ES2638818T3

ES2638818T3 - Una composición que comprende al menos dos compuestos que inducen indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), para el tratamiento de un trastorno autoinmune o rechazo autoinmune de órganos

Info

Publication number: ES2638818T3
Application number: ES11850142.8T
Authority: ES
Inventors: Leif Salford; Hans Olov SJÖGREN; Bengt Widegren
Original assignee: Idogen AB
Current assignee: Idogen AB
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: US9839674B2; EP2654758A1; US20130309198A1; JP6063392B2; US20180028621A1; WO2012087234A1; JP2014500312A; PL2654758T3; EP3238726A2; DK2654758T3; EP3238726A3; EP2654758A4; CA2822745A1; EP2654758B1; US20150182592A1

Abstract

Una composición que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), para su uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad autoinmune o rechazo inmune de trasplantes o células terapéuticamente modificadas por genes, en el que los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de acción, en donde la composición da lugar a un efecto sinérgico sobre el nivel de IDO en comparación con la suma del nivel IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferón gamma, interferón A y gonadotropina coriónica humana.

Description

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DESCRIPCION

Una composicion que comprende al menos dos compuestos que inducen indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), para el tratamiento de un trastorno autoimmune o rechazo autoimmune de organos

Campo de la invencion

La invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3-dioxigenasa, para su uso en el tratamiento de un trastorno autoimmune o enfermedad o rechazo immune de trasplantes o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en donde dichos inductores tienen diferentes mecanismos de accion y en el que la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre los niveles de IDO. La invencion se caracteriza ademas en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invencion

La indolamina dioxigenasa (IDO) degrada el resto indol de triptofano e inicia la produccion de metabolitos neuroactivos e inmunorreguladores, colectivamente conocidos como quinureninas. La expresion funcional de IDO por las celulas dendnticas ha surgido en los ultimos anos como un importante mecanismo detolerancia periferica. La IDO contribuye a la tolerancia materna en el embarazo, el control del rechazo del aloinjerto, y la proteccion contra la autoinmunidad, la patologfa inflamatoria y la alergia. La expresion de IDO tambien sirve a un mecanismo fisiologico por el cual las malignidades inducen tolerancia inmune (Uyttenhove et al., 2004, Mellor et al., 2004, Munn et al., 2004). El amplio espectro de condiciones fisiopatologicas en las que la IDO aparece en funcionamiento sugiere que este sistema supresor esta frecuentemente implicado en la desregulacion fisiologica de las respuestas de las celulas T y las respuestas inflamatorias resultantes. Hay una serie de sustancias conocidas que inducen IDO, en donde dichos compuestos tienen diferentes mecanismos de accion. Ejemplos de clases de tales inductores de IDO, que tienen diferentes mecanismos de accion, son, entre otros, los analogos de citidina, inhibidores de histona desacetilasa, analogos de vitamina D3, interferones, ligandos de receptores tipo toll, hormonas de senalizacion del receptor de gonadotropina, analogos de prostaglandina E2, estabilizadores de IDO, conjugados CTLA4 solubles , y glicocorticoides.

Sin embargo, muchas de estas sustancias aumentan la cantidad de IDO a niveles que son demasiado bajos para ser adecuados en la composicion farmaceutica, y por lo tanto requieren, para inducir niveles efectivos de IDO, dosis altas que no son adecuadas por razones de toxicologfa, cumplimiento o costes. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevas composiciones farmaceuticas que, a niveles de dosis adecuados, puedan aumentar IDO a niveles que sean suficientes y terapeuticamente utiles en el tratamiento de diferentes trastornos autoinmunes y en la prevencion de rechazos de trasplantes.

El documento US2008/108559 describe composiciones y metodos de tratamiento de enfermedades tales como el cancer y los trastornos hematologicos usando un inhibidor de la metilacion del ADN y un inhibidor de la histona desacetilasa.

El documento WO2008/147283 describe el uso de zebularina para aumentar la cantidad de produccion de IDO con el fin de inducir tolerancia inmunologica.

Sumario de la invencion

La invencion se refiere al hallazgo de que los compuestos que, cuando se usan solos, inducen IDO a niveles que no son suficientes en relacion con los regfmenes de tratamiento, podnan usarse en mezclas o combinaciones de compuestos que inducen IDO, y que mezclando diferentes inductores de IDO con un mecanismo de accion diferente, el aumento de IDO era mas que la suma de lo que cada inductor de IDO habna logrado solo, y en algunos casos hasta 100 veces mayor que ese efecto aditivo. Haciendo esta combinacion, sera por primera vez posible producir una composicion farmaceutica que pueda utilizarse para el tratamiento de un mairnfero que lo necesite para una serie de enfermedades y trastornos en los que la induccion de IDO es terapeuticamente util.

En un primer aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), para su uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad autoinmune o rechazo inmune de trasplantes o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en el que uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon Ay gonadotropina corionica humana.

En un segundo aspecto, la invencion se refiere a la composicion descrita anteriormente para su uso en un metodo de tratamiento de un mamffero que tiene un trastorno o enfermedad autoinmune o que sufre de un rechazo inmune de organos, tejidos, celulas normales o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en donde una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha composicion se administra a un paciente y en el que el tratamiento induce IDO.

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En un tercer aspecto de la invencion, se cultivan celulas dendnticas u otras celulas presentadoras de antigeno, por ejemplo a partir de sangre periferica o medula osea del paciente o de otra persona, ex vivo en un medio adecuado. A estas celulas se anaden la composicion inventada descrita anteriormente con el objetivo de inducir la produccion de IDO e inducir la diferenciacion a celulas que tienen una produccion elevada de IDO. Simultaneamente o poco despues, se administrara a las celulas uno o mas antigenos, que estan asociados con la afeccion que se esta tratando (por ejemplo, un autoantigeno responsable de una enfermedad autoinmune), despues de lo cual las celulas se transfieren al paciente. Este tratamiento ex vivo, o transferencia celular adoptiva, como tambien puede llamarse en la bibliograffa cientifica, conducira a una migracion de las celulas transferidas a organos o tejidos donde pueden activar las celulas T para convertirse en celulas T supresoras o para convertirse en celulas T reguladoras espedficas de antigeno. Las celulas transferidas tambien pueden migrar a sitios de inflamacion donde pueden perpetuar localmente las celulas T reguladoras existentes. Por lo tanto, segun este aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion tiene un efecto sinergico sobre el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos es seleccionado de la lista que consiste en interferon gamma, interferon A y gonadotropina corionica humana, para su uso en un metodo de tratamiento de un mairnfero que tiene un trastorno o enfermedad autoinmune o que sufre de rechazo inmune de organos, tejidos, celulas normales o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en donde el tratamiento induce IDO, en el que

i. Una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha composicion se administra ex vivo a celulas derivadas del marnffero tratado o de otro mamffero;

ii. Uno o mas antfgenos asociados con una afeccion que se esta tratando se administran a las celulas; y

iii. Las celulas tratadas se transfieren al mamffero que se esta tratando.

En un cuarto aspecto, la invencion se refiere a un metodo para inducir IDO en un cultivo celular capaz de tener IDO inducido que comprende las etapas de:

(A) proporcionar celulas aisladas en un medio adecuado;

(B) anadir la composicion que comprende al menos dos compuestos cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el nivel de IDO comparado con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usa solo, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon Gamma, interferon Ay gonadotropina corionica humana;

(C) incubar dichas celulas aisladas con la composicion; y

(D) obtener un cultivo celular en el que se induce IDO.

En un quinto aspecto de la invencion, se proporciona un cultivo celular en el que se ha inducido IDO que comprende una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en los que la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usa solo, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon Ay gonadotropina corionica humana.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina e interferon gamma. La escala es logantmica y los valores relativos se dan para cada barra.

Figura 2: Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por interferon gamma y acido valproico. 2A: Acido valproico a 1 mM. 2B: Acido valproico a 0,5 mM.

Figura 3: Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma y acido valproico. El resultado demuestra claramente un efecto sinergico de lastres sustancias sobre la expresion de IDO1 por celulas THP-1.

Figura 4: Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por hCG y zebularina y por hCG e interferon gamma. 4R: Las celulas de la lmea de celulas monoctticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control del medio), expuestas a zebularina sola (100 jM), hCG sola (0,1 unidades/ml) o una combinacion. Los resultados de las celulas THP-1 expuestas a la combinacion demuestran un efecto sinergico. 4B: Resultados obtenidos cuando las celulas no estaban expuestas (control del medio), expuestas a hCG sola (0,01 unidades/ml), interferon gamma solo (200 UI/ml) o una combinacion. Las celulas THP-1 expuestas a la combinacion demostraron un efecto sinergico.

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Figura 5: Cinetica de la expresion de IDO1 despues de la exposicion al interferon gamma durante 24 horas desde el inicio y la exposicion continua a zebularina. El objetivo del estudio fue investigar la cinetica del interferon en combinacion con zebularina. La induccion de IDO1 por el interferon gamma solo fue fuerte despues de 24 horas, pero el efecto no se mantuvo y disminuyo rapidamente. En contraste, cuando se combino con zebularina mantenida durante todo el penodo, el efecto se mantuvo los dfas 2 y 3, aunque a un nivel reducido.

Figura 6: Cinetica de la expresion de IDO1 despues de la exposicion al interferon gamma durante 24 horas despues de diferentes tiempos de preexposicion a zebularina. Cinetica del efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina e interferon gamma. En el panel A se demuestra un bajo efecto de la zebularina despues de cuatro dfas. Interferon gamma solo administrado despues de 3 dfas, 24 horas antes de la cosecha da una banda fuerte y cuando se anade interferon gamma despues de 3 dfas, 24 horas antes de la cosecha de celulas THP-1 expuestas a zebularina, da un efecto mas fuerte, demostrando un efecto sinergico tambien cuando la zebularina precede al interferon con 3 dfas. En el panel B, las celulas THP-1 recibieron zebularina solo durante 5 dfas y se detecto una banda debil. Interferon gamma solo dado despues de 3 dfas y lavado 24 horas mas tarde, mostro una banda debil cuando se probo 24 horas despues de la eliminacion del interferon. Esto esta de acuerdo con los resultados presentados en la Figura 5. La combinacion de zebularina desde el inicio y el interferon gamma dado durante 24 horas despues de tres dfas, dio como resultado un alto nivel de expresion sostenido. En el panel C, las celulas THP- 1 fueron expuestas a zebularina durante 6 dfas y el interferon gamma se administro durante 24 horas despues de cuatro dfas y las celulas se cosecharon despues de un total de 6 dfas. De nuevo, casi no se detecto induccion de IDO1 por el interferon gamma solo, pero con la combinacion se observo una fuerte expresion de IDO1. En el panel D y E, las celulas THP-1 fueron expuestas a zebularina durante 7 dfas y al interferon gamma durante 24 horas, bien despues de tres dfas (panel D) o despues de cuatro dfas (panel E). Una expresion de IDO1 fuerte sostenida por la combinacion se ilustra tanto en el panel D como en el E.

Figura 7: Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina y dos concentraciones de interferon A, 2,5 y 25 ng/ml, respectivamente.

Figura 8. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma e interferon A.

Figura 9. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma y TGF-b1.

Figura 10. Efecto sinergico sostenido sobre la expresion de IDO por zebularina y una exposicion de 24 horas al interferon gamma.

Figura 11. Efecto sinergico sostenido sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma e interferon A.

Figura 12. Efecto sinergico sostenido sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma, interferon A y TGF-beta.

Figura 13. La expresion mejorada de IDO1 en celulas dendnticas derivadas de medula osea de rata (BMDC) despues de una exposicion de 5 dfas a 50 pM de zebularina in vitro y una funcion supresora mejorada, inhibiendo la activacion policlonal de los linfocitos del bazo mezclados in vitro.

Figura 14. Zebularina, inoculada diariamente durante 7 dfas intraperitonealmente en ratas Wistar adultas, induce una expresion aumentada de IDO1 en el bazo y una reactividad de celulas T suprimida frente a la estimulacion policlonal in vitro.

Figura 15. Supresion del rechazo inmunologico de los islotes pancreaticos alotransplantados por debajo de la capsula renal mediante inoculaciones intraperitoneales diarias de zebularina durante 14 dfas en comparacion con los controles no tratados. Seguimiento de glucosa en sangre en ratas de control como una indicacion del rechazo. La figura muestra los resultados de animales de control.

Figura 16. Supresion del rechazo inmunologico de los islotes pancreaticos alotransplantados por debajo de la capsula renal mediante inoculaciones intraperitoneales diarias de zebularina durante 14 dfas en comparacion con los controles no tratados. Seguimiento de glucosa en sangre en ratas tratadas con zebularina como una indicacion del rechazo. La figura muestra los resultados de animales tratados.

Descripcion detallada de la invencion

En el contexto de la presente solicitud e invencion, se aplican las siguientes definiciones:

La expresion "efecto sinergico" pretende significar un aumento en los niveles de IDO, despues del uso de una combinacion de inductores de IDO, que es significativamente mayor que la suma de los niveles de IDO alcanzados con cada uno de los inductores de IDO si se usan solos, soliendose denominar dicha suma "efecto aditivo".

La expresion "mecanismo de accion diferente" se define como diferentes maneras de inducir IDO, a nivel molecular y/o por vfas biologicas mas complejas, algunas de las cuales pueden incluir vfas inmunologicas. En particular, se sabe por la literatura que las diferentes clases de inductores de IDO mostrados en la Tabla 1 a continuacion tienen modos de acciones totalmente o parcialmente diferentes con respecto a su induccion de IDO. Estas diferentes

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clases son analogos de citidina, inhibidores de histona desacetilasa, analogos de la vitamina D3, analogos del interferon gamma, otros interferones, tales como el interferon alfa, ligandos de receptores de tipo toll, hormonas de senalizacion del receptor de gonadotropina, analogos de prostaglandina E2, estabilizadores de IDO, conjugados CTLA4 solubles, TGF-beta y glicocorticoides. Los inductores de IDO de la presente invencion incluyen analogos de citidina, inhibidores de histona desacetilasa, analogos de interferon gamma, otros interferones, tales como interferon alfa, hormonas de senalizacion del receptor de gonadotropina y TGF-beta.

El termino “inmunosupresor” se define en este documento como un efecto que reduce, detiene o mejora el insulto inmunologico y es protector, resucitativo o revivativo para el tejido afectado que ha sufrido el insulto citotoxico a partir de celulas inmunes o de inflamacion.

La expresion “agente inmunosupresor” se define en este documento como el ingrediente activo o la composicion que contiene una dosis de tratamiento de insulto inmune del ingrediente activo eficaz para reducir, prevenir, detener o mejorar el insulto inmunitario y que proporciona proteccion, resucitacion o reactivacion al tejido afectado que ha sufrido el insulto inmuno-mediado o esta en riesgo de ello.

La expresion "dioxigenasa de indolamina (IDO)" pretende significar IDO-1 (indolamina 2,3-dioxigenasa, EC 1.13.11.52). IDO-1 e IDO-2 (indolamina-pirrol 2,3 dioxigenasa-tipo 1, EC 1.13.11.-) son dos protemas diferentes que pueden catabolizar el triptofano. IDO-1 tambien puede catabolizar la serotonina y la melatonina, pero la especificidad del sustrato para IDO-2 no esta tan bien estudiada. Los catabolitos procedentes de la ruta del triptofano son el triptofano, la N-formil-quinurenina, el formilantranilato, el antranilato, la L-quinurenina, el 4-(2-aminofenil) -2,4- dioxibutanoato, el acido quinurenico, la 3-hidroxi-L-quinurenina, 3-hidroxi-antranilato, 3-metoxi-antranilato, 4-(2- amino-3-hidroxi-fenil)-2,4-dioxobutanoato, xanturenato, 8-metoxi-curenato, semialdehndo de 2-amino-3-carboxi- muconato, semialdefndo de 2-aminomuconato, acido quimolmico, cinnavalininato, triptamina, N-metiltriptamina, indolacetato, 2-formamino-benzoilacetato, 5-hidroxi-L-triptofano, 5-hidroxi-N-formilcunerina, 5-hidroxi-cunerina, 4,6- Dihidroxi-cunerenamina, 4,6-dihidroxi-quinolina, serotonina, N-acetil-serotonina, melatonina, 6-hidroxi-melatonina, formil-N-acetil-5-metoxiquinurenamina, N-metilserotonina, formil-5-hidroxi-quinurenamina, 5-Metoxitriptamina, 5- hidroxiindol-acetaldehndo, 5-hidroxiindolacetato, 5-Metoxiindolacetato, o 5-hidroxiindol-acetilglicina para potenciar la actividad inmunosupresora de IDO. Ejemplos son Quinurenina, 3-hidroxi-quinaurenina, acido antramlico, acido 3- hidroxi-antramlico, acido quinolmico y acido picolmico.

La inmunosupresion mediada por IDO esta mediada por la inanicion de triptofano, la induccion de la apoptosis en los linfocitos y la induccion de las celulas T reguladoras (Treg). La induccion de la apoptosis y la induccion de Treg esta mediada por los catabolitos, de donde la adicion de tales catabolitos en combinacion con la induccion de IDO por la composicion de la invencion puede aumentar el efecto clmico. La accion inmunosupresora de IDO puede explicarse por 1) la inanicion de triptofano, 2) el efecto toxico directo de varios de los catabolitos anteriormente mencionados que inducen la apoptosis de las celulas inmunitarias, particularmente L-quinurenina, antranilato, 3-hidroxi-antranilato y 3- hidroxi-L-quinurenina, y/o 3) que algunos de los catabolitos estimulan la diferenciacion de celulas T helper a celulas T reguladoras inmunosupresoras importantes para la tolerancia.

Un analogo es una molecula que difiere en la estructura qrnmica de un compuesto original, por ejemplo un homologo (que difiere por un incremento en la estructura qrnmica, tal como una diferencia en la longitud de una cadena alqmlica), un fragmento molecular, una estructura que difiere de uno o mas grupos funcionales, un cambio en la ionizacion. Los analogos estructurales a menudo se encuentran usando relaciones de actividad de estructura cuantitativa (QSAR), con tecnicas tales como las descritas en Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19a edicion (1995), capttulo 28).

Se sabe que la expresion del gen IDO se induce en las celulas presentadoras de antfgeno. Diferentes subpoblaciones productoras de IDO de celulas dendnticas o macrofagos tienen una expresion variable de las otras enzimas en la ruta del triptofano y por lo tanto se puede anticipar que producen diferentes subconjuntos de catabolitos. Las celulas dendnticas (DC) y, particularmente, las celulas dendnticas plasmocitoides (pDC) son los mediadores mas fuertes de la supresion de las celulas T dependientes de IDO (Fallarino et al., Current Drug Metabolism 8: 209-16, 2007).

La expresion de IDO esta sujeta a una regulacion compleja por una serie de senales, y los niveles de IDO pueden ser inducidos o mantenidos por diferentes mecanismos de accion. Por ejemplo, IDO puede ser inducido por la inhibicion de las ADN metil transferasas o las histona desacetilasas que activan a promotores silenciados de otra manera de IDO. La IDO tambien puede ser inducida por la activacion de NFkB, lo que da como resultado la expresion genica de IDO, siendo inducida dicha activacion de NFkB por diversos factores tales como la senalizacion del interferon gammaR1/gamma R2, la activacion del receptor de tipo toll, etc. Ademas, los inhibidores de las especies oxidativas reactivas (ROS) pueden contribuir a la estabilizacion del IDO, asf como otros mecanismos que estabilizan los niveles existentes de iDo o potencian los efectos del IDO existente o inhiben las vfas que degradan o inactivan el IDO. Otra forma de aumentar o mantener los niveles de IDO deseados es mediante la inhibicion de vfas que estan en la direccion de otros inductores de IDO pero que no conducen a la induccion de IDO, favoreciendo dicha inhibicion la induccion de IDO. Otro mecanismo mas es activando el interferon gamma, y/u otras formas de activar una induccion autocrina de IDO. Estos y otros modos de accion para la induccion de IDO se describen en la Tabla 1.

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La invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce IDO, para su uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad autoimmune o rechazo immune de trasplantes o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en el que los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en los que la composicion da lugar a un efecto sinergico (el "efecto sinergico" se define anteriormente) en el nivel IDO en comparacion con la suma del nivel IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usa solo, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon A y gonadotropina corionica humana. Preferiblemente, tales efectos sinergicos debenan ser significativamente mas altos que el efecto aditivo (el "efecto aditivo" se define anteriormente), por ejemplo, al menos tres veces mas alto. Sin embargo, el efecto sinergico es preferiblemente mas de tres veces superior, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 veces mas alto o incluso mas tal como se muestra en algunos de los ejemplos in vitro presentados a continuacion. Los inductores de IDO pueden seleccionarse del grupo que consiste en analogos de citidina, inhibidores de histona desacetilasa, analogos de vitamina D3, analogos de interferon gamma, otros interferones, ligandos del receptor de tipo toll, hormonas de senalizacion del receptor de gonadotropina, analogos de prostaglandina E2, estabilizadores iDo, conjugados CTLA4 solubles y glicocorticoides. Ejemplos de diferentes inductores son zebularina, acido valproico, gonadotropina corionica humana e interferon gamma. Otros ejemplos son los mencionados en la Tabla 1 a continuacion. En una realizacion de la invencion, la composicion comprende:

i. Zebularina e interferon gamma;

ii. Zebularina, interferon gamma e interferon A;

iii. Zebularina, interferon gamma y acido valproico;

iv. Zebularina, interferon gamma y TGF-beta; o

v. Zebularina, interferon gamma, interferon Ay TGF-beta.

En otra realizacion de la invencion, la composicion comprende zebularina e interferon A.

En otra realizacion de la invencion, la composicion comprende zebularina y gonadotropina corionica humana.

Las composiciones inventadas pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en aclorhidria, leucoencefalitis hemorragica aguda, enfermedad de Addison, alopecia areata, anemia perniciosa, enfermedad de la membrana basal anti-glomerular, smdrome antifosfolfpido, anemia aplastica, alergia atopica, gastritis atrofma autoinmune, perdida auditiva autoinmune, anemia hemolttica autoinmune, hipoparatiroidismo autoinmune, hipofisitis autoinmune, smdrome linfoproliferativo autoinmune, miocarditis autoinmune, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, poliendocrinopatfa-candidiasis-distrofia ectodermica autoinmune, smdrome autoinmune poliglandular Tipo II, smdrome de Behcet, enfermedad celfaca , enfermedad de Chagas, colangitis esclerosante, polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, tiroiditis linfodtica cronica, smdrome de Churg-Strauss, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia, smdrome de Cushing, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetes mellitus (dependiente de insulina), esclerosis cerebral difusa de Schilder, epidermolisis bullosa acquisita,smdrome de Felty, glomerulonefritis membranosa, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, smdrome de Hamman-Rich, hepatitis autoinmune, hepatitis cronica activa, enfermedades inflamatorias del intestino, smdrome miastenico de Lambert-Eaton, uveftis inducida por lentes, Lichus Sclerosus et Atrophicus, lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso sistemico, hepatitis lupus, lupus nefritis, linfopenia, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido mixto conectivo, ulcera de Mooren, smdrome del ganglio linfatico mucocutaneo, esclerosis multiple, miastenia gravis, mielitis transversa, miocarditis, narcolepsia, neuromielitis optica, smdrome vestfbulo ocular auditor, oftalirna simpatica, smdrome de opsoclono-mioclono, pancreatitis, penfigoide ampolloso, penfigo foliaceo, pemfigo vulgaris, poliarteritis nodosa, policondritis recidivante, poliendocrinopatfa autoinmune, polimialgia reumatica, poliradiculoneuropatfa, cirrosis biliar primaria, psoriasis, purpura trombocitopenica idiopatica, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, smdrome de Sjogren, espondilitis anquilosante, el smdrome de persona ngida, enfermedad de Still de inicio adulto, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tirotoxicosis, resistencia a la insulina tipo B, smdrome uveomeningoencefalttico, granulomatosis de Wegener y vitiligo. Entre los ejemplos espedficos de enfermedades se incluyen la artritis reumatoide, la diabetes mellitus tipo I, la psoriasis, el smdrome de Sjogren, la esclerosis multiple, la enfermedad de Crohn, la arteriosclerosis, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrofica y la demencia o en trasplantes para inhibir el rechazo inmune de organos, tejidos, o celulas normales o terapeuticamente modificadas por genes.

En particular, las composiciones de la invencion pueden usarse para el tratamiento de la artritis reumatoide, la diabetes mellitus tipo I, la psoriasis, el smdrome de Sjogren, la esclerosis multiple, la enfermedad de Crohn, la arteriosclerosis, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrofica o la demencia.

La composicion inventada puede comprender ademas un tampon, excipiente, disolvente o vehroulo farmaceuticamente aceptable.

"Farmaceuticamente aceptable" significa un material no toxico que no disminuye la eficacia de la actividad biologica

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de los ingredientes activos. Tales tampones, vefnculos o excipientes farmaceuticamente aceptables son bien conocidos en la tecnica (vease Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edicion, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).

El termino "tampon" pretende significar una solucion acuosa que contiene una mezcla acido-base con el proposito de estabilizar el pH. Ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, acido imidazolelactico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.

El termino "disolvente" pretende significar un lfquido acuoso o no acuoso con el fin de presentar, diluir y/o disolver la composicion. El disolvente puede ser uno o mas de solucion salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cartamo, aceite de mafz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon o aceite de sesamo).

El excipiente puede ser uno o mas de hidratos de carbono, polfmeros, lfpidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se anaden a la composicion, p. ej., para facilitar la liofilizacion. Ejemplos de polfmeros son el almidon, eteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenanos, acido hialuronico y sus derivados, acido poliacnlico, polisulfonato, polietilenglicol/oxido de polietileno, copolfmeros de oxido de polietileno/oxido de polipropileno, poli (alcohol vimlico)/polivinilacetato de diferente grado de hidrolisis y polivinilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, que se anaden a la composicion, por ejemplo, para el control de la viscosidad, para lograr la bioadhesion, para la dilucion o para proteger el lfpido de la degradacion qmmica y proteolftica. Ejemplos de lfpidos son los acidos grasos, fosfolfpidos, mono-, di- y trigliceridos, ceramidas, esfingolfpidos y glicolfpidos, todos de diferente longitud y saturacion de cadena de acilo, lecitina de huevo, lecitina de soja, huevo hidrogenado y lecitina de soja, que se anaden a la composicion por razones similares a las de los polfmeros. Ejemplos de minerales son talco, oxido de magnesio, oxido de zinc y oxido de titanio, que se anaden a la composicion para obtener beneficios tales como la reduccion de la acumulacion de lfquido o propiedades de pigmento ventajosas.

La composicion puede administrarse a un mairnfero que lo necesite en una cantidad adecuada para conseguir un efecto correspondiente a tales concentraciones que inducen una fuerte actividad IDO in vitro de dichos al menos dos inductores.

Al tener un efecto directo sobre el sistema inmunitario, el tratamiento con una dosis adecuada tambien es posible para utilizar la composicion para el pretratamiento de trasplantes (organos, tejidos o celulas) induciendo la expresion de IDO en las celulas endoteliales y como consecuencia haciendolas menos inmunogenicas al huesped y reduciendo el riesgo de rechazo de las celulas injertadas. Mediante el tratamiento subsiguiente de los receptores de injerto con la composicion, a una dosis que proporcione la supresion inmune in vivo, se puede lograr una supervivencia permanente de los trasplantes sin mas terapia inmunosupresora o con un mmimo de tal terapia.

Para tratar a un paciente, la composicion inventada puede administrarse a niveles de dosis que alcanzaran concentraciones in vivo, en los sitios o lugares de accion, que se hagan entre 5 pM a 10 mM, u otros niveles mas bajos o mas altos que sean efectivos, dependiendo de que enfermedad o trastorno se trate y en la que se hace referencia al inductor de IDO. Para los inductores de IDO para los que las concentraciones normalmente no se expresan como concentraciones molares (M), se aplican otros valores numericos, por ejemplo de 0,001 UI/mL a 100 MUI/mL, o intervalos mas estrechos tales como 1-1000 UI/mL u otros niveles adecuados. De forma similar, se aplican otros valores numericos cuando los niveles resultantes se expresan como ng/ml, mg/ml, mg/kg de peso corporal, etc. Inicialmente, se puede usar una dosis mas alta tal como la seguida por una dosis de mantenimiento mas baja. Para el tratamiento ex vivo (transferencia de celulas adoptiva), deben alcanzarse concentraciones similares a las indicadas anteriormente, si bien estas son concentraciones in vitro/ex vivo y no concentraciones in vivo. Las dosis destinadas para cada inductor de IDO tambien dependeran de que otro inductor(es) IDO que actue sinergicamente se use. Ademas, como el numero de inductores de IDO en la composicion inventada y que actua sinergicamente puede ser dos, tres, cuatro o mas, es obvio que se puede definir un numero muy grande de niveles de dosis viables.

La composicion de la invencion puede ser administrada por cualquier via adecuada incluyendo oral, sublingual, bucal, nasal, por inhalacion, parenteral (incluyendo intraperitoneal, intraorgano, subcutanea, intradermica, intramuscular, intraarticular, venosa (central, hepatica o periferica), linfatica, cardiaca, arterial, incluyendo el abordaje cerebral selectivo o superselectivo, perfusion retrograda a traves del sistema venoso cerebral, via cateter en el parenquima cerebral o ventnculos), exposicion directa o bajo presion sobre o a traves del cerebro o tejido espinal o cualquiera de los ventnculos del lfquido cefalorraqrndeo, inyecciones en los espacios subaracnoideo, cerebral cisternal, subdural o epidural, a traves de cisternas cerebrales o puncion lumbar, instilacion intra y periocular incluyendo la aplicacion por inyeccion alrededor del ojo, dentro del globo ocular, sus estructuras y capas, el ofdo, incluyendo la trompa de Eustaquio, celulas de aire mastoides, canales auditivos externos e internos, membrana timpanica, ofdo medio, ofdo interno incluyendo el ganglio espiral coclear y los organos labermticos, asf como via

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enteral, intestinal, rectal, vaginal, uretral o cisterna vesical. Ademas, para las indicaciones in utero y perinatal, las inyecciones en la vasculatura materna, o a traves de o dentro de los organos maternos incluyendo el utero, el cuello del utero y la vagina, y en el embrion, el feto, el neonato y los tejidos y espacios aliados como el saco amniotico, el cordon umbilical, la arteria o venas umbilicales y la placenta. La ruta preferida puede variar dependiendo del estado del paciente y de la composicion utilizada en cada caso.

El efecto de la composicion inventada puede combinarse con un agente inmunosupresor para reducir la frecuencia de las celulas inmunitarias efectoras durante o antes de la induccion de la tolerancia.

Esta invencion incluye la posibilidad de utilizar el tiempo y la secuencia de suministro de la composicion inventada para inducir la tolerancia de una manera optima. Tambien incluye la posibilidad de utilizar el tiempo y secuencia de suministro de los inductores IDO individuales, que comprende la composicion inventada, para inducir la tolerancia de una manera optima. Por ejemplo, cuando la composicion inventada comprende dos inductores de IDO (“A” y “B”), se puede administrar primero A mediante una determinada via de administracion y regimen de dosificacion (dosis, concentraciones, frecuencia, etc.). A continuacion, B se administrara en otra ruta, dosis y regimen de dosificacion. Finalmente, uno de A o B puede ser detenido antes que el otro. Se puede prever un gran numero de tales regfmenes de tratamiento diferentes y sinergicos para las diversas combinaciones inventadas, cada uno teniendo en cuenta la inductancia IDO de cada inductor de IDO, la cinetica de expresion genica, la farmacocinetica, etc.

La composicion puede comprender ingredientes activos adicionales tales como metotrexato, rapamicina, ciclofosfamida, antimetabolitos incluyendo azatioprina, inhibidores de la smtesis de nucleotidos (incluyendo micofenolato de mofetilo, mizoribina, leflunomida, FK778), FTY720, anticuerpos que agotan los linfocitos (incluyendo anticuerpos policlonales a linfocitos, timocitos, celulas T, muromonab-CD3, rituximab, alemtuzumab, CAMPATH-1), anticuerpos anti-TNF (incluyendo infliximab, adalimumab), natalizumab (anti-VLA-4), anticuerpos anti-CD154 BG9588 e IDEC 131), receptores de citoquinas solubles (incluyendo lenercept y etanercept (receptores TNF p55 y TNF p75 solubles) y anakinra (IL-1RA soluble). Los farmacos inmunosupresores mencionados anteriormente pueden usarse en combinacion con la composicion de la invencion para reducir el numero de celulas efectoras inmunes.

La composicion se puede distribuir y poner a disposicion en formas de dosificacion unitarias convenientes tales como capsulas y ampollas y puede fabricarse y distribuirse por cualquiera de los metodos conocidos en las tecnicas farmaceuticas. Ademas del ingrediente activo, la composicion puede contener tambien otros agentes habituales de la tecnica relacionados con el tipo de composicion producida. Esto puede tomar, por ejemplo, la configuracion de suspensiones, soluciones y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes lipfdicos, no acuosos o acuosos, disolventes, agentes disolventes, emulsionantes, jarabes, granulados o polvos, o mezclas de los mismos. La composicion tambien puede contener agentes colorantes, conservantes, perfumes, adiciones aromatizantes y agentes edulcorantes. Ademas del ingrediente activo, la composicion puede contener tambien otros medicamentos farmaceuticamente activos. La fabricacion y distribucion de la composicion se lleva a cabo por tecnicas conocidas en la tecnica, tales como, unir uniformemente e mtimamente el ingrediente activo con lfquidos o solidos finos o ambos, y luego, si es necesario, formar la composicion en una forma de unidad de dosis. La dosis discreta, la porcion y el vetuculo portador que constituyen la composicion se adaptaran generalmente en virtud de su forma o embalaje para administracion medica y se distribuiran para este fin.

Los comprimidos se pueden fabricar y distribuir por compresion o molde, a partir del ingrediente activo posiblemente con uno o mas compuestos farmaceuticamente activos adicionales. Las tabletas comprimidas se pueden fabricar y distribuir, por compresion en una maquina tfpica de la tecnica, de una cantidad conocida del ingrediente activo en una configuracion dispersable tal como polvo o granulos, posiblemente mezclada con otros agentes incluyendo aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes, conservantes y agentes dispersantes . Las tabletas moldeadas pueden fabricarse y distribuirse moldeando en una maquina tfpica de la tecnica una mezcla de cantidad conocida de compuestos farmaceuticamente activos de adicion de ingrediente activo y otros aditivos humedecidos con un diluyente lfquido. Las tabletas pueden estar revestidas, envueltas o cubiertas, con sustancias que incluyen matrices protectoras, que pueden contener opacificantes o edulcorantes y pueden formularse para permitir una liberacion lenta o controlada o tambien liberar dentro de una cierta parte del sistema digestivo de los ingredientes activos contenidos. Las capsulas pueden fabricarse y distribuirse mediante la colocacion de una cantidad conocida de ingrediente activo, compuestos farmaceuticamente activos adicionales y aditivos dentro de una capsula de gelatina u otra sustancia disolvible acuosa de dos partes o sellada. El ingrediente activo tambien se puede fabricar y distribuir como una composicion en formas microencapsuladas, microsomicas, micelares y microemulsiones.

Las composiciones que contienen los ingredientes activos aceptables para la administracion topica oral pueden fabricarse y distribuirse como pastillas que contienen los ingredientes activos, otros compuestos farmaceuticamente activos y aditivos en una base aromatizada, tales como acacia y tragacanto; como pastillas que contienen el ingrediente activo con otros compuestos farmaceuticamente activos y aditivos en una base inerte tales como gelatina y sacarosa: enjuagues bucales o enjuagues que contienen el ingrediente activo con otros compuestos farmaceuticamente activos y aditivos en un lfquido aceptable.

La composicion que contiene el ingrediente activo aceptable para la administracion topica de la piel puede fabricarse y distribuirse como unguentos, aceites, cremas, lociones, geles, pastas y como parches transdermicos que contienen el ingrediente activo, otros compuestos farmaceuticamente activos, aditivos y un medio portador

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aceptable.

Las composiciones que contienen el ingrediente activo aceptable para la administracion nasal pueden fabricarse y distribuirse con otros compuestos y aditivos farmaceuticamente activos como un polvo para la inhalacion, o como un Kquido oleoso, acuoso o no acuoso para la pulverizacion nasal o gotas.

Las composiciones que contienen el ingrediente activo aceptable para la administracion rectal pueden fabricarse y distribuirse como supositorios, cremas, espumas, duchas o enemas con otros compuestos farmaceuticamente activos, bases adecuadas de los diluyentes, grasas y aditivos habituales solubles en agua conocidos por los profesionales de la tecnica.

La composicion que contiene el ingrediente activo aceptable para la administracion vaginal puede fabricarse y distribuirse como pesarios, supositorios, cremas, geles, espumas, duchas o pulverizaciones con otros compuestos farmaceuticamente activos, bases adecuadas y aditivos conocidos por los expertos en la tecnica.

La composicion que contiene el ingrediente activo aceptable para la administracion parenteral puede fabricarse y distribuirse a partir de soluciones inyectables esteriles acuosas y no acuosas, otros compuestos farmaceuticamente activos, aditivos incluyendo antioxidantes, bacteriostaticos y solutos y azucares tales como manitol para hacer la composicion isotonica, hipotonica o hipertonica con la sangre del receptor; y tambien suspensiones acuosas y no acuosas esteriles que pueden incluir suspensiones y espesantes. La composicion puede fabricarse y distribuirse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas de vidrio o plastico selladas, viales, botellas y bolsas como lfquido, y en estado seco requiriendo solamente la adicion de lfquido esteril, por ejemplo agua, soluciones salinas o dextrosa, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones extemporaneas para inyeccion se pueden preparar a partir de polvos y tabletas del tipo anteriormente descrito.

La composicion que contiene el ingrediente activo aceptable para la administracion al cerebro y estructuras relacionadas, la medula espinal y estructuras relacionadas, el sistema ventricular y los espacios de lfquido cefalorraqrndeo pueden ser fabricados y distribuidos como soluciones de inyeccion esteriles acuosas y no acuosas, que contienen otros compuestos farmaceuticamente activos, aditivos que incluyen antioxidantes, bacteriostaticos y solutos y azucares tales como manitol para hacer la composicion isotonica, hipotonica o hipertonica con el lfquido cefalorraqrndeo; y tambien suspensiones acuosas y no acuosas esteriles que pueden incluir suspensiones y espesantes. La composicion puede fabricarse y distribuirse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas de vidrio o plastico selladas, viales, botellas y bolsas como lfquido, y en estado seco requiriendo solamente la adicion de lfquido esteril, por ejemplo agua, soluciones salinas o dextrosa, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones extemporaneas para inyeccion se pueden preparar a partir de polvos y tabletas del tipo anteriormente descrito.

Las dosis unitarias deseadas de composiciones son aquellas que contienen una dosis diaria o una dosis de tratamiento con insulto inmunologico o una fraccion apropiada de la misma, del ingrediente activo administrado. Las formas de dosis unitarias de la invencion tambien pueden incluir sistemas mas complejos tales como jeringas de doble canon, jeringas con compartimentos secuenciales, uno de los cuales puede contener el ingrediente activo, y el otro cualquier diluyente o vehuculo necesario. Los agentes en las jeringas senan liberados secuencialmente o como una mezcla o combinacion de los dos despues de la activacion del embolo de la jeringa. Tales sistemas son conocidos en la tecnica.

La composicion puede usarse para el tratamiento de una enfermedad o trastorno tal como los mencionados anteriormente.

Tabla 1. Once clases de sustancias inductoras de IDO

Clase: Ejemplos de sustancias en la clase Otras sustancias de la clase Mecanismo de accion para la induccion de IDO

Analogos de la citidina: Zebularina, desoxiazacitidina, azacitidina Otros derivados de zebularina y analogos de citidina 5- metilcitidina, 2'-desoxiebularina, 5-fluoro-zebularina, 5-fluoro-2'- dexiebularina, 5-cloro-zebularina, 5-cloro-2'-dexiebularina, 5-bromo- zebularina , 5-bromo-2'- dexiebularina, 5-yodo-zebularina, 5-yodo-2'-dexiebularina, 5- metilpirimidin-2-ona, 5-Me-2'- desoxicebularina, o mono, di- o trifosfatos de los mismos La inhibicion de la ADN- metil transferasa, activando los promotores silenciados de IDO-1, y posiblemente de FoxP3 e interferon gamma

Inhibidores de la histona desacetilasa: Acido valproico, tricostatina A, vorinostat (SAHA) Otros acidos hidroxamicos, tetrapeptidos dclicos (trapoxina B) y depsipeptidos, benzamidas, cetonas electrofflicas, fenilbutirato, belinostat (PXD 101), LAQ824, panobinostat (LBH589), CI994, mocetinostat (MGCD0103) La inhibicion de la histona desacetilasa, activando los promotores silenciados de IDO-1 y posiblemente de FoxP3 e interferon gamma

Analogos de la vitamina D3: Calcitriol (1,25 (OH^Da) Dihidrotaquisterol, alfacalcidol, calcitriol, paricalcitol 1,25(OH)2Da inhibe Th1 (IL2, IFNg) y Th17 e inhibe la produccion de IL12, todo lo cual tiene lugar al menos parcialmente a traves de la induccion de IDO

Interferon gamma analogos *: Interferon gamma Los analogos de interferon gamma, inductores de IFN-g (IL12, IL18, mAb 4-1BB) La senalizacion interferon gammaR1/gamma R2 indujo la activacion de NFkB que da como resultado la expresion genica IDO

Otros interferones: Interferon A, interferon B1, interferon-tau El interferon W1, el interferon K, El receptor de interferon indujo la activacion de NFkB que resulta en la expresion del gen IDO

Los ligandos del receptor tipo Toll (TLR): Oligonucleotidos de ADN que contienen CpG (por ejemplo, ODN 1826 y 2006), lipopolisacaridos Otros motivos CpG no metilados, ARN de doble hebra, ARN de cadena sencilla, ADN de cadena doble no metilado CpG. La activacion de NFkB activada por TLR da como resultado la expresion genica de IDO

hormonas de senalizacion del receptor de gonadotropina: La gonadotropina corionica humana recombinante (rhCG), la prolactina La hormona luteinizante (LH) Senalizacion del receptor de gonadotropina, que resulta en la expresion del gen IDO

Analogos de prostaglandinas E2: Prostaglandina E2 (PGE2) Otros analogos de prostaglandinas E2, p. ej., ester metilico de (R)-15-metil-PGE2, ester metflico de (S)-15-metil- PGE 2 senalizacion de PGE2- receptor , lo que resulta en la expresion del gen IDO

Estabilizadores IDO: TGF-beta, Interleucina-10 TGF-beta 1: 2, 1: 3 y 2: 3, GDNF, BMPs Inhibidores de las Especies Oxidativas Reactivas (ROS), estabilizando asf la IDO. Asf como otros mecanismos de estabilizacion IDO o efecto IDO

Conjugados CTLA4 solubles: CTLA4-Ig (abatacept/Orencia®) Otros conjugados solubles de CTLA4 La union a CD80/86 activando interferon gamma, con una induccion autocrina de IDO

Glicocorticoides: Dexametasona Otros analogos de glicocorticoides La induccion del ligando GITR en celulas dendnticas y la regulacion positiva de GITR en celulas T mejoran

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: la senalizacion inversa en DC a traves de GITRL que induce expresion de IDO.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina e interferon gamma Materiales y metodos

THP-1 (ATCC: TIB-202) es una lmea celular monodtica humana que se origina de una leucemia monodtica aguda. Tiene el fenotipo de monocitos pero puede diferenciarse a un fenotipo mas dendntico. En el presente estudio, las celulas THP-1 fueron pasadas in vitro en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 5% o 10%, Hepes 10 mM, piruvato sodico 1 mM y gentamicina 50 pg/ml (medio R5 o R10 respectivamente). La densidad celular se ajusto a 200.000 celulas por ml y los cultivos se incubaron durante cuatro a siete dfas a 37°C con CO2 al 10% en una incubadora humidificada. La sustancia, o combinacion de sustancias, que se esta estudiando, se anadieron al medio en los puntos de tiempo especificados y en el caso de IFN-gamma se elimino del medio como se indica. 96-168 horas despues del inicio del tratamiento, la expresion de IDO se evaluo por PCR o por PCR cuantitativa (Roche). El ARN se extrajo de las celulas cultivadas en matraces o placas de seis pocillos usando reactivo de Trizol segun el protocolo de Invitrogen. El ADN residual se elimino mediante tratamiento con DNasa libre de Rnasa (Roche Applied Science). La calidad y cantidad del ARN aislado se midio por espectrofotometro y electroforesis en gel.

La expresion genica se demostro utilizando PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando el kit (Superscript RT- PCR de un solo paso con Platinum Taq, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones. Las secuencias de cebadores directos y cebadores inversos para el gen IDO-1 humano analizado y el gen de mantenimiento HPRT, respectivamente, fueron: IDO-1 directo: 5'-GGCAAACTGGAAGAAAAAGG-3', inverso: 5'-CAGACAAATATA TGCGAAGAAC; HPRT directo: 5'-CAAGCTTGCTGGTGAAAAGGA-3', HPRT inverso: 5'-

ACTAAGCAGATGGCCACAGAA-3'. Las condiciones de PCR se establecieron de la siguiente manera: 1 ciclo de desnaturalizacion a 94°C durante 2 min seguido por 40 ciclos (para el IDO-1) o 30 ciclos (para el HPRT) a 94°C durante 15 s, 53°C durante 30°C S y 72°C durante 30 s con una reaccion de extension final a 72°C durante 5 min.

Los analisis de la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizaron utilizando el kit Superscript III platino de dos pasos qRT-PCR con SYBR Green (Invitrogen). Se utilizo un total de 100-500 ng de ARN total en una reaccion de 20 pl de RT utilizando una mezcla de cebadores polydT y hexameros aleatorios. El cDNA obtenido se diluyo hasta un volumen total de 80 pl y se almaceno a -20°C. Las secuencias de cebadores para los diferentes genes se disenaron utilizando el soporte de software Gene Fisher (G. Giegerich, F. Meyer, C. Schleiermacher, ISMB-96). Los cebadores utilizados para la amplificacion del gen IDO fueron: directo: 5'- AGTCCGTGAGTTTGTCCTTTCAA-3', secuencias de cebador, inverso: TtTCACA-CAGGCGTCATAAGCT-3'.

Hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HPRT) HPRT directo: 5'-CAAGCTTGCTGGTGAAAAGGA-3', HPRT inverso: 5'-ACTAAGCAGATGGCCACAGAA-3' segun la secuencia de cDNA. La qRT-PCR se realizo en 20 pl de reaccion que constaba de 2 pl de ADNc diluido (12,5 ng), 0,3 pM de cada cebador, 1 pl de albumina de suero bovino (50 pg/ml) y 10 pl de Platino SYBR Verde qRT-PCR superMix-UDG . La amplificacion de IDO se llevo a cabo en un Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals) con el siguiente perfil termico: Platino SYBR Verde qRT-PCR superMix- UDG incubacion a 50°C durante 2 min, luego desnaturalizacion a 95°C durante 5 min, seguido de 45 ciclos a 94°C durante 2 s, 58°C durante 10 s, y 72°C durante 14 s. La amplificacion de HPRT se llevo a cabo como sigue, incubacion con UDG a 50°C durante 2 min, desnaturalizacion a 95°C durante 5 min, seguido de 45 ciclos a 94°C durante 2 s, 55°C durante 10 s y 72°C durante 14 s. Despues de la amplificacion se realizo un analisis de la curva de fusion. Los experimentos de qRT-PCR se realizaron siempre portriplicado.

Resultados y discusion

Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), o expuestas a zebularina (Berry & Associates, Inc. EE.UU.) solo, o interferon gamma IFNg, Sigma) solo a diferentes concentraciones (Figura 1). Las celulas tambien fueron expuestas a 100 pM de zebularina en combinacion con diversas concentraciones de interferon gamma. La escala es logantmica y los valores relativos se dan para cada barra. Es sorprendente que, por ejemplo, la zebularina sola a 100 pM diera un valor de 9 y 200 UI/ml de interferon gamma diera un valor de 80. La suma de estos valores es 89, mientras que cuando ambos se dan juntos la expresion de IDO1 alcanzo un valor por encima de 37.000. Esto demuestra la induccion sinergica de la expresion de IDO-1 en celulas THP-1 por las dos sustancias.

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Ejemplo 2. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por interferon gamma y acido valproico

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monocfticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control del medio), expuestas a interferon gamma solo (200 Ul/ml), acido valproico (Sigma) solo (1 mM) o a la combinacion (Figura 2A). Los resultados de las celulas THP-1 expuestas a la combinacion demuestran un efecto sinergico. Experimentos similares pero con la concentracion de acido valproico reducida a 0,5 mM tambien se realizaron (Figura 2B). Tambien se demostro un efecto sinergico sobre la expresion de IDO1 con esta combinacion.

Ejemplo 3. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma y acido valproico

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea celular monocftica humana THP-1 no estaban expuestas (control del medio), expuestas a zebularina sola (100 |jM), al interferon gamma solo (200 Ul/ml) o acido valproico solo (1 mM) (figura 3). Las celulas THP-1 fueron expuestas a las tres sustancias por parejas y tambien con las tres sustancias en combinacion. La escala es logarftmica y los valores relativos se dan para cada barra. El resultado demuestra claramente un efecto sinergico de las tres sustancias sobre la expresion de IDO1 en celulas THP-1.

Ejemplo 4. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por gonadotropina corionica humana (hCG) y zebularina, y por hCG e interferon gamma

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea celular monocftica humana THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a zebularina sola (100 jM), hCG (Pregnyl, Suecia) sola (0,1 unidades/ml), o una combinacion (Figura 4A). Los resultados de las celulas THP-1 expuestas a la combinacion demuestran un efecto sinergico. La Figura 4B muestra los resultados cuando las celulas no estan expuestas (control del medio), se exponen a hCG sola (0,01 unidades/ml), inteferon gamma solo (200 Ul/ml) o una combinacion. La combinacion demuestra un efecto sinergico sobre la expresion de IDO1 en celulas THP-1.

Ejemplo 5. Cinetica de la expresion de IDO1 despues de la exposicion al interferon gamma durante 24 horas desde el inicio y la exposicion continua a zebularina

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea celular monocftica humana THP-1 se expusieron a zebularina sola (100 jM), interferon gamma (200 Ul/ml) solo

0 las dos sustancias en combinacion (Figura 5). El objetivo del estudio fue investigar la cinetica del interferon en combinacion con zebularina. Las celulas THP-1 se dividieron en cuatro grupos, uno expuesto a interferon gamma solo durante 24 horas, otro a zebularina solo durante todo el periodo de incubacion y un tercer grupo expuesto a interferon gamma durante las 24 horas iniciales en combinacion con zebularina para el penodo de incubacion completo. Las celulas THP-1 se lavaron despues de 24 horas y se sustituyo la zebularina. Los cuatro grupos de celulas THP-1 se recogieron para el aislamiento de ARN despues de 24, 48, 72 o 96 horas. La exposicion de 24 horas a la zebularina sola no proporciono induccion de IDO1. Despues de 96 horas se detecto un pequeno incremento en la induccion de lDO1 por zebularina. La induccion de lDO1 por el interferon gamma solo fue fuerte despues de 24 horas, pero el efecto no se mantuvo y disminuyo rapidamente. En contraste, cuando se combino con zebularina mantenida durante todo el penodo, el efecto se mantuvo a los dfas 2 y 3, aunque a un nivel reducido.

Ejemplo 6. Cinetica de la expresion de IDO1 despues de la exposicion al interferon gamma durante 24 horas despues de diferentes tiempos de preexposicion a zebularina

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. La Figura 6 demuestra la cinetica del efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina e interferon gamma. En el panel A se demuestra por la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) un bajo efecto de zebularina despues de cuatro dfas. El interferon gamma solo administrado despues de 3 dfas, 24 horas antes de la cosecha da una banda fuerte y cuando se anade interferon gamma despues de 3 dfas, 24 horas antes de la cosecha de celulas THP-1 expuestas a zebularina, da un efecto mas fuerte, demostrando un efecto sinergico tambien cuando la zebularina precede al interferon con 3 dfas. En el panel B, las celulas THP-1 recibieron zebularina sola durante 5 dfas y se detecto una banda debil. El interferon gamma solo dado despues de 3 dfas y lavado 24 horas mas tarde, mostro una banda debil cuando se probo 24 horas despues de la eliminacion del interferon. Esto esta de acuerdo con los resultados presentados en la figura 5. La combinacion de zebularina desde el inicio y el interferon gamma dado durante 24 horas despues de tres dfas, dio como resultado un alto nivel de expresion sostenido. En el panel C, las celulas THP-

1 fueron expuestas a zebularina durante 6 dfas y el interferon gamma se administro durante 24 horas despues de cuatro dfas y las celulas se cosecharon despues de un total de 6 dfas. De nuevo, casi no se detecto induccion de IDO1 por el interferon gamma solo, pero con la combinacion se observo una fuerte expresion de IDO1. En el panel D y E, las celulas THP-1 fueron expuestas a zebularina durante 7 dfas y a interferon gamma durante 24 horas, bien despues de tres dfas (panel D) o despues de cuatro dfas (panel E). Una fuerte expresion IDO1 mantenida por la combinacion se ilustra en el panel D y E. Como un control de ARN se ha utilizado HPRT.

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Ejemplo 7. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina e interferon A

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. EE.UU.) solo, o al interferon A (interferon alfa, IFN-A, Sigma) solo a dos concentraciones diferentes, 2,5 y 25 ng/ml (Figura 7). Las celulas tambien fueron expuestas a 100 pM de zebularina en combinacion con IFN-A en las mismas dos concentraciones. La zebularina estuvo presente durante toda la incubacion, mientras que se anadio IFN-A despues de 96 h y se aislo el ARN despues de 120 h. La suma de las expresiones de IDO1 inducidas por zebularina sola e IFN-A solo es de 3,1 y 4,7, respectivamente, para las dosis mas bajas y mas altas de IFN-a, pero para el tratamiento combinado 6,0 y 16,1 a los dos niveles de dosis de IFN-A. Esto demuestra la induccion sinergica de la expresion de IDO1 por las dos sustancias.

Ejemplo 8. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma e interferon A

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. USA), o solo a interferon alfa (IFN-A, Sigma) de 2,5 ng/ml solo o a 50 pg/ml de interferon gamma (IFN-g) solo, y a ambos IFN-g e IFN-A, o finalmente a una combinacion de las tres sustancias (Figura 8). El tratamiento combinado con IFN-g e IFN-A se realizo anadiendo IFN-g al medio en el instante 0 y reemplazando este medio a las 72 h por medio que contema IFN-A y a las 96 h reemplazando este medio con medio sin aditivos. El tratamiento con una combinacion de las tres sustancias se realizo mediante la inclusion de zebularina y IFN-g en medio en el intervalo 0-72 h, reemplazandolo con medio que contema IFN-A y zebularina, y despues de otras 24 h este medio fue reemplazado por medio que contema zebularina sola. Los tratamientos con sustancias singulares se realizaron en los mismos intervalos y al final del intervalo se sustituyo el medio por medio sin aditivos. La combinacion de las tres sustancias induce un fuerte efecto sinergico sobre la expresion de IDO1. El fuerte efecto sinergico se observa 48 h despues de la eliminacion de IFN-g y 24 h despues de la eliminacion de IFN-A, lo que indica un efecto sinergico sostenido en la expresion de IDO1.

Ejemplo 9. Efecto sinergico sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma y TGF-beta

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. EE.UU.) solo o hasta 20 ng/ml de factor de crecimiento tumoral beta 1 (TGF-b1) (Sigma) solo, o a 100 pg/ml de interferon gamma (IFN-g) o a una combinacion de IFN-g y TGF- B1 o a una combinacion de zebularina e IFN-g, o a una combinacion de las tres sustancias, zebularina, IFN-g y TGF-b1. El tratamiento de combinacion con IFN-g y TGF-b1 se realizo anadiendo IFN-g al medio 72 h despues del inicio del cultivo y reemplazando el medio 24 h despues con un medio que contema TGF-b1. El tratamiento combinado con zebularina e IFN-g se realizo incluyendo zebularina en medio desde el inicio del cultivo, despues de 72 h anadiendo IFN-g y 24 h despues reemplazando el medio con medio que contema zebularina. El tratamiento combinado con las tres sustancias se realizo anadiendo zebularina desde el inicio del cultivo, anadiendo IFN-g despues de 72 h, y despues de otras 24 h reemplazando el medio con medio que contema zebularina y TGF-b1. Los tratamientos con sustancias singulares se realizaron en los mismos intervalos y al final del intervalo se sustituyo el medio por medio sin aditivos. La combinacion de las tres sustancias induce un fuerte efecto sinergico sobre la expresion de IDO1, significativamente mas fuerte que la zebularina y el IFN-g juntos o cada uno de ellos (Figura 9). Por el contrario, TGF-b1, en ausencia de zebularina, reduce el efecto de IFN-g. El fuerte efecto sinergico se observa 24 h despues de la eliminacion de IFN-g, lo que indica un efecto sinergico sostenido en la expresion de IDO1.

Ejemplo 10. Efecto sinergico sostenido sobre la expresion de IDO por zebularina y una exposicion de 24h al interferon gamma

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. USA) solo durante todo el periodo de cultivo, o hasta 200 pl/ml de interferon gamma (IFN-g, Sigma) solo durante 24 h (dfa 4 de cultivo) despues de lo cual el medio de cultivo se reemplazo con medio sin aditivos, o a una combinacion de 100 pM de zebularina durante todo el penodo de cultivo e IFN-g durante 24 h al dfa 4 de cultivo, despues de lo cual el medio de cultivo se reemplazo por medio que contema zebularina sola (Figura 10). El ARN se aislo despues de 10, 12 o 14 dfas de cultivo y se analizo la expresion de IDO1. Aunque la expresion inducida por la exposicion al interferon gamma de 24 h solo es inicialmente fuerte, es minima en los puntos de tiempo estudiados. Por el contrario, el efecto sinergico cuando se combino con zebularina se mantuvo durante al menos 10 dfas despues de la eliminacion del interferon gamma, siendo demostrable todavfa en el dfa 14. Esto demuestra que la IDO1 inducida sinergicamente se mantiene durante mucho tiempo incluso cuando la exposicion al interferon gamma es relativamente corta y los propios efectos del interferon gamma han desaparecido desde hace mucho tiempo.

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Ejemplo 11. Efecto sinergico sostenido sobre la expresion de IDO por zebularina, interferon gamma e interferon A

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. EE.UU.) solo durante todo el periodo de cultivo, o a 100 pl/ml de interferon gamma (IFN-g, Sigma) solo durante 24 h (dfa 4 de cultivo) o al interferon A (IFN-A, Sigma) despues de cuyo cultivo, el medio se sustituyo por un medio sin aditivos. Otras muestras de celulas se expusieron a una combinacion de 100 pM de zebularina durante todo el penodo de cultivo de 168 hya IFN-g e IFN-A durante 24 h al dfa 4 de cultivo, despues de lo cual el medio de cultivo se reemplazo por medio que contema zebularina sola (Figura 11). El ARN se aislo despues de 168 h de cultivo y se analizo la expresion de IDO1. Aunque la expresion inducida por la exposicion de 24 h de IFN-g o IFN-A sola es inicialmente fuerte, es minima en los puntos de tiempo estudiados. En contraste, el efecto sinergico cuando se combino con zebularina se mantuvo durante 72 dfas despues de la eliminacion del IFN-g e IFN-A. Esto demuestra que la expresion fuerte de IDO1 inducida sinergicamente se mantiene durante mucho tiempo incluso cuando la exposicion a IFN-g e IFN-A es relativamente corta y los propios efectos de IFN-g e IFN-A han desaparecido desde hace mucho tiempo.

Ejemplo 12. La expresion de IDO sinergica sostenida por tratamiento combinado con zebularina, interferon gamma, interferon A y TGF-beta

Los materiales y metodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las celulas de la lmea de celulas monodticas humanas THP-1 no estaban expuestas (control de medio), expuestas a 100 pM de zebularina (Berry & Associates, Inc. USA) solo durante todo el periodo de cultivo, o bien a 100 pg/ml de interferon gamma (IFN-g, Sigma) solo o a 25 ng/ml de interferon A solo, o a 20 ng/ml de TGF-beta (TGG-b, Sigma) solo durante 24 h (dfa 4 de cultivo), despues de lo cual se reemplazo el medio de cultivo por medio sin aditivos. Otras muestras de celulas se expusieron a una combinacion de 100 pM de zebularina durante todo el periodo de cultivo de 168 h y al IFN-g, IFN-A y TGF-b durante 24 h al dfa 4 de cultivo, despues de lo cual el medio de cultivo fue reemplazado por medio que contema solo zebularina (Figura 12). El ARN se aislo despues de 168 h de cultivo y se analizo la expresion de IDO1. Aunque la expresion inducida por la exposicion de 24 h de IFN-g o IFN-A sola es inicialmente fuerte, es minima en los puntos de tiempo estudiados. En contraste, el efecto sinergico de las 4 sustancias cuando se combinaron con zebularina se mantuvo durante 72 dfas despues de la eliminacion de IFN-g e IFN-A. Esto demuestra que la expresion fuerte de IDO1 inducida sinergicamente se mantiene durante mucho tiempo incluso cuando la exposicion a IFN-g e IFN-A y TGF-b es relativamente corta y los propios efectos de IFN-g e IFN-A han desaparecido desde hace mucho tiempo .

Ejemplo 13. Expresion mejorada de IDO en celulas dendriticas derivadas de medula osea (BMDC) de rata despues de la exposicion a zebularina in vitro y una funcion supresora mejorada, que inhibe la reactividad inmune de los linfocitos del bazo mezclados

Se cosecharon celulas de la medula osea de los femures de ratas y se cultivaron mediante tecnicas in vitro en presencia de las citoquinas IL-4 (5 ng/ml) y GM-CSF (5 ng/ml) para apoyar la diferenciacion en celulas dendnticas (BMDC). El dfa 7 del cultivo, el medio fue reemplazado por medio que contema solo GM-CSF. Algunas de las BMDC fueron expuestas a zebularina 50 pM durante los dfas 5-10 de cultivo y las celulas de control se quedaron sin este tratamiento adicional. La expresion de IDO1 por celulas tratadas con control y zebularina se analizo (Figura 13a). El resultado demuestra que la exposicion a zebularina aumenta la expresion de IDO1 por encima del nivel expresado por las BMDC de control inmaduro. Los mismos dos tipos de celulas tambien se ensayaron en cuanto a su capacidad para suprimir la respuesta inmune proliferativa de las celulas T CD4+ y CD8+ del bazo, respectivamente, de la misma cepa endocrina de ratas Fischer 344 tras la estimulacion con el estimulador fuerte anti-CD3 unido al fondo de los pozos del cultivo. La proliferacion se analizo en FACS por la tecnica CFSE y los anticuerpos monoclonales que reconocen a los creadores de CD4 y CD8. La adicion de BMDC tratadas con zebularina en una proporcion de 1:30 a cultivos de celulas de bazo demostro un efecto supresor significativamente mas fuerte frente a la respuesta proliferativa que las BMDC de control ensayadas en paralelo, tanto para celulas T CD4+ como para CD8+ (Figura 13b). Esto demuestra que la exposicion de BMDC a zebularina in vitro esta induciendo una expresion mas fuerte de IDO1, y que estos BMDC tambien tienen un efecto supresor mas fuerte en la respuesta de celulas T que las BMDC no expuestas a zebularina.

Ejemplo 14. La zebularina, inoculada diariamente durante 7 dias intraperitonealmente en ratas adultas, induce una expresion aumentada de IDO en el bazo y una reactividad de celulas T de bazo suprimida frente a la estimulacion inmune in vitro

Un grupo de ratas Wistar recibio inoculaciones diarias intraperitoneales de zebularina (225 mg/kg/dfa) durante 7 dfas y un grupo control paralelo recibio inoculaciones diarias por via intraperitoneal de PBS. Se aislo ARN de los bazos y se analizo la expresion de IDO1 mediante la tecnica de RT-PCR cuantitativa. Los resultados demuestran que el tratamiento sistemico con zebularina in vivo induce una mayor expresion de IDO1 en celulas de bazo (Figura 14a). Ademas, se recogieron celulas de bazo de ambos grupos despues de la ultima dosis de zebularina y se ensayo su reactividad proliferativa para celulas T frente a la estimulacion policlonal con anticuerpos anti-CD3. La proliferacion se analizo en FACS por la tecnica CFSE y anticuerpos monoclonales anti-CD4 y CD8 de rata (Figura 14b). La

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respuesta proliferativa calculada fue aproximadamente tres veces menor con celulas de ratas tratadas con zebularina en comparacion con celulas de ratas control tratadas con PBS. Esto demuestra que el tratamiento con zebularina induce una expresion aumentada de IDO1 en el bazo e inhibe la respuesta inmune de los linfocitos T del bazo.

Ejemplo 15. Supresion del rechazo inmunologico de los islotes pancreaticos alotransplantados por inoculaciones intraperitoneales diarias de zebularina durante 14 dias.

Se aislaron islotes pancreaticos del pancreas de ratas Lewis mediante una tecnica establecida. Despues del cultivo a 37°C durante la noche, se implantaron 500-1200 islotes debajo de la capsula renal de ratas Fischer 344 adultas (11-14 semanas de edad) que fueron confirmadas hiperglucemicas (glucosa en sangre > 20 mMol/L) despues de haber recibido una dosis unica de 35-40 mg/kg intraperitonealmente de estreptozotocina, que es selectivamente toxico para las celulas beta productoras de insulina presentes en los islotes pancreaticos. La glucosa en sangre disminuyo rapidamente a niveles normales como signo del transplante exitoso de los islotes productores de insulina. Un grupo de estas ratas se dejo sin tratamiento adicional como controles, mientras que otro grupo se trato con inoculaciones diarias intraperitoneales de zebularina (225 mg/kg) durante 14 dfas comenzando 6-8 dfas despues del trasplante en un momento en que las ratas teman un azucaren sangre normal por debajo de 11,1 mMol/l. Los islotes alotransplantados fueron rechazados inmunologicamente a los 9-14 dfas en 6/8 ratas de control (Figura 15). Las dos ratas excepcionales que mantuvieron un azucar en sangre normal fueron sometidas a nefrectoirna 40 y 43 dfas despues del trasplante para comprobar si su glucosa en sangre normal era el resultado de una supervivencia sostenida inesperada de los islotes injertados (en cuyo caso su azucar en la sangre debena aumentar rapidamente al retirarse el injerto) o se debio a la recuperacion de algunos islotes pancreaticos danados por la estreptozotocina (en cuyo caso su azucar en la sangre debfa permanecer normal a pesar de la eliminacion del injerto). Dado que la glucemia permanecio normal durante > 7 dfas despues de la nefrectomfa de las dos ratas de control, se concluyo que despues del dano inicial causado por la etreptozotocina en estas 2 ratas, algunos islotes pancreaticos se habfan recuperado para producir cantidades suficientes de insulina para mantener un nivel de azucar en sangre normal . Veintidos dfas despues del trasplante solo 1/10 de las ratas tratadas con zebularina habfan rechazado el injerto como se indica por un azucar en sangre normal en todas las ratas, excepto esta unica, al completarse el tratamiento de 20-22 dfas despues del trasplante y en todas las 7 analizadas >1 semana despues de que se detuviera el tratamiento con zebularina (Figura 16). Esto demuestra una capacidad inmunosupresora o de induccion tolerante de la sustancia inductora de IDO1 zebularina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), para su uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad autoinmune o rechazo inmune de trasplantes o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en el que los al menos dos compuestos inducen IDO

5 mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en donde uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon Ay gonadotropina corionica humana.
2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende:

10 (i) zebularina e interferon gamma;

(ii) zebularina, interferon gamma e interferon A;

(iii) zebularina, interferon gamma y acido valproico;

(iv) zebularina, interferon gamma y TGF-beta; o

(v) zebularina, interferon gamma, interferon A y TGF-beta.

15 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende zebularina e

interferon A.
4. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende zebularina y gonadotropina corionica humana.
5. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha 20 composicion comprende ademas un tampon, excipiente, diluyente, disolvente o vehmulo farmaceuticamente

aceptable.
6. La composicion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composicion se usa para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en aclorhidria, leucoencefalitis hemorragica aguda, enfermedad de Addison, alopecia areata, anemia perniciosa, enfermedad de

25 membrana basal anti-glomerular, smdrome antifosfolfpido, anemia aplastica, alergia atopica, gastritis atrofica autoinmune, perdida auditiva autoinmune, anemia hemolttica autoinmune, hipoparatiroidismo autoinmune, hipofisitis autoinmune, smdrome linfoproliferativo autoinmune, miocarditis autoinmune, oreopatfa autoinmune, orquitis autoinmune, poliendocrinopatfa autoinmune-candidiasis-ectodermica-distrofia, smdrome autoinmune poliglandular Tipo II, smdrome de Behcet, enfermedad celfaca, enfermedad de Chagas, colangitis esclerosante, polineuropatfa 30 desmielinizante inflamatoria cronica, tiroiditis linfocftica cronica, smdrome de Churg-Strauss, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia, smdrome de Cushing, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetes mellitus (dependiente de insulina), esclerosis cerebral difusa de Schilder, epidermolisis bullosa acquisita, smdrome de Felty, glomerulonefritis de membrana, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain- Barre, smdrome de Hamman-Rich, hepatitis autoinmune, hepatitis activa cronica, enfermedades inflamatorias del 35 intestino, smdrome miastenico de Lambert-Eaton, uveitis inducida por lentes, Lichus Sclerosus et Atrophicus, lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso sistemico, hepatitis lupica, nefritis lupica, linfopenia, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conjuntivo mixto, ulcera de Mooren, smdrome del ganglio linfatico mucocutaneo, esclerosis multiple, miastenia gravis, mielitis transversa, miocarditis, narcolepsia, neuromielitis optica, smdrome vestfbulo ocular auditor, oftalirna simpatica, smdrome de opsoclono-mioclono, pancreatitis, penfigoide ampolloso, penfigo foliaceo, 40 pemfigo vulgaris, poliarteritis nodosa, policondritis recidivante, poliendocrinopatfa autoinmune, polimialgia reumatica, poliradiculoneuropatfa, cirrosis biliar primaria, psoriasis, purpura trombocitopenica idiopatica, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, smdrome de Sjogren, espondilitis anquilosante, el smdrome de persona ngida, enfermedad de Still de inicio adulto, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tirotoxicosis, resistencia a la insulina tipo B, smdrome uveomeningoencefalttico, 45 granulomatosis de Wegener y vitiligo.
7. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composicion se utiliza para el tratamiento de la artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I, psoriasis, smdrome de Sjogren, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn, arteriosclerosis, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica) o demencia.

50 8. Un metodo ex vivo de induccion de IDO en un cultivo celular capaz de tener IDO inducido que comprende las

etapas de;

A) proporcionar celulas aisladas en un medio adecuado;

B) anadir una composicion que comprende al menos dos compuestos cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion,

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en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el IDO en comparacion con la suma del nivel IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en el que uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, Interferon A y gonadotropina corionica humana;

C) incubar dichas celulas aisladas con la composicion; y

D) obtener un cultivo celular en el que se induce IDO.
9. Un metodo para inducir IDO en un cultivo celular capaz de tener IDO inducido segun la reivindicacion 8, en el que la composicion comprende:

(i) zebularina e interferon gamma;

(ii) zebularina, interferon gamma e interferon A;

(iii) zebularina, interferon gamma y acido valproico;

(iv) zebularina, interferon gamma y TGF-beta; o

(v) zebularina, interferon gamma, interferon A y TGF-beta.
10. Un metodo para inducir IDO en un cultivo celular capaz de tener IDO inducido segun la reivindicacion 8, en el que la composicion comprende zebularina e interferon A o zebularina y gonadotropina corionica humana.
11. Una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un metodo de tratamiento de un mairnfero que tiene un trastorno o enfermedad autoinmune o que sufre de rechazo inmune de organos, tejidos, celulas normales o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en donde una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha composicion se administra a un paciente y en la que el tratamiento induce IDO.
12. Una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3- dioxigenasa (IDO), en el que los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico en el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en el que uno de los al menos dos compuestos es zebularina y otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon A y la gonadotropina corionica humana, para su uso en un metodo de tratamiento de un mamffero que tiene un trastorno o enfermedad autoinmune o que sufre de rechazo inmune de organos, tejidos, celulas normales o celulas terapeuticamente modificadas por genes, en el que el tratamiento induce IDO,en el que:

i. Una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha composicion se administra ex vivo a las celulas derivadas del mamffero tratado o de otro mamffero;

ii. Uno o mas antfgenos asociados con una afeccion que se esta tratando se administran a las celulas; y

iii. Las celulas tratadas se transfieren al mamffero que se esta tratando.
13. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que la composicion comprende:

(i) zebularina e interferon gamma;

(ii) zebularina, interferon gamma e interferon A;

(iii) zebularina, interferon gamma y acido valproico;

(iv) zebularina, interferon gamma y TGF-beta; o

(v) zebularina, interferon gamma, interferon A y TGF-beta.
14. Una composicion segun la reivindicacion 12, en la que la composicion comprende zebularina e interferon A o zebularina y gonadotropina corionica humana.
15. Un cultivo celular en el que se ha inducido IDO, comprendiendo el cultivo de celulas una composicion que comprende al menos dos compuestos, cada uno de los cuales induce indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), en donde los al menos dos compuestos inducen IDO mediante diferentes mecanismos de accion, en donde la composicion da lugar a un efecto sinergico sobre el nivel de IDO en comparacion con la suma del nivel de IDO alcanzado con cada uno de los al menos dos compuestos cuando se usan solos, en el que uno de los al menos dos compuestos es zebularina y el otro de los al menos dos compuestos se selecciona de la lista que consiste en interferon gamma, interferon A y gonadotropina corionica humana y celulas aisladas en un medio.