ES2638435T3 - Métodos y medios para proliferación de células madre y posterior generación y expansión de células progenitoras, así como también producción de células efectoras como terapéuticos clínicos - Google Patents

Métodos y medios para proliferación de células madre y posterior generación y expansión de células progenitoras, así como también producción de células efectoras como terapéuticos clínicos Download PDF

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Abstract

Un método para expandir y diferenciar células progenitores hematopoyéticas que comprenden cultivar células de una muestra que comprende células madre, células progenitoras o ambos, desde tejido postembrionario humano en una medio expansión que comprende un medio de cultivo de célula, 1-100 mg/l heparina desfultada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton, una colección de citoquinas en las que dicha colección de citoquinas comprende TPO, FLT-3L, SCF y IL-7, y opcionalmente comprende adicionalmente IL-3, en cantidades convencionales y adicionalmente a GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-1α y IL-6, en cantidades fisiológicas, y adicionalmente complementos convencionales, y cultivar las células adicionales en un medio de expansión y diferenciación que comprende una colección de citoquinas, 1-100 mg/l heparina desfultada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton y suero humano, en el que dicha colección de citoquinas comprende TPO, FLT-3L, SCF, IL-7, IL-2, IL-15, y adicionalmente GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-la y IL-6, en el que las células cultivadas se expanden y diferencian.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y medios para proliferacion de celulas madre y posterior generacion y expansion de celulas progenitoras, as^ como tambien produccion de celulas efectoras como terapeuticos clmicos.
La invencion se refiere al campo de la biologfa molecular moderna. En particular la invencion se refiere a la tecnologfa de celulas madre. Mas en particular la invencion se refiere a la tecnologfa de celulas madre, en particular tecnologfa de celulas madre postembrionarias.
Las celulas madre son celulas primordiales indiferenciadas que tienen la capacidad de autorrenovacion y la capacidad de diferenciarse en otros tipos de celulas. Esta capacidad les permite actuar como un sistema reparador del cuerpo, reponiendo otras celulas siempre y cuando el organismo este vivo.
Las celulas madre se categorizan por potencia que describe la especificidad de esa celula.
Las celulas madre totipotentes son celulas que tienen la capacidad de autorrenovacion y son capaces de diferenciarse en todos y cada uno de los tipos de celulas para formar un organismo completamente nuevo. Se producen normalmente a partir de la fusion de un ovulo y celulas de esperma. Las celulas producidas por las primeras pocas divisiones de la celula de ovario fertilizada tambien son totipotentes. Estas celulas pueden crecer en cualquier tipo de celula sin excepcion.
Las celulas madre pluripotentes son los descendientes de las celulas totipotentes y pueden crecer en cualquier tipo de celula a excepto para las celulas madre totipotentes.
Las celulas madre multipotentes pueden solo pueden producir celulas de una familia de celulas estrechamente relacionada (por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas que se pueden diferenciar en las celulas sangumeas tales como globulos rojos, globulos blancos y plaquetas).
Las celulas unipotentes (denominadas en ocasiones celulas progenitoras) solo pueden producir un tipo de celula tipo; pero, tienen la propiedad de autorrenovacion que las distingue de las celulas no madre.
Las celulas madre tambien se caracterizan de acuerdo con su fuente, ya sean celulas madre embrionarias o adultos (postembrionarias).
Las celulas madre de adultos son celulas indiferenciadas encontradas entre celulas diferenciadas de un tejido espedfico y principalmente son celulas multipotentes. Se denominan mas precisamente celulas madre somaticas, porque no necesitan venir de adultos, sino que tambien pueden venir de ninos o de cordones umbilicales.
Las celulas madre embrionarias son celulas obtenidas de celulas de masa interna indiferenciadas de un blastocito, un embrion en etapa primaria que tiene 50 a 150 celulas.
La sangre proveniente de la placenta y el cordon umbilical que quedan despues de un nacimiento es una fuente de celulas madre de adulto. Se recolectan al retirar el cordon umbilical, limpiarlo y extraer la sangre de la vena umbilical. Otras fuentes son la medula osea (BM) o sangre periferica G-CSF movilizada (mPB).
Los globulos rojos y las plaquetas se pueden retirar de la sangre del cordon, BM o mPB y el resto de celulas que contienen las celulas madre se pueden utilizar o almacenar (por ejemplo, en nitrogeno lfquido).
Las celulas madre por sf mismas son utiles en muchas aplicaciones de la denominada medicina regenerativa. Se han utilizado para tratar enfermedades cardiacas, reparacion de medula espinal y muchas otras enfermedades en donde se necesitan reemplazar tejidos de todos los tipos.
Las celulas madre tambien se pueden utilizar para producir determinados tipos de celulas diferenciadas que son las celulas efectoras en determinadas enfermedades.
Sin embargo, desafortunadamente, las celulas madre estan presentes en el cuerpo de un mairnfero solamente en pequenas cantidades. Frecuentemente se presentan en organos o tejidos que no se pueden alcanzar facilmente. Las celulas madre embrionarias tampoco se pueden obtener facilmente y solamente en mmimas cantidades. Mas aun, existen algunas preocupaciones eticas en el cultivo de embriones exclusivamente para el proposito de producir celulas madre. Por lo tanto, subsiste la necesidad de metodos para multiplicar las celulas madre disponibles y/o progenies espedficas de linaje primitivo de las misma, sin diferenciacion en descendientes menos potentes. Las celulas totipotentes deben permanecer totipotentes despues de expansion y no cambiar en celulas madre pluripotentes, las celulas madre pluripotentes deben permaneces pluripotentes, etcetera. En algunos casos el cambio en un descendiente menos potente puede ser aceptable (por lo menos en cierta medida) mientras que se retiene el potencial para autorrenovacion y por lo menos multipotencia.
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Aunque las celulas madre tienen la capacidad de auto renovacion, expansion y/ o mantener las celulas madre en cultivo no es una tarea facil. En su sentido mas amplio la presente invencion proporciona una tecnologfa para cultivo de celulas madre y/o expansion y/o diferenciacion que comprenden una serie de elementos que son extremadamente adecuados solo para ese proposito.
Se describe aqrn un medio para el cultivar, expandir y/o diferenciar posteriormente celulas madre en espedficamente celulas efectoras objetivo deseada, dicho medio comprende un medio de cultivo celular basico, 0-25% de suero humano, glucosaminoglucano (GAG) desulfurado 0,1-100 mg/l, preferiblemente heparina (=UFH) o un equivalente funcional del mismo. Preferiblemente dicho GAG/UHF esta completamente desulfurado. Preferiblemente dicho GAG/UHF no es fraccionado. Se prefiere particularmente dicho GAG es de bajo peso molecular GAG (LMWH). Se prefiere particularmente dicho GAG de bajo peso molecular que es una heparina de bajo peso molecular, derivada preferiblemente de heparina estandar mediante despolimerizacion de UFH. Las heparinas de bajo peso molecular (LMWH), consisten en cadenas cortas de polisacarido. Los LMWH se definen como heparina o sales de heparina que tienen un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton, preferiblemente entre 5000 y 8000 dalton y mas preferiblemente aproximadamente 8000 dalton, preferiblemente por lo menos 60% de las cadenas tienen menos que la longitud de cadena promedio. Cuando el promedio de bajo peso molecular de heparina es de aproximadamente 8000 dalton se prefiere que por lo menos el 60% de todas las cadenas tengan un peso molecular menor de 8000 da. Se pueden obtener LMWh mediante diversos metodos de fraccionamiento o despolimerizacion de heparina polimerica. Se utilizan diversos metodos de despolimerizacion de heparina en la fabricacion de heparina de bajo peso molecular. Una lista no limitante se proporciona aqrn adelante. Una heparina descrita aqrn se puede obtener a partir de un mairnfero u otro organismo tal como caracoles, alternativamente las heparinas se sintetizan sinteticamente o semisinteticamente. Un ejemplo de la ultima es la produccion de heparina en bacterias tal como pero no limitado a la heparina K5 por E.coli. Modificaciones de heparina tal como pero no limitadas a acilacion, desulfatacion fosforilacion tambien se considera que son una heparina como se define aqrn. Ejemplos preferidos pero no limitantes de dichas modificaciones son LMWH completamente o parcialmente desulfatado, LMWH completamente o parcialmente desulfatado y completamente o parcialmente Re-N-acilado, LMWH completamente o parcialmente desulfatado y completamente o parcialmente Re-N-sulfatado, sustancia L4: LMWH completamente o parcialmente desulfatado y completamente o parcialmente Re-N-fosforilado, meno de 8000 Da y para el que por lo menos 60% de todas las cadenas tienen un peso molecular menor de 8000 Da. Estas se pueden obtener mediante diversos metodos de fraccionamiento o despolimerizacion de heparina polimerica. Se utilizan diversos metodos de despolimerizacion de heparina en la fabricacion de una heparina de bajo peso molecular. Adelante se proporciona una lista no limitante.
Despolimerizacion oxidativa con peroxido de hidrogeno. Utilizada en la fabricacion de ardeparina (Normiflo®)
Division desaminativa con nitrito isoamilo. Utilizado en la fabricacion de certoparina (Sandoparin®)
Division beta-eliminadora alcalina de bendl ester de heparina. Utilizado en la fabricacion de enoxaparina (Lovenox® y Clexane®)
Despolimerizacion oxidativa con Cu2+ y peroxido de hidrogeno. Utilizado en la fabricacion de parnaparina (Fluxum®)
Division beta-eliminadora por enzima heparinasa. Utilizado en la fabricacion de tinzaparina (Innohep® y Logiparin®)
Division desaminadora con acido nitroso. Utilizada en la fabricacion de dalteparina (Fragmin®), reviparina (Clivarin®) y nadroparina (Fraxiparin®)
Una combinacion de citoquinas adecuadas, abarcan preferiblemente tres o mas de trombopoyetina, flt-3 lig- y, factor de celulas madre, IL-3, IL-7, IL-15, IL-2 en cantidades de saturacion (>4 ng/ml) asf como una combinacion de G-CSF, GM- CSF, IL-6, MIP-I-a y LIF en cantidades fisiologicas (<250 pg/ml) y complementos convencionales adicionales, tal como L- glutamina, antibioticos, acido ascorbico, selenita de selenio, sal de litio, etanolamina y 2-beta-mercaptoetanol. Las citoquinas dadas se seleccionan por sus funciones. Para algunas de las citoquinas dadas existen otras citoquinas que por lo menos seran capaces en parte de realizar la misma funcion. Aquellas pueden luego por supuesto sustituir las enumeradas.
Preferiblemente un medio descrito aqrn comprende aproximadamente 1-100, mas preferiblemente aproximadamente 1550 mg/l de GAG/UFH desulfatado o un equivalente funcional del mismo puede estar presente en diferentes cantidades que son equivalentes en actividad a las cantidades dadas para el UFH desulfatado. Preferiblemente 1-100mg, mas preferiblemente 15-50mg de heparina de bajo peso molecular (LMWH) se utiliza, preferiblemente derivado de heparina estandar mediante despolimerizacion UFH. Un equivalente funcional puede estar presente en diferentes cantidades que son equivalentes en actividad a las cantidades dadas para el LMWH.
Las cantidades de citoquinas agregadas son convencionales en la tecnica, se proporcionan cantidades preferidas en los ejemplos, pero el 10% de las desviaciones en la cantidad son muy bien aceptables.
Se conocen muchos medios basicos. Adelante se proporciona una seleccion, pero muchos mas pueden ser adecuados. Los medios basicos incluyen, pero no se limitan a BEM (Medio Eagle Basica), DMEM (Medio Eagle modificado de
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Dulbecco), medio esencial mmimo de Glasgow, medio basal M199, HAM F-10, HAM F-12, DMEM de Iscove, RPMI, Leibovitz L15, MCDB, McCoy 5A, StemSpan H3000® y StemSpanSFEM®, Stemline I™ y Stemline II™; X-Vivo10™, X- Vivo15™ y X-Vivo20™, etc.
Tambien se pueden utilizar combinaciones de estos medios basicos. Preferiblemente formulaciones libres de suero, tal como Stemline I™ y Stemline II™, StemSpan H3000®, StemSpan SFEM® o X-Vivo10™, X-Vivo15™ y X-Vivo20™ se utilizaran en el punto de tiempo de iniciacion del cultivo con/o sin la adicion de suero humano. Se prefieren las combinaciones de DMEM y HAM F-12 en puntos de tiempo espedficos. Las cantidades dadas aqrn son normalmente adecuadas para cultivos que se inician con preferiblemente aproximadamente 100,000 celulas por ml. Las cantidades se pueden adaptar para diferentes cantidades de celulas con las que se inician los cultivos.
La media se puede variar en su contenido de suero, preferiblemente junto con una combinacion diferente de citoquinas para proporcionar un medio de expansion o un medio de diferenciacion y o alternativamente un medio de diferenciacion+expansion en puntos de tiempo definidos.
Se describe aqrn un medio y un metodo para hacer proliferar celulas madre con la posterior generacion celulas progenitoras espedficas de linaje primitivos, particularmente celulas madre de sangre de cordon umbilical (UCB), medula osea (BM) o sangre periferica G-CSF-movilizada (mPB) que se proporcionan en una forma en que la proliferacion de celulas madre produce una celula madre hija y una celula madre progenitora primitiva, la ultima con la capacidad de autorrenovacion extensa y maduracion funcional. Normalmente desde 100.000 celulas de una poblacion enriquecida con celula madre > 2x106 progenitores primitivos se pueden generar mientras conserva el grupo de celulas madre. Cada progenitor primitivo es capaz de producir > 1 x l03 celulas efectoras maduradas funcionales. La poblacion enriquecida con celulas madre pueden ser celulas CD34+ aisladas y/o celulas CD133+. Alternativamente, celulas mononucleares (MNC) que contienen todas las CD34+ asf como todas las celulas CD133+ tambien son adecuadas.
La presente invencion se dirige a un metodo para la expandir y diferenciar celulas progenitoras hematopoyeticas que comprenden cultivar celulas de una muestra que comprende celulas madre, celulas progenitoras o ambas, de tejidos postembrionarios humanos en un medio de expansion que comprende un medio de cultivo celular, 1-100 mg/l de heparina desulfatada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton, una coleccion de citoquinas en el que dicha coleccion de citoquinas comprende trombopoyetina, ligando flt-3, factor de celulas madre e IL-7 y opcionalmente comprende adicionalmente iL-3, en convencional (cantidades saturadas >4 ng/ml) y en adicion a G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-a y LI-F en cantidades fisiologicas (<250 pg/ml) y suplementos convencionales adicionales, y cultivar las celulas adicionalmente en un medio de expansion y diferenciacion que comprenden una recoleccion de citoquinas, 1-100 mg/l de heparina desulfatada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un promedio de peso molecular de entre aproximadamente 200010000 dalton y suero humano, en el que dicha recoleccion de citoquinas comprende trombopoyetina, ligando flt-3, factor de celulas madre, IL-7, IL-2, IL-15 y adicionalmente G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIp-I-a, y LI-F, en el que las celulas cultivadas se diferencian y expanden.
Preferiblemente, un medio de expansion de acuerdo con la invencion comprende 15-50 mg/l de UFH de sulfatado o LMWH. El medio basico preferido es una formulacion libre de suero disponible comercialmente, tal como el medio Stemline I™ y Stemline II™, StemSpan H3000® y/o StemSpan SFEM<®>.
Un medio preferido es un medio para expansion que comprende trombopoyetina, ligando flt-3, factor de celulas madre, IL-7, en cantidades convencionales, asf como G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-Ia, LIF, preferiblemente en las cantidades dadas en los ejemplos.
Tambien se describe aqrn una diferenciacion y adicionalmente un medio de expansion+diferenciacion para expansion/diferenciacion simultanea de celulas madre en progenitores de celulas Citotoxicas Naturales y la posterior maduracion en celulas NK maduras funcionales. El medio basico puede ser el medio comercialmente disponible tal como Stemline I™ y el medio Stemline II™, X-Vivo10™, X-Vivo15™, X-Vivo20™, StemSpan H3000®, StemSpan SFEM®, IMDM, DMEM, RPMI, HAM F-10, HAM F-12, etcetera se prefiere una mezcla de 2:1 (v/v) DMEM y HAM F-12. Se tiene que agregar suero AB humano en una concentracion final entre 1-25% preferiblemente la cantidad de suero es de aproximadamente 5-15%.
Una combinacion preferida de citoquinas para el medio de expansion+diferenciacion es TPO, FLT - 3L, SCF, IL-7, IL-2, IL-15, en cantidades convencionales y en adicion a GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-a y IL-6 preferiblemente en las cantidades dadas en el ejemplo. Este medio se aplica preferiblemente despues de la etapa de expansion inicial de celulas madre (515 dfas despues de la iniciacion).
En una realizacion particularmente preferida un metodo para expansion y diferenciacion comprende por lo menos un cambio de condiciones entre un medio de expansion inicial y por lo menos un medio de expansion/diferenciacion aplicada posteriormente como se ilustra en la figura 1:
Preferiblemente el cultivo se inicia en condiciones libres de suero complementados con sal de litio y 1-100 mg/l de UFH o LMWH desulfatado y/o modificado qmmicamente adicionalmente. En algas etapas, (preferiblemente despues de 5-15 dfas
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de cultivo), preferiblemente entre el dfa 7-11, el medio se intercambia con el medio de expansion+diferenciacion que preferiblemente contiene ahora suero humano (1-25%, preferiblemente 10-20%) e IL-2. En algunas etapas (preferiblemente entre el dfa 10 y 23, preferiblemente entre el dfa 13-20), el UFH/LMWH asf como la sal de litio que se ha complementado de acuerdo con la invencion se retira del medio. Esto se logra preferiblemente al reemplazar el medio de cultivo con medio fresco que no contiene dicho litio. Normalmente esto se logra al reemplazar el medio de cultivo con medio de expansion y diferenciacion. Adicionalmente, en algunas etapas (preferiblemente entre el dfa 10-23, preferiblemente entre el dfa 11-15) la cantidad de 3 citoquinas flt3-L, SCF y TPO se reduce a cantidades <4 ng/ml.
Todos los medios son preferiblemente refrescados cada tercer dfa, preferiblemente 3 veces/semana. El refresco se logra preferiblemente al reemplazar por lo menos 30% del medio con medio fresco. Preferiblemente por lo menos 50% del medio se reemplaza, mas preferiblemente por lo menos 100% del medio se reemplaza. El remplazo del medio se puede combinar con intercambio de medio para cambiar del medio de expansion a medio de expansion y diferenciacion. Se prefiere ajustar la cantidad de medio de tal manera que las celulas al inicio del cultivo (continuado) tienen una densidad entre 100,000 a 1,000,000 de celulas por ml de medio. Preferiblemente una densidad de entre 100,000 y 500,000 celulas por ml de medio.
La invencion abarca los metodos para mantener las celulas madre proliferantes con la generacion y expansion de celulas progenitoras, en particular celulas madre para sangre de cordon umbilical, BM o mPB, que comprende cultivar celulas madre de sangre de cordon, cultivar dichas celulas en un medio de acuerdo con la invencion y separar las celulas expandidas de dicho medio. La invencion comprende adicionalmente metodos para diferenciar celulas madre en celulas progenitoras NK y adicionalmente en celulas NK maduras funcionales que comprenden cultivar dichas celulas madre, en particular celulas madre derivadas de sangre de cordon umbilical, BM o mPB, en medio de expansion + diferenciacion descrito aqrn y preferiblemente cultivar dichas celulas madre en un medio de expansion y posteriormente en un medio de expansion+diferenciacion en un esquema como se proporciona en la descripcion detallada adelante. El cultivo se hace preferiblemente bajo condiciones adecuadas convencionales normalmente que abarcan aproximadamente 37 grados Celsius, 100% RH, 10% O2 y 5-7% CO2.
La invencion tambien abarca celulas madre proliferadas y mantenidas producidas mediante un proceso de acuerdo con la invencion.
La invencion tambien abarca celulas progenitoras citotoxicas naturales producidas mediante un metodo de acuerdo con la invencion.
En una realizacion adicional la invencion comprende un grupo de medios (equipo de partes) para proliferacion y mantenimiento de celulas madre, en particular derivadas de sangre de medula, BM, o mPB y generacion de celulas progenitoras NK primitivas con la posterior expansion y maduracion funcional en celulas NK maduras, que comprenden un medio de expansion descrito aqrn, un medio de expansion+diferenciacion descrito aqrn y preferiblemente un panfleto de instrucciones para uso del medio.
Las celulas progenitoras NK se pueden diferenciar en celulas NK maduras y funcionales que reconocen un objetivo deseado mediante receptores espedficos sobre su superficie conocidos por el experto en el campo (CD56, CD16, CD107a, NKG2A/CD94, NKG2D, receptores NCR, receptores KIR, etcetera.). Estas celulas NK maduras y funcionales se pueden generar in vitro de acuerdo con la invencion. Las celulas progenitoras NK generadas se pueden inyectar en pacientes como terapeuticos celulares seguidos por maduracion y expansion in vivo dentro del cuerpo del paciente. Alternativamente, las celulas NK activas maduras y funcionales se pueden generadas in vitro de acuerdo con la invencion e inyectarse como celulas NK funcionalmente activas y maduras. Ambas aplicaciones mencionadas anteriormente (infusion NK-IC-progenitor asf como la infusion de celulas NK maduradas in vitro) se puede utilizar para el tratamiento de cualquier tipo de enfermedad humana preferiblemente todas las enfermedades malignas tal como tumores, cancer, leucemia, asf como todas las enfermedades vmcas, tambien en situaciones de rechazo de trasplantes solido y enfermedades autoinmunitarias y perdida de embarazo.
En una realizacion adicional las celulas NK generadas in vitro asf como las celulas NK maduras y expandidas demuestran actividad citotoxica funcional contra objetivos utilizados y aceptados comunmente, tal como tumores malignos. Adicionalmente, la actividad productora de citoquinas de celulas Nk normales esta probada dentro de las celulas NK maduras generadas
Metodos para (expandir y) diferenciar celulas madre en celulas progenitoras NK y hacia adelante en celulas NK tambien hacen parte de la presente invencion.
Las celulas NK espedficas objetivo producidas mediante estos metodos tambien hacen parte de la presente invencion. Las composiciones farmaceuticas que comprenden las celulas progenitoras o celulas NK maduras producidas de acuerdo con la invencion que comprenden adicionalmente constituyentes habituales de dichas composiciones tambien hacen parte de la presente invencion. Las dosis para dichas composiciones farmaceuticas se expresan en general en el numero de celulas viables presentes en dicha composicion. Dicho numero debe estar entre 1-10 x 106 NK-IC o 1-10 x 107 celulas NK maduras por kg de peso corporal de un sujeto que se va a tratar.
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Descripcion detallada
La siguiente descripcion divulga un metodo de generacion in vitro de terapeuticos celulares para uso clmico que se pueden derivar de pequenas almuotas de celulas madre postembrionarias. Este procedimiento se caracteriza al cultivar celulas madre postembrionarias en un medio formulado espedficamente con una composicion definida as^ como un cultivo definido que maneja el procedimiento para producir suficientes progenitores para aplicacion clmica.
La invencion divulgada aqu se basa por lo menos en parte en el problema tecnico de que para el tratamiento de enfermedades malignas, es decir cancer, leucemia y linfoma asf como para situaciones de rechazo de trasplante y enfermedades autoinmunitarias y perdida del embarazo. La disponibilidad de las terapias celulares es muy limitada. Con la excepcion de muy pocos trasplantes de celulas madre hematopoyeticas que utilizan sangre de cordon umbilical (UCB), no se han utilizado celulas madre postembrionarias para tratamiento celular dirigido en un escenario de trasplante no halogenico sin acondicionamiento de altas dosis de quimioterapia/radiacion del paciente principalmente debido al hecho de que, aun no estan disponibles suficientes celulas progenitoras dirigidas para terapia celular. Adicionalmente, estas celulas son aloreactivas y provocan graves enfermedades injerto versus anfitrion en el receptor si no se selecciona un producto celular optimo.
El problema tecnico se resuelve por lo menos parcialmente en esta invencion al proporcionar procedimientos practicables para generar suficientes numeros de progenitores asf como celulas efectoras maduradas para tratamientos seleccionados como se indica aqu adelante. El problema tecnico de la generacion progenitora seleccionada de celulas madre postembrionarias humanas para aplicacion clmica se puede resolver al aplicar ambos procedimientos bien definidos de las etapas de cultivo in vitro, asf como los cambios espedficos de las condiciones de cultivo como se describe en la seccion de metodo. Estos procedimientos permiten por primera vez la produccion de progenitores de celulas Citotoxicas Naturales (celulas NK) adecuadas en numero y funcion para aplicaciones clmicas de pequenas alfcuotas de celulas madre postembrionarias.
Las siguientes celulas madre postembrionarias que se pueden obtener empiezan desde la semana 12 despues de gestacion de tngado fetal, sangre de cordon umbilical perinatal (UCB), medula osea humana (BM) o sangre periferica G- CSF estimulada (mPB) se puede aislar y utilizar para procedimientos de cultivo de acuerdo con la invencion. El experto en la tecnica conoce los metodos para la recoleccion de estas celulas madre, con lo cual la cosecha del cordon umbilical perinatal, BM, o mPB se prefiere para los procedimientos de acuerdo con la invencion.
En una realizacion preferida adicional de los procedimientos de acuerdo con la invencion se realiza una prueba funcional de los terapeuticos celulares finales consecutivos para cultivo. Se prefiere especialmente la prueba de caractensticas progenitoras de celulas Citotoxicas Naturales (celulas NK) asf como la funcion de prueba para celulas NK maduras, activas.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion:
1. Iniciacion del cultivo in vitro y expansion de las celulas madre postembrionarias:
Pequenas alfcuotas de celulas madre postembrionarias (mmimo 10-20 ml de sangre de cordon umbilical humano, una cantidad que esta bien por debajo de la cantidad minima requerida para bancos clmicos) se procesan de acuerdo con procedimientos de funcionamiento estandar de lisis de globulos rojos para obtener celulas nucleadas para procesamiento adicional. Como una opcion las celulas se pueden purificar adicionalmente mediante separacion celular inmunomagnetica de acuerdo con el fabricante (Miltenyi-Biotec, Alemania) en celulas CD34+ enriquecidas (o alternativamente celulas CD133+) y adicionalmente tambien se pueden separar celulas CD14+. El experto en este campo sera capaz de realizar estas separaciones de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Estas celulas se ponen en frascos de cultivo o bolsas de teflon que contienen un medio de expansion de acuerdo con la invencion descrita que en este caso seran las denominadas
Medio 1 de expansion de Glicostema (GEM1):
Se utiliza el medio de expansion o GEM1 en la invencion en este ejemplo que consiste de X-vivo10™ (Cambrex Inc.) que contiene 5% de AB-suero humano (Cambrex Inc.), heparina de bajo peso molecular (LMWH), que se deriva de una heparina de mucosa de porcino mediante division con acido nitroso, en una concentracion de 50 mg/l. Las siguientes citoquinas humanas recombinantes (si no se mencionan espedficamente todas las citoquinas que se han proporcionado por Stem Cell Technology Inc. o R&D Systems): trombopoyetina (TPO; 35 ng/ml); ligando FLT-3L (FLT - 3L; 35 ng/ml), factor de celulas madre (SCF; 35ng/ml), interleuquina- 7 (IL-7; 35 ng/ml), factor estimulador de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF; 10 pg/ml), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, 250 pg/ml), factor inhibidor de leucemia (LIF; 50 pg/ml), protema alfa 1de inflamacion- macrofago (200 pg/ml; MIP-I alfa) e interleuquina 6 (IL-6; 50 pg/ml). Complementos adicionales son la L-glutamina (2 mmol/l; Invitrogen), penicilina (1000 U/ml), estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen), 25 pm de acido 2-beta-mercaptoetanol (Invitrogen) ascorbico (20 mg/ml, Sigma), selenita de selenio (50 pmol, Sigma), etanolamina (Sigma 50 pmol); cloruro de litio (100 pmol Fluka).
El cultivo de iniciacion se puede realizar en 3 formas alternas:
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a) inoculacion de celulas nucleadas despues de lisis de globulos rojos en medio GEM1
b) inoculacion de celulas CD34+ separadas (para celulas CD133+ alternativamente) en medio GEM1
c) inoculacion de celulas CD34+ separadas (o alternativamente celulas CD133+) junto con celulas CD14+ separadas como se complementa en medio GEMl en una relacion de 1 celula de CD34+ [o alternativamente celulas CD133+]: Icelua CD14+)
La relacion final de medio a las celulas inoculadas fue de 1 x 106 celulas totales de por 1 ml de medio o 1 x 105 CD34+ (o alternativamente celulas CD133+). Las condiciones de cultivo se refrescaran al utilizar medio nuevo cada 2 dfas. Se preferira el siguiente procedimiento:
Dfa 0: 1 x 105 celulas positivas CD34 se siembran en 1 ml del medio
Dfa 2: adicion de 1 ml de medio GEM-1 por 1 x 105 celulas de entrada totales
Dfa 4: adicion de 1 ml de medio GEM-1 por 1 x 105 celulas de entrada totales
Dfa 6: adicion de 1 ml de medio GEM-1 por 1 x 105 celulas de entrada
Dfa 8: adicion de 1 ml de medio GEM-1 por 1 x 105 celulas de entrada totales
Las celulas se cultivan en el medio de expansion mencionado anteriormente de acuerdo con la invencion descrita con relaciones bajo condiciones adecuadas. Las condiciones adecuadas de ejemplo con respecto a los recipientes de cultivo adecuados, temperatura, humedad relativa, contenido de O2 y CO2del gas de fases son conocidos por el experto en la tecnica. Preferiblemente las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente bajo las siguientes condiciones: (a) 37°C, (b) humedad relativa del 100% (c) 10% O2y (d) 5% de CO2.
2. Iniciacion de diferenciacion y generacion de celulas madres postembrionarias expandidas en un producto de celulas Citotoxicas Naturales in vitro:
En el dfa 7-11 de cultivo se realiza el primer cambio de condiciones de cultivo basal con respecto al medio de suplementacion. En este punto se activa el cultivo de suspension celular en diferenciacion de celulas NK.
El producto completo se diferencia adicionalmente en progenitores NK y adicionalmente se madura en celulas NK durante el penodo de cultivo.
Las cantidades designadas del producto de cultivo celular inicial se complementan con un medio de expansion y diferenciacion utilizado en esta invencion. En este ejemplo se agregara en el dfa 9 despues de iniciacion de cultivo un medio de expansion y diferenciacion utilizado en esta invencion, el denominado medio 1 de expansion y diferenciacion de celulas NK de Glicostem (NGKED1):
El medio consiste de medio F12 DMEM/Ham (Invitrogen Inc.) relacion de volumen 2:1 (V/V) que contiene suero AB- humano al 20% (Cambrex Inc.), heparina de bajo peso molecular (LMWH) hasta el dfa 16-18, que se deriva de heparina de mucosa de porcino mediante division con acido nitroso, en una concentracion de 50 mg/l. Las siguientes citoquinas humanas recombinantes (si no se mencionan espedficamente todas las citoquinas que se han probado por Stem Cell Technology Inc. o R&D Systems): trombopoyetina (TPO 1ng/ml); Ligando FLT-3L (FLT-3L; 1 ng/ml), factor de celulas madre (SCF, 1 ng/ml), interleuquina 7 ( IL-7; 25 ng/ml), interleuquina-15 (IL-15, 25 ng/ml), interleuquina-2 (Proleukin© [Chiron]; 1000 U/ml), factor estimulador de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF, 10 pg/ml), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, 250 pg/ml), factor inhibidor de leucemia (LIF; 50 pg/ml), protema alfa 1 inflamatoria de macrofagos(200 pg/ml; MIP-I alfa) e interleuquina 6 (IL-6; 50 pg/ml). Complementos adicionales son L-glutamina (2 mmol/l; Invitrogen), penicilina (1000 U/ml), estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen), 25 pm de 2-beta-mercaptoetanol (Invitrogen) acido ascorbico (20 mg/ml, Sigma), selenita de selenio (50 pmol, Sigma), etanolamina (Sigma 50 pmol).
Las condiciones de cultivo se refrescaran dos dfas a la semana al agregar nuevo medio. Se preferira el siguiente procedimiento:
Dfa 9: adicion de 5 ml de medio GNKED1 por 1 x 105 celulas de entrada total
Dfa 13: adicion de 5 ml de medio GNKED1 por 1 x 105 celulas de entrada total
Dfa 16: adicion de 5 ml de medio GNKED1 por 1 x 105 celulas de entrada total
Dfa 20: adicion de 5 ml de medio GNKED1 sin heparina por 1 x 105 celulas de entrada total
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Dfa 23: adicion de 5 ml de medio GNKED1 sin heparina por 1 x 105 celulas de entrada total
Dfa 27: adicion de 5 ml de medio GNKED1 sin heparina por 1 x 105 celulas de entrada total
Dfa 30: adicion de 5 ml de medio GNKED1 sin heparina por 1 x 105 celulas de entrada total
Las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente utilizado en esta invencion y las relaciones bajo condiciones
adecuadas. Las condiciones adecuadas de ejemplo con respecto a los recipientes de cultivo adecuados, temperature, humedad relativa, contenido de O2y CO2 de la fase de gas son conocidos por el experto. Preferiblemente las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente bajo las siguientes condiciones: (a) 37°C, (b) humedad relativa del 100% (c) 10% de O2 y (d) 5% de CO2.
Se pueden cosechar progenitores de celula NK inmaduras (NK-IC) de cultivos entre el dfa 15-20 despues de iniciacion seguido por 2 etapas de lavado en PBS que contiene AB-de suero humano al 1% que se realizan de acuerdo con procedimientos de operacion estandar conocidos por el experto en el campo. Despues de eso las celulas se suspenden en solucion de NaCl fisiologica (0,9%) para infusion en el paciente. Despues de infusion, las celulas NK maduradas espedficamente dentro del cuerpo del paciente (in vivo) y diferenciadas finalmente in vivo en celulas citotoxicas naturales completamente funcionales que son capaces de matar celulas de tumor espedficas a objetivos.
Alternativamente, las celulas se expandiran y diferenciaran hasta que el dfa 26-30 obtengan celulas NK funcionalmente maduradas que se han expandido/diferenciado >2 x 104 desde los numeros de entrada. Todas las celulas se cosechan y se realizan 2 etapas de lavado en PBS que contiene 1% de AB de suero humano de acuerdo con procedimientos de funcionamiento estandar conocidos por el experto en el campo. Como una realizacion de la invencion, las celulas NK maduras se activaran durante la noche antes de aplicacion intravenosa al paciente mediante cultivo en medio X-vivo15, complementada con AB de suero humano al 10% y IL-2 (1000 U/ml), IL-15 (25 ng/ml) y IL-18 (25 ng/ml). Al siguiente dfa las celulas se lavan dos veces y resuspenden en solucion fisiologica de NaCl (0,9%) para infusion en el paciente.
Las celulas citotoxicas naturales asf generadas y activadas son capaces de matar las celulas tumorales espedficas objetivo. Por esta razon al paciente se trata preferiblemente despues de la infusion con IL-2 subcutaneo (Proleukin©) en una dosis de hasta 2 x 106 lU/kg de peso corporal.
Se utiliza una pequena cantidad de celulas para el aseguramiento del control de producto y se analizara fenotfpicamente para celulas NK maduras y funcionales en analisis de citometna de flujo.
Resultados del ejemplo 1 experimental:
En 3 experimentos independientes (muestras UCB, cantidad entre 10-25 ml) se enriquecen celulas CD34+ y se expanden 1 x 103 celulas en medio GEM1 de acuerdo con la invencion durante 9 dfas seguido por una expansion de 18 dfas y la diferenciacion en medio GNKED1. La cantidad total de celulas CD56+/CD3-generados en estos experimentos fue de 2,05 ± 0,35 x 107 celulas con una cantidad de 90,5 ± 4,2% de celulas vivas y una pureza de 92,0 ± 5,1% de celulas NK totales (figura 2). En el experimento de control sin las etapas de la invencion se generan 0,67± 0,33 x 106 celulas NK con medio de supervivencia de 46 ± 4,1% y una pureza de 34,1 ± 6,6% (figura 3).
Figura 2: la grafica muestra un analisis de una muestra pequena de celulas NK generadas de acuerdo con la invencion descrita. Esta grafica se traza con respecto a celulas vivas CD3- y muestra la correlacion de los antfgenos CD56 y CD34.
Las celulas generadas en este ejemplo contienen mas del 92% de celulas NK CD56+/CD3-.
Figura 3: la grafica se muestra un analisis de una muestra pequena de celulas NK generadas sin etapas de la invencion. Esta grafica se traza con respecto a celulas vivas CD3- y muestra la correlacion de antfgenos CD56 y CD34.
Ejemplo experimental 2:
En una segunda configuracion de experimentos se procesan alfcuotas de celulas madre postembrionarias (mmimo 10-20 ml de sangre de cordon umbilical humano o BM) de acuerdo con procedimientos de operacion estandar de lisis de globulos rojos para obtener celulas nucleadas para su procesamiento adicional. Como una opcion las celulas se pueden purificar adicionalmente mediante separacion inmunomagnetica de celulas de acuerdo con el fabricante (MiltenyiBiotec, Alemania) en celulas CD34+ enriquecidas (o alternativamente celulas CD133+) y adicionalmente se pueden separar tambien celulas CD14+. El experto en este campo sera capaz de realizar estas separaciones de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Estas celulas se ponen en unos frascos de cultivo o bolsas de teflon que contiene un medio de expansion utilizado en la invencion descrita en este caso sera el denominado medio 2 de expansion de Glicostem (GEM2):
El medio utilizado en la invencion descrita en este ejemplo consiste de StemSpan H3000® (Stem Cell Technology Inc.) que no contiene suero, pero esta completamente desulfatado de heparina (Seikagaku), de 20 mg/l. Las siguientes citoquinas humanas recombinantes (si no se mencionan espedficamente todas las citoquinas que se han proporcionado por Stem Cell Technology Inc. o R&D Systems): interleuquina 3 (IL-3, 5 ng/ml) trombopoyetina (TPO; 25 ng/ml); ligando
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FLT-3 (FLT-3L; 25 ng/ml), factor de celulas madre (SCF; 25ng/ml), interleuquina-7 (IL-7; 25 ng/ml), factor estimulador de colonias de macrofago de granulocitos (GM-CSF, 10 pg/ml), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, 250 pg/ml), factor inhibidor de leucemia (LIF; 50 pg/ml), protema alfa 1 inflamatoria de macrofagos (200 pg/ml; MIP-I alfa) e interleuquina 6 (IL-6; 50 pg/ml). Complementos adicionales son la L-glutamina (2 mmol/l; Invitrogen), penicilina (1000 U/ml), estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen), 25pm de acido 2-beta-mercaptoetanol (Invitrogen) ascorbico (20 mg/ml, Sigma), selenita de selenio (50 pmol, Sigma), etanolamina (Sigma 50 pmol).
Se puede realizar el inicio del cultivo en tres formar alternativas:
d) inoculacion de celulas nucleadas despues de lisis de celulas rojas en medio GEM2
e) inoculacion de celulas CD34+ separadas (o alternativamente celulas CD133+) en medio GEM2
f) inoculacion de celulas CD34+ separadas (o alternativamente celulas CD133+) junto con celulas CD14+ separadas como complemento en medio GEM2 a una relacion de 1 celula CD34+ [o alternativamente celulas CD133+]: 1 celula CD14+)
La relacion final del medio con las celulas inoculadas es 1x106 celulas totales por 1 ml de medio o 1x105 CD34+ (o alternativamente celulas CD133+). Las condiciones del cultivo se refrescaran al agregar nuevo medio cada 2do dfa. Se preferira el siguiente procedimiento:
Dfa 0: 1x105 celulas positivas a CD34 se siembran en 1 ml de medio Dfa 2: adicion de 1 ml de medio GEM2 por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 4: adicion de 1 ml de medio GEM2 por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 6: adicion de 1 ml de medio GEM2 por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 8: adicion de 1 ml de medio GEM2 por 1x105 celulas de entrada totales
Las celulas se cultivan en el medio anteriormente mencionado de acuerdo con la invencion descrita y las relaciones bajo condiciones adecuadas. Las condiciones adecuadas de ejemplo con respecto a los contenedores de cultivo adecuados, temperatura, humedad relativa, contenido de O2 y CO2 de la fase de gas son conocidos por el experto.
Preferencialmente las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente bajo las siguientes condiciones: (a) 37°C, (b) 100% humedad relativa, (c) 10% de O2 y (d) 5% de CO2.
2. Iniciacion de diferenciacion y generacion de las celulas madre postembrionicas expandidas en un producto de celula citotoxica natural in vitro:
En los dfas 7-11 del cultivo se realiza el primer cambio en las condiciones de cultivo basales con respecto al medio de complementacion. En este punto el cultivo de suspension celular se dirige a diferenciacion de celula NK.
Todo el producto se diferencia adicionalmente en progenitores NK y se madura adicionalmente en celulas NK durante el penodo de cultivo.
Las cantidades designadas del producto de cultivo de celula inicial se complementan con un medio de expansion+diferenciacion utilizado en la invencion descrita. En este ejemplo en el dfa 9 despues del inicio del cultivo se agregara un medio utilizado en la invencion descrita que se denomina medio de expansion y diferenciacion 2 de celula NK de Glycostem (GNKED2):
El medio utilizado en la invencion descrita consiste de medio DMEM/Ham's F12 (Invitrogen Inc.) relacion de volumen 2:1 (V/V) que contiene 10% de suero AB humano (Cambrex Inc.), heparina completamente desulfatada (Seikagaku), de 20 mg/l hasta el dfa 16-18. las siguientes citoquinas humanas recombinantes (si no se menciona espedficamente todas las citoquinas se han proporcionado por Stem Cell Technology Inc. or R&D Systems): trombopoyetina (TPO; 1 ng/ml); ligando flt-3 (FLT-3L; 1 ng/ml), factor de celula madre (SCF; 1 ng/ml), interleuquina-7 (IL-7; 25 ng/ml), interleuquina-15 (IL-15; 25 ng/ml), interleuquina- 2 (Proleukin© [Chiron]; 1000 U/ml), factor de estimulacion de colonia de macrofago de granulocito (GMCSF; 10 pg/ml), factor de estimulacion de colonia de granulocito (G-CSF, 250 pg/ml), factor inhibidor de leucemia (LIF; 50 pg/ml), protema inflamatoria de macrofago 1 alfa (200 pg/ml; MIP-I alfa) y interleuquina-6 (IL- 6; 50 pg/ml). Los complementos adicionales son L-glutamina (2 mmol/l; Invitrogen), penicilina (1000 U/ml), estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen), 2-beta-mercaptoetanol 25 pM (Invitrogen) acido ascorbico (20 mg/ml, Sigma), selenita de selenio (50 pmol, Sigma), etanolamina (50 pmol Sigma).
Las condiciones del cultivo se refrescaran dos dfas a la semana al agregar nuevo medio. Se preferira el siguiente procedimiento:
5
10
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25
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50
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60
Dfa 9: adicion de 5 ml de medio GNKED2 por 1x105 celulas de entrada totales
D^a 13: adicion de 5 ml de medio GNKED2 por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 16: adicion de 5 ml de medio GNKED2 por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 20: adicion de 5 ml de medio GNKED2 sin heparina por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 23: adicion de 5 ml de medio GNKED2 sin heparina por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 27: adicion de 5 ml de medio GNKED2 sin heparina por 1x105 celulas de entrada totales
Dfa 30: adicion de 5 ml de medio GNKED2 sin heparina por 1x105 celulas de entrada totales
Las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente de acuerdo con la invencion descrita y las relaciones bajo condiciones adecuadas. Las condiciones adecuadas de ejemplo con respecto a contenedores de cultivo, temperatura, humedad relativa, contenido de O2 y CO2 de la fase de gas se conocen por el experto. Preferencialmente las celulas se cultivan en el medio mencionado anteriormente bajo las siguientes condiciones: (a) 37°C, (b) 100% humedad relativa, (c) 10% de O2 y (d) 5% de CO2.
Los progenitores de celulas NK inmaduros (NK-IC) se pueden cosechar a partir de los cultivos entre el dfa 15-20 despues de la iniciacion seguido por 2 etapas de lavado en pBs que contiene suero AB humano al 1% que se llevan a cabo de acuerdo con procedimientos operativos estandar conocidos por el experto en el campo. Posteriormente las celulas se resuspenden en solucion fisiologica de NaCl (0.9%) para infusion en el paciente. Despues de infusion, las celulas NK se maduran espedficamente dentro del cuerpo de los pacientes (in vivo) y finalmente se diferencian in vivo en celulas citotoxicas naturales completamente funcionales que son capaces de eliminar objetivos espedficos de celulas tumorales.
Alternativamente, las celulas se expandiran y se diferenciaran hasta el dfa 26-30 para obtener celulas NK funcionalmente maduradas que se han expandido/diferenciado >2x104 veces a partir de los numeros de entrada. Se cosechan todas las celulas y se realizan 2 etapas de lavado en PBS que contiene suero AB humano al 1% de acuerdo con los procedimientos operativos estandar conocidos por el experto en el campo. Como una realizacion de la invencion, las celulas NK maduradas se activaran durante la noche antes de aplicacion intravenosa al paciente mediante cultivo en medio 15 x- vivo, complementado con suero AB humano al 10% e IL-2 (1000 U/ml), IL-15 (25 ng/ml) e IL-18 (25 ng/ml). Al dfa siguiente las celulas se lavaran dos veces y se resuspenderan en solucion fisiologica de NaCl (0.9%) para infusion en el paciente.
Las celulas citotoxicas naturales generadas y activadas de esta manera son capaces de destruir objetivos espedficos de celulas tumorales. Por esta razon, el paciente se trata preferiblemente inmediatamente despues de infusion con IL-2 subcutanea (Proleukin©) a una dosis de 2x106 Ul/kg de peso corporal.
Una pequena alfcuota de las celulas se utiliza para el control de la garantfa de calidad del producto y se analizara fenotfpicamente para celulas NK maduras y funcionales en analisis de citometna de flujo.
Resultados del ejemplo experimental 2
En 3 muestras UCB independientes (cantidad entre 10-25 ml) se enriquecieron celulas CD34+ y se expandieron 1x103 celulas en medio GEM2 de acuerdo con la invencion descrita durante 9 dfas, seguido de una expansion y diferenciacion de 18 dfas en medio GNKD2. La cantidad total de celulas CD56+/CD3' en estos experimentos fue de 2.13 ± 0.55 x 107 celulas con una cantidad de 86.2 ± 5.6% de celulas vivas y una pureza de 83.8 ± 4.8% de celulas NK totales (Figura 4). En los experimentos de control sin etapas inventivas cruciales se generaron 0.97 ± 0.13 x 106 celulas NK con una supervivencia media de 55.3 ± 7.2% y una pureza de 44 ± 5.6% (Figura 5).
Figura 4: La grafica muestra un analisis de una pequena muestra de celulas NK generadas de acuerdo con la invencion descrita. Esta grafica se realiza sobre celulas vivas CD3 y muestra la correlacion de antfgenos CD56 y CD34.
El medio utilizado en este periodo de cultivo de acuerdo con la invencion descrita contiene heparina como se menciono anteriormente. Las celulas CD56+/CD3- de celulas NK generadas en este ejemplo contienen mas de 84% de celulas NK. Figura 5: La grafica muestra un analisis de una pequena muestra de celulas nK generadas de acuerdo con la invencion descrita. Esta grafica se realiza sobre celulas cD3- vivas y muestra la correlacion de los antfgenos CD56 y CD34

Claims (19)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para expandir y diferenciar celulas progenitores hematopoyeticas que comprenden cultivar celulas de una muestra que comprende celulas madre, celulas progenitoras o ambos, desde tejido postembrionario humano en una medio expansion que comprende un medio de cultivo de celula, 1-100 mg/l heparina desfultada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton, una coleccion de citoquinas en las que dicha coleccion de citoquinas comprende TPO, FLT-3L, SCF y IL-7, y opcionalmente comprende adicionalmente IL-3, en cantidades convencionales y adicionalmente a GM-CSF, G-CSF, LlF, MlP-1a y IL-6, en cantidades fisiologicas, y adicionalmente complementos convencionales, y cultivar las celulas adicionales en un medio de expansion y diferenciacion que comprende una coleccion de citoquinas, 1-100 mg/l heparina desfultada (UFH) y/o heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2000-10000 dalton y suero humano, en el que dicha coleccion de citoquinas comprende TPO, FLT-3L, SCF, IL-7, IL-2, IL-15, y adicionalmente GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-la y IL-6, en el que las celulas cultivadas se expanden y diferencian.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho medio expansion comprende adicionalmente litio.
  3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que se logra el cambio para medio de expansion y diferenciacion mediante reemplazo en forma de etapas y/o dilucion de medio cultivo con medio de expansion y diferenciacion.
  4. 4. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentracion de FLT-3, TPO y/o SCF se reduce durante cultivo.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el litio y/o UFH se reduce durante el cultivo.
  6. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente recolectar celulas de cultivo.
  7. 7. Una coleccion de celulas ex vivo que se puede obtener mediante un metodo de acuerdo con reivindicaciones 1 a 6 y que comprende 109 celulas citotoxicas naturales a partir de un unico donante.
  8. 8. Una coleccion de celulas ex vivo de acuerdo con la reivindicacion 7, que comprenden celulas madre proliferadas o mantenidas o ambas.
  9. 9. Una coleccion de celulas ex vivo de acuerdo con la reivindicacion 7, que comprende celulas citotoxicas naturales progenitoras.
  10. 10. Una coleccion de celulas ex vivo de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dichas celulas son esencial y geneticamente identicas.
  11. 11. Una coleccion de celulas ex vivo de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dichas celulas son funcionales inmunologicas.
  12. 12. Uso de una coleccion de celulas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, para la preparacion de un medicamento.
  13. 13. Uso de una coleccion de celulas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un individuo que sufre de un tumor, una infeccion vmca o ambos.
  14. 14. Uso de una coleccion de celulas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un individuo que sufre de una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o perdida de embarazo.
  15. 15. Un kit de partes para generar celulas citotoxicas naturales a partir de celulas progenitoras, celulas madre o ambas dicho kit que comprende el medio de expansion y diferenciacion de acuerdo con la reivindicacion 1, y/o los componentes de los mismos en cantidades suficientes para producir dicho medio.
  16. 16. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicacion 15, que comprende adicionalmente un medio de expansion de acuerdo con la reivindicacion 1, y/o los componentes de los mismos en cantidades suficientes para producir dicho medio.
  17. 17. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las celulas de la muestra son celulas madre somaticas de tejido postembrionario humano.
  18. 18. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que despues de 5 a 15 dfas de cultivar las celulas en el medio de expansion, el medio de expansion se reemplaza por el medio de expansion y diferenciacion.
  19. 19. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que las celulas se diferencian en celulas NK.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2536242C2 (ru) 2007-09-28 2014-12-20 Антродженезис Корпорейшн Угнетение опухолей с помощью плацентарного перфузата человека и выделенных из плаценты человека вспомогательных натуральных клеток-киллеров
MX342995B (es) 2010-07-13 2016-10-21 Anthrogenesis Corp Métodos de generar células asesinas naturales.
ES2856825T3 (es) * 2011-03-18 2021-09-28 Glycostem Therapeutics B V Generación de células NK y progenitores de células NK
DK2812011T3 (da) * 2012-02-08 2020-02-24 Glycostem Therapeutics B V Differentiering ex vivo af nk-celler fra cd34+ hæmatopoietiske celler
US9664671B2 (en) 2012-07-24 2017-05-30 Nissan Chemical Industries, Ltd. Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
CN114134113A (zh) * 2012-08-13 2022-03-04 人类起源公司 自然杀伤细胞及其用途
US10017805B2 (en) 2012-08-23 2018-07-10 Nissan Chemical Industries, Ltd. Enhancing ingredients for protein production from various cells
AU2014215458A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells from placenta
WO2014171486A1 (ja) * 2013-04-17 2014-10-23 日産化学工業株式会社 培地組成物及び当該培地組成物を用いた赤血球の製造方法
CN108239621B (zh) * 2018-01-24 2020-08-18 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法
EP3746095A4 (en) 2018-02-01 2021-04-21 Nkmax Co., Ltd. Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer
CN110247106B (zh) * 2019-05-25 2021-11-19 浙江锋锂新能源科技有限公司 一种带有铌酸钛的混合固液电解质电池
EP4114415A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Sorrento Therapeutics, Inc. Innate immunity killer cells targeting psma positive tumor cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5087570A (en) * 1988-05-10 1992-02-11 Weissman Irving L Homogeneous mammalian hematopoietic stem cell composition
US7396681B1 (en) * 1998-03-27 2008-07-08 Gabriele Multhoff Application of Hsp70 proteins
WO2005105982A1 (de) 2004-03-31 2005-11-10 Reinhardt Schwartz-Albiez Verfahren zur sequentiellen ex vivo expansion humaner postembryonaler stammzellen mit nachfolgender selektiver differenzierung
JP5525689B2 (ja) * 2004-11-02 2014-06-18 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法
SI1941027T1 (sl) 2005-09-28 2014-11-28 Ipd-Theapeutics B.V. Postopki in sredstva za proliferacijo zarodnih celic in kasnejšo generacijo in ekspanzijo progenitorskih celic, kot tudi izdelava efektor celic kot kliničnih zdravil

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