ES2313029T3 - Metodo para evaluar la actividad de fosforilacion de lkb1. - Google Patents

Abstract

Método in vitro para evaluar la actividad de LKB1, que comprende (i) proporcionar una muestra que comprende LKB1, (ii) poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato, en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y (iii) monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato, en el que la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.

Description

Método para evaluar la actividad de fosforilación de LKB1.

Antecedentes de la invención

El síndrome de Peutz-Jeghers (PSJ) es un síndrome cancerígeno hereditario que se caracteriza por una predisposición a tumores tanto benignos como malignos de muchos sistemas orgánicos. Se piensa que este síndrome está relacionado con mutaciones de pérdida de función en la proteína quinasa LKB1 (número de acceso de Gen-Bank U63333 - véase Hemminki et al., 1998, Nature, Vol. 391, p. 185-187).

En la técnica anterior no existe ningún ensayo satisfactorio para determinar la actividad de quinasa intermolecular de LKB1.

Los ensayos de la técnica anterior para determinar la actividad de LKB1 incluyen ensayos de autofosforilación, tales como los presentados por Boudeau et al., 2003, Human Mutation: Mutation in Brief 583. A pesar de la importancia fisiológica de la autofosforilación en Thr336 de LKB1, que en el mejor de los casos no está clara, en la técnica anterior no se conocen sustratos fisiológicos de LKB1 (véase, por ejemplo Boudeau, página 8 y en otras partes), y mucho menos ningún sustrato de quinasa de LKB1.

Además, los intentos de la técnica anterior por estudiar la actividad de LKB1 se centran en mutantes de pérdida de función, tales como supresiones bastas de una parte o partes catalíticas de la molécula. Se sabe tan poco sobre LKB1 en la técnica anterior, que las mejores rutas disponibles de investigación son tales experimentos toscos. El progreso está obstaculizado por la falta de conexión de LKB1 con componentes aguas abajo de las rutas de señalización/metabólicas.

Incluso si la autofosforilación de LKB1 es un suceso biológico significativo, la destrucción de esta actividad y el estudio de los efectos negativos es un instrumento tosco de investigación, y no puede conducir al análisis de componentes aguas abajo sin los sustratos importantes y biológicamente significativos para LKB1.

Puesto que no se conocen en la técnica anterior sustratos significativos de LKB1, es imposible diseñar un ensayo robusto para determinar la actividad o activación de LKB1. Tampoco es posible analizar e interpretar de forma minuciosa el significado de las partes del propio LKB1, tal como el suceso de la autofosforilación, el cual puede ser meramente permisivo en vez de regulador.

La investigación del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) está limitada por lo que se sabe sobre la base genética subyacente de la enfermedad. La técnica anterior discute sobre las relaciones con LKB1 (véase, por ejemplo, Hemminki et al., 1998, Nature, vol. 391, p. 185-187). Sin embargo, en la técnica anterior no se han establecido las relaciones con dianas o efectores aguas abajo. Además, en la técnica anterior no se han establecido dianas o efectores de LKB1 aguas abajo. De este modo, hay una falta de dianas adecuadas para la intervención, tal como en el tratamiento o prevención del PJS.

Se sabe que la activación de AMPK está correlacionada con su estado de fosforilación (véase, por ejemplo Neumann et al., 2003, Protein Expression and Purification "Mammalian AMP-activated protein kinase: functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E. coli"). Sin embargo, no se ha identificado la quinasa responsable de esta fosforilación.

La técnica anterior ha intentado proporcionar técnicas para la activación de AMPK, pero, en ausencia de un activador conocido de AMPK, estas técnicas están confinadas a la purificación parcial de extractos celulares, los cuales se aplican entonces a AMPK in vitro con la esperanza de que dichos extractos comprendan alguna forma activa de una quinasa aguas arriba desconocida que pueda dar como resultado la activación de AMPK. Estos experimentos, aunque representan el estado de la técnica, requieren no obstante un gran esfuerzo y necesariamente tienen una naturaleza tosca, basándose en extractos celulares incompletamente caracterizados. Además, estos experimentos implican el sacrificio de animales que, aunque se minimiza, no obstante es indeseable.

Baas et al. (2003, EMBO, vol. 22, p. 3062-3072) describe la activación de la quinasa supresora de tumores LKB1 mediante la pseudoquinasa STRAD de tipo STE20.

El documento EP1036844A1 describe un método de examen, un reactivo para examen, y un remedio para enfermedades provocadas por la variación en el gen de LKB1.

El documento WO 01/93874 describe un método para tratar la obesidad y el músculo paralizado, y describe ayudas ergogénicas.

Hardie y Hawley (2001, Bioessays, Vol. 23, páginas 1112-1119) describen la proteína quinasa activada por AMP, y su implicación en la hipótesis de la carga de energía.

La presente invención busca superar el problema o problemas asociados con la técnica anterior.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que LKB fosforila quinasa o quinasas aguas abajo. Además, LKB1 está en la misma ruta relacionada que AMPK.

Más particularmente, la invención se basa en el hallazgo sorprendente de que LKB1 actúa sobre AMPK. Además, como se demuestra en la presente memoria, LKB1 provoca la fosforilación y activación de AMPK. Como se explica más abajo, LKB1 puede ejercer su acción mediante fosforilación directa de AMPK, y se muestra por primera vez que LKB1 tiene un sustrato de quinasa celular específico (por ejemplo AMPK), y, contrariamente, que AMPK es seleccionada como diana y es activada por la quinasa LKB1 aguas arriba.

Estos hallazgos sorprendentes han permitido la provisión de numerosos ensayos, composiciones y tratamientos, los cuales se detallan a continuación y en las reivindicaciones anejas.

De este modo, en un aspecto, la invención proporciona un método in vitro para evaluar la actividad de LKB1, que comprende:

(i)

proporcionar una muestra que comprende LKB1,

(ii)

poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y

(iii)

monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato,

en el que la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.

Se muestra que AMPK es una quinasa sustrato particularmente buena para LKB1. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe anteriormente, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK.

Se considera que AMPK es un complejo heterotrimérico in vivo. Por lo tanto, es ventajoso usar AMPK heterotrimérica cuando se evalúa LKB1. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe anteriormente, en el que la AMPK comprende AMPK heterotrimérica. Preferentemente, la AMPK comprende AMPK de ratón o humana, preferentemente AMPK humana.

La fosforilación de AMPK se puede evaluar mediante cualquier método adecuado, tal como el ensayo de activación de AMPK. En otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe anteriormente, en el que la incorporación de fosfato en AMPK se monitoriza evaluando la actividad de AMPK. Preferentemente, la actividad de AMPK se evalúa vía la fosforilación del péptido SAMS.

La fosforilación de AMPK también se puede evaluar mediante lectura directa del estado de fosforilación de AMPK. Esto se puede hacer usando cualquier método adecuado, tal como fosfato marcado radiactivamente, o usando reactivos específicos para evaluar directamente el estado de fosforilación de AMPK. Preferentemente, se usan los reactivos específicos. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe anteriormente, en el que la incorporación de fosfato en AMPK se monitoriza evaluando la fosforilación de T-172 de AMPK, o su equivalente. El equivalente significa el mismo resto en una isoforma u homólogo de AMPK, o puede incluir un resto diferente (por ejemplo serina) en la misma posición en AMPK. Preferentemente, equivalente significa funcionalmente equivalente, es decir, indicativo de la activación de AMPK.

Ventajosamente, la incorporación de fosfato en AMPK se puede cuantificar para dar una estimación de la actividad de LKB1. En la técnica son bien conocidas las técnicas para el ensayo cuantitativo de quinasas. La incorporación de fosfato se puede cuantificar mediante formación de fosforoimagen o mediante densitometría, o mediante técnicas similares aplicadas a un ensayo inmunológico directo de T-172. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe anteriormente, que comprende además cuantificar la cantidad de fosfato incorporado por mol de AMPK, en el que dicho nivel de fosfato indica el nivel de LKB1 presente en dicha muestra.

Sorprendentemente se describe en la presente memoria que se puede usar LKB1 para fosforilar y activar AMPK. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de LKB1 recombinante o aislado, en la activación de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de LKB1 recombinante o aislado, como una AMPKK.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de LKB1 recombinante o aislado, en la fosforilación de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de LKB1 en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS).

Sorprendentemente se describe en la presente memoria que AMPK se encuentra en la misma ruta similar que LKB1, y es activada directamente por la acción de LKB1.

Se describe en la presente memoria que LKB1 incrementa la fosforilación de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de AMPK en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de hipercardiomiotrofia (HCM).

Es conocido que existen ciertas moléculas que estabilizan y/o activan LKB1. Por lo tanto, es ventajoso usar estas moléculas en la activación y/o mantenimiento de AMPK. De este modo, la presente invención se refiere al uso in vitro de moduladores de LKB1, en la modulación de AMPK. En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para modular AMPK, que comprende modular LKB1.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de HSP90 en la modulación de la actividad de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de Cdc37 en la modulación de la actividad de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de la proteína STRAD en la modulación de la actividad de AMPK.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de LKB1 en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para fosforilar AMPK, que comprende poner en contacto AMPK con LKB1 recombinante o aislado.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para incrementar la fosforilación de AMPK en un sistema, que comprende incrementar la actividad de LKB1 en dicho sistema.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para activar AMPK en un sistema, que comprende activar LKB1 en dicho sistema.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para activar AMPK, que comprende poner en contacto dicho AMPK con LKB1 recombinante o aislado.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para fosforilar AMPK, que comprende poner en contacto dicho AMPK con LKB1 recombinante o aislado.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de un modulador o moduladores de LKB1, que comprende proporcionar una primera y segunda muestra de LKB1, poner en contacto dicha primera muestra con un modulador candidato de LKB1, poner en contacto dichas primera y segunda muestras con un sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, monitorizar la incorporación de fosfato en dicho sustrato, y comparar la incorporación de fosfato en dicho sustrato en dichas primera y segunda muestras, en el que, si la incorporación de fosfato en el sustrato difiere entre dichas primera y segunda muestras, el modulador candidato se identifica como un modulador de la actividad de LKB1. Preferentemente, el sustrato es una quinasa sustrato. Preferentemente, la quinasa sustrato es o deriva de AMPK. En otro aspecto, la invención se refiere a moduladores de LKB1 identificados mediante este método. Preferentemente, dichos moduladores son activadores.

En otro aspecto, la invención se refiere a eucariotas recombinantes para el estudio de AMPK/AMPKK. Por ejemplo, la invención proporciona ventajosamente células de levadura destruidas por las AMPKK. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula de levadura recombinante que comprende perturbaciones génicas en por lo menos dos de Pak1, Tos3 y Elm1. Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende perturbaciones génicas en Pak1, Tos3 y Elm1. Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende además una perturbación génica en Snf1. Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende además una perturbación génica en Snf4. Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende además una perturbación génica en SIP1, SIP2 y GAL83. Preferentemente, la célula de levadura recombinante es capaz de expresar AMPK de mamífero. Preferentemente, la célula de levadura recombinante expresa AMPK de levadura. Preferentemente, la AMPK de mamífero es AMPK de ratón o humana, preferentemente AMPK humana. Sin embargo, la AMPK humana comprende subunidades alfa, beta y gamma. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. Las perturbaciones génicas se pueden realizar mediante cualquier técnica adecuada, o se pueden ensamblar juntas en la misma célula a partir de cepas individuales mediante cruzamiento genético. En otro aspecto, la invención se refiere a la clonación de las AMPKK y/o AMPK por complementación mediante el uso de estas cepas, por ejemplo mediante transformación con una AMPK/AMPKK candidata, o su librería, y selección sobre fuentes de carbono, para aislar las AMPK y/o AMPKK funcionales. En otro aspecto, la invención se refiere a las AMPK/AMPKK aisladas de esta
manera.

Descripción detallada de la invención

Se ha identificado una proteína quinasa que fosforila y activa a la proteína quinasa activada por AMP. Ésta forma una diana terapéutica para compuestos dirigidos a modular AMPK, en particular activar AMPK.

La invención encuentra una utilidad particular en el tratamiento o prevención de uno o más de diabetes de tipo 2, el síndrome de Peutz-Jeghers, cáncer y obesidad. Más abajo se proporcionan otras aplicaciones y detalles.

La identificación de AMPK como un sustrato de LKB1 aguas abajo proporciona la provisión de un sistema de ensayo para identificar sistemáticamente compuestos que modulan y/o activan la quinasa aguas arriba, y que pueden tener un papel terapéutico en el tratamiento de cáncer u otros trastornos, según se explica en la presente memoria.

La identificación de una quinasa aguas arriba en la cascada de AMPK proporciona una diana para la identificación de fármacos candidatos dirigidos a tratar diabetes de tipo 2 y obesidad, así como otros trastornos descritos en la presente memoria.

La identificación de AMPK como sustrato para LKB1 proporciona además un ensayo para identificar sistemáticamente fármacos candidatos que activan LKB1. Esto tiene aplicación en la terapia contra el cáncer, así como en enfermedades metabólicas y otros trastornos.

En un aspecto amplio, la invención se refiere a un método para evaluar la actividad de LKB1, que comprende proporcionar una muestra de LKB1, poner en contacto dicha muestra con un sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, y monitorizar la incorporación de fosfato en dicho sustrato, en el que la incorporación de fosfato en dicho sustrato indica la actividad de LKB1. En este aspecto, el sustrato significa cualquier sustrato biológicamente significativo, tal como aquel que tiene un efecto biológico demostrable tal como los demostrados en la presente memoria (véase la sección de Ejemplos). Preferentemente, dicho sustrato es propiamente una quinasa (es decir, una "quinasa sustrato"); preferentemente, dicho sustrato es o deriva de AMPK; preferentemente, dicho sustrato es AMPK.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "quinasa sustrato" tiene su significado normal. En particular, la "quinasa" significa una quinasa reconocible mediante comparación de secuencias, tal como la que posee el motivo o motivos distintivos de quinasa según se definen por Hunter (por ejemplo, véase Hanks, Quinn y Hunter, 1988, Science, vol. 241, p. 42). Naturalmente, "quinasa" no implica la exclusión de variantes muertas de quinasa o un fragmento o fragmentos catalíticamente inactivos, sino que se usa para describir esa familia de proteínas que se clasifica normalmente como quinasas con referencia a Hanks et al. Preferentemente, quinasa significa proteína y/o azúcar y/o lípido quinasa, preferentemente proteína quinasa.

Como se usa en la presente memoria, "sistema" tiene su significado natural, y puede incluir un sistema o sistemas biológicos complejos, tal como una célula o células completas.

La expresión "deriva de" tiene su significado normal en la técnica, en la que una sustancia se considera que "deriva de" una primera sustancia cuando parte de la sustancia se ha creado o construido a través de una cadena de sucesos que incorpora toda o parte de la primera sustancia en la sustancia en cuestión. Naturalmente, es probable que las dos sustancias difieran, por ejemplo, a través de una mutación, adición o supresión, o modificación similar, pero si la sustancia en cuestión tiene rasgos heredados de la primera sustancia entonces deriva de ella. En particular, cuando se usa en relación con biopolímeros tales como polinucleótidos o polipéptidos, una sustancia se considera que deriva de una primera sustancia cuando posee una identidad de secuencia suficiente para ser reconocida como relacionada con la primera sustancia. En este contexto, si una sustancia deriva de una primera sustancia, entonces dicha sustancia tiene preferentemente por lo menos 10 restos contiguos que poseen por lo menos un 25% de identidad con la primera sustancia, preferentemente un 30% de identidad, preferentemente un 40% de identidad, preferentemente un 50% de identidad, preferentemente un 60% de identidad, preferentemente un 70% de identidad, preferentemente un 80% de identidad, preferentemente un 90% de identidad, preferentemente un 95% de identidad, preferentemente un 96% de identidad, preferentemente un 97% de identidad, preferentemente un 98% de identidad, preferentemente un 99% de identidad, o incluso más. Preferentemente, dicha sustancia tiene por lo menos 15 restos contiguos con dicha identidad, preferentemente por lo menos 20 restos, preferentemente por lo menos 30 restos, preferentemente por lo menos 50 restos, preferentemente por lo menos 100 restos, preferentemente por lo menos 200 restos, o incluso más. Para entidades multiméricas, la expresión se puede aplicar al complejo y/o a los componentes individuales, como será manifiesto a partir del contexto. Generalmente, será suficiente si una de las subunidades deriva de la entidad
dada.

Un homólogo es como se entiende habitualmente en la técnica. Preferentemente, homólogo se refiere al equivalente de otro organismo, tal como otra especie de organismo.

El término "aislado" puede significar recombinante y/o purificado. Cuando significa purificado, el término se refiere a la sustancia cuando se separa de por lo menos un componente de la composición en la que se encuentra naturalmente.

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El agente/modulador de la presente invención se refiere a entidades implicadas en la activación de y/o fosforilación de AMPK. Un agente/modulador ejemplar de la presente invención es LKB1. Éste se puede usar en combinación con un agente o agentes estabilizantes, tales como HSP90 y/o Cdc37, o 37, o sus combinaciones. Otro modulador es la proteína STRAD, que puede activar LKB1 y, por lo tanto, activar AMPK. De este modo, la invención se refiere al uso de la proteína STRAD en la modulación de AMPK, preferentemente en la activación de AMPK.

Evaluación de la actividad de AMPK

Existe una variedad de formas en las que se puede evaluar la AMPK por una persona experta en la técnica. Según la presente invención, se puede emplear cualquier técnica adecuada para evaluar la actividad de AMPK.

La actividad de AMPK se puede determinar directamente (por ejemplo, evaluando la actividad de quinasa de AMPK) o indirectamente (por ejemplo, evaluando el estado de fosforilación de treonina 172 de AMPK). Preferentemente, la actividad de AMPK se mide directamente.

La mayoría de las técnicas para evaluar AMPK se basan en la medición de la fosforilación de un sustrato capaz de ser fosforilado por AMPK. Este sustrato puede ser cualquier sustrato adecuado, tal como un polipéptido (por ejemplo un polipéptido sustrato relativamente corto (por ejemplo 50 restos de aminoácidos o menos), o un polipéptido más largo/proteína o fragmento o dominio del mismo.

La actividad de AMPK se puede evaluar midiendo la transferencia de fosfato a un sustrato de AMPK por AMPK. También es posible evaluar la actividad de AMPK determinando el estado de fosforilación del resto 172 (preferentemente la treonina 172 de tipo natural) dentro de la subunidad alfa de AMPK. Los ejemplos de este ensayo se dan más abajo, por ejemplo como se muestra en la Fig. 4e.

Usando este método, se fosforila AMPK por la quinasa aguas arriba, y la fosforilación de treonina 172 se determina mediante transferencia Western, usando un anticuerpo que reconoce específicamente fosfotreonina 172 (comercialmente disponible de Cell Signalling Technologies).

La actividad de AMPK se evalúa preferentemente midiendo la fosforilación de un sustrato (por ejemplo un péptido o un sustrato proteínico). Este procedimiento es muy estándar para las proteína quinasas. La AMPK se puede evaluar usando sustratos proteínicos (por ejemplo acetil-CoA carboxilasa), así como también péptidos más cortos.

La transferencia de fosfato se monitoriza preferentemente usando un radioisótopo o radioisótopos de fósforo. Por ejemplo, se puede usar ATP marcado con 32-P, pero podría ser cualquier fosfato marcado radiactivamente, por ejemplo 33-P. Preferentemente se usa ATP marcado con 32-P gamma.

El sustrato de AMPK es preferentemente un péptido. Este péptido puede ser cualquier sustrato peptídico que sea capaz de ser fosforilado por AMPK.

Preferentemente, el péptido comprende una secuencia de consenso para la fosforilación por AMPK, comprendiendo dicho consenso un resto hidrófobo 5 aminoácidos N-terminales a un resto fosforilable (que es una serina o una treonina), un resto básico en una posición 2, 3 ó 4 aminoácidos N-terminales al resto fosforilable, con un resto hidrófobo 4 aminoácidos C-terminales al resto fosforilable, que se puede representar según:

hidrófobo-(básico,X,X)-X-serina o treonina-X-X-X-hidrófobo

en el que el orden de los aminoácidos entre paréntesis no es crítico.

En Weekes, J., Ball, K.L., Caudwell, F.B. y Hardie, D.G., FEBS Lett. 334, 335-339 (1993), que se incorpora en la presente memoria como referencia, se puede encontrar una guía adicional sobre el motivo de consenso para la fosforilación por AMPK.

Estos péptidos se pueden sintetizar fácilmente mediante cualquier técnica adecuada, o se pueden obtener a partir de compañías comerciales o laboratorios, o simplemente se pueden obtener según las necesidades en base al fin o caso particular.

Un ejemplo preferido de un sustrato de AMPK adecuado es el péptido SAMS (HMRSAMSGLHLVKRR) (Davies, S.P., Carling, D. y Hardie, D.G., Eur. J. Biochem. 186, 123-128 (1989)). Éste está comercialmente disponible de Upstate Biotechnology Inc.

Preferentemente, la actividad de AMPK se evalúa como se describe en la presente memoria (por ejemplo como se muestra en la Figura 4d).

La AMPK también se puede evaluar por medios genéticos. Por ejemplo, se puede usar o adaptar un ensayo para AMPK de levadura (Snf1), en el que la transcripción de un informador lexAop-lacZ depende de la actividad catalítica de LexA-Snf1p unido al promotor (Kuchin, 2000-Kuchin, S., Treich, I. y Carlson, M. A regulatory shortcut between the Snf1 protein kinase and RNA polymerase II holoenzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7916-7920 (2000) -
incorporado en la presente memoria como referencia). Este y otros ensayos genéticos se explican de forma más completa más abajo, tal como en la sección de ejemplos.

AMPK

Con relación al uso de AMPK en los ensayos de la presente invención, hay muchos métodos alternativos para producir las proteínas disponibles para la persona experta.

En un ensayo según la presente invención, se podría usar AMPK, u homólogos de AMPK, que contienen el resto fosforilable necesario para la activación, y que contiene aquellos restos de aminoácidos necesarios para la actividad. Preferentemente, el resto de la activación es 172, preferentemente treonina 172. El que un resto sea necesario o no para la actividad se puede determinar mediante pruebas en un ensayo o ensayos de AMPK como se describen en la presente memoria, por ejemplo usando el péptido SAMS.

La AMPK es activada por fosforilación en el bucle de activación. En particular, la AMPK es activada por fosforilación en el sitio 172 de activación. La AMPK de origen natural habitualmente posee treonina en este sitio; sin embargo, se apreciará que se puede sustituir en este sitio por un aminoácido fosfoaceptor similar, por ejemplo serina. Además, se pueden construir mutantes constitutivamente activos mediante mutación posterior en este sitio, como se sabe en la técnica, por ejemplo introduciendo restos cargados negativamente. En el contexto de la presente invención, la AMPK posee preferentemente un resto fosfoaceptor en el bucle de activación en la posición 172 como se juzga con referencia a la secuencia de mamífero de tipo natural, y preferentemente la posición 172 es treonina.

A este respecto, se puede usar cualquier preparación activa de LKB1, por ejemplo LKB1 recombinante expresada en un sistema adecuado con o sin una secuencia o secuencias de etiquetas, para fosforilar y activar cualquier forma de AMPK que retenga el sitio de activación (equivalente a treonina 172) y/o que fue capaz de presentar actividad catalítica de AMPK tras la fosforilación.

Se apreciará que AMPK está compuesta naturalmente de múltiples subunidades. De este modo, como se usa en la presente memoria, el término "AMPK" se refiere a aquella proteína o asociación de proteínas que tiene la actividad de AMPK. Actualmente hay por lo menos 12 posibles combinaciones de subunidades en asociación para formar AMPK. Este número surge del hecho de que hay actualmente 2 subunidades alfa, 2 subunidades beta y 3 subunidades gamma, dando de ese modo 12 posibles formas heterotriméricas diferentes de AMPK. La subunidad alfa es seleccionada como diana por LKB1.

La fuente preferida de AMPK útil en la presente invención es un complejo de AMPK de mamífero expresado de forma bacteriana. En Neumann et al., 2003, Protein Expression and Purification "Mammalian AMP-activated protein kinase:functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E. coli" se detalla una estrategia preferida usada para la expresión del complejo. De este modo, en una forma de realización preferida, la AMPK usada en los ensayos de la presente invención se prepara según Neumann et al.

Se apreciará que aunque Neumann et al. trabaja a partir de subunidades de AMPK de ratón codificadas por ADNc detallados en los números de acceso GenBank X95578, X95577 y U40819, la preparación de subunidades de AMPK humana está también dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica siguiente Neumann y modificando simplemente los cebadores de la PCR usados para las etapas de clonación para hacer un seguimiento de la secuencia humana según sea necesario, y usando para la etapa de la PCR un ácido nucleico molde humano adecuado. De este modo, en otra forma de realización, preferentemente la AMPK es AMPK humana preparada según Neumann
et al.

También es posible usar una versión o versiones truncadas de la subunidad alfa de AMPK en la presente invención, preferentemente aquellas que contienen la subunidad catalítica, preferentemente que incluyen treonina 172. Truncando la AMPK alfa, es posible producir una proteína que se puede fosforilar en la treonina 172 por la quinasa aguas arriba y es activa en ausencia de las otras 2 subunidades de AMPK reguladoras (beta y gamma). Preferentemente, la AMPK alfa truncada, para uso en la presente invención, se prepara según Hamilton, S.R., O'Donnell, J.B., Hammet, A., Stapleton, D., Habinowski, S.A., Means, A.R., Kemp, B.E., y Witters, L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 892-898 (2002). Este material comprende los primeros 312 aminoácidos de alfa1 expresada bacterianamente y purificada usando Ni-NTA. Este material se puede usar entonces como un sustrato para la quinasa aguas arriba, en los ensayos de la presente invención.

También es posible usar AMPK purificada de tejidos de animales. Por ejemplo, la AMPK se puede purificar a partir de hígado de rata, según Carling, D., Clarke, P.R., Zammit, V.A. y Hardie, D.G. Eur. J. Biochem. 186, 123-128 (1989). Naturalmente, se apreciará por el lector experto que es posible usar en los ensayos de la presente invención AMPK purificada de cualquier fuente que contenga la enzima. Por ejemplo, la AMPK purificada, para uso en la presente invención, está comercialmente disponible de Upstate Biotechnology Inc.

Adicionalmente, se apreciará que el homólogo o los homólogos de AMPK procedentes de otras especies también serían útiles en la presente invención, por ejemplo SNF1 de levadura.

En una forma de realización preferida, la AMPK se puede preparar para uso en los ensayos de la presente invención como se describe en Neumann et al. (Neumann, Woods, Carling, Wallimann y Schlattner Protein Expression and Purification 2003 "Mammalian AMP-activated protein kinase: functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E. coli").

En otra forma de realización preferida, la AMPK se puede preparar según Hamilton et al. (Hamilton et al. 2002, BBRC, vol. 293, p. 892-898), que describe la expresión de una forma truncada de AMPK adecuada para uso en la presente invención.

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LKB1

Con respecto al uso de LKB1 en los ensayos de la presente invención, hay muchos métodos alternativos para producir LKB1 disponibles para el lector experto. Naturalmente, puede que no se sepa que la muestra comprende LKB1, por ejemplo si el ensayo se está usando cualitativamente para determinar si está presente la actividad de LKB1 en dicha muestra.

Se podría usar cualquier preparación activa de LKB1 (por ejemplo expresada en un sistema adecuado con o sin una secuencia o secuencias de etiquetas) para fosforilar y activar cualquier preparación de AMPK, tal como AMPK que retiene el sitio de activación (equivalente a treonina 172 de AMPK) y/o que fue capaz de mostrar actividad catalítica tras la fosforilación (véase la sección de AMPK anterior).

Específicamente, Sapkota et al. (Sapkota et al. 2001, JBC, vol. 276, p. 19469-19482) proporciona ejemplos de diferentes formas etiquetadas de LKB1, adecuadas para uso en la presente invención. Preferentemente, la LKB1 se produce en E. coli y se purifica según Sapkota et al., que se incorpora en la presente memoria como referencia.

El lector experto apreciará que también serían adecuados diferentes clones de LKB1 procedentes de diferentes especies. Estos pueden incluir homólogos de LKB1. Los preferidos son aquellos homólogos que muestran la mayor identidad de secuencia con LKB1 humana o de ratón, preferentemente con LKB1 humana.

Sapkota usa como molde la secuencia de ratón NCBI AA542163/IMAGE 550355 en la clonación de LKB1 mediante PCR. Naturalmente, la persona experta en la técnica apreciará que Sapkota se adapta fácilmente para proporcionar la LKB1 humana siguiendo los mismos procedimientos, y adaptando simplemente las secuencias cebadoras según sea necesario a la secuencia humana, y usando un ácido nucleico molde humano adecuado. De este modo, en una forma de realización, LKB es preferentemente LKB humana.

Puede ser deseable usar una versión truncada de LKB1 que retenga actividad. La retención de la actividad de LKB se determina fácilmente usando los ensayos de la presente invención.

La LKB se puede activar como se describe más abajo, por ejemplo mediante expresión en una estirpe o estirpes celulares particulares.

Puede ser deseable expresar LKB1 directamente en una forma activa, y esto se podría usar entonces en los ensayos de la presente invención. La LKB1 se puede activar y/o estabilizar como se sabe en la técnica, por ejemplo usando la proteína HSP90 y/o Cdc37 y/o STRAD.

Se sabe que LKB1 es activa cuando se expresa en células COS7, HEK293, de melanoma G361, de hepatoma hepático CCL13, de músculo esquelético H2K, HeLa o Sf9.

En una forma de realización preferida, la LKB y la AMPK procederían de, o derivarían de, la misma especie.

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Ensayo de LKB1

El ensayo de LKB1 quinasa se realiza usando condiciones estándar para ensayos de quinasa. El comentario a continuación se refiere a concentraciones finales en el ensayo.

El pH se tampona preferentemente para los ensayos de LKB1 quinasa. Preferentemente, el pH se tampona entre 6 y 9, preferentemente entre 6,5 y 8,5, preferentemente 7,5.

El agente tamponante puede ser Tris, HEPES, MOPS, MES, u otro agente tampón adecuado. Preferentemente, el agente es HEPES. Preferentemente, el agente tampón es 50 mM.

Se incluye un ion metálico. Preferentemente, un ion metálico 2+. Preferentemente, un ion manganeso y/o magnesio. Preferentemente, un ion magnesio. Preferentemente, el ion metálico se proporciona como cloruro metálico. Preferentemente, el ion metálico está presente en una concentración de 1-10 mM, preferentemente 5 mM.

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Opcionalmente se incluye un estabilizante. El estabilizante puede ser glicerina, por ejemplo glicerina al 10%, o puede ser un detergente, tal como Tritón, por ejemplo Tritón al 1%, o Tween, por ejemplo Tween al 0,1%.

Ventajosamente se incluye un agente reductor. El agente reductor puede ser DTT, glutationa, b-mercaptoetanol, u otro agente adecuado. Preferentemente, el agente se usa en una concentración de 1 mM. Preferentemente, el agente es DTT.

Opcionalmente se usa un agente quelante. Preferentemente, el agente quelante es EDTA, preferentemente EDTA 1 mM.

Se incluye ATP. Preferentemente, el ATP está presente en una concentración de 10 uM a 10 mM, preferentemente 10 uM a 5 mM, preferentemente 100 uM. El ATP está marcado radiactivamente (preferentemente marcado gamma), por ejemplo con 33P o 32P, preferentemente 32P, o puede no estar marcado radiactivamente, dependiendo de las necesidades y de la lectura escogida. Si no está marcado radiactivamente, la lectura se lleva a cabo preferentemente mediante inmunodetección de P-T172 de AMPK.

Opcionalmente se puede incluir un activador o activadores de LKB1. Estos pueden incluir la proteína STRAD y/o AMP.

Si se desea, se pueden incluir otros factores de LKB1, por ejemplo HSP90, Cdc37 u otros.

Preferentemente, las condiciones para el ensayo de LKB1 son como se explican en la sección de ejemplos, particularmente se prefieren aquellas condiciones dadas en el Ejemplo 7, tal como 100 uM de ATP.

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Perturbación génica

La perturbación génica se puede lograr mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, tal como interrupción, mutación o supresión. Preferentemente, la perturbación génica se logra mediante supresión de por lo menos parte de la secuencia codificante del genoma, preferentemente mediante supresión de toda la secuencia codificante del genoma.

La destrucción también se puede lograr mediante modificación de elementos transcripcionales, tal como un elemento o elementos promotores, o mediante la sobreexpresión de un ácido o ácidos nucleicos antisentido o inhibidores, para reducir o suprimir la traducción de un ARN transcrito, o por cualquier otro medio adecuado conocido en la técnica.

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Secuencias de etiquetas

Los polipéptidos útiles en la presente invención se pueden preparar con una etiqueta de epítopo, tal como myc, HA, glutationa-S-transferasa, flag, u otra etiqueta. Preferentemente es flag.

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Aplicaciones médicas

La presente invención encuentra utilidad particular en el tratamiento, prevención y/o mejora del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), obesidad, diabetes, preferentemente diabetes de tipo II, hipercardiomiotrofia (HCM), mantenimiento de la homeostasia de la energía celular, estrés, incluyendo choque térmico, hipoxia e isquemia, fatiga muscular y otros estados conectados con niveles alterados de ATP celular, cáncer, particularmente cánceres que se producen en sujetos con PJS, poliposis intestinal, resistencia a la transformación y supresión del crecimiento celular, por ejemplo inversión/detección de un estado o estados de crecimiento desregulado, inducción de o permisión de muerte
apoptótica.

La familia de Snf1/AMPK de quinasas es importante para las respuestas al estrés metabólico en eucariotas. En mamíferos, la AMPK es activada por múltiples estreses, muchos de los cuales conducen a un incremento en la relación de AMP:ATP celular, y también por leptina y por el agente hipoglucémico metformina. La AMPK tiene un papel central coordinando la homeostasia energética, y es un regulador importante del metabolismo lipídico, del almacenamiento de glucógeno, y del transporte de glucosa. Se ha implicado a la AMPK en el desarrollo y tratamiento de trastornos metabólicos, incluyendo diabetes de tipo 2 y obesidad, y las mutaciones en AMPK producen anormalidades cardíacas en seres humanos.

En particular, los tratamientos de la presente invención se pueden usar en un régimen combinado con fármacos dirigidos contra p53 (por ejemplo, véase Bardeesy et al., Nature, vol. 419, p. 162), para un efecto potenciado.

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Activación de Snf1 de levadura y de proteína quinasa de mamífero activada por AMP por quinasas aguas arriba

Se han identificado tres quinasas, Tos3p, Pak1p, y Elm1p, que funcionan como quinasas aguas arriba en la cascada de la quinasa Snf1. Se presentan datos genéticos y bioquímicos de que estas quinasas fosforilan y activan Snf1 quinasa in vitro e in vivo (véase la sección de ejemplos). Las células de levadura mutantes, que carecen de estas tres quinasas, son defectuosas en la utilización de fuentes de carbono distintas de la glucosa, una función distintiva de la ruta de Snf1 quinasa. Esta es la primera identificación de quinasas aguas arriba en la cascada de Snf1/AMPK quinasa con papeles/funciones fisiológicas demostradas.

Estas tres quinasas muestran claramente una redundancia funcional significativa, puesto que las tres deben de estar mutadas para conferir los fenotipos de Snf examinados en la presente memoria. Sin embargo, parece probable que demostrarán tener algunas funciones distintas con respecto a la regulación de Snf1. Cada una de las tres quinasas aguas arriba puede mostrar cierta preferencia por Snf1 quinasa que contiene una isoforma de la subunidad \beta específica. Otra posibilidad es que las tres quinasas respondan preferentemente a diferentes tipos de estrés metabólico, o a diferentes señales que resulten de un único estrés, tal como la limitación de glucosa.

Como se explica en la presente memoria, la identificación de estas quinasas también tiene importancia más allá de la levadura, al permitir diseñar y refinar ensayos según la presente invención, tales como ensayos y/o detecciones sistemáticas para la identificación de quinasas aguas arriba en la cascada de AMPK.

El examen de la quinasa LKB1 (una quinasa supresora de tumores) de mamífero estrechamente relacionada, dio pruebas de que la LKB1 es una quinasa aguas arriba para AMPK.

Se demuestra en la presente memoria que LKB1 fosforila y activa in vitro AMPK en el resto de treonina del bucle de activación.

De este modo, se demuestra que LKB1 es una diana valiosa para fármacos candidatos que influyan sobre la actividad de AMPK en las células.

Además, estos hallazgos apoyan el papel descrito para AMPK en la regulación del crecimiento y transformación así como del metabolismo, e igualmente el papel fisiológico de LKB1 en la regulación de AMPK in vivo.

Se apreciará que otras quinasas de mamíferos, que están relacionadas con las quinasas aguas arriba de levaduras, también son candidatas para quinasas genuinas de la cascada de AMPK según la presente invención. Estas quinasas aguas arriba de mamíferos representan dianas terapéuticas según la presente invención, particularmente para el tratamiento de trastornos metabólicos humanos, incluyendo obesidad y diabetes de tipo 2, y cánceres.

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Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del agente o agentes y/o del modulador o moduladores de la presente invención, y un vehículo, diluyente o excipiente (incluyendo sus combinaciones) farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal, en medicina humana y veterinaria, y comprenderán típicamente uno cualquiera o más de un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publising Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la ruta pretendida de administración y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como el vehículo, excipiente o diluyente - o además de él - cualquier aglutinante o aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de revestimiento, agente o agentes solubilizantes, adecuados.

En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico, y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación, dependiendo de los diferentes sistemas de suministro. A título de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular para ser administrada usando una minibomba o mediante una ruta mucosal, por ejemplo como un pulverizador nasal o aerosol para inhalación o disolución ingerible, o parenteralmente, en la que la composición se formula mediante una forma inyectable, para el suministro, por ejemplo, mediante una ruta intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, la formulación se puede diseñar para ser administrada mediante un número de rutas.

Cuando el agente se administra de forma mucosal a través de la mucosa gastrointestinal, debería de ser capaz de permanecer estable durante el tránsito a través del tubo digestivo; por ejemplo, debería de ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido, y resistente a los efectos detergentes de la bilis.

Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante inhalación, en forma de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción, disolución, crema, ungüento o polvo muy fino, mediante el uso de un parche para la piel, oralmente en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, ya sea solos o en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o se pueden inyectar parenteralmente, por ejemplo intravenosa, intramuscular o subcutáneamente. Para la administración parenteral, las composiciones se deben de usar mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones se pueden administrar en forma de comprimidos o pastillas para chupar, que se pueden formular de manera convencional.

Para algunas formas de realización, los agentes y/o factores de crecimiento de la presente invención también se pueden usar en combinación con una ciclodextrina. Se sabe que las ciclodextrinas forman complejos de inclusión y de no inclusión con moléculas farmacéuticas. La formación de un complejo de fármaco-ciclodextrina puede modificar la solubilidad, la velocidad de disolución, la biodisponibilidad y/o la propiedad de estabilidad de una molécula farmacéutica. Los complejos de fármaco-ciclodextrina generalmente son útiles para la mayoría de las formas de dosificación y rutas de administración. Como una alternativa a la complejación directa con el fármaco, la ciclodextrina se puede usar como un aditivo auxiliar, por ejemplo como un vehículo, diluyente o solubilizante. Las más usadas habitualmente son las alfa-, beta- y gamma-ciclodextrinas, y los ejemplos adecuados se describen en los documentos WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 y WO-A-98/55148.

Si el agente/modulador es una proteína, entonces dicha proteína se puede preparar in situ en el sujeto tratado. A este respecto, se pueden suministrar secuencias nucleotídicas, que codifican dicha proteína, mediante el uso de técnicas no víricas (por ejemplo mediante el uso de liposomas) y/o mediante técnicas víricas (por ejemplo mediante el uso de vectores retrovíricos), de forma que dicha proteína se exprese a partir de dicha secuencia nucleotídica.

En una forma de realización preferida, el fármaco de la presente invención se administra tópicamente.

Por tanto, preferentemente, el fármaco está en una forma que es adecuada para el suministro tópico.

Administración

El término "administrar" incluye el suministro mediante técnicas víricas o no víricas. Los mecanismos de suministro vírico incluyen pero no se limitan a vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores víricos del herpes, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, y vectores baculovíricos. Los mecanismos de suministro no vírico incluyen la transfección mediada por lípidos, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfífilos faciales catiónicos (CFA), y sus combinaciones.

Los componentes de la presente invención se pueden administrar solos, pero generalmente se administrarán como una composición farmacéutica - por ejemplo, cuando los componentes están en mezcla con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico adecuado, seleccionado con respecto a la ruta pretendida de administración y a la práctica farmacéutica estándar.

Por ejemplo, los componentes se pueden administrar (por ejemplo oral o tópicamente) en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, disoluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retrasada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.

Si el fármaco es un comprimido, entonces el comprimido puede contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, carbonato cálcico dibásico, y glicina, agentes disgregantes tales como almidón (preferentemente almidón de maíz, de patata o de tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa sódica, y algunos silicatos complejos, y aglutinantes de la granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, se pueden incluir agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo, y talco.

También se pueden utilizar como cargas en cápsulas de gelatina composiciones sólidas de un tipo similar. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche, o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para las suspensiones acuosas y/o elixires, el agente se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, materia colorante o tintes, con agentes emulsionantes y/o de suspensión, y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y sus combinaciones.

Las vías de administración (suministro) incluyen, pero no se limitan a, uno o más de: oral (por ejemplo como un comprimido, cápsula, o como una disolución ingerible), tópica, mucosal (por ejemplo como una pulverización nasal o un aerosol para inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo mediante una forma inyectable), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutánea, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), transdérmica, rectal, bucal, vaginal, epidural, sublingual.

En un aspecto preferido, la composición farmacéutica se suministra tópicamente.

Se entenderá que no todos los componentes del fármaco necesitan ser administrados por la misma vía. Igualmente, si la composición comprende más de un componente activo, entonces esos componentes se pueden administrar por vías diferentes.

Si un componente de la presente invención se administra parenteralmente, entonces los ejemplos de tal administración incluyen uno o más de: la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraestémica, intracraneal, intramuscular o subcutánea del componente, y/o usando técnicas de infusión.

Para la administración parenteral, el componente se usa mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o glucosa para que la disolución sea isotónica con la sangre. Las disoluciones acuosas se deberían tamponar adecuadamente (preferentemente hasta un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas, en condiciones estériles, se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar, bien conocidas por los expertos en la materia.

Como se ha indicado, el componente o componentes de la presente invención se pueden administrar intranasalmente o mediante inhalación, y se suministra convenientemente en forma de un inhalador de polvo seco o en una presentación de un pulverizador de aerosol desde un recipiente a presión, bomba, pulverizador o nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A^{TM}) o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA^{TM}), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para que suministre una cantidad medida. El recipiente a presión, bomba, pulverizador o nebulizador puede contener una disolución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propelente como disolvente, que adicionalmente puede contener un agente lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitán. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (hechos de, por ejemplo, gelatina) para uso en un inhalador o in-
suflador, para que contengan una mezcla en polvo del agente y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Como alternativa, el componente o componentes de la presente invención se pueden administrar en forma de un supositorio o un pesario, o se pueden aplicar tópicamente en forma de un gel, hidrogel, loción, disolución, crema, ungüento o polvo muy fino. El componente o componentes de la presente invención también se pueden administrar dérmica o transdérmicamente, por ejemplo mediante el uso de un parche para la piel. También se pueden administrar mediante las vías pulmonar o rectal. También se pueden administrar mediante la vía ocular. Para uso oftálmico, los compuestos se pueden formular como suspensiones micronizadas en disolución salina estéril, isotónica, de pH ajustado, o, preferentemente, como disoluciones en disolución salina estéril, isotónica, de pH ajustado, opcionalmente en combinación con un agente conservante, tal como cloruro de benzalconio. Como alternativa, se pueden formular en un ungüento, tal como vaselina.

Para la aplicación tópica a la piel, el componente o componentes de la presente invención se pueden formular como un ungüento adecuado que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, aceite de vaselina, vaselina blanca, propilenglicol, un compuesto de polioxietileno y polioxipropileno, cera emulsionante, y agua. Como alternativa, se puede formular como una loción o crema adecuada, suspendida o disuelta en, por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

Niveles de la dosis

Típicamente, un médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un individuo. El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular se pueden variar, y dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, de la estabilidad metabólica y de la duración de la acción de ese compuesto, de la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular, y la terapia individual que se sigue.

Dependiendo de las necesidades, el agente se puede administrar a una dosis de 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal, tal como de 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal.

Formulación

El componente o componentes de la presente invención se pueden formular en una composición farmacéutica, tal como mezclando con uno o más de un vehículo, diluyente o excipiente adecuado, usando técnicas que son conocidas en la técnica.

Sal farmacéuticamente activa

El agente de la presente invención se puede administrar como una sal farmacéuticamente aceptable. Típicamente, una sal farmacéuticamente aceptable se puede preparar fácilmente usando un ácido o base deseado, según sea apropiado. La sal puede precipitar de la disolución y se puede recoger por filtración, o se puede recuperar por evaporación del disolvente.

Tratamiento

Se apreciará que todas las referencias en la presente memoria a tratamiento incluyen uno o más de un tratamiento curativo, paliativo y profiláctico. Preferentemente, el término tratamiento incluye por lo menos un tratamiento curativo y/o un tratamiento profiláctico.

El tratamiento puede ser de uno o más de los trastornos mencionados en la presente memoria, o una dolencia relacionada.

Terapia

Los agentes/moduladores identificados por los métodos de la presente invención se pueden usar como agentes terapéuticos - es decir, en aplicaciones de terapia.

Al igual que el término "tratamiento", el término "terapia" incluye efectos curativos, efectos de alivio, y efectos profilácticos.

La terapia se puede realizar sobre seres humanos o animales.

La terapia puede incluir el tratamiento de uno o más de los trastornos mencionados en la presente memoria, o una dolencia relacionada.

La invención se describe a continuación mediante los ejemplos, en los que la referencia se hace a las figuras siguientes.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Sobreexpresión y fenotipos mutantes. (A) La sobreexpresión de Tos3p, Pak1p, y Elm1p estimula la función de Snf1 en un ensayo informador. Los transformantes de la cepa TAT7 (ura3::lexAop-lacZ) expresaron GST o GST-Tos3p, -Pak1p, o -Elm1p a partir de un promotor (pRH95, pRH98, pRH94, respectivamente, purificados de una librería (Martzen, 1999)), inducible por cobre, y LexA-Snf1p (pOV8 (vincent, 2001)). La síntesis de \beta-galactosidasa a partir del informador dependió de la actividad de LexA-Snf1p (Kuchin, 2000). Los transformantes (n = 3) se hicieron crecer hasta la fase logarítmica media en medio completo sintético (SC) selectivo + 2% de glucosa, se cambiaron a un medio que contiene 0,5 mM de CuSO_{4} y 2% de glucosa (barras en blanco) o 0,05% de glucosa (barras en negro) durante 3 h, y se evaluaron para determinar la actividad de \beta-galactosidasa (Kuchin, 2000). Los transformantes del control, que expresan LexA con cada GST-quinasa, tuvieron valores de <0,3 U. (B) Los mutantes tos3\Deltapak1\Deltaelm1\Delta triples mostraron defectos de crecimiento. Los mutantes dobles derivados de W303, MCY5117 (MAT\alpha, tos3\Delta::KanMX4 pak1\Delta::KanMX4 ura3) y MCY5122 (MATa tos3\Delta::KanMX4 ELM1\Delta::URA3 ura3), se cruzaron y se sometieron a análisis de tétradas. Los segregantes se replicaron a partir de medio rico hasta SC-Ura + 2% de glucosa y SC + 2% de glicerina/3% de etanol. Se muestran cinco tétradas. Se observó el mismo patrón de crecimiento en SC + 2% de rafinosa + antimicina A (1 \mug/ml). Los asteriscos indican segregantes de mutantes triples; los genotipos se determinaron mediante análisis por PCR de ADN genómico. Cepas de control: de tipo natural (WT); mutante snf1\Delta; mutantes dobles progenitores.

Fig. 2. Ensayos de la actividad de Snf1 quinasa. (A, B) Se hicieron crecer, en SC selectivo + 2% de glucosa, células de tipo natural y de mutantes triples que expresan LexA-Snf1p o sus derivados mutantes T210A y K84R (pRJ55, pRJ217, y pRJ215 (Jiang, 1996)). Las proteínas se inmunoprecipitaron de los extractos (200 \mug) con anti-LexA. Los inmunoprecipitados (A) se incubaron en tampón de quinasa que contiene \gamma-^{32}P-ATP, y después se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía, y (B) se analizaron mediante inmunotransferencia con anti-LexA. (C, D) Los extractos se prepararon por duplicado a partir de células que se hicieron crecer en medio rico. La Snf1 quinasa se purificó parcialmente mediante cromatografía sobre DEAE-Sepharose, y las fracciones del pico se reunieron y se concentraron. Las fracciones reunidas (C) se evaluaron por triplicado para determinar la fosforilación del péptido SAMS (HMRSAMSGLHLVKRR) en presencia de \gamma-^{32}P-ATP (Woods, 1994; Davies, 1989), y (D) se inmunotransfirieron con anti-Snf1. También, un extracto de mutante snf1-K84R no mostró actividad.

Fig. 3. Tos3p y Elm1p fosforilan Snf1p en T210 in vitro. Snf1KD-K84R y Snf1KD-T210A, etiquetados con His, se expresaron bacterianamente a partir de pRH89 y pRH90, y derivados de pET32c (Novagen), y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con cobalto sobre una resina TALON (Clontech). Los extractos se prepararon a partir de células de levadura que expresan GST-Tos3p (Martzen, 1999), GST-Pak1p (Martzen, 1999) y GST-Elm1p (Zhu, 2000), y la GST-quinasa se purificó sobre glutationa-Sepharose. La GST-quinasa inmovilizada se incubó con la proteína mutante Snf1KD indicada (0,2 \mug) o sin sustrato, en presencia de \gamma-^{32}P-ATP durante 20 minutos a 25ºC. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE. Se muestra un autorradiograma. Una GST-quinasa arbitraria, YPL141C, sirvió como control. Las flechas representan Snf1KD. Los asteriscos muestran la GST-quinasa de longitud completa autofosforilada. Se indican los marcadores de tamaño molecular (kDa).

Fig. 4. Tos3p y LKB1 fosforilan y activan AMPK in vitro. (A) Se incubó AMPK expresada bacterianamente (\alpha1\beta1\gamma1 (Neumann, 2003)) con MgATP y GST-quinasa unida a glutationa-Sepharose, durante 30 minutos a 30ºC. Tras la centrifugación para eliminar la resina, se midió la actividad de AMPK en el sobrenadante usando el ensayo del péptido SAMS (Davies, 1989). (B) Se incubó una forma catalíticamente inactiva de AMPK (2 \mug), que contiene una mutación D157A en la subunidad \alpha (Stein, 2000), con GST-Tos3p o GST unida a perlas de glutationa-Sepharose, en presencia de \gamma-^{32}P-ATP durante 30 minutos a 30ºC. Las perlas se eliminaron por centrifugación, y las proteínas en el sobrenadante se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Se indican los marcadores de tamaño molecular (kDa). (C) Se fosforiló AMPK expresada bacterianamente (0,15 \mug) mediante GST-Tos3p, y se analizó mediante inmunotransferencia con anticuerpo específico anti-fosfotreonina 172 (Cell Signalling Technologies). La AMPK también se incubó con GST o con AMPKK de hígado de rata parcialmente purificada (Hawley, 1996). (D) Se purificó LKB1 (de tipo natural, WT) etiquetada con FLAG, o un mutante catalíticamente inactivo (D194A), a partir de lisados de células COS7 mediante la unión a gel de afinidad por FLAG (Sigma). La AMPK expresada bacterianamente se incubó con las perlas, y se midió la actividad de AMPK como en (A). La fosforilación de T172 se determinó mediante inmunotransferencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Activación de Snf1 de levadura y de proteína quinasa activada por AMP de mamífero mediante quinasas aguas arriba Sumario

Snf1 y la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) son los componentes aguas abajo de las cascadas de proteínas quinasas que desempeñan papeles fundamentales en las respuestas celulares al estrés metabólico, y parece que se conservan en todas las células eucariotas. En seres humanos, se ha propuesto que la AMPK desempeña un papel en trastornos metabólicos, incluyendo la diabetes y la obesidad. La quinasa o quinasas aguas arriba en la cascada han sido esquivas, a pesar de los esfuerzos considerables. Se han identificado tres quinasas, Pak1p, Tos3p y Elm1p, que activan Snf1 quinasa en levadura. La supresión triple de los genes emparentados provoca un fenotipo mutante, y elimina la actividad catalítica de Snf1. Las tres quinasas fosforilan Snf1p recombinante en la treonina del bucle de activación. Además, Tos3p fosforila y activa AMPK recombinante de mamífero, sugiriendo la conservación de la función de las quinasas aguas arriba. No hay homólogos claros de mamífero de Pak1p, Tos3p y Elm1p, aunque sus dominios catalíticos están muy estrechamente relacionados con los miembros de la familia de proteínas quinasas quinasas dependientes de Ca^{2+}/calmodulina (CaMKK). Sin embargo, estudios previos indican que la principal quinasa aguas arriba en la cascada de AMPK (AMPKK) no depende de Ca^{2+}/calmodulina.

Se demostró en la presente memoria que la proteína quinasa LKB1 relacionada con CamKK fosforila y activa AMPK in vitro. Las mutaciones en LKB humana provoca el síndrome de Peutz-Jeghers, un cáncer hereditario. Estos resultados sugieren que la misma cascada de proteína quinasas está implicada en la regulación del metabolismo, así como en el crecimiento y la transformación.

La familia de quinasas Snf1/AMPK es importante para las respuestas frente al estrés metabólico en eucariotas. En mamíferos, la AMPK es activada por múltiples estrés, muchos de los cuales conducen a un incremento en la relación AMP:ATP celular, y también por leptina y el agente hipoglucémico metformina. La AMPK tiene un papel central coordinando la homeostasia energética, y es un regulador principal del metabolismo de lípidos, del almacenamiento de glucógeno, y del transporte de glucosa. Se ha implicado a la AMPK en el desarrollo y tratamiento de trastornos metabólicos, incluyendo diabetes de tipo 2 y obesidad, y las mutaciones en AMPK provocan anormalidades cardíacas en seres humanos.

En la levadura S. cerevisiae, la Snf1 quinasa también es necesaria para respuestas frente al estrés, notablemente la adaptación de las células al estrés del carbono. Snf1 regula la transcripción de muchos genes en respuesta a la limitación de la glucosa, y es necesaria para la utilización de fuentes alternativas de carbono. La Snf1 también tiene papeles en la meiosis y esporulación, en el crecimiento invasivo filamentoso, y en el envejecimiento.

La Snf1 quinasa comprende la subunidad catalítica Snf1p (subunidad \alpha de AMPK), Snf4p (subunidad \gamma de AMPK), y una de tres subunidades \beta (codificada por SIP1, SIP2 y GAL83). Snf4 estimula la actividad de quinasa neutralizando la autoinhibición mediante el dominio regulador de Snf1p. La subunidad \beta regula la localización subcelular de la quinasa, y media las interacciones con dianas aguas abajo. Las señales que controlan la actividad de Snf1 en respuesta a niveles de glucosa no están resueltas en la técnica anterior, aunque la relación AMP:ATP puede tener cierto papel.

A pesar de los profundos esfuerzos, la identidad de las quinasas aguas arriba que fosforilan Snf1 y AMPK ha seguido siendo evasiva. En levadura, los enfoques genéticos han fracasado a la hora de producir mutaciones en el gen emparentado, sugiriendo que múltiples quinasas activan Snf1.

Snf1 es activada por fosforilación, y el resto de treonina del bucle de activación, T210, es crítico para la actividad de quinasa.

Ejemplo 2 Tos3p, Elm1p y Pak1p activan Snf1

El análisis espectrométrico de masas de complejos proteínicos de levadura indicó que Tos3p (YGL179C) se copurifica con Snf4p, y que Pak1p (no relacionada con la quinasa activada por p21 de mamífero) se copurifica con Snf1p y con Snf4p. Tos3p y Pak1p están estrechamente relacionadas, pero sus funciones son desconocidas, excepto que Pak1 suprime mutaciones de la ADN polimerasa.

Se demuestra que Tos3p, Elm1p y Pak1p activan Snf1.

Se demuestra la activación de AMPK de levadura (Snf1) por las quinasas aguas arriba (Elm1p, Tos3p y Pak1p).

Se describe un ensayo ejemplar de AMPK de levadura (Snf1).

Para confirmar que Tos3p interactúa con Snf1p, se expresó una fusión de glutationa-S-transferasa (GST) a Tos3p en levadura, y se demostró que Snf1p etiquetada con LexA copurificó en glutationa-Sepharose.

Se introdujeron las mutaciones tos3\Delta y pak1\Delta en células de levadura, y se ensayaron para determinar los fenotipos característicos de un mutante snf1\Delta. Los mutantes individual y doble no mostraron defecto en el crecimiento sobre rafinosa o glicerina/etanol (véase Fig. 1B).

Se buscó entonces otra prueba genética de que Tos3p y Pak1p están funcionalmente relacionadas con la Snf1 quinasa. Se razonó que si activan Snf1, su sobreexpresión puede compensar la ausencia de la subunidad estimulante Snf4p. La sobreexpresión de GST-Tos3p o GST-Pak1p suprimió parcialmente los defectos del mutante snf4\Delta en la expresión génica de SUC2 (invertasa), y GST-Tos3p restauró el crecimiento sobre rafinosa en un mutante snf4\Delta, pero no evitó el requisito de Snf1.

También se usó un ensayo en el que la transcripción de un informador lexAop-lacZ depende de la actividad catalítica de LexA-Snf1p unida al promotor (Kuchin, 2000 - incorporada en la presente memoria como referencia).

La sobreexpresión de GST-Tos3p o GST-Pak1p estimuló la síntesis de \beta-galactosidasa en respuesta a la limitación de glucosa, implicando un efecto positivo sobre la actividad catalítica de LexA-Snf1p (Fig. 1A).

La falta de fenotipo en el mutante doble sugirió que otra quinasa proporciona la función redundante. La quinasa más estrechamente relacionada con Pak1p y Tos3p es Elm1p, que se identificó mediante una mutación que provoca una morfología celular alargada, y afecta al desarrollo pseudohífico. Elm1p desempeña papeles en el control del crecimiento y citoquinesis del capullo.

Se introdujo elm1\Delta en las cepas de los mutantes anteriores, mediante perturbación génica. Las cepas de tos3\Delta elm1\Delta y pak1\Delta elm1\Delta crecieron sobre rafinosa y glicerina/etanol, pero el mutante triple tos3\Delta pak1\Deltaelm1\Delta no lo hizo. Para confirmar este resultado, se cruzaron las cepas de tos3\Deltapak1\Delta y tos3\Delta elm1\Delta, y se llevó a cabo un análisis de tétradas. Catorce segregantes de mutantes triples procedentes de trece tétradas fueron defectuosos en el crecimiento sobre glicerina/etanol y rafinosa (Fig. 1B). Los ensayos de la actividad de invertasa mostraron que la expresión de SUC2 estaba eliminada (95 U en células de tipo natural desreprimidas, y <1 U en células del mutante snf1 y del mutante triple). El mutante triple también manifestó un defecto en la acumulación de glucógeno, otro fenotipo del mutante de snf1\Delta. Estos hallazgos genéticos apoyan el punto de vista de que, para la función de Snf1 quinasa in vivo, es necesaria una función proporcionada redundantemente por Tos3p, Pak1p y Elm1p.

Ejemplo 3 Activación de AMPK (Snf1) por quinasa aguas arriba

Para determinar si estas tres quinasas activan AMPK (Snf1), se usó un ensayo de quinasa in vitro. Los extractos proteínicos se prepararon a partir de células de tipo natural y de mutantes triples que expresan LexA-Snf1p. Se inmunoprecipitó LexA-Snf1p con anti-LexA, y se incubó en presencia de \gamma-^{32}P-ATP. Cuando se inmunoprecipitó a partir del extracto de tipo natural, LexA-Snf1p se fosforiló in vitro, y los controles con LexA-Snf1K84R y LexA-Snf1T210A catalíticamente inactivos (que poseen sustituciones de la lisina del sitio de unión a ATP y de la treonina del bucle de activación, respectivamente) confirmaron que la actividad de Snf1 quinasa fue la responsable. Por el contrario, cuando LexA-Snf1p se precipitó a partir del mutante triple, no se detectó fosforilación (Fig. 2A), a pesar de los niveles proteínicos equivalentes (Fig. 2B).

Ejemplo 4 Ensayo de la actividad de AMPK (Snf1)

También se ensayó la actividad catalítica de AMPK (Snf1) in vitro mediante fosforilación del sustrato peptídico sintético SAMS [Woods, 1994 #507; Davies, 1989 #526]. Se purificó parcialmente Snf1 a partir de extractos celulares, en condiciones que activan la quinasa [Wilson, 1996 #463; Woods, 1994 #507], y se incubó con el péptido SAMS en presencia de \gamma-^{32}P-ATP. El péptido se fosforiló en ensayos de tipo natural, pero no con extractos de snf1\Delta. No se detectó actividad en el mutante tos3\Deltapak1\Deltaelm1\Delta (Fig. 2C); el análisis de inmunotransferencia confirmó la presencia de Snf1p (Fig. 2D). Estos resultados indican que Snf1 permanece inactiva en presencia de una quinasa aguas arriba, tal como Tos3p, Pak1p y Elm1p.

Ejemplo 5 Activación de AMPK (Snf1) mediante quinasa aguas arriba

Para demostrar que estas tres quinasas fosforilan directamente Snf1p, se usó como sustrato una forma inactiva del dominio catalítico de Snf1 aislado, denominado Snf1KD-K84R (Fig. 3). Se purificaron GST-Tos3p, GST-Pak1p, y GST-Elm1p a partir de levadura, y se incubaron con Snf1KD-K84R, expresado bacterianamente, en presencia de \gamma-^{32}P-ATP. GST-Tos3p y GST-Elm1p y GST-Pak1p fosforilaron Snf1KD-K84R. GST-Pak1p fosforiló débilmente el sustrato, quizás debido a que sólo se recuperaron cantidades mínimas de la proteína de fusión de longitud completa. La incubación con una GST-quinasa no relacionada, YPL141C, confirmó que Snf1KD-K84R no se había autofosforilado.

Para demostrar que Tos3p y Elm1p fosforilan la treonina del bucle de activación, se usó un sustrato mutante que carece de T210, Snf1KD-T210A. No se detectó fosforilación (Fig. 3).

Ejemplo 6 Activación de AMPK (de mamífero) mediante quinasa aguas arriba

Seguidamente, se demostró la capacidad de las GST-quinasas purificadas de levadura para fosforilar y activar AMPK de mamífero. Se incubó AMPK recombinante (\alpha1\beta1\gamma1), expresada en bacterias (Neumann, 2003), con cada una de las quinasas y MgATP, y se determinó la actividad de AMPK usando el ensayo del péptido SAMS.

La incubación con GST-Tos3p condujo a un incremento notable de la actividad de AMPK, mientras que GST-Elm1p y GST-Pak1p sólo provocaron un pequeño incremento (Fig. 4A).

GST-Tos3p fosforiló la subunidad \alpha de una forma catalíticamente inactiva de AMPK, pero no la subunidad \beta ni la subunidad \gamma (Fig. 4B). El análisis de inmunotransferencia mostró que GST-Tos3p fosforila AMPK en T172 (Fig. 4C). Estos hallazgos sugieren la conservación funcional de las quinasas aguas arriba entre la levadura y los mamíferos.

Ejemplo 7 Activación de AMPK (de mamífero) mediante quinasa aguas arriba (de mamífero)

Tos3p, Pak1p y Elm1p están muy estrechamente relacionadas con la proteína quinasa quinasa dependiente de Ca^{2+}/calmodulina (CaMKK), aunque pueden haberse bifurcado del grupo de levaduras de las CaMK. La CaMKK de mamífero fosforila débilmente y activa AMPK in vitro, pero la principal quinasa de AMPK (AMPKK) es distinta de CaMKK.

Como se describe en la presente memoria, estos hallazgos confirman que AMPKK corresponde a otra quinasa o quinasas relacionadas con CaMK. Por lo menos una AMPKK principal es la quinasa supresora de tumores LKB1 (STK11), que está mutada en el síndrome de Peutz-Jeghers.

Se purificó LKB1 etiquetada con FLAG (de tipo natural, WT, de longitud completa, o un mutante catalíticamente inactivo (D 194A); (ADNc de ratón en el vector pCDNA3, etiquetado con flag) a partir de lisados de células COS7, mediante unión a gel de afinidad por FLAG (Sigma). Se incubó con las perlas AMPK expresada bacterianamente, y se midió la actividad de AMPK.

Se incubó AMPK expresada bacterianamente (\alpha1\beta1\gamma1 (Neumann, 2003)) con MgATP y FLAG-LKB1 quinasa unida a un gel de afinidad por FLAG, durante 30 minutos a 30ºC. En otro aspecto, la invención se refiere a un incubador de agitación.

Específicamente, las condiciones de tampón de AMPK se ajustan hasta la concentración final de 100 uM de ATP, 5 mM de MgCl_{2}, 50 mM de HEPES pH 7,5, 10% de glicerina, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, en el momento en el que se añade el gel con FLAG-LKB1.

Tras la centrifugación para eliminar la resina, se midió la actividad de AMPK en el sobrenadante, usando el ensayo del péptido SAMS (Davies, 1989).

LKB1, expresada en células de mamífero, fosforiló T172 y activó AMPK recombinante in vitro (Fig. 4D).

La fosforilación de T172 se determinó mediante inmunotransferencia (Fig. 4E).

De este modo, se demostró que LKB1 fosforila y activa AMPK.

Ejemplo 8 Expresión de LKB1 en células eucariotas

Se usó una estrategia a base de la reacción en cadena de la polimerasa para preparar un constructo de ADNc etiquetado con el epítopo FLAG N-terminal que codifica LKB1 de ratón, usando, como molde, una etiqueta de secuencia expresada que codifica LKB1 de ratón de longitud completa (número de acceso NCBI AA542163, número IMAGE 550355), obtenida del consorcio IMAGE. El constructo se obtuvo usando el cebador 59:

atgcatactagtgccaccatggactactacaaggacgacgatgacaaggacgtggcggaccccgagccgttggg

y el cebador 39: gacagaactagttcactgctgcttgcaggccgaga.

Para preparar el mutante catalíticamente inactivo de LKB1, denominado LKB1 (KD), en el que KD quiere decir quinasa muerta, se mutó Asp194, en el subdominio VII del dominio de quinasa, a Ala.

Naturalmente, cualquier homólogo, tal como un homólogo de mamífero de LKB1, podría ser usado en lugar del de ratón, tal como LKB1 humana. Igualmente, la LKB1 se podría expresar con o sin la etiqueta del epítopo de LKB1, o se podría expresar con una etiqueta alternativa, tal como myc, HA, glutationa-S-transferasa, u otra etiqueta.

Expresión de LKB1 en células de mamífero

El fragmento resultante de la reacción en cadena de la polimerasa se subclonó como un fragmento de EcoRI-EcoRI en el vector pCDNA3 (Invitrogen) para codificar la expresión de FLAG-LKB1 en células de mamífero.

Expresión de LKB1 en levadura

Se subclonó LKB1 (que contiene una etiqueta del epítopo myc) de ratón en el vector de expresión pYX212 de levadura (R and D Systems), y se expresó en levadura.

Ejemplo 9 Fosforilación y evaluación de AMPK

La AMPK (\alpha1\beta1\gamma1) expresada bacterianamente se purificó mediante cromatografía usando Ni-NTA agarosa (Qiagen) como se describió previamente (la purificación se realiza como se explica en Neumann et al.,2003 Protein Expression and Purification, incorporado en la presente memoria como referencia). La AMPK se incubó con 100 \muM de ATP, 5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de AMP y 1 mM de DTT en 50 mM de Hepes, pH 7,4, en presencia o ausencia de quinasa aguas arriba, durante 30 minutos a 30ºC. Después de una breve centrifugación, se retiró el sobrenadante que contiene AMPK, y se midió la actividad usando el ensayo del péptido SAMS (Davies et al., 1989). La fosforilación de T172 se determinó mediante transferencia Western, usando un anticuerpo que reconoce específicamente fosfo-treonina 172 dentro de la subunidad \alpha de AMPK (Cell Signaling Technologies).

Se analizó el marcador radiactivo de AMPK con fosfato que contiene ^{32}P, incubando una forma catalíticamente inactiva de AMPK (que contiene la mutación D157A en la subunidad \alpha) en presencia de \gamma-^{32}P-ATP, en presencia o ausencia de quinasa aguas arriba. En este ejemplo, la quinasa aguas arriba es LKB1.

Expresión de LKB1

El ADN plasmídico, que codifica LKB1 (de ratón) de tipo natural etiquetada con FLAG, o LKB1 catalíticamente inactiva (que contiene una mutación D194A) etiquetada con FLAG, se transfectó en células COS7 usando reactivo de lipofectamina. Las células se recogieron a las 48 h después de la transfección, y la proteína LKB1 se inmunoprecipitó con el gel de afinidad para M2 FLAG EZview Red (Sigma) y se usó según fue necesario, tal como en incubaciones con AMPK.

La AMPK en el sobrenadante se resolvió mediante SDS-PAGE, seguido de autorradiografía.

Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la presente invención serán manifiestas para los expertos en la materia, sin apartarse de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con formas de realización preferidas específicas, se debe entender que la invención, tal como se reivindica, no deberá estar excesivamente limitada a tales formas de realización específicas. De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvios para los expertos en la bioquímica, biología/genética molecular y biotecnología o campos relacionados, pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (23)

1. Método in vitro para evaluar la actividad de LKB1, que comprende

(i)

proporcionar una muestra que comprende LKB1,

(ii)

poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato, en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y

(iii)

monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato,

en el que la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.

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2. Método según la reivindicación 1, en el que la AMPK comprende AMPK heterotrimérica.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la AMPK comprende AMPK de ratón o humana.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación de fosfato en AMPK se monitoriza evaluando la actividad de AMPK.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la actividad de AMPK se evalúa a través de la fosforilación del péptido SAMS.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación de fosfato en AMPK se monitoriza evaluando la fosforilación de T-172 de AMPK, o su equivalente.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además cuantificar la cantidad de fosfato incorporada por molde AMPK, en el que dicho nivel de fosfato indica el nivel de LKB1 presente en dicha muestra.

8. Uso in vitro de LKB1 recombinante o aislada, como una AMPKK.

9. Uso in vitro según la reivindicación 8, en la fosforilación de AMPK.

10. Uso in vitro según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la activación de AMPK.

11. Uso de LKB1 en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS).

12. Uso in vitro de HSP90, Cdc37, o de la proteína STRAD en la modulación de la actividad de AMPK.

13. Método in vitro para modular AMPK, que comprende modular LKB1.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho método comprende incrementar la fosforilación de AMPK en un sistema, incrementando la actividad de LKB1 en dicho sistema.

15. Método según la reivindicación 13, en el que dicho método comprende activar AMPK en un sistema, activando LKB1 en dicho sistema.

16. Método según la reivindicación 13, en el que dicho método comprende fosforilar AMPK poniendo en contacto AMPK con LKB1 recombinante o aislada.

17. Método según la reivindicación 13, en el que dicho método comprende activar AMPK poniendo en contacto dicho AMPK con LKB1 recombinante o aislada.

18. Método in vitro para la identificación de un modulador o moduladores de LKB1, que comprende

(i)

proporcionar una primera y una segunda muestra de LKB1,

(ii)

poner en contacto dicha primera muestra con un modulador candidato de LKB1,

(iii)

poner en contacto dichas primera y segunda muestras con una quinasa sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK,

(iv)

monitorizar la incorporación de fosfato en dicho sustrato, y comparar la incorporación de fosfato en dicho sustrato en dichas primera y segunda muestras,

en el que la incorporación de fosfato en el sustrato difiere entre dichas primera y segunda muestras, y el modulador candidato se identifica como un modulador de la actividad de LKB1.

19. Célula de levadura recombinante que comprende perturbaciones génicas en por lo menos dos de Pak1, Tos3 y Elm1.

20. Célula de levadura recombinante según la reivindicación 19, que comprende perturbaciones génicas en Pak1, Tos3 y Elm1.

21. Célula de levadura recombinante según la reivindicación 19 ó 20, que comprende además una perturbación génica en Snf1.

22. Célula de levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que expresa AMPK de mamífero.

23. Célula de levadura recombinante según la reivindicación 22, en la que la AMPK de mamífero comprende las subunidades alfa, beta y gamma.