ES2638554T3 - Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas - Google Patents

Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas Download PDF

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Abstract

Una construcción de ADN que comprende una molécula polinucleotídica que tiene actividad reguladora de genes y (i) que comprende una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1, o (ii) que consiste en una secuencia polinucleotídica con al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de longitud completa de SEQ ID NO: 1, que proporciona expresión en el desarrollo de estructuras florales, en la que dicha molécula polinucleotídica está unida operativamente a un transgén de interés.

Description

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(Patentes de Estados Unidos n.º 5.750.876 y 6.476.295), producción de aceites modificados (Patente de Estados Unidos n.º 6.444.876), alta producción de aceite (Patentes de Estados Unidos n.º 5.608.149 y 6.476.295), contenido de ácidos grasos modificados (Patente de Estados Unidos n.º 6.537.750), alta producción de proteínas (Patente de Estados Unidos n.º 6.380.466), maduración de frutos (Patente de Estados Unidos n.º 5.512.466), alimentación animal o humana potenciada (Patentes de Estados Unidos n.º 5.985.605 y 6.171.640), biopolímeros (Patente de Estados Unidos n.º 5.958.745 y Patente de Estados Unidos n.º de Publicación US 20030028917), resistencia al estrés ambiental (Patente de Estados Unidos n.º 6.072.103), péptidos farmacéuticos (Patente de Estados Unidos n.º 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de Estados Unidos n.º 6.476.295), digestibilidad mejorada (Patente de Estados Unidos n.º 6.531.648), baja rafinosa (Patente de Estados Unidos n.º 6.166.296), producción de enzimas industriales (Patente de Estados Unidos n.º 5.543.576), sabor mejorado (Patente de Estados Unidos n.º 6.011.199), fijación de nitrógeno (Patente de Estados Unidos n.º 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de Estados Unidos n.º 5.689.041) y producción de biocombustibles (Patente de Estados Unidos n.º 5.998.700).
Como alternativa, una molécula polinucleotídica transcribible puede tener efecto en los fenotipos mencionados anteriormente codificando una molécula de ARN que provoca la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo a través de ARN inhibidor antisentido (iARN), o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN podría también ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) modificada por ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Por lo tanto, cualquier molécula polinucleotídica que codifique una proteína o ARNm que exprese un cambio de fenotipo o morfología de interés puede ser útil para la práctica de la presente invención.
Las construcciones de la presente invención en general son construcciones de ADN con bordes del plásmido Ti dobles que tienen las regiones del borde derecho (BD o AGRtu.BD) y el borde izquierdo (BI o AGRtu.BI) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de Agrobacterium, permite la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal. Las construcciones también contienen segmentos de ADN de la estructura del plásmido que proporcionan una función de replicación y la selección por antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación de amplio intervalo de huéspedes tal como oriV u oriRi, y una región codificante de un marcador de selección tal como Espec/Estrp, que codifica la aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que otorga resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador de selección de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación vegetal, la cepa bacteriana hospedadora a menudo es Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 o LBA4404, sin embargo, pueden funcionar en la presente invención otras cepas conocidas para los expertos en la técnica de transformación vegetal.
Plantas transformadas y células vegetales
Como se usa en el presente documento, el término “transformado” se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido una molécula polinucleotídica ajena, tal como una construcción. La molécula polinucleotídica introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo destinatario, de forma que la progenie posterior herede la molécula polinucleotídica introducida. Una célula u organismo “transgénico” o “transformado” también incluye a la progenie de la célula o del organismo, y la progenie producida a partir de un programa de mejora genética que emplea tal planta transgénica como un parental en un cruzamiento y que presenta un fenotipo modificado a consecuencia de la presencia de una molécula polinucleotídica ajena. Una construcción para la transformación vegetal que contiene un promotor de la presente invención puede introducirse en plantas mediante cualquier procedimiento de transformación vegetal. Los procedimientos y materiales para la transformación vegetal introduciendo una construcción para expresión vegetal en un genoma de planta puede incluir cualquiera de los procedimientos bien conocidos y demostrados, incluyendo la electroporación, como se ilustra en la Patente de Estados Unidos n.º 5.384.253; el bombardeo de microproyectiles como se ilustra en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 y 6.403.865; la transformación mediada por Agrobacterium como se ilustra en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840 y 6.384.301; y la transformación por protoplastos como se ilustra en la Patente de Estados Unidos n.º 5.508.184.
Los procedimientos para transformar de forma específica dicotiledóneas son bien conocidos para los expertos en la materia. La transformación y la regeneración de plantas utilizando estos procedimientos se han descrito para varios cultivos incluyendo el algodón (Gossypium hirsutum), la soja (Glycine max), el cacahuete (Arachis hypogaea) y los miembros del género Brassica.
Los procedimientos para la transformación de monocotiledóneas son bien conocidos por los expertos en la materia. La transformación y la regeneración de plantas utilizando estos procedimientos se han descrito para varios cultivos incluyendo, pero sin limitación, cebada (Hordeum vulgarae); maíz (Zea mays); avena (Avena saliva); dáctilo (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sativa), incluyendo las variedades índica y japónica); sorgo (Sorghum bicolor); caña de azúcar (Saccharum sp); cañuela (Festuca arundinacea); especies de césped (por ejemplo, las especies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); trigo (Triticum aestivum) y alfalfa (Medicago sariva). Es evidente para los expertos en la materia que pueden utilizarse y modificarse varias metodologías de transformación para la producción de plantas transgénicas estables a partir de cualquier número de cultivos diana de interés.
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Tabla 2: Análisis cuantitativo de la actividad de GUS en callos de maíz.
Construcción
Actividad de GUS (pmoles/μg de proteína/hora)
Os-TubA-3 (pMON77978)
17,51 ± 2,16
E35S (pMON77952)
33,53 ± 11,28
Vector de GUS sin promotor de control blanco (pMON77951)
1,67 ± 0,502
Ejemplo 4: Caracterización del promotor en plantas transgénicas
Se utilizó el vector de expresión vegetal pMON70453 para transformar maíz utilizando un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium. Por ejemplo, se utiliza la cepa desactivada de Agrobacterium C58 que porta una construcción de ADN binaria de la presente invención. La construcción de ADN se transfiere a Agrobacterium mediante un procedimiento de apareamiento triparental (Ditta y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 73477335, 1980). Se inician cultivos líquidos de Agrobacterium a partir de reservas en glicerol o a partir de un estriado en placa reciente, y se cultivan durante una noche a 26 ºC-28 ºC con agitación (aproximadamente 150 rpm) hasta la fase logarítmica de crecimiento medio en medio LB líquido, pH 7,0, que contiene los antibióticos apropiados. Las células de Agrobacterium se resuspenden en el medio de inoculación (CM4C líquido) y la densidad se ajusta a una DO660 de 1. Se inoculan embriones de maíz HiIIxLH198 de tipo II inmaduros y Hill recientemente aislados con Agrobacterium que contiene una construcción y se cocultivan varios días en oscuridad a 23 ºC. Después, los embriones se transfieren a medio de retardo y se incuban a 28 ºC durante varios o más días. Todos los cultivos posteriores se mantienen a esta temperatura. Los embriones se transfieren a un primer medio de selección que contiene carbenicilina 500/glifosato 0,5 mM. Dos semanas más tarde, el tejido superviviente se transfiere a un segundo medio de selección que contiene carbenicilina 500/glifosato 1,0 mM. Los callos supervivientes se subcultivan cada 2 semanas hasta que se pueden identificar acontecimientos. Esto puede tardar aproximadamente 3 subcultivos en glifosato 1,0 mM. Una vez que se identifican los acontecimientos, se acumula el tejido para la regeneración. Las plántulas (acontecimientos) se transfieren a medio MSOD en recipientes de cultivo y se mantienen durante dos semanas. La eficacia de transformación se determina dividiendo el número de acontecimientos producidos por el número de embriones inoculados. Después, las plantas con raíces se transfieren al suelo. Los expertos en la técnica de procedimientos de transformación de monocotiledóneas pueden modificar este procedimiento para proporcionar plantas monocotiledóneas transgénicas sustancialmente idénticas que contienen las composiciones de ADN de la presente invención, o utilizar otros procedimientos, tales como la pistola de partículas, que se sabe que proporcionan plantas monocotiledóneas transgénicas.
Se generaron aproximadamente 25 acontecimientos por construcción. Los acontecimientos se seleccionaron en medio que contenía glifosato, se transfirieron al suelo y después se llevaron al invernadero. En el invernadero, las plantas se rociaron con glifosato (0,84 kg de equivalente ácido de glifosato-ha-1) utilizando la formulación Roundup Ultra aproximadamente en la fase de hojas V4. Las plantas que sobrevivieron sin daños (clorosis <10 % y malformación) se mantuvieron y transfirieron a tiestos grandes. Aproximadamente en la fase V8, se realizó una segunda aplicación de glifosato igual que antes. Esta segunda pulverización era para evaluar la tolerancia reproductiva masculina. Los acontecimientos de las construcciones nuevas se puntuaron para la fertilidad masculina tras la maduración de las espigas. La Clasificación de la Fertilidad Masculina (CFM) se puntúa en un intervalo en donde CFM = 1 es completamente estéril (para espigas que carecen de inflorescencias desarrolladas) y CFM = 5 es desprendimiento completo de polen (para anteras completamente desarrolladas con desprendimiento de polen); CFM = 4-5 se considera comercialmente viable. Se utilizó una combinación de análisis de Taqman y Southern para evaluar el número de copias del transgén en los acontecimientos que se llevaban al invernadero. El análisis de Southern utilizando los elementos nuevos también mostró que estas secuencias heterólogas no presentan hibridación cruzada con las secuencias endógenas de maíz -un atributo significativo para la caracterización de acontecimientos. Estas evaluaciones tempranas son parte de un procedimiento para seleccionar casetes equivalentes a P-Os.Act1/CP4. Los criterios importantes para una construcción satisfactoria incluyen una buena eficacia de transformación (número de acontecimientos producidos/n.º de explantes inoculados) y la capacidad de proporcionar de forma reproducible transformantes tolerantes de forma vegetativa y de forma reproductiva que porten una única copia del transgén. En la Tabla 3 se muestra un resumen de las evaluaciones de la transformación temprana y en el invernadero. Los acontecimientos de única copia que pasaron a las evaluaciones en el invernadero prosiguieron a las evaluaciones de campo.
Tabla 3: evaluaciones de transformación temprana y en el invernadero.
Construcción
Frecuencia de Transformación Número de Acontecimientos CopiaÚnica Copia única y tolerante de forma vegetativa en R0 Copia única, tolerante de forma vegetativa y CFM=4-5 en R0
P-Os.Act1 pMON30167
5,1 % 24 33 % 21 % 21
P-Os.TubA-3 pMON70453
5,2 % 49 53 % 37 % 33
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