ES2640475T3 - Generación, regeneración y protección de neuronas - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido, cuya secuencia consiste en menos de 100 aminoácidos, que comprende: - la secuencia de SEQ ID NO: 6, o - una secuencia, que: - es de 34 a 54 aminoácidos, - es al menos el 94 % idéntica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de la longitud entera de la más corta de las dos secuencias, - comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es x1-x2-x3-x4, en la que: x1 es cualquier aminoácido excepto E (preferentemente Q), y x2 es T o S o I (preferentemente no I, más preferentemente T), y x3 es cualquier aminoácido (preferentemente R), y x4 es L o V (preferentemente L) (SEQ ID NO: 14), siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante A, o - una secuencia, que: - es de 44 aminoácidos, - es al menos el 94 % idéntica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6, - comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es x1-x2-x3-x4, en la que: x1 es E, y x2 es T o S o I (preferentemente no I, más preferentemente T), y x3 es cualquier aminoácido (preferentemente R), y x4 es L o V (preferentemente L) (SEQ ID NO: 13 con x1 >= E), y - no comprende el aminoácido L en la posición 11, siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante B, o - un fragmento de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, en el que dicho fragmento es de al menos 34 aminoácidos y ha retenido la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, respectivamente, siendo dicho polipéptido para su uso en el tratamiento y/o la paliación y/o prevención de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulación y/o inducción del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extensión de árboles dendríticos de neuronas de dicho sistema nervioso, en el que dicho polipéptido se usa como un principio activo para dicha estimulación y/o inducción.
Description
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DESCRIPCION
Generacion, regeneracion y proteccion de neuronas CAMPO DE LA SOLICITUD O INVENClON
La solicitud, ademas de la invencion, se refieren a la generacion, regeneracion y proteccion de neuronas, mas particularmente al crecimiento de neuritas.
La solicitud, ademas de la invencion, proporcionan medios para reducir y/o estimular efectos neuritogenicos, que son utiles en el campo medico, mas particularmente en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de trastornos del sistema nervioso. Mas particularmente, la solicitud, ademas de la invencion, proporcionan medios para inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, que son utiles para inducir la diferenciacion de neuronas, por ejemplo para el tratamiento de una neoplasia del sistema nervioso, ademas de en la regeneracion de neuronas alteradas, por ejemplo para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afeccion neurodegenerativa o en el tratamiento de una infeccion microbiana, o en la proteccion de neuronas de agentes neurotoxicos o estres oxidativo.
Los medios de la solicitud, ademas de la invencion, se basan en ciertas protemas G del virus de la rabia no apoptosico, mas particularmente de la cola citoplasmica de las mismas.
ANTECEDENTES DE LA SOLICITUD O INVENCION
Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas extienden los axones a lo largo de distancias considerables con el fin de enervar sus dianas de una manera apropiada. Esto implica la estimulacion en las celulas de vfas de senalizacion espedficas que pueden estimular la actividad del cono de crecimiento.
Mientras que el sistema nervioso en desarrollo, mas particularmente el sistema nervioso central en desarrollo, es altamente plastico, el sistema nervioso adulto, mas particularmente el cerebro adulto, tiene potencial de reparacion mas limitado. Por tanto, el crecimiento de neuritas-axones y la proteccion contra la degeneracion son factores importantes a considerar para mejorar el resultado de una enfermedad, trastorno o afeccion neurodegenerativa, tal como una lesion aguda del sistema nervioso o un trastorno neurodegenerativo cronico. Productos, que senan capaces de inducir el crecimiento de neuritas a partir de tales celulas neuronales, traenan una solucion terapeutica y/o preventiva y/o paliativa muy util a tales enfermedades, trastornos o afecciones.
En el otro lado del proceso de desarrollo de neuronas, la proliferacion de progenitores neuronales, que no se diferencian en estructuras neuronales maduradas, conduce a neoplasia del sistema nervioso. Productos, que senan capaces de inducir el crecimiento de neuritas a partir de tales celulas progenicas, traenan una solucion terapeutica y/o preventiva y/o paliativa a tales neoplasias.
La idea general sobre la infeccion de celulas neuronales por un virus neurotropico es que no tiene impacto positivo sobre la morfologfa de las neuronas, mas particularmente sobre el crecimiento de neuritas.
De hecho, hay numerosos ejemplos que muestran que los virus neurotropicos producen muerte celular neuronal por apoptosis. Esto se refiere a tanto virus de ADN, tales como el virus del herpes, como a virus de ARN, bien con envuelta tales como alfavirus, bunyavirus y paramyxovirus, o bien sin envuelta tales como picornavirus y reovirus.
Tambien se ha descrito el virus de la rabia, mas particularmente las cepas del virus de la rabia atenuadas, como inductor de apoptosis neuronal.
Por ejemplo, el documento WO 03/048198 se refiere a protemas G del virus de la rabia y fragmentos de las mismas de al menos 100 aminoacidos, que inducen la rotura de la integridad de la celula neuronal y la formacion de cuerpos apoptosicos. Estos cuerpos apoptosicos son capaces de estimular una respuesta inmunitaria humoral, preferentemente una respuesta inmunitaria humoral dependiente de B.
El documento WO 03/048198 muestra que:
- la cepa del virus de la rabia atenuado (tal como la cepa ERA atenuada) induce la rotura apoptosica de las celulas que infecta,
- los cuerpos apoptosicos asf producidos estimulan una respuesta inmunitaria humoral, mas particularmente una respuesta inmunitaria humoral dependiente de B;
- la induccion de apoptosis por una cepa del virus de la rabia se determina por la naturaleza de su protema G;
- un virus de la rabia que contiene la protema G de una cepa del virus de la rabia atenuado (tal como la cepa ERA atenuada) es capaz de desencadenar la apoptosis de celulas humanas, pero no la expresion de la protema G de un virus de la rabia patogeno (tal como una cepa de virus estandar de exposicion -CVS-) (vease mas particularmente el Ejemplo 5 y las Figuras 19 y 20 del documento WO 03/048198).
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Por favor, vease tambien Lay et al. 2003 y Prehaud et al. 2003.
Asf, se sabe que las protefnas G de cepas del virus de la rabia apoptosicas, tales como la protefna G de la cepa ERA atenuada, son utiles en estimular una respuesta humoral, mas particularmente una respuesta inmunitaria humoral dependiente de B.
Como estas protefnas G particulares inducen la apoptosis de las celulas que infectan, tambien se han propuesto como agentes candidates para eliminar celulas no deseables por rotura apoptosica de las celulas diana.
Tambien se ha descrito que la patogenicidad de una cepa del virus de la rabia se correlaciona inversamente con su capacidad de induccion de apoptosis (vease el documento WO 03/048198; Ugolini 1995; Sarmento et al. 2005; Ugolini 2008; Jackson et al. 2008).
Por tanto, la cepa del virus de la rabia mas virulenta es la menos apoptosica.
Los hallazgos de que las cepas del virus de la rabia virulentas, tales como las cepas de CVS, no inducen apoptosis neuronal y asf escapan de la deteccion humoral explican por que las cepas del virus de la rabia virulentas pueden propagarse tan extensamente dentro del SNC antes de la aparicion de los signos y sfntomas de la enfermedad.
Se han realizado estudios adicionales para analizar los cambios en el patron de expresion genica que se inducen tras la infeccion por un virus neurotropico, tal como un virus de la rabia o del herpes simple tipo 1 (VHS-1).
Estos estudios han demostrado que las neuronas humanas post-mitoticas, en ausencia de la glia, tienen la maquinaria intrfnseca para detectar la infeccion por virus, y que los virus neurotropicos, tales como el virus de la rabia patogeno o VHS-1, inducen la liberacion de citocinas de neuronas humanas post-mitoticas (Prehaud et al. 2005). Se cree que esta liberacion de citocinas contribuye ademas al escape de neuronas de la apoptosis y a la consecuente extension de tales virus neurotropicos.
Por tanto, se han investigado minuciosamente mecanismos de muerte celular neuronal, ademas de la capacidad de las neuronas para producir una respuesta inmunitaria tras la infeccion viral.
Sin embargo, se sabe menos sobre los procesos involucrados en la neurogeneracion, neuroregeneracion y neuroproteccion, mas particularmente en el crecimiento de neuritas a partir de neuronas pre-mitoticas, tales como progenitores neuronales o neuronas neoplasicas, o de neuronas degenerativas.
Si se centra en el virus de la rabia, un resumen esquematico del presente conocimiento serfa que las cepas del virus de la rabia atenuadas son conocidas por tener aplicaciones medicas debido a la apoptosis que inducen, y que las cepas del virus de la rabia virulentas son conocidas por no inducir la apoptosis, sino, por el contrario, preservar la red neuronal, que favorece su extension.
Aunque se ha descrito que las cepas del virus de la rabia virulentas preservan la integridad de la red neuronal, tambien se ha informado que tienen un impacto negativo, o como poco impacto no positivo, sobre la morfologfa neuronal, mas particularmente sobre el crecimiento de neuritas.
Por ejemplo, la publicacion de Guigoni y Coulon 2002 describe que la cepa del virus de la rabia virulenta CVS-Gif- sur-Yvette no induce el crecimiento de neuritas de motoneuronas de rata (veanse, por ejemplo, las Figuras 5A y 5B de esta publicacion).
Tambien se ha informado del impacto negativo sobre el crecimiento de neuritas. Por ejemplo, la publicacion de Scott et al., 2008 ha informado que la cepa del virus de la rabia patogena CVS-11 induce el rebordeado de las dendritas y axones, es decir, la formacion de vacuolas que son caracterfsticas de un impacto de estres negativo.
La solicitud, ademas de la invencion, proporcionan medios para la generacion, regeneracion y proteccion de neuronas, que derivan de ciertas cepas del virus de la rabia patogenas, y que muestran propiedades sorprendentes e inesperadas.
SUMARIO DE LA SOLICITUD O INVENCION
La solicitud, ademas de la invencion, demuestran que algunas protefnas G del virus de la rabia patogenas (y no apoptosicas) tienen un efecto promotor del crecimiento de neuritas, es decir, que algunas protefnas G del virus de la rabia no apoptosicas inducen y/o estimulan la neuritogenesis. Este efecto no se muestra por protefnas G del virus de la rabia apoptosicas. Ni se muestra por todas las protefnas G del virus de la rabia no apoptosicas.
Los inventores identificaron un sub-grupo de cepas del virus de la rabia no apoptosicas (y virulentas), cuya protefna G tiene un efecto significativamente positivo sobre el crecimiento de neuritas. Como se describe e ilustra mas adelante, una cepa representativa de este sub-grupo es la cepa CVS-NIV. La protefna G de esta cepa no apoptosica (y virulenta) se diferencia en solo 6 aminoacido de la protefna G de la cepa ERA apoptosica (y atenuada) (CNCM I- 2760).
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La solicitud, ademas de la invencion, demuestran ademas que este efecto promotor del crecimiento de neuritas es debido a la cola citoplasmica de dichas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas, mas particularmente a su sitio de union de PDZ (PDZ-BS) y/o a un aminoacido que, en la secuencia de la protema G de la cepa CVS-NIV, esta en la posicion 491, mas particularmente a su PDZ-BS.
La solicitud, ademas de la invencion, se refieren a polipeptidos, que son o derivan de ciertas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas, mas particularmente de su cola citoplasmica, ademas de a acidos nucleicos, vectores, celulas y composiciones farmaceuticas o farmacos.
Los medios de la solicitud, ademas de la invencion, son en particular utiles como agentes estimulantes y/o inductores del crecimiento de neuritas. Pueden usarse en particular para inducir diferenciacion de neuronas, por ejemplo en el tratamiento de una neoplasia del sistema nervioso, ademas de para regenerar neuronas alteradas, por ejemplo en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afeccion neurodegenerativa o en el tratamiento de una infeccion microbiana, o para proteger neuronas de agentes neurotoxicos o estres oxidativo.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Algunas de las figuras, a las que se refiere la solicitud, estan en color. La solicitud como se presento contiene la impresion en color de las figuras, a las que puede, por tanto, accederse por inspeccion del archivo de la solicitud en la oficina de patentes.
Figura 1: La neurogeneracion, neuroregeneracion y neuroproteccion participan en diversos trastornos, afecciones y enfermedades neuronales, que incluyen neurotoxicidad, convulsion, accidente cerebrovascular, traumatismo, envejecimiento, enfermedad neurodegenerativa, encefalopatfa.
Figura 2: Estructura esquematica del virus de la rabia recombinante (VRABr) producida por los inventores y usada en los ejemplos de mas adelante.
La protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) se diferencia en solo 6 aa de la protema G de la cepa ERA (cepa apoptosica).
G-supervivencia = protema G de la cepa CVS-NIV G-muerte = protema G de la cepa ERA
G-cito muerte = cola citoplasmica de G-muerte en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-cito supervivencia = cola citoplasmica de G-supervivencia en un antecedente genico de G de ERA
SP = peptido senal
EC: dominio extracelular
TM: dominio transmembranario
Cito: dominio citoplasmico
Figuras 3A, 3B, 3C, 3D: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) contiene una firma molecular que promueve el crecimiento de neuritas.
Figura 3A: ensayo de crecimiento de neuritas con G-CVS-NIV de VRABr y G-ERA de VRABr
Figura 3B: resultados del ensayo de crecimiento de neuritas con db-AMPc con G-CVS-NIV de VRABr y G-ERA de VRABr
Figura 3C: resultados del ensayo de crecimiento de neuritas sin db-AMPc con G-CVS-NIV de VRABr, G-CVS- Cito muerte de VRABr, G-ERA de VRABr y G-ERA-Cito supervivencia de VRABr
Figura 3D: resultados del ensayo de crecimiento de neuritas con G-CVS-NIV de VRABr, G-CVS de VRABr (LQ) y G-CVS de VRABr (HE)
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
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G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
G-CVS de VRABr (LQ) = protema G del virus de la rabia recombinante de la cepa CVS-NIV, en la que el aminoacido H, que esta en la posicion 491 en la protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV, se ha sustituido por el aminoacido L
G-CVS de VRABr (HE) = protema G del virus de la rabia recombinante de la cepa CVS-NIV, en la que el aminoacido Q, que esta en la posicion 521 en la protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV, se ha sustituido por el aminoacido E
Figuras 4A, 4B: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) es un efecto intrmseco que promueve la neuritogenesis, que funciona sinergicamente con AMPc*
Figura 4A: sin db-AMPc
Figura 4B: sin db-AMPc (primeros dos histogramas) y con AMPc (dos ultimos histogramas)
★ significa significativamente diferente (prueba de la t de Student con p=0,0067)
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
Figura 5: El efecto de neuritogenesis de la cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) depende de la firma molecular y n de la cantidad de protema G expresada.
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
Figuras 6A, 6B: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) confiere neuroproteccion contra el farmaco de colapso del cono de crecimiento (LPA)
Figura 6A: con db-AMPc
Figura 6B: sin db-AMPc
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
5
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Figura 7: La neuroproteccion contra el farmaco de colapso del cono de crecimiento LPA que se induce por la cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) es robusta.
★ significa significativamente diferente (prueba de ANOVA)
▲ significa no significativamente diferente (prueba de ANOVA)
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
LPA = acido lisofosfatidico
Figura 8: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) confiere neuroproteccion contra el estres oxidativo (H2O2). Estos experimentos se realizaron sin db-AMPc.
★ significa significativamente diferente (prueba de la t de Student)
▲ significa no significativamente diferente (prueba de la t de Student)
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
Figuras 9A, 9B, 9C: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) confiere proteccion contra el efecto citopatico del virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1).
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
Figuras 10A, 10B: Proliferacion celular de celulas de neuroblastoma humano tratadas con el farmaco pro- diferenciativo acido all-trans-retinoico (ATRA) (Figura 10A: citometna de flujo; Figura 10B: ensayo MTT). N.I. = no infectado
Figuras 11A, 11B: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) confiere propiedades antiproliferativas: proliferacion celular (Figura 11A) y longitud de neuritas (Figura 11B) de celulas de neuroblastoma humano tratadas con G-CVS-NIV de VRABr o G-ERA de VRABr
N.I. = no infectado
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VRAB = virus de la rabia recombinante G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV G-ERA = protema G de la cepa ERA
Figuras 12A, 12B: La cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV (cepa no apoptosica) confiere propiedades antiproliferativas: proliferacion celular de celulas de neuroblastoma humano tratadas con G-CVS de VRABr, G-ERA de VRABr, G-CVS-Cito muerte de VRABr o G-ERA-Cito supervivencia de VRABr (Figura 12A: citometna de flujo; Figura 12B: ensayo MTT) (N.I. = no infectado)
N.I. = no infectado
VRABr = virus de la rabia recombinante
G-CVS o G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV
G-CVS-Cito muerte = cola citoplasmica de la protema G de la cepa ERA en un antecedente genico de G de CVS-NIV
G-ERA = protema G de la cepa ERA
G-ERA-Cito supervivencia = cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV en un antecedente genico de G de ERA
Figuras 13A, 13B: Secuencias de acido nucleico y protemas de la protema G de la cepa CVS-NIV (Figura 13A) y de la cepa ERA (Figura 13B). En la Figura 13A, el motivo PDZ-BS de la protema G de la cepa CVS-NIV esta subrayado (QTRL). aa = aminoacido
Figura 14: Alineamiento de secuencias de las protemas G de las cepas CVS-NIV y ERA; las protemas G se diferencian en solo 6 aminoacidos (mostrado en negrita en la Figura 14):
Tabla 1:
- Posicion del aminoacido en la secuencia de protema G de longitud completa
- Protema G de la cepa CVS- NIV (cepa no apoptosica) Protema G de la cepa ERA (cepa apoptosica)
- 48
- V I
- 139
- H R
- 179
- P S
- 219
- A V
- 491
- H L
- 521
- Q E
El alineamiento mostrado en la Figura 14 se ha realizado usando los siguientes parametros: Matriz de comparacion: BLOSUM62 Numero de alineamientos calculados: 20 Penalizacion por abertura de hueco: 12 Penalizacion por extension de hueco: 4 El resultado de este alineamiento es:
98,9 % de identidad en solapamientos de 524 residuos;
Puntuacion: 2787,0;
Frecuencia de huecos: 0,0%.
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Figura 15: Secuencias de acidos nucleicos y de protemas del dominio citoplasmico de la protema G de la cepa CVS-NIV y de la cepa ERA. En la Figura 15, el motivo PDZ-BS de la protema G de la cepa cVs-NIV esta subrayado (QTRL).
aa = aminoacido
Figura 16: Secuencias de acidos nucleicos y de protemas de PDZ-BS de la protema G de la cepa CVS-NIV y de la cepa ERA.
aa = aminoacido
Figura 17: Alineamiento de la protema G de la cepa CVS-NIV (SEQ ID NO: 2) y de la protema G de la cepa CVS- Gif-sur-Yvette (SEQ ID NO: 15).
Figura 18: Alineamiento de la protema G de la cepa CVS-NIV (SEQ ID NO: 2) y de las protemas G de tres cepas CVS-11 (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18).
Figura 19: Secuencia del fragmento citoplasmico de la protema G de la cepa CVS-NIV (SEQ ID NO: 6) y de dos variantes conservativas que derivan de la misma (secuencia A de variante de SEQ ID NO: 19; secuencia B de variante de SEQ ID NO: 20).
Figura 20: La delecion de PDZ-BS afecta el fenotipo del crecimiento de neuritas (longitud de neurita promedio en pm 8 h despues de la infeccion, en presencia de db-AMPc).
N.I. = no infectado;
G-CVS-NIV = protema G de la cepa CVS-NIV;
G-CVS-NIV-DeltaPDZ-BS = protema G de la cepa CVS-NIV de la que se ha delecionado PDZ-BS.
Figura 21: Estructura esquematica de mutantes de un solo punto de la solicitud o invencion (variantes B y A). Los virus mutantes CVS HE (I-4143) y CVS LQ (I-4142) de la solicitud se diferencian de CVS-NIV (I-4140) por sus protemas G, en las que se ha introducida una mutacion de un solo punto.
CVS HE (variante B) = mutacion de un solo punto del primer aminoacido PDZ-BS de la protema G de la cepa CVS-NIV, que es E en CVS HE (posicion 521) en lugar de Q.
CVS LQ (variante A) = mutacion de un solo punto del aminoacido en la posicion 491, que es E en lugar de Q.
SP: peptido senal
EC: dominio extracelular
TM: dominio transmembranario
Cito: dominio citoplasmico
Figura 22: Secuencias de aminoacidos de dominios de la protema G de una cepa de virus no apoptosica y de inserciones de construccion
- Secuencias de los dominios G-CVS:
- Longitud de G-Completa (SEQ ID NO: 2): protema G de longitud completa de una cepa del virus de la rabia apoptosica (CVS-NIV);
- Peptido senal (SP; SEQ ID NO: 21): peptido senal de una cepa del virus de la rabia apoptosica (CVS-NIV);
- Ectodominio (EC; SEQ ID NO: 22): ectodominio de una cepa del virus de la rabia apoptosica (CVS-NIV);
- Dominio transmembranario (TM. SEQ ID NO: 23): dominio transmembranario de una cepa del virus de la rabia apoptosica (CVS-NIV);
- Dominio citoplasmico (Cito; SEQ ID NO: 6): dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia apoptosica (CVS-NIV).
- Secuencias de aminoacidos codificadas por inserciones de construccion:
- Aminoacido M + SEQ ID NO: 6 = SEQ ID NO: 24 (construccion G-Cito);
- Dominio transmembranario de SEQ ID NO: 23 + dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 = SEQ ID NO: 25;
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- Dos aminoacidos del extremo C del ectodominio de G-CVS-NIV (aminoacidos GK) + dominio transmembranario de SEQ ID NO: 23 + dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 = SEQ ID NO: 26;
- Peptido senal de SEQ ID NO: 21 + dos aminoacidos del extremo C del ectodominio de G-CVS-NIV (aminoacidos GK) + dominio transmembranario de SEQ ID NO: 23 + dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 = SEQ ID NO: 27 (construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito).
Figura 23: Alineamiento de las secuencias de aminoacidos codificadas por las inserciones de tres construcciones (SEQ ID NO: 2 codificadas por la construccion G-Completa; SEQ ID NO: 27 codificadas por la construccion G-(SP)- [2a]-TM-Cito (=GSP2aaTMCito); SEQ ID NO: 24 codificadas por la construccion G-Cito).
Figura 24: Representacion esquematica de tres construcciones genicas de G de VRAB (G-Completa de SEQ ID NO: 2 (= Supervivencia de G); G-Cito de SEQ ID NO: 24 (= Supervivencia de G-Cito); G-(SP)-[2a]-TM-Cito de SEQ ID NO: 27 (= Supervivencia de G-AEC).
Figura 25: Expresion de G de VRAB (unidades arbitrarias) para el plasmido de control, construccion G-Completa (SEQ ID NO: 2), construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito) (SEQ ID NO: 27) y construccion G-Cito (SEQ ID NO: 24) en la lmea celular SH-SY5Y (lmea celular de neuroblastoma humano).
Figuras 26 y 27: Efecto sobre el crecimiento de neuritas de la expresion:
- de la protema G de longitud completa de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (SEQ ID NO: 2; construccion G-Completa),
- de los dominios transmembranarios y citoplasmicos de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (SEQ ID NO: 27; construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito)), o
- del dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (SEQ ID NO: 24; construccion G-Cito),
en celulas de neuroblastoma humano (lmea celular SH-SY5Y en presencia de db-AMPc), en comparacion con control (sin ADN) y con el plasmido de control.
Figura 26: expresion transitoria.
Figura 27: expresion estable.
Figura 28: La expresion de los dominios transmembranarios y citoplasmicos de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (SEQ ID NO: 27; construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito) induce el crecimiento de neuritas de celulas de neuroblastoma humano (lmea celular SH-SY5Y en presencia de db-AMPc), y confiere proteccion contra el farmaco de colapso del cono de crecimiento LPA a las neuritas que han crecido.
Figuras 29 y 30: La expresion (estable) del dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica induce y/o estimula la diferenciacion de una lmea celular de carcinoma embrionario (NTera 2cl.-D1; ATCC CRL- 1973) en neuronas humanas post-mitoticas maduras (5 dfas despues del procedimiento de diferenciacion: efecto de la construccion de G-Completa - insercion de SEQ ID NO: 2-, de la construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito) - insercion de SEQ ID NO: 27-, o de la construccion G-Cito - insercion de SEQ ID NO: 24-, en comparacion con plasmido de control).
Figura 29: imagenes en color.
Figura 30: puntas de neurita.
Figura 31: La expresion (estable) del dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica induce y/o estimula la diferenciacion de una lmea celular de carcinoma embrionario (NTera 2cl.-D1; ATCC CRL-1973) en neuronas humanas post-mitoticas maduras, e induce y/o estimula la organizacion de una red neuronal con axones largos (imagenes en color de neuronas vivas, 50 dfas despues del procedimiento de diferenciacion: efecto de la construccion G-Completa - insercion de SEQ ID NO: 2-, de la construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito) - insercion de SEQ ID NO: 27-, o de la construccion G-Cito - insercion de SEQ ID NO: 24-, en comparacion con plasmido de control).
Figuras 32 y 33: La expresion de los dominios transmembranarios y citoplasmicos de una cepa del virus de la rabia no apoptosica induce y/o estimula la regeneracion de neuronas humanas post-mitoticas maduras heridas (neuronas sembradas en utensilios de plastico de PDL-laminina, 3 dfas despues de raspar con aguja de inyeccion (26GX1/2", 12-4,5); efecto del polipeptido de SEQ ID NO: 27 (construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito) -regeneracion de neuritas-, en comparacion con plasmido de control -degeneracion de neuritas-).
Figura 32: imagenes en color
Figura 33: porcentaje de regeneracion de neuritas
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA SOLICITUD O INVENCION
La solicitud se refiere a la materia como se define en las reivindicaciones como se presentaron y como se describen e ilustran en el presente documento.
La patogenicidad del virus de la rabia, un virus neurotropico causante de la encefalitis letal en la mayona de las especies de mairnfero, se correlaciona con la capacidad de las neuronas infectadas a sobrevivir. La atenuacion de las cepas de laboratorio obtenidas en la busqueda de candidatos a vacuna viva esta siempre asociada a la capacidad de aquellas cepas de vacuna para desencadenar la muerte celular.
La subversion de una celula infectada por un virus dado implica la perturbacion de vfas de senalizacion espedficas.
El virus de la rabia es un virus con forma de bala envuelto que pertenece a la familia Rhabdoviridae y el genero Lyssavirus. La partmula viral consiste en una membrana compuesta de lfpidos hospedadores y dos protemas virales, las protemas G y M, que rodean una nucleocapside helicoidal (NC). La NC esta compuesta por una molecula de ARN de hebra negativa viral de ARN protegido por la protema N, la protema P y la ARN polimerasa dependiente de ARN, la protema L. Las protemas del virus de la rabia no son sintetizadas en cantidades iguales en celulas infectadas y no estan presentes en las mismas relaciones en partmulas virales. De hecho, las protemas N, G y M son, en este orden, las especies mas predominantes en los viriones.
La decision estrategica entre la preservacion de la integridad de la red neuronal (que favorece la extension del virus de la rabia) y la muerte celular neuronal (que favorece la inmunogenicidad) implica necesariamente una eleccion entre al menos dos redes de senalizacion.
La solicitud, ademas de la invencion, demuestran que la cola citoplasmica de la protema G de la cepa del virus de la rabia tiene una funcion crucial en el dominio de la pro-supervivencia (es decir, preservacion de la integridad de la red neuronal, que favorece la extension del virus de la rabia) frente al proceso de decision pro-apoptosica (es decir, muerte celular, que favorece la inmunogenicidad).
La solicitud, ademas de la invencion, descubren ademas efectos inesperados de la estrategia de pro-supervivencia.
De hecho, la solicitud, ademas de la invencion, muestran que las protemas G de algunas cepas no apoptosicas (y virulentas) del virus de la rabia, mas particularmente de la cepa CVS-NIV, tienen un efecto promotor del crecimiento de neuritas, es decir, que estas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas inducen y/o estimulan la neuritogenesis.
Este efecto no se muestra por las protemas G del virus de la rabia apoptosico, tales como las protemas G de ERA y otras cepas del virus de la rabia atenuadas.
Ademas, este efecto no es mostrado por todas las protemas G del virus de la rabia apoptosicas y/o virulentas. Mas particularmente, no se muestra por la protema G de la cepa CVS-Gif-sur-Yvette (Prehaud et al. 1988), aunque esta protema G tiene una alta puntuacion de identidad con la protema G de la cepa de CVS-NIV (vease la Figura 17). Dicho efecto no es mostrado por las protemas G de las cepas de CVS-11 (por ejemplo, ACA57830, AAC34683, ABV24348), aunque estas protemas G tambien tiene una alta puntuacion de identidad con la protema G de la cepa CVS-NIV (vease la Figura 18). Ni se muestra por las protemas G de las cepas N2C o CVS-24.
Por tanto, no todas las cepas del virus de la rabia virulentas tienen una protema G, que muestra un efecto significativamente positivo sobre el crecimiento de neuritas.
Por lo tanto, los inventores identificaron un sub-grupo de cepas no apoptosicas (y virulentas) del virus de la rabia, cuya protema G tiene un efecto significativamente positivo sobre el crecimiento de neuritas. Una cepa representativa de este sub-grupo es la cepa CVS-NIV. Estas protemas G pueden denominarse en el presente documento las protemas G del tipo CVS-NIV.
La cepa CVS-NIV se ha depositado en la CNCM el 1 de abril de 2009 con el numero de deposito I-4140.
Un plasmido que expresa la protema G de la cepa CVS-NIV se ha depositado en la CNCM el 30 de noviembre de 2001 con el numero de deposito I-2578.
La protema G de la cepa CVS-NIV se ha descrito en Prehaud et al. 2003.
La secuencia de la protema G de la cepa CVS-NIV esta disponible con el numero de acceso AF 406694.
Una secuencia de la protema G de la cepa CVS-NIV es la secuencia de SEQ ID NO: 2 mostrada en la Figura 13A.
Una protema G del virus de la rabia es una glucoprotema transmembranaria de tipo I que forma las espmulas trimericas de la envoltura viral y que se encuentra en la membrana de celulas infectadas. La protema G del virus de la rabia es una protema de 524 aminoacidos de longitud, que consiste en un ectodominio, un segmento transmembranario y un dominio citoplasmico de 44 aminoacidos de longitud.
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Los ultimos 4 aminoacidos de este dominio del extremo C forman un sitio de union de PDZ (PDZ-BS).
Los dominios PDZ (PSD-95, Discs Large, ZO-1) forman estructuras globulares de 80-100 aa organizadas en seis hebras beta y dos helices alfa que crean un enchufe donde podna insertarse la secuencia del extremo C de una protema componente.
Un sitio de union de PDZ (PDZ-BS) es una secuencia de 4 aminoacidos; la secuencia de PDZ-BS es la secuencia de SEQ ID NO: 13:
xi - X2 - X3 - X4, en la que: xi es cualquier aminoacido, y X2 es T o S o I, y x3 es cualquier aminoacido, y x4 es L o V.
La solicitud, ademas de la invencion, demuestran en particular que es la cola citoplasmica de dichas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas del tipo CVS-NIV, la que es responsable de este efecto de crecimiento de neuritas.
La solicitud, ademas de la invencion, demuestran ademas que esto es en particular debido a que PDZ-BS esta contenido en la cola citoplasmica de dichas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas del tipo CVS-NIV.
El motivo PDZ-BS de dichas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas del tipo CVS-NIV muestra una mutacion de un solo punto en comparacion con aquellas de las protemas G del virus de la rabia apoptosico. Esta mutacion de un solo punto se refiere al primer aminoacido de PDZ-BS, que no es E en protemas G del virus de la rabia no apoptosicas.
La solicitud, ademas de la invencion, demuestran ademas que el aminoacido, que, en la secuencia de protemas del virus de la rabia G no apoptosicas de longitud completa de la cepa CVS-NIV, esta en la posicion 491, tambien contribuye a este efecto de crecimiento de neuritas. Este aminoacido es H en la protema G de la cepa CVS-NIV (vease la SEQ ID NO: 2). La posicion 491 en la protema G de longitud completa se corresponde con la posicion 11 en el fragmento citoplasmico de esta protema (sEq ID NO: 6 en la Figura 15).
Los inventores demuestran que los aminoacidos, que, en la secuencia de protemas del virus de la rabia G no apoptosicas de longitud completa de la cepa CVS-NIV (SEQ ID NO: 2), estan en las posiciones 491 y 521, son ambos importantes para el efecto de crecimiento de neuritas de la solicitud o invencion. Mas particularmente, muestran que H (pero no L) en la posicion 491 y Q (pero no E) en la posicion 521, ambos favorecen el efecto de crecimiento de neuritas de la solicitud o invencion. El virus mutante, que se diferencia de la cepa CVS-NIV en que sus protemas G estan mutadas en un solo punto H491L o mutadas en un solo punto Q521E, han sido construidas y producidas por los inventores (CNCM I-4142 y I-4143).
La protema G mutante H491L todavfa tiene Q en la posicion 521.
La protema G mutante Q521E todavfa tiene H en la posicion 491.
Ambas protemas mutantes inducen un efecto de crecimiento significativamente positivo de neuritas, aunque a un menor grado que la protema G de CVS-NIV, que tiene tanto H en la posicion 491 como Q en la posicion 521.
Los fragmentos citoplasmicos de estas protemas G mutantes se muestran en la Figura 19 (SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20).
Definicion de un polipeptido de la solicitud o invencion:
La solicitud se refiere a un polipeptido, que es:
- un polipeptido, que comprende:
- la secuencia parental seleccionada de la secuencia de SEQ ID NO: 6, el fragmento citoplasmico de la protema G de la cepa I-4140, el fragmento citoplasmico de la protema G producida por el plasmido I-2578, el fragmento citoplasmico de la protema G de secuencia AF406694, el fragmento citoplasmico de la protema G de SeQ ID NO: 2,
o
- una secuencia de variante conservativa de dicha secuencia parental, o
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- un fragmento conservativo de dicha secuencia parental o de dicha secuencia de variante conservativa.
Dichas secuencias parentales, secuencias de variante conservativa y secuencias de fragmentos conservativos tienen ventajosamente la funcion de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, por ejemplo como se ilustra mas adelante, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
La solicitud se refiere mas particularmente a dicho polipeptido, para su uso en estimular y/o inducir el crecimiento de neuritas, mas particularmente para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion que implica un crecimiento de neuritas insuficiente o alterado, mas particularmente una neuritogenesis insuficiente o alterada.
Preferentemente, la longitud de aminoacidos de dicho polipeptido es inferior a 100 aminoacidos, mas preferentemente inferior a 90 aminoacidos.
La secuencia de las protemas de variante anteriormente mencionadas puede ser una secuencia, que no se corresponde con ninguna protema del virus de la rabia conocida o identificable.
De hecho, un experto medio en la materia reconocera que a partir de la secuencia de una protema del virus de la rabia dada, pueden hacerse una o varias sustituciones y/o adiciones y/o deleciones de aminoacidos, mientras que todavfa se retiene la capacidad de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas. Tal(es) sustitucion (sustituciones) y/o adicion (adiciones) y/o delecion (deleciones) de aminoacidos conservativas estan englobadas en el presente documento.
Sin desear quedar ligado a teona, se considera que cada uno de los ocho siguientes grupos contiene aminoacidos que son sustituciones conservativas por otro:
1) Alanina (A), glicina (G);
2) Acido aspartico (D), acido glutamico (E);
3) Asparagina (N), glutamina (Q);
4) Arginina (R), lisina (K);
5) Isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V);
6) Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W);
7) Serina (S), treonina (T); y
8) Cistema (C), metionina (M).
Por tanto, las protemas de variante anteriormente mencionadas en particular engloban protemas, que han sido manipuladas por el hombre, y que se diferencian de dicha protema G del virus de la rabia por una o varias sustituciones y/o adiciones y/o deleciones de aminoacidos, a condicion de que la protema de variante resultante todavfa tenga la capacidad de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
Preferentemente, dicha secuencia de variante conservativa es:
- una secuencia de variante de dicha secuencia parental, que:
- es de 34 a 54 aminoacidos,
- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia parental a lo largo de la longitud entera de la mas corta de las secuencias parentales y de variante,
- comprende una secuencia de PDZ-BS (preferentemente los cuatro ultimos aminoacidos del extremo C), en la que dicha secuencia de PDZ-BS es:
x-i-x2-x3-x4, en la que
x1 es cualquier aminoacido excepto E (preferentemente Q), y x2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y
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X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L)
(SEQ ID NO: 14),
siendo dicha secuencia de variante denominada secuencia de variante A, o
- una secuencia de variante de dicha secuencia parental, que:
- es de 44 aminoacidos,
- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia parental,
- comprende una secuencia de PDZ-BS (preferentemente los cuatro ultimos aminoacidos del extremo C), en la que dicha secuencia de PDZ-BS es:
X1-X2-X3-X4, en la que
xi es E, y
X2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L)
(SEQ ID NO: 13 con xi = E),
y
- no comprende el aminoacido L en la posicion 11 (preferentemente comprende el aminoacido H en esta posicion),
siendo dicha secuencia de variante denominada secuencia de variante B.
La invencion se refiere a un polipeptido, cuya secuencia consiste en menos de 100 aminoacidos, que comprende:
- la secuencia de SEQ ID NO: 6, o
- una secuencia, que:
- es de 34 a 54 aminoacidos,
- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de la longitud entera de la mas corta de las dos secuencias,
- comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es X1-X2-X3-X4, en la que:
X1 es cualquier aminoacido excepto E (preferentemente Q), y X2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y x3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y x4 es L o V (preferentemente L)
(SEQ ID NO: 14),
siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante A, o
- una secuencia, que:
- es de 44 aminoacidos,
- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6,
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- comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es X1-X2-X3-X4, en la que: xi es E, y
X2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L)
(SEQ ID NO: 13 con xi = E),
y
- no comprende el aminoacido L en la posicion 11,
siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante B,
o
- un fragmento de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, en la que dicho fragmento es de al menos 34 aminoacidos y ha retenido la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, respectivamente,
siendo dicho polipeptido para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, en el que dicho polipeptido se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
Preferentemente, dicha identidad de secuencia es de al menos el 95 % (preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, todavfa mas preferentemente al menos el 97,5 %, incluso todavfa mas preferentemente al menos el 98 %, lo mas preferentemente al menos el 98,5 %, todavfa lo mas preferentemente al menos el 99 %).
Mas preferentemente, dicha secuencia de variante conservativa es una secuencia de variante A.
Preferentemente, dicho fragmento conservativo es un fragmento de al menos 34 aminoacidos, que ha retenido la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia parental o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, respectivamente
Por brevedad, el termino "polipeptido" pretende en el presente documento englobar protemas, y a la inversa.
Este termino tambien engloba polipeptidos (o protemas), que se han modificado por modificacion post-transcripcional y/o por qmmica sintetica, por ejemplo, por adjuncion de un grupo qmmico no peptfdico y/o por modificacion de la estructura terciaria del polipeptido, por ejemplo, por acetilacion, acilacion, hidroxilacion, ciclacion, racemizacion, fosforilacion, etc., en tanto que el polipeptido modificado resultante haya retenido la capacidad de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
El polipeptido de la solicitud o invencion es ventajosamente, solo y por sf mismo, neurotropico.
Si se requiere o desea, el polipeptido de la solicitud o invencion puede, sin embargo, acoplarse a, o fusionarse con un agente que mejora su neurotropicidad, mas particularmente su tropicidad para neuronas cerebrales, tales como RVG-9R como se describe por Kumar et al. 2007.
Secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos se dan en el presente documento segun la orientacion estandar, es decir, de extremo N a extremo C para las secuencias de aminoacidos y de extremo 5' a extremo 3' para secuencias de nucleotidos.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de variante A es QTRL (SEQ ID NO: 10).
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha secuencia de variante A es de 44 aminoacidos y tiene el aminoacido H o L, preferentemente H, en la posicion 11.
Una secuencia de variante A ilustrativa, que es de 44 aminoacidos y que tiene el aminoacido L en la posicion 11, es la secuencia de SEQ ID NO: 19 (vease la Figura 19).
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Segun una realizacion de la solicitud o invencion, la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de variante B es ETRL (SEQ ID NO: 12).
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha secuencia de variante B tiene el aminoacido H en la posicion 11.
Una secuencia de variante B ilustrativa, que es de 44 aminoacidos y que tiene el aminoacido H en la posicion 11, es la secuencia de SEQ ID NO: 20 (vease la Figura 19).
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicho fragmento es el fragmento 11-44 de la secuencia de SEQ ID NO: 6.
Un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender, o consistir, en dicha secuencia de crecimiento de pro- neuritas y de la parte transmembranar de una protema G del virus de la rabia o cualquier otro medio de anclaje que la persona de experiencia media en la materia puede encontrar apropiada para anclar el polipeptido sobre o en la membrana de una celula, tal como una celula como se define mas adelante.
Un polipeptido de la solicitud o invencion puede insertarse en la estructura de un anticuerpo modificado, por ejemplo un anticuerpo monocatenario.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicho polipeptido es la protema G de una cepa del virus de la rabia, o un fragmento citoplasmico de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 6), o un sub-fragmento de un fragmento citoplasmico tal (por ejemplo, fragmento 11-54 de SEQ ID NO: 6). Dicha protema G del virus de la rabia es mas preferentemente una protema del virus de la rabia no apoptosico. Por ejemplo, dicha cepa del virus de la rabia es la cepa depositada en la CNCM con I-4140. Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicho polipeptido comprende, o consiste en, una secuencia de variante A o B (como se definio anteriormente) de un fragmento citoplasmico o sub-fragmento tal. Por ejemplo, dicho polipeptido comprende, o consiste en, el fragmento citoplasmico de la protema G de la cepa del virus de la rabia depositada en la CNCM con I-4142 o I-4143 (vease la Figura 21), cuyas protemas G son protemas mutantes de un solo punto de la protema G de la cepa I-4140 (fragmentos citoplasmicos de SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente; vease la Figura 19).
CNCM es The Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 28, rue du Docteur Roux; F- 75724 Paris Cedex 15; Francia. Dichos depositos se han hecho bajo los terminos del Tratado de Budapest.
Secuencia de variante A:
Una secuencia de variante A de la solicitud o invencion comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14, es decir, la
secuencia X1 - X2 - X3 - X4, en la que:
X1 es cualquier aminoacido excepto E, y X2 es T o S o I, y x3 es cualquier aminoacido, y x4 es L o V.
Esta secuencia es un motivo de PDZ-BS particular. Normalmente se localiza en el extremo C del polipeptido, lo mas
normalmente esta secuencia es la secuencia de los cuatro ultimos aminoacidos del extremo C del polipeptido.
Preferentemente, dicho aminoacido x1 es Q.
Preferentemente, dicho aminoacido x2 no es I. Preferentemente es T.
Preferentemente, dicho aminoacido x3 es R.
Preferentemente, dicho aminoacido x3 es L.
Preferentemente, la secuencia de dicho motivo de PDZ-BS es la secuencia de SEQ ID NO: 14, en la que: x1 es Q, y x2 es T o S o I, y x3 es R, y x4 es L o V.
Lo mas preferentemente, la secuencia de dicho motivo de PDZ-BS es la secuencia de SEQ ID NO: 14, en la que:
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xi es Q, y X2 es T, y X3 es R, y X4 es L o V.
Lo mas preferentemente, la secuencia de dicho motivo de PDZ-BS es la secuencia de SEQ ID NO: 14, en la que: xi es Q, y x2 es T o S o I, y x3 es R, y x4 es L.
Mas preferentemente, la secuencia de dicho motivo de PDZ-BS es la secuencia de SEQ ID NO: 14, en la que: xi es Q, y x2 es T, y x3 es R, y
x4 es L,
es decir, es la secuencia de SEQ ID NO: 10 (vease la Figura 16).
Esta secuencia de QTRL es la secuencia del motivo PDZ-BS de la protema G de la cepa CVS-NIV, estando dicha cepa disponible de la CNCM con el numero de deposito I-4140, y/o de la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758 (E. coli recombinante que contiene dicho plasmido), y/o de la protema de SEQ ID NO: 2 (vease la Figura 13A).
Condiciones apropiadas para el cultivo de la cepa de E. coli recombinante que contiene el plasmido CNCM I-2758 que codifica la protema G de CVS-NIV comprenden la incubacion de dicha cepa de E. coli recombinante a 37 °C en un medio de crecimiento LB-TYM estandar(en presencia de ampicilina); vease el documentoWO 03/048198.
Condiciones apropiadas para la propagacion del virus I-4140 (virus de la rabia recombinante) comprenden la incubacion de dicho virus a 37 °C con 5 % de CO2 con celulas BHK-21 (sub-clon BSR) en un medio de crecimiento DMEM que contiene glucosa (por ejemplo, 4,5 g/l), piruvato de sodio y Glutamax (Invitrogen 31966047) y 5 % de FBS; vease el Ejemplo 1 mas adelante.
Preferentemente, una secuencia de variante A de la solicitud o invencion es de 44 aminoacidos y tiene el aminoacido H o L, preferentemente H, en la posicion 11 de su secuencia de 44 aa.
Polipeptidos de variante A ilustrativos en particular comprenden la protema G de la cepa del virus de la rabia recombinante depositada el 1 de abril de 2009 en la CNCM con el numero de deposito I-4142 (cuya protema G es una protema mutante de un solo punto de la protema G de I-4140; vease la Figura 21), el fragmento citoplasmico de la misma y los sub-fragmentos citoplasmicos conservativos de la misma.
La cepa I-4142 se diferencia de la cepa CVS-NIV (CNCM I-4140) en que su protema G tiene el aminoacido L en la posicion 491 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa), en lugar de H (veanse la Tabla 2 mas adelante y la Figura 3D).
Condiciones apropiadas para la propagacion del virus I-4142 (virus de la rabia recombinante) comprenden la incubacion de dicho virus a 37 °C con 5 % de CO2 con celulas BHK-21 (sub-clon BSR) en un medio de crecimiento DMEM que contiene glucosa (por ejemplo, 4,5 g/l), piruvato de sodio y Glutamax (Invitrogen 31966047) y 5 % de FBS; vease el Ejemplo 1 mas adelante.
Polipeptidos de variante A ilustrativos en particular comprenden polipeptidos que comprenden el fragmento citoplasmico de SEQ ID NO: 19 o al menos un sub-fragmento conservativo de los mismos. La secuencia de SEQ ID NO: 19 es una variante conservativa ilustrativa de la secuencia de SEQ ID NO: 6 (vease la Figura 19). Todavfa tiene un efecto positivo del crecimiento de neuritas, aunque a un nivel mas bajo que la secuencia de SEQ ID NO: 6 (vease la Figura 3D y comentarios asociados en la seccion de ejemplos).
Secuencia de variante B:
Una secuencia de variante B de la solicitud o invencion es de 44 aminoacidos.
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Comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13 con xi = E, es dedr, la secuencia xi - X2 - X3 - X4, en la que: xi es E, y
X2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L).
Esta secuencia es un motivo de PDZ-BS particular. Normalmente se localiza en el extremo C del polipeptido, lo mas normalmente esta secuencia es la secuencia de los cuatro ultimos aminoacidos del extremo C del polipeptido.
Preferentemente, dicha secuencia de SEQ ID NO: 13 es ETRL (SEQ ID NO: 12).
En una secuencia de variante B de la solicitud o invencion, el aminoacido, que esta en la posicion 11, no es L. Es lo mas preferentemente H.
Polipeptidos de variante B ilustrativos en particular comprenden la protema G de la cepa del virus de la rabia recombinante depositada el 1 de abril de 2009 en la CNCM con el numero de deposito I-4143 (cuya protema G es una protema mutante de un solo punto de la protema G de I-4140; vease la Figura 21), el fragmento citoplasmico de la misma y los sub-fragmentos citoplasmicos conservativos de la misma.
La cepa I-4143 se diferencia de la cepa CVS-NIV (CNCM I-4140) en que su protema G tiene el aminoacido E en la posicion 521 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa), en lugar de Q (veanse la Tabla 2 mas adelante y la Figura 3D).
Condiciones apropiadas para la propagacion del virus I-4143 (virus de la rabia recombinante) comprenden la incubacion de dicho virus a 37 °C con 5 % de CO2 con celulas BHK-21 (sub-clon BSR) en un medio de crecimiento DMEM que contiene glucosa (por ejemplo, 4,5 g/l), piruvato de sodio y Glutamax (Invitrogen 31966047) y 5 % de FBS; vease el Ejemplo 1 mas adelante.
Polipeptidos de variante B ilustrativos en particular comprenden polipeptidos que comprenden el fragmento citoplasmico de SEQ ID NO: 20 o al menos un sub-fragmento conservativo del mismo. La secuencia de SEQ ID NO: 20 es una variante conservativa ilustrativa de la secuencia de SEQ ID NO: 6 (vease la Figura 19). Todavfa tiene un efecto positivo del crecimiento de neuritas, aunque a un nivel mas bajo que la secuencia de SEQ ID NO: 6 (veanse la Figura 3D y comentarios asociados en la seccion de ejemplos).
Las protemas G de las cepas I-4142 y I-4143 inducen un efecto significativamente positivo del crecimiento de neuritas, aunque este efecto es significativamente mas bajo que el de la protema G de la cepa CVS-NIV (I-4140); veanse el Ejemplo 1 y la Figura 3D.
Por tanto, cada una de las dos posiciones de aminoacidos contribuye al efecto de crecimiento de neuritas, es decir:
- la posicion de aminoacido, que, en la protema G de la cepa CVS-NIV, es la posicion 491 (es decir, H en la protema G de la cepa CVS-NIV), y
- la posicion de aminoacido, que, en la protema G de la cepa CVS-NIV, es el primer aminoacido de PDZ-BS de la protema G, es decir, la posicion 521 en la protema G de la cepa CVS-NIV (es decir, aminoacido Q en la protema G de la cepa CVS-NIV).
Definicion alternativa o complementaria de un polipeptido de la solicitud o invencion:
Un polipeptido de la solicitud o invencion es un polipeptido de crecimiento de pro-neuritas.
Un polipeptido de la solicitud o invencion comprende una secuencia parental y/o una secuencia de variante conservativa (secuencia de variante A o B) y/o una secuencia de fragmento conservativo como se definio anteriormente.
Alternativamente o complementariamente, un polipeptido de la solicitud puede definirse como que es la protema G de una cepa del virus de la rabia, o una secuencia de variante de la misma que deriva de la misma por una o varias sustituciones y/o adiciones y/o deleciones de aminoacidos, o una secuencia de fragmento de una protema G o protema G de variante tal, mas particularmente un fragmento citoplasmico o sub-fragmento de la misma, a condicion de que dicho polipeptido tenga la funcion de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, por ejemplo como se ilustra mas adelante, mas particularmente el crecimiento de neuritas a partir de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCc CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
Mas particularmente, un polipeptido de la solicitud puede definirse alternativamente o complementariamente como que es la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, o una secuencia de variante de la misma que
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deriva de la misma por una o varias sustituciones y/o adiciones y/o deleciones de aminoacidos, o una secuencia de fragmento de una protema G o protema de variante tal, mas particularmente un fragmento citoplasmico o sub- fragmento de la misma, a condicion de que dicha secuencia de variante o dicho fragmento haya retenido la funcion de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, por ejemplo como se ilustra mas adelante, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
Protemas de crecimiento de pro-neuritas ilustrativas, que no son la protema G de la cepa CVS-NIV y/o que son distintas de la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, y/o que son distintas de la protema de SEQ ID NO: 2, pero que todavfa son polipeptidos de crecimiento de pro-neuritas adecuados en particular comprenden las protemas G de las cepas del virus de la rabia recombinante depositadas el
1 de abril de 2009 en la CNCM con los numeros de deposito I-4142 y I-4143.
La cepa I-4142 se diferencia de la cepa CVS-NIV (CNCM I-4140) en que su protema G tiene el aminoacido L en la posicion 491 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa), en lugar de H (veanse la Tabla
2 mas adelante y la Figura 3D).
La cepa I-4143 se diferencia de la cepa CVS-NIV (CNCM I-4140) en que su protema G tiene el aminoacido E en la posicion 521 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa), en lugar de Q (veanse la Tabla 2 mas adelante y la Figura 3D).
Las protemas G de las cepas I-4142 y the I-4143 inducen un efecto significativamente positivo del crecimiento de neuritas, aunque este efecto es significativamente mas bajo que el de la protema G de la cepa CVS-NIV (I-4140).
Por tanto, cada una de las dos posiciones de aminoacidos contribuye al efecto de crecimiento de neuritas, es decir:
- la posicion de aminoacido, que, en la protema G de la cepa CVS-NIV, es la posicion 491 (es decir, H en la protema G de la cepa CVS-NIV), y
- la posicion de aminoacido, que, en la protema G de la cepa CVS-NIV, es el primer aminoacido de PDZ-BS de la protema G, es decir, la posicion 521 en la protema G de la cepa CVS-NIV (es decir, el aminoacido Q en la protema G de la cepa CVS-NIV).
Por lo tanto, polipeptidos de crecimiento de pro-neuritas ilustrativos comprenden la protema G de la cepa I-4142 y la protema G de la cepa I-4143, ademas de los fragmentos de estas protemas, mas particularmente los fragmentos citoplasmicos de las mismas (SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 en la Figura 19) y los sub-fragmentos citoplasmicos de las mismas, a condicion de que estos sub-fragmentos hayan retenido la funcion de inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, por ejemplo como se ilustra mas adelante, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas humanas, por ejemplo, de la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; vease, por favor, el Ejemplo 1 mas adelante para condiciones y materiales experimentales ilustrativos).
La solicitud se refiere mas particularmente a dicho polipeptido, para su uso en estimular y/o inducir el crecimiento de neuritas, mas particularmente para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion que implica un crecimiento de neuritas insuficiente o alterado, mas particularmente una neuritogenesis insuficiente o alterada.
Preferentemente, la longitud de aminoacidos de dicho polipeptido es inferior a 100 aminoacidos, mas preferentemente inferior a 90 aminoacidos.
La expresion "protema del virus de la rabia no apoptosica" esta prevista en el presente documento segun su significado habitual en el campo.
PDZ-BS de una protema G del virus de la rabia no apoptosica es de SEQ ID NO: 14.
Una protema G del virus de la rabia no apoptosica puede caracterizarse adicionalmente o alternativamente por el hecho de que su secuencia es la secuencia de una protema G de una cepa del virus de la rabia, y que no desencadena la apoptosis de neuronas humanas.
Medios ilustrativos para comprobar que un candidato a protema G del virus de la rabia es uno no apoptogenico son conocidos para el experto habitual en la materia.
Uno de los medios comprende comprobar que la cepa del virus de la rabia, que comprende esta protema G, es una cepa no apoptosica cuando infecta neuronas, mas particularmente neuronas humanas, tales como la lmea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC HTB11) o la lmea celular de neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), preferentemente la lmea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC HTB11). Tales medios son en particular utiles cuando una cepa del virus de la rabia que existe de forma natural que comprende el candidato a protema G esta disponible para analisis.
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Otros medios comprenden manipular geneticamente celulas para hacer que expresen el candidato a protema G, infectar celulas de neurona con candidato a protema G expresado y determinar que la apoptosis no es inducida por dicha infeccion.
Una ilustracion de tales medios se describe en Prehaud et al. 2003.
Celulas geneticamente manipuladas ilustrativas comprenden la lmea celular de Jurkat transgenica que se describe en Prehaud et al. 2003, mas particularmente en la pagina 10538 (vease el parrafo "inducible transgenic cell lines").
Celulas de neurona ilustrativas comprenden la lmea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC HTB11) o la lmea celular de neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), preferentemente la lmea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC HTB 11).
Condiciones experimentales ilustrativas para preparar las celulas geneticamente manipuladas que infectan las celulas de neurona comprenden aquellas descritas en Prehaud et al. 2003, mas particularmente en la pagina 10538 (vease el parrafo "inducible transgenic cell lines").
La deteccion de que la cepa del virus de la rabia o la celula geneticamente manipulada no induce la apoptosis de las celulas de neurona esta dentro del ambito del experto medio en la materia. Medios ilustrativos comprenden aquellos descritos en Prehaud et al. 2003 y Prehaud et al. 2005. Medios ilustrativos comprenden detectar que no se induce fragmentacion de ADN significativa, por ejemplo, por tincion de Hoechst (vease, Prehaud et al,2003, mas particularmente en la pagina 10538, parrafo "Detection of nuclear fragmentation by Hoechst staining"), y/o por el metodo de TUNEL (vease Prehaud et al. 2003, mas particularmente en la pagina 10538 (vease el parrafo "Detection of nuclear fragmentation by the TUNEL method"), y/o por electroforesis de ADN (vease Prehaud et al. 2005).
Medios ilustrativos adicionales o alternativos para detectar que no se induce fragmentacion de ADN significativa comprenden la deteccion de que la caspasa 8 no es activada, por ejemplo, siguiendo el procedimiento descrito en Prehaud et al. 2003, mas particularmente en la pagina 10538, parrafo "Detection of caspase activation"), con la condicion de que las celulas de neurona usadas deban entonces contener la caspasa 8, que es el caso de la lmea celular SK-N-SH.
Valores ilustrativos de apoptosis no significativa se muestran en la Figura 5D de Prehaud et al. 2003: vease la penultima columna con el encabezamiento "JrtTA-G-CVS":
- solo el 19 % de las celulas apoptosicas como se mide por tincion de Hoechst;
- solo el 4,7 % de las celulas apoptosicas como se mide por evaluacion de la activacion de la caspasa 8.
Las cepas del virus de la rabia que son cepas atenuadas (es decir, no patogenas, por ejemplo, no patogenas cuando se inyectan por via intramuscular en ratones inmunocompetentes), tales como la cepa ERA atenuada, la cepa RV194-2, la cepa AVO-1, la cepa SN10, la cepa SN-10-SAD, la cepa SAG2, son cepas apoptogenicas.
Aquellas cepas del virus de la rabia, que son patogenas, es decir, neurovirulentas in vivo (tales como la cepa CVS- NIV), son no apoptosicas.
Por tanto, una cepa del virus de la rabia no apoptogenica es una cepa patogena (neurovirulenta) (por ejemplo, patogena cuando se inyecta por via intramuscular en ratones inmunocompetentes).
El actual conocimiento es que:
- cuando una cepa del virus de la rabia no apoptogenica infecta una celula de neurona humana, la protema G que codifica se acumula en el citoplasma de dicha celula de neurona bajo la forma de estructuras globulares perinucleares, y no es difusivamente distribuida en el citoplasma de dicha celula de neurona;
- y que, por el contrario, cuando un virus de la rabia apoptogenico infecta una celula de neurona humana, la protema G que codifica no se acumula en el citoplasma de dicha celula de neurona bajo la forma de estructuras globulares perinucleares, sino que se distribuye difusivamente en el citoplasma de dicha celula de neurona.
Como se menciono anteriormente y se ilustra mas adelante, un polipeptido de la solicitud puede ser la protema G de una cepa del virus de la rabia.
Preferentemente, dicha protema G del virus de la rabia es:
i. la protema G de la cepa CVS-NIV, estando dicha cepa disponible de la CNCM con el numero de deposito I- 4140 (siendo la fecha de deposito el 1 de abril de 2009), y/o la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, (siendo la fecha de deposito el 30 de noviembre de 2001) y/o la protema de SEQ ID NO: 2; o
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ii. una protema de variante de dicha protema G del virus de la rabia de i., en la que dicha protema de variante todavfa es una protema del virus de la rabia, y en la que la secuencia del motivo PDZ-BS de dicha protema G de variante del virus de la rabia todavfa es la secuencia de SEQ ID NO: 14.
Preferentemente, dicha protema G del virus de la rabia es:
i. la protema G de la cepa CVS-NIV que esta disponible de la CNCM con el numero de deposito I-4140, y/o la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, y/o la protema de SEQ ID NO: 2; o
ii. una protema de variante de dicha protema G del virus de la rabia de i., en la que:
- dicha protema de variante consiste en una secuencia que es al menos el 95 % identica (preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, todavfa mas preferentemente al menos el 97,5 %, incluso todavfa mas preferentemente al menos el 98 %, lo mas preferentemente al menos el 98,5 %, todavfa lo mas preferentemente al menos el 99 %) a la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i. a lo largo de la longitud entera de la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i., y
- la secuencia del motivo PDZ-BS de dicha protema G de variante del virus de la rabia es la secuencia de SEQ ID NO: 14.
Preferentemente, dicha protema G del virus de la rabia es:
i. la protema G de la cepa CVS-NIV que esta disponible de la CNCM con el numero de deposito I-4140, y/o la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, y/o la protema de SEQ ID NO: 2; o
ii. una protema de variante de dicha protema G del virus de la rabia de i., en la que dicha protema de variante todavfa es una protema del virus de la rabia, y en la que:
- dicha protema de variante consiste en una secuencia que es al menos el 95 % identica (preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, todavfa mas preferentemente al menos el 97,5 %, incluso todavfa mas preferentemente al menos el 98 %, lo mas preferentemente al menos el 98,5 %, todavfa lo mas preferentemente al menos el 99 %) a la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i. a lo largo de la longitud entera de la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i., y
- la secuencia del motivo PDZ-BS de dicha protema de variante G del virus de la rabia es la secuencia de SEQ ID NO: 14.
Preferentemente, dicha protema G del virus de la rabia es:
i. la protema G de la cepa CVS-NIV que esta disponible de la CNCM con el numero de deposito I-4140, y/o la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, y/o la protema de SEQ ID NO: 2; o
ii. una protema de variante de dicha protema G del virus de la rabia de i., en la que dicha protema de variante todavfa es una protema del virus de la rabia, y en la que dicha protema de variante consiste en una secuencia que:
- es al menos el 95 % identica (preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, todavfa mas preferentemente al menos el 97,5 %, incluso todavfa mas preferentemente al menos el 98 %, lo mas preferentemente al menos el 98,5 %, todavfa lo mas preferentemente al menos el 99 %) a la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i. a lo largo de la longitud entera de la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i., y
- ha retenido el motivo PDZ-BS de SEQ ID NO: 14 de dicha protema G del virus de la rabia de i. y/o contiene un motivo de PDZ-BS, cuya secuencia es QTRL (SEQ ID NO: 14 con x-i=Q; X2=T; X3=R; X4=L).
Preferentemente, la longitud de aminoacidos de dicha protema de variante G del virus de la rabia de ii. no supera la longitud de dicha protema G del virus de la rabia de i. de mas de 50 aminoacidos. Preferentemente, la longitud de aminoacidos de dicha protema de variante G del virus de la rabia de ii. es no mas de 50 aminoacido mas baja que la longitud de dicha protema G del virus de la rabia de i., por ejemplo de la misma longitud que la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i.
Mas preferentemente, la longitud de aminoacidos de dicha protema de variante G del virus de la rabia de ii. comprende al menos la longitud de dicha protema G del virus de la rabia de i. menos 50 aminoacidos, y como maximo la longitud de dicha protema G del virus de la rabia de i. mas 50 aminoacidos, por ejemplo de la misma longitud que la secuencia de dicha protema G del virus de la rabia de i.
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Protemas G del virus de la rabia de crecimiento de pro-neuritas ilustrativas que no son la protema G de la cepa CVS- NIV (I-4140) y/o que son distintas de la protema codificada por el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758, y/o que son distintas de la protema de SEQ ID NO: 2, pero que todavfa son protemas G del virus de la rabia de crecimiento de pro-neuritas adecuadas en particular comprenden las protemas G de la cepa del virus de la rabia recombinante depositadas el 1 de abril de 2009 en la CNCM con el numero de deposito I-4142.
La cepa I-4142 se diferencia de la cepa CVS-NIV (CNCM I-4140) en que su protema G tiene el aminoacido L en la posicion 491 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa), en lugar de H (veanse la Tabla 2 mas adelante y la Figura 3D).
Un fragmento ilustrativo de la secuencia de SEQ ID NO: 19 (vease la Figura 19).
Otras secuencias que pueden estar adicionalmente presentes:
Como se menciono anteriormente y se ilustra mas adelante, un polipeptido de la invencion comprende una secuencia de aminoacidos, que tiene un efecto de crecimiento de pro-neuritas (y/o de brote de neuritas y/o de crecimiento de axones y/o de extension de arboles dendnticos).
Como se menciono anteriormente y se ilustra mas adelante, dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas puede definirse como una secuencia parental y/o una secuencia de variante conservativa (secuencia de variante A o B) y/o una secuencia de fragmento conservativo como se definio anteriormente.
Como se menciono anteriormente y se ilustra mas adelante, dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas puede, alternativamente o complementariamente, definirse como que es la secuencia de la protema G de una cepa del virus de la rabia (no apoptosica) (por ejemplo, la protema G de la CNCM I-4140, I-4142 o I-4143), o una secuencia de variante de la misma, que deriva de la misma por una o varias sustituciones y/o adiciones y/o deleciones de aminoacidos, o una secuencia de fragmento de una protema G o protema G de variante tal, mas particularmente un fragmento citoplasmico o sub-fragmento de la misma.
Ejemplos ilustrativos de tales fragmentos de protema G o protema de variante G en particular comprenden aquellos fragmentos, que han retenido el dominio citoplasmico y el dominio transmembranario de dicha protema G o protema G de variante.
Un dominio transmembranario tal en particular tiene la ventaja de anclar el fragmento citoplasmico en compartimento(s) intracelular(es) de las celulas, mas particularmente en el retroulo endoplasmico y/o la membrana de Golgi de las celulas, por lo que dicho fragmento citoplasmico ejerce mas eficientemente sus efectos de estimulacion y/o induccion de la neurogeneracion, neuroregeneracion y neuroproteccion. Veanse, por favor, los Ejemplos 4 y 5 mas adelante.
Por lo tanto, ademas de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas una secuencia, que ancla dicho polipeptido en la membrana del endoretroulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas, estando dicha secuencia de anclaje preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, lo mas preferentemente directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas.
Por lo tanto, ademas de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas una secuencia de aminoacidos, que ancla dicho polipeptido en la membrana del endoretroulo y/o en la membrana de Golgi (preferentemente en la membrana del endoretroulo y en la membrana de Golgi) de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas (por ejemplo, la lmea celular de neuroblastoma humano la lmea celular SH-SY5Y como se describe en los ejemplos de mas adelante, por ejemplo, el Ejemplo 4).
Dicha secuencia de anclaje esta preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o secuencia de variante A o secuencia de variante B. Lo mas preferentemente, dicha secuencia de anclaje esta directamente o indirectamente, preferentemente directamente, unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B.
Una secuencia de anclaje tal puede, por ejemplo, ser una secuencia de aminoacidos, que tiene la capacidad de anclar el dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 en la membrana del endoretroulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas (por ejemplo, la lmea celular de neuroblastoma humano la lmea celular SH-SY5Y como se describe en los ejemplos de mas adelante, por ejemplo, el Ejemplo 4).
Ilustrativo de una secuencia de anclaje tal es la secuencia del dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), preferentemente la secuencia del dominio transmembranario de la protema G del virus de la rabia CVS-NIV, que es de SEQ ID NO: 23.
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Por lo tanto, ademas de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, dicho polipeptido puede comprender ademas, preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o secuencia de variante A o secuencia de variante B, lo mas preferentemente directamente unido al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B:
- la secuencia del dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, o
- una secuencia, que se diferencia de dicha secuencia del dominio transmembranario G del virus de la rabia por al menos una sustitucion y/o delecion y/o adicion de aminoacidos, preferentemente por sustitucion (sustituciones) y/o delecion (deleciones) de aminoacidos, mas preferentemente por sustitucion (sustituciones) de aminoacidos, pero que ha retenido la capacidad de anclar dicho polipeptido (mas particularmente la capacidad de anclar el dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 -cuando dicha secuencia de anclaje esta directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6-), en la membrana del endoretmulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas (por ejemplo, la lmea celular de neuroblastoma humano la lmea celular SH-SY5Y como se describe en los ejemplos mas adelante, por ejemplo, el Ejemplo 4).
Por lo tanto, ademas de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas, preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o secuencia de variante A o secuencia de variante B, lo mas preferentemente directamente unido al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B:
- la secuencia del dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, o
- una secuencia, que se diferencia de dicha secuencia de dominio transmembranario G del virus de la rabia por al menos una sustitucion de aminoacidos y/o delecion y/o adicion, preferentemente por sustitucion (sustituciones) y/o delecion (deleciones) de aminoacidos, mas preferentemente por sustitucion (sustituciones) de aminoacidos, pero que ha retenido la capacidad de anclar el polipeptido de SEQ ID NO: 6 (cuando dicha secuencia de anclaje esta directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6), en la membrana del endoretmulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas.
Ejemplos preferidos de tales secuencias de anclaje en particular comprenden:
- la secuencia del dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, todavfa mas particularmente de la cepa CVS- NIV, por ejemplo la secuencia de SEQ ID NO: 23, o
- una secuencia de variante de las mismas, que es de 18 a 26 aminoacidos, preferentemente de 18 a 22 aminoacidos, mas preferentemente de 22 aminoacidos, y que es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 23 con respecto a la mas corta de las dos secuencias (es decir, con respecto a la mas corta de SEQ ID NO: 23 y de dicha secuencia de variante).
Una secuencia de anclaje tal es particularmente util cuando esta unida a una secuencia de crecimiento de pro- neuritas que es la secuencia de SEQ ID NO: 6 o dicha secuencia de variante A, mas particularmente la secuencia de SEQ ID NO: 6.
Por lo tanto, segun una realizacion de la invencion, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de la invencion comprende, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 23 seguida de (de extremo N a extremo C) la secuencia de SEQ ID NO: 6, en la que uno a cuatro aminoacidos, preferentemente un aminoacido (por ejemplo, M) esta/n opcionalmente presentes entre dicha secuencia de SEQ ID NO: 23 y dicha secuencia de SEQ ID NO: 6. Ilustrativo de un polipeptido tal es el polipeptido de SEQ ID NO: 25.
Ademas de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas:
- un fragmento del ectodominio de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, todavfa mas particularmente de la cepa CVS-NIV, y/o
- un peptido senal, siendo este peptido senal preferentemente el peptido senal de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, todavfa mas particularmente de la cepa CVS-NIV.
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Dicho fragmento de ectodominio y/o peptido senal pueden estar presentes en dicho polipeptido de la solicitud o invencion, ademas de dicha secuencia de anclaje.
Preferentemente, cuando un peptido senal esta comprendido en dicho polipeptido, dicho peptido senal es el primer componente en el extremo N del polipeptido.
Preferentemente, cuando un peptido senal y un fragmento de ectodominio estan comprendidos en dicho polipeptido, dicho fragmento de ectodominio esta comprendido en dicho polipeptido de la solicitud o invencion entre dicho peptido senal y dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, preferentemente entre dicho peptido senal y cualquier posible secuencia de anclaje que puede estar comprendida en dicho polipeptido.
Segun una realizacion, un polipeptido de la solicitud o invencion comprende, o consiste en, de su extremo N a su extremo C:
dicho peptido senal (por ejemplo, SEQ ID NO: 21), dicha secuencia de anclaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 23) y dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas.
Segun otra realizacion, un polipeptido de la solicitud o invencion comprende, o consiste en, de su extremo N a su extremo C:
dicho peptido senal (por ejemplo, SEQ ID NO: 21), dicho fragmento de ectodominio (por ejemplo, los dos aminoacidos GK), dicha secuencia de anclaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 23) y dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas.
Preferentemente, dicho fragmento de ectodominio es de uno a cuatro aminoacidos, mas preferentemente de 2 aminoacidos.
Preferentemente, dicho fragmento de ectodominio es un fragmento del extremo C de dicho ectodominio, mas preferentemente los ultimos uno a cuatro, mas particularmente los ultimos dos aminoacidos en el extremo C de dicho ectodominio.
Por lo tanto, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas (directamente o indirectamente, preferentemente directamente) unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de anclaje:
uno a cuatro aminoacidos, preferentemente dos aminoacidos, mas preferentemente uno a cuatro aminoacidos del extremo C del ectodominio de la protema G de un virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), todavfa mas preferentemente los dos ultimos aminoacidos del extremo C del ectodominio de la protema G de un virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), por ejemplo los aminoacidos GK.
Ejemplos de un polipeptido tal en particular comprenden el polipeptido de SEQ ID NO: 26 y los polipeptidos, que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 26.
Por lo tanto, un polipeptido de la solicitud o invencion puede comprender ademas un peptido senal, preferentemente el peptido senal de la protema G de una cepa del virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), estando dicha secuencia de peptidos preferentemente en el extremo N de dicho polipeptido (lo mas preferentemente en el mismo extremo N de dicho polipeptido, es decir, en el extremo N de cualquier secuencia de anclaje que pueda estar comprendida en dicho polipeptido).
Ejemplos de un polipeptido tal en particular comprenden el polipeptido de SEQ ID NO: 27 y los polipeptidos, que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 27.
Ejemplos de polipeptidos preferidos:
Polipeptidos preferidos de la solicitud comprenden polipeptidos, que son de menos de 100 aminoacidos, mas preferentemente de tan pocos aminoacidos como sea posible, mientras que todavfa se retiene un efecto de crecimiento de neuritas, mas preferentemente de menos de 90 aminoacidos.
Polipeptidos preferidos de la solicitud o invencion comprenden polipeptidos, que comprenden, o consisten en los fragmentos citoplasmicos de dichas protemas G, lo mas preferentemente el fragmento citoplasmico de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 (vease la Figura 19).
Polipeptidos preferidos de la solicitud o invencion tambien comprenden polipeptidos, que comprenden, o consisten en los 11-44 sub-fragmentos de estos fragmentos citoplasmicos.
Polipeptidos preferidos de la solicitud o invencion comprenden polipeptidos, que, ademas de dicha secuencia de crecimiento de pro-neuritas, comprenden al menos una secuencia de anclaje como se definio anteriormente (por ejemplo, la secuencia de anclaje de SEQ ID NO: 23; veanse, por favor, los Ejemplos 4-6 de mas adelante).
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Acidos nucleicos, vectores y celulas:
La solicitud, ademas de la invencion, tambien se refiere a cualquier acido nucleico, mas particularmente a cualquier ADN o ARN, que codifica un polipeptido de la solicitud o invencion, segun el codigo genetico universal, teniendo en cuenta su degeneracion.
Como se muestra en la Figura 15, un acido nucleico ilustrativo que codifica el fragmento citoplasmico de SEQ ID NO: 6 (es decir, el fragmento citoplasmico de la cepa CVS-NIV) es el acido nucleico de SEQ ID NO: 5.
Como se muestra en la Figura 16, un acido nucleico ilustrativo que codifica PDZ-BS de SEQ ID NO: 10 (es decir, PDZ-BS de la cepa CVS-NIV) es el acido nucleico de SEQ ID NO: 9.
La solicitud, ademas de la invencion, tambien se refiere a cualquier vector de acido nucleico, que comprende al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido de la solicitud o invencion. Dicho vector puede ser una transfeccion y/o vector de expresion.
Dicho vector de expresion puede comprender ademas al menos una senal de expresion y/o secuencia reguladora en la direccion 5' y/o en la direccion 3' de dicho acido nucleico, tal como al menos un promotor, o al menos un potenciador y al menos un promotor, en la direccion 5' de dicho acido nucleico. Dicho vector de expresion puede ser, por ejemplo, un plasmido.
Ilustrativo de tales vectores es el plasmido disponible de la CNCM con el numero de deposito I-2758.
De forma interesante, pueden usarse vectores de lentivirus, vectores de AAV, vectores de adeno-virus y vectores del virus incapacitado del herpes simple.
Alternativamente o complementariamente, un acido nucleico de la solicitud o invencion puede acoplarse a, o de otro modo asociarse a, un dendnmero tal como liposomas, o un polfmero cationico tal como DEAE-dextrano o polietilenimina, o una nanopartmula de solido inerte, tal como una partfcula de oro, o cualquier otro medio de transfeccion que el experto medio en la materia pueda encontrar apropiado.
La solicitud, ademas de la invencion, tambien se refiere a cualquier celula, que comprende al menos un polipeptido de la solicitud o invencion, y/o al menos acido nucleico de la solicitud o invencion y/o al menos un vector de la solicitud o invencion.
Dicha celula es preferentemente una celula, que ha sido geneticamente manipulada para comprender dicho polipeptido y/o acido nucleico y/o vector.
Dicha celula puede ser una celula eucariota, preferentemente una celula de mairnfero, por ejemplo una celula humana o una celula no humana, lo mas preferentemente una celula humana.
Dicha celula puede ser una celula procariota, preferentemente una bacteria, por ejemplo E. coli.
Dicha celula puede ser un virion, siempre que dicho virion no induzca ningun efecto significativamente perjudicial o no deseable al sujeto receptor, mas particularmente a un paciente humano. Preferentemente, dicha celula no es una celula embrionaria humana.
Usos:
La solicitud, ademas de la invencion, se refieren mas particularmente a dicho polipeptido y/o acido nucleico y/o vector y/o celula, para su uso en inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, mas particularmente en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion que implica una neuritogenesis insuficiente o alterada, mas particularmente un crecimiento de neuritas insuficiente o alterado.
Dicho uso es un uso no inmunogenico.
De hecho, aquellas protemas G del virus de la rabia, que son apropiadas para la solicitud o invencion, pueden definirse como protemas G no apoptosicas.
Por tanto, el polipeptido de la solicitud o invencion no induce la formacion de cuerpos apoptosicos tales como aquellos que se han descrito en la solicitud internacional PCT previamente publicada WO 03/048198.
Segun la solicitud o invencion, el polipeptido de la solicitud o invencion esta previsto como un efector de crecimiento de neuritas (y/o de desarrollo de axones y/o de dendritas), por ejemplo, para la diferenciacion de neuronas de progenitores de neuronas o neuronas neoplasicas, y/o para la regeneracion de neuronas de neuronas alteradas (siendo ambos efectos obtenidos mediante estimulacion del crecimiento de neuritas).
Por tanto, el polipeptido de la solicitud o invencion no es un agente o adyuvante inmunogenico, o como poco no se usa como un agente inmunogenico o adyuvante y no se usa en condiciones que permitinan que dicho polipeptido actuara de agente o adyuvante inmunogenico.
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Mas particularmente, a diferencia de las protemas G de cepas del virus de la rabia apoptosicas, tales como las protemas G de la cepa ERA atenuada y de las otras cepas del virus de la rabia atenuadas, el polipeptido de la solicitud o invencion no provoca una respuesta inmunitaria humoral detectable cuando se administra a neuronas.
El polipeptido de la solicitud o invencion no se usa en una composicion farmaceutica o farmaco, que fuera una composicion inmunogenica o una vacuna.
Por consiguiente, el polipeptido de la solicitud o invencion preferentemente no se acopla a, no se fusiona con y no se asocia a ningun antigeno, mas particularmente a ningun antigeno que fuera un antigeno viral, un antigeno de tumor, un antigeno de celula, cuya expresion en exceso o alteracion conducina a una patolog^a tal como una neuropatologfa.
Enfermedades, trastornos y condiciones:
La solicitud, ademas de la invencion, proporciona polipeptidos, acidos nucleicos, vectores y celulas. Estos productos inducen y/o estimulan la neuritogenesis, mas particularmente el crecimiento de neuritas, todavfa mas particularmente el crecimiento de neuritas humanas.
Un producto de la solicitud o invencion es preferentemente un vector de acido nucleico de la solicitud o invencion, mas particularmente un plasmido de la solicitud o invencion.
Mas particularmente, un producto de la solicitud o invencion induce y/o estimula la neuritogenesis, mas particularmente el crecimiento de neuritas de neuronas pre-mitoticas, neuronas neoplasicas, progenitores de neuronas, ademas de neuronas alteradas.
Por tanto, la solicitud, ademas de la invencion, se refieren a dicho producto, para su uso como un agente neurogenerativo y/o neuroregenerativo y/o neuroprotector.
Un producto de la solicitud o invencion estimula y/o induce el brote de neuritas y/o el crecimiento de axones y/o la extension de arboles dendnticos.
Un producto de la solicitud o invencion estimula la actividad del cono de crecimiento. Ademas, previene que el cono de crecimiento colapse tras el contacto con un agente de colapso del crecimiento, tal como LpA o estres oxidativo (vease el Ejemplo 1 mas adelante).
Un producto de la solicitud o invencion, por consiguiente, estimula y/o induce la sinaptogenesis y/o neurotransmision.
Un producto de la solicitud o invencion es un agente que inhibe la proliferacion de neuronas neoplasicas, mas particularmente como un agente de neuro-diferenciacion.
Un producto de la solicitud o invencion es un agente que estimula el desarrollo neuronal y/o la regeneracion neuronal y/o crecimiento de axones y/o desarrollo de dendritas y/o extension de arboles dendnticos y/o plasticidad neuronal y/o sinaptogenesis y/o neurotransmision.
Un producto de la solicitud o invencion es un agente que previene y/o inhibe y/o bloquea cualquier tipo de neurotoxicidad que conducina a la retraccion de neurita y/o colapso del cono de crecimiento.
Un producto de la solicitud o invencion es un agente que estimula y/o induce la actividad de crecimiento de neuritas y/o de crecimiento del cono despues de que dicha neurita y/o cono se hayan puesto en contacto con un agente neurotoxico.
Un producto de la solicitud o invencion es un agente que previene y/o inhibe y/o bloquea el colapso del cono de crecimiento y/o la retraccion de neuritas y/o dano o lesion axodendntica y/o rotura de la integridad sinaptica y/o perdida de la conectividad de neuronas y/o dano a terminaciones nerviosas y/o alteracion de la neurotransmision.
Un producto de la solicitud o invencion es un medio para inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas, que es en particular util:
- en inducir la diferenciacion de neuronas, por ejemplo en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una neoplasia del sistema nervioso, ademas de
- en regenerar neuronas alteradas, mas particularmente neuritas alteradas, por ejemplo en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad neurodegenerativa, trastorno o afeccion, en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de infecciones microbianas de las neuronas, o en proteger neuronas de agentes neurotoxicos o estres oxidativo.
Por tanto, la solicitud, ademas de la invencion, se refieren a dicho producto, para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de cualquier enfermedad, trastorno o afeccion que implica una neuritogenesis insuficiente o alterada, mas particularmente un crecimiento de neuritas insuficiente o alterado.
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Dicha enfermedad, trastorno o afeccion se define alternativamente o complementariamente como cualquier enfermedad, trastorno o afeccion que implica un ciclo de celulas de neurona desequilibrado, en el que dicho ciclo de celulas de neurona esta desequilibrado:
- bien por presencia excesiva o no deseada de neuronas pre-mitoticas (mas particularmente, por diferenciacion insuficiente de neuronas y/o por re-entrada excesiva o no deseada de neuronas post-mitoticas en el ciclo de celulas de neurona, como es el caso cuando se desarrolla una neoplasia en el sistema nervioso),
- o bien por degeneracion de neuronas excesiva o no deseada, mas particularmente degeneracion de neuritas excesiva o no deseada (como es el caso para una enfermedad neurodegenerativa, trastorno o afeccion, y para cierta infeccion microbiana de las neuronas).
Un producto de la solicitud o invencion puede usarse en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion, que altera el sistema nervioso central (SNC) y/o el sistema nervioso periferico (SNP), por ejemplo como una terapia neuro-restaurativa y/o prevencion y/o paliacion.
La expresion "sistema nervioso central" o "SNC" pretende significar en el presente documento el cerebro y (en el caso de un animal vertebrado) la medula espinal.
El sistema nervioso periferico (SNP) es la vasta red de nervios espinales y craneales que unen el cuerpo con el cerebro y la medula espinal. El SNP esta subdividido en el sistema nervioso autonomo (SN simpatico y SN parasimpatico) y el sistema nervioso somatico. El SNP consiste en neuronas sensitivas que corren de receptores de estfmulos al SNC y neuronas motoras que corren del SNC al musculo y glandulas.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad, trastorno o afeccion es o implica una infeccion microbiana del sistema nervioso, tal como una infeccion bacteriana y/o viral, mas particularmente una infeccion viral.
Dicha infeccion viral puede, por ejemplo, ser una infeccion por el virus del herpes simple (VHS), mas particularmente una infeccion por VHS de tipo 1 (que conduce a encefalopatfa viral).
Dicha infeccion microbiana puede ser una infeccion viral, que no induce apoptosis de neuronas, tal como una infeccion por el virus de la rabia.
Preferentemente, dicha infeccion microbiana es una infeccion microbiana que induce la apoptosis de neuronas, tal como la poliomielitis (vease Blondel et al., 2005).
Segun otra realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad, trastorno o afeccion es o implica una enfermedad, trastorno o afeccion no viral, mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no bacteriana y no viral, todavfa mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no microbiana.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad o trastorno es o implica una enfermedad neurodegenerativa o trastorno (por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa cronica o trastorno), tal como encefalopatfa no viral, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad de Huntington, esclerosis multiple (EM) o enfermedad genetica rara.
Preferentemente, dicha enfermedad neurodegenerativa o trastorno es una enfermedad no viral o trastorno, mas preferentemente una enfermedad no bacteriana y no viral o trastorno, todavfa mas preferentemente un trastorno no microbiano.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha afeccion es o implica una afeccion neurodegenerativa, tal como envejecimiento.
Preferentemente, dicha afeccion neurodegenerativa es una afeccion no viral, mas preferentemente una afeccion no bacteriana y no viral, todavfa mas preferentemente una afeccion no microbiana.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad, trastorno o afeccion es o implica una lesion ffsica o isquemica del sistema nervioso, tal como convulsion, accidente cerebrovascular, traumatismo, epilepsia.
Preferentemente, dicha lesion ffsica o isquemica es una enfermedad, trastorno o afeccion no viral, mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no bacteriana y no viral, todavfa mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no microbiana.
Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad, trastorno o afeccion implica la presencia de un agente neurotoxico qrnmico y/o de un estres oxidativo.
Preferentemente, dicha enfermedad, trastorno o afeccion es una enfermedad, trastorno o afeccion no viral, mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no bacteriana y no viral, todavfa mas preferentemente una enfermedad, trastorno o afeccion no microbiana.
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Segun una realizacion de la solicitud o invencion, dicha enfermedad es una neoplasia, mas particularmente una neoplasia que comprende neuronas neoplasicas.
El termino "neoplasia" esta previsto en el presente documento mas particularmente como una neoplasia maligna, mas particularmente un cancer, todavfa mas particularmente un tumor o una leucemia, incluso todavfa mas particularmente un tumor.
Un producto de la solicitud o invencion no actua de un agente inmunogenico. Mas particularmente, un producto de la solicitud o invencion no actua de un agente inmunogenico, que producina una respuesta humoral contra antigenos de tumor.
Preferentemente, un producto de la solicitud o invencion no puede, solo y por sf mismo, actuar de agente inmunogenico. Mas particularmente, un producto de la solicitud o invencion no puede, solo y por sf mismo, actuar de agente inmunogenico, que producina una respuesta humoral contra antigenos de tumor.
Un producto de la solicitud o invencion actua de agente antiproliferativo.
Un producto de la solicitud o invencion induce y/o estimula el crecimiento de neuritas de neuronas neoplasicas, induciendo asf y/o estimulando la diferenciacion de neuronas neoplasicas en neuronas maduras.
Dicha neoplasia puede ser una neoplasia del SNC y/o SNP, preferentemente un ganglioglioma, un tumor cerebral, un neurocitoma central, un meduloblastoma, un ependimoma, un teratoma, un neuroblastoma.
Preferentemente, dicha neoplasia es una neoplasia no viral, mas preferentemente una neoplasia no bacteriana y no viral, todavfa mas preferentemente una neoplasia no microbiana.
Cualquier modo de administracion que el experto pueda encontrar apropiado esta englobado por la solicitud o invencion.
Dependiendo de como se formule el producto de la solicitud o invencion, puede administrarse por administracion parenteral o enteral (por ejemplo, oral), preferentemente por administracion parenteral, mas preferentemente mediante inyeccion parenteral.
Composicion farmaceutica o farmaco: metodo de tratamiento:
La solicitud, ademas de la invencion, tambien se refieren a cualquier composicion farmaceutica o farmaco, que comprende al menos un polipeptido de la solicitud o invencion y/o al menos un acido nucleico de la solicitud o invencion y/o al menos un vector de la solicitud o invencion y/o al menos una celula de la solicitud o invencion.
La composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion puede usarse para el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion que implica un crecimiento de neuritas insuficiente o alterado como se describio anteriormente en mas detalle. La composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion no es una composicion inmunogenica y no es una vacuna.
La composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion puede comprender ademas al menos un vehroulo farmaceuticamente y/o fisiologicamente aceptable (diluyente, excipiente, aditivo, agente de ajuste del pH, emulsionante o agente dispersante, conservante, tensioactivo, gelificante, ademas de agente de tamponamiento y otro estabilizante y solubilizante, etc.).
La composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion no contiene preferentemente ningun adyuvante inmunitario.
Lo mas preferentemente, la composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion no comprende ningun antfgeno, mas particularmente ningun antfgeno que sea un antfgeno viral, un antfgeno de tumor, un antfgeno de celula, cuya expresion en exceso o alteracion conducina a una patologfa tal como una neuropatologfa.
La composicion farmaceutica o farmaco de la solicitud o invencion puede ser, por ejemplo, una disolucion lfquida, suspension, emulsion, comprimido, pfldora, capsula, formulacion de liberacion sostenida, o polvo. Preferentemente, se formula bajo una forma adecuada para administracion parenteral.
La solicitud tambien describe un metodo de tratamiento de un sujeto, mas particularmente de un ser humano, en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho sujeto o ser humano al menos un polipeptido de la solicitud y/o al menos un acido nucleico de la solicitud y/o al menos un vector de la solicitud y/o al menos una celula de la solicitud como se describio anteriormente.
En la solicitud o invencion, el termino "que comprende", que es sinonimo de "que incluye" o "que contiene", es de extremos abiertos y no excluye elemento(s), componente(s) o etapa(s) de metodo adicionales no citados, mientras que el termino "que consiste en" es un termino cerrado, que excluye cualquier elemento, etapa o componente adicional que no se haya citado explfcitamente.
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El termino "que consiste esencialmente en" es un termino parcialmente abierto, que no excluye elemento(s), etapa(s) o componente(s) adicionales no citados, en tanto que estos elemento(s), etapa(s) o componente(s) adicionales no afecten materialmente las propiedades basicas y novedosas de la materia de la solicitud o de la invencion.
El termino "que comprende" (o "comprende(n)"), por lo tanto, incluye el termino "que consiste en" ("consiste(n) en"), ademas del termino "que consiste esencialmente en" ("consiste(n) esencialmente en"). Por consiguiente, el termino "que comprende" (o "comprende(n)") significa, en la solicitud o invencion, como mas particularmente que engloba el termino "que consiste en" ("consiste(n) en"), y el termino "que consiste esencialmente en" ("consiste(n) esencialmente en").
Cada una de las divulgaciones relevantes de todas las referencias citadas en el presente documento se incorpora espedficamente por referencia. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion, y no a modo de limitacion.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: El dominio citoplasmico de la protema G de la cepa CVS-NIV no apoptosica del virus de la rabia (dominio citoplasmico de G-CVS-NIV o de "G-supervivencia") induce el crecimiento de neuritas, y el crecimiento de neuritas inducido es altamente resistente al agente de colapso del cono de crecimiento (es decir, LPA) y a estres oxidativo (H2O2).
La neuroregeneracion y neuroproteccion son hitos comunes en campos tan grandes como la neurotoxicidad, enfermedades neurodegenerativas, traumatismo-convulsion-accidente cerebrovascular, encefalopatia o incluso mas envejecimiento en general (vease la Figura 1).
Neuronas humanas inmaduras, tales como celulas de neuroblastoma, son capaces de diferenciarse adicionalmente si se tratan con las moleculas de senalizacion apropiadas. Este es el caso de las celulas SH-SY5Y cuando se tratan con db-AMPc permeable a la celula.
Los inventores han desarrollado una prueba de neuroproteccion funcional, que implica el uso de una lmea celular de neuroblastoma humano, tal como la lmea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. En este sistema, las celulas pueden ser adicionalmente diferenciadas y puede monitorizarse el crecimiento de las neuritas, que permite probar efectores estimulantes de la actividad del cono de crecimiento. Ademas, puede evaluarse la capacidad de neuritas estiradas para luchar contra los procesos de retraccion despues del tratamiento con farmaco, tal como acido lisofosfatfdico (LPA) o peroxido de hidrogeno (H2O2). Se ha demostrado que los datos reunidos con tales sistemas se correlacionan con los analisis de neurotoxicidad hechos in vivo.
El ejemplo a continuacion en particular demuestra que:
- la proteina G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (es decir, virulenta), es decir, la cepa CVS-NIV, tiene un efecto promotor del crecimiento de neuritas, es decir, algunas protemas G del virus de la rabia no apoptosicas inducen y/o estimulan la neuritogenesis;
- este efecto de crecimiento de neuritas es suficientemente fuerte para proteger neuronas del farmaco de colapso del cono de crecimiento (LPA) y estres oxidativo (H2O2);
- es la cola citoplasmica de la proteina G de dicha cepa del virus de la rabia CVS-NIV no apoptosica, que es responsable de este efecto de crecimiento de neuritas;
- protemas G del virus de la rabia apoptosicas no muestran este efecto de crecimiento de neuritas; mas particularmente la protema G de la cepa ERA, que se diferencia de la protema G de la cepa CVS-NIV en solo seis aminoacidos (y en solo dos aminoacidos en la cola citoplasmica), no muestra este efecto de crecimiento de neuritas;
- esto es en particular debido al hecho de que el motivo PDZ-BS que esta contenido en la cola citoplasmica de dicha protema G del virus de la rabia no apoptosica muestra una mutacion de un solo punto en comparacion con la de dicha protema del virus de la rabia apoptosica: la protema G de la cepa CVS-NlV no apoptosica tiene el aminoacido Q en la posicion 521 (posicion calculada con respecto a la protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV, correspondiente a la posicion 41 en el fragmento citoplasmico de dicha protema G), mientras que G-ERA tiene E en la misma posicion;
- el aminoacido, que esta en la posicion 491 en la protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV (posicion 11 en el fragmento citoplasmico de dicha protema G), tambien contribuye a este efecto de crecimiento de neuritas (aminoacido H).
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MATERIAL Y METODOS Celulas, virus y clones moleculares
SH-SY5Y es una lmea celular de neuroblastoma, que esta disponible de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC; 10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; EE.UU.) con el numero de deposito CRL-2266.
Las cepas del virus de la rabia (VRAB) ERA y CVS originales estan disponibles de la ATCC con el numero de deposito vr332 y vr959, respectivamente. Las cepas ERA y CVS, que se han usado en este estudio, han sido sometidas a pases en el laboratorio de los inventores durante los ultimos veinte anos en celulas BSR (un clon de celulas de rinon de hamster bebe-clon 21, numero de deposito de ATCC BHK-21). Estas cepas de pases son la cepa ERA-NIV y la cepa CVS-NIV, respectivamente.
En todos los ejemplos y las figuras de la solicitud, CVS significa CVS-NIV y ERA significa ERA-NIV (protema G CNCM I-2760; SeQ ID No: 4), a menos que se especifique de otro modo.
La cepa CVS-NIV (CVS HQ de VRABr) se ha depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) el 1 de abril de 2009 con los terminos del Tratado de Budapest (CNCM; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 PARIS CEDEX 15; FRANCIA). El numero de deposito de la CNCM es I-4140.
La obtencion y caracterizacion de los clones moleculares representativos de la protema G de la cepa ERA-NIV, es decir, de G-eRa-NIV, y de la protema G de la cepa CVS-NIV, es decir, de G-cVs-NIV, se han descrito en Prehaud et al. 2003.
Las secuencias de estas protemas G tambien estan disponibles con el numero de acceso AF 406693 (para G-ERA- NIV) y AF 406694 (para G-CVS-NIV); veanse tambien las Figuras 13A y 13B.
La protema G de la cepa CVS-NIV tambien esta disponible de la cepa de E. coli recombinante depositada el 30 de noviembre de 2001 en la CNCM bajo los terminos del Tratado de Budapest. El numero de deposito de la CNCM I- 2758. Esta E. coli recombinante comprende un plasmido (plasmido pRev-TRE-G-CVS; vease el documento WO 03/048198), que expresa induciblemente la protema G de la cepa CVS-NIV.
La protema G de la cepa ERA tambien esta disponible de la cepa de E. coli recombinante depositada el 30 de noviembre de 2001 en la CNCM bajo los terminos del Tratado de Budapest. El numero de deposito de la CNCM es I- 2760. Esta E. coli recombinante comprende un plasmido (plasmido pRev-TRE-G-ERA; vease el documento WO 03/048198), que expresa induciblemente la protema G de la cepa ERA.
Condiciones apropiadas para el cultivo de la cepa de E. coli recombinante que contiene el plasmido CNCM I-2758 que codifican la protema G de la cepa del virus de la rabia CVS-NIV y para el cultivo de la cepa de E. coli recombinante que contiene el plasmido CNCM I-2760 que codifica la protema G de la cepa ERA del virus de la rabia comprenden la incubacion de dicha cepa de E. coli recombinante a 37 °C en un medio de crecimiento LB-TYM estandar (en presencia de ampicilina).
Los virus de la rabia recombinantes (VRABr) se produjeron y aislaron siguiendo los procedimientos descritos por Faul et al. 2008. Se construyeron VRABr para alojar o bien las secuencias de "G supervivencia" o "G muerte" no mutantes (secuencia G de la cepa CVS-NIV y de la cepa ERA, respectivamente), o la cola citoplasmica de G supervivencia en un antecedente genico de G genetico de ERA, o la cola citoplasmica de G muerte en un antecedente genico de G genetico de CVS-NIV (vease la Figura 2).
Tambien se produjeron virus de la rabia recombinantes, que derivan de la cepa CVS-NIV por mutaciones en la secuencia codificante de G. Estos virus de la rabia recombinantes tienen una protema G, que se diferencia de la protema G de la cepa CVS-NIV por uno o dos aminoacidos, concretamente:
- por el aminoacido, que en la secuencia de protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV esta en la posicion 491 (posicion 11 en el fragmento citoplasmico de la misma); y/o
- por el aminoacido, que en la secuencia de protema G de longitud completa de la cepa CVS-NIV esta en la posicion 521 (posicion 41 en el fragmento citoplasmico de la misma).
Mas particularmente, se produjeron las siguientes cepas del virus de la rabia recombinante:
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Tabla 2:
- Posicion 491 en la protema G de longitud completa del virus (aminoacido H en la protema G de la cepa CVS-NIV) Posicion 521 en la protema G de longitud completa del virus (aminoacido Q en la protema G de la cepa CVS-NIV)
- CVS LE de VRABr
- L E
- CVS LQ de VRABr
- L Q
- CVS HE de VRABr
- H E
Se han depositado CVS LE de VRABr, CVS LQ de VRABr y CVS HE de VRABr en la CNCM bajo los terminos del Tratado de Budapest el 1 de abril de 2009. Los numeros de deposito de la CNCM son I-4141, I-4142 y I-4143, respectivamente.
Condiciones apropiadas para la propagacion del virus I-4141 o I-4142 o I-4143 (virus de la rabia recombinantes) comprenden la incubacion de dicho virus a 37 °C con 5 % de CO2 con celulas BHK-21 (sub-clon BSR) en un medio de crecimiento DMEM que contiene glucosa (por ejemplo, 4,5 g/l), piruvato de sodio y Glutamax (Invitrogen 31966047) y 5% de FBS.
Crecimiento de neuritas de alto rendimiento y ensayos de retraccion
Se siembran celulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y en placas de 24 pocillos (utensilios de plasticos Cell Bind, Corning, EE.UU.) a una densidad de 40,000 celulas por pocillo en medio no diferenciante [DMEMF12 (Invitrogen, R.U.) con 20 % de suero bovino fetal mas 1 % de Pen:Strep y 1 % de glutamina], y se cultivan durante la noche a 37 °C. 24 h despues de la siembra se sustituye el medio no de diferenciacion por medio diferenciante [medio neurobasal (Invitrogen, R.U.) complementado con suplemento B27 (Invitrogen, R.U.) 1 % de P/S, 1 % de glutamina y db-AMPc 1 mM (dibutiril AMPc es permeable a la membrana, Sigma)], y las celulas se incuban durante 6 h. Entonces, las celulas se infectan con vector vado, se infectan con VRABr a una MOI 3 en medio diferenciante. Despues de 1 h de incubacion, las celulas se lavan una vez con medio diferenciante, y despues de anadir medio diferenciante se incuban durante 24 h a 37 °C.
Para la diferenciacion natural, se usa el mismo procedimiento pero se omite db-AMPc.
30 h despues de la diferenciacion, las celulas se fijan con 3 % de paraformaldetndo en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 min a temperatura ambiente (TA), seguido de tratamiento durante 5 min con 0,1 % de Triton-X-100 y 50% de suero de cabra normal (NGS) en pBs durante 1 h a TA. Se usan Ab anti-tubulina pIII espedfico neuronal (Promega, Francia) y Ab anti-nucleocapside de VRAB para tenir los procesos de neuritas y para revelar la infeccion por VRAB respectivamente. Alternativamente, las celulas tambien se tinen con cristal violeta que preserva los procesos de neuritas.
El ensayo de retraccion es identico al ensayo de crecimiento como se ha mencionado anteriormente, excepto por la adicion de LPA bien 10 pM-30 pM o 50 pM (Sigma, EE.UU.) en medio diferenciante o bien H2O2 75 pM (Sigma, EE.UU.), en antioxidante B27 menos que contiene medio diferenciante. Se obtienen imagenes de las celulas usando un microscopio de UV Leica DM 5000B equipado con una camara DC 300FX (x40 o x20 objetivos) y se analiza usando el software ImageJ 1.38X (Wayne Rasband, NIH, EE.UU.,
http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su programa adicional NeuronJ (Meijering et al. 2004;
http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/). La longitud de neuritas promedio por neurona se determina a partir de experimentos por triplicado.
http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su programa adicional NeuronJ (Meijering et al. 2004;
http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/). La longitud de neuritas promedio por neurona se determina a partir de experimentos por triplicado.
Deteccion de antigenos de VRAB por citometria de flujo
Se diferenciaron celulas SH-SY5Y mediante tratamiento con db-AMPc y se infectaron con VRABr 6 horas despues de la diferenciacion. 24 horas despues de la infeccion, las celulas se recogieron y se trataron para la deteccion por citometna de flujo de o bien la glucoprotema de VRAB que alcanzo la membrana citoplasmica o bien la cantidad total de protema G expresada en las celulas infectadas. Los procedimientos seguidos se han descrito en Prehaud et al. 2003.
RESULTADOS y DISCUSION
Cola citoplasmica de G-CVS-NIV (es decir, la cola citoplasmica de la protema G de la cepa CVS-NIV) contiene una firma molecular que promueve el crecimiento de neuritas
En ausencia de infeccion, el tratamiento con db-AMPc desencadena la elongacion de neuritas (Figura 3A, los dos paneles izquierdos). Cuando las celulas se tratan con db-AMPc y se infectan con G-CVS-NIV de VRABr, presentan neuritas mas largas (191 %, Figura 3A, panel derecho central). Este resultado establece que G-CVS-NIV de VRABr
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promueve el crecimiento de neuritas cuando la actividad del cono de crecimiento se estimula por senalizacion de AMPc.
A diferencia, la longitud de las neuritas es similar entre celulas no infectadas y celulas infectadas con G-ERA de VRABr ambas tratadas con db-AMPc (Figura 3B), que muestra que la muerte de G que expresa ERA de VRABr tiene un fenotipo silencioso para el ensayo de crecimiento de neuritas. Hay que tener entonces en cuenta que el transcurso de tiempo del experimento (es decir, 30 h despues de la diferenciacion y 24 horas despues de la infeccion) es un momento de tiempo anterior al momento de tiempo donde el nivel maximo de apoptosis se detecta en celulas de neuroblastoma infectadas con ERA de VRABr (es decir, 48 h despues de la infeccion).
Usando VRABr que llevan el intercambio final de la protema G (vease la Figura 2) como se describe en la Figura 3C, los inventores muestran que este fenotipo es totalmente transferido por la cola citoplasmica solo. Este resultado establece firmemente que la cola citoplasmica de G-CVS-NIV contiene una firma molecular que promueve el crecimiento de neuritas cuando los procesos de elongacion se inician por la via de senalizacion de AMPc.
Ademas, se realizaron ensayos de crecimiento de neuritas con virus de la rabia recombinante, que se diferencian de la cepa CVS-NIV (G-CVS-NIV de VRABr) por uno o dos aminoacidos en sus protemas G respectivas.
Mas particularmente, se realizaron ensayos con CVS LE de VRABr, CVS LQ de VRABr y CVS HE de VRABr, que expresan una protema G que se diferencia de G-CVS-NIV por el aminoacido 491 y/o el aminoacido 521 (vease la Tabla 2 anteriormente). Los resultados de estos ensayos se ilustran por la Figura 3D. En la Figura 3D, todas las diferencias con respecto al control son estadfsticamente significativas (p<0,005 prueba de la t de Student):
- G-CVS HQ de VRABr frente a N.I.: p<0,0001;
- G-CVS LQ de VRABr frente a N.I.: p=0,0002;
- G-CVS HE de VRABr frente a N.I.: p=0,0111.
G-CVS-NIV de VRABr tiene H y Q en las posiciones 491 y 521 de su protema G, respectivamente (posiciones calculadas con respecto a la protema G de longitud completa de CVS-NIV, estas posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 41 en el fragmento citoplasmico de esta protema G, respectivamente).
CVS LQ de VRABr tiene L y Q en estas posiciones.
CVS HE de VRABr tiene H y E en estas posiciones.
CVS LE de VRABr tiene L y E en estas posiciones.
Como se ilustra por la Figura 3D, CVS LQ de VRABr y CVS HE de VRABr todavfa muestran un efecto positivo del crecimiento de neuritas, aunque a un grado significativamente mas bajo que CVS-NIV (G-CVS-NIV de VRABr) [analisis de la prueba de la t de Student: CVS HQ de VRABr frente a CVS LQ de VRABr: p = 0,0156; CVS HQ de VRABr frente a CVS HE de VRABr: p = 0,0009].
Por tanto, la posicion 491 y la posicion 521 de la protema G de la cepa CVS (posiciones 11 y 41 en el fragmento citoplasmico) estan ambas estrechamente involucradas en el efecto de crecimiento de neuritas y la posicion 521 tiene un contribucion predominante al mismo.
CVS LE de VRABr no indujo ningun efecto del crecimiento de neuritas significativamente positivo en comparacion con el control (vease la Figura 3C, donde G-CVS-Cito muerte de VRABr = CVS LE de VRABr).
La cola citoplasmica de G-CVS-NIV es un efector intrinseco que promueve la neuritogenesis, que funciona sinergicamente con AMPc
Los inventores investigaron si la expresion de la cola citoplasmica de G-CVS-NIV podna, sola y por sf misma, estimular la neuritogenesis. Se infectaron celulas SH-SY5Y con los diferentes VRABr (vease la Figura 2) y se monitorizo la elongacion de las neuritas.
Como se observo en la Figura 4A, la expresion de G-CVS-NIV o G-ERA-Cito supervivencia es suficiente para promover el crecimiento de neuritas. Estos datos establecen que el dominio citoplasmico de G-CVS-NIV contiene una firma molecular intrmseca que senalizo por un mecanismo desconocido los procesos de elongacion de neuritas. Cuando el mismo experimento se realizo con o sin db-AMPc, se observo que tanto las neuritas mediadas por G- CVS-NIV como AMPc funcionan sinergicamente (vease la Figura 4B).
El dominio citoplasmico basado en neuritogenesis de G-CVS-NIV es dependiente de la firma molecular y no de la cantidad de protema G expresada
Se analizo muy cuidadosamente la cantidad de glucoprotema del virus de la rabia producida bien monitorizando la cantidad total de antigeno de VRAB producido en las celulas SH-SY5Y tratadas con db-AMPc infectadas, o la 5 cantidad de protema G completamente procesada a la membrana citoplasmica. Los dos VRAB que expresan G- CVS-NIV o G-ERA tienen una cantidad similar de protema G expresada en total y en la membrana citoplasmica (vease la Figura 5). Asf, el fenotipo de supervivencia, es decir, el crecimiento de neuritas, no esta asociado a un fenomeno de cantidad de protema disponible, sino a determinante(s) espedfico(s) presente(s) en la secuencia del peptido de supervivencia citoplasmico.
10 Ademas, es interesante observar que G-ERA-Cito supervivencia de VRABr expresan ligeramente menos glucoprotema, pero este virus todavfa presenta un fuerte fenotipo de supervivencia (veanse las Figuras 3C, 4A). Significa que en tanto que el (los) determinante(s) de supervivencia esten presentes dentro de las celulas infectadas, la cantidad del peptido no es la principal advertencia y se estimula el crecimiento de neuritas.
La cola citoplasmica de G-CVS-NIV confiere neuroproteccion contra el farmaco de colapso del cono de 15 crecimiento
LPA es un lfpido bioactivo que actua de fosfolfpidos similares al factor de crecimiento que se ha mostrado que ejerce diversas funciones celulares que influyen en el crecimiento, motilidad, morfologfa y destino celulares. En celulas neuronales, LPA media en el colapso del cono de crecimiento y la retraccion de neuritas que implican la activacion de Rho y Rho-cinasa que conduce la reorganizacion del citoesqueleto de actomiosina.
20 Se investigo la capacidad de la cola citoplasmica de la protema G para proteger contra la retraccion de neuritas inducida por LPA 10 pM. Cuando celulas SH-SY5Y diferenciadas con db-AMPc se tratan con LPA, se observa la retraccion de las neuritas (vease la Figura 6A, izquierda). El mismo efecto tambien se observa cuando las celulas se infectan con G-ERA de VRABr (vease la Figura 6A, derecha). Por el contrario, las neuritas largas detectadas en celulas tratadas con db-AMPc e infectadas con G-CVS-NIV de VRABr se preservan totalmente contra el tratamiento 25 con un agente de colapso del cono de crecimiento (vease la Figura 6A, centro). Este resultado establece que G- CVS-NIV poseen algunas propiedades neuroprotectoras intnnsecas.
Esta proteccion tambien se reconoce tras la infeccion con G-ERA-Cito supervivencia de VRABr pero no con G-CVS- Cito muerte de VRABr: vease la Figura 6B. Por tanto, el uso de los mutantes de intercambio final establece firmemente que el fenotipo de neuroproteccion esta asociado a la expresion del dominio citoplasmico de G-CVS.
30 La neuroproteccion de la cola citoplasmica G-CVS-NIV a LPA es robusta
El intervalo fisiologico de LPA es normalmente aproximadamente 1 pM. Los inventores usaron una dosis alta de LPA, es decir, 10 pM, para validar la robustez de la neuroproteccion conferida por la cola citoplasmica de G-CVS- NIV.
Se probaron dosis sub-letales de LPA hasta 50 pM con el fin de monitorizar la eficiencia de esta neuroproteccion. 35 Celulas SH-SY5Y fueron o bien no infectadas o bien infectadas con G-CVS-NIV de VRABr o G-ERA-Cito supervivencia de VRABr. 30 horas despues de la diferenciacion, las celulas se trataron con diferentes dosis de LPA (vease la Figura 7). Los tratamientos de celulas no infectadas con cantidad creciente de LPA conducen a una retraccion lineal de la longitud de las neuritas (vease la Figura 7, izquierda). Por el contrario, las celulas que han sido infectadas con G-CVS-NIV de VRABr no presentan ningun colapso obvio de sus neuritas sea cual sea la dosis de 40 LPA (vease la Figura 7, centro). Se observan los mismos datos para las celulas infectadas con G-ERA-Cito supervivencia de VRABr para una dosis de LPA hasta 30 pM (vease la Figura 7, derecha). La ligera disminucion observada para la dosis mas alta de LPA (50 pM) podna ser con respecto a la cantidad de protema G mas baja expresada por este VRABr. En este caso, y para una concentracion muy alta de farmaco de colapso del cono de crecimiento, la cantidad relativa de protema G podna llegar a ser un factor limitante. En cualquier caso, estos datos 45 demostraron la muy alta eficiencia de la neuroproteccion conferida por la cola citoplasmica de G-CVS-NIV.
La cola citoplasmica de G-CVS-NIV confiere neuroproteccion contra el estres oxidativo
Basandose en las observaciones hechas anteriormente sobre la neuroproteccion conferida por el dominio citoplasmico de G-CVS-NIV en la retraccion de neuritas conducida por LPA, los inventores hicieron la pregunta de si este fenotipo podna ser generalizado a otros agentes mas ubicuos.
50 El estres oxidativo representa una via importante que conduce a degeneracion neuronal. El estres oxidativo participa en muchas enfermedades neurodegenerativas, pero tambien en caso de dano agudo al cerebro tal como traumatismo, accidente cerebrovascular y epilepsia. Por tanto, los inventores realizaron un estudio sobre los fenotipos de retraccion de neuritas despues del tratamiento con peroxido de hidrogeno. Cuando las celulas diferenciadas se someten a H2O2 75 pM, sus neuritas se acortan (vease la Figura 8, primer par de barras a la 55 izquierda). Se hace la misma observacion cuando las celulas han sido previamente infectadas con G-ERA de VRABr (vease la Figura 8, tercer par de barras). Por el contrario, no se observa retraccion de las neuritas cuando las celulas
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se infectan con G-CVS-NIV de VRABr (vease la Figura 8, segundo par de barras). Asf, la expresion de G-CVS-NIV confiere neuroproteccion contra un estres oxidativo.
Usando mutantes de intercambio final, los presentes inventores tambien mostraron que esta propiedad neuroprotectora esta asociada a la expresion de la cola citoplasmica de G-CVS-NIV como se describe en la Figura 8 (veanse cuarto y quinto pares de barras, referentes a G-CVS-Cito muerte de VRABr y G-ERA-Cito supervivencia de VRABr, respectivamente; vease la Figura 2 para la estructura de estos mutantes de intercambio final).
El PDZ-BS del extremo COOH del dominio citoplasmico de la proteina G del virus de la rabia esta criticamente involucrado en el destino del fenotipo de supervivencia de las celulas neuronales infectadas.
La delecion de los ultimos restos de 4 aa de G-Cito supervivencia (supervivencia G-protema-delta) fue suficiente para reducir significativamente el fenotipo de supervivencia de VRABr, como se mide por su efecto sobre el crecimiento de neuritas.
Vease, por ejemplo, la Figura 20, que muestra el crecimiento de neuritas medido 8 horas despues de la infeccion, en presencia de db-AMPc, como se indujo por CVS-NIV Delta-PDZ-BS de VRABr (CVS-NIV que tiene el aminoacido H en la posicion 491 y del que se ha delecionado PDZ-BS), en comparacion con el control (N.I.) y con G-CVS-NIV (CVS-NIV que tiene el aminoacido H en la posicion 491 y que tiene su PDZ-BS, es decir, QTRL en las posiciones 521-524): el efecto de crecimiento de neuritas inducido por CVS-NIV Delta-PDZ-BS de VRABr es significativamente diferente del inducido por el control (p = 0,0002 prueba de la t de Student) y es significativamente diferente del inducido por CVS-NIV de VRABr (p = 0,0003 prueba de la t de Student).
Los inventores en particular demuestran que:
- la proteina G de CVS-NIV (G-CVS-NIV) es capaz de promover el crecimiento de neuritas (neuritogenesis) en un sistema donde la actividad del cono de crecimiento se estimula por la via de senalizacion de AMPc (administrado como un efecto externo);
- El dominio citoplasmico de G-CVS-NIV es responsable de este fenotipo;
- La expresion de la cola citoplasmica de G-CVS-NIV tambien es responsable de la estimulacion del crecimiento de neuritas en ausencia de AMPc;
- Tanto G-CVS-NIV como AMPc funcionan como efectos sinergicos;
- Los fenotipos estan unidos a la firma molecular administrada por la cola citoplasmica de G-CVS-NIV, mas particularmente por aquellos aminoacidos que estan en las posiciones 491 y 521 en la proteina G-CVS-NIV de longitud completa (posiciones 11 y 41 en el fragmento citoplasmico de la misma), todavfa mas particularmente por el aminoacido que esta en la posicion 521 en la proteina G-CVS-NIV de longitud completa (posicion 41 en el fragmento citoplasmico de la misma), y que es parte de PDZ-BS;
- El fenotipo de supervivencia conferido por la cola citoplasmica de G-CVS-NIV es altamente resistente a los tratamientos por el agente de colapso del cono de crecimiento (es decir, LPA);
- El fenotipo de supervivencia conferido por la cola citoplasmica de G-CVS-NIV tambien es resistente al estres oxidativo (H2O2).
EJEMPLO 2: El dominio citoplasmico de G-CVS-NIV confiere neuroproteccion contra el efecto citopatico de VHS-1
La encefalitis del virus del herpes simple tipo I (EVHS) es la infeccion del sistema nervioso central mortal esporadica mas comun en los pafses occidentales y se manifiesta durante todo el ano en pacientes de todas las edades. La EVHS se desarrolla cuando el virus del herpes simple de tipo 1 infecta tejidos cerebrales de una manera lttica:necrotica.
Se investigo la capacidad de la cola citoplasmica de la proteina G para proteger contra el efecto citopatico del VHS-1 en celulas.
MATERIAL Y METODOS Crecimiento de neuritas
Como se describio en el Ejemplo 1 anteriormente.
Determinacion del efecto citopatico del VHS-1
Se produjeron VRABr como se describio en el Ejemplo 1 anteriormente.
Se propago VRABr en celulas BSR (veanse, Faul et al. 2008)
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Se propago la cepa KOS del VHS-1 (veanse, Skare et al. 1975) en celulas U373MG (ATCC HTB 17).
Se infectaron con vector vado celulas SH-SY5Y o se infectaron con VRABr en medio diferenciante menos db-AMPc durante 6 horas. Entonces, se anadio VHS-1 a una multiplicidad de infeccion de 3 (MOI 3) y se determinaron los fenotipos de crecimiento de neuritas 24 horas despues. Con el fin de establecer el efecto sobre el crecimiento de neuritas de la unica infeccion por VHS-1, se diferenciaron celulas SH-SY5Y por db-AMPc en medio diferenciante durante 6 horas y entonces se realizo la infeccion por VHS-1 (MOI 3).
Tambien se determino el fenotipo de crecimiento de neuritas 24 horas despues.
RESULTADOS y DISCUSION
Celulas de neuroblastoma SH-SY5Y, que habfan sido diferenciadas mediante tratamiento con db-AMPc, muestran una drastica retraccion de sus neuritas (hasta el 79 %, vease la Figura 9A) despues de la infeccion por VHS-1, que pueden con el tiempo conducir a la muerte de las celulas.
Al contrario, cuando las celulas han sido previamente infectadas con G-CVS-NIV de VRABr o G-ERA-Cito supervivencia de VRABr (vease el Ejemplo 1 anteriormente), presentan crecimiento de neuritas (vease la Figura 9B) y se protegen contra la extensa retraccion de neuritas (vease la Figura 9C).
EJEMPLO 3: El dominio citoplasmico de G-CVS-NIV presenta propiedades antiproliferativas para celulas de neuroblastoma
El neuroblastoma es el segundo tumor solido mas comun de la infancia que representa mas del 13 % de la muerte por cancer en ninos en los Estados Unidos. El pronostico depende del estadio clmico del trastorno y la edad del nino. Generalmente, la mayona de los pacientes con neuroblastoma se tratan con enfoques terapeuticos que incluyen cirugfa, radiacion y quimioterapia citotoxica.
Como el neuroblastoma maligno humano se caracteriza por mala diferenciacion y proliferacion no controlada de neuroblastos inmaduros, se han usado farmacos pro-diferenciativos tales como el acido all-trans-retinoico (ATRA) a alta dosis. Los inventores han demostrado que la cola citoplasmica de G-CVS-NIV de VRAB es capaz de promover el crecimiento de neuritas en celulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y (veanse los ejemplos anteriormente), es decir, de inducir la diferenciacion de estas celulas. Por tanto, los inventores quisieron responder la pregunta de si esta propiedad de diferenciacion era lo suficientemente eficiente como para controlar la proliferacion de tales celulas en cultivo.
MATERIAL Y METODOS Ensayo MTT
El ensayo se describe por Sargent 2003. Brevemente, celulas que han sido infectadas con vector vacfo o infectadas con VRABr durante 48 h en medio diferenciante sin db-AMPc, se tinen con la disolucion de MTT durante 3,5 horas a 37 °C con 5 % de CO2. Entones se elimina la mezcla de medio y la disolucion de tincion, se disuelven los cristales de MTT con el disolvente durante una hora a temperatura ambiente con agitacion constante. El ensayo se lee a una DO de 550 nm. Cada condicion representa un n de 8. El analisis estadfstico se hizo con pruebas de ANOVA.
Citometna de flujo
Se evaluaron el recuento de celulas y los cambios morfologicos por dispersion de la luz lateral y frontal (SSC y FSC, respectivamente) como se describe en Prehaud et al. 2003. Cada punto representa las celulas reunidas durante 1 minuto a baja velocidad. Los analisis de citometna de flujo se regularon en una poblacion viable con el fin de excluir celulas muertas o necroticas que representan menos del 1 % de la poblacion de celulas en el momento de tiempo de 48 h.
Crecimiento de neuritas
Como se describio en el Ejemplo 1 anteriormente.
Tratamiento con ATRA
Se realizo tratamiento con acido all-trans-retinoico (ATRA) de las celulas de neuroblastoma como ya se describio por Prehaud et al. 2005.
RESULTADOS y DISCUSION
En un primer caso, celulas SH-SY5Y fueron o bien no tratadas o bien tratadas con ATRA a 5 pM o 10 pM en el medio de cultivo. La proliferacion celular se ensayo o bien por citometna de flujo para celulas viables o bien por recuento de celulas mediante un ensayo MTT. Los datos se presentan en las Figuras 10A y 10B, respectivamente.
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En cada caso, el tratamiento con ATRA de las celulas conduce a un crecimiento mas lento de los neuroblastos con una disminucion en la proliferacion variable en entre el 27 % hasta el 55 % dependiendo de la prueba usada para monitorizar el crecimiento celular. Asf, celulas SH-SY5Y estan respondiendo eficazmente al efecto de farmacos antiproliferativos.
Por tanto, se infectaron celulas SH-SY5Y bien con G-CVS-NIV de VRABr o bien con G-ERA de VRABry se midieron la proliferacion de las celulas (establecida por un ensayo MTT), ademas del crecimiento de las neuritas (veanse las Figuras 11A y 11B). Los presentes inventores encontraron que el crecimiento celular estaba inversamente correlacionado con el crecimiento de neuritas, estableciendo que la propiedad de neurosupervivencia de G-CVS-NIV esta asociada por un fenotipo antiproliferativo intrmseco sobre neuroblastos.
Se infectaron celulas de neuroblastoma en una segunda serie de experimentos con o bien los virus parentales G- CVS-NIV de VRABr o G-ERA de VRABr, ademas de los mutantes de intercambio final (G-CVS-Cito muerte de VRABr o G-ERA-Cito supervivencia de VRABr; veanse el Ejemplo 1 anteriormente y la Figura 2). El crecimiento celular se midio por citometna de flujo y ensayo MTT (veanse las Figuras 12A y 12B, respectivamente). Los datos mostraron que en cada caso cuando las celulas se infectan con virus de la cola de G-Cito supervivencia promotoras del crecimiento de neuritas, la proliferacion de los neuroblastos se afecta variando de un retardo entre el 18,3 % al 23 %. Asf, G-Cito supervivencia posee una propiedad intrmseca para ralentizar el crecimiento de celulas de neuroblastos.
EJEMPLO 4: Demostracion experimental de que las propiedades de pro-supervivencia Cito-G estan conservadas en el vector de expresion
Este ejemplo demuestra que, cuando se expresa en la celula en ausencia de infeccion viral (polipeptidos administrados al principio como un vector de expresion), el dominio citoplasmico de VRAB de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (Cito-G) conserva las propiedades de pro-supervivencia (neuritogenesis y proteccion contra la retraccion).
Este ejemplo investiga ademas si dichas propiedades de supervivencia dependen del tamano y del anclaje en la membrana citoplasmico o endoplasmica.
Se realizo mutagenesis usando procedimientos de mutagenesis basada en PCR de oligonucleotidos satisfactoriamente usados para generar los VRAB del Ejemplo 1 (kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange Lightning, Agilent Technologies; division de producto de Stratagene; numero de catalogo 210518-12; kit usado segun las recomendaciones de fabricacion; patentes de EE.UU. N.° 7.176.004; 7.132.265; 7.045.328; 6.734.293; 6.489.150; 6.444.428; 6.391.548; 6.183.997; 5.948.663; 5.932.419; 5.866.395; 5.789.166; 5.545.552, y patentes en tramitacion).
Los oligonucleotidos se disenaron para introducir respectivamente sitios Nhel y Xmal en los extremos de las construcciones.
Los cebadores mutagenicos fueron:
GFullATG:
GGCCGCTAGCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTT (SEQ ID NO: 28)
GCitoATG:
GGCCGCTAGCATGAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCT (SEQ ID NO: 29)
GendSTOP:
GGCCCCCGGGTCACAGTCTGGTCTGACCCCCACT (SEQ ID NO: 30) mutTM.Cito:
CCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGT (SEQ ID NO: 31)
Los mutantes se cribaron por secuenciacion de las inserciones. Usando esta metodologfa, se obtuvieron especialmente las tres siguientes construcciones (G-Completa; G-[SP-(2aa)-TM-Cito]; G-Cito):
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G-Completa: numero de acceso AF 406694 (protema G de CVS-NIV)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNL
SGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDA
CRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDR
SLHSRVFPSGKCPGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASK
GSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPD
QLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGF
GKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILG
PDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPD
VHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRG
TGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL (SEQ ID NO: 2)
G-[SP-(2aa)-TM-Cito]:
G-[SP-(2aa)-TM-Cito] es una construccion que comprende (de extremo N a C):
- el peptido senal de una protema G (por ejemplo, el peptido senal de CVS-NIV; SEQ ID NO: 21);
- 2 aminoacidos (por ejemplo, desde el ectodominio de una protema G, tal como de G-CVS-NIV);
- el dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (por ejemplo, el dominio transmembranario de G-CVS-NIV; SEQ ID NO: 23);
- el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (por ejemplo, el dominio citoplasmico de G-CVS-NIV; SEQ ID NO: 6).
La secuencia de G-[SP-(2aa)-TM-Cito] que se uso en el presente ejemplo es:
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHN LRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL (SEQ ID NO: 27)
G-Cito:
G-Cito es una construccion que comprende (de extremo N a C): un aminoacido (por ejemplo, M) y el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (por ejemplo, el dominio citoplasmico de G-CVS-NIV; SEQ ID NO: 6).
La secuencia de G-Cito que se uso en el presente ejemplo es:
MRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL (SEQ ID NO: 24).
Las secuencias se muestran en la Figura 22.
El alineamiento de secuencias se muestra en la Figura 23.
Una representacion esquematica de las tres construcciones se muestra en la Figura 24.
Se eliminaron las inserciones por digestion de Nhel y Xmal y se clonaron en derivado de pCI-Neo desfosforilado con SAP (Promega, Francia) por procedimientos de clonacion estandar. Se transformaron celulas XL1-blue de E. coli (Stratagene, EE.UU.) con las construcciones de plasmido. Se purifico ampliamente el ADN de plasmido en columnas Purelink (Invitrogen, R.U.) y las inserciones se secuenciaron con el fin de verificar la integridad de la secuencia insertada en el plasmido. Se usaron clones de plasmido para nucleofectar las celulas de neuroblastoma humano [celulas SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), o celulas Ntera cl2D1 (ATCC CRL-1973)] usando la tecnologfa de electroporacion Amaxa GmbH (kit V Amaxa® nucleofector®, N.° de catalogo VCA 1003, Lonza, Alemania, siguiendo las recomendaciones del fabricante). La expresion de las protemas G se ensayo por citometna de flujo como se describio en Ejemplo 1.
Para la expresion transitoria, los ensayos biologicos se realizaron 24 h despues de la nucleofeccion.
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Para la expresion estable, ambas lmeas celulares nucleofectadas [SH-SY5Y o Ntera cl2D1] se trataron con G418 a 800 |jg/ml durante tres semanas. Se aislaron y congelaron los clones de celulas resistentes a G418. La lmea celular de control consiste en celulas, que han sido nucleofectadas con pCI-Neo solo sin ninguna insercion.
Se realizaron ensayos de crecimiento de neuritas y ensayos de retraccion como se describio en el Ejemplo 1.
Resultados ilustrativos se muestran en las Figuras 25-28.
La Figura 25 ilustra la expresion de un polipeptido que comprende el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, mas particularmente la expresion:
- de la protema G de longitud completa de dicha cepa del virus de la rabia,
- de un polipeptido, que comprende los dominios transmembranarios y citoplasmicos de dicha protema G, pero que no comprende el ectodominio de dicha protema G, y
- de un polipeptido, que comprende el dominio citoplasmico de dicha protema G, pero que no comprende el ectodominio y el dominio transmembranario de dicha protema G, en comparacion con la expresion medida con el plasmido de control.
Como ya se ilustro, la expresion al nivel de G es diferente y los fenotipos biologicos no estan directamente correlacionados con el nivel de expresion (vease mas adelante y la Figura 5).
La expresion transitoria del dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica -en ausencia de infeccion viral- induce y/o estimula el crecimiento de neuritas de celulas de neuroblastoma humano (Figura 26). Un polipeptido transitoriamente expresado que comprende el dominio transmembranario, ademas del dominio citoplasmico (pero que no comprende el ectodominio) de dicha protema G, es mas eficiente en inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas que la protema G de longitud completa transitoriamente expresada o que el dominio citoplasmico transitoriamente expresado de dicha protema G (dominio citoplasmico sin el ectodominio y sin el dominio transmembranario) (Figura 26).
La expresion estable del dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, o de polipeptidos o protemas que comprenden dicho dominio -en ausencia de infeccion viral- es factible en celulas de neuroblastoma humano (Figura 27). Un polipeptido establemente expresado que comprende el dominio transmembranario, ademas del dominio citoplasmico (pero que no comprende el ectodominio) de dicha protema G, es mas eficiente en inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas que la protema G de longitud completa establemente expresada o que el dominio citoplasmico establemente expresado de dicha protema G (dominio citoplasmico sin el ectodominio y sin el dominio transmembranario) (Figura 27). El dominio citoplasmico establemente expresado de dicha protema G (dominio citoplasmico sin el ectodominio y sin el dominio transmembranario) es tan eficiente en inducir y/o estimular el crecimiento de neuritas como la protema G de longitud completa establemente expresada (Figura 27).
La expresion de un polipeptido que comprende el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica -en ausencia de infeccion viral- confiere resistencia a un agente neurotoxico (por ejemplo, el farmaco de colapso del cono de crecimiento LPA; (vease la Figura 28, que muestra los resultados obtenidos con la construccion G-(SP-[2a]-TM-Cito)).
En las mismas condiciones experimentales, este lote de LPA esta induciendo el colapso del cono de crecimiento como se ilustra en las Figuras 6A, 6B, 7.
El dominio transmembranario de G-(SP-[2a]-TM-Cito) en particular permite que el polipeptido expresado por esta construccion se ancle en la membrana de Golgi y/o la membrana del endoretmulo de las celulas, aumentando asf la eficiencia del polipeptido expresado en inducir y/o estimular la neurogeneracion, neuroregeneracion y neuroproteccion.
Por lo tanto, el acoplamiento del dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica a una secuencia de anclaje de membrana tal aumenta los efectos de neurogeneracion, neuroregeneracion y neuroproteccion inducidos y/o estimulados por dicho dominio citoplasmico.
EJEMPLO 5: Demostracion experimental de que el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica posee propiedades intrinsecas para conducir el precursor neuronal (celulas EC) a la diferenciacion a neuronas maduras (compromiso)
El dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, tal como Cito-G (vease el Ejemplo 4 anterior; por ejemplo, SEQ ID NO: 6 o 24), promueve el crecimiento de las neuritas por tal promocion de la diferenciacion de la lmea celular de neuroblastoma SH-SY5Y (vease el Ejemplo 4 anterior).
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El Ejemplo 5 trae la demostracion experimental de que esta propiedad revela una capacidad mas amplia de dicho dominio citoplasmico para promover y para orientar el compromiso de la lmea celular hacia la diferenciacion neuronal.
Se ha descrito la produccion de neuronas humanas post-mitoticas puras de la lmea celular de carcinoma embrionario NTera 2cl.-D1 (ATCC CRL-1973) en la materia, por ejemplo, en Prehaud et al. 2005.
Se usaron construcciones que expresan el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, como se describe en el Ejemplo 4 anteriormente, por ejemplo:
- la construccion G-Completa que contiene la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (protema G de SEQ ID NO: 2) como insercion,
- la construccion G-Cito que contiene el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6) como insercion, y
- la construccion G-(SP)-[2aa]-TM-Cito, que contiene el peptido senal de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (peptido senal de SEQ ID NO: 21), dos aminoacidos (del extremo C del ectodominio de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, por ejemplo, GK), el dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus no apoptosica (dominio transmembranario de SEQ ID NO: 23) y el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6).
Se investigo la capacidad de construcciones que expresan G para inducir la diferenciacion de celulas NTera 2-D1 en neuronas.
Se procesaron celulas NTera 2-D1 que expresan G estables siguiendo el protocolo similar a neuroesfera de ATRA como se describe Prehaud et al. 2005.
Despues del ultimo tratamiento antimitotico y los dos duplicados, se sembraron celulas o bien para representar puntas de neuritas (5 dfas despues del ultimo duplicado) o bien la arquitectura de red neuronal (50 dfas despues del ultimo duplicado).
Resultados ilustrativos se muestran en las Figuras 29-31.
La expresion de un polipeptido que comprende el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica -en ausencia de infeccion viral- induce y/o estimula la produccion de neuronas humanas post- mitoticas maduras por diferenciacion de celulas de neuroblastoma: vease la Figura 29, que ilustra los resultados obtenidos con la expresion:
- de la protema G de longitud completa de una cepa del virus de la rabia no apoptosica,
- de un polipeptido que comprende el dominio transmembranario y el dominio citoplasmico (pero que no comprende el ectodominio) de dicha protema G,
- del dominio citoplasmico de dicha protema G (dominio citoplasmico sin el ectodominio y sin el dominio transmembranario),
en comparacion con el plasmido de control.
El polipeptido, que comprendfa el dominio transmembranario, ademas del dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica (pero que no comprende el ectodominio de dicha protema G), es mas eficiente en inducir y/o estimular dicha diferenciacion de neuronas humanas post-mitoticas que la protema G de longitud completa o que el dominio citoplasmico de dicha protema G (dominio citoplasmico sin el ectodominio y sin el dominio transmembranario); vease la Figura 30.
Ademas de inducir y/o estimular la produccion de neuronas humanas post-mitoticas maduras por diferenciacion de celulas de neuroblastoma, la expresion de un polipeptido que comprende el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica -en ausencia de infeccion viral- induce y/o estimula la organizacion de una red de neuronas humanas post-mitoticas maduras con axones largos (vease la Figura 31).
EJEMPLO 6: Demostracion experimental de que el dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica es capaz de promover la regeneracion de neuronas lesionadas
Neuronas lesionadas pueden tener la posibilidad de regenerarse, dependiendo de sus ongenes y del entorno local. Por ejemplo, las neuronas del sistema nervioso central del mairnfero tienen capacidad regenerativa muy limitada, aun cuando la lesion a un proceso periferico produzca el aumento de la regeneracion de las neuronas de los ganglios de las rafces dorsales. Esta evidentemente establecido que las senales de regeneracion intrmseca influyen en el exito de la regeneracion apropiada, implicando algunas de ellas la via de cinasa espedfica (Hammarlund et al. 2009).
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El dominio citoplasmico de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, tal como el dominio citoplasmico de SEQ ID NO: 6 contenido en la construccion Cito-G (vease el Ejemplo 4 anterior), presenta al menos dos propiedades interesantes en lo que se refiere a la medicina regenerativa. Primero, promueve el crecimiento de neuritas, que significa que dicho dominio citoplasmico puede estimular el cono de crecimiento neuronal.
En segundo lugar, preserva que las neuritas se retraigan despues del tratamiento con LPA o H2O2, que significa que dicho dominio citoplasmico puede estimular o reforzar las cerraduras moleculares que evitan el colapso del cono de crecimiento.
Con el fin de presentar la demostracion experimental que estas propiedades conducen a la regeneracion de una neurona lesionada, se investigo el fenomeno en un modelo celular. Se eligio la lmea celular NT2-N (celulas neuronales humanas), que expresan establemente la construccion G-[SP-(2aa)-TM-Cito] del Ejemplo 4 (construccion que contiene SEQ ID NO: 27 como una insercion). Se uso pCI-Neo-NT2-N como control.
La lmea celular NT2-N se derivo de celulas Ntera-2cl.D1 diferenciadas (NT2/D1; ATCC CRL-1973) como se describe en Prehaud et al. 2005, Cheung et al. 1999 y Paquet-Durand et al. 2003.
Para ensayos inducidos por aranazo, se sembraron celulas en utensilios de plastico de 12 pocillos Cell + recubiertos de poli-D-lisina-laminina (Sarstedt, Alemania), y se cultivaron durante dos dfas con el fin de recuperar completamente despues de la tripsinacion. El medio se cambio 10 h antes de los aranazos. Se hicieron heridas individuales con una aguja de inyeccion (26GX1/2", 12-4,5). Se hicieron al menos 10 aranazos en cada celula individual. Se fijaron celulas con PFA (4 %) 3 dfas despues de la formacion de heridas y se tineron con disolucion de cristal violeta. Se obtuvieron imagenes de las celulas usando un microscopio Leica Dm 5000B equipado con una camara DC 300FX (objetivo x20) y se analizaron usando el software ImageJ 1.38X (Wayne Rasband, NIH, EE.UU.,
http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su programa adicional NeuronJ. El porcentaje promedio de neurona en la regeneracion se determina a partir de 8 experimentos.
http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su programa adicional NeuronJ. El porcentaje promedio de neurona en la regeneracion se determina a partir de 8 experimentos.
Resultados ilustrativos se muestran en las Figuras 32-33.
La expresion de un polipeptido, que comprende el dominio citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, induce y/o estimula la regeneracion de neuronas humanas post-mitoticas maduras heridas (vease la Figura 32, que ilustra los resultados obtenidos con la expresion de un polipeptido que comprende los dominios transmembranarios y citoplasmicos de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica).
La regeneracion de neuritas asf inducida despues de la formacion de heridas es drastica, mas particularmente cuando el polipeptido comprende los dominios transmembranarios y citoplasmicos de dicha protema G, pero no comprende el ectodominio de dicha protema G (vease la Figura 33, que ilustra los resultados obtenidos con la expresion de un polipeptido que comprende los dominios transmembranarios y citoplasmicos de la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica).
EJEMPLO 7:
Se genero un ADNc de VRABr infeccioso a partir de la cepa del virus de la rabia CVS-N2c (Morimoto et al. 1999), un patogeno fijado y VRAB no apoptosico.
El ADNc de VRABr infeccioso asf generado (cN2C) se describe en Schnell et al. 2010.
El gen que codifican G-vir (la protema G de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, tal como la protema G de SEQ ID NO: 2) ha sido integrado en este ADNc de VRAB. El virus infeccioso se ha recuperado como se describio en el Ejemplo 1.
El virus recombinante ha sido inyectado a grupos de 8 ratones C57B16 hembra de seis semanas de edad por via intramuscular con el numero de partmulas de virus de G-vir de VRABr para desencadenar encefalitis mortal en el 80 % de los ratones. El numero de ratones y experimentos han sido cuidadosamente evaluados para minimizar la contribucion del animal.
Se ha monitorizado la progresion de la enfermedad puntuando signos clmicos y la mortalidad (como se describe en Camelo et al. 2001). En el transcurso de la infeccion, grupos de dos o tres ratones han sido perfundidos, y se han extrafdo cerebros, congelado criogenicamente y guardado a -80 °C antes de ser procesados para la extraccion de ARN (mitad del cerebro) y matrices de inmunohistoqmmica o multiples (segunda mitad del cerebro) con el fin de medir la neuroinvasividad del virus.
Este modelo permite analizar ademas diferentes parametros de la respuesta inmunitaria innata del cerebro desencadenada por la cepa de VRABr.
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Documento WO 03/048198; solicitud internacional PCT en nombre del Instituto Pasteur, Inv. Lafon et al., publicado el 12 de junio de 2003; ademas de sus solicitudes homologas nacionales / regionales.
Cada una de las divulgaciones relevantes de todas las referencias citadas en el presente documento se incorpora espedficamente por referencia.
Claims (35)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Un polipeptido, cuya secuencia consiste en menos de 100 aminoacidos, que comprende:- la secuencia de SEQ ID NO: 6, o- una secuencia, que:- es de 34 a 54 aminoacidos,- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de la longitud entera de la mas corta de las dos secuencias,- comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es X1-X2-X3-X4, en la que:X1 es cualquier aminoacido excepto E (preferentemente Q), y X2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L)(SEQ ID NO: 14),siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante A, o- una secuencia, que:- es de 44 aminoacidos,- es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 6,- comprende una secuencia de PDZ-BS, en la que dicha secuencia de PDZ-BS es X1-X2-X3-X4, en la que:x1 es E, yX2 es T o S o I (preferentemente no I, mas preferentemente T), y X3 es cualquier aminoacido (preferentemente R), y X4 es L o V (preferentemente L)(SEQ ID NO: 13 con X1 = E),y- no comprende el aminoacido L en la posicion 11, siendo dicha secuencia denominada secuencia de variante B, o- un fragmento de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, en el que dicho fragmento es de al menos 34 aminoacidos y ha retenido la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B, respectivamente,siendo dicho polipeptido para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, en el que dicho polipeptido se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
- 2. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de variante A es QTRL (SEQ ID NO: 10).
- 3. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha secuencia de variante A es de 44 aminoacidos y tiene el aminoacido H o L, preferentemente H, en la posicion 11.415101520253035404550
- 4. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de PDZ-BS de dicha secuencia de variante B es ETRL (SEQ ID NO: 12).
- 5. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 4, en el que dicha secuencia de variante B tiene el aminoacido H en la posicion 1l.
- 6. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho fragmento es el fragmento 11-44 de la secuencia de SEQ ID NO: 6.
- 7. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho polipeptido es o comprende el fragmento citoplasmico de la protema G de una cepa del virus de la rabia, o un sub-fragmento de un fragmento citoplasmico tal.
- 8. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 7, en el que dicha cepa del virus de la rabia es la cepa depositada en la CNCM con 1-4140,1-4142 o I-4143.
- 9. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho polipeptido comprende ademas una secuencia de aminoacidos, que ancha dicho polipeptido en la membrana del endoretmulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas, estando dicha secuencia de anclaje preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o secuencia de variante A o secuencia de variante B, lo mas preferentemente directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B.
- 10. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho polipeptido comprende ademas, preferentemente en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o secuencia de variante A o secuencia de variante B, lo mas preferentemente directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o de dicha secuencia de variante A o de dicha secuencia de variante B:- la secuencia del dominio transmembranario de la protema G de una cepa del virus de la rabia, mas particularmente de una cepa del virus de la rabia no apoptosica, o- una secuencia, que se diferencia de dicha secuencia de dominio transmembranario G del virus de la rabia por al menos una sustitucion y/o delecion y/o adicion de aminoacidos, preferentemente por sustitucion (sustituciones) y/o delecion (deleciones) de aminoacidos, mas preferentemente por sustitucion (sustituciones) de aminoacidos, pero que ha retenido la capacidad de anclar el polipeptido de SEQ ID NO: 6 (cuando dicha secuencia de anclaje esta directamente unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de SEQ ID NO: 6), en la membrana del endoretmulo y/o en la membrana de Golgi de celulas, mas particularmente de celulas neuronales, mas particularmente de celulas neuronales humanas.
- 11. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 9 o 10, en la que dicha secuencia de anclaje es:- la secuencia de SEQ ID NO: 23, o- una secuencia de variante de la misma, que es de 18 a 26 aminoacidos, preferentemente de 18 a 22 aminoacidos, mas preferentemente de 22 aminoacidos, y que es al menos el 94 % identica a dicha secuencia de SEQ ID NO: 23 a lo largo de la mas corta de las dos secuencias (es decir, a lo largo de la mas corta de SEQ ID NO: 23 y de dicha secuencia de variante).
- 12. El polipeptido para su uso segun una cualquiera reivindicaciones 9-11, en el que dicho polipeptido comprende dicha secuencia de SEQ ID NO: 6 o dicha secuencia de variante A, mas particularmente dicha secuencia de SEQ ID NO: 6.
- 13. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 12, en el que la secuencia de aminoacidos de dicho polipeptido consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 23 seguido de (de extremo N a extremo C) la secuencia de SEQ ID NO: 6, en el que uno a cuatro aminoacidos, preferentemente un aminoacido (por ejemplo, M) esta/n opcionalmente presente/s entre dicha secuencia de SEQ ID NO: 23 y dicha secuencia de sEq ID NO: 6.
- 14. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que dicho polipeptido es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25.
- 15. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en el que la secuencia de aminoacidos de dicho polipeptido comprende ademas (directamente o indirectamente, preferentemente directamente) unida al primer aminoacido en el extremo N de dicha secuencia de anclaje:uno a cuatro aminoacidos, preferentemente dos aminoacidos, mas preferentemente uno a cuatro aminoacidos del extremo C del ectodominio de la protema G de un virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), todavfa mas preferentemente los dos ultimos aminoacidos del extremo C del ectodominio510152025303540455055de la protema G de un virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), por ejemplo aminoacidos GK.
- 16. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 15, en el que dicho polipeptido es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26.
- 17. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-16, en el que dicho polipeptido comprende ademas un peptido senal, preferentemente el peptido senal de la protema G de una cepa del virus de la rabia (por ejemplo, una cepa del virus de la rabia no apoptosica), estando dicha secuencia de peptidos preferentemente en el extremo N de dicho polipeptido (lo mas preferentemente en el mismo extremo N de dicho polipeptido, es decir, en el extremo N de cualquier secuencia de anclaje que puede estar comprendida en dicho polipeptido).
- 18. El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 17, en el que dicho polipeptido es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27.
- 19. Un acido nucleico que codifica el polipeptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que dicho acido nucleico es para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, y en el que dicho acido nucleico se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
- 20. Un vector que comprende un acido nucleico que codifica el polipeptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que dicho vector es para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, y en el que dicho vector se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
- 21. Una celula, que comprende el polipeptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y/o un acido nucleico que codifica dicho polipeptido y/o un vector que comprende dicho acido nucleico, en la que dicha celula es para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, y en la que dicha celula se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
- 22. Una composicion farmaceutica o farmaco, que comprendfa al menos uno del polipeptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, el acido nucleico como se define en la reivindicacion 19, el vector como se define en la reivindicacion 20, la celula como se define en la reivindicacion 21, en la que dicha composicion farmaceutica es para su uso en el tratamiento y/o la paliacion y/o prevencion de una enfermedad o trastorno que afecta el sistema nervioso por estimulacion y/o induccion del crecimiento de neuritas y/o brote de neuritas y/o crecimiento de axones y/o extension de arboles dendnticos de neuronas de dicho sistema nervioso, y en la que dicha composicion farmaceutica se usa como un principio activo para dicha estimulacion y/o induccion.
- 23. El polipeptido de una cualquiera para su uso segun las reivindicaciones 1-18, el acido nucleico de la reivindicacion 19, el vector de la reivindicacion 20, la celula de la reivindicacion 21, o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 22, que se usa para estimular y/o inducir la sinaptogenesis y/o neurotransmision y/o plasticidad neuronal.
- 24. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, el acido nucleico para su uso segun la reivindicacion 19 o 23, el vector para su uso segun la reivindicacion 20 o 23, la celula para su uso segun la reivindicacion 21 o 23, o la composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 22 o 23, que se usa como un agente neurogenerativo y/o neuroregenerativo y/o neuroprotector.
- 25. El polipeptido de una cualquiera para su uso segun las reivindicaciones 1-18, 23 y 24, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23 y 24, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23 y 24, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 y 24, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22, 23 y 24, en el que dicho uso es en un uso no inmunogenico y/o dicho producto no es un agente inmunogenico o adyuvante.
- 26. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23-25, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 y 23-25, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 y 23-25, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21 y 23-25, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que dichas neuronas son neuronas que estan alteradas por neurodegeneracion.
- 27. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23-26, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 y 23-26, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 y 23-26, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21 y 23-26, o la51015202530354045composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-26, en el que dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad neurodegenerativa o trastorno, tal como encefalopatfa no viral, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad de Huntington, una enfermedad neurodegenerativa relacionada con la edad o trastorno, EM o enfermedad genetica rara.
- 28. El polipeptido para su uso segun 26 o 27, el acido nucleico para su uso segun la reivindicacion 26 o 27, el vector para su uso segun la reivindicacion 26 o 27, la celula para su uso segun la reivindicacion 26 o 27, o la composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 26 o 27, en el que dicha enfermedad o trastorno es EM.
- 29. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23-25, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 y 23-25, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 y 23-25, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21 y 23-25, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que dichas neuronas son neuronas que estan alteradas por una infeccion microbiana del sistema nervioso y/o por una lesion ffsica o isquemica del sistema nervioso y/o por un agente neurotoxico qrnmico y/o por un estres oxidativo.
- 30. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, 23-25 y 29, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23-25 y 29, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23-25 y 29, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23-25 y 29, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 y 29, en el que dicha enfermedad o trastorno implica una infeccion microbiana del sistema nervioso, tal como poliomielitis.
- 31. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, 23-25 y 29, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23-25 y 29, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23-25 y 29, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23-25 y 29, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 y 29, en el que dicha enfermedad o trastorno es una lesion del sistema nervioso ffsica o isquemica, tal como convulsion, accidente cerebrovascular, traumatismo, epilepsia.
- 32. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, 23-25 y 29, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23-25 y 29, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23-25 y 29, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23-25 y 29, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 y 29, en el que dicha enfermedad o trastorno implica la presencia de un agente neurotoxico qrnmico y/o de un estres oxidativo.
- 33. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23-25, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 y 23-25, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 y 23-25, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21 y 23-25, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que dichas neuronas son neuronas pre-mitoticas o progenitores de neuronas.
- 34. El polipeptido de una cualquiera para su uso segun las reivindicaciones 1-18, 23-25 y 33, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23-25 y 33, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23-25 y 33, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23-25 y 33, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 y 33, que se usa como agente neuro-diferenciador.
- 35. El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, 23-25, 33 y 34, el acido nucleico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23-25, 33 y 34, el vector para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 20, 23-25, 33 y 34, la celula para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23-25, 33 y 34, o la composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, 33 y 34, en el que dicha enfermedad es un tumor del SNC y/o SNP, tal como un ganglioglioma, un tumor cerebral, un neurocitoma central, un meduloblastoma, un ependimoma, un teratoma, un neuroblastoma.
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