ES2625486T3 - Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas - Google Patents

Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas Download PDF

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James D. Masucci
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Abstract

Una construcción de ADN que comprende una molécula de polinucleótido que tiene actividad génica reguladora y que (i) comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 2, o (ii) consta de una secuencia polinucleotídica con al menos un 98 % de identidad secuencial con la secuencia polinucleotídica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresión en estructuras florales en desarrollo, en la que dicha molécula de polinucleótido está unida operativamente a un transgén de interés.

Description

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DESCRIPCION
Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas Campo de la invencion
La invencion esta relacionada con el campo de la biologfa molecular de las plantas e ingeniena genetica de las plantas y con moleculas de polinucleotidos que son utiles para la expresion de transgenes en plantas.
Antecedentes
Uno de los objetivos de la ingeniena genetica de las plantas es producir plantas con caractensticas o rasgos deseables desde un punto de vista agronomico. Un medio para lograr este objetivo es la expresion adecuada de un transgen deseable en una planta transgenica. Los elementos reguladores tales como promotores, lfderes, e intrones, son moleculas de polinucleotidos no codificantes que desempenan un papel esencial en la expresion global de genes en celulas vivas. Por lo tanto, los elementos reguladores aislados que funcionan en plantas son utiles para modificar fenotipos de plantas a traves de los procedimientos de ingeniena genetica.
Muchos elementos reguladores estan disponibles y son utiles para proporcionar una expresion global buena de un transgen. Por ejemplo, se sabe que los promotores constitutivos, tales como el P-FMV, el promotor del transcrito 35S del virus del mosaico de la escrofularia (patente de Estados Unidos N.° 6.051.753); el P-CaMV de 35S, el promotor del transcrito de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (patente de Estados Unidos N.° 5.530.196); el PRice Actin 1, el promotor del gen de actina 1 de Oryza sativa (patente de Estados Unidos N.° 5.641.876); y P-NOS, el promotor del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, proporcionan cierto nivel de expresion genica en la mayona o en todos los tejidos de una planta durante gran parte, o toda, transcrito 35S del virus del mosaico de la escrofularia (patente de Estados Unidos N.° 6.051.753); la vida util de la planta. Aunque estudios anteriores han proporcionado diversos elementos reguladores utiles que influyen en la expresion genica en plantas transgenicas, aun existe una gran necesidad de elementos reguladores nuevos que tengan caractensticas de expresion beneficiosas. Muchos elementos reguladores identificados anteriormente, no proporcionan los patrones o niveles de expresion requeridos para conseguir plenamente los beneficios de expresion de genes seleccionados en plantas de cultivo transgenicas.
La organizacion espacial en la celula eucariota y los movimientos dirigidos del contenido celular estan mediados por el citoesqueleto, una red de polfmeros proteicos filamentosos que penetra en el citosol. La tubulina es una de las tres familias de protemas principales que constituyen el citoesqueleto. En casi todas las especies eucariotas se han informado miembros de esta familia multigenica, entre los que se incluyen las levaduras, los seres humanos, el raton, el genero Drosophila, el tabaco, el mafz, el arroz, la soja, la patata y el genero Arabidopsis. En eucariotas superiores existen dos tipos de protemas de tubulina, la tubulina a y p.
Las tubulinas a y p de las plantas estan codificadas por dos familias de genes, cada una de ellas constituida por diversos isotipos diferentes.
Nuestra hipotesis era que un promotor de un gen de tubulina a podna tener un patron de expresion constitutivo y que el promotor y los elementos reguladores podnan ser utiles para dirigir la expresion de un transgen tal como un transgen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato para producir una planta tolerante a glifosato. La produccion eficiente de las plantas tolerantes a glifosato requiere el uso de un promotor y de elementos reguladores capaces de dirigir la expresion transgenica en todos los tejidos, incluyendo los organos reproductores mas sensibles, tales como las anteras y tejidos meristematicos. Por tanto, la presente invencion proporciona dichos promotores y elementos reguladores aislados de un gen de tubulina a de Oryza sativa.
Sumario
La invencion proporciona moleculas de polinucleotidos aisladas de Oryza sativa utiles para modular la expresion transgenica en plantas, en particular
(1) una construccion de ADN que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que
(i) comprende la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO: 2, o
(ii) consta de una secuencia polinucleotfdica con al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo, en la que dicha molecula de polinucleotido aislada esta unida operativamente a un transgen de interes;
(2) una planta transgenica transformada de forma estable con, y que comprende, una construccion de ADN que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que
(i) comprende la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO: 2, o
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(ii) consta de una secuencia polinucleotfdica con al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo,
en la que dicha molecula de polinucleotido esta unida operativamente a un transgen de interes;
(3) una semilla de dicha planta transgenica del apartado (2) anterior, que comprende la construccion de ADN del apartado (1) anterior;
(4) una molecula de polinucleotido aislada que tiene actividad genica reguladora y que
(i) comprende la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO: 2, o
(ii) consta una secuencia polinucleotidica con al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo; y
(5) un procedimiento para inhibir el crecimiento de malas hierbas en un campo de plantas de cultivo transgenicas tolerantes a glifosato que comprende:
(i) plantar las plantas transgenicas transformadas con un casete de expresion que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que comprende la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO: 2 y que esta unido operativamente a una molecula de ADN que codifica un gen de tolerancia a glifosato y
(ii) aplicar el glifosato al campo a un mdice de aplicacion que inhiba el crecimiento de malas hierbas,
en el que el crecimiento y el rendimiento de la planta de cultivo transgenica no se ven sustancialmente afectados por la aplicacion de glifosato.
Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: mapa del plasmido pMON77978. Se muestran los elementos geneticos y su posicion relativa. P =
promotor; I = Intron; L = UTR 5'; CR = region codificante; T = region 3' mas secuencia cadena abajo; nptII = gen
de resistencia a la kanamicina, para la seleccion vegetal y microbiana.

Figura 2: mapa del plasmido pMON70453. Se muestran los elementos geneticos y su posicion relativa. P =

promotor; I = Intron; L = UTR 5'; TS = secuencia de peptido de transito; CR = region codificante; T = region 3'
mas secuencia cadena abajo; CP4 = gen de resistencia a glifosato para la seleccion vegetal; SPC/STR = aad para la seleccion microbiana; se muestran los bordes derecho e izquierdo de ADN-T.
Descripcion detallada
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invencion y para guiar a los expertos en la materia en la practica de la presente invencion. A menos que se indique lo contrario, los terminos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de los expertos en la materia pertinente.
La invencion desvelada en el presente documento proporciona moleculas de polinucleotidos que tienen actividad genica reguladora de Oryza sativa. El diseno, la construccion y el uso de estas moleculas de polinucleotidos son un objeto de la presente invencion. Las secuencias polinucleotidicas de estas moleculas de polinucleotidos se proporcionan como SEQ ID NO: 2. Estas moleculas de polinucleotidos son capaces de influir en la transcripcion de moleculas de polinucleotidos transcribibles unidas operativamente tanto en tejidos vegetativos como reproductores de plantas y por tanto pueden regular la expresion de transgenes en estos tejidos de forma selectiva.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "molecula de polinucleotido" se refiere a ADN o a ARN mono o bicatenario de origen genomico o sintetico, es decir, un polfmero de bases desoxirribonucleotfdicas o ribonucleotfdicas, respectivamente, lefdo desde el extremo 5' (cadena arriba) al extremo 3' (cadena abajo).
Tal como se usa en el presente documento, el termino "secuencia polinucleotidica" se refiere a la secuencia de una molecula de polinucleotido. La nomenclatura que se usa para las bases de ADN es la que se expone en el Tttulo 37 del Codigo de Regulaciones Federales de los Estados Unidos §1.822.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "actividad genica reguladora " se refiere a una molecula de polinucleotido capaz de influir en la transcripcion o traduccion de una molecula de polinucleotido transcribible unida operativamente. Una molecula de polinucleotido aislada que tiene actividad genica reguladora puede proporcionar una expresion temporal o espacial o modular niveles e indices de expresion de la molecula de polinucleotido transcribible unida operativamente. Una molecula de polinucleotido aislada que tiene actividad genica reguladora puede comprender un promotor, un intron, un lfder, o una region 3' de terminacion transcripcional.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “promotor" se refiere a una molecula de polinucleotido que esta involucrada en el reconocimiento y en la union de la ARN polimerasa II y de otras protemas (factores de transcripcion que actuan en trans) para iniciar la transcripcion. Un “promotor vegetal” es un promotor nativo o no nativo que es funcional en celulas vegetales. Un promotor vegetal puede usarse como elemento regulador 5' para
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modular la expresion de uno o mas genes unidos operativamente. Los promotores vegetales pueden definirse por su patron de expresion temporal, espacial, o evolutivo.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “dominio potenciador" se refiere a un elemento regulador transcripcional que actua en cis, un elemento cis a.k.a, que confiere un aspecto del control global de la expresion genica. Un dominio potenciador puede funcionar uniendo factores de transcripcion, factores proteicos que actuan en trans que regulan la transcripcion. Algunos dominios potenciadores se unen a mas de un factor de transcripcion, y los factores de transcripcion pueden interaccionar con diferentes afinidades con mas de un dominio potenciador. Los dominios potenciadores pueden identificarse mediante diversas tecnicas, entre las que se incluye analisis de delecion, es decir, delecionar uno o mas nucleotidos del extremo 5' o interior a un promotor; analisis de protemas de union a ADN usando obtencion de huella (footprinting) con DNasa I, interferencia de metilacion, ensayos de cambio de la movilidad electroforetica, obtencion de huella genomica in vivo mediante PCR mediada por ligamiento, y otros ensayos convencionales; o por analisis de similitud de secuencia de ADN con motivos conocidos de elementos en cis mediante procedimientos de comparacion de secuencias de ADN. La estructura refinada de un dominio potenciador puede estudiarse adicionalmente mediante mutagenesis (o sustitucion) de uno o mas nucleotidos o mediante otros procedimientos convencionales. Los dominios potenciadores pueden obtenerse mediante smtesis qmmica o aislamiento de promotores que incluyen dichos elementos, y pueden sintetizarse con nucleotidos flanqueantes adicionales que contengan sitios de enzimas de restriccion utiles para facilitar la manipulacion de las subsecuencias. Por lo tanto, en el presente documento se describe el diseno, la construccion y el uso de dominios potenciadores de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento, para modular la expresion de moleculas de polinucleotidos unidas operativamente.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "quimerico" se refiere al producto de la fusion de porciones de dos o mas moleculas de polinucleotidos diferentes. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "promotor quimerico" se refiere a un promotor producido mediante la manipulacion de promotores conocidos u otras moleculas de polinucleotidos. Dichos promotores quimericos pueden combinar dominios potenciadores que pueden conferir o modular la expresion genica de uno o mas promotores, por ejemplo, fusionando un dominio potenciador heterologo de un primer promotor a un segundo promotor con sus propios elementos reguladores parciales o completos. Por lo tanto, en el presente e documento se describe, el diseno, la construccion y el uso de promotores quimericos de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para modular la expresion de moleculas de polinucleotidos unidas operativamente.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleotidos identicos en una secuencia polinucleotidica lineal de una molecula de polinucleotido de referencia (o su cadena complementaria) en comparacion con una molecula de polinucleotido de prueba (o su cadena complementaria) cuando las dos secuencias estan alineadas de forma optima (con inserciones, deleciones o huecos nucleotfdicos apropiados, con un total inferior al 20 por cierto de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparacion). Los expertos en la materia conocen bien el alineamiento optimo de secuencias para alinear una ventana de comparacion y puede realizarse con herramientas tales como el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, el procedimiento de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, y preferentemente mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos tales como GAP, BeStFIT, FaStA, y TFASTA disponible como parte del GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, MA). Una "fraccion de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el numero de componentes identicos que son compartidos por las dos secuencias alineadas dividido entre el numero total de componentes en el segmento de secuencia de referencia, es decir, la secuencia de referencia completa o una parte mas pequena definida de la secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia se representa como la fraccion de identidad multiplicada por 100. La comparacion de las secuencias polinucleotidicas es con una secuencia polinucleotidica de longitud completa.
Por lo tanto, un aspecto descrito en el presente documento es una molecula de polinucleotido que tiene al menos el 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia polinucleotfdica descrita en el presente documento. Tambien se contemplan moleculas de polinucleotidos que son capaces de regular la transcripcion de moleculas de polinucleotidos transcribibles unidas operativamente y que tienen un porcentaje de identidad de secuencia sustancial con las secuencias polinucleotfdicas de las moleculas de polinucleotidos descritas en el presente documento.
Procedimientos de aislamiento y modificacion de un de promotores
Para aislar fragmentos de un promotor desvelado en el presente documento pueden utilizarse diversos procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, utilizando informacion de secuencias disponible de forma publica, puede utilizarse tecnologfa de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) para amplificar regiones flanqueantes de una genoteca de una planta. Los expertos en la materia conocen diversos procedimientos para amplificar moleculas de polinucleotidos desconocidas adyacentes a una region nucleo de una secuencia polinucleotfdica conocida. Como procedimientos se incluyen, pero sin limitacion, estrategias de PCR inversa (PCRI), PCR vectorial, PCR en forma de Y y paseo genomico. Tambien pueden obtenerse fragmentos polinucleotfdicos mediante otras tecnicas tales como la sintetizacion directa del fragmento por medios qrnmicos, como habitualmente se realiza utilizando un sintetizador de oligonucleotidos automatico. Para la presente invencion, las moleculas de polinucleotidos se aislaron de ADN genomico disenando cebadores de PCR basandose en
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informacion de secuencias disponible.
Los nuevos promotores quimericos pueden disenarse o modificarse por ingeniena genetica mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, un promotor quimerico puede producirse fusionando un dominio potenciador de un primer promotor a un segundo promotor. El promotor quimerico resultante puede tener nuevas propiedades de expresion relativas al primer o segundo promotor. Los nuevos promotores quimericos pueden construirse de tal forma que el dominio potenciador de un primer promotor se fusiona en el extremo 5', en el extremo 3', o en cualquier posicion interna al segundo promotor. La ubicacion de la fusion del dominio potenciador al segundo promotor puede ocasionar que el promotor quimerico resultante tenga nuevas propiedades de expresion relativas a una fusion realizada en una ubicacion diferente.
Los expertos en la materia estan familiarizados con los recursos materiales convencionales que describen las condiciones y procedimientos espedficos para la construccion, manipulacion, y aislamiento de macromoleculas (por ejemplo, moleculas de polinucleotidos, plasmidos), asf como la generacion de organismos recombinantes y la exploracion y el aislamiento de moleculas de polinucleotidos.
Construcciones
Tal como se usa en el presente documento, el termino "construccion" se refiere a cualquier molecula de polinucleotido recombinante tal como un plasmido, un cosmido, un virus, una molecula de polinucleotido replicante autonomamente, un fago, una molecula de polinucleotido de ADN o ARN mono o bicatenaria, lineal o circular, procedente de cualquier fuente, capaz de integrarse genomicamente o replicarse autonomamente, que comprende una molecula de polinucleotido en la que una o mas moleculas de polinucleotidos se han unido operativamente.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "unido(a) operativamente" se refiere a una primera molecula de polinucleotido, tal como un promotor, conectado con una segunda molecula de polinucleotido transcribible, tal como un gen de interes, en el que las moleculas de polinucleotidos estan dispuestas de tal modo que la primera molecula de polinucleotido influye en la funcion de la segunda molecula de polinucleotido. Las dos moleculas de polinucleotidos pueden ser parte de una sola molecula de polinucleotido contigua y pueden ser adyacentes. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a un gen de interes si el promotor regula o media la transcripcion del gen de interes en una celula.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "molecula de polinucleotido transcribible" se refiere a cualquier molecula de polinucleotido capaz de transcribirse en una molecula de ARN. Se conocen procedimientos para introducir construcciones en una celula de tal forma que la molecula de polinucleotido transcribible se transcribe en una molecula ARNm funcional que se traduce y por tanto se expresa como un producto proteico. Las construcciones tambien pueden construirse para ser capaces de expresar moleculas de ARN antisentido, con el fin de inhibir la traduccion de una molecula de ARN de interes espedfica. Para la practica de la presente invencion, las composiciones y los procedimientos convencionales para preparar y usar construcciones y celulas hospedadoras, son bien conocidos para un experto en la materia, vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, volumenes 1,2 y 3 (2000) J.F. Sambrook, D. W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Las construcciones de la presente invencion contendnan tfpicamente un promotor unido operativamente a una molecula de polinucleotido transcribible unida operativamente a una molecula de polinucleotido de terminacion transcripcional 3'. Asimismo, las construcciones pueden incluir, pero sin limitacion, moleculas de polinucleotidos reguladoras adicionales de la region 3' no traducida (3' UTR) de genes de plantas (por ejemplo, una 3' UTR para aumentar la estabilidad ARNm del ARNm, tal como la region de terminacion PI-II de la patata o las regiones de terminacion 3' de la octopina o nopalina sintasa). Las construcciones pueden incluir, pero sin limitacion, las regiones 5' no traducidas (5' UTR) de una molecula de polinucleotido de ARNm que puede desempenar un papel importante en el inicio de la traduccion y tambien puede ser un componente genetico en una construccion de la expresion de una planta. Por ejemplo, las moleculas de polinucleotidos lfder 5' no traducidas procedentes de genes de protemas de choque termico, han demostrado potenciar la expresion genica en plantas (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.659.122 y la patente de Estados Unidos N.° 5.362.865).
Estas moleculas de polinucleotidos reguladoras adicionales cadena arriba y cadena abajo pueden proceder de una fuente que es nativa o heterologa con respecto a los otros elementos presentes en la construccion del promotor.
Por lo tanto, un promotor, tal como el que se proporciona en SEQ ID NO: 1-2, esta unido operativamente a una molecula de polinucleotido transcribible para dirigir la transcripcion de dicha molecula de polinucleotido transcribible a un nivel deseado o en un tejido deseado o un patron de desarrollo despues de la introduccion de dicha construccion en una celula vegetal. En algunos casos, la molecula de polinucleotido transcribible comprende una region de un gen que codifica una protema, y el promotor proporciona la transcripcion de una molecula de ARNm funcional que esta traducida y expresada como un producto de protema. Las construcciones tambien pueden construirse para la transcripcion de moleculas de ARN antisentido u otros ARN inhibidores similares, para inhibir la expresion de una molecula de ARN de interes espedfica en una celula hospedadora diana.
Entre los ejemplos de moleculas de polinucleotidos transcribibles para la incorporacion en construcciones de la presente invencion se incluyen, por ejemplo, moleculas de polinucleotidos o genes de una especie distinta de la
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especie del gen diana, o incluso genes que se originan con la misma especie o que estan presentes en ella, pero que se incorporan en celulas receptoras mediante procedimientos de ingeniena genetica en lugar de con tecnicas clasicas de reproduccion o cultivo. Se entiende que un gen o elemento genetico exogeno se refiere a cualquier gen o molecula de polinucleotido que se introduce en una celula receptora. El tipo de molecula de polinucleotido incluido en la molecula de polinucleotido exogena puede incluir una molecula de polinucleotido que ya esta presente en la celula vegetal, una molecula de polinucleotido de otra planta, una molecula de polinucleotido de un organismo diferente, o una molecula de polinucleotido generada externamente, tal como una molecula de polinucleotido que contenga un mensaje antisentido de un gen, o una molecula de polinucleotido que codifique una version artificial o modificada de un gen.
Los promotores de la presente invencion pueden incorporarse en una construccion usando genes marcadores como se describe y prueba en analisis transitorios que proporcionan un indicio de expresion genica en sistemas vegetales estables. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "gen marcador" se refiere a cualquier molecula de polinucleotido transcribible cuya expresion puede explorarse o puntuarse de algun modo. Los procedimientos de ensayo para la expresion de genes marcadores en ensayos transitorios son conocidos por los expertos en la materia. La expresion transitoria de genes marcadores se ha descrito usando una variedad de plantas, de tejidos, y de sistemas de suministro de ADN. Por ejemplo, como tipos de analisis transitorios pueden incluirse, pero sin limitacion, el suministro directo de genes por electroporacion o bombardeo de partmulas de tejidos en cualquier ensayo de planta transitorio usando cualquier especie vegetal de interes. Dichos sistemas transitorios incluinan, pero sin limitacion, la electroporacion de protoplastos procedentes de una variedad de fuentes de tejidos o el bombardeo de partmulas de tejidos espedficos de interes. En el presente documento se describe el uso de cualquier sistema de expresion transitorio para evaluar promotores o fragmentos de promotor unidos operativamente a cualquier molecula de polinucleotido transcribible, entre los que se incluye, pero sin limitacion, genes indicadores seleccionados, genes marcadores, o genes de interes agronomico.
Como ejemplos de tejidos vegetales contemplados para probarse en ensayos transitorios mediante un sistema de suministro adecuado, se incluinan, pero sin limitacion, tejidos de base foliar, callos, cotiledones, rames, endospermo, embriones, tejido floral, polen, y tejido epidermico.
En un ensayo transitorio puede usarse cualquier gen marcador puntuable o explorable. Como ejemplos de genes marcadores para analisis transitorios de los promotores o fragmentos de promotores ende la presente invencion se incluyen un gen GUS (patente de Estados Unidos N.° 5.599.670) o un gen GFP (patentes de Estados Unidos N.° 5.491.084 y 6.146.826).
Las construcciones que contienen los promotores o fragmentos de promotores unidos operativamente a un gen marcador se suministran a los tejidos y los tejidos se analizan mediante el procedimiento adecuado, dependiendo del marcador. Los analisis cuantitativos o cualitativos se usan como herramienta para evaluar el posible perfil de expresion de los promotores o fragmentos de promotores cuando estan unidos operativamente a genes de interes agronomico en plantas estables.
Por lo tanto, en una realizacion preferida, una molecula de polinucleotido de la presente invencion, como se muestra en SEQ ID NO: 2, se incorpora en una construccion, de tal forma que un promotor de la presente invencion esta unido operativamente a una molecula de polinucleotido transcribible que proporciona un marcador seleccionable, explorable, o puntuable. Como marcadores para su uso en la practica de la presente invencion se incluyen, pero sin limitacion, moleculas de polinucleotidos transcribibles que codifican □ glucuronidasa (GUS), protema verde fluorescente (GFP), luciferasa (LUC), protemas que confieren resistencia a antibioticos, o protemas que confieren tolerancia a herbicidas. En la tecnica se conocen marcadores utiles de resistencia a antibioticos, incluyendo aquellos genes que codifican protemas que confieren resistencia a kanamicina (nptll), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, espec/estrep) y gentamicina (aac3 y aacC4). Como herbicidas para los que se ha demostrado la tolerancia de una planta transgenica y que pueden aplicarse en el procedimiento descrito en el presente documento, se incluyen, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, delapon, ciclohezanodiona, inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa, y herbicidas de isoxaflutol. En la tecnica se conocen moleculas de polinucleotidos que codifican protemas involucradas en la tolerancia a herbicidas, e incluyen una molecula de polinucleotido que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), descrita en la patente de Estados Unidos N.° 5.627.061, en la patente de Estados Unidos N.° 5.633.435, y en la patente de Estados Unidos N.° 6.040.497 y aroA descrita en la patente de Estados Unidos N.° 5.094.945 para la tolerancia a glifosato, una molecula de polinucleotido que codifica una bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la patente de Estados Unidos N.° 4.810.648 para la tolerancia a Bromoxinil, una molecula de polinucleotido que codifica la fitoeno desaturasa (crtl) descrita en Misawa y col., (1993) Plant Journal 4:833-840 y Misawa y col., (1994) Plant Journal 6:481-489 para la tolerancia a norflurazon; una molecula de polinucleotido que codifica una aceto hidroxiacido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan y col. (1990) Polynucleotides Research 18:2188-2193 para la tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, y col., (1987) EMBO Journal 6:2513-2519 para la tolerancia a glufosinato y bialafos.
En una realizacion de la invencion, una molecula de polinucleotido como se muestra en SEQ ID NO: 2, se incorpora en una construccion, de tal forma que una molecula de polinucleotido de la presente invencion, esta unida operativamente a una molecula de polinucleotido transcribible que es un gen de interes agronomico. Tal como se
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usa en el presente documento, la expresion "gen de interes agronomico" se refiere a una molecula de polinucleotido transcribible que incluye, pero sin limitacion, un gen que proporciona una caractenstica deseable asociada a la morfologfa, fisiolog^a, crecimiento y desarrollo, rendimiento, mejora nutricional, resistencia a enfermedades o a plagas, o tolerancia ambiental o qmmica de la planta. La expresion de un gen de interes agronomico es deseable para conferir un rasgo importante desde el punto de vista agronomico. Un gen de interes agronomico, que proporciona un rasgo agronomico beneficioso a las plantas de cultivo puede ser, por ejemplo, la inclusion de elementos geneticos que comprenden resistencia a herbicidas (patentes de Estados Unidos N.° 5.633.435 y 5.463.175), rendimiento aumentado (patente de Estados Unidos N.° 5.716.837), control de insectos (patentes de Estados Unidos N.° 6.063.597; 6.063.756; 6.093.695; 5.942.664; y 6.110.464), resistencia a enfermedades fungicas (patentes de Estados Unidos N.° 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407, y 6.506.962), resistencia a virus (patentes de Estados Unidos N.° 5.304.730 y 6.013.864), resistencia a nematodos (patente de Estados Unidos N.° 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de Estados Unidos N.° 5.516.671), produccion de almidon (patentes de Estados Unidos N.° 5.750.876 y 6.476.295), produccion de aceites modificados (patente de Estados Unidos N.° 6.444.876), produccion de aceite superior (patentes de Estados Unidos N.° 5.608.149 y 6.476.295), contenido de acido graso modificado (patente de Estados Unidos N.° 6.537.750), produccion elevada de protemas (patente de Estados Unidos N.° 6.380.466), maduracion de frutos (patente de Estados Unidos N.° 5.512.466), nutricion mejorada de animales y seres humanos (patentes de Estados Unidos N.° 5.985.605 y 6.171.640), biopolfmeros (patente de Estados Unidos N.° 5.958.745 y publicacion de patente de Estados Unidos N.° US20030028917), resistencia al estres ambiental (patente de Estados Unidos N.° 6.072.103), peptidos farmaceuticos (patente de Estados Unidos N.° 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de Estados Unidos N.° 6.476.295), digestibilidad mejorada (patente de Estados Unidos N.° 6.531.648) rafinosa inferior (patente de Estados Unidos N.° 6.166.292), produccion de enzima industrial (patente de Estados Unidos N.° 5.543.576), sabor mejorado (patente de Estados Unidos N.° 6.011.199), fijacion de nitrogeno (patente de Estados Unidos N. ° 5.229.114), produccion de semillas hforidas (patente de Estados Unidos N.° 5.689.041), y produccion de biocombustible (patente de Estados Unidos N.° 5.998.700).
Como alternativa, una molecula de polinucleotido transcribible puede efectuar los fenotipos anteriormente mencionados codificando una molecula de ARN que cause la inhibicion de expresion dirigida de un gen endogeno, por ejemplo, mediante mecanismos mediados por ARN antisentido, inhibidor (ARNi), o cosupresion. El ARN tambien puede ser una molecula de ARN catalttica (por ejemplo, una ribozima) disenada geneticamente para escindir un producto de ARNm endogeno deseado. Por lo tanto, cualquier molecula de polinucleotido que codifique una protema o un ARNm que exprese un cambio de fenotipo o de morfologfa de interes, puede ser util para la practica de la presente invencion.
Las construcciones de la presente invencion son generalmente construcciones dobles de borde de ADN de un plasmido Ti que tienen las regiones del borde derecho (RB o AGRtu.RB) y del borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plasmido Ti aisladas del Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con las moleculas de transferencia proporcionadas por las celulas de Agrobacterium, permiten la integracion del ADN-T en el genoma de la celula vegetal. Las construcciones tambien contienen los segmentos de ADN de la estructura del plasmido que proporcionan una funcion de replicacion y seleccion antibiotica en celulas bacterianas, por ejemplo, un origen de replicacion de Escherichia coli tal como or /322, un origen de replicacion de amplio intervalo de hospedador, tal como oriV u oriRi, y una region codificante para un marcador seleccionable tal como Espec/Estrp que codifica el aminoglucosido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformacion de plantas, la cepa bacteriana hospedadora es con frecuencia Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, o LBA4404, sin embargo, en la presente invencion pueden funcionar otras cepas conocidas por los expertos en la materia.
Plantas transformadas y celulas de plantas
Tal como se usa en el presente documento, El termino "transformado" se refiere a una celula, tejido, organo, u organismo en el que se ha introducido una molecula de polinucleotido exogena, tal como una construccion. La molecula de polinucleotido que se ha introducido puede integrarse en el ADN genomico de la celula, tejido, organo, u organismo receptor, de tal manera que la descendencia posterior heredara la molecula de polinucleotido que se ha introducido. Una celula u organismo "transgenico" o "transformado" tambien incluye la descendencia de la celula u organismo y descendencia producida por un programa de cultivo que emplea dicha planta transgenica como un progenitor en un cruzamiento y que muestra un fenotipo alterado resultante de la presencia de una molecula de polinucleotido exogena. En las plantas puede introducirse una construccion de transformacion de plantas que contenga un promotor de la presente invencion mediante cualquier procedimiento de transformacion de plantas. Como procedimientos y materiales de transformacion de plantas introduciendo una construccion de expresion de plantas en un genoma de planta, pueden incluirse cualquiera de los procedimientos bien conocidos y demostrados entre los que se incluye, electroporacion, como se ilustra en la patente de Estados Unidos N.° 5.384.253; bombardeo con microproyectiles, como se ilustra en las patentes de Estados Unidos N.° 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; y 6.403.865; transformacion mediada por Agrobacterium, como se ilustra en las patentes de Estados Unidos N.° 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; y 6.384.301; y transformacion con protoplastos, como se ilustra en las patente de Estados Unidos N.° 5.508.184.
Los expertos en la materia conocen bien procedimientos para transformar espedficamente plantas dicotiledoneas.
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La transformacion y regeneracion de plantas usando estos procedimientos se han descrito para diversos cultivos entre los que se incluye el algodon (Gossypium hirsutum), la soja (Glycine max), el cacahuete (Arachis hypogaea), y miembros del genero Brassica.
Los expertos en la materia conocen bien procedimientos para transformer espedficamente plantas monocotiledoneas. La transformacion y regeneracion de plantas usando estos procedimientos se han descrito para diversos cultivos entre los que se incluye, pero sin limitacion, la cebada (Hordeum vulgare); el mafz (Zea mays); la avena (Avena sativa); el pasto ovillo (Dactylis glomerata); el arroz (Oryza sativa, incluyendo las variedades indica y japonica); el sorgo (Sorghum bicolor); la cana de azucar (Saccharum sp); la festuca talluda (Festuca arundinacea); especies de cesped (por ejemplo, las especies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); el trigo (Triticum aestivum), y la alfalfa (Medicago sativa). Para los expertos en la materia es obvio que pueden usarse y modificarse diversas metodologfas de transformacion para la produccion de plantas transgenicas estables a partir de cualquiera de los diversos cultivos diana de interes.
Las plantas transformadas se analizan con respecto a la presencia de genes de interes y al nivel de expresion y/o perfil conferido por los promotores de la presente invencion. Los expertos en la materia son conscientes de los numerosos procedimientos disponibles para el analisis de plantas transformadas. Por ejemplo, entre los procedimientos para el analisis de plantas se incluye la transferencia de Southern y la transferencia Northern, estrategias basadas en la PCR, analisis bioqmmicos, procedimientos de exploracion fenotfpica, evaluaciones de campo, y ensayos inmunodiagnosticos.
Las semillas de la presente invencion pueden cosecharse de plantas transgenicas fertiles y usarse para cultivar generaciones progenitoras de plantas transformadas de la presente invencion, entre las que se incluye lmeas vegetales hnbridas que comprenden la construccion de la presente invencion y que expresan un gen de interes agronomico.
Tambien se proporcionan partes de las plantas descritas en el presente documento. Entre las partes de la planta se incluye la semilla, el endospermo, el ovulo y el polen. En una realizacion de la presente invencion, la parte de la planta es una semilla.
Otro aspecto mas de la invencion es un procedimiento de inhibicion del crecimiento de malas hierbas en un campo de plantas de cultivo transgenicas, que comprende una primera plantacion de plantas transgenicas transformadas con un casete de expresion que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que comprende una secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO: 2 y que esta unida operativamente a una molecula de ADN que codifica un gen de tolerancia a glifosato y a continuacion la aplicacion de glifosato al campo a un mdice de aplicacion que inhiba el crecimiento de las malas hierbas, en el que el crecimiento y el rendimiento de la planta de cultivo transgenica no se ven sustancialmente afectados por la aplicacion de glifosato. El mdice de aplicacion de glifosato es el mdice efectivo necesario para controlar las malas hierbas en un cultivo tolerante a glifosato particular; estos indices pueden variar de 0,56 a 17,93 kg/ha (8 a 256 onzas/acre), preferentemente de 1,12 a 8,97 kg/ha (16 a 128 onzas/acre), y de forma mas preferente de 2,24 a 6,72 kg/ha (32 a 96 onzas/acre). El glifosato se aplica al menos una vez durante el crecimiento del cultivo tolerante a glifosato y puede aplicarse 2, 3, o 4 veces durante el crecimiento del cultivo o mas veces si fuese necesario para controlar las malas hierbas en el campo. Los ejemplos no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones se presentan a tftulo ilustrativo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificacion de genes constitutivos
Se identificaron genes de arroz que teman un patron de expresion constitutivo como la primera fase en el aislamiento de elementos heterologos para su uso en la construccion de casetes transgenicos. Los genes que participan en funciones celulares basicas, tales como la formacion del citoesqueleto, a menudo se expresan de manera constitutiva en toda la planta. Sin embargo, estos genes a menudo existen en familias de genes, y aunque la expresion global de los miembros de la familia pueda ser constitutiva en toda la planta, los miembros individuales pueden tener patrones de expresion espedficos mas restringidos, temporales, de desarrollo, o de tipo de organo/tejido/celula. En este sentido, familias de genes espedficas se centraron en la seleccion de genes candidatos individuales usando datos de estudios de expresion de genes.
Usando una secuencia genomica de arroz se identificaron las secuencias de la region no traducida (UTR) 5' de miembros de familias multigenicas seleccionadas (entre las que se inclma la tubulina, la actina, la histona, etc.). Se disenaron cebadores para hibridarse con las secuencias de la UTR 5' y la PCR se realizo usando procedimientos convencionales. Los productos de molecula de polinucleotido posteriores se dispusieron en filtros de nilon para el analisis de expresion de ARNm. Despues, los filtros se analizaron con moleculas de ADNc procedentes de acumulaciones de ARNm de tejido de rafz, hoja, grano, antera, ovario, o gluma. El experimento se repitio dos veces y los resultados se usaron para analizar la expresion de los genes seleccionados. A partir del analisis de los datos de expresion, se seleccionaron veinte genes para un analisis adicional utilizando PCR en tiempo real con cebadores espedficos de la UTR 3'. Los cebadores se usaron junto con el kit SYBR Green (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA) utilizando un aparato Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA) y protocolos convencionales suministrados por
el fabricante para amplificar las secuencias fuera del ADNc de la hoja, ra^z, antera, gineceo, o apice. A continuacion los resultados se compararon con el nivel de expresion para el gen de la actina 1 de arroz, cuyo promotor y primer intron se sabe que proporcionan alta tolerancia a glifosato cuando esta unido operativamente a un gen EPSPS resistente a glifosato. Se mostro que un gen de tubulina a, denominado Os-TubA-3, se expresaba en todos los 5 tejidos del arroz a niveles mas altos que los del gen ractl.
El patron de expresion generalmente constitutivo del gen Os-TubA-3 se confirmo adicionalmente cuando se realizo un analisis con BLASTN usando su secuencia UTR 3' como una busqueda de genotecas de EST de arroz preparadas a partir de diversos organos de arroz a varias fases de desarrollo (vease la Tabla 1). Los resultados se compararon de nuevo con el nivel de expresion para el gen de la actina 1 de arroz. Un rasgo de expresion 10 particularmente deseable del gen TubA-3 fue la representacion de EST en estructuras florales en desarrollo, incluyendo las anteras. Se realizo una busqueda con BLASTN usando la secuencia UTR 3' de Os-TubA-3 para identificar un BAC de arroz que contuviese una copia genomica completa del gen Os-TubA-3 incluyendo la region del promotor.
Tabla 1: Aparicion de secuencias UTR 3' respectivas en genotecas de EST de arroz.
Genoteca
Numero total de lecturas 5' y 3' Apariciones de actina 1 de arroz Apariciones de Os-TubA-3
pamcula, rotura- 3/4 apertura de la flor
20.227 7 >16
desarrollo de la pamcula
7.909 5 >16
ultima antera
5.956 14 4
desarrollo de la semilla
7.453 1 8
semilla seca
9.362 0 0
semilla germinada
9.743 0 1
apice vegetativo
7.672 2 >16
hoja, hoja 3-5
10.040 0 1
hoja, brote 3-4
9.209 1 0
hoja, elongacion del pasador
7.897 1 3
rafz, hoja 3-5
10.524 2 4
rafz, brote 3-4
10.624 1 9
rafz, tercer brote lechoso
7.481 1 3
Ejemplo 2: Construcciones
15 El promotor Os-T ubA-3 se aislo de la region genomica cadena arriba del gen Os-TubA-3 para la incorporacion en un casete de expresion y caracterizacion posterior en plantas transgenicas. Se disenaron oligonucleotidos OsTUBA136- 1 y OsTUBA136-2 (proporcionados como SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente) para amplificar la region 5' (promotor y UTR 5'). La region del promotor cadena arriba del gen Os-TubA-3 se amplifico empezando inmediatamente cadena arriba del codon de inicio de la traduccion y terminando aproximadamente 1,2 kb 20 inmediatamente cadena arriba del comienzo del sitio de inicio de la transcripcion (deducido examinando la UTR 5' mas larga presente para el gen Os-TubA-3 en la coleccion de EST). La secuencia del promotor se proporciona como SEQ ID NO: 2. La secuencia del lfder se proporciona como SEQ ID NO: 5. El primer intron del gen Os-TubA-3 (que se encuentra cadena abajo del inicio de la traduccion) se amplifico con oligonucleotidos OsTUBA136-3 y OsTUBA136-4 (proporcionados como SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente). La secuencia del intron se 25 proporciona como SEQ ID NO: 4. A continuacion se retiro el intron de su contexto nativo y se coloco en la UTR 5' inmediatamente cadena arriba del codon de inicio de la traduccion para producir un promotor quimerico Os-TubA-3. La secuencia del promotor quimerico se proporciona como SEQ ID NO: 1.
A continuacion se crearon construcciones para la caracterizacion en planta del promotor Os-TubA-3 para la expresion de un transgen unido operativamente. El promotor se ligo a una construccion de expresion de planta de tal 30 manera que el promotor estaba unido operativamente al transgen de interes.
La region 3' de Os-TubA-3 (500-600 pb de secuencia inmediatamente cadena abajo del codon de terminacion de la
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traduccion que inclma la secuencia cadena abajo adyacente mas la UTR 3') tambien se amplifico usando oligonucleotidos OsTUBA136-5 y OsTUBA136-6 (proporcionados como SEQ ID NO: 10 y SEQ iD NO: 11). La secuencia de la region 3' se proporciona como SEQ iD NO: 3. La region 3' se uso en la construccion del vector de transformacion de la planta para proporcionar mayor diversidad de elementos sobre las construcciones existentes para capturar cualquier capacidad reguladora (transcripcional o al nivel de estabilidad del ARNm) presente en la secuencia. La region 3' de Os-TubA-3 se ligo al extremo 3' del transgen de interes. Para la caracterizacion de la actividad GUS el vector de transformacion de la planta pMON77978 como se muestra en la figura 1 contiene el gen indicador GUS como el transgen de interes. Para la caracterizacion de la tolerancia a glifosato el vector de transformacion de la planta pMON70453 como se muestra en la figura 2 contiene el gen CTP2/CP4 EPSPS como el transgen de interes.
Ejemplo 3: Caracterizacion de promotores en sistemas transitorios
Se uso el vector de expresion de planta pMON77978 para transformar callos de mafz usando bombardeo de partfculas para la caracterizacion del promotor de la planta. La actividad GUS se analizo despues cuantitativamente. Los resultados se muestran en la Tabla 2. El promotor Os-TubA-3 demostro tener un nivel de expresion deseable en este sistema transitorio.
Tabla 2: Analisis cuantitativo de actividad GUS en callos de maiz.
Construccion
Actividad GUS (pmoles/protema pg/hora)
Os-TubA-3 (pMON77978)
17,51 ± 2,16
E35S (pMON77952)
33,53 ± 11,28
Control en blanco de vector GUS sin promotor (pMON77951)
1,67 ± 0,502
Ejemplo 4: Caracterizacion de promotores en plantas transgenicas
Se uso el vector de expresion de planta pMON70453 para transformar mafz usando un procedimiento de transformacion mediado por Agrobacterium. Por ejemplo, se uso una cepa desarmada de Agrobacterium C58 que llevaba una construccion de ADN binario de la presente invencion. La construccion de ADN se transfirio a un Agrobacterium mediante un procedimiento de apareamiento triparental (Ditta y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:73477351,1980). Se iniciaron cultivos lfquidos de Agrobacterium a partir de reservas de glicerol o de una placa recien sembrada en estnas y cultivada durante toda la noche a 26-28 °C con agitacion (aproximadamente 150 rpm) hasta una fase de crecimiento semilogantmica en medio LB lfquido, a pH 7,0 que contema los antibioticos apropiados. Las celulas de Agrobacterium se resuspendieron en el medio de inoculacion (lfquido CM4C) y la densidad se ajusto a una DO660 de 1. Se inocularon embriones de mafz inmaduro HiiixLH198 y Hiii de tipo II recien aislados con Agrobacterium que contema una construccion y se cocultivo durante varios dfas en la oscuridad a 23 °C. A continuacion los embriones se transfirieron a medios de retardo y se incubaron a 28 °C durante varios dfas o mas. Todos los cultivos posteriores se mantuvieron a esta temperatura. Los embriones se transfirieron a un primer medio de seleccion que contema carbenicilina 500/ glifosato 0,5 mM. Dos semanas despues, el tejido que sobrevive se transfirio a un segundo medio de seleccion que contema carbenicilina 500 y glifosato 1,0 mM. El callo sobrevive en subcultivo cada 2 semanas hasta que pueden identificarse sucesos. Esto puede llevar aproximadamente 3 subcultivos en glifosato 1,0 mM. Una vez identificado los sucesos, el tejido se hace crecer hasta regenerarse. Las plantulas (sucesos) se transfieren a un medio MSOD en un recipiente de cultivo y se conservan durante dos semanas. La eficacia de la transformacion se determina dividiendo el numero de sucesos producidos entre el numero de embriones inoculados. A continuacion, las plantas con rafz se transfieren al suelo. Los expertos en la materia de procedimientos de transformacion de monocotiledoneas pueden modificar este procedimiento para proporcionar plantas monocotiledoneas transgenicas sustancialmente identicas que contengan las composiciones de ADN de la presente invencion, o usar otros procedimientos, tales como pistola de partfculas, que se sabe que proporcionan plantas monocotiledoneas transgenicas.
Se generaron aproximadamente 25 sucesos por construccion. Los sucesos se seleccionaron en un medio que contema glifosato, se transfirieron al suelo, y a continuacion se trasladaron al invernadero. En el invernadero, las plantas se pulverizaron con glifosato (glifosato 0,84 kg de equivalente de acido por ha'1) usando la formulacion Roundup Ultra en la fase de hoja V4 aproximadamente. Las plantas que sobrevivieron sin ningun tipo de lesion (< 10 % de clorosis y malformacion) se guardaron y transfirieron a macetas grandes. En la fase V8 aproximadamente, se realizo una segunda aplicacion de glifosato como anteriormente. Esta segunda pulverizacion se realizo para evaluar la tolerancia reproductora masculina. Se puntuaron los sucesos de las nuevas construcciones para la fertilidad masculina tras la maduracion de las pamculas. La calificacion de fertilidad masculina (MFR) se puntuo en un intervalo en el que MFR=I es completamente esteril (para pamculas que no tengan flores desarrolladas) y MFR=5 contiene mucho desprendimiento de polen (para anteras completamente desarrolladas con desprendimiento de polen); Una MFR=4-5 se considera comercialmente viable. Se uso una combinacion de analisis Taqman y Southern para evaluar el numero de copias transgenicas en los sucesos que ocunian en el invernadero. El analisis Southern
usando los nuevos elementos tambien demostro que estas secuencias heterologas no manifestaban hibridacion cruzada en secuencias de ir^z endogenas - una calidad significativa para la caracterizacion de sucesos. Estas evaluaciones tempranas forman parte de un procedimiento para seleccionar casetes equivalentes a P-Os.Act1/CP4. Entre los criterios importantes para realizar una construccion satisfactoria se incluyen una eficacia de transformacion 5 buena (numero de sucesos producidos/n° de explantes inoculados) y la habilidad de proporcionar de manera reproducible transformantes tolerantes de forma vegetativa y reproductiva que lleven una unica copia del transgen. En la Tabla 3 se muestra un resumen de las evaluaciones de la transformacion temprana y en invernadero. Los sucesos de copia unica que aprobaron las evaluaciones en invernadero se adelantaron a las evaluaciones en campo.
10 Tabla 3: Evaluaciones de transformacion temprana e invernadero.
Construccion
Transformacion Frecuencia Numero de sucesos Copia unica Copia unica y tolerante de forma vegetativa en R0 Copia unica, tolerante de forma vegetativa y MFR=4-5 en R0
P-Os.Act1 pMON30167
5,1% 24 33% 21% 21
P-Os.TubA-3 pMON70453
5,2% 49 53% 37% 33
Las evaluaciones de campo se realizaron en Puerto Rico con plantas de mafz de generacion F2. Las plantas se trataron con dos aplicaciones de glifosato 3,36 kg de equivalente acido por ha-1) en una formulacion Roundup UltraMax™ (4X por encima de la tasa real de uso en campo). Se realizo un tratamiento en la etapa V4 y un segundo 15 tratamiento en la etapa V8. Las calificaciones vegetativas para la clorosis (<10% clorosis) y la malformacion (<10% malformacion) se tomaron 10 dfas despues del tratamiento. Las calificaciones de fertilidad masculina (MFR) se tomaron en la maduracion de la pamcula. Para comparar, se evaluo un suceso comercial NK603 (pMON25496 que contema P-Os.Actl/CP4 EP- SPS::P-e35S/CP4 EPSpS). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Evaluacion de campo.
Construccion
Numero de sucesos Sucesos que aprobaron la calificacion de malformacion V8 Sucesos que aprobaron la calificacion de clorosis V8 Sucesos que aprobaron las calificaciones vegetativas y MFR = 4-5
P- Os.Act1+E35S NK603
1 1 1 1
P-Os.TubA-3 pMON70453
7 6 6 6
20 La acumulacion de protema CP4 EPSPS (pg/mg de protema total mostrada como media ± error estandar) en varios tejidos de mafz se midio despues para sucesos de copia unica en plantas F1 hemicigotas que mostraron una eficacia de campo buena para la tolerancia a glifosato. Para comparar, el suceso NK603 tiene aproximadamente 21 ppm o aproximadamente 1,4 pg CP4 EPSPS/mg de protema total en la fase de la lamina de hoja V4 cuando se cultivo en condiciones similares. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
25 Tabla 5: Acumulacion de CP4 EPSPS en varios tejidos de maiz.
Construccion
Numero de sucesos de copia unica lamina de hoja V4 en fase V4 lamina de hoja V9-10 en fase V9- 10 Pamcula inmadura (5-10 cm) Punta de la raiz (~ 1 cm)
P-Os.TubA-3 pMON70453
10 0,041 ± 0,005 0,070 ± 0,006 0,144 ± 0,014 0,095 ± 0,016
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Monsanto Technology, LLC 30
<120> Moleculas promotoras para su uso en plantas
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<150> EP 04786581.1 <151> 5
<150> US 60/497523 <151>
<160> 11
10
<170> Patent In version 3.2
<210> 1 <211> 2190 15 <212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 1
gcctcgagac
aacaacatgc ttctcatcaa catggaggga agagggaggg agaaagtgtc 60
gcctggtcac
ctccattgtc acactagcca ctggccagct ctcccacacc accaatgcca 120
ggggcgagct
ttagcacagc caccgcttca cctccaccac cgcactaccc tagcttcgcc 180
caacagccac
cgtcaacgcc tcctctccgt caacataaga gagagagaga agaggagagt 240
agccatgtgg
ggaggaggaa tagtacatgg ggcctaccgt ttggcaagtt attttgggtt 300
gccaagttag
gccaataagg ggagggattt ggccatccgg ttggaaaggt tattggggta 360
gtatcttttt
actagaattg tcaaaaaaaa atagtttgag agccatttgg agaggatgtt 420
gcctgttaga
ggtgctctta ggacatcaaa ttccataaaa acatcagaaa aattctctcg 480
atgaagattt
ataaccacta aaactgccct caattcgaag ggagttcaaa acaattaaaa 540
tcatgttcga
attgagtttc aatttcactt taaccccttt gaaatctcaa tggtaaaaca 600
tcaacccgtc
aggtagcatg gttcttttta ttcctttcaa aaagagttaa ttacaaacag 660
aatcaaaact
aacagttagg cccaaggccc atccgagcaa acaatagatc atgggccagg 720
cctgccacca
ccctccccct cctggctccc gctcttgaat ttcaaaatcc aaaaatatcg 780
gcacgactgg
ccgccgacgg agcgggcgga aaatgacgga acaacccctc gaattctacc 840
ccaactacgc
ocaocaaccc acacgccact gacaatccgg tcccaccctt gtgggcccac 900
ctacaagcga
gacgtcagtc gctcgcagca accagtgggc ccacctccca gtgagcggcg 960
ggtagatctg
gactcttacc cacccacact aaacaaaacg gcatgaatat tttgcactaa 1020
aaccctcaga
aaaattccga tattccaaac cagtacagtt cctgaccgtt ggaggagcca 1080
aagtggagcg
gagtgtaaaa ttgggaaact taatcgaggg ggttaaacgc aaaaacgccg 1140
aggcgcctcc
cgctctatag aaaggggagg agtgggaggt ggaaacccta ccacaccgca 1200
gagaaaggcg
tcttcgtact cgcctctctc cgcgccctcc tccgccgccg ctcgccgccg 1260
ttcgtctccg
ccgccaccgg ctagccatcc aggtaaaaca aacaaaaacg gatctgatgc 1320
ttccattcct
ccgtttctcg tagtagcgcg cttcgatctg tgggtggatc tgggtgatcc 1380
tggggtgtgg
ttcgttctgt ttgatagatc tgtcggtgga tctggccttc tgtggttgtc 1440
gatgtccgga
tctgcgtttt gatcagtggt agttcgtgga tctggcgaaa tgttttggat 1500
ctggcagtga
gacgctaaga atcgggaaat gatgcaatat taggggggtt tcggatgggg 1560
atccactgaa
ttagtctgtc tccctgctga taatctgttc ctttttggta gatctggtta 1620
gtgtatgttt
gtttcggata gatctgatca atgcttgttt gttttttcaa attttctacc 1680
taggttgtat
aggaatggca tgcggatctg gttggattgc catgatccgt gctgaaatgc 1740
ccctttggtt
gatggatctt gatattttac tgctgttcac ctagatttgt actcccgttt 1800
atacttaatt
tgttgcttat tatgaataga tctgtaactt aggcacatgt atggacggag 1860
tatgtggatc
tgtagtatgt acattgctgc gagctaagaa ctatttcaga gcaagcacag 1920
aaaaaaatat
ttagacagat tgggcaacta tttgatggtc tttggtatca tgctttgtag 1980
tgctcgtttc
tgcgtagtaa tcttttgatc tgatctgaag ataggtgcta ttatattctt 2040
aaaggtcatt
agaacgctat ctgaaaggct gtattatgtg gattggttca cctgtgactc 2100
cctgttcgtc
ttgtcttgat aaatcctgtg ataaaaaaaa ttcttaaggc gtaatttgtt 2160
gaaatcttgt
tttgtcctat gcagcctgat 2190
<210>2 <211>1206 5 <212> ADN
<213> Oryza sativa
<400>2
gcctcgagac
aacaacatgc ttctcatcaa catggaggga agagggaggg agaaagtgtc 60
gcctggtcac
ctccattgtc acactagcca ctggccagct ctcccacacc accaatgcca 120
ggggcgagct
ttagcacagc caccgcttca cctccaccac cgcactaccc tagcttcgcc 180
caacagccac
cgtcaacgcc tcctctccgt caacataaga gagagagaga agaggagagt 240
agccatgtgg
ggaggaggaa tagtacatgg ggcctaccgt ttggcaagtt attttgggtt 300
gccaagttag
gccaataagg ggagggattt ggccatccgg ttggaaaggt tattggggta 360
gtatcttttt
actagaattg tcaaaaaaaa atagtttgag agccatttgg agaggatgtt 420
gcctgttaga
ggtgctctta ggacatcaaa ttccataaaa acatcagaaa aattctctcg 480
atgaagattt
ataaccacta aaactgccct caattcgaag ggagttcaaa acaattaaaa 540
tcatgttcga
attgagtttc aatttcactt taaccccttt gaaatctcaa tggtaaaaca 600
tcaacccgtc
aggtagcatg gttcttttta ttcctttcaa aaagagttaa ttacaaacag 660
aatcaaaact
aacagttagg cccaaggccc atccgagcaa acaatagatc atgggccagg 720
cctgccacca
ccctccccct cctggctccc gctcttgaat ttcaaaatcc aaaaatatcg 780
gcacgactgg
ccgccgacgg agcgggcgga aaatgacgga acaacccctc gaattctacc 840
ccaactacgc
ccaccaaccc acacgccact gacaatccgg tcccaccctt gtgggcccac 900
ctacaagcga
gacgtcagtc gctcgcagca accagtgggc ccacctccca gtgagcggcg 960
ggtagatctg
gactcttacc cacccacact aaacaaaacg gcatgaatat tttgcactaa 1020
aaccctcaga
aaaattccga tattccaaac cagtacagtt cctgaccgtt ggaggagcca 1080
aagtggagcg
gagtgtaaaa ttgggaaact taatcgaggg ggttaaacgc aaaaacgccg 1140
aggcgcctcc
cgctctatag aaaggggagg agtgggaggt ggaaacccta ccacaccgca 1200
gagaaa
1206
<210>3 <211> 582 5 <212> ADN
<213> Oryza sativa
<400>3
5
10
cagggttctt
gcctggtgcc ttggcaatgc ttgattactg ctgctatcct atgatctgtc 60
cgtgtgggct
tctatctatc agtttgtgtg tctggttttg aaaaacattt gcttttcgat 120
tatgtagggt
ttgcttgtag ctttcgctgc tgtgacctgt gttgtttatg tgaaccttct 180
ttgtggcatc
tttaatatcc aagttcgtgg tttgtcgtaa aacgaagcct ctacttcgta 240
aagttgtgtc
tatagcattg aaatcgtttt tttgctcgag aataattgtg acctttagtt 300
ggcgtgaaac
tagttttgga tatctgattc tctggttcgc aatcttgaga tcgtcgctgc 360
ttaggtgagc
taagtgatgt tcctaagtaa atgctcctca ccagaatacg tagctgtgtg 420
aaaagagaac
gcgtgaatac gtagctgtgt aaagattgtg tcccaagtaa acctcagtga 480
tttttgtttg
gatttttaat ttagaaacat tcgactggga gcggctagag ccacacccaa 540
gttcctaact
atgataaagt tgctctgtaa cagaaaacac ca 582
<210>4 <211> 892 <212> ADN <213> Oryza sativa
<400> 4
gtaaaacaaa
caaaaacgga tctgatgctt ccattcctcc gtttctcgta gtagcgcgct 60
tcgatctgtg
ggtggatctg ggtgatcctg gggtgtggtt cgttctgttt gatagatctg 120
tcggtggatc
tggccttctg tggttgtcga tgtccggatc tgcgttttga tcagtggtag 180
ttcgtggatc
tggcgaaatg ttttggatct ggcagtgaga cgctaagaat cgggaaatga 240
tgcaatatta
ggggggtttc ggatggggat ccactgaatt agtctgtctc cctgctgata 300
atctgttcct
ttttggtaga tctggttagt gtatgtttgt ttcggataga tctgatcaat 360
gcttgtttgt
tttttcaaat tttctaccta ggttgtatag gaatggcatg cggatctggt 420
tggattgcca
tgatccgtgc tgaaatgccc ctttggttga tggatcttga tattttactg 480
ctgttcacct
agatttgtac tcccgtttat acttaatttg ttgcttatta tgaatagatc 540
tgtaacttag
gcacatgtat ggacggagta tgtggatctg tagtatgtac attgctgcga 600
gctaagaact
atttcagagc aagcacagaa aaaaatattt agacagattg ggcaactatt 660
tgatggtctt
tggtatcatg ctttgtagtg ctcgtttctg cgtagtaatc ttttgatctg 720
atctgaagat
aggtgctatt atattcttaa aggtcattag aacgctatct gaaaggctgt 780
attatgtgga
ttggttcacc tgtgactccc tgttcgtctt gtcttgataa atcctgtgat 840
aaaaaaaatt
cttaaggcgt aatttgttga aatcttgttt tgtcctatgc ag 892
<210> 5 <211> 86 <212> ADN <213> Oryza sativa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ggcgtcttcg tactcgcctc tccgccgcca ccggctagcc
<210>6 <211> 32 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleotfdico sintetico <400>6
gacaagcttg cctcgagaca acaacatgct tc 32
<210>7 <211> 38 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleotidico sintetico <400>7
attccatggc ggctagccgg tggcggcgga gacgaacg 38
<210>8 <211> 39 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleotidico sintetico <400>8
cgagctagcc atccaggtaa aacaaacaaa aacggatct 39
<210>9 <211> 34 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleotidico sintetico <400>9
attccatgga tcaggctgca taggacaaaa caag 34
<210> 10 <211> 33 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleotidico sintetico <400> 10
tagagagctc cagggttctt gcctggtgcc ttg 33
<210> 11 <211> 33 <212>ADN <213> Artificial
tctccgcgcc ctcctccgcc gccgctcgcc gccgttcgtc 60
atccag 86
<223> Cebador oligonucleotidico sintetico <400> 11
acttctagat ggtgttttct gttacagagc aac 5
33

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una construccion de ADN que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que
    (i) comprende la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO: 2, o
    (ii) consta de una secuencia polinucleotfdica con al menos un 98 % de identidad secuencial con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo,
    en la que dicha molecula de polinucleotido esta unida operativamente a un transgen de interes.
  2. 2. La construccion de ADN de la reivindicacion 1, en la que dicho transgen de interes es un gen marcador.
  3. 3. La construccion de ADN de la reivindicacion 1, en la que dicho transgen de interes es un gen de interes agronomico, preferentemente dicho gen de interes agronomico es un gen con tolerancia a herbicidas seleccionado de genes que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, dalapon deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, glifosato oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa.
  4. 4. Una planta transgenica transformada de forma estable con, y que comprende, una construccion de ADN que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que
    (i) comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO: 2, o
    (ii) consta de una secuencia polinucleotfdica con al menos un 98 % de identidad secuencial con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo,
    en la que dicha molecula de polinucleotido esta unida operativamente a un transgen de interes.
  5. 5. La planta transgenica de la reivindicacion 4, en la que dicho transgen de interes es un gen exogeno.
  6. 6. La planta transgenica de la reivindicacion 4 o 5, en la que dicho transgen de interes es un gen marcador.
  7. 7. La planta transgenica de la reivindicacion 4 o 5, en la que dicho transgen de interes es un gen de interes agronomico, preferentemente dicho gen de interes agronomico es un gen con tolerancia a herbicidas seleccionado de genes que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, dalapon deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, glifosato oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa.
  8. 8. La planta transgenica de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que dicha planta es una monocotiledonea seleccionada de trigo, mafz, centeno, arroz, avena, cebada, cesped, sorgo, mijo y cana de azucar.
  9. 9. La planta transgenica de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que dicha planta es una dicotiledonea seleccionada de tabaco, tomate, patata, soja, algodon, colza, girasol y alfalfa.
  10. 10. Una semilla de dicha planta transgenica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende la construccion de ADN de las reivindicaciones 4 a 7.
  11. 11. Una molecula de polinucleotido aislada que tiene actividad genica reguladora y que
    (i) comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO: 2, o
    (ii) consta de una secuencia polinucleotfdica con al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotfdica de longitud completa de SEQ ID NO: 2 que proporciona expresion en estructuras florales en desarrollo.
  12. 12. Un procedimiento para inhibir el crecimiento de malas hierbas en un campo de plantas de cultivo transgenicas tolerantes a glifosato que comprende:
    (i) plantar las plantas transgenicas transformadas con un casete de expresion que comprende una molecula de polinucleotido que tiene actividad genica reguladora y que comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO: 2 y que esta unida operativamente a una molecula de ADN que codifica un gen de tolerancia a glifosato y
    (ii) aplicar glifosato al campo a un mdice de aplicacion que inhiba el crecimiento de malas hierbas,
    en el que el crecimiento y el rendimiento de la planta de cultivo transgenica no se ven sustancialmente afectados por la aplicacion de glifosato.
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que dicho gen de tolerancia a glifosato se selecciona de un gen que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato, una glifosato oxidorreductasa y una glifosato N-acetil-transferasa.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que
    (i) las plantas transgenicas son capaces de tolerar una tasa de aplicacion de hasta 17,93 kg/ha ; o
    (ii) las plantas transgenicas son capaces de tolerar una tasa de aplicacion que vana de 0,56 a 8,97 kg/ha ; o
    (iii) las plantas transgenicas son capaces de tolerar una tasa de aplicacion que vana de 2,24 a 6,72 kg/ha ; o
    5 (iv) la aplicacion de glifosato se realiza al menos una vez durante el crecimiento del cultivo.
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