ES2640524B1

ES2640524B1 - Uso de tcfl5/cha como nuevo marcador para el pronóstico y/o diagnóstico diferencial de leucemias linfoblásticas agudas

Info

Publication number: ES2640524B1
Application number: ES201630400A
Authority: ES
Inventors: Manuel Fresno Escudero; Núria GIRONÈS PUJOL; Manuel RAMÍREZ ORELLANA
Original assignee: Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Universitario Nino Jesus; Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Univ Nino Jesus; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Universitario Nino Jesus; Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Univ Nino Jesus; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2018-09-24
Anticipated expiration: 2036-04-01
Also published as: ES2640524A1; WO2017168031A1

Abstract

La presente invención proporciona un método pronóstico y/o para el diagnóstico diferencial de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:#a) determinar de manera simultánea los niveles de expresión de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biológica aislada de dicho paciente; y#b) comparar los niveles de expresión de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,#donde una reducción en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo,#donde preferiblemente dichas muestras de referencia corresponden a una o más muestras de pacientes con LLA o a líneas establecidas de LLA. Proporciona también un kit para la implementación de dicho método. Asimismo, se refiere a un método para el diagnóstico diferencial, la clasificación o estratificación de los pacientes en base a dicho pronóstico; un método para el tratamiento; y un método para la monitorización de la progresión de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA.

Description

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LLA de adultos y sigue siendo una enfermedad agresiva con supervivencia libre de enfermedad a 5 anos entre el 20 y el 50%. El pronostico sigue siendo pobre en ninos y adultos. Las recaidas tempranas son comunes en T-LLA y se asocian con un mal pronostico. La base del tratamiento actual es el diagnostico hemopatologico y se pueden agrupar en subtipos, basado en translocaciones cromosomicas y en perfiles de expresion genica (Inaba, H., et al., Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 2013. 381(9881): p. 194355).

TCFL5 es un factor de transcripcion de la familia basic helix-loop-helix y uno de los 14 genes que caracterizan las leucemias TEL/AMLI-positivas (Gandemer V, Rio AG, de Tayrac M, et al. Five distinct biological processes and 14 differentially expressed genes characterize TEL/AML1-positive leukemia. BMC Genomics. 2007;8:385). Asimismo, ha sido identificado como uno de los 5 factores geneticos asociados a la resistencia a vincristina en LLA (Silveira VS, et al. Gene expression pattern contributing to prognostic factors in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 2013;54:310-314, Tabla 1). Silveira VS, et al. tambien describen una asociacion significativa entre niveles mas altos de expresion del gen TCFL5 y el estado de la medula osea y con un fenotipo B-LLA ETV6/RUNX1 negativo.

TCFL5 ha sido tambien descrito como un gen diana de NOTCH-1, un importante mediador en el desarrollo de leucemias T-LLA (Weerkamp, F., et al., Identification of Notch target genes in uncommitted T-cell progenitors: No direct induction of a T-cell specific gene program. Leukemia, 2006. 20(11): p. 1967-77). El factor de transcripcion CHA fue clonado por primera vez por los inventores, siendo descrito como una isoforma del gen TCFL5 (Rodriguez, C.I., N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity. J Biol Chem, 2003. 278(44): p. 43135-45).

La estratificacion de los pacientes de LLA permite adaptar la intensidad de la terapia al riesgo de recaida del paciente, contribuyendo asi a mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes y/o a evitar recaidas. Los perfiles de expresion genica pueden proporcionar una buena herramienta para la subclasificacion y la estratificacion terapeutica de los pacientes (Zhou, Y., et al., Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia. Hum Pathol 2012. 43: 1347-1362; Mullighan, C. G., Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 2012. 122: 3407-3415; Mullighan, C. G., Genomic profiling of B-progenitor acute lymphoblastic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 2011. 24: 489-503; Harvey, R. C., et al., Identification of novel cluster groups in pediatric high-risk

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B-precursor acute lymphoblastic leukemia with gene expression profiling: correlation with genome-wide DNA copy number alterations, clinical characteristics, and outcome. Blood 2010. 116: 4874-4884;Van Vlierberghe P, Ferrando A. The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest. 2012;122:3398-3406 ).

En EEUU se realizo un gran ensayo clmico denominado "high-risk ALL Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments” (TARGET) fruto de la colaboracion entre el Instituto Nacional del Cancer (NCI) y el Grupo de Oncologia Infantil (COG), para la identification y validation de nuevas dianas terapeuticas. Se analizaron 207 muestras de 272 (75%) pacientes de LLA de celulas B precursoras de alto riesgo de los pacientes participates en el ensayo clmico COG p9906 en un esfuerzo para identificar subgrupos de estos pacientes de alto riesgo caracterizados por presentar perfiles de expresion genica caracteristicos. Los resultados de dicho estudio se describen en la solicitud de patente WO2009/064481. En particular, se identificaron marcadores geneticos asociados con alto riesgo en pacientes de B-LLA y el uso de los mismos para el diagnostico, pronostico y/o en la determination de la eficacia del tratamiento. Mas espedficamente los metodos descritos comprenden la determinacion de los niveles de expresion de genes seleccionados del siguiente grupo: CENTG2 (ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 1); PTPRM (protein tyrosine phosphatase, receptor type, M); STAPl (signal transducing adaptor family member 1); CCNJ (cyclin J); PCDH17 (procadherin 17); MCAM (melanoma cell adhesion molecule); CAPN3 (calpain 3); CABLESl (Cdk5 and Abl enzyme substrate 1); GPR155 (G protein-coupled receptor 155); MUC4 (mucin 4); GPRl 10 (G protein-coupled receptor 110); IGJ (immunoglobulin J polypeptide); NRXN3 (neurexin 3); CD99 (CD99 molecule); CRLF2 (cytokine receptor-like factor 2); ENAM (enamelin); TP53INP1 (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1); IFITMl (interferon induced transmembrane protein 1); IFITM2 (interferon induced transmembrane protein 2); JJTTM3 (interferon induced transmembrane protein 3); TTYH2 (tweety homolog 2); SEMA6A (semaphorin 6A); TNFSF4 (tumor necrosis factor superfamily, member 4); y SLC37A3 (solute carrier family 37, member 3).

WO2015/092755 reporta un metodo para el diagnostico o pronostico de leucemia linfoblastica aguda de alta hiperdiploidia (HeH-ALL en sus siglas en ingles) mediante la determinacion simultanea de la presencia/ausencia de los cromosomas 6, 18 y 21 utilizando la tecnologia iFISH.

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WO2008/019872 se refiere a un metodo para el diagnostico de leucemia linfoblastica aguda en ninos mediante la determination de los niveles de expresion de al menos 14 genes de los descritos en las tablas 1-4 o 5-16, en especial aquellos mostrados en la Figura 3 de dicha publication: DNTT, SBGR101, DEFA3, CAMP, FCER2, DEFA4, BPI, PGLYRP1, LTF, SBGR2, NM_003526, CEACAM8, RNASE3, y ELA2.

Asi pues, a pesar de los avances en el tratamiento de la LLA, existe una necesidad urgente de identificar biomarcadores espedficos que permitan monitorizar la eficacia del tratamiento y el pronostico de la enfermedad. La mejora de los metodos pronosticos es esencial para poder predecir de manera fiable el riesgo del paciente y asi optimizar la estrategia de tratamiento permitiendo personalizar la terapia, reduciendo la toxicidad en pacientes de bajo riesgo y permitiendo terapias agresivas en pacientes de riesgo elevado.

La adoption de la terapia mas adecuada para cada paciente de LLA gracias a su correcta clasificacion en funcion del pronostico de la enfermedad permitira aumentar el porcentaje de exito del tratamiento, consiguiendo un mayor porcentaje de supervivencia y evitando recaidas, presentando tambien como ventaja la reduction de los costes de tratamiento y hospitalization asociados.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los inventores efectuaron un analisis bioinformatico partiendo de datos de secuencias de RNAm de TCFL5 publicadas en las bases de datos de secuenciacion de RNA "RNAseq” (NCBI, Ensemble, Vega y EC gene) en el que se analizaron las uniones de exones, y se establecieron los mensajeros consenso expresados en humano (ver Figura 1 y Tabla I del Ejemplo 1). En base a dichos resultados, los inventores establecieron que el gen TCFL5 presenta a nivel de RNAm 6 isoformas mayoritarias distintas: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 y (6) CHA (Tcfl5R2b o R2b), aumentando el numero de isoformas respecto a las 2 isoformas previamente descritas: TCFL5 y CHA.

En el presente documento cuando se hace referencia a la isoforma TCFL5 se refiere a aquella que presenta E1, E2a, E3, E4 (E4a o E4b), E5 y E8; es decir, engloba a TCFL5R y TCFL5R4b.

La isoforma CHA fue descrita previamente por los inventores (Rodriguez, C.I., N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity. J Biol Chem, 2003. 278(44): p. 43135-45) y se origina

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debido a que CHA utiliza un promotor alternativo situado entre el exon 1 y 2, presentando como exon inicial E2b. A nivel RNAm CHA presenta E2b, E3, E4, E5 y E8. Asi pues se diferencia de TCFL5 por la ausencia de E1 y por presentar E2b en lugar de E2a (la porcion de la secuencia de E2a distinta de E2b se ha indicado en cursiva en la Figura 3).

Es importante considerar que el exon 2b contiene un 5’UTR y una region codificante coincidente con E2a por lo que a nivel proteico la secuencia correspondiente a E2 es identica en TCFL5 y CHA, y por tanto CHA se diferencia unicamente por la ausencia de la secuencia aminoaddica correspondiente a E1.

Asimismo, los inventores detectaron por primera vez que para un mismo tejido, lmea celular o muestra de paciente, bajo las mismas condiciones experimentales, las isoformas TCFL5 y CHA (TCFL5R2b) presentan una expresion diferencial, en concreto se observaron distintos grados de expresion tanto a nivel de RNAm (Fig.2 y 7B) como proteico (Fig.7A).

La determinacion precisa del riesgo de un paciente a sufrir una recaida constituye el paradigma fundamental en el tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda (LLA). Dicha estratificacion de los pacientes en funcion del riesgo permite adaptar la intensidad de la terapia al riesgo de recaida del paciente. Considerando la expresion diferencial de dichas isoformas, los inventores emitieron la hipotesis de que el uso de TCFL5 como marcador pronostico y/o de diagnostico diferencial en LLA dependera de si se determinan los niveles de expresion de la isoforma TCFL5, de la isoforma CHA (TCFL5R2b) o de ambas.

En base a dicha hipotesis, procedieron al diseno de cebadores y sondas que detectan el RNAm de las isoformas TCFL5 y CHA respectivamente de manera espedfica e independiente, y ambas isoformas simultaneamente (TCFL5/CHA).

Los inventores establecieron una asociacion entre niveles bajos de expresion de TCFL5/CHA y un pronostico de LLA de alto riesgo (Fig.6C y Tabla VI del Ejemplo 5). En particular, observaron que la expresion de RNAm de TCFL5/CHA en el momento del diagnostico es mucho menor en las LLA de alto riesgo respecto de las LLA de riesgo no alto (medio o bajo) (Tabla VII del Ejemplo 5). En la Fig.6A (Tabla IV del Ejemplo 5) se muestra que en el momento del diagnostico la expresion de TCFL5/CHA en pacientes de LLA-T es menor que en pacientes de LLA-B, aunque la diferencia no es estadisticamente significativa.

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Una asociacion entre niveles bajos de expresion de TCFL5/CHA y un pronostico de LLA de alto riesgo se observo tambien al analizar exclusivamente muestras de LLA-B (Tablas IX y X del Ejemplo 5) que es el grupo representado de manera mayoritaria en la cohorte analizada.

Asimismo, los inventores determinaron que existe una correlation entre los niveles de expresion de TCFL5/CHA en pacientes con LLA y la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento. Mas espedficamente, observaron que la expresion de RNAm de TCFL5/CHA en LLA es significativamente menor en la recaida que en el diagnostico (Fig.6B y Tabla V del Ejemplo 5), dicha asociacion se observa especialmente en muestras de B-LLA (Tabla VIII del Ejemplo 5).

Por tanto, de acuerdo con dichos hallazgos la presente invention se refiere en un primer aspecto a un metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:

a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; y

b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,

donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.

El termino "los niveles de expresion de TCFL5/CHA” tal y como se utiliza en la presente invencion hace referencia a los niveles de expresion de TCFL5 y CHA de manera conjunta.

En un aspecto asociado, la presente invencion se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere tambien a un metodo para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA que comprende las siguientes etapas:

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donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativo de recaida.

En un aspecto relacionado, la presente invention se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de recaida.

La invencion hace referencia tambien a un metodo para la determination del tratamiento mas adecuado para un paciente de LLA que comprende la clasificacion de dicho paciente de acuerdo con el metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial del primer aspecto de la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento de pacientes de LLA donde dicho tratamiento se determina en funcion de la clasificacion de dicho paciente de acuerdo con el metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial del primer aspecto de la invencion.

En otro aspecto, la invencion hace referencia a un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende:

a. un cebador y/o sonda que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%; y

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b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determination de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.

La invention se refiere tambien al uso de un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) en un metodo de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, donde dicho kit comprende:

a. un reactivo para determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5; y

b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determinacion de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.

En un aspecto adicional, la invencion esta relacionada con una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig.1: Transcritos RNAm consenso mayoritarios del gen TCFL5. Se determinaron mediante analisis de las uniones de exones sobre las bases de datos ya publicadas de secuencias de RNAseq del gen TCFL5.

Fig.2: Transcritos de RNAm de TCFL5 correspondientes al exon E1 vs E2 codificantes presentes en diferentes celulas/tejidos. Se determinaron mediante analisis de las bases de datos ya publicadas de RNAseq referentes al gen TCFL5 y se representan por codigos de colores (mas oscuro mayor frecuencia), respecto a los 2 exones. Se observa una expresion alta de E2 codificante en celulas y tejidos donde la expresion de E1 es baja, indicando una expresion diferencial de CHA respecto al resto de isoformas del gen TCFL5 (presentan E1).

Fig.3: Secuencia de TCFL5 RNAm (SEQ ID NO:1). Se indican las regiones 5’UTR y 3’UTR. Asimismo, se especifica la secuencia correspondiente a la region codificante en la que los distintos exones E1, E2, E3, E4, E5 y E8 se indican con alternancia de colores (gris y negro). En esta secuencia el exon 2 es E2a, la parte del exon 2a utilizado por TCFL5 pero

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no por CHA es representada en cursiva y el ATG iniciador de CHA dentro del exon 2 se ha resaltado en negrita (la parte no traducida de este exon para CHA es distinta y representa el exon 2b, no mostrado). La region comun para ambas isoformas se muestra sombreada en gris. Asimismo, se han enmarcado unas de las secuencias utilizadas para el diseno de cebadores donde el cebador forward se une a E5 y el reverse a E8.

Fig.4: Alineamiento de las secuencias codificantes de TCFL5 y CHA (RNAm).

Fig.5: Expresion de TCFL5 y CHA en celulas Jurkat: efectos de DAPT (inhibidor de Notchl) sobre los niveles de expresion de TCFL5/CHA a nivel protema (Western Blot).

Fig.6: Expresion de TCFL5/CHA en muestras de LLA obtenidas de pacientes: Los niveles de expresion de TCFL5/CHA a nivel de RNAm se muestran de manera individualizada para cada uno de los grupos de estudio. En las graficas se comparan los valores obtenidos en muestras (A) de B-ALL vs T-ALL, (B) recogidas en el momento de diagnostico vs recaidas y (C) clasificadas en funcion del grado de riesgo bajo, medio o alto de acuerdo con los criterios especificados en materiales y metodos.

Fig.7: Expresion de TCFL5/CHA en muestras de leucemias ALL obtenidas de pacientes en el momento del diagnostico (LLA012, LL014) y recaida (LLA751, LLA783). (A) Expresion de las protemas CHA y TCFL5 por Western Blot; (B) Cuantificacion del RNAm de TCFL5/CHA por qRT-PCR.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

El termino “seguimiento o monitorizacion de la progresion de la enfermedad” como se usa en el presente documento se refiere a determinar la evolucion de la enfermedad, por ejemplo determinar si existe una recaida.

El termino “eficacia de un tratamiento” como se usa en el presente documento se refiere al grado en el que un tratamiento logra el resultado deseado o previsto, por ejemplo, la capacidad de un farmaco para lograr el efecto deseado.

El termino “tratamiento” engloba tanto un tratamiento profilactico como terapeutico. El

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termino “tratamiento terapeutico” como se usa en el presente documento se refiere a aquel cuyo objetivo es pasar de un estado de enfermedad o patologico a un estado de salud. El termino “tratamiento profilactico” tal y como se usa en el presente documento se refiere a la prevencion de un estado patologico.

El termino "cantidad terapeuticamente efectiva" como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que es efectiva, tras la administracion de una dosis unica o multiple a un sujeto (por ejemplo, a un paciente humano) en el tratamiento profilactico o terapeutico de una enfermedad, trastorno o afeccion patologica.

El termino "sonda" como se usa en el presente documento se refiere a acidos nucleicos producidos de forma sintetica o biologica, de entre 10 y 285 nucleotidos de longitud que contienen secuencias nucleotidicas espedficas que permiten una hibridacion espedfica y preferente bajo condiciones predeterminadas a las secuencias de acido nucleico diana, y opcionalmente se han modificado para la deteccion o para potenciar el rendimiento del ensayo. En general, es necesario un minimo de diez nucleotidos para obtener estadisticamente la especificidad y para formar productos de hibridacion estables, y un maximo de 285 nucleotidos representa en general un limite superior para la longitud en la que los parametros de reaccion se pueden ajustar facilmente para determinar secuencias erroneamente emparejadas e hibridacion preferente. Opcionalmente, las sondas pueden contener determinados elementos constitutivos que contribuyen a su funcionamiento correcto u optimo en determinadas condiciones de ensayo. Por ejemplo, las sondas se pueden modificar para mejorar su resistencia a la degradacion por nucleasas, para llevar a cabo la deteccion de ligandos (por ejemplo, marcaje con fluorescema) o para facilitar su captura sobre un soporte solido (por ejemplo, cola de polyA).

El termino "cebadores" como se usa en el presente documento se refiere a oligonucleotidos o sondas que se pueden usar en un procedimiento de amplificacion, tal como una reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"), para amplificar una secuencia de nucleotidos. Los cebadores se disenan en base a la secuencia polinucleotidica de una secuencia diana particular, por ejemplo, una secuencia de RNAm espedfica. El diseno y la validacion de cebadores y sondas es bien conocido en la tecnica. Para procedimientos de PCR en tiempo real cuantitativa, vease, por ejemplo, Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275:3156).

El termino “espedfico" como se usa en el presente documento quiere decir que una

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secuencia nucleotidica se hibridara a/amplificara una secuencia diana predeterminada y no se hibridara sustancialmente a/amplificara una secuencia no diana en las condiciones de ensayo, en general se usan condiciones restrictivas.

El termino "hibridacion" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento por el que, en condiciones de reaccion predeterminadas, dos hebras parcial, sustancial o completamente complementarias de acido nucleico se deja que entren en contacto de forma antiparalela para formar un acido nucleico bicatenario con enlaces de hidrogeno espedficos y estables, siguiendo reglas explicitas que hacen que las bases de acidos nucleicos se puedan emparejar entre si.

El termino "parcialmente complementaria" tal y como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia nucleotidica que es al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% complementaria a una secuencia nucleotidica de referencia.

El termino "sustancialmente complementaria" tal y como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia nucleotidica que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% complementaria a una secuencia nucleotidica de referencia.

El termino "hibridacion sustancial" quiere decir que la cantidad de hibridacion observada sera tal que alguien que observe los resultados considere el resultado positivo con respecto a los datos de hibridacion en controles positivos y negativos. Los datos que se consideran "ruido de fondo" no son de hibridacion sustancial.

El termino "condiciones de hibridacion restrictivas" quiere decir de aproximadamente 35 °C a 65 °C en una solucion salina de NaCl aproximadamente 0,9 molar. La restriction tambien se puede regir por dichos parametros de reaccion como la concentration y el tipo de especies ionicas presentes en la solucion de hibridacion, los tipos y concentraciones de agentes desnaturalizantes presentes, y la temperatura de hibridacion. En general, como las condiciones de hibridacion se vuelven mas restrictivas, son preferentes sondas mas largas si se van a formar hibridos estables. Como norma, la restriccion de las condiciones bajo las que va a tener lugar la hibridacion determinara ciertas caracteristicas de las sondas preferentes que se van a emplear.

El termino "anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales y policlonales, asi como anticuerpos recombinantes. El termino “anticuerpo recombinante” tal y como se utiliza en la

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presente invention se refiere a un anticuerpo producido o expresado utilizando un vector de expresion recombinante, donde el vector de expresion comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo recombinante, tal que la introduction del vector de expresion en una celula huesped apropiada resulta en la production o expresion del anticuerpo recombinante. Los anticuerpos recombinantes pueden ser anticuerpos quimericos o humanizados, anticuerpos mono- o multi-espetificos. El termino "anticuerpo" tambien se refiere a fragmentos y derivados de todos los anteriores, y puede comprender ademas cualquier variante de los mismos que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un eprtopo. Los anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos de dominio unico (sdAb), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, F (ab')2, fragmentos Fv (sdFv) disulfuros, anti-idiotipo (anticuerpos anti-Id), intra- cuerpos, anticuerpos sinteticos, y fragmentos de union a eprtopo de cualquiera de los anteriores. El termino "anticuerpo" tambien se refiere a una protema de fusion que incluye una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina.

El termino "kit" indica un conjunto de reactivos y coadyuvantes requeridos para un analisis. Aunque un kit consiste en la mayoria de los casos de varias unidades, tambien pueden estar disponibles los varios elementos de analisis presentados en una unica unidad, que deben considerarse como kits.

Un metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA)

En un primer aspecto la invencion se refiere a un metodo para el pronostico de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:

El metodo segun el primer aspecto de la invencion permite el diagnostico diferencial, la clasificacion o estratificacion de los pacientes de LLA en base al pronostico e.g., LLA de alto riesgo.

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En un aspecto relacionado la invention se refiere a un metodo para el diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:

Donde la expresion “determination simultanea” se refiere a la determination conjunta y mediante una unica reaction, por ejemplo mediante el uso de cebadores que amplifican la region comun a ambas isoformas (RNAm) y/o el uso de reactivos de afinidad que se unen espetificamente a los polipeptidos codificados por las mismas.

El gen TCFL5 (NCBI Gene ID: 10732) se ha descrito en humanos y codifica para un factor de transcription de tipo basic helix-loop-helix. Esta localizado en el cromosoma 20 (20q13.33) y presenta 8 exones(E1-E8) que sufren “splicing” alternativos dando lugar a 6 formas mayoritarias segun analisis bionformaticos llevados a cabo por los inventores de las bases de datos de secuenciacion de RNA “RNAseq” (NCBI, Ensemble, Vega y EC gene). Dichas isoformas del gen TCFL5 son: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 y (6) CHA (Tcfl5R2b o R2b), aumentando el numero de isoformas respecto a las 2 isoformas previamente descritas: Tcfl5R y CHA (Tcfl5R2b). Ver Figura 1 y Tabla I del Ejemplo 1.

La secuencia canonica de la variante de transcription o isoforma TCFL5 (RNAm) es TCFL5R y se identifica en la presente invencion como SEQ ID NO:1 (NCBI: NM_006602).

La secuencia de la variante de transcription o isoforma CHA (RNAm) se identifica en la presente invencion como SEQ ID NO:2 (NCBI: AJ271337.1).

Los polipeptidos codificados por las isoformas TCFL5 y CHA (RNAm) corresponden a las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente.

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La determination de las isoformas TCFL5 y CHA de acuerdo con el metodo de la invention se realiza preferiblemente con reactivos que detectan ambas isoformas del gen TCFL5 (a nivel de RNAm o proteico) de manera simultanea, mas preferiblemente la detection y/o cuantificacion de dichas isoformas es espedfica para TCFL5 y CHA, no detectandose y/o cuantificandose otras isoformas del gen TCFL5.

En un modo de realization particular, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel de RNA mensajero (RNAm).

Los procedimientos de biologia molecular para cuantificar las secuencias de acidos nucleicos diana son bien conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a PCR de punto final, PCR competitiva, transcriptasa inversa asociada a PCR (RT- PCR), PCR cuantitativa (qPCR), transcriptasa inversa asociada a qPCR (RT-qPCR), PCR- pirosecuenciacion, PCR-ELISA, micromatrices de ADN, espectrometria de masas, ensayos de hibridacion in situ tales como inmunotransferencia por puntos (dot-blot) o ensayo de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH), ADN ramificado (bDNA; Nolte, Adv. Clin. Chem. 1998,33:201-235) y versiones multiplex de dichos procedimientos (vease, por ejemplo, Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009;15,2066-2073), asi como la proxima generation de cualquiera de las tecnicas enumeradas y combinaciones de las mismas, todos los cuales estan dentro del alcance de la presente invencion. Dichos procedimientos pueden incluir tambien la pre-conversion del RNAm en cDNA a traves de la reaction con una transcriptasa inversa (RT), por ejemplo la reaccion de PCR es habitualmente precedida de la conversion del RNAm en cDNA y se refiere como RT-PCR.

Los cebadores y/o sondas, en general, reaccionan ofreciendo una respuesta directa y lineal a cantidades crecientes de las secuencias de acidos nucleicos dianas. Gracias a la comparacion con estandares apropiados, se puede cuantificar facilmente la cantidad de una secuencia de acidos nucleicos dados en una muestra. Preferentemente, dicho procedimiento molecular para cuantificacion genica se selecciona del grupo que consiste en reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), PCR-pirosecuenciacion, hibridacion in situ con fluorescencia (FISH), micromatrices de ADN y PCR-ELISA.

Un procedimiento de cuantificacion preferido es FISH, que combina la hibridacion de sondas con microscopia optica fluorescente, microscopia laser confocal o citometria de flujo para la

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cuantificacion directa de secuencias diana individuals.

Otro procedimiento de cuantificacion preferido es la PCR cuantitativa (qPCR) asociada a la transcriptasa inversa. La qPCR o PCR en tiempo real es bien conocidad por un experto en la materia. Se comercializan distintos instrumentos para llevar a cabo dicha reaccion, tales como ABI Prism 7700 SDS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS de Applied Biosystems; iCycler iQ de Bio-Rad; Smart Cycler de Cepheid; Rotor-Gene de Corbett Research; LightCycler de Roche Molecular Biochemicals y Mx4000 Multiplex de Stratagene. El procedimiento de qPCR permite la cuantificacion exacta del producto de PCR en tiempo real midiendo la acumulacion del producto de PCR muy pronto en la fase exponencial de la reaccion, reduciendo asi el sesgo en la cuantificacion ligado a la eficacia de la amplification de PCR que se produce en la PCR de punto final. La PCR en tiempo real es bien conocida en la tecnica y por tanto, no se describe en detalle en el presente documento. Una vision general de la tecnologia y los protocolos para qPCR estan disponibles, por ejemplo, de los proveedores mencionados anteriormente, por ejemplo,

http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html o
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr- technical-guide.html. Una revision del uso de qPCR en la cuantificacion de mRNA se encuentra por ejemplo en Wong ML y Medrano JF, Biotechniques 2005, 39(1):75-85.

Estan disponibles diferentes bioqtimicas de detection para qPCR. Se pueden usar todas ellas con los instrumentos de qPCR mencionados anteriormente. El termino “bioqtimica de deteccion” se refiere a un procedimiento para informar de la amplificacion del producto de PCR espedfico en PCR en tiempo real. Dichas bioqtimicas de deteccion se clasifican en dos grupos principales. El primer grupo comprende moleculas de intercalado de ADN de doble cadena: tales como SYBR Green I y EvaGreen; y el segundo grupo incluye oligonucleotidos marcados tipicamente con un fluoroforo. Este ultimo, a su vez, se ha dividido en tres subgrupos: (i) cebadores-sondas (Scorpions, Amplifluor®, LUX™, Cyclicons, Angler®); (ii) sondas de hidrolisis (TaqMan, MGB-TaqMan, Snake assay) y de hibridacion (Hybprobe or FRET, Molecular Beacons, HyBeacon™, MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense®, Yin-Yang or displacing); y (iii) analogos de acidos nucleicos (PNA, LNA®, ZNA ™, bases no naturales: Plexor™ primer, Tiny-Molecular Beacon), ver E. Navarro eta l. ,Clinica Chimica Acta, Volume 439, 15 January 2015, Pages 231-250.

En un modo de realization preferente, dichas sondas son oligonucleotidos de doble marcaje, tales como sondas de hidrolisis o balizas moleculares. El extremo 5’ del oligonucleotido,

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tipicamente, se marca con una molecula indicadora (reporter) fluorescente tales como FAM, TET o JOE mientras que el extremo 3’ se marca con una molecula desactivadora (quencher), tales como TAM o BHQ1. La secuencia de la sonda es espedfica para una region de interes en la molecula diana amplificada. En un modo de realizacion mas preferente, dicha sonda es una sonda de hidrolisis que esta disenada de modo que la longitud de la secuencia situa el fluoroforo 5’ y la molecula desactivadora 3’ en proximidad suficientemente estrecha para suprimir la fluorescencia. Varias moleculas indicadoras y extintoras para su uso en sondas de qPCR son bien conocidas en la tecnica. Estas estan disponibles, por ejemplo, de
https://www.eurofinsgenomics.eu/en/dna-rna- oligonucleotides/optimised-application-oligos/qpcr-probes.aspx.

Generalmente, para la cuantificacion de secuencias de nucleotidos se utilizan sondas y/o cebadores. El termino "un cebador y/o sonda” incluye espedficamente "cebadores y/o sondas”, englobando por ejemplo a un cebador, una sonda, un cebador y una sonda, una pareja de cebadores, y una pareja de cebadores y una sonda. Ambos terminos se utilizan de manera indistinta en la presente invencion.

Las sondas y/o cebadores utilizadas en el metodo de la invencion hibridan espedficamente con SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Dichas sondas y/o cebadores son parcialmente complementarias, preferiblemente sustancial o completamente complementarias a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 o a fragmentos de las mismas tal y como se describe en el presente documento.

Preferiblemente, una sonda y/o cebador es un secuencia de polinucleotidos de entre 10 y 30 nucleotidos, mas preferiblemente de entre 15 y 26 nucleotidos, aun mas preferiblemente de entre 18 y 22 nucleotidos, y aun mucho mas preferiblemente de alrededor de 20 nucleotidos. En una realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas han sido modificados para la deteccion o para potenciar el rendimiento del ensayo.

En una realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.

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Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70 (ver Tabla III).

En otra realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas son espedficos para la cuantificacion/amplificacion de una region comprendida entre los exones 3 y 8 de TCFL5R (SEQ ID NO: 1) permitiendo cuantificar de manera espedfica y simultanea la expresion de TCFL5 (independientemente de que el exon 4 presente la variante E4a o E4b) y CHA (TCFL5R2b).

En dicho modo de realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5/CHA a nivel RNAm se efectua mediante la cuantificacion de una secuencia comprendida entre el primer nucleotido de E3 y el ultimo nucleotido de E8.

En una realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas hibridan espedficamente con secuencias comprendidas en cualquiera de los exones E3, E4, E5 y/o E8, incluyendo cuando ambos cebadores hibridan en un mismo exon y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42; y SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42; y SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III).

En otra realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas hibridan espedficamente con secuencias comprendidas en cualquiera de los exones E3, E4 y/o E5 (amplificando una region comun a todas las isoformas), incluyendo cuando ambos cebadores hibridan en un mismo exon y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42 (ver Tabla III).

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En otra realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas amplifican la region comun y espedfica de las isoformas TCFL5R y CHA, mas espedficamente un cebador y/o sonda hibrida en E3 o E5 y el otro en E8, o ambos en E8.

En una realizacion mas preferida, uno de los cebadores y/o sondas hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en E5 y el otro en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 54 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 54 (ver Tabla III).

En otra realizacion mas preferida, uno de los cebadores y/o sondas hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en E3 y el otro en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO: 56 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO: 56 (ver Tabla III).

En otra realizacion mas preferida adicional, ambos cebadores y/o sondas hibridan en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III).

Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 (Primer TCFL5/CHA 01 Forward): GAGACTGACAAGGCCACAACT, SEQ ID NO: 46 (Primer TCFL5/CHA 01 Reverse):

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CCGCAAAATACGCTCTCAA, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.

Las secuencias oligonucleotidicas con una identidad de al menos un 75 % mencionadas en la presente invention presentan preferiblemente una identidad de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, mas preferentemente, 96 %, 97 %, 98%, 99% o un 100% con las respectivas secuencias de referencia. Ademas, estas secuencias con una identidad de al menos un 75 % pueden tener el mismo numero de nucleotidos, o bien presentar mas o menos nucleotidos que la secuencia de referencia.

Los niveles de cuantificacion pueden ser absolutos o relativos. En general, es preferente que los niveles de expresion se normalicen. La normalization se puede realizar con respecto a diferentes medidas en la muestra, tal como por peso de la muestra, cuantificacion de celulas humanas, cuantificacion de ADN total, y/o cuantificacion de los niveles de expresion de un gen de expresion constitutiva. Estos procedimientos son bien conocidos para un experto en la tecnica.

En un modo de realization particular, la normalizacion se lleva a cabo con respecto a la cuantificacion de los niveles de expresion de un gen de expresion constitutiva. En la presente invencion se entiende por "genes que se expresan de forma constitutiva" o "genes de expresion constitutiva", a aquellos genes que se ha descrito que se transcriben de manera constante. Ejemplos de genes que se expresan de forma constitutiva son 2- mioglobulina, ubiquitina, protema ribosomal 18S, ciclofilina A, GAPDH, protema de activation de la tirosina 3-monooxigenasa/triptofano 5-monooxigenasa (YWHAZ), beta- actina, p-2- microglobulina o hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT).

En un modo de realizacion preferente, la cuantificacion de los niveles de expresion de TCFL5/CHA se realiza por RT-qPCR y comprende la normalizacion de los niveles de expresion respecto a un gen de expresion constitutiva.

La detection y/o cuantificacion de las isoformas TCFL5/CHA se puede llevar a cabo tambien a nivel proteico. Los polipeptidos codificados por las isoformas TCFL5 y CHA (RNAm)

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corresponden a las secuencias de aminoacidos referidas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en la presente invencion. Existen diversos metodos para la cuantificacion de peptidos y protemas bien conocidos por un experto en la materia, tales como inmunoensayos. Diversos tipos de inmunoensayos son conocidos por un experto en la materia para la cuantificacion de manera espedfica de protemas de interes, ya sea en solucion o utilizando un ensayo en fase solida. Dichos metodos estan basados en el uso de reactivos de afinidad, que pueden ser receptores o ligandos espedficos, por ejemplo anticuerpos, preferiblemente marcados. Por ejemplo, el Western Blot o inmunotransferencia permite comparar las abundancias de protemas separadas mediante un gel electroforetico, eg. SDS-PAGE. En esta tecnica, las protemas separadas por electroforesis en gel se transfieren sobre una lamina de material polimerico (generalmente de nitrocelulosa, nylon, o difluoruro de polivinilideno), donde se inmovilizan. Las protemas diana se revelan mediante el uso de una solucion que contiene un anticuerpo espedfico. El anticuerpo puede conjugarse directamente con un marcador radiactivo, fluorescente o enzimatico (metodo de deteccion directa) o bien se puede usar un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y por lo tanto amplifica la senal (metodo de deteccion indirecta o ensayo de tipo sandwich).

Tradicionalmente, la cuantificacion espedfica de protemas en solucion se ha efectuado mediante inmunoensayos en un soporte solido. Tipicamente, se inmoviliza un anticuerpo de captura espedfico para la protema diana en una superficie polimerica o de plastico y se anade al soporte una solucion que contiene la protema de interes (por ejemplo, suero o lisado celular). Finalmente, se incuba la muestra en el soporte durante un tiempo para permitir que se formen los complejos antigeno-anticuerpo. A continuacion, se suelen realizar uno o mas lavados para eliminar la solucion y la protema diana se detecta con un segundo anticuerpo que reconoce un eprtopo de protema diferente al reconocido por el anticuerpo de captura. Al igual que en el caso del Western Blot, este anticuerpo de deteccion puede estar marcado directamente o puede ser reconocido con un anticuerpo secundario. Un inmunoensayo comunmente utilizado para la cuantificacion de protemas es el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) en el que el anticuerpo de deteccion lleva una enzima que convierte un sustrato comunmente incoloro en un compuesto coloreado o un sustrato no fluorescente en un compuesto fluorescente. Asimismo, en otros inmunoensayos en fase solida, el anticuerpo puede estar marcado con un isotopo radioactivo o con fluorescencia.

Otros metodos que pueden ser utilizados para la cuantificacion de las isoformas TCFL5 y CHA de acuerdo con la invencion son tecnicas basadas en espectrometna de masas (MS)

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tales como la cromatografia liquida acoplada a la espectrometria de masas (LC/MS), descrita por ejemplo en US2010/0173786, o el tandem LC-MS/MS (WO2012/155019, US2011/0039287, Rauh M., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012 Feb 1;883-884:59-67), as^ como el uso de arrays de peptidos, protemas o anticuerpos y versiones multiplex de las tecnicas mencionadas, as^ como la proxima generation de dichas tecnicas y combinaciones de las mismas.

En un modo de realization particular de la invention, opcionalmente en combination con una o mas de las caracteristicas descritas anteriormente, la cuantificacion de TCFL5/CHA se realiza mediante un inmunoensayo que comprende el uso de cualquier anticuerpo que detecte ambas isoformas, tales como HPA055223 (Sigma) o SAB4500152 (Sigma), o bien anticuerpos espedficos de cada una de ellas.

El grado de variation en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a los valores de referencia puede ser, por ejemplo, de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% o mas. Preferiblemente, dicha variacion es estadisticamente significativa. Como se usa en este documento, "estadisticamente significativa" se refiere a un valor de p de menos de 0,05, por ejemplo, un valor de p de menos de 0,025, un valor de p de menos de 0,01 o un valor de p de menos de 0,005, utilizando una prueba estadistica apropiada. Un experto en la tecnica sabra definir aquellas pruebas estadisticas mas apropiadas. Preferentemente, en aquellos casos en los que haya una distribucion normal y homocedasticidad, se usa un modelo parametrico tal como la prueba de la t de student o la prueba de ANOVA; y cuando no se logre al menos uno de estos dos requisitos, entonces se usa, en general, un modelo no parametrico tal como la prueba de la U de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis.

Las muestras biologicas para el uso en los metodos de la invencion pueden obtenerse a partir de una variedad de tejidos o fluidos biologicos, en particular de sangre, pero tambien pueden ser utilizadas muestras de medula osea, linfa, liquido cefalorraqtideo, liquido sinovial, y similares. Tales muestras se pueden separar por centrifugation, decantation, separation en gradiente de densidad, aferesis, selection por afinidad, FACS, etc. antes del analisis. Las muestras biologicas utilizadas en el metodo de la presente invencion son preferiblemente muestras de medula osea, de sangre periferica o de liquido cefalorraqtideo. Dichos tipos de muestra se utilizan de manera habitual en la practica clmica y un experto en la materia sabra identificar los medios adecuados para su obtencion y conservation

(Coustan-Smith E et al., Blood. 2002 Oct 1;100(7):2399-402; Martinez-Laperche C et al.,

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American journal of hematology 88: 359-64). Una vez obtenida la muestra biologica, se puede utilizar directamente, congelar, o mantener en un medio de cultivo apropiado. Varios medios de cultivo pueden ser empleados para mantener las celulas en cultivo. Las muestras se pueden obtener por cualquier procedimiento adecuado, tal como la extraccion de sangre, puncion venosa, biopsia, o similares.

Las celulas mononucleares (MC) son generalmente aisladas de dicha muestra biologica, mediante metodos conocidos en el estado del arte. Las celulas mononucleares se aislan tipicamente mediante centrifugacion por gradiente de densidad, por ejemplo con Ficoll® o Percoll®.

En una realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se efectua en una poblacion celular que se ha aislado de una muestra biologica del paciente mediante un procedimiento que comprende una centrifugacion por gradiente de densidad.

Tras el aislamiento de MCs de las muestras biologicas, una seleccion espedfica del tipo celular de interes puede llevarse a cabo usando uno de los muchos metodos descritos en la literatura, sobre la base de la expresion de marcadores de superficie celular espedficos y, si procede, de otras protemas, asi como la actividad de proliferacion, el metabolismo y / o el estado morfologico de las celulas. Tipicamente, la purificacion de una poblacion celular de interes en una muestra biologica comprende una seleccion positiva y/o negativa en base a la expresion de marcadores de superficie celular caracteristicos.

En otra realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se efectua en una poblacion de celulas de LLA que se ha aislado de una muestra biologica del paciente mediante un procedimiento que comprende ademas la seleccion positiva mediante el uso de marcadores de superficie celular asociados a leucemia.

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Tipicamente se utilizan combinaciones de marcadores celulares que se encuentran en LLA y no en lmeas celulares normales que se encuentren habitualmente tambien en dicha muestra biologica. Por ejemplo, las celulas LLA-B pueden ser seleccionadas por eliminacion de otras MCs tales como los linfocitos T (celulas CD2+, o CD3+), y/o por la presencia de marcadores de superficie espedficos, como por ejemplo CD19 (espedfico de linfocitos B), y/o CD10 (antigeno asociado a la leucemia linfoblastica). En una realizacion particular, las celulas de LLA-B se aislan mediante una seleccion que comprende la expresion de CD19, y/o CD10.

La poblacion de celulas de LLA se puede seleccionar sobre la base de la expresion de al menos un marcador de superficie celular. La seleccion normalmente se lleva a cabo utilizando protemas que se unen espedficamente a una de dichas protemas de superficie celular, tipicamente anticuerpos, y que se puede vincular a soportes solidos (por ejemplo, partmulas o superficies de plastico) o pueden ser conjugadas con moleculas de marcaje (por ejemplo, un fluorocromo) que pueden ser detectadas por ejemplo mediante citometria de flujo.

Preferiblemente, la muestra biologica del paciente y la muestra biologica de referencia son del mismo tipo, es decir, tienen un mismo origen biologico y han sido aisladas utilizando los mismos procedimientos. Dichas muestras biologicas pueden ser tomadas alrededor del momento del diagnostico, antes, durante o despues del tratamiento, preferiblemente son tomadas alrededor del momento del diagnostico.

Los valores de referencia pueden ser los niveles de expresion determinados para el producto de expresion en una o varias muestras de referencia (por ejemplo, valores medios +/- s.m.e.) o bien valores predeterminados. Tipicamente dicho valor de referencia se refiere como valor umbral o de corte (cut-off).

Una variedad de metodos estadisticos y matematicos para establecer el valor umbral o de corte son conocidos en el estado de la tecnica. Un valor de expresion umbral o de corte para un biomarcador particular puede ser seleccionado, por ejemplo, utilizando un analisis de Receiver Operating Characteristic (ROC). Un experto en la tecnica apreciara que dicho valor

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de corte se puede variar, por ejemplo, moviendolo a lo largo del grafico ROC, para obtener diferentes valores de sensibilidad o especificidad y por tanto afectando el rendimiento general del ensayo. El mejor punto de corte ("best cut-off”) se refiere al valor obtenido del grafico ROC para un biomarcador que produce la mejor sensibilidad y especificidad. Los valores de sensibilidad y especificidad se calculan sobre el rango de umbrales (cut-offs). Asi pues, los valores de umbral o de corte pueden ser seleccionados de manera que los valores de sensibilidad y / o especificidad son al menos aproximadamente 70%, y pueden ser, por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90 %, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% en al menos 60% de la poblacion de estudio, o en al menos 65%, 70 %, 75% o 80% de la poblacion de estudio.

En una realizacion particular, las muestras de referencia o control para la obtencion de los valores de referencia corresponden a una o mas muestras de linfocitos aislados de donantes sanos (por ejemplo, de sangre periferica o de medula osea) o bien a lmeas establecidas de linfocitos B (Raji, ATCC® CCL-86™) o T humanos (Jurkat, Clone E6-1 (ATCC® TIB-152™).

En otra realizacion particular, las muestras de referencia para la obtencion de los valores de referencia o control corresponden a una o mas muestras celulares de pacientes con LLA o a lmeas celulares establecidas de LLA. Tipicamente, las lmeas celulares y/o muestras celulares de donantes (sanos o pacientes) utilizadas han sido previamente caracterizadas, por ejemplo, de acuerdo a su fenotipo (e.g., LLA-B o LLA-T), inmunofenotipo (un panel standard incluye: CD10, CD19, CD20, CD34, CD38 y CD45), marcadores geneticos de LLA- B (e.g. PAX5, IKZF1, o EBF1) y citogeneticos (e.g., presencia de translocaciones MLL-AF4, ETV6-RUNX1 o BCR-ABL1. TEL-AML-1), o LLA-T (e.g. HOX11L2, LYL1 mas LMO2, TAL1 mas LMO1 o LMO2, HOX11, y MLL-EN, NOTCH1, c-MYC, etc) caracteristicas demograficas y/o clmicas del donante (e.g., edad, sexo, origen etnico, contaje de globulos blancos (WBC) etc.), y/o respuesta al tratamiento. Lmeas celulares caracteristicas de LLA-B incluyen pero no se limitan a CCL-120 (ATCC). Asimismo, lmeas celulares caracteristicas de LLA-T incluyen pero no se limitan a CCL-119, CCL-120.1, CRL-1552, CRL-2264, CRL-2265, PTS- CCL-119, CRM-CCL-119, CRM-CCL-119D, CRL-11386, TIB-195 (todas de ATCC).

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Preferiblemente, dichas muestras de pacientes han sido asociadas a pacientes de riesgo medio y/o bajo tanto LLA-B, como LLA-T .(Zhou, Y., You, M. J., Young, K. H., Lin, P., Lu, G., Medeiros, L. J., and Bueso-Ramos, C. E. (2012) Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia. Human pathology 43, 1347-136 Van Vlierberghe, P., and Ferrando, A. (2012) The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 122, 3398-3406)

En un modo de realization particular del metodo de la invention se utiliza para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes de LLA-B o LLA-T. Preferiblemente, en pacientes de LLA-B. Independientemente del tipo de LLA diagnosticado, en un modo de realizacion preferido, dichos pacientes son ninos. La poblacion infantil en LLA se define tipicamente como aquellos pacientes que tienen menos de 20 anos. En una realizacion, preferida, dichos pacientes tienen entre 0 y 15 anos, e incluso entre 0-12 meses. En otra realizacion preferida, dichos pacientes tienen entre 1 y 19 anos.

En el tratamiento de pacientes con LLA, es practica habitual el determinar el tratamiento mas adecuado en funcion del diagnostico, estratificacion o clasificacion del paciente como perteneciente a un grupo de riesgo, es decir se escoge o personaliza el tratamiento segun el grupo de riesgo al que pertenecen, siendo menos intenso en los de riesgo medio o bajo y mayor en los de riesgo alto.

La clasificacion de la enfermedad puede ser, por ejemplo, una clasificacion de preferencia basada en el riesgo de recaida (remision vs fracaso terapeutico); pero que tambien puede basarse en las caractensticas clmicas de los pacientes, en los datos citogeneticos; en el subtipo de leucemia; la respuesta al tratamiento y/o en la etiologia de la enfermedad.

Tipicamente, se definen como pacientes de alto riesgo aquellos que presentan mayores probabilidades de recaida. Dichos criterios para la clasificacion y/o estratificacion de pacientes son bien conocidos por un experto en la materia y se describen por ejemplo en Ceppi F, et al., (2015) Risk factors for relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia: prediction and prevention. Expert review of hematology 8: 57-70; Hunger SP, Mullighan CG (2015) Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. The New England journal of medicine

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373: 1541-52; Teachey DT, Hunger SP (2013) Predicting relapse risk in childhood acute lymphoblastic leukaemia. British journal of haematology 162: 606-20):

En general, se distinguen 3 grupos de riesgo en funcion de una evaluacion de los datos relativos a la edad del paciente y a los resultados obtenidos en una o mas de las siguientes pruebas geneticas y/o bioqdmicas:

Tecnicas de laboratorio generalmente usadas en el diagnostico y/o recaida:

- Hematimetria estandar con hemocitometro.

- Citologia convencional en extension de muestra de medula osea y en citospin de muestra de liquido cefalorraqddeo.

- Citometria de flujo multiparametrica, preferiblemente en muestra de medula osea.

- Tecnicas citogeneticas clasicas y de bandeo de cromosomas, preferiblemente en muestra de medula osea.

- RT-PCR con cebadores espedficos para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), preferiblemente en muestras de medula osea.

- FISH con sondas para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y break apart en MLL, preferiblemente en muestras de medula osea.

En base a los resultados obtenidos en dichas pruebas, los pacientes de LLA se suelen clasificar en uno de los siguientes grupos de riesgo:

RIESGO ESTANDAR o RIESGO BAJO: El paciente debe reunir todos y cada uno de los siguientes criterios:

- Edad >1 y <10 anos.

- Leucocitos <20 x109/l al diagnostico.

- Inmunofenotipo no T.

- Ausencia de infiltracion del SNC y/o testes.

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Citogenetica (uno de los dos criterios siguientes es suficiente):

■ Alta Hiperdiploidia (51-67 cromosomas), mdice de DNA 1,10-1,44 (siempre confirmado por otras tecnicas citogeneticas).

■ t(12;21) positiva Ausencia de t(1;19)

No reordenamiento MLL

Presencia de < 1.000 blastos/mm3 en dia +8 de la Induction, en sangre periferica

Presencia de < 5% de blastos y < 0,1% de enfermedad residual minima (ERM) en medula osea en d^a +15 de la Induccion y al final de la induccion IA

15 RIESGO ALTO: La existencia de cualquiera de los siguientes criterios determina la inclusion del paciente en este grupo:

- t(4;11) (MLL/AF4).

- t(9;22) p190.

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Hipodiploidia <44 cromosomas o mdice DNA <0,81 (se requiere confirmation por otras tecnicas).

> 1.000 blastos en dia +8 de la Induccion, en sangre periferica.

> 25% de blastos y >10% de ERM en el dia +15 de la Induccion, en medula osea. ERM > 1% en el dia +33 de la Induccion, en medula osea.

- ERM > 0,1% antes de la Consolidation, en medula osea.

RIESGO MEDIO: Aquellos pacientes que no reunan los criterios de Riesgo Estandar ni de Riesgo Alto.

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Dichos criterios son descritos en mayor detalle en la Gwa de Recomendacion Terapeutica SEHOP/PETHEMA 2013.

En un modo de realization particular, opcionalmente en combination con una o mas de las caracteristicas definidas descritas, dicho metodo comprende ademas la detection o cuantificacion de uno o mas marcadores geneticos descritos con valor pronostico para LLA, preferiblemente comprende la determination de la presencia de una o mas de las translocaciones seleccionadas del grupo que consiste en t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), Hipodiploid^a <44 cromosomas o mdice DNA <0,81.

Dicho metodo puede comprender ademas la determinacion de uno o mas de los parametros bioquimicos y/o clmicos descritos mas arriba habitualmente utilizados para la estratificacion de los pacientes de LLA en funcion del riesgo.

El metodo de la invencion puede comprender ademas el almacenaje de los resultados obtenidos en dispositivo de almacenamiento de datos. En un modo de realizacion, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es una lamina de papel. En un modo de realizacion preferente, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es un medio legible por ordenador. Como se usa en el presente documento, "un medio legible por ordenador” puede ser cualquier aparato que pueda incluir, almacenar, comunicar, propagar o transportar los resultados de la determinacion del procedimiento de la invention. El medio puede ser un sistema (o aparato o dispositivo) electronico, magnetico, optico, electromagnetico, infrarrojo o semiconductor o un medio de propagation.

En un aspecto asociado, la presente invencion se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con LLA, donde una reduction en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.

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Metodo para la personalizacion del tratamiento en funcion del riesgo

La invencion hace tambien referencia a un metodo para la personalizacion del tratamiento o para la determination del tratamiento mas adecuado en funcion del perfil de riesgo del paciente, donde dicho metodo comprende el pronostico y/o diagnostico diferencial en funcion del riesgo segun el metodo del primer aspecto de la invencion.

En un aspecto relacionado, la invencion hace referencia a un metodo para el tratamiento de pacientes de LLA que comprende la administration de una cantidad terapeuticamente efectiva de un farmaco o combination de farmacos donde dicho tratamiento se determina en funcion de la clasificacion o estratificacion de dicho paciente en funcion del riesgo segun el metodo del primer aspecto de la invencion. Dicha terapia esta tipicamente formado por la asociacion de varios farmacos, puediendo incluir entre otros vincristina, prednisona y antraciclinas (daunorrubicina o idarubicinao doxorrubicina), L-asparaginasa, y metotrexato , etc((Inaba, H., M. Greaves, and C.G. Mullighan, Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 2013. 381(9881): p. 1943-55).

En la practica clmica actual aquellos pacientes de LLA clasificados como de alto riesgo recibiran un tratamiento quimioterapeutico de mayor intensidad. Una mayor intensidad del tratamiento se caracteriza por una mayor dosificacion y/o frecuencia de las administraciones respecto a la administracion del mismo farmaco o combinacion de farmacos en un paciente clasificado como de riesgo medio o bajo. Asimismo, un tratamiento de mayor intensidad puede consistir tambien en la administracion de otros farmacos cuya utilization se considera mas agresiva, por ejemplo al estar asociados a una mayor toxicidad.

Metodo para la monitorizacion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento

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donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativo de recaida. Tipicamente, la toma de muestras se realiza al inicio del tratamiento, a lo largo del tratamiento y/o una vez finalizado el tratamiento, de manera dclica o puntual.

En un aspecto relacionado, la invention hace referencia al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para la monitorizacion de pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de recaida.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo de obtencion de datos utiles para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende:

a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente.

Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de estos aspectos de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.

Kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLA

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b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho cebador y/o sonda para la determination de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.

Preferiblemente, dicho cebador y/o sonda comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invention.

Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de este aspecto de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.

La invencion se refiere tambien al uso de un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLA en un metodo de acuerdo con los aspectos anteriores de la invencion, donde dicho kit comprende:

Secuencia nucleotidicas

En un aspecto adicional, la invencion esta relacionada con una secuencia nucleoridica, preferiblemente una sonda y/o cebador, que hibrida espedficamente a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Dichas sondas y/o cebadores son parcialmente complementarias, preferiblemente sustancial o completamente complementarias a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 o a fragmentos de las mismas tal y como se ha descrito en otros aspectos de la invencion.

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Preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%; mas preferiblemente dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invention.

En un aspecto relacionado, la invencion se refiere al uso de una secuencia nucleotidica que hibrida espedficamente a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 como cebador y/o sonda en un metodo in vitro para el pronostico, diagnostico y/o monitorizacion de pacientes con LLA de acuerdo con los aspectos anteriores de la invencion. Preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invencion.

En otro aspecto, la invencion hace referencia a un metodo para la determination in vitro, preferiblemente de manera simultanea, de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA); donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel de RNAm mediante el uso de un cebador y/o sonda seleccionado del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Preferiblemente, dicho cebador y/o sonda consiste en una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y una secuencia identica a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invencion.

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Se contempla que cualquier modo de realizacion analizado en esta memoria descriptiva se puede implementar con respecto a cualquier metodo, kit, reactivo o uso de la invencion, y viceversa. En particular, aquellas caracteristicas detalladas y realizaciones particulares relativas al primer aspecto de la invencion podran tambien implementarse respecto a otros aspectos de la invencion. Se entendera que los modos de realizacion particulares descritos en el presente documento se muestran a modo de ilustracion y no como limitaciones de la invencion. Los rasgos caracteristicos principales de la presente invencion se pueden emplear en varios modos de realizacion sin apartarse del alcance de la invencion. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar usando no mas que experimentacion rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos espedficos descritos en el presente documento. Se considera que estos equivalentes estan dentro del alcance de la presente invencion y estan contemplados por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en el presente documento por referencia en el mismo grado que si cada publicacion o solicitud de patente individual se indicase espedfica e individualmente para incorporarse por referencia.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el termino "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede querer decir "uno" pero tambien es coherente con el significado de "uno o mas", "al menos uno" y "uno o mas de uno". El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para querer decir "y/o" a menos que se indique explicitamente para referirse a alternativas solo o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la divulgacion respalda una definicion que se refiere solo a alternativas y "y/o". En toda esta solicitud, el termino "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variacion de error inherente para el dispositivo, empleandose el procedimiento para determinar el valor, o la variacion que existe entre los sujetos de estudio.

Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, las palabras "comprender" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "tener" (y cualquier

forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "incluir" (y cualquier forma de incluir, tal como

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"induye" y "incluyen") o "contener" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas del procedimiento no citados, adicionales. El termino “comprende” engloba y espedficamente describe "consiste esencialmente en" y “consiste en”. Como se usa en el presente documento, la expresion "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicacion a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) caracteristica(s) basica(s) y novedosa(s) de la invencion reivindicada. Como se usa en el presente documento, la expresion "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicacion excepto, por ejemplo, impurezas habitualmente asociadas con el elemento o la limitacion.

El termino "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los puntos enumerados que preceden al termino. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, tambien BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o mas puntos o terminos, tales como BBB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y asi sucesivamente. El experto en la tecnica entendera que ripicamente no existe un limite sobre el numero de puntos o terminos en cualquier combinacion, a menos que sea evidente de otro modo a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, palabras de aproximacion tales como, sin limitacion, "sobre”, "alrededor de”, “aproximadamente” se refieren a una condicion que, cuando se modifica asi, se entiende que no es necesariamente absoluta o perfecta sino que se consideraria lo suficientemente proxima para los expertos en la tecnica para garantizar la designacion de la condicion como presente. La medida en que puede variar la descripcion dependera de lo grande que se pueda instituir un cambio y todavia reconozca un experto en la tecnica que el rasgo caracteristico modificado todavia tenga las caracteristicas y capacidades requeridas del rasgo caracteristico no modificado. En general, pero sujeto al analisis precedente, un valor numerico en el presente documento que se modifica por un palabra de aproximacion tal como "aproximadamente" puede variar desde el valor establecido en ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 o 15%, o menos, preferiblemente representa el valor establecido (± 0%)..

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EJEMPLOS

Sitios WEB para el analisis de las bases de datos utilizados

• Secuencias:

1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2.
http://www.ensembl.org/index.html

3.
http://vega.sanger.ac.uk/index.html

4.
http://genome.ewha.ac.kr/ECgene/

• Alineamientos:

1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2.
http://www.ensembl.org/index.html

3.
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/

4.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/

Arrays: 1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2.: https://www.oncomine.org/resource/login.html

3.: http://www-test.ebi.ac.uk/gxa/

4.: http://www.cbioportal.org/

5.: http://www.tumorportal.org

Materiales y Metodos Obtencion de muestras de pacientes

Se obtuvieron muestras de aspirado de medula osea en el momento del diagnostico o de la recaida, de 60 ninos con LLA (edades 0-15 anos) del Hospital Universitario Nino Jesus de Madrid. 18 LLA-T y 42 LLA-B

Clasificacion de los pacientes

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Se distinguieron 3 grupos de riesgo en funcion de una evaluacion de los datos relativos a la edad del paciente y a los resultados obtenidos en una o mas de las siguientes pruebas geneticas y/o bioqdmicas:

- Hematimetria estandar con hemocitometro.

- Citolog^a convencional en extension de muestra de medula osea y en citospin de muestra de liquido cefalorraqddeo.

En base a los resultados obtenidos en dichas pruebas, los pacientes de LLA se clasificaron en uno de los siguientes grupos de riesgo:

- Edad >1 y <10 anos.

- Leucocitos <20 x109/l al diagnostico.

- Inmunofenotipo no T.

- Ausencia de infiltracion del SNC y/o testes.

- Citogenetica (uno de los dos criterios siguientes es suficiente):

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■ t(12;21) positiva

- Ausencia de t(1;19)

- No reordenamiento MLL

- Presencia de < 1.000 blastos/mm3 en d^a +8 de la Induction, en sangre periferica

- Presencia de < 5% de blastos y < 0,1% de enfermedad residual minima (ERM) en medula osea en dia +15 de la Induccion y al final de la induccion IA

RIESGO ALTO: La existencia de cualquiera de los siguientes criterios determina la inclusion del paciente en este grupo:

- t(4;11) (MLL/AF4).

- t(9;22) p190.

- Hipodiploidia <44 cromosomas o mdice DNA <0,81 (se requiere confirmation por otras tecnicas).

- > 1.000 blastos en dia +8 de la Induccion, en sangre periferica.

- > 25% de blastos y >10% de ERM en el dia +15 de la Induccion, en medula osea.

- ERM > 1% en el dia +33 de la Induccion, en medula osea.

- ERM > 0,1% antes de la Consolidation, en medula osea.

Western blot

Se utilizaron 20 ng de protema correspondientes a las muestras de los pacientes por pocillo en geles al 10% de SDS-poliacrilamida y se aplicaron 90Voltios hasta que el frente de azul de bromocresol migro a la position deseada. Las protemas fueron transferidas (100Voltios a 4°C) a una membrana de nitrocelulosa durante 1h 30min con el buffer de transferencia.

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Una vez transferidas las protemas a la membrana de nitrocelulosa, se bloquearon uniones inespedficas mediante su incubacion durante una hora en una solucion de BSA (Suero de Albumina Bovina) al 5% en TBS-T. Antes de realizar el bloqueo, se realizo una tincion reversible con Rojo Ponceau que permite visualizar las protemas transferidas.

Los tiempos de incubacion al igual que las concentraciones utilizadas de los anticuerpos se realizaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se utilizo el anticuerpo policlonal anti TCFL5/CHA (SAB4500152, Sigma-Aldrich) y el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti conejo Goat (A-21431, Invitrogen). Entre dichas incubaciones se realizan 3 lavados de 15min con TBS-T y el ultimo lavado con TBS.

El revelado de la membrana se realizo con el kit SuperSignal (Thermo Scientific) o el kit Immun-Star HRP (BIO_RAD) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Para la reutilizacion de las membranas se realizo un stripping con el Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Aislamiento de celulas mononucleadas a partir de muestras de medula osea

La extraction de celulas mononucleadas de pacientes se realizo mediante centrifugation por gradiente de densidad. Las muestras de medula osea de pacientes se diluyen a la mitad en PBS. En un tubo a parte se preparan 5 ml de Ficoll (Ficoll® Paque Plus, Sigma-Aldrich). La muestra de medula osea diluida se pone sobre el ficoll lentamente apoyando la punta sobre la pared del tubo para generar dos fases. Se centrifuga a 1500 rpm durante 25 minutos con deceleration baja a temperatura ambiente. Nos quedamos con la fase blanca que es donde se encuentran las celulas mononucleadas. Se lavan con PBS 1400 rpm durante 7 minutos para eliminar restos de ficoll. Tras el lavado, el pellet se resuspende en suero fetal bovino (FBS) y se criopreserva en viales de como maximo 12,5x106 celulas.

Extraccion de RNA y RT-qPCR (Protocolo utilizado en el ejemplo 5)

Una vez aisladas las celulas la extraccion del RNA se llevo a cabo con RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la retrotranscripcion se utilizo el Kit TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystem, Life Technologies) siguiendo el programa: un ciclo a 42°C durante 45 minutos y un ultimo ciclo a 99°C durante 3 minutos. Por ultimo para la PCR a tiempo real se utilizo SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystem, Life Technologies) siguiendo el programa: un ciclo 50°C durante 2 min, 95°C duante 10 minutos, 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 58°C durante 1 minutos, curva de melting continua. La secuencia de los oligonucleotidos utilizados son TCFL5/CHA_F (SEQ ID NO: 45): 5’ GAGACTGACAAGGCCACAACT 3’, TCFL5/CHA_R (SEQ ID NO:46): 5’

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CCGCAAAATACGCTCTCAA 3’,: Beta-actina_F (SEQ ID NO: 71)

CATGTACGTTGCTATCCAGGC; CTCCTTAATGTCACGCACGAT.: Beta-actina_R (SEQ ID NO: 72)

Extraccion de RNA y RT-qPCR (Protocolo utilizado en el ejemplo 6)

Las muestras se conservaron en TRIzol (Life Technologies) a 70°C hasta su uso. La extraccion del RNA total se realizo con RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

RT-qPCR cuantitativa. El RNAm se retrotranscribio a DNA complementary (DNAc) y se cuantificaron los genes con oligonucleotidos espedficos (SEQ ID NO: 45 (TCFL5/CHA 01 Forward) y SEQ ID NO: 46 (TCFL5/CHA 01 reverse) de la Tabla III) con el kit GoTaq 2-Step RT-PCR System (Promega) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Para la amplification de los genes por PCR se sometieron las muestras a 95°C durante 5min, a continuation se realizaron 45 ciclos de 15s a 95°C, 30s a 59°C y 15s a 72°C; finalmente, se realiza un ciclo a 95°C en el termociclador ABIPrism 7900 HT SDS (Applied Biosystems).

Los calculos de cuantificacion de la expresion de genes se realizaron por el metodo de comparacion del ciclo umbral (Comparative Threshold Method, CT). Los valores obtenidos para cada gen se normalizaron con el gen House keeping HPRT (Hypoxantina-guanina fosforibosiltransferasa) para obtener el ACT, tras lo cual se normalizaron con el valor de la muestra control para obtener el AACT. La cantidad relativa, RQ, se calculo a partir de la siguiente formula RQ = 2"AACT Los cebadores utilizados para cuantificar la expresion de HPRT fueron HPRT- Forward (SEQ ID NO: 73): CTGGAAAGAATGTCTTGATTGTGG; y HPRT-Reverse (SEQ ID NO: 74): CATCTTGGATTATACTGCCTGAC.

Analisis estadlsticos

Los analisis de significancia y correlation estadisticos de expresion genica, se realizaron con las herramientas de analisis de GraphPad (5.0 para Windows) mediante los tests de ANOVA y T de Student para los analisis individuales y, de Spearman para los estudios de correlacion tomando los datos como no parametricos.

Resultados

5 Ejemplo 1.- Determinacion de mensajeros consenso e identificacion de nuevas isoformas de TCFL5

Se efectuo un analisis bioinformatico partiendo de datos de secuencias de RNAm de TCFL5 publicadas y analizando lecturas de uniones de exones, se establecieron los mensajeros 10 consenso expresados en humano aumentando la cifra de las 2 isoformas previamente descritas (TCFL5 y CHA) a 6 isoformas.

La Tabla I muestra los RNAm consenso o isoformas identificadas a partir de las secuencias de RNAm publicadas en las distintas bases de datos.

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: NCBI Ensemble Vega EC gene

Gene_ID: 10732 ENSG00000101190 OTTHUMG00000032939 -

Variantes (mRNA): Exones

TCFL5R (R): E1 E2a E3 E4 E5 E8 NM_006602, AB012124.1, AF070992.1 ENST00000335351 OTTHUMT00000080079 H20C8515.6, H20C8515.3

TCFL5R4b (R4b): E1 E2a E3 E4b E5 E8 XM_005260185.1

TCFL5R7 (R7): E1 E2a E3 E4 E5 E7 XM_005260184.1, BC046933.1, H20C8515.9 ENST00000217162

TCFL5R4b6 (R4b6): E1 E2a E3 E4b E5 E6 XM_005260186.1, BC065520.1,

TCFL5R6 (R6): E1 E2a E3 E4 E5 E6 H20C8515.9

CHA: E2b AJ271337.1 H20C8515.5,

: E3

(R2b): E4 H20C8515.2

: E5

: E8

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Tabla I. Se indican los codigos de acceso para cada uno de los RNAm de TCFL5 descritos en bases de datos y la asociacion de acuerdo con el analisis bioinformatico efectuado por los inventores.

10 La Tabla II proporciona datos adicionales referentes a las variantes o isoformas y a las

secuencias de RNAm correspondientes.

Variantes: Comentarios

R: Variante de referencia (RefSeq, NM_006602). H20C8515.3 presenta un 3'UTR mas largo. AB012124.1 comienza 39 bases despues saltandose el 1er ATG, por lo que podna ser un mensajero parcial. Ademas, presenta un 3'UTR mas corto. Q9UL49-1 es la traduccion de este mensajero. AF070992.1 comienza 170 bases despues saltandose el 1er ATG, por lo que podna ser un mensajero

R4b: Esta variante es identica a R salvo porque su exon 4 tiene 3 bases menos en su extremo 5' (exon 4b). Existen EST que soportan la existencia de esta variante.

R7: Presenta un exon final alternative (denominado exon 7). XM_005260184.1, ENST00000217162, BC046933.1 y H20C8515.8 muestran diferencias en la longitud de sus UTRs.

R4b6: Presenta un exon final alternativo (denominado exon 6) y utiliza el exon 4 alternativo (3 bases menos en su extremo 5' exon 4b) BC065520 1 nresenta algunos errores de seeueneiaeion

R6: Identica a R4b6 pero utiliza el exon 4 completo (exon 4a). Soportado por una EST.

R2b: CHA. Utiliza un exon inicial alternativo (exon 2b) que contiene un 5'UTR y una region codificante coincidente con E2a. H20C8515.2 y H20C8515.5 presentan 3'UTRs mas largos.

En base a dicho analisis bioinformatico, se establecio que el gen TCFL5 se compone de 8 exones (ver Figura 1) siendo los exones 3 (E3) y 5 (E5) comunes a todas las isoformas. El 15 exon 1 (E1) esta presente en 5 de las 6 isoformas, faltando su expresion unicamente en la isoforma denominada CHA (R2b). El ultimo exon puede estar representado por el exon 8, en el caso de la isoforma consenso TCFL5 (TCFL5R) y la isoforma CHA, por el exon 7 o bien por el exon 6. A su vez, la isoforma consenso TCFL5 (TCFL5R) y la isoforma que acaba con

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5 el exon 6, pueden presentar un exon 4 al cual le faltan los primeros codones (R4b6). Por su parte, la isoforma CHA presenta un exon 2 distinto al resto (E2b).

Ejemplo 2.- Diseno de oligonucleotidos para la deteccion de TCFL5/CHA

10 En base a dicha determinacion de los exones y variantes de los mismos que componen cada una de las isoformas, se procedio al diseno de cebadores que cuantifican TCFL5, CHA de manera independiente y TCFL5/CHA conjuntamente.

Para la cuantificacion de TCFL5/CHA se disenaron cebadores que amplificaran una region 15 comun a ambas isoformas, es decir la region comprendida entre los exones 3 y 8 (ver Figs. 1 y 3).

Asimismo, para la cuantificacion de las isoformas TCFL5 y CHA de manera espedfica, es decir cuantificando unicamente las isoformas TCFL5 y CHA (TCFL5R2b), se disenaron 20 cebadores espedficos para la amplificacion de una region comprendida entre los exones 5 y

8 de TCFL5 (ver Figs. 1 y 3).

Tabla III.-

: Primers para amplificar todas las isoformas

Nombre Pareja cebadores: Nombre secuencia Forward (5' - 3') Nombre secuencia Reverse (5' - 3') Exon

TodoTCFL5_01: SEQ ID NO:5 TGCCTGAGCAAGTTTGGATT SEQ ID NO:6 CGCATTCTACTCCGATTCCT 3 y 4

TodoTCFL5_02: SEQ ID NO:7 GAGTCCTCACAGGCAAACCT SEQ ID NO:8 GATTCAACTCATCACAGCAAATG 4 y 5

TodoTCFL5_03: SEQ ID NO:9 CAACGTAGGGAGAGGCATAAC SEQ ID NO:10 CAGAACGGCACTAAGAGATTCA 4 y 5

TodoTCFL5_04: SEQ ID NO:11 GCCTGAGCAAGTTTGGATTAAAG SEQ ID NO:12 GTGTCCAACTGACGCATTCTA 3 y 4

TodoTCFL5_05: SEQ ID NO:13 CACTAAACAGACGTTAGGTAGTAGAA SEQ ID NO:14 GATTCCTCTTCAGTGCTTGTTTG 3 y 4

TodoTCFL5_06: SEQ ID NO:15 AGGCATAACCGAATGGAAAG SEQ ID NO:16 TTGCAGAACGGCACTAAGAG 4 y 5

TodoTCFL5_07: SEQ ID NO:17 TGCCTGAGCAAGTTTGGAT SEQ ID NO:18 ACGCATTCTACTCCGATTCC 3 y 4

TodoTCFL5_08: SEQ ID NO:19 AGAAATTGAATCCACTAAACAGACG SEQ ID NO:20 CCAACTGACGCATTCTACTCC 3 y 4

TodoTCFL5_09: SEQ ID NO:21 TCAACGTAGGGAGAGGCATA SEQ ID NO:22 ACGGCACTAAGAGATTCAACTC 4 y 5

TodoTCFL5_10: SEQ ID NO:23 TGCAATTTACATACCCACTGTTTAC SEQ ID NO:24 CTCTAGGCAATCCAATATCCTGG 2 y 3

TodoTCFL5_11: SEQ ID NO:25 TGAATCTCTTAGTGCCGTTCTG SEQ ID NO:26 CTCCATGTCTTTCCTGGATGTAT 5

TodoTCFL5_12: SEQ ID NO:27 GAGCCCTTGGAGAGATTCAG SEQ ID NO:28 AGGTGCCACCGCCACACAAG 5

TodoTCFL5_13: SEQ ID NO:29 CTCTTAGTGCCGTTCTGCAA SEQ ID NO:30 CTGTGGTCCACTGCAGAGTT 5

TodoTCFL5_14: SEQ ID NO:31 GGGAGGAAGGTCTCAACGTA SEQ ID NO:32 GGATTCTGCGCCTTCTATCT 4

TodoTCFL5_15: SEQ ID NO:33 GAGCTCTGCTCGGCTAGTCT SEQ ID NO:34 GAGCTCTGCTCGGCTAGTCT 4

TodoTCFL5_16: SEQ ID NO:35 GCAAACAAGCACTGAAGAGG SEQ ID NO:36 GGGCTCTTCGCTCTACATTT 4

TodoTCFL5_17: SEQ ID NO:37 TGCCTGAGCAAGTTTGGAT SEQ ID NO:38 ACGCATTCTACTCCGATTCC 3 y 4

TodoTCFL5_18: SEQ ID NO:39 AGAGCCCTTGGAGAGATTCA SEQ ID NO:40 CCTACGCTGAGACCTTCCTC 3 y 4

TodoTCFL5_19: SEQ ID NO:41 AAGGTCTCAGCGTAGGGAGA SEQ ID NO:42 TTGCAGAACGGCACTAAGAG 3 y 4

: Primers para amplificar todas las isoformas menos CHA

TCFL5noCHA_01: SEQ ID NO:43 TTCAACAGCATCCCCGC SEQ ID NO:44 GTTGCTGAAGAGGAACATTCAT 1 y 2

: Primers para amplificar TCFL5/CHA

TCFL5/CHA_01: SEQ ID NO:45 GAGACTGACAAGGCCACAACT SEQ ID NO:46 CCGCAAAATACGCTCTCAA 5 y 8

TCFL5/CHA_02: SEQ ID NO:47 CTGACAAGGCCACAACTCTG SEQ ID NO:48 CTTTAGCCTTCGGCCAGTT 5 y 8

TCFL5/CHA_03: SEQ ID NO:49 ATCTCTTAGTGCCGTTCTGC SEQ ID NO:50 CCGCAAAATACGCTCTCAAATTC 5 y 8

TCFL5/CHA_04: SEQ ID NO:51 GTGATCGGACTGAACAGGAA SEQ ID NO:52 CGAGTTTCAGGGATGACCTC 5 y 8

TCFL5/CHA_05: SEQ ID NO:53 CTGACAAGGCCACAACTCTG SEQ ID NO:54 CTTTAGCCTTCGGCCAGTT 5 y 8

TCFL5/CHA_06: SEQ ID NO:55 GTCCCGTCAGCTTGAGTCACG SEQ ID NO:56 CTGCAGTGGACCACAGCATTCC 3 y 8

TCFL5/CHA_07: SEQ ID NO:57 AAACTGGCCGAAGGCTAAA SEQ ID NO:58 GTCCGATCACTTGATCTCCATC 8

TCFL5/CHA_08: SEQ ID NO:59 GTGATCGGACTGAACAGGAA SEQ ID NO:60 TACTGGAGTCCCGTCAGCTT 8

TCFL5/CHA_9: SEQ ID NO:61 AATTTGAGAGCGTATTTTGCGG SEQ ID NO:62 GGATTCCTGTTCAGTCCGATC 8

: Primers para amplificar CHA

SoloCHA_01: SEQ ID NO:63 GGAAGAGGAGGACTTCCACA SEQ ID NO:64 AGCAATACGTGGCAGACAAG 2b

SoloCHA_02: SEQ ID NO:65 GCTCATCCCAGCCTGTAGTT SEQ ID NO:66 TGTGGAAGTCCTCCTCTTCC 2b

SoloCHA_03: SEQ ID NO:67 CATTCTTGGATGTCAGGGAA SEQ ID NO:68 TAGAGCTCAAAGCCTGCAAA 2b

SoloCHA_04: SEQ ID NO:69 GAGAGTTGGGTTGCTGTCTGG SEQ ID NO:70 GTTCAGATGGATGTCGAATGAGAG 2b

5

Ejemplo 3.- Diferente expresion de TCFL5 y CHA en tejidos y lineas celulares humanos

Se analizo la expresion de E1 y E2 codificante en las bases de datos citadas anteriormente 10 y se observo una expresion preferente de E1 en cerebro, corazon, Wgado, pulmon, rinon y testiculo, mientras que el E2 se expreso preferencialmente en la lmea celular T Jurkat, celulas mononucleadas de sangre periferica (PBMNCs), monocitos y celulas T y B. Los resultados se muestran en la Fig. 2.

15 Ejemplo 4.- Determinacion de los niveles de expresion de TCFL5 y CHA en lineas celulares tratadas con DAPT

Se determinaron mediante Western Blot los niveles de expresion de las isoformas TCFL5, CHA y HSP90 (como control), en celulas Jurkat (Clone E6-1, ATCC® TIB-152™). Los 20 resultados en la Fig.5 muestran que se observa una diferencia de expresion entre las isoformas CHA y TCFL5 para distintas concentraciones de DAPT.

5 Ejemplo 5.- Comparacion de los niveles de expresion de TCFL5/CHA RNAm en muestras de pacientes de LLA (LLA-B vs LLA-T, diagnostico vs recaidas, riesgo alto vs medio vs bajo, y riesgo no alto vs riesgo alto)

Los pacientes fueron clasificados en funcion del riesgo tal y como se describe en materiales 10 y metodos. Los niveles de expresion de RNAm de TCFL5/CHA fueron determinados mediante Real Time qPCR.

Los datos se muestran en la Tablas IV-IX y en las graficas en la figura 6 A, B y C, correspondientes a los datos en las Tablas IV, V y VI respectivamente. Se observan 15 diferencias significativas entre las muestras en el momento del diagnostico vs recaidas, LLA- B vs LLA-T y entre muestras de pacientes con bajo, medio y alto riesgo de recaida.

Tabla IV.- LLA-B (B) versus LLA-T (T), solo muestras al diagnostico:

: media B eem B media T eem T P

TCFL5 CHA: 0,0108 0,0042 0,0009 0,0004 0,1150

TCFL5: 0,0025 0,0008 0,0004 0,0002 0,3994

CHA: 0,1299 0,0441 0,0404 0,0209 0,9484

20 Tabla V.- Diagnosticos (DX) versus recaidas (REC):

: media DX eem DX media REC eem REC P

TCFL5 CHA: 0,0095 0,0037 0,0002 0,00005 0,0099

TCFL5: 0,0023 0,0008 0,0003 0,00005 0,6847

CHA: 0,1182 0,0386 0,0306 0,0275 0,0396

5 Tabla VI.- Riesgo bajo (B), medio (M), alto (A), solo muestras al diagnostico:

: media B eem B media M eem M media A eem A

TCFL5 CHA: 0,0171 0,0075 0,0035 0,0017 0,0011 0,0004

TCFL5: 0,0033 0,0014 0,0011 0,0005 0,0013 0,0013

CHA: 0,1381 0,0689 0,0667 0,0295 0,1504 0,0926

Tabla VII.- Riesgo no alto (NA) versus riesgo alto (A), solo muestras al diagnostico:

: media NA eem NA media A eem A P

TCFL5 CHA: 0,0117 0,0046 0,0011 0,0004 0,0734

TCFL5: 0,0025 0,0009 0,0013 0,0013 0,4161

CHA: 0,1095 0,0429 0,1504 0,0926 0,9714

Las tablas siguientes presentan dichas comparaciones efectuadas solo con las muestras de 10 LLA-B (el grupo mas numeroso).

Tabla VIII.- Diagnosticos (DX) versus recaidas (REC):

: media DX eem DX media REC eem REC P

TCFL5 CHA: 0,0108 0,0043 0,0003 0,00005 0,0217

TCFL5: 0,0025 0,0008 0,0003 0,00005 0,8637

CHA: 0,1199 0,0441 0,0349 0,0314 0,1215

5 Tabla IX.- Riesgo bajo (B), medio (M), alto (A), solo muestras al diagnostico:

: media B eem B media M eem M media A eem A

TCFL5 CHA: 0,0171 0,0075 0,0054 0,0028 0,0011 0,0004

TCFL5: 0,0033 0,0014 0,0016 0,0007 0,0013 0,0013

CHA: 0,1381 0,0689 0,0856 0,0488 0,1504 0,0926

Tabla X.- Riesgo no alto (NA) versus riesgo alto (A), solo muestras al diagnostico:

: media NA eem NA media A eem A P

TCFL5 CHA: 0,0138 0,0055 0,0011 0,0004 0,026

TCFL5: 0,0028 0,001 0,0013 0,0013 0,3711

CHA: 0,1234 0,0511 0,1504 0,0926 1

eem = error estandar de la media; p = significacion estadistica

10

A los resultados de la tabla VI se le aplico un analisis de discriminates mediante el programa IBM SPSS Statistics Base con el objeto de averiguar el valor pronostico (predictivo de riesgo de recaida) de los valores de expresion de TCFL5/CHA. Los resultados indican que los valores de expresion de TCFL5/CHA permiten predecir un 87% de los pacientes de 15 alto riesgo (Tabla XI)

5 Tabla XI.- Pronostico segun los grupos de riesgo de recaida bajo, medio y alto segun los niveles de expresion de TCFL5/CHA.

Riesgo: Pronostico segun los niveles de TCFL5/CHA Total

Bajo: Medio Alto

Recuento: Bajo 6 6 6 18

Clasificacion: Medio 1 4 7 12

clfnica: Alto 0 1 7 8

%: Bajo 33,3 33,3 33,3 100,0

: Medio 8,30 33,3 58,3 100,0

: Alto 0,0 12,5 87,5 100,0

Ejemplo 6.- Determinacion de TCFL5/CHA RNAm en pacientes de LLA (diagnostico vs recaidas)

10 Determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA a nivel de RNAm y protema en muestras de pacientes de LLA clasificadas de alto o bajo riesgo de acuerdo con los criterios indicados en materiales y metodos. Los resultados se muestran en las Figuras 7A y 7B donde se observan mayores niveles de expresion de TCFL5/CHA en el momento del diagnostico.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Metodo pronostico y/o para el diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:

a. determinar de manera espedfica y simultanea los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; y

b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,

donde una reduccion en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo, y

donde el termino isoforma TCFL5 se refiere a las isoformas TCFL5R y TCFL5R4b.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, donde dichas muestras de referencia corresponden a una o mas muestras de pacientes con LLA o a lmeas establecidas de LLA.
3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel de RNA mensajero (RNAm).
4. El metodo segun la reivindicacion 3, donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan mediante RT-PCR cuantitativa.
5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la determinacion de los niveles de expresion de dichas isoformas se efectua mediante el uso de una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en:

a) un cebador que hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en el exon E3 y un cebador que hibrida con una secuencia comprendida en el exon E8;

b) un cebador que hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en el exon E5 y un cebador que hibrida con una secuencia comprendida en el exon E8;

c) una pareja de cebadores donde ambos hibridan espedficamente con una secuencia comprendida en el exon E8.
6. El metodo segun la reivindicacion 5, donde dichos cebadores son seleccionados del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62.

5

10

15

20

25

30

35

40
7. El metodo segun la reivindicacion 6, donde dichos cebadores son seleccionados del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46.
8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel proteico.
9. El metodo segun la reivindicacion 8, donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan mediante un inmunoensayo.
10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicha muestra biologica es una muestra aislada de medula osea, de sangre periferica o de liquido cefalorraquideo.
11. El metodo segun la reivindicacion 10, donde dicha muestra consiste en celulas mononucleares aisladas.
12. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, donde dicha muestra ha sido obtenida en el momento del diagnostico.
13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha leucemia linfoblastica aguda es una leucemia linfoblastica aguda de celulas B (LLA-B) o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T (LLA-T).
14. El metodo segun la reivindicacion 13, donde dicha leucemia linfoblastica aguda es LLA- B.
15. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde dichos pacientes tienen menos de 20 anos.
16. El metodo segun la reivindicacion 15, donde dichos pacientes tienen entre 0 y 15 anos.
17. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho metodo comprende ademas la deteccion o cuantificacion de uno o mas marcadores geneticos asociados a LLA de alto riesgo.

5

10

15

20

25

30

35

40
18. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho metodo comprende ademas la determination de la presencia de una o mas de las translocaciones seleccionadas del grupo que consiste en t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), Hipodiploid^a <44 cromosomas o mdice DNA <0,81.
19. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde dicho metodo comprende ademas almacenar los resultados de dicho metodo en un dispositivo de almacenamiento de datos.
20. Un metodo para la determinacion del tratamiento mas adecuado para un paciente de LLA que comprende el pronostico y/o diagnostico diferencial segun el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Metodo para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA que comprende las siguientes etapas:

a. determinar de manera espedfica y simultanea los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; y

b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,

donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativo de recaida; y

donde el termino isoforma TCFL5 se refiere a las isoformas TCFL5R y TCFL5R4b.
22. El metodo segun la revindication 21, donde dichas muestras de referencia corresponden a una o mas muestras de pacientes con LLA o a lmeas establecidas de LLA.
23. Un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLA que comprende:

a. una pareja de cebadores donde dichos cebadores son seleccionados del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62,; y

b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicha pareja de cebadores para la determinacion de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.

10

15
24. Uso de un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLA en un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde dicho kit comprende:

a. un reactivo para determinar de manera espedfica y simultanea los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5; y

b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determination de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente;

donde el termino isoforma TCFL5 se refiere a las isoformas TCFL5R y TCFL5R4b.
25. Una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62.