ES2638853T3 - Amplificación isotérmica de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento isotérmico para amplificar una molécula objetivo de ácido nucleico bicatenario que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar: (i) cebadores en dirección 5' y en dirección 3', comprendiendo cada uno una molécula de ADN monocatenario de menos de 30 nucleótidos, al menos una porción de la cual es complementaria a una secuencia de la molécula objetivo; (ii) un oligonucleótido que comprende una molécula de ADN monocatenario de al menos 30 nucleótidos, al menos una porción de la cual es complementaria a una secuencia de la molécula objetivo que interviene en los cebadores directo e inverso, en donde el oligonucleótido tiene un extremo terminal 3'; (b) poner en contacto el oligonucleótido (ii) con la recombinasa para permitir que invada la región complementaria de la molécula objetivo, volviendo de este modo la región complementaria de la molécula objetivo y regiones adyacentes monocatenarias; (c) aplicar el cebador en dirección 5' a la región monocatenaria de la molécula objetivo y extender el extremo terminal 3' del cebador en dirección 5' con polimerasa y dNTP para producir una molécula objetivo de ácido nucleico bicatenario; (d) aplicar el cebador en dirección 3' a la molécula objetivo monocatenaria y extender el extremo terminal 3' del cebador en dirección 3' con polimerasa y dNTP para producir otra molécula objetivo de ácido nucleico bicatenario; (e) continuar la reacción mediante la repetición de (b) hasta (d).

Description

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Sacarosa fosforilasa (Sigma S0937) Se disolvió hasta 0,4 u/µL en glicerol al 40%/H2O UvsX, UvsY; 100 µM en acetato de K 300 mM; glicerol al 50%. Gp32 (NEB, 10 mg/mL) Klenow, exo -(Jena Biosciences, 50 u/µL) utilizado a una concentración final de 0,05 u/µL

Componente

Concentración final de reacción

Tris pH 8

10 mM

Acetato de Mg

10 mM

BSA**

0,1 mg/mL

DTT**

5 mM

DMSO**

5%

PEG 1000**

5%

Sacarosa**

150 mM

ATP

2mM

dNTP

200 µM

Sybr Green*

1:100.000

Oligonucleótidos

Como se muestra en los ejemplos

gp32

0,5 µM

Fosfocreatina (diTRIS) pH hasta 7,8 con KOH

75 mM

Creatina Quinasa

1µM

Mioquinasa**

1µM

Pirofosfatasa**

1µM

UvsY

1,5 µM

UvsX

1,5 µM

Sacarosa fosforilasa**

1µM

Klenow

0,1µM

ADN plantilla

Como se muestra en los ejemplos

** = componentes que se encuentra que optimizan, pero que no son esenciales para la amplificación.

Se añadió plantilla de ensayo a una mezcla de los componentes de reacción excepto por UvsX y Klenow. Los componentes de reacción se incubaron con una muestra de ensayo durante 5 minutos a la temperatura de trabajo (40° C) y se añadieron UvsX y Klenow. Los volúmenes totales de muestra fueron de 20 µL colocados en placas de

10 microtitulación de 384 pocillos de bajo volumen. La fluorescencia se evaluó en un BMG-fluostar-II. La fluorescencia se controló a intervalos de un minuto por excitación a 480 nm y leyendo la emisión a 520 nm para la fluorescencia Sybr Green (a menos que se indique lo contrario).

Ejemplo 1: Sistema de dos cebadores, sin oligonucleótido intermedio (sistema de la técnica anterior)

El protocolo utilizado es el mismo que aquel descrito anteriormente a menos que se indique lo contrario. Los 15 constituyentes de oligonucleótidos comprendían dos cebadores a una concentración final de 150 nM junto con la

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Claims (1)

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