ES2641373T3 - Uso de P3 de proteínas de fusión de bacteriófagos como agentes de unión amiloides - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende un fragmento de unión a amiloide de g3p y un fragmento Fc de una inmunoglobulina, en el que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: (a) aminoácidos 21-509 de SEQ ID NO: 13; (b) aminoácidos 22-509 de SEQ ID NO: 13; (c) aminoácidos 23-509 de SEQ ID NO: 13; (d) aminoácidos 21-508 de SEQ ID NO: 13; (e) aminoácidos 22-508 de SEQ ID NO: 13; (f) aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 13; 10 (g) aminoácidos 21-506 de SEQ ID NO: 9; (h) aminoácidos 22-506 de SEQ ID NO: 9; (i) aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 9; (j) aminoácidos 21-505 de SEQ ID NO: 9; (k) aminoácidos 22-505 de SEQ ID NO: 9; (l) aminoácidos 23-505 de SEQ ID NO: 9; (m) aminoácidos 21-506 de SEQ ID NO: 11; (n) aminoácidos 22-506 de SEQ ID NO: 11; (o) aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 11; (p) aminoácidos 21-505 de SEQ ID NO: 11; (q) aminoácidos 22-505 de SEQ ID NO: 11; (r) aminoácidos 23-505 de SEQ ID NO: 11; (s) aminoácidos 21-528 de SEQ ID NO: 31; (t) aminoácidos 22-528 de SEQ ID NO: 31; (u) aminoácidos 23-528 de SEQ ID NO: 31; (v) aminoácidos 21-527 de SEQ ID NO: 31; (w) aminoácidos 22-527 de SEQ ID NO: 31; (x) aminoácidos 23-527 de SEQ ID NO: 31; y (y) un mutante o variante que es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a)-(x) y es capaz de unirse a amiloide.
Description
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La figura 42 presenta los resultados de un experimento que prueba dos proteínas de fusión rs-g3p(N1N2)-IgG para su efecto sobre los niveles de GFAP en el hipocampo en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer después del tratamiento con rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (Constructo 5) y rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6). Ninguna de los constructos alteró significativamente el nivel de GFAP en el hipocampo de ratones con enfermedad de Alzheimer.
La figura 43 presenta los resultados de un experimento de unión diseñado para comparar rs-g3p(N1N2)-hlgG4-Fc (Constructo 5) y rsg3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6). Los constructos se unen a fAβpotencialmente con KD similares (~11).
Las figuras 44A y 44B muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2) (Constructo 3) para bloquear el montaje de tau. En la figura 44A, 1 µM de tau se incubó solo o coincubó con 1 µM de Constructo 3, y se analizó mediante TEM después de 5 días. El Constructo 3 bloquea el ensamblaje de tau. La figura 44B muestra los resultados de un ensayo de fluorescencia de ThT utilizando ftau incubado en presencia o ausencia de 3 concentraciones de rs-g3p(N1N2) (Constructo 3). El constructo 3 bloquea de forma dependiente de la dosis el ensamblaje de tau.
La figura 45 muestra un esquema del experimento para analizar las interacciones entre fAβ42 y rs-g3p(N1N2) (Constructo 3).
La figura 46 muestra los resultados de un estudio de RMN para analizar las interacciones entre fAβ42 y rsg3p(N1N2) (Constructo 3). H significa hidrógeno y D significa deuterio. Los hidrógenos de las fibras Aβ intercambian el deuterio con el tiempo y la velocidad se ve afectada por la unión del Constructo 3 a las fibras. Los resultados indican una iteración molecular entre el Constructo 3 y fAβ42 en los residuos 17-22 y 33-40 de fAβ42.
Las figuras 47A, 47B, 47C y 47D muestran TEMs representativas de Constructo 3 desagregando el fAβ42 preformado después de la incubación durante 744 horas. La figura 47A muestra fAβ42 solo. La figura 47B muestra fAβ42 más el constructo 3. La figura 47C muestra fAβ42 solo con una magnificación incrementada en comparación con la figura 47A. La figura 47D muestra fAβ42 más Constructo 3 con mayor aumento en comparación con la figura 47B.
La figura 48 muestra los resultados de un ensayo SPR representativo que muestra que rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6) se une fuertemente a ftau.
La figura 49A presenta los resultados de un ensayo ThT representativo que muestra la capacidad del Constructo 6 para desagregar ftau. La figura 49B muestra una representación gráfica del experimento de la figura 49A. Las figuras 49A y 49B también muestran que la desagregación de ftau por el Constructo 6 es dependiente de la dosis.
La figura 50A presenta un estudio SPR de la unión de rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG4-Fc (Constructo 8) a las fibrillas Aβ. Los resultados muestran que el Constructo 8 se une fuertemente a las fibrillas Aβ (KD ~36 nM). Un fragmento N1N2 de g3p (no enlazado a un dominio Fc) mostró una unión más débil (KD ~36 nM). La figura 50B presenta los resultados de un ensayo de competición de unión que muestra la capacidad de rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 8) para unirse a fAβ-42. Un fragmento N1N2 de g3p (no enlazado a un dominio Fc) mostró una unión más débil.
La figura 51 muestra una comparación de aminoácidos entre If1 g3p (SEQ ID NO: 29) y fd g3p (SEQ ID NO: 30). Los aminoácidos que son idénticos entre If1 y fd en el dominio N1 de g3p están sombreados. El dominio N1 está en caja.
Las figuras 52A y 52B presentan los resultados de experimentos que muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6) para reducir significativamente la deposición de Aβ y las fibras de tau después de la inyección directa al cerebro en un modelo in vivo de enfermedad de Alzheimer. En la figura 52A, el nivel de Aβ está significativamente reducido en ratones que recibieron Constructo 6 en comparación con control. En la figura 52B, el nivel de tau se reduce significativamente en ratones que recibieron el Constructo 6 en comparación con el control.
Las figuras 53A y 53B presentan los resultados de experimentos que muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6) para tratar la EA cuando se administra sistemáticamente en lugar de como una inyección directa al cerebro. Las figuras 53A y 53B muestran que los ratones AD que recibieron Constructo 6 han reducido la hiperactividad en comparación con los ratones que recibieron un control.
La figura 54 presenta los resultados de experimentos que muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6) para tratar la EA cuando se administra sistemáticamente en lugar de una inyección directa al cerebro. En la figura 54, la capacidad de los ratones AD de circular se reduce en ratones que recibieron el Constructo 6 en comparación con el control.
La figura 55 presenta los resultados de experimentos que muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc
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(Constructo 6) para tratar la EA cuando se administra sistemáticamente en lugar de una inyección directa al cerebro. En la figura 55, el salto en la esquina de los ratones AD se reduce significativamente en los ratones que recibieron el Constructo 6 en comparación con el control.
La figura 56 presenta los resultados de experimentos que muestran la capacidad de rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (Constructo 6) para tratar la EA cuando se administra sistemáticamente en lugar de como una inyección directa al cerebro. En la figura 56, los ratones AD que recibieron el Constructo 6 mostraron una alternancia significativamente más espontánea de entradas de brazo en el laberinto en Y con relación a ratones que recibían PBS de control.
Breve descripción de las secuencias
- SEQ ID NO:
- Constructo
- 1
- M13 g3p
- 2
- fd g3p
- 3
- f1 g3p
- 4
- secuencia de consenso de SEQ ID NOs: 1, 2 y 3
- 5
- I2-2 g3p
- 6
- Ike g3p
- 7
- secuencia de consenso de SEQ ID NOs: 5 y 6
- 8
- If1 g3p
- 9
- Aminoácido del constructo 4
- 10
- ADN del constructo 1
- 11
- Aminoácido del constructo 5
- 12
- ADN del constructo 2
- 13
- Aminoácido del constructo 6
- 14
- fd N2
- 15
- f1 N2
8
- 16
- M13 N2
- 17
- Ike N2
- 18
- I2-2 N2
- 19
- If1 N2
- 20
- Aminoácido del constructo 3
- 21
- GxFxGxF
- 22
- KLVFF
- 23
- Secuencia de ADN de la porción g3p de constructo 3
- 24
- Secuencia de aminoácidos de la porción g3p del constructo 3
- 25
- His His His His His His
- 26
- ADN del constructo 4
- 27
- ADN del constructo 5
- 28
- ADN del constructo 6
- 29
- If1 g3p (Figura 51)
- 30
- fd g3p (Figura 51)
- 31
- Aminoácidos del constructo rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc "Constructo 8"
- 32
- ADN del constructo rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc "Constructo 8"
- 33
- Cebador directo: AAAAAAGGGAATTCGATGGCTGAAACTGTTGAAAGTTG
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Los términos "compuestos activos", "agente activo" e "ingrediente activo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a la porción de una proteína de fusión que proporciona la actividad biológica de la proteína de fusión. La porción g3p de las proteínas de fusión de la invención es el "compuesto activo", el "agente activo" o el "ingrediente activo". Igualmente, la porción g3p de las proteínas de fusión de la invención es la parte biológicamente activa o terapéuticamente efectiva. La porción g3p de la proteína de fusión de la presente invención no se usa para facilitar el plegamiento anómalo de proteínas de un socio de fusión, que actúa entonces como un agente terapéutico no relacionado con g3p, como se describe en el documento WO 2004/018685. Tampoco se usan las proteínas de fusión de la invención para la presentación de fagos como se describe en el documento US 2009/105090.
El término "inmunogénico" se usa en el presente documento para referirse a la capacidad de una composición para provocar una respuesta inmune en un mamífero que ha sido expuesto a la composición.
Tal como se utiliza en el presente documento, "Constructo 1" se deriva de M13 de tipo salvaje (véase, archivo Genbank: NC_003287.2, versión GI: 56718463. En el constructo 1, en comparación con M13 de tipo salvaje, Ser378(AGC) se cambia a Gly(GGC), e Ile87 (ATT) se cambia a Asn (AAC)). Por lo tanto, mientras que en el tipo salvaje M13 hay un "G" en el ácido nucleico número 2710, en el constructo 1 hay un "A" en esta posición. Del mismo modo, en el tipo salvaje M13 hay una "A" en el ácido nucleico número 4479, en el constructo 1 hay un "T" en esta posición. Finalmente, en el tipo salvaje M13 hay un "C" en el ácido nucleico número 4480, mientras que en el Constructo 1 hay un "T" en esta posición. El constructo 1 comprende los ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 10.
"Constructo 2" es un aislado M13 de tipo salvaje (GenBank JX412914.1). El constructo 2 comprende los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 12.
"Constructo 3" es un fragmento g3p soluble recombinante que comprende los dominios N1 y N2 de g3p (rsg3p(N1N2)) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
"Constructo 4" es la proteína de fusión IgG4 Fc del fragmento g3p soluble recombinante (rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc) que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. La región N1N2 de "Constructo 4" se deriva de la región N1N2 de "Constructo 1". La secuencia de ácidos nucleicos que codifica "Constructo 4" se expone en SEQ ID NO: 26.
Los primeros 21 aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 9 representan una secuencia señal que se escinde entre los aminoácidos 20 y 21 durante la producción recombinante. La metionina en el aminoácido 21 de SEQ ID NO: 9 es un artefacto de clonación (codificado por el sitio de clonación múltiple usado para fusionar la secuencia señal con la secuencia N1-N2) y a veces también se escinde durante el recombinante. La alanina en el aminoácido 22 de SEQ ID NO: 9 corresponde al aminoácido N-terminal de g3p aislado de fago M13. La alanina en el aminoácido 22 de SEQ ID NO: 9 a veces también se escinde durante el recombinante. La lisina C-terminal en el aminoácido 506 de SEQ ID NO: 9 también se corta a veces durante la producción recombinante en células eucariotas. Los productos que contienen una o más de las eliminaciones N-y C-terminales identificadas anteriormente forman parte de la presente invención.
Así, en algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p descrita como "Constructo 4" es una "forma madura de Constructo 4", y comprende el aminoácido 21-506 de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p comprende los aminoácidos 22-506 de SEQ ID NO: 9 ("forma madura truncada en Met de N-terminal del Constructo 4"). En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p comprende los aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 9 ("forma madura truncada en Met-Ala en N-terminal del Constructo 4"). En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p comprende los aminoácidos 21-505 de SEQ ID NO: 9 ("forma madura truncada en Lys de C terminal del Constructo 4"). En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p comprende los aminoácidos 22-505 de la SEQ ID NO: 9 ("forma madura N-terminal Met-truncada, Truncada en Lys en C terminal del Constructo 4"). En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p comprende los aminoácidos 23-505 de la SEQ ID NO: 9 ("Forma madura truncada en Met-Ala de N terminal, truncada en lys de C-terminal del Constructo 4").
Del mismo modo, se incluyen los ácidos nucleicos que codifican las formas truncadas de longitud completa, N, C y N y C-terminal del Constructo 4, como se describe en el presente documento. En una realización, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión g3p comprende los nucleótidos de la SEQ ID NO: 26. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión g3p es la porción de SEQ ID NO: 26 que codifica la porción g3p, o la porción g3p-lg, excluyendo los nucleótidos que codifican la secuencia señal (es decir, excluyendo los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-20, 1 22, o 1-23 de la SEQ ID NO: 9).
"Constructo 5" es una proteína de fusión IgG4 Fc de fragmento g3p soluble recombinante (rs-g3p(N1N2)-hlgG4-Fc) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 11. La región N1N2 de "Constructo 5" se deriva de la región N1N2 de "Constructo 2". La secuencia de ácidos nucleicos que codifica "Constructo 5" se expone en SEQ ID NO: 27.
Los primeros 21 aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 11 representan una secuencia señal que se escinde entre los aminoácidos 20 y 21 durante la producción recombinante. La metionina en el aminoácido 21 de SEQ ID
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que codifica la proteína de fusión g3p es la porción de SEQ ID NO: 32 que codifica la porción g3p, o la porción g3p-Ig, excluyendo los nucleótidos que codifican la secuencia señal (es decir, excluyendo los nucleótidos que codifican aminoácidos 1-20, 1-22, o 1-23 de la SEQ ID NO: 31).
Los constructos 4, 5, 6 y 8, así como sus mutantes y variantes, son proteínas de fusión g3p de ejemplo de la invención.
Proteínas de fusión G3p
Las proteínas de fusión g3p de la invención comprenden un fragmento de unión a amiloide de g3p que es el agente activo, ingrediente activo, compuesto activo, porción biológicamente activa, porción terapéuticamente efectiva y/o parte farmacéuticamente efectiva de cada fusión. Las proteínas de fusión que comprenden mutantes, variantes y fragmentos g3p están incluidas en la invención. En un aspecto, la proteína de fusión g3p comprende un fragmento de g3p que se une a amiloide. En algunas realizaciones, la proteína de fusión g3p de la invención comprende un dominio N1 N2 de g3p o un mutante, variante o fragmento del mismo, en el que el fragmento de unión a amiloide de g3p está unido, fusionado, conjugado, acoplado o asociado con al menos una proteína diferente de g3p. En las proteínas de fusión de la invención, la proteína diferente de g3p es un fragmento Fc de una inmunoglobulina. La porción g3p de la proteína de fusión no se proporciona para facilitar el plegamiento de proteínas de un socio terapéutico de fusión como se describe en el documento WO 2004/018685, o para la presentación en fagos como se describe en el documento US 2009/105090.
En otros aspectos, la proteína de fusión comprende un polipéptido g3p que se une al amiloide y comprende un dominio G3p N2 o un mutante, variante o de los mismos, en el que el fragmento de unión a amiloide de g3p está unido, fusionado, conjugado, acoplado o asociado con al menos una proteína diferente de g3p. En las proteínas de fusión de la invención, la proteína diferente de g3p es un fragmento Fc de una inmunoglobulina. En otros aspectos, la proteína de fusión comprende un polipéptido g3p que se une al amiloide y comprende un dominio N1 N2 de g3p, en el que el dominio N3 de g3p comprende un mutante, variante o fragmento g3p N2 que estabiliza el dominio N1 de g3p, g3p dominio N2 en una conformación que es susceptible de unión a g3p.
La porción g3p de la proteína de fusión está unida, fusionada, conjugada, acoplada o asociada con/a al menos un dominio de proteína o proteína adicional con el que normalmente no está asociado. La porción no g3p de la proteína de fusión g3p de la invención comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina. En una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión g3p que comprende un fragmento de unión a amiloide de g3p unido a un segundo dominio que comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina. En otra realización, la proteína de fusión consiste en un fragmento de unión a amiloide de una proteína g3p unida a un fragmento Fc de una inmunoglobulina. Como se ha indicado, algunas proteínas de fusión de la invención comprenden un fragmento de unión a amiloide mutado o variado de g3p, tal como un dominio N1N2 o N2 mutado o variado que se une a las fibras amiloides. Por lo tanto, las proteínas de fusión que comprenden estas formas mutadas o variadas son también parte de la invención.
El fragmento de unión a amiloide de g3p y el polipéptido de socio de fusión puede ser parte de una secuencia de aminoácidos continua con el polipéptido asociado de fusión unido directamente o a través de un enlace peptídico corto al extremo N o al extremo C del polipéptido de fragmento de unión g3p o amiloide. En tales casos, el fragmento amiloide de unión de g3p y el polipéptido socio de fusión puede traducirse como un único polipéptido a partir de una secuencia codificante que codifica tanto el fragmento de unión amiloide de g3p como el polipéptido asociado a la fusión.
A. Porciones G3p de las proteínas de fusión g3p
La g3p tiene dos dominios amino-terminales, N1 y N2, que interactúan para formar un complejo N1-N2, y un dominio carboxi terminal, N3 (también denominado “CT”). Una bisagra permite abrir y cerrar entre N1 y N2. A veces la bisagra se considera parte de N2, mientras que en otros casos se trata como un elemento separado. N1 y N2 también están enlazados por una secuencia ligadora flexible rica en glicina. Dentro de N1, hay dos puentes disulfuro entre Cys7 y Cys36 y entre Cys46 y Cys53. Hay un solo puente de disulfuro en N2 entre Cys188 y Cys201. En el dominio carboxi terminal hay un puente disulfuro entre Cys354 y Cys371. Marvin, 1998. No hay puentes disulfuro interdominio en g3p.
Ejemplos de fragmentos de unión amiloide de g3p incluyen el dominio N2 bien con la bisagra o sin la bisagra; y los dominios N1-N2, con o sin la secuencia intermedia de enlace, y con o sin la bisagra. En cualquiera de los ejemplos anteriores, los fragmentos N2 o N1N2 pueden ser N2 o N1N2 encontrados en un bacteriófago filamentoso de tipo salvaje o N2 o N1 N2 recombinante. En cualquiera de los ejemplos anteriores, los fragmentos N2 o N1N2 pueden ser mutantes o variantes de la secuencia de bacteriófagos filamentosos de tipo salvaje.
Una alineación de estructura primaria de N2 de: fd, f1, M13, Ike, I2-2, e If1 se muestra como la figura 26. Los aminoácidos de fd se muestran en la SEQ ID NO: 14; f1 en la SEQ ID NO: 15; M13 en la SEQ ID NO: 16; Ike en la
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es el ingrediente activo y confiere actividad biológica terapéutica a la proteína de fusión. En algunos aspectos, la porción g3p de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a la porción g3p de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 31 o cualquiera de los truncamientos N, C, N y C terminales de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 31 descritas en este documento. En un aspecto de esta realización, la porción g3p de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la porción g3p de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, la porción g3p puede ser un mutante, variante o fragmento en comparación con cualquier porción g3p indicada en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31 y es capaz de unirse a amiloide. En otro aspecto, la proteína de fusión se selecciona entre los aminoácidos 21-506 de SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 22-506 de SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 21-505 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 22-505 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 23-505 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 21-506 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 22-506 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 21-505 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 22-505 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 23-505 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 21-509 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 22509 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 23-509 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 21-508 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 22-508 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos 21-528 de SEQ ID NO: 31, aminoácidos 22-528 de SEQ ID NO: 31, aminoácidos 23-528 de SEQ ID NO: 31, aminoácidos 21-527 de SEQ ID NO: 31, aminoácidos 22-527 de SEQ ID NO: 31, o aminoácidos 23-527 de SEQ ID NO: 31, o es un mutante
o variante de cualquiera de estas proteínas de fusión.
En otro aspecto, la porción g3p de la proteína de fusión es una g3p mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 20 sustituciones de aminoácidos en comparación con la porción g3p correspondiente de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31, en donde la proteína de fusión es menos inmunogénica en un ser humano que su contrapartida no modificada. En algunos aspectos de estas realizaciones, la proteína de fusión tiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con la correspondiente porción de g3p de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO:
31. En otros aspectos, la proteína de fusión tiene de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos en comparación con la correspondiente porción de g3p de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO:
31. En otros aspectos, las sustituciones de aminoácidos están presentes en la porción g3p de la proteína de fusión (por ejemplo, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de la SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de SEQ ID NO: 13, o los aminoácidos 21, 22 o 23 a 296 de SEQ ID NO: 31),
En otras realizaciones, la proteína de fusión menos inmunogénica es una variante de los aminoácidos 21, 22 o 23 a 505 o 506 de la SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 505 o 506 de la SEQ ID NO: 11 , los aminoácidos 21, 22 o 23 a 508 o 509 de SEQ ID NO: 13, o los aminoácidos 21, 22 o 23 a 527 o 528 de SEQ ID NO: 31, en los que la variante difiere de la secuencia de aminoácidos citada sólo por tener 1 a 20 sustituciones de aminoácidos en la región de los aminoácidos 22 o 23 a 238 de la SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 22 o 23 a 238 de la SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 22 o 23 a 238 de la SEC ID NO. 13, o aminoácidos 22 o 23 a 296 de SEQ ID NO: 31, respectivamente, en algunos aspectos de estas realizaciones, la proteína de fusión tiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos. En otros aspectos, la proteína de fusión tiene de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos.
Las proteínas de fusión menos inmunogénicas a las que se ha hecho referencia anteriormente se pueden identificar usando procedimientos de desinmunización bien conocidos. Típicamente, las porciones g3p de las proteínas de fusión se seleccionan para determinar dónde contienen epítopos de células T. Dichos epítopos potenciales de células T se definen comúnmente como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos con la capacidad de unirse a moléculas de MHC Clase II. En otras realizaciones, toda la proteína de fusión se prepara para epítopos de células
T.
En la técnica, se han proporcionado métodos para permitir la detección de epítopos de células T mediante medios computacionales que exploran motivos de secuencia reconocidos en epítopos de células T determinados experimentalmente o, alternativamente, utilizando técnicas computacionales para predecir péptidos de unión a MEC de clase II y en péptidos de unión a DR particulares. Por ejemplo, los documentos WO98/52976 y WO00/3431 describen métodos de subprocesamiento computacional para identificar secuencias de polipéptidos con el potencial de unirse a un subconjunto de alotipos DR humanos de clase 11 de MHC. El documento WO08/044032 describe la selección de una secuencia de aminoácidos primaria frente a una base de datos de epítopos de células T conocidos para identificar epítopos de células T en esa secuencia.
Alternativamente, las porciones peptídicas de la proteína que se va a desinmunizar (por ejemplo, las porciones g3p de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13) se pueden sintetizar y probar in silico o en un ensayo celular o in vivo para determinar si se unen a moléculas de MHC (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 7,208,147).
Una vez que se han identificado los epítopos de células T predichos, se utiliza una sustitución de aminoácidos juiciosa dentro de la secuencia primaria de la porción g3p de la proteína de fusión de la invención en un intento de
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secuencia señal, o una secuencia de ácidos nucleicos que es degenerativa para, pero codifica el mismo polipéptido que cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, la secuencia señal es de mamífero.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión g3p comprende SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 32, donde los ácidos nucleicos que codifican la secuencia señal (es decir, aminoácidos 1-20, 1-21 o 1-22 de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 11, 13 o 31) están excluidos. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión g3p, pero excluye los nucleótidos que codifican una secuencia señal se selecciona de i) nucleótidos 61, 64 o 67 a 1521 de cualquiera de las SEQ ID NO: 26 o 27; ii) los nucleótidos 61, 64, o 67 a 1527 de SEQ ID NO: 28; y iii) los nucleótidos 61, 64, o 67 a 1587 de SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica un dominio g3p N1N2 o mutante, variante o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 20 sustituciones de aminoácidos en comparación con la porción g3p de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31, en la que la proteína de fusión es menos inmunogénica en un humano que la porción g3p de cualquiera de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31. En algunos aspectos de estas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión tiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con la porción g3p de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 31. En otros aspectos de estas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión tiene de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos en comparación con la porción g3p de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13
- o SEQ ID NO: 31. En otros aspectos de estas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido en el que las sustituciones de aminoácidos están todas presentes en la porción g3p de la proteína de fusión (por ejemplo, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de la SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de la SEQ ID NO: 13, o los aminoácidos 21, 22 o 23 a 296 de SEQ ID NO: 31,
- o mutantes, variantes o fragmentos de los mismos).
En algunas realizaciones, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión que es una variante de cualquiera de los aminoácidos 21, 22 o 23 a 505 o 506 de la SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 505 o 506 de SEQ ID NO: 11, aminoácidos 21, 22 o 23 a 508 o 509 de SEQ ID NO: 13, o aminoácidos 21, 22 o 23 a 527 o 528 de SEQ ID NO: 31 , y menos inmunogénica que la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31, en la que la variante difiere de su correspondiente secuencia de aminoácidos sólo teniendo 1 a 20 sustituciones de aminoácidos en la g3p región (es decir, los aminoácidos 21, 22 o 23 a 238 de SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 22 ó 23 a 238 de SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 22 o 23 a 238 de SEQ ID NO: 13,
- o aminoácidos 22 o 23 a 296 de SEQ ID NO: 31, respectivamente). En algunos aspectos de estas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión tiene de 1 a 10 tales sustituciones de aminoácidos. En otros aspectos, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión tiene de 1 a 5 amino tales sustituciones de ácido.
- E.
- Proteínas de fusión mutantes g3p
En otro aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden fragmentos mutantes de unión a amiloide de g3p. Pueden producirse, o seleccionarse, proteínas de fusión que comprenden fragmentos mutantes de unión a amiloide de g3p, para propiedades que contribuyen a la eficacia terapéutica de las composiciones farmacéuticas descritas en esta solicitud. Por ejemplo, los fragmentos de unión a amiloide de g3p pueden ser mutados recombinantemente o seleccionados de otro modo para poseer una o más de las siguientes propiedades relativas a g3p de M13: afinidad aumentada por unión amiloide, una articulación reducida TM, avidez incrementada (se distingue la avidez de afinidad en que la avidez se usa para describir la suma de toda la unión amiloide disponible donde un g3p comprende más de un sitio de unión a amiloide), mayor capacidad para desagregar agregados amiloides o mayor capacidad para prevenir la agregación de fibrillas amiloides. Alternativamente, o además, los fragmentos amiloides mutantes de g3p pueden incorporar otras propiedades útiles descritas en otra parte de la descripción.
Pueden producirse fragmentos amiloides mutantes de g3p por mutagénesis de fagos, o por técnicas recombinantes, tales como mutagénesis dirigida a sitios basados en PCR o mutagénesis aleatoria.
Los fragmentos de unión a amiloide de g3p, por ejemplo, dominios N1N2 o dominios N2, también pueden ser mutagenizados usando técnicas recombinantes e incorporados en proteínas de fusión de la invención. Por ejemplo, un vector tal como se describe en este documento que lleva g3p o un fragmento de unión a amiloide del mismo (por ejemplo, N1N2 o N2) puede ser mutado usando estrategias de mutagénesis basadas en PCR. La proteína mutada codificada se expresa entonces y la unión amiloide y la afinidad de los mutantes se evalúan como se describe.
Los fragmentos mutantes de unión a amiloide de g3p también pueden derivarse de g3p mutante. Por ejemplo, mutando g3p y/o seleccionando un g3p mutado con propiedades deseables y obteniendo a continuación el fragmento de unión a amiloide deseado, por ejemplo, mediante proteólisis y posterior purificación.
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