realizacion, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificacion de BH3 (por tanto, incluyendo mutacion en sitios no esenciales y esenciales), tales como por mutagenesis por saturacion, y los mutantes resultantes pueden cribarse para identificar los mutantes que retienen la actividad. Se incluye tambien en el significado de sustancialmente homologo cualquier peptido BH3 que pueda aislarse en virtud de reactividad cruzada con anticuerpos del peptido BH3 descrito en la presente memoria o cuyas secuencias nucleotfdicas codificantes que incluyen ADN genomico, ARNm o ADNc puedan aislarse mediante hibridacion con la secuencia complementaria de secuencias nucleotfdicas genomicas o subgenomicas o el ADNc de los peptidos BH3 de la presente memoria o fragmentos de los mismos.

Los derivados, variantes y analogos pueden ser de longitud completa o distintos de longitud completa, si el derivado o analogo contiene un acido nucleico o aminoacido modificado. Los derivados o analogos de peptidos BH3 incluyen, p.ej., moleculas que incluyen regiones que son sustancialmente homologas de los peptidos, en diversas ocasiones con al menos aproximadamente un 30 %, 50 %, 70 %, 80 % o 95 %, 98 % o incluso 99 % de identidad con una secuencia aminoaddica de tamano identico o cuando se compara con una secuencia alineada en que se realiza el alineamiento por un programa informatico de homologfa conocido en la materia. Por ejemplo, la identidad de secuencia puede medirse usando software de analisis de secuencia (Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), con los parametros por defecto de mismo.

En diversas ocasiones, el peptido BH3 mantiene su estructura secundaria, p.ej. estructura de helice a. Son conocidos metodos de estabilizacion de helice en la materia.

Preferiblemente, el peptido BH3 es un peptido estable. Se entiende por “estable” que el peptido posee suficiente estabilidad para permitir la fabricacion y que mantiene la integridad del compuesto durante un periodo de tiempo suficiente para ser util con los fines detallados en la presente memoria. Por ejemplo, los peptidos se estabilizan covalentemente usando reticulaciones polares y/o labiles (Phelan et al. 1997 J. Am. Chem. Soc. 119: 455; Leuc et al. 2003 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 100: 11273; Bracken et al., 1994 J. Am. Chem. Soc. 116: 6432; Yan et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. 14: 1403). Como alternativa, los peptidos se estabilizan usando el enfoque basado en metatesis, que empleaba aminoacidos no naturales alfa,alfa-disustituidos que conteman anclajes de alquilo (Schafmeister et al., 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 5891; Blackwell et al. 1994 Angew Chem. Int. Ed. 37: 3281). Preferiblemente, los peptidos se estabilizan usando grapado de hidrocarburos. Los peptidos grapados son peptidos qmmicamente reforzados o “grapados” de modo que su forma, y por lo tanto su actividad, se restaura y/o mantiene. La reticulacion estable de un polipeptido que tiene al menos dos aminoacidos modificados (un proceso denominado “grapado de hidrocarburos”) puede ayudar a otorgar conformacionalmente la estructura secundaria nativa de ese polipeptido. Por ejemplo, la reticulacion de un polipeptido predispuesto a tener una estructura secundaria de helice alfa puede restringir el polipeptido a su conformacion de helice alfa nativa. La estructura secundaria restringida puede aumentar la resistencia del polipeptido ante la escision proteolftica y aumenta tambien la hidrofobicidad. Los peptidos BH3 grapados se producen, por ejemplo, como se describe en el documento WO05044839A2, incorporado a la presente memoria como referencia en su totalidad. Como alternativa, los peptidos BH3 son peptidos dclicos. Los peptidos dclicos se preparan mediante metodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la macrociclacion esta

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acompanada a menudo por la formacion de un enlace amida entre los extremos N y C del peptido, entre una cadena lateral y el extremo N o C [p.ej., con K3Fe(CN)6 a pH 8,5] (Samson et al., Endocrinology, 137: 5182-5185 (1996)), o entre dos cadenas laterales aminoaddicas. Vease, p.ej. DeGrado, Adv Protein Chem. 39: 51-124 (1988).

Como alternativa, el dominio BH3 es un ligando no natural, p.ej. un mimetico. Los mimeticos de BH3 ejemplares incluyen Gossypol, ABT263 y ABT 737. Otros mimeticos de bH3 incluyen aquellos descritos en Cell Death and Differentiation (2006) 13: 1339-1350, cuyos contenidos se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Un mimetico de dominio BH3 es un agente que es capaz de unirse a miembros de la familia de Bcl-2 e inducir una o mas actividades de BH3. Los mimeticos incluyen, por ejemplo, polipeptidos tales como anticuerpos, celulas fantasma o moleculas pequenas. Las moleculas pequenas incluyen, pero sin limitacion, peptidos, peptidomimeticos (p.ej., peptoides), aminoacidos, analogos de aminoacidos, acidos peptidonucleicos, conjugados de peptido-acido nucleico, polinucleotidos, analogos de polinucleotidos, nucleotidos, analogos de nucleotidos, compuestos organicos e inorganicos (incluyendo compuestos heterorganicos y organometalicos) que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 2.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 500 gramos por mol y sales, esteres y otras formas farmaceuticamente aceptables de tales compuestos.

Los peptidos BH3 o mimeticos de los mismos estan ligados operativamente (p.ej. covalentemente) con un peptido no BH3 formando una especie quimerica. Un peptido no BH3 hace referencia a un polipeptido que tiene una secuencia aminoaddica correspondiente a una protema que no es sustancialmente homologa al peptido BH3. El peptido no BH3 permite la adicion de una funcionalidad al peptido BH3. Por ejemplo, el peptido no BH3 es una secuencia de translocacion, una protema GST o una porcion de una molecula de inmunoglobulina, p.ej. la region Fc, o un derivado de acido nucleico.

Los peptidos BH3 descritos en la presente memoria pueden conjugarse igualmente con grupos detectables tales como biotina, radiomarcadores (p.ej., 35S, 125I, 131I, 111In), marcadores enzimaticos (p.ej., peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina) y marcadores fluorescentes (p.ej., fluorescema) de acuerdo con tecnicas conocidas.

Los peptidos BH3 se preparan facilmente usando tecnicas de clonacion modernas, o pueden sintetizarse mediante metodos en estado solido o mutagenesis dirigida a sitio. Un peptido de dominio BH3 puede incluir formas negativas dominantes de un polipeptido. En una realizacion, los peptidos BH3 nativos pueden aislarse de fuentes de celulas o tejidos mediante un esquema de purificacion apropiado usando tecnicas de purificacion de protema estandares. En otra realizacion, se producen polipeptidos de dominio BH3 mediante tecnicas de ADN recombinante.

Como alternativa a la expresion recombinante, los peptidos BH3 se sintetizan qmmicamente usando tecnicas de smtesis peptfdica estandares. Las transformaciones de qmmica sintetica y metodologfas de grupo protector (proteccion y desproteccion) utiles en la smtesis de los compuestos descritos en la presente memoria son conocidas en la materia e incluyen, por ejemplo, aquellas tales como se describen en R. Larock, “Comprehensive Organic Transformations”, VCH Publishers (1989); T. W. Greene y P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2a. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser y M. Fieser, “Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis”, John Wiley and Sons (1994) y L. Paquette, ed., “Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis”, John Wiley and Sons (1995), y posteriores ediciones de los mismos. Los peptidos de esta invencion pueden elaborarse mediante metodos de smtesis qmmica, que son bien conocidos por el especialista en la materia. Veanse, por ejemplo, Fields et al., Capftulo 3 en “Synthetic Peptides: A User's Guide”, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., Nueva York, N.Y., 1992, pag. 77. Por ello, los peptidos pueden sintetizarse usando las tecnicas de Merrifield automatizadas de smtesis en fase solida con el a-NH2 protegido por cualquiera de la qmmica de Boc o F-moc usando aminoacidos protegidos en la cadena lateral, por ejemplo, en un sintetizador peptfdico de Applied Biosystems modelo 430A o 431.

Es una manera de elaborar los peptidos descritos en la presente memoria usar la smtesis peptfdica en fase solida (SPFS). Se enlaza el aminoacido C-terminal con una resina de poliestireno reticulada a traves de un enlace labil a acidos con una molecula ligadora. Esta resina es insoluble en los disolventes usados para la smtesis, haciendo relativamente sencillo y rapido retirar por lavado el exceso de reactivos y subproductos. El extremo N esta protegido con el grupo Fmoc, que es estable ante acido pero retirable por base. Cualquier grupo funcional de cadena lateral esta protegido con grupos estables ante base labiles ante acido. Podnan elaborarse peptidos mas largos juntando peptidos sinteticos individuales usando ligamiento qmmico nativo. Como alternativa, pueden sintetizarse peptidos sinteticos mas largos mediante tecnicas de ADN recombinante bien conocidas. Tales tecnicas se proporcionan en manuales estandares bien conocidos con protocolos detallados. Para construir un gen que codifica un peptido de esta invencion, se traduce de forma inversa la secuencia aminoaddica para obtener una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia aminoaddica, preferiblemente con codones que sean optimos para el organismo en que se va a expresar el gen. A continuacion, se elabora un gen sintetico, tfpicamente sintetizando oligonucleotidos que codifican el peptido y cualquier elemento regulador, si es necesario. Se inserta el gen sintetico en un vector de clonacion adecuado y se transfecta a una celula hospedadora. Se expresa entonces el peptido en condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresion y hospedador seleccionados. Se purifica el peptido y se caracteriza por metodos estandares.

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Los peptidos pueden elaborarse de forma combinatoria de alto rendimiento, p.ej. usando un sintetizador combinatorio policanal de alto rendimiento de Advanced Chemtech.

Una protema “aislada” o “purificada” o porcion biologicamente activa de la misma esta sustancialmente libre de material celular u otras protemas contaminantes de la fuente de celulas o tejidos de la que deriva el peptido BH3, o sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente. La frase “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de peptidos BH3 en que la protema se separa de los componentes celulares de las celulas de las que se afsla o produce recombinantemente. En una realizacion, la frase “sustancialmente exento de material celular” incluye preparaciones de peptidos BH3 que tienen menos de aproximadamente un 30 % (en peso seco) de peptido no BH3 (al que se hace referencia tambien en la presente memoria como una “protema contaminante”), mas preferiblemente menos de aproximadamente un 20 % del peptido no BH3 y/o peptidos de dominio de no transduccion, todavfa mas preferiblemente menos de aproximadamente un 10 % de peptido no BH3 y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente un 5 % de peptido no BH3 y/o peptidos de dominio de no transduccion. Cuando el peptido BH3 o porcion biologicamente activa del mismo se produce recombinantemente, preferiblemente esta tambien sustancialmente libre de medio de cultivo, concretamente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20 %, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 10 % y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente un 5 % del volumen de la preparacion de protema.

La frase “sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos” incluye preparaciones de peptidos BH3 en que la protema esta separada de los precursores qmmicos u otros productos qmmicos que estan implicados en la smtesis de la protema. En una realizacion, la frase “sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos” incluye preparaciones de peptidos BH3 que tienen menos de aproximadamente un 30 % (en peso seco) de precursores qmmicos o peptido no BH3 y/o productos qmmicos de peptidos de dominio no de transduccion, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 20 % de precursores qmmicos o peptido no BH3 y/o productos qmmicos de peptidos de dominio de no transduccion, todavfa mas preferiblemente menos de aproximadamente un 10 % de precursores qmmicos o productos qmmicos de peptido no BH3 y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente un 5 % de precursores qmmicos o peptido no BH3 y/o productos qmmicos de peptidos de dominio de no transduccion.

METODOS TERAPEUTICOS

Se describen metodos tanto profilacticos como terapeuticos de tratamiento de un sujeto con riesgo (o susceptible) de un trastorno o que tienen un trastorno asociado a un metabolismo de glucosa aberrante (p.ej., insuficiente o excesivo) o anormalidades de la ruta apoptotica extrmseca o intrmseca. Como se usa en la presente memoria, el termino “tratamiento” se define como la aplicacion o administracion de un agente terapeutico a un paciente, o la aplicacion o administracion de un agente terapeutico a un tejido aislado o estirpe celular de un paciente que tiene una enfermedad, un smtoma de enfermedad o una predisposicion a una enfermedad, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, los smtomas de la enfermedad o la predisposicion hacia la enfermedad.

Se induce la secrecion de insulina por exposicion, p.ej. poniendo en contacto un tejido (p.ej. tejido de pancreas) o celula (p.ej. celulas p) con un peptido BH3 de BAD o mimetico. Se entiende por induccion un aumento de la produccion de insulina en comparacion con un tejido o celula que no ha estado en contacto con el peptido BH3 de BAD o mimetico. Se ponen en contacto los tejidos o celulas directamente con el peptido BH3 de BAD o mimetico. Como alternativa, se administra por via sistemica el peptido BH3 de BAD o mimetico. Se administran el peptido BH3 de BAD o mimetico en una cantidad suficiente para aumentar (p.ej., activar) la actividad glucocinasa, aumentar la concentracion de Ca2+ intracelular o rebajar los niveles sangumeos de glucosa. Se mide la secrecion de insulina mediante ensayos conocidos en la materia, tales como por ejemplo un ELISA espedfico de insulina. Como alternativa, se evalua la secrecion de insulina midiendo los niveles sangumeos de glucosa. Una vuelta a los niveles de glucosa basales (p.ej. normales) indica tambien un aumento de la secrecion de insulina.

Se aumenta la supervivencia de las celulas p al exponer una celula de islote p a un peptido BH3 de BAD o mimetico. Se entiende por aumento en la supervivencia una disminucion de la muerte celular en comparacion con una celula que no ha estado en contacto con el peptido BH3 de BAD o mimetico. Se mide la muerte celular mediante metodos conocidos en la materia tales como exclusion con azul de tripano. Se ponen en contacto las celulas directamente con el peptido BH3 de BAD o mimetico. Como alternativa, se administra el peptido BH3 de BAD o mimetico por via sistemica. Se pone en contacto la celula con el peptido BH3 de BAD o mimetico antes, durante o despues del trasplante de celulas en un sujeto.

Los metodos son utiles para tratar, aliviar los smtomas o retardar el inicio de diabetes o resistencia a la insulina. Diabetes incluye diabetes de tipo I o diabetes de tipo II. La diabetes de tipo I o diabetes insulinodependiente esta causada por la destruccion gradual de las celulas beta en el pancreas, dando como resultado la incapacidad del pancreas de producir insulina. La diabetes de tipo II o diabetes no insulinodependiente es debida a una combinacion de secrecion defectiva de insulina y sensibilidad defectiva ante la insulina (a menudo denominada sensibilidad reducida a la insulina). La diabetes del adulto de inicio juvenil (MODY) es una forma genetica de diabetes de tipo II.

La resistencia a la insulina (p.ej., prediabetes) es la afeccion en que las cantidades normales de insulina son

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inadecuadas para producir una respuesta normal ante la insulina de celulas de grasa, musculo e tugado. La resistencia a la insulina en celulas de grasa da como resultado la hidrolisis de los trigliceridos almacenados, lo que eleva los acidos grasos libres en el plasma sangumeo. La resistencia a la insulina en el musculo reduce la captacion de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el tugado reduce el almacenamiento de glucosa, sirviendo ambos efectos para elevar la glucosa sangumea. Los altos niveles plasmaticos de insulina y glucosa debidos a la resistencia a la insulina a menudo conducen al smdrome metabolico y diabetes de tipo 2.

El sujeto padece o esta en riesgo de desarrollar diabetes, enfermedad cardiovascular, hipertension, obesidad, retinopatfa diabetica o neuropatfas diabeticas. Los sujetos que padecen o estan en riesgo de desarrollar diabetes, retinopatfa diabetica, neuropatfas diabeticas, enfermedad cardiovascular, hipertension u obesidad se identifican mediante metodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la diabetes se diagnostica por ejemplo midiendo los niveles sangumeos de glucosa en ayunas o la insulina o por la prueba de tolerancia a la glucosa. Los niveles de glucosa en adultos normales son de 60-126 mg/dl. Los niveles de insulina normales son de 7 mU/ml ± 3 mU. La hipertension se diagnostica como una presion sangumea consistentemente en o por encima de 140/90. La enfermedad cardiovascular se diagnostica midiendo los niveles de colesterol. Por ejemplo, un colesterol LDL por encima de 137 o colesterol total por encima de 200 es indicativo de enfermedad cardiovascular. La obesidad se diagnostica, por ejemplo, por el mdice de masa corporal. El mdice de masa corporal (IMC) se mide por (kg/m2 (o Ib/pulgada2 x 704,5)). Como alternativa, se mide la circunferencia de la cintura (estima la distribucion de grasa), la relacion de cintura a caderas (estima la distribucion de grasa), el grosor del pliegue cutaneo (si se mide en varios sitios, estima la distribucion de grasa) o la bioimpedancia (basada en el principio de que la masa magra conduce la corriente mejor que la masa grasa (concretamente, la masa grasa dificulta la corriente), estima el % de grasa). Los parametros para individuos normales, con sobrepeso u obesos son los siguientes: bajo peso: IMC< 18,5; normal: IMC 18,5 a 24,9; sobrepeso: IMC= 25 a 29,9. Los individuos con sobrepeso se caracterizan por tener una circunferencia de cintura >94 cm para hombres o >80 cm para mujeres y relaciones de cintura a caderas > 0,95 en hombres y > 0,80 en mujeres. Los individuos obesos se caracterizan por tener un IMC de 30 a 34,9, tener mas de un 20 % por encima del peso “normal” para la altura, tener un porcentaje de grasa corporal > 30 % para mujeres y de 25 % para hombres y tener una circunferencia de cintura >102 cm (40 pulgadas) para hombres o 88 cm (35 pulgadas) para mujeres. Los individuos con obesidad grave o morbida se caracterizan por tener un IMC >35.

Los metodos descritos en la presente memoria conducen a una reduccion de la gravedad o al alivio de uno o mas smtomas de diabetes, resistencia a la insulina, un trastorno asociado a la diabetes o un trastorno asociado a un metabolismo aberrante de glucosa. Los smtomas de diabetes incluyen por ejemplo niveles de glucosa sangumea en ayunas elevados, presion sangumea a o por encima de 140/90 mmHg; niveles sangumeos de grasa anormales, tales como lipoprotemas de alta densidad (HDL) menores o iguales a 35 mg/dl, o trigliceridos mayores o iguales a 250 mg/dl (mg/dl= miligramos de glucosa por decilitro de sangre). Se determina la eficacia del tratamiento en asociacion con cualquier metodo conocido para el diagnostico o el tratamiento de diabetes, resistencia a la insulina o un trastorno asociado a diabetes. El alivio de uno o mas smtomas de diabetes, resistencia a la insulina o un trastorno asociado a la diabetes indica que el compuesto confiere un beneficio clmico. Los trastornos asociados a la diabetes incluyen, por ejemplo, insuficiencia renal, ceguera, neuropatfa y enfermedad arterial coronaria. Se diagnostican y/o monitorizan diabetes, resistencia a la insulina o un trastorno asociado a la diabetes tfpicamente por un medico usando metodologfas estandares. Por ejemplo, se diagnostica la diabetes por una prueba de glucosa plasmatica en ayunas o una prueba de glucosa oral. Los niveles de glucosa en ayunas menores de 99 mg/dl son normales. Un nivel de glucosa en ayunas de 100 a 125 mg/dl indica prediabetes. Un nivel de glucosa de 126 mg/dl o mayor es indicativo de diabetes.

Se administran un peptido BH3 de BAD o mimetico con un compuesto antidiabetico. Los ejemplos de compuestos antidiabeticos incluyen, pero sin limitacion, insulina, farmacos de sulfonilurea, meglitinidas, biguanidas, inhibidores de alfa-glucosidasa, tiazolidindionas o compuestos activadores de GK (GKA). Los compuestos GKA ejemplares incluyen el compuesto de Roche RO-28-1675, el compuesto de Lilly LY2121260 y los compuestos de AstraZeneca GKA1 y 2 (Veanse Grimsby et al. Science (2003) 301: 370-373. McKerrecher, et al Bioorganic an Med Chem Letters (2005) 2103-2106 y Brocklehurst et al. Diabetes (2004) 53: 535-541, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad).

Se modulan, aumentan o disminuyen el crecimiento tumoral o la proliferacion celular poniendo en contacto una celula tumoral con un peptido BH3 o mimetico. Por ejemplo, al inhibir la utilizacion de glucosa en una celula tumoral, disminuye el crecimiento celular. Como alternativa, al aumentar la utilizacion de glucosa en una celula tumoral, aumenta el crecimiento celular. Tanto aumentar como disminuir el crecimiento tumoral tiene beneficio terapeutico. Disminuir el crecimiento tumoral retarda la progresion del tumor, mientras que aumentar el crecimiento tumoral puede hacer al tumor mas sensible ante agentes terapeuticos tales como quimioterapia o radiacion. Como alternativa, puede conseguirse la modulacion del crecimiento tumoral conmutando la funcion de BH3 entre las rutas homeostatica y proapoptotica, y reactivando asf la muerte celular en el cancer.

Se modulan las rutas homeostaticas celulares poniendo en contacto una celula con un peptido BH3 o mimetico del mismo. Por ejemplo, puede modularse la progresion de la celula por el ciclo celular mediante la administracion de un peptido BH3 de BID, un mimetico o fosfomimetico del mismo.

La celula es cualquier celula, tal como una celula de tugado o una celula de cerebro.

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El sujeto puede ser, p.ej., un mairnfero, p.ej. un ser humano, un primate, raton, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo.

ADMINISTRACION TERAPEUTICA

Los compuestos, p.ej. peptidos BH3 o mimeticos (a los que se hace referencia tambien en la presente memoria como “compuestos activos) descritos en la presente memoria y los derivados, fragmentos, analogos y homologos de los mismos pueden incorporarse a composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion. Tales composiciones comprenden tfpicamente el peptido o mimetico y un portador farmaceuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, “portador farmaceuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares compatibles con la administracion farmaceutica. Se describen los portadores adecuados en la edicion mas reciente de “Remington's Pharmaceutical Sciences”, un texto de referencia estandar en el campo, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Los ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, pero sin limitacion, agua, disolucion salina, disoluciones de Finger, disolucion de dextrosa y seroalbumina humana al 5 %. Pueden usarse tambien liposomas y vetuculos no acuosos tales como aceites no volatiles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Pueden incorporarse tambien compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Se formula una composicion farmaceutica de la invencion para ser compatible con su via de administracion pretendida. Los ejemplos de vfas de administracion incluyen administracion parenteral, p.ej. intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (p.ej., inhalacion), transdermica (topica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyecciones, disolucion salina, aceites no volatiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clortndrico o hidroxido de sodio. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis multiples compuestos de vidrio o plastico.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones (cuando sean hidrosolubles) o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para administracion intravenosa, los portadores adecuados incluyen disolucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o disolucion salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y debena ser fluida en la medida en que exista una facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse frente a la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. Puede conseguirse la prevencion de la accion de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. Puede causarse la absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables esteriles pueden prepararse mediante la incorporacion del compuesto activo (p.ej. un peptido BH3 o mimetico) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, son metodos de preparacion secado a vado y liofilizacion, que procuran un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolucion previamente filtrada por esterilizacion del mismo.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en capsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Con el fin de administracion terapeutica oral, puede incorporarse el compuesto activo con excipientes y usarse en forma de comprimidos, comprimidos oblongos o capsulas. Las composiciones orales pueden prepararse tambien usando un portador lfquido para uso como colutorio, en el que el compuesto en el portador lfquido se aplica oralmente y se enjuaga, expectora o traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes y/o materiales coadyuvantes farmaceuticamente compatibles como parte de la composicion. Los comprimidos, pfldoras, comprimidos oblongos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma

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de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa; un agente disgregante tal como acido algmico, Primogel o almidon de ir^z; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina o un agente aromatizante tal como menta piperita, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para administracion por inhalacion, se suministran lo compuestos en forma de un pulverizador de aerosol desde un envase a presion o dispensador que contiene un propelente adecuado, p.ej. un gas tal como dioxido de carbono, o un nebulizador.

La administracion sistemica puede ser tambien por medios transmucosos o transdermicos. Para administracion transmucosa o transdermica, se usan en la formulacion penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo para administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del acido fusfdico. La administracion transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para administracion transdermica, se formulan los compuestos activos en pomadas, unguentos, geles o cremas como es generalmente conocido en la materia.

Los compuestos pueden prepararse tambien en forma de supositorios (p.ej. con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para suministro rectal.

En una ocasion, se preparan los compuestos activos con portadores que protegeran al compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, tales como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polfmeros biodegradables biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, poliantndridos, poli(acido glicolico), colageno, poliortoesteres y poli(acido lactico). Los metodos para la preparacion de tales formulaciones resultaran evidentes para los especialistas en la materia. Los materiales pueden obtenerse tambien comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Pueden usarse tambien suspensiones liposomicas (incluyendo liposomas orientados a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales de antfgenos vmcos) como portadores farmaceuticamente aceptables. Estas pueden prepararse segun metodos conocidos por los especialistas en la materia, por ejemplo, como se describen en la patente de EE.UU. n° 4.522.811, incorporada totalmente a la presente memoria como referencia.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificacion por la facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. Forma de unidad de dosificacion como se usa en la presente memoria hace referencia a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas de unidad de dosificacion de la invencion esta dictada por y es directamente dependiente de las caractensticas unicas del compuesto activo y del efecto terapeutico particular para conseguir.

Las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un envase, paquete o dispensador junto con instrucciones para administracion.

ENSAYOS DE CRIBADO

Se describen tambien metodos (a los que se hace referencia tambien en la presente memoria como “ensayos de cribado”) para la identificacion de agentes que modulan la actividad de glucocinasa o modulan el ciclo celular.

Puede exponerse un peptido BH3 marcado, p.ej. marcado fluorescentemente, o fragmento del mismo (p.ej., BID, BAD, BAK, BAX, etc.) en presencia de su protema diana (p.ej. glucocinasa) a concentraciones variables de un compuesto candidato (p.ej., 1 nM, 10 nM, 1o0 nM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 mM y 10 mM) para identificar inhibidores moleculares de esta interaccion. Opcionalmente, el peptido BH3 esta fosforilado. Se analiza entonces el efecto de cada concentracion de compuesto candidato para determinar el efecto del compuesto candidato sobre la actividad glucocinasa, el ciclo celular o la actividad de union a protema diana de BH3 in vivo. El compuesto candidato puede modular la actividad glucosa cinasa o el ciclo celular de manera competitiva o no competitiva. Pueden efectuarse tambien ensayos de union directa entre protemas de la familia de Bcl-2 y compuestos candidatos marcados fluorescentemente para determinar la Kd de la interaccion de union. Tambien puede cribarse en los compuestos candidatos la actividad biologica in vitro, por ejemplo midiendo su eficacia de respuesta a la dosis y para desencadenar la liberacion de citocromo c de mitocondrias purificadas, el potencial de membrana mitocondrial o la actividad glucocinasa como se valora por la produccion de NADH mediada por glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.

Los ensayos descritos en la presente memoria pueden efectuarse con compuestos candidatos individuales o pueden efectuarse con una pluralidad de compuestos candidatos. Cuando los ensayos se efectuan con una pluralidad de compuestos candidatos, los ensayos pueden efectuarse usando mezclas de compuestos candidatos o pueden realizarse en reacciones paralelas, teniendo cada reaccion un solo compuesto candidato. Los compuestos o agentes de prueba pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques de metodos de coleccion combinatoria conocidos en la materia.

En una ocasion, el ensayo es un ensayo bioqmmico, mediante el que los polipeptidos grapados por hidrocarburos pueden ligarse con resina de afinidad para purificar o identificar copartfcipes interactivos nuevos o conocidos en

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rutas homeostaticas, tales como la ruta de glucocinasa o el ciclo celular. En otra ocasion, la protema grapada con hidrocarburos contiene un resto fotoactivable que posibilita formar una reticulacion covalente con un copartfcipe nuevo o conocido en rutas homeostaticas, tales como la ruta de glucocinasa o el ciclo celular.

La invencion se describira ademas en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. El papel de BAD en la funcion de celulas p

Para examinar el papel de BAD en celulas p, se valoro la secrecion de insulina en una cohorte de ratones Bad +/+ y Bad -/- usando analisis de pinzamiento hiperglucemico. Se realizo un pinzamiento de 2 horas con una infusion cebada y variable de 20 % de glucosa para elevar y mantener las concentraciones plasmaticas de glucosa a 300 mg/dl en ratones Bad +/+ (n= 10) y Bad -/- (n= 12). (Fig. 5). El analisis de los niveles plasmaticos de insulina en multiples puntos temporales durante el periodo de pinzamiento indicaba una alteracion significativa de la secrecion de insulina en ratones deficientes en Bad (Fig. 6). El area bajo la curva (AUC) para la respuesta a insulina a lo largo del experimento (0-120 min) mostraba un 32 % de reduccion en ratones Bad -/- (p< 0,05, Fig. 7). Las fases aguda (030 min) y tardfa (30-120 min) de secrecion estaban marcadas por un 37 % (p< 0,01) y 30 % (p< 0,05) de reduccion, respectivamente (Fig. 7).

Para determinar si este defecto de secrecion de insulina se manifiesta igualmente in vitro, se sometieron islotes purificados de ratones Bad-/- a ensayos de perfusion (Cunningham BA. et al., 1996. Am J Physiol 271, E702-10) (Fig. 8). Despues de un periodo de preperfusion de 25 min con glucosa 3 mM, se perfundieron 120 islotes de cada genotipo con glucosa 3 mM y 25 mM como se indica. Despues de 40 min, se alterno la solucion de perfusion a KCl 30 mM para despolarizar la membrana plasmatica y liberar el conjunto total de granulos de insulina. El contenido de ADN por islote era de 12,4 ng y de 14,6 ng para ratones Bad +/+ y Bad -/-, respectivamente. El AUC para la primera fase de liberacion (min 8-15) era de 12,50 frente a 5,98, y para la segunda fase (min 15-40) de 15,05 frente a 8,44, en Bad +/+ y Bad -/- respectivamente. Los islotes Bad -/- perfundidos con glucosa 25 mM secretaban niveles significativamente menores de insulina durante ambas primera y segunda fases de la respuesta secretora. Sin embargo, el conjunto total de insulina liberada por KCl estaba inalterado (Fig. 8). Aunque la magnitud de la liberacion de insulina era menor, el patron oscilatorio de secrecion en los islotes Bad -/- era comparable a los islotes de control (datos no mostrados). Estos resultados indican que la deficiencia en Bad compromete la capacidad de las celulas p de secretar insulina en respuesta ante la glucosa, lo que puede haber contribuido en parte a la tolerancia anormal a la glucosa resenada anteriormente en ratones Bad -/- (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6).

Ejemplo 2. El papel de los componentes de la ruta de secrecion de insulina en el defecto secretor de insulina en celulas p Bad -/La ruta de secrecion de insulina inducida por glucosa en celulas p consiste en eventos mitocondriales tanto proximales como distales (Wiederkehr A. y Wollheim C.B., 2006. Endocrinology 147, 2643-9). Las mitocondrias generan los factores de acoplamiento metabolico requeridos para la induccion de la liberacion de insulina por glucosa y otros nutrientes. El aumento de la relacion de ATP/ADP intracelular es un factor de acoplamiento metabolico importante en este proceso que conduce al cierre de los canales de K sensibles a ATP (Katp) en la membrana plasmatica, seguido de despolarizacion de membrana y apertura de los canales de Ca2+ sensibles al voltaje (Ashcroft F.M. y Gribble F.M., 1999. Diabetologia 42, 903-19; Rorsman P, 1997. Diabetologia 40, 487-95). El aumento de la concentracion de Ca2+ intracelular [Ca2+]i estimula a su vez la liberacion de insulina. Consistentemente con su defecto secretor en respuesta ante la glucosa, los islotes Bad -/- no consegrnan mostrar un aumento robusto de la relacion de ATP/ADP (Fig. 9), sugiriendo la falta de un acoplamiento metabolico suficiente.

Para examinar si las etapas mitocondriales distal y proximal implicadas en la liberacion de insulina estan intactas en islotes Bad -/-, se probaron varios secretagogos bien caracterizados. El KlC (acido a-cetoisocaproico) es un secretagogo nutriente que alimenta el ciclo de TCA mitocondrial independientemente de la fosforilacion de glucosa por GK (Gao Z, et al., 2003. Endocrinology 144, 1949-57). Se cultivaron islotes Bad +/+ y Bad -/- en medios que conteman la cantidad indicada de glucosa en presencia o ausencia de acido 2-cetoisocaproico (KIC) 10 mM, tolbutamida 0,25 mM o carbacol 0,25 mM. Se midio la secrecion de insulina usando el metodo de incubacion estatica. El contenido de insulina por islote era de 115,1 ± 4,64 y 118,49 ± 4,09 ng, para Bad +/+ y Bad -/-, respectivamente. La secrecion de insulina inducida por KIC por islotes deficientes en Bad era robusta y comparable con la observada en controles (Fig. 10). Se probaron las etapas mitocondriales distales, incluyendo aquellas que culminan en el aumento del [Ca2+]i y la activacion de la maquinaria secretora, usando la sulfonilurea tolbutamida y el receptor de acido muscarmico carbacol. La tolbutamida se une a y cierra el canal de Katp independientemente de los cambios en la relacion de ATP/ADP (Proks P. et al., 2002. Diabetes 51 Supl 3, S368-76), permitiendo el examen de la senalizacion posterior de este canal. Se uso carbacol para valorar si la liberacion mediada por IP3 de los almacenes de Ca2+ intracelular ocunia apropiadamente. La respuesta de los islotes Bad -/- tanto ante tolbutamida como carbacol era comparable a los islotes de tipo silvestre (Fig. 10). Este analisis farmacologico de la secrecion de insulina sugiere que los islotes Bad -/- no estan globalmente alterados en su respuesta secretora.

La eficacia de la glucosa y otros secretagogos de alimentacion para estimular la secrecion de insulina se correlaciona estrechamente con su capacidad de hiperpolarizar el potencial de membrana mitocondrial (A^m) (Antinozzi P.A. et al., 2002. J Biol Chem. 277, 11746-55). En celulas p, los rasgos caractensticos de la respiracion

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impulsada por glucosa se correlacionan con los de la fosforilacion de glucosa por GK (Liang Y, et al., 1996. Am J Physiol 270, E846-57). Se valoro la hiperpolarizacion de membrana mitocondrial inducida por glucosa en celulas p Bad +/+ y Bad -/-. Para calcular el A^, se analizaron los cambios en la intensidad de fluorescencia de ester etilico de tetrametilrodamina (TMRE) en multiples celulas individuales tras un aumento de glucosa de 3 mM a 8 mM o despues de la adicion de KIC 10 mM en presencia de glucosa 3 mM (Heart E. et al., 2006. Am J Physiol Endocrinol Metab 290, E143-E148). Se cocargaron los islotes dispersados con Mitotracker y el tinte potenciometrico TMRE. Se registraron las alteraciones en A^m de celulas p Bad +/+ y Bad -/- individuales (Fig. 11). Un aumento de la intensidad de fluorescencia de TMRE refleja la hiperpolarizacion del potencial de membrana mitocondrial y se usa como mdice de la respiracion. Los cambios inducidos por glucosa en el A^m se redudan significativamente en celulas p Bad -/(Fig. 12, 1,84 ± 1,58 en Bad -/- frente a 6,88 ± 1,71 en Bad +/+, n= 10), mientras que KIC induda cambios comparables en el A^m en ambos genotipos (Fig. 12). Estos datos indican que el defecto de secrecion de insulina en celulas p Bad -/- implica un componente mitocondrial proximal selectivo de glucosa.

Ejemplo 3. Los efectos de BAD sobre la actividad GK y la sensibilizacion ante glucosa por celulas p

El aspecto selectivo de glucosa del defecto de celulas p Bad -/- daba pie a un minucioso examen de GK en estas celulas. Se ha resenado anteriormente por los inventores de que BAD se asocia con la isoforma hepatica de GK en las mitocondrias, y que los hepatocitos nulos de Bad exhiben una actividad GK anclada a mitocondrias y respiracion impulsada por glucosa debilitadas (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6). Debido a que las isoformas hepatica y de celulas p de GK se regulan diferentemente, se justidicaba la evaluacion del efecto regulatorio potencial de BAD sobre la isoforma de celulas p de la enzima. Para determinar la capacidad de la glucocinasa de asociarse con BAD en celulas p, se ligaron covalentemente anticuerpo anti-GK (carriles 1-3) o IgG de conejo de control (carriles 4-6) con gel de acoplamiento AminoLink Plus (Pierce) segun las instrucciones del fabricante y se incubaron con fraccion de membrana pesada (HM) enriquecida en mitocondrias solubilizada en CHAPS preparada a partir de celulas p MIN6 (Figura 31). Se eluyo secuencialmente el material unido, se resolvio por PAGE-SDS y se sometio a inmunotincion (WB) con anticuerpos anti-glucocinasa o anti-BAD. De forma similar, la Figura 32 muestra los resultados de la purificacion por afinidad con microcistina de protemas de interaccion con PP1 en mitocondrias aisladas de celulas p MIN6. Se solubilizo la fraccion HM enriquecida en mitocondrias en CHAPS 15 mM y se incubo con perlas de agarosa acopladas con microcistina (MC) (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6). Se resolvieron las protemas unidas por PAGE-SDS y se sometieron a inmunotincion (WB) con los anticuerpos indicados. La isoforma de celulas p de GK se asocia con bAd en las mitocondrias en un complejo similar al encontrado en hepatocitos (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6).

La Figura 13 muestra la actividad glucocinasa en homogeneizados de islotes primarios aislados de ratones Bad +/+ y Bad -/-. Se midio la actividad glucocinasa como la diferencia entre la actividad fosforilante de glucosa a glucosa 100 mM y 0,5 mM. Se midio la actividad fosforilante de glucosa como el aumento de la fluorescencia de NADH en una reaccion impulsada por glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (Trus M.D. et al., 1981. Diabetes 30, 911-22). Los ensayos de GK en homogeneizados preparados a partir de islotes Bad -I- primarios mostraban una actividad enzimatica reducida en comparacion con los islotes de control (Fig. 13). Es un sello caractenstico de la disfuncion de celulas p asociada a la actividad GK debilitada la perdida de sensibilizacion ante glucosa, evidente por un desplazamiento a la derecha de la respuesta a la dosis de glucosa de la secrecion de insulina (Byrne M.M. et al., 1994. J Clin Invest 93, 1120-30). Para delimitar adicionalmente la importancia de la actividad GK debilitada en el defecto secretor de celulas p nulas de Bad, se perfundieron islotes pancreaticos con concentraciones crecientes de glucosa (Fig. 14). Se perfundieron 120 islotes de cada genotipo como en la Figura 8 y se recogieron las fracciones correspondientes al primer pico de liberacion de insulina para medidas de insulina antes de alternar a la siguiente dosis de glucosa. Los islotes nulos de Bad requenan mas glucosa para liberar la misma magnitud de insulina secretada por los islotes de control. Por ejemplo, la cantidad de insulina liberada por islotes Bad -/- a glucosa 25 y 35 mM era comparable con la liberada por islotes Bad +/+ a glucosa 15 y 20 mM, respectivamente (Fig. 14). Los islotes de control mostraban la mayor induccion en veces de liberacion de insulina de 10 a 15 mM, seguido por aumentos menores pero significativos con incrementos adicionales de glucosa de hasta glucosa 25 mM. El aumento de la liberacion de insulina a estas mismas concentraciones de glucosa estaba significativamente debilitado en islotes Bad -/- (Fig. 14). Estos resultados son consistentes con las anormalidades en la sensibilizacion frente a GK y glucosa en islotes nulos de Bad.

Ejemplo 4. El papel del dominio BH3 de BAD en la secrecion de insulina

Como prueba rigurosa para determinar si el defecto secretor en los islotes Bad -/- esta directamente relacionado con la funcion de BAD en celulas p o es producto de otros cambios en los ratones Bad -/-, se restauro la expresion de BAD en islotes Bad -/- purificados usando adenovirus. Se ensayo la liberacion de insulina como en la Figura 10. Antes de la correccion genetica, los islotes Bad -/- no consegrnan exhibir un aumento por etapas de la liberacion de insulina con aumentos incrementales de las concentraciones de glucosa (Fig. 15, Bad -/- frente a Bad +/+ infectados con virus de GFP de control). La reintroduccion de BAD en estos islotes era suficiente para corregir el defecto y confena un comportamiento secretor sensible a la dosis robusto con concentraciones crecientes de glucosa (p< 0,001, Fig. 15, Bad -/-: GFP-BAD, liberacion a 12,5 mM frente a 5,5 mM y p< 0,01 a glucosa 25 mM frente a 12,5 mM). El contenido de insulina por islote era de 122,75 ± 12,34 y 127,13 ± 5,09 ng, para Bad +/+ y Bad -/-, respectivamente. Estos datos son consistentes con la conclusion de que la perdida de BAD en las celulas p confiere

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un defecto secretor de insulina.

Los mutantes de BAD permitian una diseccion adicional de los requisitos moleculares para la funcion novedosa de BAD. Como la propiedad bioqmmica mejor establecida de BAD es la union a alta afinidad a copartfcipes antiapoptoticos, se justificaba un examen detallado de si el efecto de BAD sobre la secrecion de insulina estaba mediado por su union a BCL-2/Xl. El dominio BH3 de BAD es una helice a anfipatica que se une al bolsillo hidrofobo de BCL-2/Xl neutralizando asf su actividad antiapoptotica (Zha J. et al., 1997. J Biol Chem 272, 24101-4; Kelekar A. et al., 1997. Mol Cell Biol 17, 7040-6; Petros A.M. et al., 2O0O. Protein Sci 9, 2528-34). La leucina 151 (enumeracion de BADl de raton) del dominio BH3 es importante en la union a BCL-2/Xl, por consiguiente la mutacion L^A anula la actividad proapoptotica de BAD (Zha J. et al., 1997. J Biol Chem 272, 24101-4). Al contrario que la BAD de tipo silvestre, la correccion genetica con un BAD mutante L^A no era capaz de corregir el defecto de SIEG en islotes Bad -/- (Fig. 15, p> 0,05 a todas las concentraciones de glucosa, Bad -/-: GFP frente a Bad -/-: GFP-BAD L^A), confirmando por tanto la especificidad del efecto de BAD de tipo silvestre observado.

Ejemplo 5. Fosforilacion de BAD: un determinante molecular de la BAD apoptotica frente a las funciones metabolicas

El requisito de un dominio BH3 de BAD intacto en SIEG abna la posibilidad de que esta actividad pudiera estar mediada por la union a BCL-2/Xl. Para explorar adicionalmente este mecanismo, se empleo un mutante de BAD en que los 3 sitios de fosforilacion de serina (S112, S136 y S155) se convertfan en alanina (BAD 3SA) (Datta S.R. et al., 2002. Dev Cell 3, 631-43). Como la interaccion entre BAD y BCL-2/Xl se inhibe por la fosforilacion (Zha J. et al., 1996. Cell 87, 619-28), BAD 3SA constituye un mutante no represible que rebaja el umbral para la apoptosis (Datta S.R. et al., 2002. Dev Cell 3, 631-43). Debido a que los adenovirus portadores de este mutante eran toxicos para los islotes en los ensayos de reconstitucion genetica, se estudiaron islotes aislados de ratones con insercion genica Bad 3SA no fosforilable. Es importante que los ratones Bad 3SA muestran actividad GK debilitada en los islotes (datos no mostrados) y en el hngado (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6). Como los islotes Bad -/-, los islotes Bad 3SA exhibfan SlEG alterada (Fig. 16). Se valoro la secrecion de insulina usando el metodo de incubacion estatica como anteriormente. El contenido de insulina por islote era de 118,74 ± 3,86, 96,46 ± 3,42 y 106,5 ± 6,24 ng, para Bad +/+, Bad 3SA y Bad S155A, respectivamente. Aunque las mutaciones 3SA y L^A comparten defectos similares en la secrecion de insulina, exhiben capacidades opuestas para interactuar con BCL-Xl. Estos hallazgos sugieren que la capacidad de BAD de regular la secrecion de insulina y su capacidad de contrarrestar los copartfcipes prosupervivencia no se cosegregan, destacando una funcion novedosa para el dominio BH3 de BAD aparte de su papel en la regulacion de la apoptosis.

Ejemplo 6. El papel de compuestos mimeticos de BAD en la liberacion de insulina

Para determinar si el dominio BH3 de BAD mismo es suficiente para corregir el defecto de SIEG observado en islotes nulos de Bad, se trataron islotes pancreaticos con un panel de peptidos “grapados” correspondientes a esta region. Se modificaron las secuencias de BH3 por un metodo qmmico conocido como grapado de hidrocarburos, usado recientemente para generar helices alfa estabilizadas de dominios de BCL-2 (SAHB) que resumen la bioactividad de BH3 (Fig. 17-18 y Figura 33) (Walensky L.D. et al., 2004. Science 305, 1466-70).

La Figura 33 muestra un esquema de una estrategia sintetica de grapado de hidrocarburos. Se efectuo la smtesis asimetrica de S-N-(carbamato de 9-fluorenilmetil)-2-(4'-pentenil)alanina ("S5") como se describe anteriormente (Schafmeister C. et al., 2000. J Am Chem Soc 122, 5891-5892; Williams R.M. e Im M.N., 1991. J Am Chem Soc 113, 9276-9286). Se generaron los compuestos de SAHB reemplazado dos aminoacidos de la secuencia de BH3 por aminoacidos no naturales en localizaciones discretas que flanquean 3 aminoacidos naturales (posiciones i, i+4). Se efectuaron la smtesis peptfdica, metatesis olefmica, derivatizacion de FITC, purificacion por HPLC en fase inversa y microanalisis como se resena anteriormente para SAHB de BID (Walensky L.D. et al., 2004. Science 305, 1466-70). Se reemplazo la metionina nativa de BH3 de BID por norleucina (Nl) en SAHB de BID debido a la incompatibilidad del azufre con la reaccion de metatesis catalizada por rutenio. La caracterizacion de los compuestos grapados revelaba una helicidad (Figura 34) y permeabilidad celular (datos no mostrados) comparables. Se evaluo tambien una coleccion de truncamiento para valorar la tolerancia al acortamiento del peptido bioactivo BH3 de BAD como se valora por la retencion de una actividad de union a BCL-Xl de alta afinidad (veanse las secuencias de la figura de truncamiento y la isoterma de union en la Figura 18). Sorprendentemente, la SAHBa de BAD restauraba el defecto de secrecion en islotes Bad -/- a 3 pM, una concentracion que no es toxica para los islotes (p< 0,001, Fig. 17, secrecion a glucosa 12,5 frente a 5,5 mM y p< 0,05 secrecion a glucosa 25 frente a 12,5 mM en Bad -/- tratados con SAHBa de BAD). Aunque el efecto de SBHBa de BAD sobre la restauracion de la liberacion de insulina no alcanzaba la magnitud de la observada al reemplazar por la protema de longitud completa usada en la reconstitucion genetica, se observaba una correccion estadfsticamente significativa. En contraposicion, la SAHBa de BAD, una SAHB distinta modelada segun BH3 de BID, no corregfa el defecto secretor en islotes Bad -/- (p> 0,05, Fig. 17, Bad -/-, DMSO frente a Bad -/- tratados con SAHBa de BID), demostrando por tanto la especificidad de secuencia del efecto de SAHB de BAD observado. Mutar los residuos L151 y D156 conservados de SAHB de BAD (SAHBa(l.d^a) de BAD) anulaba su efecto sobre la liberacion de insulina (Fig. 17, p>0,05, Bad -/- DMSO frente a Bad -/-tratado con SAHBa(l.d^a) de BAD). Estos resultados son consistentes con los estudios de reconstitucion genetica que usan el mutante L^A (Fig. 15). De forma importante, la eficacia de SAHBa de BAD en la restauracion de SIEG acompanaba a su efecto sobre el potencial de membrana mitocondrial (Fig. 19). Se trataron islotes dispersados con 1 pM de

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compuestos durante 4 horas y se midieron los cambios de como en la Fig. 12. A una concentracion 1 jM, las SAHB de BAD pero no de BlD confenan una hiperpolarizacion significativa del potencial de membrana mitocondrial (A^m) tras el tratamiento con glucosa, mientras que el efecto de SAHB de BID sobre el A^m era estadfsticamente indistinguible de las celulas p tratadas con DMSO.

Estos hallazgos indican que el dominio BH3 de BAD es suficiente para restaurar el defecto de secrecion de insulina en celulas p Bad -/- y predicen ademas que la administracion de compuestos de SAHB de BAD mejorara la tolerancia a la glucosa de ratones Bad -/-. De hecho, experimentos piloto indicaban que 60 minutos despues de una exposicion intraperitoneal a glucosa, los niveles sangumeos de glucosa en ratones Bad -/- inyectados con SAHBA de BAD eran un 66 % de los de los ratones Bad -/- inyectados con vetnculo.

Ejemplo 7. El papel de los compuestos fosfomimeticos de BAD en la liberacion de insulina

La especificidad del dominio BH3 de BAD en comparacion con la secuencia BH3 de BID en la regulacion de la liberacion de insulina eleva la posibilidad de que puedan requerirse tambien residuos distintos de L151 y D156, que esten conservados por los dominios BH3 de todos los miembros de la familia de BCL-2. De forma interesante, la serina 155 es un rasgo distintivo de la secuencia de BH3 de BAD. La modelizacion estructural revelo que la Ser 155 de BAD apunta hacia la hendidura hidrofoba de BCL-Xl, que tras fosforilacion por PKA crea un impedimento esterico significativo para la asociacion de BAD/BCL-Xl (Datta S.R. et al., 2000. Mol Cell 6, 41-51). Para probar el papel de S155 en la secrecion de insulina, se genero un modelo genetico de insercion genica en que se reemplazaba solo este residuo de serina por alanina (Figuras 36-38). Las celulas p Bad S155A muestran anormalidades en la secrecion de insulina tanto in vitro, cuando se examinaron islotes purificados (Fig. 16) como in vivo, cuando se valoraron los niveles de insulina en la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ip-GTT) (Figuras 39-40).

Estos hallazgos sugieren que la fosforilacion en el dominio BH3 de BAD puede dictar el efecto regulador de BAD sobre la liberacion de insulina. Para probar esta hipotesis, se generaron compuestos fosfomimeticos de SAHB de BAD (SAHBa(s^ps) y SAHBa(s^d), Fig. 17-18 y Fig. 34). SAHBa(s^ps) contiene un residuo de serina fosforilado en posicion 155 de la secuencia de BH3 de BAD, mientras que SAHBa(s^d) contiene un reemplazo de acido aspartico que se muestra anteriormente que simula un residuo fosforilado constitutivamente al imitar la carga negativa de un grupo fosfato (Datta S.R. et al., 2000. Mol Cell 6, 41-51). Ambos compuestos corregfan el defecto de SIEG en islotes Bad -/- (Fig. 17). De forma importante, estos compuestos fosfomimeticos restauraban la secrecion de insulina a pesar de su incapacidad de unirse a BCL-Xl (Fig. 35). Se efectuaron ensayos de union de polarizacion por fluorescencia usando peptidos marcados con FITC (50 nM) y BCL-Xl AC a las concentraciones indicadas (Fig. 35). Se determinaron los valores de CE50 para la union por analisis de regresion no lineal de curvas de dosis y respuesta usando el software Prism 4.0 (Graphpad). Estas observaciones son consistentes con los datos de ratones con insercion genica Bad 3SA y S155A, proporcionando una confirmacion farmacologica de que el efecto del dominio BH3 de BAD sobre la liberacion de insulina no cosegrega con la union a BCL-Xl.

Ejemplo 8. Compuestos mimeticos de BAD: activadores de GK novedosos

Para averiguar el mecanismo mediante el que los compuestos de SAHB de BAD restauran la SIEG, se examino su efecto sobre la activacion de GK. La SaHBa de BAD y sus analogos fosfomimeticos estimulan la actividad GK endogena en la estirpe de celulas p MIN6, mientras que SAHBa(l,d^a) de BAD no lo hace (Fig. 20). Colectivamente, los datos presentados en la Fig. 19-20 sugieren que la capacidad del dominio BH3 de BAD de activar la liberacion de insulina esta en paralelo con sus efectos sobre la activacion de GK y la hiperpolarizacion inducida por glucosa del potencial de membrana mitocondrial.

De forma importante, los efectos de los compuestos de SAHB de BAD sobre la activacion de GK y SIEG estan en paralelo con su capacidad de unirse directamente a GK (Fig. 70-71).

Ejemplo 9. El papel de BAD en la supervivencia de celulas p

La disfuncion e incapacidad de compensar las demandas secretoras de la hiperglucemia de las celulas p contribuyen significativamente a la patofisiologfa de la diabetes de tipo 2. La destruccion de la masa de celulas p sucede cuando la apoptosis supera la tasa de replicacion de celulas p. Los estudios de los inventores han identificado un papel para el dominio BH3 de BAD y el estado de fosforilacion de la molecula en la liberacion de insulina. Debido a que los mismos rasgos moleculares son conocidos por regular la funcion apoptotica de BAD, se investigo si esta proterna de solo BH3 afectaba a la supervivencia de celulas p.

Aunque la exposicion a corto plazo de celulas p a glucosa estimula la secrecion de insulina, la incubacion cronica con altas concentraciones de glucosa activa la ruta apoptotica. Es importante que, en estas condiciones “glucotoxicas”, se regula positivamente la expresion de varios genes proapoptoticos incluyendo Bad (Federici M. et al., 2001. Diabetes 50, 1290-301). Los islotes deficientes en Bad estaban significativamente protegidos en estas condiciones (p< 0,01, Figura 41, % de viabilidad en glucosa alta, Bad +/+ frente a Bad -/-). La correccion genetica usando adenovirus de Bad restauraba la sensibilidad a la apoptosis (Fig. 41). Ademas, interferir con la fosforilacion de BAD rebajaba el umbral para apoptosis como es evidente por la sensibilidad potenciada de los islotes Bad 3SA ante la apoptosis inducida por glucotoxicidad (Fig. 42). Colectivamente, estos datos proporcionan evidencias

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geneticas de que BAD desempena un papel en la muerte inducida por glucotoxicidad.

La toxina de celulas p, estreptozotocina (STZ), agota espedficamente las celulas p y se usa comunmente en modelos animales de diabetes inducida experimentalmente. Los islotes deficientes en BAD eran resistentes a la muerte inducida por STZ, mientras que aquellos aislados de animales BAD 3SA mostraban una sensibilidad potenciada ante STZ (Fig. 41-42). Se probo el requisito de BAD en la destruccion de celulas p inducida por STZ examinando una cohorte de ratones Bad -/- y Bad +/+ despues de la inyeccion intraperitoneal de este compuesto. La resistencia de los ratones deficientes en Bad a la STZ era evidente cuando se examinaban los islotes en secciones pancreaticas (Fig. 43). La STZ causaba el colapso de la arquitectura de los islotes en ratones Bad +/+ marcado por una reduccion significativa de la senal de insulina concomitante con la tincion de glucagon dentro de los islotes (Fig. 43). En notable contraste, las secciones pancreaticas nulas de Bad demostraban una conservacion casi completa de los islotes (Fig. 43). Estos resultados son consistentes con las diferencias en la actividad caspasa 3 en celulas p Bad +/+ frente a Bad -/- el dfa 7 (Fig. 44). La resistencia de las celulas p Bad -/- ante la apoptosis era tambien evidente a los niveles de insulina y glucosa detectados despues del tratamiento con STZ. El dfa 0, los niveles sangumeos de insulina eran cerca de 1,5 veces mayores en ratones Bad -/- en comparacion con controles Bad +/+ (p< 0,01, Fig. 45). Para el dfa 7, cuando los islotes experimentaban apoptosis, el nivel de insulina en animales Bad +/+ se desplomaba un 86 %, mientras que los ratones deficientes en Bad manteman una disminucion del 44 % de la hormona. El valor absoluto de insulina serica el dfa 7 era ~6 veces mayor en ratones Bad -/- frente a Bad +/+ (Fig.

45, p <0,01). Ademas, los ratones deficientes en BAD estan protegidos frente al efecto hiperglucemico de STZ (Fig.

46, dfa 7, glucosa a 434,29 ± 53,34 mg/dl en Bad +/+ frente a 239,83 ± 50,86 mg/dl en Bad -/-, p< 0,05). Por tanto, la deficiencia en Bad procura proteccion frente a la destruccion de celulas p inducida por STZ y el fenotipo diabetico resultante.

Ejemplo 10. BAD: un determinante de la diabetes inducida por dieta rica en grasas

Las celulas p experimentan normalmente cambios compensatorios para satisfacer la demanda secretora en estado resistente a la insulina. Estos mecanismos adaptativos incluyen cambios en las rutas de senalizacion de celulas p y programas de expresion genica que dan como resultado hiperplasia e hipertrofia de celulas p. Por consiguiente, una falta de adaptacion apropiada da como resultado diabetes (Bell GJ. y Polonsky K.S., 2001. Nature 414, 788-91; Weir G.C. et al., 2001. Diabetes 50 Supl. 1, S154-9; DeFronzo R.A., 1988. Diabetes 37, 667-87; Accili D. et al., 2001. Curr Mol Med 1, 9-23). Ademas, la exposicion cronica a alta glucosa y lfpidos puede conducir eventualmente a una alteracion de la secrecion de insulina (glucolipotoxicidad) y la apoptosis de celulas p (Prentki M. et al., 2002. Diabetes 51 Supl. 3, S405-13).

Los estudios descritos anteriormente han identificado un papel para el dominio BH3 de BAD y su derivado fosforilado en la regulacion de la liberacion de insulina. De forma interesante, es conocido que el mismo motivo peptfdico regula la funcion apoptotica de BAD y las pruebas sugieren que BAD es un centinela importante en la supervivencia de celulas p con exposicion cronica a alta glucosa o tratamiento con estreptozotocina (Fig. 41-46) y en la muerte de celulas p neonatales (Hettiarachchi K.D. et al., 2006, enviado).

Para examinar como las funciones metabolicas y apoptoticas de BAD en celulas p pueden ser relevantes para la patofisiologfa de la diabetes, se investigo su papel en la adaptacion de celulas p asociada a un modelo de resistencia a la insulina asociado a una dieta rica en grasas (HFD). Los niveles relativos de ARNm de BAD aumentan significativamente en islotes aislados de ratones de tipo silvestre sometidos a HFD (Fig. 21). Para examinar la importancia de esta observacion, se sometio una cohorte de ratones Bad +/+ y Bad -/- a HFD durante 16 semanas. Se mantuvo una cohorte paralela con dieta de control. Con la dieta de control, el peso corporal y los niveles de glucosa con alimentacion en ratones Bad +/+ y Bad -/- eran comparables a lo largo del estudio (datos no mostrados). Con dieta HFD, sin embargo, los ratones Bad -/-eran resistentes al desarrollo de hiperglucemia (Fig. 22) a pesar de ganar peso a una tasa similar a los animales de control (Fig. 23). Esta resistencia estaba asociada a un aumento del area porcentual de islote, que era significativamente mayor en ratones Bad -/- en comparacion con controles (Fig. 24-25).

Se determino a continuacion si el aumento del area total de celulas p con HFD es dependiente de BAD y su estado de fosforilacion. En las Figuras 47-50, cada rombo representa un islote que se inmunotefua con anticuerpo anti- insulina. El eje vertical demuestra el area de pfxeles asignada a los islotes rastreada por el programa de software MetaMorph. El eje horizontal denota islotes. Para cada par representativo de genotipos mostrado (Bad +/+ frente a Bad-/- y Bad +/+), era comparable el area de seccion total. Las secciones Bad -/- contienen significativamente mas islotes para el mismo area de tejido total. Se analizaron multiples secciones de al menos 3 animales por grupo de forma similar. El analisis de las secciones pancreaticas Bad -/- revelo que el aumento derivaba de un mayor numero de islotes en comparacion con las secciones Bad +/+ HFD (Fig. 47-48). Paralelamente a estas observaciones, los niveles sangumeos de insulina eran mayores en ratones Bad -/- en comparacion con controles Bad +/+ (p< 0,05, Fig. 26). Por tanto, las celulas p Bad -/- parecen tener una respuesta adaptativa ventajosa independientemente de su defecto en SIEG.

BAD es una diana de las rutas de senalizacion de supervivencia que incluyen las redes de AKT y S6P70, que son conocidas por afectar a la supervivencia de celulas p (Tuttle R.L. et al. 2001. Nat Med 7, 1133-7; Pende M. et al.,

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2000. Nature 408, 994-7). Tanto AKT como S6P70 pueden fosforilar e inactivar la funcion proapototica de BAD. Para valorar si el efecto de BAD en la adaptacion de celulas p en el modelo de HFD se cosegrega con su funcion apoptotica, se examino una cohorte paralela de ratones Bad 3SA y sus correspondientes controles de camada como se describe anteriormente. Al contrario que los ratones Bad -/-, los animales Bad 3SA eran mas sensibles a la exposicion a HFD, mostrando de media mayores niveles sangumeos de glucosa (Fig. 27). Los pesos corporales de los ratones Bad 3SA eran inicialmente menores que en las cohortes de control (p< 0,05, semanas 0 y 1, Fig. 28) pero no mostraban ninguna diferencia significativa durante las posteriores semanas de estudio. El area porcentual de islote en las secciones pancreaticas era significativamente menor en ratones Bad 3SA en comparacion con los controles de camada, sugiriendo que la adaptacion de la masa de celulas p puede haber sido ineficaz (Fig. 29). Las secciones Bad 3SA contienen significativamente menos islotes (Figura 49-50). Estos datos eran consistentes con las medidas de los niveles sangumeos de insulina, que eran significativamente menores en ratones Bad 3SA con HFD (Fig. 30). Colectivamente, los hallazgos sugieren que la compensacion de celulas p y la sensibilidad ante HFD acompanantes estan influidas por el estado de fosforilacion de BAD. Ademas, la respuesta opuesta de Bad -/- y Bad 3SA frente a exposicion a HFD, a pesar de las anormalidades metabolicas comunes en estos modelos geneticos, sugiere que el papel de la BAD en la determinacion de la sensibilidad a HFD es paralelo a su funcion apoptotica en lugar de a su efecto sobre GK, destacando ademas el papel dual de BAD, y teniendo cada uno importantes consecuencias fisiologicas.

Explotar el papel de las protemas de BCL-2 en la manipulacion terapeutica de la funcion de islotes requiere una cuidadosa valoracion del impacto de distintos miembros de la familia tanto sobre el metabolismo como la supervivencia de celulas p. Esto es especialmente relevante considerando los papeles emergentes de las protemas de la familia de BCL-2 en las mitocondrias (Green D.R. y Kroemer G., 2004. Science 305, 626-9) y el RE (Thomenius M.J. y Distelhorst C.W., 2003. J Cell Sci 116, 4493-9). El papel de BAD en la liberacion de insulina estimulada por glucosa por celulas p es consistente con su capacidad de afectar a GK y regular la respiracion impulsada por glucosa. El dominio BH3 de BAD, que se requiere para la funcion proapoptotica de la molecula, se requiere tambien para la secrecion de insulina. Es mas, los compuestos de SAHB derivados del dominio BH3 de BAD probaron ser sondas moleculares ideales de la regulacion por BAD de la secrecion de insulina. Usando mutantes y peptidos de BAD que son o bien defectivos en la union a BCL-Xl (SAHBa(l,d^a,a), SAHBa(s^ps) de BAD y SAHBa(s^d) de BAD) o aquellos cuya union no puede reprimirse (BAD 3SA y 155A), se demostro que BH3 de bAd tiene funcionalidades distintas en la regulacion de la secrecion de insulina y la union a BCL-Xl. Estos hallazgos son consistentes con la observacion de que la perdida de BAD no fenocopia enteramente la sobreexpresion de BCL-Xl. En un modelo transgenico de BCL-Xl espedfico de celulas p la supervivencia de islotes potenciada estaba acompanada por perturbaciones en la funcion mitocondrial, el manejo de Ca2+ y la secrecion de insulina (Zhou Y.P. et al., 2000. Am J Physiol Endocrinol Metab 278, E340-51). Los islotes transaenicos de BCL-Xl exhibfan defectos secretores significativos en respuesta a secretagogos movilizadores de Ca2+ (KCl y tolbutamida) y combustibles de mitocondria, tales como KIC (Zhou Y.P. et al., 2000. Am J Physiol Endocrinol Metab 278, E340-51). Por otro lado, los islotes Bad -/- tienen una robusta respuesta a todos estos mismos secretagogos. Por tanto, aunque la supervivencia potenciada de celulas p es comun en ambos modelos geneticos, la naturaleza del defecto secretor de islote no lo es. Esto puede ser debido a su vez a los efectos de BCL-Xl sobre la bioenergetica celular, que no son dependientes de su interaccion con BAD.

La BAD sienta un precedente por la posibilidad de que moleculas solo de BH3 funcionen como componentes integrales de distintas rutas de senalizacion, regulando procesos fisiologicos mas alla de controlar la apoptosis. Al adquirir un dominio BH3, estas protemas han evolucionado para integrar la apoptosis con otras rutas homeostaticas. Debido a su capacidad de regular la respiracion mitocondrial impulsada por glucosa, la BAD esta en posicion unica para registrar el metabolismo de la glucosa y cualquier consecuencia bioenergetica celular que siga a la utilizacion de glucosa. El dominio BH3 de BAD tiene la capacidad de intervenir selectivamente en interacciones de protemas discretas que regulan el metabolismo de glucosa/secrecion de insulina (Figura 4). Esta capacidad dual esta determinada por el estado de fosforilacion del dominio BH3. Aunque BCL-Xl sea la diana de BH3 a traves de la cual BAD interviene en la maquinaria apoptotica, la naturaleza de la diana de BH3 que le permite activar la GK espera investigaciones adicionales. Estudios futuros evaluaran si la SAHB de BAD funciona desplazando un regulador negativo en el complejo o poniendo a disposicion de GK un activador, y determinaran como estos eventos estan orquestados por el estado de fosforilacion de BH3 de BAD. Caracterizar los rasgos espedficos de las dianas de BH3 de BAD que funcionan en distintas condiciones y las senales metabolicas precisas implicadas en su seleccion proporcionara importantes perspectivas del mecanismo subyacente en la decision binaria dependiente de BAD entre metabolismo y apoptosis. Estos hallazgos sugieren tambien que las dos funciones de BAD pueden orientarse separadamente con fines terapeuticos. Debido a que la fosforilacion de BAD tiene efectos opuestos sobre la union a BCL-Xl y la SIEG, un mimetico de BH3 de BAD fosforilado que facilite la SIEG pero sea incapaz de unirse a BCL-Xl para promover la apoptosis puede servir como terapia prototfpica en diabetes y trasplante de islotes.

Ejemplo 11: Resistencia periferica a la insulina

La diabetes de tipo 2 proviene de deficiencias tanto en la accion de la insulina como en la funcion de celulas p pancreaticas. Tres tejidos, a saber musculo esqueletico, adipocitos e hngado, constituyen los sitios de resistencia a la insulina con papeles cnticos en la captacion de glucosa, lipolisis y produccion hepatica de glucosa, respectivamente. Sin embargo, el sitio primario de resistencia a la insulina se ha sometido a investigacion activa (Accili D. 2003.

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Diabetes 53, 1633-42). Las pruebas geneticas sugieren que el fracaso del tugado en regular apropiadamente el metabolismo de la glucosa en respuesta a la insulina constituye el sitio primario de resistencia a la insulina en diabetes de tipo 2 (Lauro D. et al., 1998. Nat Genet 20: 294-8; Bruning J.C. et al., 1998. Mol Cell 2: 559-69). La incapacidad de equilibrar la produccion hepatica de glucosa frente a la captacion y almacenamiento de glucosa tiene un efecto drastico sobre los niveles sangumeos de glucosa. Por consiguiente, se han centrado esfuerzos significativos para el control terapeutico de la diabetes en la supresion de la produccion hepatica de glucosa (PHG). Por ejemplo, el rasgo prominente del farmaco antidiabetico metformina usado comunmente para el tratamiento de diabetes de tipo 2 es su efecto sobre la PHG (Kirpichnikov D, 2002, Ann Intern Med 137: 25-33).

El equilibrio entre la produccion hepatica de glucosa y la eliminacion/almacenamiento de glucosa depende en gran medida de la funcion opuesta de dos enzimas importantes, respectivamente a saber glucocinasa, que controla la fosforilacion de glucosa, y glucosa 6-fosfatasa, que convierte el 6-fosfato de glucosa de vuelta en glucosa. Ademas, al utilizar glucosa, la glucocinasa afecta directamente a la transcripcion de genes gluconeogenicos en el tugado implicados en la PHG, cuya expresion requiere la presencia de glucosa (Vaulont D., 2001. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9116-21; Scott D.K., 1998. J Biol Chem 273: 24145-51). Este efecto de la GK sobre la expresion genica es consistente con su papel como sensor de glucosa en el tugado. Por consiguiente, los activadores de molecula pequena de GK tienen eficacia en la supresion de PHG en diversos modelos de murido de diabetes (Grimsby J. et al., 2003. Science 301: 370-3)

Para delimitar el papel de BAD en la resistencia periferica a insulina, se valoro la sensibilidad de tugado, musculo y grasa frente a insulina en ratones deficientes en BAD usando el analisis de pinzamiento euglicemico- hiperinsulinemico (Fig. 51-52). Se determinan las tasas de infusion de glucosa requeridas en estas condiciones por la respuesta a la insulina en tejidos de musculo, tugado y adiposo. Se encuentra una pequena (pero estadfsticamente significativa) disminucion de la tasa de infusion de glucosa (~17 %) en animales Bad -I- frente a Bad +/+ (Figura 53). Esta diferencia puede atribuirse enteramente a la falta de supresion de la produccion hepatica de glucosa (Figura 54). No se encontraron diferencias en la smtesis de glucogeno como se indica por los estudios de flujo de glucosa (Figura 55) o en la captacion de glucosa en musculo y WAT (Figura 56 y 57). Estos datos indican que BAD desempena un papel importante en la mediacion de la accion de la insulina en tugado que es consistente con su efecto sobre la actividad GK. Por lo tanto, activar la GK a traves de compuestos mimeticos de BAD (Figura 18) puede probarse eficaz para suprimir la produccion hepatica de glucosa y normalizar los niveles sangumeos de glucosa.

Ademas, se disminrna la supresion mediada por insulina de los acidos grasos plasmaticos (Figura 58) y se detectaban mayores niveles de lfpidos en ratones Bad -/- durante el pinzamiento de insulina (Figura 59). Estos datos indican perfiles lipfdicos anormales en ratones deficientes en BAD y sugieren un papel para BAD en la mediacion del efecto de la insulina en tejidos adiposos.

Ejemplo 12: Hipoglucemia ligada a glucocinasa

Aunque las mutaciones inactivadoras en glucocinasa, como aquellas aisladas en pacientes de MODY 2 (diabetes del adulto de inicio juvenil de tipo 2), estan asociadas a trastornos metabolicos marcados por la perdida de sensibilizacion ante glucosa y la perdida de efecto de la insulina sobre la supresion de la produccion hepatica de glucosa, las mutaciones activadoras en glucocinasa estan asociadas a hiperinsulinemia congenita (Byrne M.M. et al., 1994. J Clin Invest 93,1120-30; Clement K., 1996. Diabetologica 39: 82-90), un subtipo de trastorno clmico de hipoglucemia hiperinsulinemica de la infancia (Glaser B., 1998. N Engl J Med 338: 226-30; Christesen H.B.T., 2000. Diabetes 51: 1240-6).

Evitar la fosforilacion de BAD disminuye la actividad glucocinasa (Danial N.N. et al., 2003. Nature 424, 952-6). Los derivados de compuestos de SAHB de BAD que imitan la mutacion de serina 155 a alanina (Figura 18), que vuelve este residuo aminoaddico no fosforilable, pueden probarse herramientas terapeuticas importantes en la inhibicion de glucocinasa en este entorno patologico. Esta modificacion, en combinacion con la mutacion de L151 y D156 en el dominio BH3 de BAD, que bloquea su capacidad de activar la apoptosis y la secrecion de insulina, puede servir como base para compuestos mimeticos de BAD que puedan evitar la activacion de GK sin inducir la apoptosis en celulas diana en este entorno patologico.

Ejemplo 13: Sensibilizacion ante glucosa en el cerebro

Las neuronas glucosensibles son neuronas especializadas encontradas principalmente en el hipotalamo y la medula (Yang X., 1999. Diabetes 48: 1763-72; Dunn-Maynell A.A., 2002. Diabetes 51:2056-65) que, al contrario que otras neuronas, usan la glucosa como molecula de senalizacion para regular su actividad. Las neuronas glucosensibles funcionan de modo muy analogo a las celulas p pancreaticas, sirviendo la GK como via de acceso a la actividad neuronal inducida por glucosa. Ademas, de forma similar a la ruta de celulas p para la secrecion acoplada a estfmulo, la produccion de ATP es el factor metabolico principal que acopla el metabolismo de la glucosa con la actividad neuronal inactivando los canales Katp y dando pie al posterior flujo de entrada de Ca'2+ seguido de propagacion del potencial de accion (Levin B., 2006. Physiol Behav en prensa). Esta actividad neuronal regula a su vez la ruta neuronal integrada que controla la captacion, gasto y almacenamiento de energfa.

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Como la actividad GK en las neuronas glucosensibles es esencial para su funcion fisiologica (Kang L., 2006. Diabetes 55: 412-20), se predice que los activadores de GK, incluyendo los compuestos de SAHb de BAD (Figura 18), afectan a la regulacion neuroendocrina de la homeostasis de la energfa, que a su vez se ha mostrado que tiene una importante implicacion en trastornos metabolicos asociados a diabetes y obesidad (Schwartz M.W., 2005. Science 307: 375).

Ejemplo 15: Enfermedad hepatica cronica

El hngado desempena un papel fundamental en el control de la utilizacion de glucosa/ftpido de todo el cuerpo. Mediante la smtesis de glucogeno y la gluconeogenesis, el hngado determina la produccion y almacenamiento de glucosa en el cuerpo (Dentin, R., 2005. Biochimie 87:81). Por otro lado, mediante la oxidacion p (la ruta mitocondrial a cargo de degradar la grasa para la produccion de energfa) y la smtesis de acidos grasos, el tngado afecta al metabolismo lipfdico. Las anormalidades en el metabolismo de glucosa y ftpidos en el hngado son integrales al estado de resistencia a la insulina (RI) y se cree que contribuyen a la enfermedad hepatica cronica, incluyendo enfermedad del hngado grado no alcoholica (EHGNA) y su forma mas grave esteatohepatitis no alcoholica (EHNA) (Bugianesi, E., 2005. Hepatology 42: 987).

La EHGNA es la presentacion hepatica del smdrome metabolico, un grupo de trastornos metabolicos que incluyen RI, obesidad, diabetes de tipo II, hipertension, hiperlipidemia (Falck-Ytter, Y. 2001. Semin Liver Dis 21; 17). En la forma mas grave de la enfermedad, EHNA, se observa la perdida de la arquitectura propia del hngado debido a lesion celular (cirrosis hepatica) (Brunt, E.M. 2005. Hepathol Res 33: 68). El hngado graso, tambien conocido como esteatosis o esteatohepatitis, es un distintivo histologico de EHGNA/EHNA, marcado por altos niveles de acumulacion de trigliceridos en hepatocitos. Las estrategias de tratamiento actuales para EHGNA/EHNA incluyen agentes que rebajan los ftpidos o aquellos que sensibilizan a los hepatocitos ante la accion de la insulina.

Estos hallazgos proporcionan pruebas de que la exclusion de Bad en ratones esta asociada a resistencia a la hiperglucemia inducida en un modelo de HFD de RI y diabetes de tipo II (Figuras 22). La respuesta diferencial de ratones Bad +/+ y Bad -/- ante este tratamiento es tambien evidente por la notable diferencia en la emergencia de hngados grasos (Fig. 60-63). Los animales nulos de BAD no desarrollan hngados grasos. De forma importante, esta resistencia esta asociada al estado de fosforilacion de BAD (Fig. 64-65). Los ratones que expresan una forma mutante de BAD que no puede nunca fosforilarse (Bad 3SA) son mas sensibles a la hiperglucemia inducida por HFD (Figura 27) y tienen mas tendencia a desarrollar hfgados grasos en comparacion con sus controles de camada de tipo silvestre (Fig. 64-65).

Dados estos hallazgos, evitar la funcion apoptotica de BAD puede probar ser una estrategia terapeutica eficaz en EHGNA/EHNA al evitar la lesion y funcion hepatica. De forma importante, esta estrategia puede considerarse en combinacion del tratamiento farmacologico actual para EHNA (Portincasa, P. 2006. Curr Med Chem 13: 2889).

Ejemplo 16: La alternancia glucofttica en tumores

Los tumores son conocidos por ser altamente glucolfticos (Gatenby. R.A. y Gillies, R.J. 2004. Nat Rev Cancer 4, 891-99). Esto se ha atribuido a una fosforilacion oxidativa (OXPHOS) defectiva mediante mitocondrias o a un “recableado” de las rutas metabolicas en tumores para utilizar la glucolisis y sus intermedios como fuente principal de ATP, reduciendo la smtesis equivalente y macromolecular para soportar sus altas demandas bioenergeticas (Mazurek S. y Eigenbrodt E. 2003. Anticancer Res 23,1149-54). Los ejemplos de dichos desplazamientos metabolicos o “recableado” incluyen un ciclo de TCA (acidos tricarboxfticos) truncado mediante el que el intermedio de TCA citrato, que se genera mediante la utilizacion de piruvato por las mitocondrias, proporciona acetil-CoA citosolico para la smtesis de acidos grasos (Figura 3) (Hatzivassiliou G. et al. 2005. Cancer Cell 8, 311-21). Otro ejemplo de desplazamiento metabolico de celulas tumorales es la utilizacion de piruvato para generar lactato mediante una reaccion catalizada por la lactato deshidrogenasa (Figura 3) (Fantin, V.R. et al., 2006. Cancer Cell 9, 425-34).

Mediante su capacidad de regular la eficacia mediante la que las mitocondrias utilizan la glucosa como fuente de carbono para la respiracion, la BAD puede determinar la disponibilidad del piruvato para usar en las rutas metabolicas anteriores. Los ratones deficientes en Bad avanzan hasta linfoma difuso de celulas B grandes (LDCBG) (Ranger, A.M. et al., 2003. Proc Natl Acad Sci USA 100, 9324-29), tumores conocidos por ser altamente glucolfticos. Esto puede ser indicativo tanto de perdida del control apoptotico apropiado como de potenciacion de la alternancia metabolica de OXPHOS a glucolisis en LDCBG deficiente en Bad.

Ejemplo 17: Metodos generales

Modelos animales. Los modelos geneticos de insercion genica Bad -/- y Bad 3SA se han descrito anteriormente (Datta S.R. et al., 2002. Dev Cell 3, 631-43; Ranger A.M et al., 2003. Proc Natl Acad Sci USA 100, 9324-9). El modelo de insercion genica Bad S155A se genero como se describe en la Fig. 7.

Estudios de pinzamiento hiperglucemico. Los estudios de pinzamiento hiperglucemico se efectuaron en ratones macho de 10 semanas de edad siguiendo los procedimientos estandarizados establecidos en el Mouse Metabolic Phenotyping Center de la Universidad de Yale. Al menos 5 dfas antes del analisis de pinzamiento, se anestesiaron

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los ratones y se inserto un cateter permanente en la venta yugular interna derecha para infusion intravenosa de glucosa. Se hicieron ayunar los ratones durante una noche y se realizo el analisis de pinzamiento en animales en estado despierto y mmimamente estresado. Se enlazo un conector de 3 vfas con el cateter de la vena yugular para infusion intravenosa y se obtuvieron muestras de sangre. Se realizo un pinzamiento hiperglucemico de 2 horas con una infusion cebada y variable de glucosa al 20 % para elevar y mantener las concentraciones plasmaticas de glucosa a ~300 mg/dl. Se recogieron muestras de sangre (20 jl) a intervalos de 10-20 min para la medida inmediata de las concentraciones plasmaticas de glucosa usando el analizador de glucosa Beckman II (Beckman, Fullerton, CA). Se midio la insulina plasmatica mediante radioinmunoensayo usando el kit suministrado por Linco Research (St. Charles, MO).

Estudios de pinzamiento hiperinsulinemico-euglucemico. Cuatro dfas antes de los estudios hiperinsulinemicos- euglucemicos, se valoro la composicion corporal de los ratones por espectroscopia de resonancia magnetica de 1H (Broker BioSpin, Billerica, MA). Se implantaron cateteres venosos yugulares y se dejaron recuperar los ratones durante 4 dfas. Despues de una noche de ayuno, se infundio [3-3H]-glucosa (purificada por HPLC; Perkin Elmer, Boston, MA) a una tasa de 0,05 jCi/min durante 2 h para valorar el recambio de glucosa basal. Despues del periodo basal, se realizo el pinzamiento hiperinsulinemico-euglucemico durante 120 min con una infusion cebada/continua de insulina humana (300 pmol/kg de cebado, 15 pmolkg'1min'1 de infusion (Novo Nordisk, Princeton, NJ) y una infusion variable de dextrosa al 20 % para mantener la euglucemia (-100-120 mg/dl). Se obtuvieron muestras de plasma de la cola a 20, 40, 55, 70, 75, 80, 95 y 120 min. Se infundio [3-3H]-glucosa a una tasa de 0,1 jCi/min a lo largo de los pinzamentos y se inyecto 2-desoxi-D-[1-14C]-glucosa (DOG; Perkin Elmer) como bolo en el minuto 75 del pinzamiento para estimar la tasa de captacion de glucosa en tejido estimulada por insulina como se describe anteriormente (Youn J.H., 1993. Diabetes 42: 757-63). Al final del pinzamiento, se anestesiaron los ratones con inyeccion de pentobarbital de sodio (150 mg/kg) se tomaron todos los tejidos a los 4 min, se congelaron inmediatamente usando lenguetas de aluminio enfriadas con N2 lfquido y se almacenaron a -80 °C para analisis posterior.

Preparacion de islotes. Se perfundieron pancreas de raton con colagenasa y se aislaron los islotes como se describe anteriormente (Larsson O. et al., 1996. J Biol Chem 271, 10623-6). Se cultivaron los islotes rutinariamente durante 1-2 dfas antes de los ensayos de secrecion de insulina (perfusion o incubacion estatica).

Ensayos de perfusion de islotes. Se llevaron a cabo ensayos de perfusion como se describe en (Cunningham B.A. et al., 1996. Am J Physiol 271, E702-10). Brevemente, se emparedaron 120 islotes en una columna entre dos capas de perlas Cytodex-3 micro-carrier (Pharmacia) y se perfundieron con tampon de Krebs (NaCl 119 mM, KCl 4,6 mM, MgSO4 1 mM, Na2HPO4 0,15 mM, KH2PO4 0,4 mM, NaHCOa 25 mM, CaCh 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, seroalbumina bovina al 0,05 %) que contema la concentracion indicada de glucosa o KCl. Se bombeo la disolucion de perfusion usando una bomba multicanal de alta precision (IP Istamec modelo n° 78023-02, Cole-Parmer Instruments Co.) a un caudal de 0,3 ml/min para asegurar que los islotes no se expusieran a una presion excesiva durante el curso de la perfusion. Antes de la recogida de fracciones, se preperfundieron los islotes con glucosa 3 mM durante 25 min. Se recogieron las fracciones eluidas cada 15 s usando un recolector de fracciones BioRad (modelo n° 2128). Se mantuvo el sistema entero en una camara a 37 °C. Se cambio la concentracion de glucosa en la disolucion de perfusion a los tiempos indicados (Fig. 1d). Para la valoracion de la respuesta a la dosis de glucosa de la secrecion de insulina (Fig. 2f), se recogieron las fracciones correspondientes al primer pico de insulina para medidas de insulina antes de aumentar la concentracion de glucosa al siguiente incremento. Se midio la insulina por radioinmunoensayo.

Medidas de la relacion de ATP/ADP. Se lavaron lotes de 50 islotes de tamano coincidente y se preincubaron en tampon de Krebs que contema glucosa 3 mM durante 30 min. Se alterno entonces el tampon a disolucion de Krebs que contema glucosa 5,5 mM o 25 mM seguido de 1 hora de incubacion a 37 °C en tampon de Krebs. Se midieron los contenidos de ATP y ADP como se describe en (Schultz V.et al., 1993. Anal Biochem 215, 302-04) usando un enfoque basado en la bioluminescencia.

Sintesis de SAHB. Para generar derivados de SAHB de BID y BAD, se efectuaron la smtesis peptfdica basada en Fmoc, la metatesis de olefina, la derivatizacion de FITC, la purificacion por HPLC en fase inversa y los microanalisis como se resena anteriormente (Walensky L.D. et al., 2004. Science 305, 1466-70; Walensky L.D. et al., 2006. Mol Cell en prensa). Se sintetizo un panel inicial de derivados de fosforilo de SAHB de BID y BAD como se describe (Figura 18).

Identificacion de diana por inmunoprecipitacion basada en SAHB o reticulacion. Se emplean SAHB sintetizadas con un “asa” para inmunoprecipitacion (p.ej. FITC, biotina) para identificar la diana o dianas intracelulares de la union basada en BH3 y actividades biologicas como se describe anteriormente (Walensky L.W. et.al., 2006. Mol Cell 24, 199-210). Se ha empleado tambien una metodologfa de reticulacion in situ alternativa en que los compuestos de SAHB se derivatizan para reticular directamente con dianas intracelulares tras fotoestimulacion u otros desencadenantes (Seghatelian, A. et al., 2004. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10000-5). (Fig 68-69).

Metodo de incubacion estatica (liberacion por lotes) para la liberacion de insulina en islotes p primarios aislados. Se lavaron los islotes 3 veces y se recolectaron a 5 islotes por tubo en tampon de Krebs que contema

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glucosa 3 mM. Se incubaron los tubos durante 30 min a 37 °C. Se sedimentaron entonces los islotes y se reemplazo el tampon por disolucion de Krebs que contema la concentracion indicada de glucosa o secretagogos. Despues de 1 hora de incubacion a 37 °C, se sedimentaron los islotes y se recogio el sobrenadante para la medida de insulina. Se solubilizo el sedimento para valorar el contenido de insulina intracelular. Se midio la insulina por ELISA usando insulina de raton como patron (kit ELISA de insulina, n° de cat. INSKR020, Crystal Chem. Inc.; Chicago, IL). Para ensayos de reconstitucion genetica, se incubaron lotes de 150 islotes recien aislados en medio RPMI que contema glucosa 11 mM y 10 % de suero en presencia de adenovirus a 108 unidades formadoras de placa durante 90 min a 37 °C (Zhou Y.P. et al., 2003. J Biol Chem 278, 51316-23). A estas ufp, las infecciones no causaban una apoptosis significativa de los islotes. Se reemplazo entonces el medio por RPMI reciente y se cultivaron los islotes durante 2448 h antes de los ensayos de liberacion de insulina. Se recolectaron a mano los islotes que expresan GFP en cada grupo para los ensayos de liberacion por lotes como se describe anteriormente. Para el tratamiento con los compuestos de SAHB, se incubaron 150 islotes recien aislados durante una noche en medio RPMI que contema glucosa 11 mM, 10 % de suero y 3 pM de los compuestos indicados o control de vehmulo DMSO. Se lavaron los islotes y se efectuaron los ensayos de liberacion de insulina en tampon de Krebs como anteriormente.

Medida del potencial de membrana mitocondrial. Se dispersaron los islotes, se sembraron en cubreobjetos y se incubaron durante una noche a 37 °C. El dfa del experimento, se preincubaron celulas p en glucosa 3 mM durante 3 horas. Antes de formar imagenes, se cargaron las celulas con ester etflico de tetrametilrodamina (TMRE) 7 nM y MitoTracker Green (MTG) 100 nM (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 45 min y 30 min, respectivamente. Se retiro el MTG del medio y se tomaron imagenes de las celulas usando un microscopio confocal Leica TCS SP2 invertido (Wetzlar, Alemania). Se tomaron cuatro imagenes apiladas de multiples celulas individuales antes y despues de elevar la concentracion de glucosa extracelular de 3 mM a 8 mM o antes de la adicion de KIC 10 mM. Se analizo la intensidad de fluorescencia de TMRE como se describe anteriormente (Heart E. et al., 2006. Am J Physiol Endocrinol Metab 290, E143-E148). En estudios que valoran los efectos de los compuestos de SAHB sobre A^, se incubaron celulas p dispersadas con control de vehmulo DMSO o con 1 pM del compuesto de SAHB indicado durante 4 horas antes de formar imagenes. Se tomaron cuatro imagenes apiladas de multiples celulas individuales antes y despues de elevar la concentracion de glucosa extracelular de 3 mM a 8 mM.

Ensayos de glucocinasa en islotes primarios y la estirpe de celulas p MIN6. Se siguio el procedimiento descrito por Trus et al. (Trus M.D. et al., 1981. Diabetes 30,911-22). Se adaptaron los ensayos a un formato de 96 pocillos usando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Brevemente, se homogeneizaron -900-1000 islotes de raton (Fig. 2e) o 5-6 x 106 celulas p MIN6 (Fig. 3f) en tampon que contema Tris-HCl 30 mM pH 8,2, EDTA 4 mM, KCl 150 mM, MgCh 4 mM, DTT 2,5 mM, 5'AMP 1 mM, fosfato de potasio 3 mM pH 7,4, K2SO4 1 mM, p-mercaptoetanol 15 mM y 0,2 % de BSA usando un mortero de teflon y un homogeneizador giratorio. Se aparto una pequena almuota de homogeneizado para la medida del contenido de ADN o protema. Se detecto la actividad fosforilante de glucosa en una reaccion de produccion de NADH impulsada por glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Se calculo la actividad glucocinasa como la diferencia en el NADH producido a concentraciones de glucosa de 100 mM (actividad glucocinasa) y 0,5 mM (actividad hexocinasa) en un tampon de reaccion que, ademas de glucosa, contema HEPES-HCl 50 mM pH 7,7, KCI 100 mM, MgCh 7,4 mM, p- mercaptoetanol 15 mM, NAD+ 0,5 mM, 0,05 % de BSA, G6PDH 2,5 pg/ml (0,7 U/ml) (Sigma) y ATP 5 mM. Se incubaron las reacciones durante 90 min a 31 °C en un volumen total de 100 pl (Trus M.D. et al., 1981. Diabetes 30, 911-22). Los valores obtenidos rutinariamente en estos ensayos estan dentro del intervalo de los resenados anteriormente para GK en islotes primarios (Trus M.D. et al., 1981. Diabetes 30, 911-22) y en la estirpe de celulas p MIN6 (Iizuka K. et al., 2000. J Endocrinol 164, 307-14). Para los estudios presentados en la Fig. 3f, se trataron celulas MIN6 con 3 pM de los compuestos de SAHB durante 4 horas antes de la preparacion de homogeneizados.

Preparacion de disoluciones madre adenov^ricas. Se generaron adenovirus recombinantes que expresan GFP sola o GFP y BAD de tipo silvestre o mutante usando el sistema de ensayo pAdEasy como se describe en (He T.C. et al., 1998. Proc Natl Acad Sci USA 95, 2509-14). Se efectuaron la amplificacion, purificacion, titulacion y verificacion vmcas en el Vector Core of the Harvard Gene Therapy Initiative, Harvard Medical School, Boston, MA.

Ensayos de PCR instantanea. Se preparo el ARN total a partir de islotes usando el kit Rneasy Plus Mini (Qiagen). Se usaron al menos tres animales separados para las preparaciones de ARN, se prepararon las muestras de ARN por duplicado o triplicado y se efectuaron las reacciones de smtesis de ADNc de control que no contienen enzima transcriptasa inversa para cada muestra. Se realizaron las reacciones PCR por triplicado. Se uso 1 pg de ARN total en 20 pl de reacciones de smtesis de ADNc usando tecnicas estandares. Se diluyo el ADNc 20 veces y se usaron 2 pl en una reaccion PCR de 25 pl usando cebadores para BAD. Otro conjunto de reacciones de control contema cebadores para protema ribosomica (RPL4), que sema como control interno para la calidad del ARN. La mezcla de reaccion contema 300 nM de cada cebador y 1x SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Se detectaron los productos de PCR con el detector de secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) y se determinaron los valores de umbral (Ct) como la medida del numero de ciclos al que se detecta por primera vez un aumento estadfsticamente significativo de la intensidad de fluorescencia. Se calculo la abundancia del gen amplificado usando los valores de Ct y se normalizo a los valores medios de RPL4 para obtener la abundancia relativa. Se normalizo entonces la abundancia relativa a la del grupo de control (muestras de Bad +/+) y se representaron las relaciones. La secuencia de cebadores esta disponible a peticion.

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Estudio de la dieta rica en grasas y quimicas de la sangre. Se dispusieron ratones macho Bad -/- y Bad 3SA y

sus correspondientes controles de camada con una dieta rica en grasas (58 % de energfa grasa, D12331, Research Diets, Inc. New Brunswick, NJ) 16 semanas (Winzell M.S. y Ahren B., 2004. Diabetes 53 Supl. 3, S215-9). Se mantuvo una cohorte paralela con dieta normal. Se monitorizaron semanalmente los pesos corporales y niveles sangumeos de glucosa con alimentacion. Se midieron los niveles sangumeos de glucosa usando un glucometro (One Touch, Lifescan, Milpitas, CA). Se valoraron las concentraciones sericas de insulina usando insulina de raton como patron (kit de ELISA de insulina, n° de cat.INSKR020, Crystal Chem. Inc., Chicago, IL).

Inmunotincion y medidas del area de islote. Se fijaron pancreas con formalina al 10 % y se embebieron en parafina. Se tineron secciones pancreaticas en serie de 5 pm como se describe a continuacion. Se efectuo la inmunohistoqmmica usando un suero de insulina de conejillo de Indias anti-humano n° 4011-01 (Linco Research Inc., St. Charles, MO), seguido de incubacion con anticuerpos secundarios AffiPure conjugados con peroxidasa (Jackson Immuno Research). Se revelaron las secciones usando tetraclorhidrato de 3,3-diaminobenzidina y se contratineron entonces con hematoxilina y eosina. Para las medidas del area de islote, se tineron las secciones con el anticuerpo anti-insulina anterior seguido de anticuerpo secundario biotinilado y se marcaron con estreptavidina conjugada con rojo de Tejas (Molecular Probes). Para cada seccion, se examinaron una media de 14 campos de bajo aumento bajo el microscopio y se capturaron en imagenes digitales, que se analizaron entonces usando el software MetaMorph. Brevemente, se rastrearon los islotes de cada seccion, se hallo el umbral usando el software MetaMorph y se calculo el area positiva de insulina. Se dividio la suma del area positiva de insulina (area de islote total) entre el area de tejido total en cada portaobjetos y se expreso el numero como area porcentual de islote. Se analizaron multiples secciones de al menos tres ratones por grupo.

Generacion de ratones con insercion genica Bad S155A. La estrategia de insercion genica era similar a la usad en la generacion de los alelos 3SA (Datta S.R. et al., 2002. Dev Cell 3, 631-43). Brevemente, se introdujo la mutacion de serina a alanina de S155 en el dominio BH3 de BAD con codificacion por RFLP silenciosa y se introdujo un sitio EcoRl en el exon 3 de BAD por QuickChange usando pBR322BAD como molde. Se permuto un fragmento SexA1/RsrIl de 900 pb que contema esta mutacion en un nuevo constructo pBR322BAD. Se clono un modulo FRT- PGK-NEO-FRT en un sitio Nsil 1,4 kB distal de la 3'UTR de BAD, y se introdujo un modulo de seleccion negativo de toxina de la difteria en la union genomica de BAD/pBR322 en el extremo 5' del locus de BAD. Se electroporo este vector en 129 celulas J1 ES y se inyecto en blastocitos C57B6. Se identificaron los recombinantes homologos por procedimientos estandares. Se reaislo el fragmento SexA1/RsrIl de ratones positivos del marcador RFLP y se secuencio para verificar que los ratones portaban la mutacion correcta.

Ensayo de union porpolarizacion de fluorescencia. Se expreso una protema de fusion de glutation-S-transfwrasa de bCL-Xl (residuos 1-212) que carece del dominio transmembrana C-terminal (GST-BCL-Xl AC) en E. coli BL21 usando pGEX2T (Pharmacia Biotech), y se purifico por cromatograffa de afinidad usando perlas de glutation-agarosa (Sigma) y cromatograffa lfquida de protemas rapida (FPLC). Se determino la concentracion de protema usando el ensayo de Bradford. Se incubaron SAHB fluorescinadas (50 nM) con GST-BCL-Xl AC (0,25-1000 nM) en tampon de union (NaCl 140 mM; Tris-HCl 50 mM [pH 7,4]) a temperatura ambiente. Se midio la actividad de union por polarizacion de fluorescencia usando un lector de microplacas POLARstar OPTIMA (BMG labtech). Se determinaron los valores de CE50 por analisis de regresion no lineal usando el software Prism (Graphpad).

Dicrofsmo circular. Se disolvieron los peptidos de SAHB en agua a pH neutro a concentraciones de 25-50 pM. Se obtuvieron los espectros de DC en un espectropolanmetro Jasco J-710 a 20 °C usando los siguientes parametros de medida estandares: longitud de onda, 190-260 nm; resolucion de etapa, 0,5 nm; velocidad, 20 nm/s; acumulaciones, 10; respuesta, 1 s; ancho de banda, 1 nm; longitud de paso, 0,1 cm. Se calculo el contenido de helice a de cada peptido a partir del valor de elipticidad molar del residuo medio a 222 nm ([0]222) (Chen Y.H. et al., 1974. Biochemistry 13, 3350-9; Yang JT, et al., 1986. Methods Enzymol 130, 208-269).

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un peptido BAD de dominio BH3 de menos de 195 aminoacidos para uso en el tratamiento o retardo del inicio de la diabetes.
2. 2. Un peptido para uso segun la reivindicacion 1 para tratar diabetes de tipo I.
3. 3. Un peptido para uso segun la reivindicacion 1 para tratar diabetes de tipo II.
4. 4. Un peptido para uso segun la reivindicacion 1, en el que el uso es con respecto a un sujeto que es

   hiperglucemico.
5. 5. Un peptido para uso segun la reivindicacion 1, en el que el uso es con respecto a un sujeto que es obeso.
6. 6. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se aumenta el tiempo de

   supervivencia de celulas p.
7. 7. Un peptido para uso segun la reivindicacion 6, en el que se pone en contacto el peptido con la celula p in vitro y se trasplanta entonces la celula p a un sujeto.
8. 8. Un peptido para uso segun la reivindicacion 6, en el que se pone en contacto la celula p con el peptido

   despues de trasplantar la celula p a un sujeto.
9. 9. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que aumenta la secrecion de insulina.
10. 10. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que aumenta la actividad glucocinasa.
11. 11. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que esta fosforilado.
12. 12. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que esta estabilizado en la helice alfa.
13. 13. Un peptido para uso segun la reivindicacion 12, en el que la estabilizacion se efectua reticulando por grapado de hidrocarburos o reticulacion qmmica.
14. 14. Un peptido para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende una secuencia aminoaddica expuesta en la SEQ ID NO: 2 o 3.
15. 15. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende una secuencia aminoaddica: [Xaa]n YGR ELRX1X2X3DX1 [Xbb]n (SEQ ID NO:1), en la que:

    X1 y X2 son independientemente cualquier aminoacido natural o no natural, X3 es G, D, E, S, To Y o fosforilado, cada Xaa y Xbb es independientemente un aminoacido y n es un entero de 0 a 10.
16. 16. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que es menor o igual a 25 aminoacidos de longitud.
17. 17. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que el aminoacido no natural es S5.
18. 18. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que X2 es norleucina.
19. 19. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que X1 es acido aminobutrnco o S5.