ES2641920T3

ES2641920T3 - Ingeniería genética de animales no humanos para la producción de anticuerpos quiméricos

Info

Publication number: ES2641920T3
Application number: ES11763476.6T
Authority: ES
Inventors: Larry Green; Hiroaki Shizuya
Original assignee: Ablexis LLC
Current assignee: Ablexis LLC
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2031-03-31
Also published as: US11104743B2; EP3251503A1; CA2787498C; CA2787498A1; PL2553100T3; US10494445B2; EP2553100B1; KR20180030942A; US20170190797A1; EP4345163A3; US10836832B2; EP4345163A2; US10604587B2; US20200181285A1; NZ601171A; US20170190794A1; WO2011123708A2; US10526420B2; US20170188557A1; ES2984484T3

Abstract

Una célula de ratón que comprende un transgén sintético que sustituye funcionalmente segmentos génicos de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el transgén sintético comprende una secuencia polinucleotídica de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada humana, uno o más segmentos génicos D humanos, uno o más segmentos génicos J humanos, un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de región bisagra superior humana que sustituyen los ortólogos de ratón, en donde el transgén comprende un segmento génico CH2 de ratón y un segmento CH3 de ratón, en donde el transgén sintético experimenta reorganización génica para producir una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica que comprende un dominio CH1 humano, una región bisagra superior humana, un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón, en donde las secuencias de la región constante de ratón del transgén son alotípicamente diferentes del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el transgén sintético está integrado aleatoriamente en el genoma de la célula, y en donde la célula comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivado.

Description

Ingeniería genética de animales no humanos para la producción de anticuerpos quiméricos

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención se dirige en general a cadenas de inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos y animales y células no humanos, y la producción de los mismos.

Descripción de la técnica relacionada

Las terapias de enfermedades que utilizan anticuerpos monoclonales (Acm) han revolucionado la medicina, y los fármacos basados en Acm se utilizan ahora en el tratamiento de cáncer, autoinmunidad, inflamación, degeneración macular, infecciones, etc. Sin embargo, las tecnologías disponibles para la generación y descubrimiento de Acm para uso en la prevención y tratamiento de enfermedades y trastornos tienen inconvenientes significativos incluyendo ineficacia, ausencia o pérdida de suficiente potencia, ausencia o pérdida de especificidad y la inducción de una respuesta inmunitaria contra el Acm terapéutico. Los primeros intentos de usar Acm como agentes terapéuticos estuvieron obstaculizados por la inmunogenicidad de la composición de aminoácidos de ratón de los Acm. Cuando se administra a seres humanos, la secuencia de aminoácidos de ratón provocaba una respuesta de anticuerpo anti-ratón humana (HAMA) que reducía drásticamente la potencia y farmacocinética del fármaco, así como que producía reacciones alérgicas graves y potencialmente letales.

Métodos adicionales para generar agentes terapéuticos de Acm incluyen Acm quimerizados (Acmq) creados mediante tecnología de ADN recombinante combinando un dominio variable derivado de ratón añadido a una región constante humana. Otros métodos de generar anticuerpos implican humanizar Acm in vitro para reducir más la cantidad de secuencia de aminoácidos de ratón en un Acm terapéutico. Las tecnologías de presentación de anticuerpos desarrolladas para generar anticuerpos “completamente humanos” in vitro todavía tienen que mimetizar adecuadamente el proceso de maduración del anticuerpo natural que se produce durante la respuesta inmunitaria in vivo (véase, pg. 1122-23, Lonberg, Nat. Biotech. (2005) 23:1117-1125). Los Acm desarrollados usando estos métodos pueden provocar una respuesta inmunitaria que puede reducir la eficacia y/o ser potencialmente mortal, y estos procesos típicamente llevan mucho tiempo y son costosos. Además, durante los procesos moleculares inherentes en estos métodos, se puede producir la pérdida de afinidad y cambio de epítopo, reduciendo de esta manera la potencia e introduciendo cambios indeseables en la especificidad. La expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulina quiméricas en bacterias se divulga en el documento WO 2004/078937 (D1).

Se han manipulado ratones transgénicos para producir anticuerpos completamente humanos introduciendo transgenes de anticuerpos humanos para sustituir funcionalmente loci de inmunoglobulinas (Ig) de ratón inactivadas. Sin embargo, muchos de estos modelos de ratones transgénicos carecen de componentes importantes en el proceso de desarrollo del anticuerpo, tal como suficiente diversidad en los genes de los que se generan las regiones variables de los anticuerpos, la capacidad de producir IgD (Loset et al., J. Immunol., (2004) 172:2925-2934), elementos reguladores importantes en cis importantes para la recombinación de cambio de clase (CSR), o una región control de locus 3’ completamente funcional (LCR) (por ejemplo, patente en EE UU No. 7.049.426; y Pan et al., Eur. J. Immunol. (2000) 30:1019-1029). Algunos ratones transgénicos contienen cromosomas artificiales de levadura o miniloci humanos como transgenes integrados. Otros portan transcromosomas que muestran varias frecuencias de inestabilidad mitótica y meiótica. Además, las regiones constantes completamente humanas de estos ratones transgénicos funcionan de forma subóptima debido a la actividad reducida junto con otros componentes endógenos y que actúan en trans comparado con ratones de tipo salvaje, por ejemplo, el aparato de transducción de señales de BCR (Igα e Igβ) y receptores de Fc (FcR), respectivamente.

También se han manipulado genéticamente ratones por inserción de secuencias génicas (“knock-in”) para producir anticuerpos quiméricos que están compuestos de dominios V humanos añadidos a dominios C de ratón que permanecen completamente intactos, las porciones completamente intactas comprenden todo el ADN genómico posterior al complejo génico J (véase las patentes en EE UU No. 5.770.429 y 6.596.541 y la publicación de solicitud de patente en EE UU No. 2007/0061900). Las regiones V humanas de estos ratones se pueden recuperar y añadir a genes de regiones constantes humanas por métodos de biología molecular y expresar por métodos recombinantes para producir anticuerpos completamente humanos. Los anticuerpos de estos ratones pueden mostrar reducción o pérdida de actividad, potencia, solubilidad, etc., cuando la región V humana se elimina del contexto de los dominios C de ratón en el que se desarrolló y después añadirse a una región C humana para hacer un anticuerpo completamente humano. Además, debido a las estructuras únicas y diferentes del locus lamba de la inmunoglobulina de ratón frente a la del locus lamba de la inmunoglobulina humano y debido a que el potenciador 3’ endógeno del locus lamba de ratón puede ser defectuoso, se podría esperar que el enfoque de inserción de secuencias génicas descrito diera un locus lamba que funciona ineficazmente. Otros ejemplos de animales transgénicos que producen anticuerpos se encuentran en los documentos WO 2008/090958 (D2), WO 2006/117699 (D3), WO 2998/151081 (D4), WO 2003/047336 (D5) y US 2009/260093 (D7).

Los métodos de construcción de ADN transgénico para introducir en especies eucariotas, particularmente metazoos, han empleado ADN aislado de genotecas genómicas hechas de ADN natural aislado. La manipulación del ADN natural clonado en el diseño final deseado para un transgén típicamente se alcanza mediante procesos de recombinación que son engorrosos, ineficaces, lentos y propensos a errores y están constreñidos por la disponibilidad de los ADN presentes en genotecas genómicas. En algunos casos, es deseable construir un transgén de un organismo, cepa o haplotipo específico del mismo para el que una genoteca genómica no está fácilmente disponible, pero para la que hay disponible información de secuencias genómicas parciales o secuencias de transcriptoma. Estos obstáculos previenen la creación de transgenes que comprenden secuencias complejamente reconfiguradas y/o transgenes diseñados para comprender secuencias quiméricas de ADN de diferentes especies o diferentes cepas o diferentes haplotipos de la misma especie. Como consecuencia, se previene la manipulación de transgenes muy adaptados para eucariotas, particularmente metazoos.

Los métodos actuales de desarrollar un Acm terapéutico pueden alterar funciones del anticuerpo, tal como, solubilidad, potencia y especificidad de antígeno, para las que se seleccionaron durante las fases iniciales del desarrollo. Además, los Acm generados por los métodos actuales tienen el potencial de provocar una respuesta inmunitaria peligrosa tras la administración. Los actuales ratones que producen anticuerpos humanos y quiméricos carecen del contenido genético apropiado para funcionar apropiadamente, por ejemplo, diversidad genética, elementos reguladores en cis, elementos reguladores que actúan en trans, dominios de señalización, estabilidad genética. Sería beneficioso desarrollar métodos y composiciones para la generación y descubrimiento aumentados de anticuerpos terapéuticos y que retienen potencia y especificidad a través de los procesos de generación, descubrimiento, desarrollo y producción de anticuerpos sin que provoquen una respuesta inmunitaria, así como métodos de producir tales anticuerpos. Algunas de las composiciones de transgenes comprenden secuencias de ADN tan complejamente modificadas que se han prevenido la construcción de estas mejoras y derivación de productos de las mismas. Mientras que se prefieren los ratones debido a su economía y utilidad establecida, es deseable una solución amplia a través de múltiples especies. La presente invención proporciona una solución para hacer e introducir tales transgenes, mejorar los antecedentes genéticos en los estos transgenes funcionarían si se utilizan en un ratón, y, en casos particulares, generar anticuerpos mejorados en animales transgénicos.

Breve compendio

La presente divulgación se refiere en general a animales y células no humanos, transgenes, anticuerpos, métodos, composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, así como kits de varias formas de realización divulgadas en el presente documento. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos que se refieren a cadenas de Ig quiméricas y anticuerpos producidos por los ratones y células de ratón y los anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos manipulados de los dominios variables de dichos anticuerpos quiméricos.

Una forma de realización se refiere a un método de producir una célula de ratón que comprende un genoma que comprende una cadena de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena de inmunoglobulina comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, que comprende las etapas de (1) diseñar una construcción de ADN in silico, en donde dicha construcción comprende uno o más segmentos génicos V, F y J humanos y un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de la región bisagra superior humana que sustituyen a los ortólogos de ratón; (2) producir dicha construcción de ADN; y (3) introducir la construcción en el genoma de una célula de ratón. Además, la región constante quimérica comprende un segmento génico de dominio constante de ratón, en donde las secuencias de la región constante de ratón del transgén son alotípicamente diferentes del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina endógena.

En una forma de realización, la región quimérica constante está codificada por una secuencia polinucleotídica humana derivada de dos o más alelos y/o haplotipos. En aún otra forma de realización, el dominio variable humano está codificado por una secuencia polinucleotídica derivada de dos o más alelos y/o haplotipos.

En las reivindicaciones de la invención, la cadena de inmunoglobulina quimérica es una cadena pesada y la región constante quimérica comprende un dominio CH1 humano. En otra forma de realización relacionada, el método comprende además las etapas de diseñar una segunda construcción de ADN in silico, en donde dicha construcción comprende una cadena ligera de inmunoglobulina humana; producir dicha segunda construcción de ADN; e introducir la segunda construcción en el genoma de una célula de ratón. En una forma de realización, la cadena ligera humana comprende uno o más segmentos génicos Vκ humanos. En otra forma de realización, la cadena ligera humana comprende además uno o más segmentos génicos Jκ y Cκ humanos. En aún otra forma de realización, la cadena ligera humana comprende 8 o más segmentos génicos Vλ humanos. En una forma de realización relacionada, la cadena ligera humana comprende además 7 o más pares de segmentos Jλ-Cλ humanos.

La invención se refiere a una célula de ratón que comprende un genoma que comprende una cadena de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena de inmunoglobulina comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde la célula de ratón se produce por un método que comprende las etapas de (1) diseñar una construcción de ADN in silico, en donde dicha construcción comprende uno o más segmentos génicos V, F y J humanos y un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de la región bisagra superior humana

que sustituyen a los ortólogos de ratón; (2) producir dicha construcción de ADN; y (3) introducir la construcción en el genoma de una célula de ratón. Otra forma de realización abarca un ratón generado a partir de la célula. Otra forma de realización proporciona una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica producida por el ratón. Ciertas formas de realización proporcionan un anticuerpo quimérico producido por el animal ratón.

Otra forma de realización proporciona una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde el dominio variable humano deriva de un ratón, en donde la región constante quimérica comprende un dominio CH1 humano. Una forma de realización proporciona una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde la región constante quimérica esta codificada por una secuencia polinucleotídica humana derivada de dos o más alelos y/o haplotipos. Otra forma de realización proporciona una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde dicho dominio variable humano esta codificado por una secuencia polinucleotídica humana derivada de dos o más alelos y/o haplotipos.

Aun otra forma de realización se dirige a un polinucleótido que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica divulgada. En formas de realización particulares, el polinucleótido comprende secuencias codificantes y no codificantes. En ciertas formas de realización, el polinucleótido es sintético. Una forma de realización se refiere a una construcción que comprende el polinucleótido un polinucleótido que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica divulgada.

Otra forma de realización proporciona un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica, y (2) una cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde la región constante de la cadena pesada quimérica deriva de dos o más alelos y/o haplotipos. Aún otra forma de realización proporciona un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica, y (2) una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde dicho dominio variable de cadena pesada humano deriva de dos o más alelos y/o haplotipos.

Aun otra forma de realización proporciona una célula de ratón que comprende un genoma que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde la región constante deriva de dos o más alelos y/o haplotipos. Una forma de realización proporciona una célula de ratón que comprende un genoma que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable humano y una región constante quimérica, en donde el dominio variable humano deriva de dos o más alelos y/o haplotipos. Otra forma de realización proporciona una célula de ratón que comprende un genoma que comprende un transgén sintético que codifica un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde dicha cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica. En ciertas formas de realización, el genoma de la célula de ratón divulgada comprende además una cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una forma de realización, el genoma de la célula de ratón comprende una cadena ligera Igκ humana y una cadena ligera Igλ humana. Además, la célula de ratón comprende un locus de inmunoglobulina endógeno inactivado. Otra forma de realización proporciona un anticuerpo quimérico producido por la célula de ratón.

Aun otra forma de realización proporciona un ratón que comprende un genoma que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica, y (2) una cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde la región constante de la cadena pesada quimérica deriva de dos o más alelos y/o haplotipos. Otra forma de realización proporciona un ratón que comprende un genoma que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica, y (2) una cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde el dominio variable de cadena pesada humano deriva de dos o más alelos y/o haplotipos. Una forma de realización proporciona un ratón que comprende un genoma que comprende un transgén sintético que codifica un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica. En formas de realización particulares, el genoma comprende además una cadena ligera de inmunoglobulina humana. En ciertas formas de realización, el genoma del ratón comprende una cadena ligera Igκ humana y una cadena ligera Igλ humana. Además, la célula de ratón comprende un locus de inmunoglobulina endógeno inactivado. Otra forma de realización proporciona un anticuerpo quimérico producido por el ratón divulgado.

Una forma de realización de la invención proporciona un ratón que comprende un locus de Ig endógeno inactivado, en donde el locus de Ig endógeno comprende una deleción que daña la formación de un dominio variable funcional y la formación de una región constante capaz de dirigir el desarrollo de células B primarias. En ciertas formas de

realización, el locus de inmunoglobulina endógeno es un locus de cadena pesada. En otras ciertas formas de realización, el locus de inmunoglobulina endógeno es un locus de cadena ligera. Otra forma de realización proporciona una célula de ratón que comprende un locus de Ig endógeno inactivado, en donde el locus de Ig endógeno comprende una deleción que daña la formación de un dominio variable funcional y la formación de una región constante capaz de dirigir el desarrollo de células B primarias.

También se divulga una construcción de ADN que comprende una primera secuencia flanqueante, un transgén, y una segunda secuencia flanqueante, en donde el transgén comprende una secuencia polinucleotídica capaz de introducir una deleción en un locus de Ig endógeno que daña la formación de un dominio variable funcional y la formación de una región constante capaz de apoyar el desarrollo de células B primarias. También se divulga un kit que comprende la construcción de ADN y un método para inactivar un locus de inmunoglobulina endógeno que comprende dañar la formación de un dominio variable funcional, y dañar la formación de una región constante capaz de dirigir el desarrollo de células B primarias.

También se divulga un método de producir una genoteca de presentación de anticuerpos que comprende proporcionar un animal no humano que tiene un genoma que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada no endógeno y una región constante de cadena pesada quimérica; recuperar las secuencias polinucleotídicas del animal, en donde las secuencias polinucleotídicas codifican regiones variables de la cadena ligera de inmunoglobulina y regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina no endógenas; y producir una genoteca de presentación de anticuerpos que comprende las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera. Una forma de realización de la invención proporciona una genoteca de presentación de anticuerpos que comprende regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina generadas por un animal no humano que tiene un genoma que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada quimérica comprende un dominio variable de cadena pesada no endógeno y una región constante de cadena pesada quimérica, en donde las regiones variables derivan de anticuerpos quiméricos.

Breve descripción de las varias vistas de las figuras

La figura 1 representa la recombinación homóloga de BAC C5 y BAC P12 en E. coli.

La figura 2 representa la eliminación de la repetición de 70 kb entre las dos copias del vector pBeloBAC usando recombinasa CRE.

La figura 3 representa la inserción de Tpn-Zeo 15 kb de la unión del vector.

La figura 4 representa la recombinación homóloga de BAC C5P12y BAC C20 en E. coli.

La figura 5 representa la eliminación de la repetición de 44 kb entre las dos copias del vector pBeloBAC usando recombinasa CRE.

Descripción detallada

Visión de conjunto

La presente invención se refiere a anticuerpos quiméricos, animales no humanos que producen anticuerpos quiméricos o humanizados, métodos de producir tales células y animales no humanos, y composiciones y kits que comprenden los anticuerpos. En la invención, los animales no humanos son ratones.

Los anticuerpos quiméricos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento comprenden un dominio variable no endógeno y una región constante de cadena pesada quimérica. En formas de realización particulares, una cadena IgH comprende uno o más segmentos génicos V, D y J no endógenos, un dominio CH1 no endógeno, y dominios CH2 y CH3 endógenos. En ciertas formas de realización, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la cadena IgH quimérica descrita en el presente documento comprende además una cadena IgL que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos no endógena. En otras formas de realización, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la cadena IgH quimérica descrita en el presente documento comprende además una cadena IgL que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por secuencias de nucleótidos endógenas y no endógenas.

Manipular los anticuerpos quiméricos de esta manera previene la alteración en la conformación del dominio V resultante del cambio in vitro de una primera región C, particularmente un dominio CH1 y opcionalmente una porción de la región bisagra de una especie, por ejemplo, ratón, con la que se ha desarrollado durante la respuesta inmunitaria in vivo a una segunda región C, particularmente un dominio CH1 y opcionalmente una porción de la región bisagra de otra especie, por ejemplo, humana. Los anticuerpos producidos por los ratones de la presente invención no muestran la reducción o pérdida de actividad y potencia vista en anticuerpos de otros animales

productores de anticuerpos quiméricos cuando, por ejemplo, la región V humana se añade a una región C humana para hacer un anticuerpo completamente humano, que puede estar causada por conformación alterada del dominio VH resultante del cambio del dominio CH1 y/o por diferencias en la unión a antígeno debido a la longitud o flexibilidad cambiada de las regiones bisagra superiores (la secuencia peptídica desde el final de CH1 al primer residuo de cisteína en la bisagra que forma un enlace disulfuro inter-cadena pesada, y que son variables en longitud y composición) cuando se cambia de región constante de ratón a humana (Roux et al., J. Immunology (1997) 159:3372-3382 y referencias en el mismo). La región bisagra media está unida por los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuros inter-cadena pesada.

Definiciones

Los términos usados en esta especificación en general tienen su significado normal en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde cada término se usa. Ciertos términos se discuten a continuación o en otro lugar en la especificación, para proporcionar una guía adicional al practicante al describir las composiciones y métodos de la invención y cómo hacerlos y usarlos. El ámbito y significado de cualquier uso de un término será aparente del contexto específico en el que el término se usa. Como se usa en la presente divulgación y reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen formas plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa.

Como se usa en el presente documento, “anticuerpo” e “inmunoglobulina” (Ig) se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refiere a moléculas de proteína producidas por células B que reconocen y se unen a antígenos específicos y que pueden estar unidos a la membrana o secretados. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, en que están producidos por un único clon de células B y, por tanto, reconocen el mismo epítopo y tienen la misma secuencia de ácido nucleico y aminoácidos, o policlonales, en que están producidos por múltiples clones de células B, reconocen uno o más epítopos del mismo antígeno y típicamente tienen diferentes secuencias de ácido nucleico y aminoácidos.

Las moléculas de anticuerpo, o Ig, típicamente están compuestas de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas unidas a través de enlaces disulfuro. Hay dos tipos de IgL, Igκ e Igλ. Tanto las cadenas pesadas (IgH) como las cadenas ligeras (IgL) contienen una región o dominio variable (V) y una región o dominio constante (C). La parte del locus de IgH que codifica la región V comprende múltiples copias de segmentos génicos variable (V), diversidad (D), y unión (J). La porción de los loci de IgL, Igκ e Igλ, que codifican la región V comprenden múltiples copias de segmentos génicos V y J. La parte codificante de la región V de los loci de IgH e IgL experimenta reorganización génica, por ejemplo, diferentes combinaciones de segmentos génicos se organizan para formar las regiones variables de IgH e IgL, para desarrollar diversa especificidad antigénica en los anticuerpos. La forma secretada de la región IgH está hecha de hasta tres dominios C, CH1, CH2 y CH3, opcionalmente CH4 (Cµ), y una región bisagra. La forma unida a membrana de la región C de IgH también tiene dominios de membrana e intracelular. La región constante de IgH determina el isotipo del anticuerpo, por ejemplo, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE en seres humanos. Se apreciará que los mamíferos no humanos que codifican múltiples isotipos de Ig serán capaces de experimentar cambio de clase de isotipo.

Un dominio o fragmento “Fab” comprende la parte N-terminal de la IgH, que incluye la región V y el dominio CH1 de la IgH, y la IgL entera. Un dominio “F(ab’)2” comprende el dominio Fab y una parte de la región bisagra, en donde las 2 IgH están unidas a través de enlace disulfuro en la región bisagra media. Tanto Fab como F(ab’)2 son “fragmentos de unión a antígeno”. La parte C-terminal de IgH, que comprende los dominios CH2 y CH3, es el dominio “Fc”. El dominio Fc es la parte de la Ig reconocida por receptores celulares, tal como el FcR, y al que se une la proteína activadora del complemento, C1q. La región bisagra inferior, que está codificada en la parte 5’ del exón CH2, proporciona flexibilidad dentro del anticuerpo para unirse a los receptores FcR.

Como se usa en el presente documento “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo codificado por una secuencia polinucleotídica que contienen secuencias polinucleotídicas derivadas de dos o más especies.

Un anticuerpo “humanizado” es un anticuerpo quimérico que se ha manipulado de modo que comprenda más secuencia humana que su molécula parental. Los anticuerpos humanizados son menos inmunógenos después de la administración a seres humanos cuando se comparan con anticuerpos no humanizados preparados de otra especie. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede comprender la región variable de un anticuerpo quimérico unida a una región constante humana. Los anticuerpos quiméricos descritos en el presente documento se pueden usar para producir un anticuerpo completamente humano.

Como se usa en el presente documento “cadena de Ig quimérica” se refiere a una cadena pesada de Ig o una cadena ligera de Ig codificada por una secuencia polinucleotídica que contiene secuencias polinucleotídicas de dos

o más especies. Por ejemplo, una cadena pesada de Ig quimérica puede comprender segmentos génicos VH, DH, JH y CH1 humanos y segmentos génicos CH2 y CH3 de ratón.

“Polipéptido”, “péptido” o “proteína” se usan de forma intercambiable para describir una cadena de aminoácidos que están unidos por enlaces químicos. Un polipéptido o proteína puede ser una IgH, IgL, dominio V, dominio C o un anticuerpo.

“Polinucleótido” se refiere a una cadena de ácidos nucleicos que están unidos por enlaces químicos. Los polinucleótidos incluyen, pero no están limitados a, ADN, ADNc, ARN, ARNm y secuencias y segmentos génicos. Los polinucleótidos se pueden aislar de una fuente viva tal como una célula eucariota, célula procariota o virus, o se pueden derivar mediante manipulación in vitro usando técnicas estándar de biología molecular, o por síntesis de ADN, o por una combinación de un número de técnicas.

“Locus” se refiere a una localización en un cromosoma que comprende uno o más genes o exones, tal como un locus de IgH o Igκ, los elementos reguladores en cis, y las regiones de unión a las que se unen los factores que actúan en trans. Como se usa en el presente documento, “gen” o “segmento génico” se refiere a la secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido específico o parte del mismo, tal como un dominio VL, un dominio CH1, una región bisagra superior, o una parte de la misma. Como se usa en el presente documento, “segmento génico” y “exón” se pueden usar de forma intercambiable y se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido o parte del mismo. Un gen, o segmento génico, puede comprender además uno o más intrones, elementos de control transcripcional, por ejemplo, promotores, potenciadores u otras regiones no codificantes (por ejemplo, elementos reguladores en cis, por ejemplo, regiones no traducidas 5’ y/o 3’, sitios de poliadenilación).

Como se usa en el presente documento, el término “locus de Ig inactivado” se refiere a un locus de Ig que no codifica una cadena de Ig funcional. Una “región variable funcional” producida de un locus de Ig funcional se refiere a una secuencia polinucleotídica capaz de experimentar recombinación V-(D)-J, que se transcribe y dicho transcrito se traduce a un polipéptido de región variable que es capaz de ser expresado en una superficie celular. Una “región constante de cadena pesada funcional” se refiere a una región constante capaz de unirse operativamente a una región variable y dirigir el desarrollo de células B primarias. Desarrollo de células B primarias se refiere al desarrollo de células B en los órganos linfoides primarios, por ejemplo, médula ósea, y abarca la transición de célula madre a célula B inmadura, incluyendo las fases de desarrollo de célula pro-B temprana (es decir, reorganización D-J de IgH), célula pro-B tardía (es decir, reorganización V-DJ de IgH), célula pre-B grande (es decir, expresa receptor pre-B), y célula pre-B pequeña (es decir, reorganización V-J de IgL). Mediante “dirigir” el desarrollo de células B primarias, se quiere decir que la región constante de la cadena pesada funcional es capaz de, por ejemplo, anclaje a la membrana celular, transducción de señales, y/o unión a un receptor de Fc. Una “región constante de cadena ligera funcional” se refiere a una región constante capaz de unirse operativamente a una región variable y unirse a una cadena pesada para avanzar el desarrollo de células B más allá de la fase de célula pre-B pequeña.

“Dañar” se refiere a la introducción de una deleción o mutación que produce, por ejemplo, una región variable que ya no es funcional o una región constante que ya no es funcional. Por ejemplo, la deleción homocigota de Cµ limita que una IgH dirija el desarrollo de células B primarias en algunos mamíferos y razas de los mismos.

“Mutación” se refiere a un cambio en una secuencia polinucleotídica o polipeptídica natural. Una mutación puede producir un cambio funcional. Las mutaciones incluyen tanto la adición de nucleótidos como la deleción de nucleótidos. “Deleción” se refiere a la eliminación de uno o más nucleótidos de la secuencia polinucleotídica endógena natural. Las deleciones y adiciones pueden introducir mutaciones de cambio de marco de lectura. Las deleciones también pueden eliminar genes enteros, segmentos o módulos génicos. En algunos casos, una deleción de parte de la secuencia endógena natural puede coincidir con la adición de una secuencia no endógena. Por ejemplo, una parte de la secuencia polinucleotídica endógena se puede eliminar, es decir, delecionar, tras recombinación homóloga con un polinucleótido que comprende una secuencia no endógena, por ejemplo, un marcador de selección. En otros aspectos, una deleción de una secuencia polinucleotídica endógena se puede producir después de la introducción de dos secuencias de reconocimiento no endógenas para una recombinasa específica de sitio, por ejemplo, un sitio loxP, seguido por exposición a la recombinasa, por ejemplo, CRE.

El término “endógeno” se refiere a una secuencia polinucleotídica que es natural en la célula o animal. “Ortólogo” se refiere a una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido correspondiente en otra especie, por ejemplo, un dominio CH1 humano y un dominio CH1 de ratón. El término “singénico” se refiere a una secuencia polinucleotídica que se encuentra en la misma especie que se puede introducir en un animal de esa misma especie, por ejemplo, un segmento génico Vκ de ratón introducido en un ratón. Se debe indicar que la secuencia polinucleotídica de dos individuos de la misma especie, pero de cepas diferentes, puede tener regiones de diferencia significativa.

Como se usa en el presente documento, el término “homólogo” o “secuencia homóloga” se refiere a una secuencia polinucleotídica que tiene una secuencia muy similar, o alto porcentaje de identidad (por ejemplo, el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más), a otra secuencia polinucleotídica o segmento de la misma. Por ejemplo, una construcción de ADN de la invención puede comprender una secuencia que es homóloga a una parte de una secuencia de ADN endógeno para facilitar la recombinación en esa localización específica. La recombinación homóloga puede tener lugar en células procariotas y eucariotas.

Como se usa en el presente documento, “secuencia flanqueante” o “secuencia de ADN flanqueante” se refiere a una secuencia de ADN adyacente a una secuencia de ADN no endógena en una construcción de ADN que es homóloga a una secuencia de ADN endógena o una secuencia no endógena previamente recombinada, o una parte de la misma. Las construcciones de ADN de la invención pueden tener una o más secuencias flanqueantes, por ejemplo, una secuencia flanqueante en el extremo 3’ y 5’ de la secuencia no endógena o una secuencia flanqueante en el extremo 3’ o 5’ de la secuencia no endógena. La secuencia flanqueante puede ser homóloga a una secuencia endógena en un gen endógeno, o la secuencia flanqueante puede ser homóloga a una secuencia endógena adyacente a (es decir, fuera de) un gen endógeno.

La frase “célula competente para recombinación homóloga” se refiere a una célula que es capaz de recombinar homólogamente fragmentos de ADN que contienen regiones de homología solapante. Los ejemplos de células competentes para recombinación homóloga incluyen, pero no están limitados a, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas, bacterias, levaduras, varias líneas celulares y células madre embrionarias (ES).

Un “animal no humano” se refiere a cualquier animal diferente de un ser humano, tal como, por ejemplo, aves, reptiles y mamíferos. “Mamífero no humano” se refiere a un animal diferente de seres humanos que pertenece a la clase Mammalia. los ejemplos de mamíferos no humanos incluyen, pero no están limitados a, primates no humanos, camélidos, roedores, bovinos, ovinos, equinos, perros, gatos, cabras, oveja, delfines, murciélagos, conejos y marsupiales. Los mamíferos no humanos preferidos dependen principalmente de hipermutación somática y/o conversión génica para generar diversidad de anticuerpos, por ejemplo, ratón, conejo, cerdo, oveja, cabra, camélidos, roedores y vaca. Los mamíferos no humanos particularmente preferidos son ratones.

El término “transgénico” se refiere a una célula o animal que comprende una secuencia polinucleotídica no endógena, por ejemplo, un transgén derivado de otra especie, incorporada en su genoma. Por ejemplo, un ratón que contiene un segmento génico VH humano integrado en su genoma fuera del locus de IgH de ratón endógeno es un ratón transgénico; y un ratón que contiene un segmento génico VH humano integrado en su genoma directamente sustituyendo un VH de ratón endógeno en el locus de IgH de ratón endógeno es un ratón transgénico algunas veces también denominado ratón “knock-in”. En células transgénicas y mamíferos no humanos, la secuencia polinucleotídica no endógena se puede expresar con el gen endógeno, ectópicamente en ausencia del gen endógeno o en ausencia de la secuencia endógena correspondiente, u ortólogo, originalmente encontrada en la célula o mamífero no humano.

Como se usa en el presente documento, “sustituir” se refiere tanto a sustitución directa como funcional. Mediante “sustitución directa” se quiere decir que una secuencia de ADN endógena se sustituye con una secuencia de ADN manipulada que comprende una secuencia no endógena en la localización de la secuencia endógena en el genoma, tal como por recombinación homóloga. Por ejemplo, la secuencia de ADN endógena se elimina a través de recombinación homóloga, o la secuencia endógena que permanece entre dos secuencias no endógenas incorporadas se deleciona. Mediante “sustitución funcional” se quiere decir que la función (por ejemplo, realizada por el polipéptido producido de la secuencia de ADN manipulada) de una secuencia de ADN endógena la lleva a cabo una secuencia de ADN no endógena. Por ejemplo, un locus IgH endógeno se puede sustituir funcionalmente por un transgén que codifica una cadena IgH quimérica y que se inserta en el genoma fuera del locus IgH endógeno.

Un animal “humanizado”, como se usa en el presente documento se refiere a un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que tiene una estructura genética compuesta que retiene secuencias génicas del animal no humano, además de uno o más segmentos génicos y/o secuencias reguladoras génicas de la estructura génica original que se ha sustituido con secuencias humanas análogos.

Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que se puede integrar otro fragmento de ácido nucleico sin pérdida de la capacidad del vector de replicarse. Los vectores se pueden originar de un virus, un plásmido o la célula de un organismo superior. Los vectores se utilizan para introducir ADN exógeno o recombinante en una célula huésped, en donde el vector se replica.

Un agente polinucleótido puede estar contenido en un vector, que puede facilitar la manipulación del polinucleótido, incluyendo la introducción del polinucleótido en una célula diana. El vector puede ser un vector de clonación, que es útil para mantener el polinucleótido, o puede ser un vector de expresión, que contiene, además del polinucleótido, elementos reguladores útiles para expresar el polinucleótido y, donde el polinucleótido codifica un ARN, para expresar el ARN codificado en una célula particular, ya sea para la posterior traducción del ARN a un polipéptido o para la posterior actividad reguladora en trans por el ARN en la célula. Un vector de expresión puede contener los elementos de expresión necesarios para alcanzar, por ejemplo, transcripción sostenida del polinucleótido codificante, o los elementos reguladores pueden estar operativamente unidos al polinucleótidos antes de ser clonado en el vector.

Un vector de expresión (o el polinucleótido) generalmente contiene o codifica una secuencia promotora, que puede proporcionar expresión constitutiva o, si se desea, inducible o específica de tejido o específica de estadio de desarrollo del polinucleótido codificante, una secuencia de reconocimiento de poli-A, y un sitio de reconocimiento de

ribosomas o sitio interno de entrada al ribosoma, u otros elementos reguladores tal como un potenciador, que puede ser específico de tejido. El vector también puede contener elementos requeridos para la replicación en un sistema huésped procariota o eucariota o ambos, según se desee. Tales vectores, que incluyen vectores plásmidos y vectores víricos tal como vectores bacteriófagos, baculovirus, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus vaccinia, alfa virus y virus adenoasociados, se conocen bien y se pueden comprar de una fuente comercial (Promega, Madison Wis.; Stratagene, La Jolla Calif.; GIBCO/BRL, Gaithersburg Md.) o los puede construir un experto en la materia (véase, por ejemplo, Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest 92:381-387, 1993; cada uno de los cuales se incorpora al presente documento mediante referencia).

Un vector de ADN utilizado en los métodos de la invención puede contener marcadores de selección positivos y negativos. Los marcadores positivos y negativos pueden ser genes que cuando se expresan confieren resistencia a fármacos a las células que expresan estos genes. Los marcadores de selección adecuados para E. coli pueden incluir, pero no están limitados a: Km (gen de resistencia a kanamicina), tetA (gen de resistencia a tetraciclina) y beta-lactamasa (gen de resistencia a ampicilina). Los marcadores de selección adecuados para células de mamífero en cultivo pueden incluir, pero no están limitados a: hyg (gen de resistencia a higromicina), puro (gen de resistencia a puromicina), y G418 (gen de resistencia a neomicina). Los marcadores de selección también pueden ser genes metabólicos que pueden convertir un sustrato en una sustancia tóxica. Por ejemplo, el gen de timidina quinasa cuando se expresa convierte el fármaco ganciclovir en un producto tóxico. Por tanto, el tratamiento de células con ganciclovir puede seleccionar negativamente para genes que no expresan timidina quinasa.

En un aspecto relacionado, los marcadores de selección pueden ser “marcadores cribables”, tal como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteínas de tipo GFP y luciferasa.

Varios tipos de vectores están disponibles en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, vectores bacterianos, víricos y de levadura. Un vector de ADN puede ser cualquier vector de ADN adecuado, incluyendo un plásmido, cósmido, bacteriófago, cromosoma artificial derivado de p1 (PAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC), o cromosoma artificial de mamífero (MAC). En ciertas formas de realización, el vector de ADN es un BAC. Los varios vectores de ADN se seleccionan como apropiados para el tamaño del ADN insertado en la construcción. En una forma de realización, las construcciones de ADN son cromosomas artificiales bacterianos o fragmentos de los mismos.

El término “cromosoma artificial bacteriano” o “BAC” como se usa en el presente documento se refiere a un vector de ADN bacteriano. Se pueden utilizar BAC, tal como los derivados de E. coli, para introducir, delecionar o sustituir secuencias de ADN de células de mamíferos no humanos o animales a través de recombinación homóloga. E. coli puede mantener ADN genómico complejo tan grande como 500 kb o mayor en forma de BAC (véase Shizuya y Kouros-Mehr, Keio J Med. 2001, 50(1):26-30) con mayor estabilidad de ADN que cósmidos o cromosomas artificiales de levadura. Además, las genotecas en BAC de ADN genómico humano tienen representación más completa y fiable del genoma humano que genotecas en cósmidos o cromosomas artificiales de levadura. Se describen los BAC en mayor detalle en las solicitudes en EE UU No. 10/659.034 y 61/012.701, que se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad.

Los fragmentos de ADN que comprenden un locus de Ig, o una parte del mismo, que se van a incorporar en el mamífero no humano se aíslan de la misma especie de mamífero no humano antes de la humanización del locus. Se pueden humanizar múltiples BAC que contienen fragmentos solapantes de un locus de Ig y los fragmentos solapantes recombinan para generar locus de IgH o IgL continuo. El locus de Ig quimérico resultante comprende segmentos génicos humanos operativamente unidos a segmentos génicos de Ig del mamífero no humano para producir un locus de Ig funcional, en donde el locus es capaz de experimentar reorganización génica y producir de esta manera un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos.

Estos procesos para recombinar los BAC y/o de manipular un locus de Ig quimérico o fragmento del mismo requiere que una célula bacteriana, tal como E. coli, se transforme con un BAC que contiene el locus de Ig huésped o una parte del mismo. El bacilo que contiene el BAC se transforma después con un vector de recombinación que comprende el segmento génico de Ig humano deseado unido a secuencias de homología flanqueantes compartidas con el BAC que contiene el locus de Ig del huésped o parte del mismo. La homología de secuencia compartida media la recombinación homóloga y entrecruzamiento entre el segmento génico de Ig humano en el vector de recombinación y el segmento génico de Ig de mamífero no humano en el BAC. La detección de los BAC homólogamente recombinados puede utilizar marcadores seleccionables y/o cribables incorporados en el vector. Los BAC humanizados se pueden aislar fácilmente de las bacterias y usarse para la producción de células no humanas con inserción de secuencias génicas. Los métodos de recombinar BAC y manipular inserciones y deleciones en el ADN en BAC y los métodos para producir ratones genéticamente modificados a partir de los mismos están documentados. Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.770.429; Fishwild, D. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851; Valenzuela et al. Nature Biotech. (2003) 21:652-659; Testa et al. Nature Biotech. (2003) 21:443-447; y Yang y Seed. Nature Biotech. (2003) 21:447-451.

La primera etapa de recombinación se puede llevar a cabo en una cepa de E. coli que es deficiente para actividad sbcB, sbcC, recB, recC o recD y tiene una mutación sensible a la temperatura en recA. Después de la etapa de recombinación, se aísla una construcción de ADN recombinada, la construcción tiene las varias secuencias y orientaciones como se ha descrito.

Las regiones usadas para la recombinería de BAC deben tener una longitud que permita la recombinación homóloga. Por ejemplo, las regiones flanqueantes puede tener desde aproximadamente 0,1 a 19 kb, y típicamente desde aproximadamente 1 kb hasta 15 kb, o de aproximadamente 2 kb a 10 kb.

El proceso para recombinar BAC para hacer BAC mayores y/o a medida que comprenden partes de los loci de Ig requiere que una célula bacteriana, tal como E. coli, se transforme con un BAC que porta un primer locus de Ig, una parte del mismo, o alguna otra secuencia diana. La E. coli que contiene el BAC se transforma después con un vector de recombinación (por ejemplo, plásmido o BAC) que comprende el segmento génico de Ig deseado que se va a introducir en el ADN diana, por ejemplo, uno o más segmentos génicos VH, DH y/o JH humanos que se van a unir a una región del locus de IgH de ratón, ambos vectores tienen una región de identidad de secuencia. Esta región compartida de identidad en presencia de recA funcional en E. coli media el entrecruzamiento entre el segmento génico de Ig en el vector de recombinación y el segmento génico de Ig de mamífero no humano en el BAC. La selección y resolución de los BAC homólogamente recombinados puede utilizar marcadores seleccionables y/o cribables incorporados en los vectores. Los BAC humanizados y quiméricos se pueden purificar fácilmente de E. coli y usar para producir células y animales no humanos transgénicos y con incorporación de secuencias génicas introduciendo los ADN por varios métodos conocidos en la técnica y seleccionando y/o cribando para sucesos de integración aleatorios o dirigidos.

Alternativamente, los fragmentos de ADN que contienen un locus de Ig que se van a incorporar a un animal no humano derivan de ADN sintetizado in vitro. Los genomas de muchos organismos se han secuenciado por completo (por ejemplo, humano, chimpancé, mono rhesus, ratón, rata, perro, gato, pollo, cobaya, conejo, caballo, vaca, alpaca) y están públicamente disponibles con anotación. Para muchos otros organismos, hay información públicamente disponible sobre las secuencias del transcriptoma. En particular, pero no limitado a, los loci de inmunoglobulina de ratón y humano se han estudiado y caracterizado para la localización y actividad de segmentos génicos codificantes y elementos reguladores no codificantes.

El término “in silico” como se usa en el presente documento, se refiere al uso de un ordenador o algoritmo informático para modelar un proceso natural o in vitro, y en particular, para ayudar en el diseño de una secuencia de nucleótidos o polipéptido y/o la producción sintética de una secuencia de nucleótidos o polipéptido usando, todo o en parte, un sistema sin células (por ejemplo, usando síntesis química automatizada). Las secuencias de los loci de Ig se pueden manipular y recombinar in silico usando software comúnmente disponible para análisis de secuencias de ácidos nucleicos. La recombinación in silico puede ser dentro del mismo locus, entre dos loci de la misma especie, o entre loci de dos o más especies. La recombinación in silico se puede realizar para diseñar una secuencia funcional

o una secuencia no funcional, inactivada. La manipulación precisa nucleótido o nucleótido permite la manipulación precisa de composición de secuencia que se puede aplicar para manipular de forma precisa la función del transgén y después de la transcripción y traducción, producir composición y función generada con precisión del producto polipeptídico del locus.

Las secuencias de un locus de Ig también se pueden recombinar in silico con las de un locus no de inmunoglobulina, sea de la misma especie o de una diferente. Tales secuencias incluyen, pero no están limitadas a, genes para marcadores de selección de fármacos positivos y negativos, tal como G418, hyg, puro y tk, secuencias de reconocimiento de recombinasa específica de sitio tal como sitios loxP y sus variantes y sitios frt, y secuencias precisamente demarcadas para dirigir la recombinación homóloga. Después de ensamblar la secuencia deseada in silico, se puede sintetizar y ensamblar después sin errores (Kodumal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101:1557315578). La síntesis, ensamblaje y secuenciación de ADN grandes se proporciona en base contractual (por ejemplo, DNA 2.0, Menlo Park, CA; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA; y Eurogentec, San Diego, CA). Tales secuencias de ADN sintéticas se portan en vectores tal como plásmidos y BAC y se pueden transferir en otros vectores tal como YAC.

El término “construcción” como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de ADN construida artificialmente por ingeniería genética, recombinería o síntesis. Las construcciones incluyen, por ejemplo, transgenes y vectores (por ejemplo, BAC, P1, bacteriófago lambda, cósmidos, plásmidos, YAC y MAC). En una forma de realización, las construcciones de ADN se linealizan antes de la introducción en una célula. En una forma de realización, las construcciones de ADN no se linealizan antes de la introducción en una célula.

Como se usa en el presente documento, “loxP” y “CRE” se refiere a un sistema de recombinación específico de sitio derivado del bacteriófago P1. Los sitios loxP tienen 34 nucleótidos de longitud. Cuando el ADN está flanqueado en cada lado por un sitio loxP y se expone a recombinación mediada por CRE, el ADN intermedio se deleciona y los dos sitios loxP se resuelven a uno. El uso del sistema CRE/lox, incluyendo sitios lox de secuencia variante y variantes de CRE, para el que la ingeniería genética en muchas especies, incluyendo ratones, está bien documentado.

Un sistema similar, que emplea sitios frt y recombinada flp de S. cerevisiae se puede emplear con efecto similar. Como se usa en el presente documento, cualquier implementación de CRE/loxP para mediar sucesos de deleción en células de mamífero en cultivo también puede estar mediado por el sistema flp/frt.

Como se usan en el presente documento, los términos “inmuniza”, “inmunización” e “inmunizar” se refiere a exponer el sistema inmunitario adaptativo de un animal a un antígeno. El antígeno se puede introducir usando varias rutas de administración, tal como inyección, inhalación, ingestión o inmunización con ADN. Tras una segunda exposición al mismo antígeno, la respuesta inmunitaria adaptativa, es decir, respuestas de células T y células B, aumenta.

“Antígeno” se refiere a un péptido, lípido, aminoácido, ácido nucleico, sacárido, hapteno o entidad química que es reconocida por el sistema inmunitario adaptativo. Los ejemplos de antígenos incluyen, pero no están limitados a, componentes de la pared celular bacteriana, polen y factor rh. “Antígeno diana” se refiere a un antígeno, péptido, lípido, sacárido o aminoácido, que es reconocido por el sistema inmunitario adaptativo que es elegido para producir una respuesta inmunitaria contra, por ejemplo, un agente infeccioso específico o células endógenas o exógenas o producto de las mismas. Los antígenos diana incluyen, pero no están limitados a, componentes bacterianos y víricos, antígenos específicos de tumor, citoquinas, moléculas de superficie celular, y cualquier antígeno contra el que se han hecho anticuerpos u otras proteínas de unión por métodos in vivo o in vitro, etc.

El término “agente farmacéutico” o “fármaco” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier agente farmacológico, terapéutico o biológico activo que se puede administrar a un sujeto o paciente. En ciertas formas de realización, el sujeto es un animal, y preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano.

El término “soporte farmacéuticamente aceptable” se refiere en general a cualquier material que pueda acompañar al fármaco y que no produce una reacción adversa con el sistema inmunitario del sujeto.

El término “administrar”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferir, distribuir, introducir o transportar un fármaco u otro agente, tal como un antígeno diana, a un sujeto. Tales modos incluyen administración oral, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal o subcutánea.

Mamíferos no humanos y células que codifican cadenas pesadas de Ig quiméricas

Los animales y células no humanos descritos en el presente documento comprenden uno o más loci de Ig alterados (por ejemplo, IgH, Igκ y/o Igλ) que comprenden segmentos génicos de Ig no endógenos que sustituyen los segmentos génicos endógenos. En ciertas formas de realización, los loci alterados sustituyen directamente los segmentos génicos endógenos. En otras formas de realización, los loci alterados sustituyen funcionalmente los segmentos génicos endógenos.

Los segmentos génicos no endógenos pueden derivar de cualquier especie, y pueden incluir segmentos génicos singénicos. La secuencia no endógena puede derivar de, por ejemplo, seres humanos, ratones, primates no humanos, camélidos, roedores, bovinos, ovinos, equinos, perros, gatos, cabras, ovejas, delfines, murciélagos, conejos y marsupiales. Como se ha descrito anteriormente, la célula o animal no humano puede ser cualquier animal no humano. Según esto, las células y animales transgénicos descritos en el presente documento pueden comprender secuencias de ADN derivadas de cualquier combinación de especies, siempre que el animal sea un mamífero no humano. A modo de ejemplo, se prevén células de ratón y ratones quiméricos que comprenden secuencias polinucleotídicas de Ig humanas o de camélidos. Además, la célula o animal transgénico puede comprender ADN no endógeno de más de una especie. Por ejemplo, un genoma de ratón transgénico puede comprender secuencias de ADN tanto humanas como de camélidos.

Las células y animales transgénicos descritos en el presente documento comprenden uno o más segmentos génicos V no endógenos. En la presente invención, el animal no humano es un ratón. En ciertas formas de realización, la célula o animal comprende además uno o más segmentos génicos J no endógenos. En otra forma de realización, una célula o animal que comprende una cadena IgH quimérica opcionalmente comprende además uno o más segmentos génicos D no endógenos.

En una forma de realización, la célula o animal comprende un genoma que codifica una cadena IgH quimérica y una cadena ligera transgénica. La cadena ligera transgénica puede ser una cadena ligera Igκ o Igλ. Además, la cadena ligera transgénica puede ser quimérica, o la cadena ligera transgénica puede comprender solo secuencias de aminoácidos no endógenas. En formas de realización particulares, la célula o animal comprende un genoma que codifica segmentos génicos de IgH, Igκ e Igλ no endógenos. Las células y mamíferos transgénicos que comprenden una cadena IgH quimérica descritos en el presente documento comprenden un dominio CH1 no endógeno que sustituye un dominio CH1 en un CH endógeno específico, por ejemplo, Cµ, Cδ o Cγ. En ciertas formas de realización, el dominio CH1 no endógeno es ortólogo a la región CH endógena. En otras formas de realización, el dominio CH1 no endógeno no es ortólogo a la región CH endógena. En otra forma de realización, más de un dominio CH1 se sustituye con un dominio CH1 no endógeno. En una forma de realización relacionada, todos los

dominios CH1 endógenos se sustituyen con un dominio CH1 no endógeno. Por ejemplo, un CH1 humano ortólogo puede sustituir cada uno de los genes Cγ endógenos (por ejemplo, CH1 de Cγ1 humano sustituye a CH1 de Cγ1 de ratón y CH1 de Cγ2 humano sustituye a CH1 de Cγ2 de ratón, etc.). En otra forma de realización, el dominio CH1 que sustituye al dominio CH1 de cada uno de los genes Cγ endógenos es un único isotipo IgG humano más frecuentemente usado en Acm terapéuticos, típicamente Cγ1, Cγ2 o Cγ4, de modo que se facilite mejor la maduración in vivo de un dominio V humano en el contexto de un dominio CH1 humano más clínicamente relevante.

Opcionalmente, las secuencias bisagra superiores de los genes C endógenos también se pueden sustituir con secuencias bisagra C no endógenas ortólogas. Alternativamente, las secuencias bisagra superior y media de los genes C endógenos también se pueden sustituir con secuencias bisagra C no endógenas ortólogas, respectivamente. Si se usan regiones bisagra medias humanas, la secuencia bisagra media de Cγ4 humana se puede manipular para que contenga una prolina en el residuo en la posición 229 más que una serina para dirigir la dimerización entre cadenas pesadas a través de enlaces disulfuro. La región bisagra inferior, una parte del dominio CH2, del gen Cγ endógeno no se sustituye para facilitar la unión óptima a un FcγR endógeno. Estas tres estrategias de manipulación opcionales proporcionan un dominio Fab de cadena pesada no endógena, dominio Fab más bisagra superior, o F(ab’)2, respectivamente. Si las regiones bisagra superiores se sustituyen con las superiores humanas, la región variable del anticuerpo resultante es más probable que retenga características óptimas tras la conversión a IgG completamente humana.

Otra forma de realización incorpora Ig completamente no endógena, por ejemplo, humana, incluyendo las regiones C que comprenden CH1-bisagra-CH2-CH3(-CH4) y los dominios de membrana e intracelular singénicos análogos, por ejemplo, de ratón, de modo que proporcionen transducción de señales intracelular nativa y que permita la asociación de la IgH en el receptor de células B con Igα e Igβ y allí permita la señalización de tipo endógeno del receptor de células B que contiene Igα, Igβ e IgG. En aún otra forma de realización, el dominio de membrana e intracelular de la región constante de la cadena pesada son del mismo isotipo de cadena pesada o singénico no análogo. Tal manipulación de los genes de la región constante se puede lograr fácilmente usando métodos de la invención como se detalla posteriormente.

En aun otra forma de realización, las células y animales transgénicos que comprenden una cadena IgH quimérica descrita en el presente documento comprenden región constante codificada por una secuencia polinucleotídica no endógena derivada de dos o más especies. Por ejemplo, se prevé un ratón transgénico que tiene un genoma que codifica una región constante de cadena IgH quimérica comprende un dominio CH1 humano, regiones bisagra superiores humanas, y dominios CH2 y CH3 de rata. En animales que tienen una región constante xenogénica, se prefiere que la región constante sea capaz de interaccionar con (por ejemplo, unirse a) un FcR endógeno.

En aún otra forma de realización, las células y animales transgénicos que comprenden una cadena IgH quimérica descrita en el presente documento comprenden región constante codificada por una secuencia polinucleotídica no endógena y una secuencia polinucleotídica endógena derivada de dos cepas. Por ejemplo, se prevé un ratón transgénico que tenga un genoma que codifica una región constante IgH quimérica comprende un dominio CH1 humano, regiones bisagra superiores humanas, y secuencias codificantes de CH2 y CH3 de ratón Balb/b embebidas en ADN genómico de C57BL/6 (“B6”), que comprende toda la información genética de B6 excepto que los exones de secuencia de Balb/c para CH2 y CH3 sustituyen sus homólogos B6.

En una forma de realización, la secuencia IgH compuesta comprende al menos 3 kb antes del promotor de VH6 hasta el complejo génico D hasta 3’ de JH6 y es toda humana y en configuración de línea germinal. En otra forma de realización, la secuencia IgH compuesta comprende al menos 3 kb antes del promotor de VH6 hasta el complejo génico D hasta 3’ de JH6 y es toda humana y en configuración de línea germinal excepto que el complejo génico D está sustituido por todo o parte del de una especie xenogénica. En otro aspecto de la invención, hay genes VH humanos adicionales antes del gen VH6 humano. En aún otro aspecto, los genes VH adicionales están en configuración de línea germinal. En un aspecto alternativo, los genes VH adicionales tienen tamaños menores de ese en el genoma humano, tamaños unidad que comprenden elementos reguladores anteriores tal como elementos reguladores en cis y sitios de unión para factores que actúan en trans, secuencias codificantes, intrones y 500 pb después del último codón de cada VH. En un aspecto, el tamaño unidad es 10 kb o menos. En otro aspecto, el tamaño unidad es 5 kb o menos. En otro aspecto, los genes VH se seleccionan del subconjunto de genes VH comúnmente compartidos entre haplotipos humanos. En otro aspecto, genes VH, genes DH y genes JH se eligen para reflejar un alelo específico tal como el alelo más prevalente en poblaciones humanas. En aun otro aspecto, los codones individuales del gen VH están optimizados para codón para expresión eficaz en un mamífero no humano específico. En otro aspecto los codones individuales están optimizados para ser un molde para hipermutación somática.

En otra forma de realización, la secuencia IgH compuesta comprende secuencia de ADN de ratón que empieza al menos 3 kb antes del promotor para el gen funcional VH más cercano al complejo génico D, por ejemplo, VH5-2, hasta 3’ de JH4 en configuración de línea germinal y en la que se han sustituido secuencias codificantes, todo o en parte, por secuencias codificantes humanas, por ejemplo, la secuencia codificante para VH5-2 de ratón se sustituye por la secuencia codificante para VH6-1 humana, las secuencias codificantes DH de ratón se sustituyen por secuencias codificantes DH humanas y las secuencias codificantes JH de ratón se sustituyen por secuencias

codificantes JH humanas. En casos en los que el número de elementos codificantes humanos supere esos en el ratón, por ejemplo, 6 secuencias codificantes JH humanas frente a 4 secuencias codificantes JH de ratón, los genes JH adicionales se pueden incluir por varios medios, por ejemplo, insertando las secuencias codificantes JH humanas adicionales con sus elementos reguladores en cis, tal como secuencias señal de recombinación después de JH4, u omitir del todo.

En otras formas de realización, las secuencias codificantes VH de ratón se sustituyen, todo o en parte, por secuencias codificantes VL humanas. En algunas formas de realización, el complejo génico DH entero es de secuencia de ratón. En otras formas de realización, el complejo génico DH entero es de especie xenogénica. En otro aspecto de la invención, hay genes VH adicionales antes de las secuencias codificantes VH6, de modo que toda la secuencia es de ratón excepto que secuencias codificantes de genes VH funcionales se sustituyen con la de genes VH humanos.

En aun otro aspecto, los genes VH adicionales están en configuración de línea germinal. En un aspecto alternativo, los genes VH adicionales tienen tamaños menores que esos en el genoma de ratón, tamaños unidad que comprenden elementos reguladores anteriores tal como elementos reguladores en cis y sitios de unión para factores que actúan en trans, secuencias codificantes, intrones y 500 pb después del último codón de cada VH. En un aspecto, el tamaño unidad es 10 kb o menos. En otro aspecto, el tamaño unidad es 5 kb o menos.

En otro aspecto, los genes VH se seleccionan de un subconjunto que se sabe es funcional, la secuencia codificante de genes VH humanos que sustituye es de un gen VH humano funcional conocido y sustituye a la secuencia codificante del gen VH de ratón de un gen VH de ratón funcional conocido. En otro aspecto, las secuencias codificantes VH humanas se seleccionan del subconjunto de genes VH comúnmente compartidos entre haplotipos humanos. En otro aspecto, las secuencias codificantes VH, las secuencias codificantes DH y las secuencias JH que sustituyen se eligen para reflejar un alelo específico tal como el alelo más prevalente en poblaciones humanas. En aún otro aspecto, todas o algunas de las secuencias codificantes VH, las secuencias codificantes DH y las secuencias JH que sustituyen son de una especie xenogénica diferente de humana. En aun otro aspecto, los codones individuales del gen VH están optimizados para codón para expresión eficaz en un mamífero no humano específico. En otro aspecto los codones individuales están optimizados para ser un molde para hipermutación somática.

En otra forma de realización, la secuencia IgH compuesta comprende además 3’ del JH más 3’ la secuencia de ratón inmediatamente posterior de JH4 de ratón hasta Eµ hasta Cµ hasta Cδ hasta inmediatamente 5’ del promotor Cγ3 de ratón todo en configuración de línea germinal con la excepción de la sustitución de los dominios CH1 de Cµ y Cδ de ratón por sus análogos humanos. En algunos casos, las regiones bisagra superiores de ratón se sustituyen por sus respectivas regiones bisagras superiores humanas. En una forma de realización adicional, los genes Cγ de ratón están configurados en configuración de línea germinal con la excepción de la sustitución de sus dominios CH1 por dominios CH1 humanos.

En algunos casos, las regiones bisagra superiores de ratón se sustituyen por regiones bisagra superiores humanas. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes Cγ3 de ratón se sustituyen por CH1 humano y dominios CH2, CH3, de membrana e intracelular de ratón de Cγ1. En otra forma de realización, la secuencia Cγ3 de ratón configurada en línea germinal completa desde el promotor anterior a la región de cambio hasta los dominios intracelulares y secuencias no traducida 3’ y sitio poli(A) se sustituyen por las secuencias correspondientes completas de Cγ1 en configuración de línea germinal sustituyendo CH1 humano a CH1 de ratón de Cγ1 para sustituir eficazmente el gen Cγ3 completo por Cγ1 quimérico. En algunas formas de realización, una secuencia codificante constante de ratón se sustituye por CH1 humano y dominios CH2, CH3, de membrana e intracelular de ratón de diferentes isotipos de regiones constantes de ratón, por ejemplo, dominios CH2, CH3 y de membrana de Cγ2a de ratón y dominio intracelular de Cµ. En aun otras formas de realización la secuencia de los dominios CH2 y CH3 se modifica adicionalmente para modular la unión a receptores de Fc, tal como unión disminuida al receptor inhibidor, FcγR2b, produciendo allí una respuesta inmunitaria secundaria más fuerte.

En otra forma de realización, la célula o animal no humano comprende un locus que codifica una cadena ligera de Ig humana que comprende una región variable Igκ humana. En una forma de realización relacionada, el locus de la cadena ligera de Ig comprende además una región constante Igκ humana. En una forma de realización la secuencia Igκ compuesta comprende secuencia de ADN de ratón desde al menos 3 kb antes del promotor del gen Vκ más proximal a Jκ1 de ratón (Vκ3-1) hasta 3’ de Jκ5 de ratón y está en configuración de línea germinal y en la que se han sustituido secuencias codificantes, todo o en parte, por secuencias codificantes humanas, por ejemplo, la secuencia codificante para Vκ3-1 de ratón está sustituida por la secuencia codificante para Vκ4-1 humana y las secuencias codificantes Jκ de ratón sustituidas por secuencias codificantes Jκ humanas. En otra forma de realización la secuencia desde Jκ5 hasta Cκ es de ratón y en configuración de línea germinal y en la que las secuencias codificantes Cκ se han sustituido, todo o en parte, por secuencias codificantes humanas.

En otro aspecto hay una región 3’LCR y un elemento RS después del gen Cκ. En un aspecto, los elementos 3’LCR y RS son de ratón y en configuración de línea germinal. En otro aspecto de la invención, hay genes Vκ adicionales

antes de las secuencias codificantes para Vκ4-1 humano, de modo que toda la secuencia es de ratón excepto que las secuencias codificantes de genes Vκ funcionales se sustituyen por la de genes Vκ humanos.

En aún otro aspecto, los genes Vκ adicionales están configuración de línea germinal. En un aspecto alternativo, los genes Vκ adicionales tienen tamaños menores que esos en el genoma de ratón, tamaños unidad que comprenden elementos reguladores anteriores tal como elementos en cis y sitios de unión para factores que actúan en trans, secuencias codificantes, intrones y 500 pb después del último codón de cada Vκ. En un aspecto, el tamaño unidad es 10 kb o menos. En otro aspecto, el tamaño unidad es 5 kb o menos. En otro aspecto, los genes Vκ se seleccionan del subconjunto de genes Vκ comúnmente compartidos entre haplotipos humanos. En otro aspecto, los genes Vκ y genes Jκ se eligen para reflejar un alelo específico tal como el alelo más prevalente en poblaciones humanas. En aun otro aspecto, los codones individuales del gen Vκ están optimizados para codón para una expresión eficaz en un mamífero no humano específico. En otro aspecto, los codones individuales están optimizados para ser un molde para hipermutación somática.

En aún otra forma de realización, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende todo o una parte de un locus de cadena ligera Igλ humana y una 3’LCR de Igλ, o un fragmento funcional de la misma. En una forma de realización, el locus de la cadena ligera Igλ humana comprende el locus Igλ humano entero. En otra forma de realización el locus de la cadena ligera Igλ humana comprende secuencias codificantes Vλ humanas y de 1 a 7 pares de secuencias codificantes Jλ-Cλ, en donde Cλ humano está sustituido con Cλ singénico. En aún otra forma de realización, el locus de la cadena ligera Igλ humana comprende secuencias codificantes Vλ humanas, de 1 a 7 pares de secuencias codificantes Jλ-Cλ, y una única secuencia codificante Cλ humana, en donde las secuencias codificantes humanas se parecen a una configuración de locus Igλ humano.

En formas de realización particulares, la 3’LCR de Igλ, o un fragmento funcional de la misma, es de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en humano, primate no humano, y rata. En una forma de realización, la 3’LCR de Igλ, o un fragmento funcional de la misma, es humana. En formas de realización particulares, la 3’LCR de Igλ, o un fragmento funcional de la misma, se une a NFκb. En una forma de realización, la 3’LCR de Igλ, o un fragmento funcional de la misma, es de ratón y se ha mutagenizado de modo que se restablezca la unión a NFκb. En otras formas de realización, la 3’LCR, o un fragmento funcional de la misma, en el locus Igλ humano, es una 3’LCR de Igκ,

o un fragmento funcional de la misma.

En una forma de realización, la secuencia de Igλ compuesta comprende al menos 3 kb antes del promotor Vλ3r hasta 3’ de Jλ7-Cλ7 y es toda humana y en configuración de línea germinal. En otro aspecto, la secuencia de Jλ7Cλ7 hasta la 3’LCR de λ es humana y en configuración de línea germinal. En otro aspecto de la invención, hay genes Vλ humanos adicionales antes de Vλ3r humano. En aun otro aspecto, los genes Vλ adicionales están en configuración de línea germinal. En un aspecto alternativo, los genes Vλ adicionales tienen tamaños menores que esos en el genoma humano, tamaños unidad que comprenden elementos reguladores anteriores tal como elementos en cis y sitios de unión para factores que actúan en trans, secuencias codificantes, intrones y 500 pb después del último codón de cada Vλ. En un aspecto, el tamaño unidad es 10 kb o menos. En otro aspecto, el tamaño unidad es 5 kb o menos. En otro aspecto, los genes Vλ se seleccionan del subconjunto de genes Vλ comúnmente compartidos entre haplotipos humanos. En otro aspecto, los genes Vλ y los genes Jλ se eligen para reflejar un alelo específico tal como el alelo más prevalente en poblaciones humanas. En aun otro aspecto, los codones individuales del gen Vλ están optimizados para codón para una expresión eficaz en un mamífero no humano específico. En otro aspecto, los codones individuales están optimizados para ser un molde para hipermutación somática.

Producción de células y animales quiméricos

Formas de realización específicas de la invención proporcionan métodos de producir los animales y células. En mamíferos que producen anticuerpos, por ejemplo, los genes V, (D) y J de Ig endógenos se sustituyen por segmentos génicos de Ig no endógenos (por ejemplo, humanos). En ciertas formas de realización, los genes V, (D) y J de (Ig) endógenos se sustituyen directamente por ortólogos no endógenos. En otras formas de realización, los genes endógenos se sustituyen funcionalmente por ortólogos no endógenos mientras que los genes endógenos se inactivan usando varias técnicas como se describe en el presente documento y se sabe en la técnica.

Por ejemplo, una o más construcciones que portan partes grandes de los genes V, D y J no endógenos pueden sustituir todo o una parte de los genes V, D y J endógenos. En ciertas formas de realización, esto se puede hacer por recombinación homóloga de las construcciones en o adyacente a cada locus. Según esto, las construcciones pueden sustituir las secuencias endógenas por sustitución secuencial (“desplazamiento”) o introduciendo dos construcciones en o adyacentes al locus Ig endógeno y posteriormente eliminando las secuencias intermedias.

Un método ejemplar de producir una célula que tiene un genoma que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, en donde la cadena pesada comprende un dominio variable no endógeno y una región constante quimérica, comprende las etapas de (1) producir una primera construcción de ADN, en donde la primera construcción comprende uno o más segmentos génicos de VH, DH y/o JH no endógenos, una primera y una segunda región flanqueante, en donde la primera región flanqueante es homóloga a una secuencia de ADN 5’ del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina endógena, y una primera secuencia de reconocimiento de

recombinación específica de sitio cerca del extremo 3’ de la primera construcción; (2) producir una segunda construcción de ADN, en donde la segunda construcción comprende uno o más segmentos génicos de región constante no endógena, una tercera y una cuarta región flanqueante, en donde la cuarta región flanqueante es homóloga a una secuencia de ADN 3’ del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena, y una segunda secuencia de reconocimiento de recombinación específica de sitio cerca del extremo 5’ de la segunda construcción;

(3) recombinar homólogamente la primera y segunda construcciones en el genoma de una célula; y (4) introducir una recombinasa específica de sitio en la célula, eliminando de esta manera una secuencia intermedia entre la primera y segunda secuencias de reconocimiento de recombinasa especifica de sitio.

Alternativamente, las construcciones se pueden introducir en células animales no humanas por transfección en células en cultivo o por microinyección pro-nuclear en huevos fertilizados, y las secuencias no endógenas se integran aleatoriamente en el genoma. Se puede realizar una inactivación funcional separada (es decir, “knock-out”) del locus endógeno por direccionamiento génico en células de mamífero en cultivo usando los métodos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento o por otros métodos tal como el uso de nucleasas con dedos de zinc manipuladas o meganucleasas.

Se puede generar una construcción que lleva todo o parte del locus IgH después de JH de modo que, en cada gen de la región constante, el dominio CH1 se sustituya con un dominio CH1 no endógeno. Esto se puede lograr por métodos conocidos en la técnica, tal como recombinación de BAC en E. coli o YAC en S. cerevisiae. Tal sustitución también se puede lograr usando sustitución con inserción de secuencias génicas dirigida por recombinación homóloga secuencial del dominio CH1 endógeno por el dominio CH1 no endógeno. Los marcadores seleccionables usados para la selección de recombinantes pueden estar flanqueados por secuencias de reconocimiento de recombinasa específica de sitio, por ejemplo, sitios loxP y delecionar a través de posterior exposición a las recombinasas específicas de sitio, por ejemplo, CRE. Usar diferentes sitios loxP variantes para flanquear el marcador seleccionable en cada etapa restringe la deleción mediada por CRE a solo la secuencia entre el sitio loxP específico y previene la deleción de mayor intervalo a un sitio loxP ya existente. Alternativamente, se puede generar una construcción que lleva todo o parte del locus IgH después de JH de modo que, en cada gen de región constante, el dominio CH1 endógeno se sustituya con un dominio CH1 no endógeno, usando la capacidad para sintetizar y ensamblar de forma precisa ADN basado en secuencias genómicas publicadas de organismos tal como seres humanos y ratones. Tal síntesis y ensamblaje se conoce en la técnica y se practica por entidades comerciales (por ejemplo, DNA2.0, Menlo Park, CA; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA).

Según un método de producir una célula que comprende una cadena pesada quimérica como se describe en el presente documento, se genera una construcción que comprende los loci de IgH endógenos después del complejo génico J, en donde cada gen C retenido comprende un CH1 no endógeno-CH2-CH3 (y CH4 para Cµ) endógenos, y exones de dominios de membrana e intracelular endógenos y se introduce en el genoma de una célula no humana. En ciertas formas de realización, la construcción se recombina homólogamente en o adyacente al locus IgH endógeno. En otras formas de realización, la construcción se integra aleatoriamente en el genoma de la célula. La construcción puede comprender además uno o más segmentos génicos V no endógenos. En una forma de realización alternativa, la construcción que comprende los segmentos génicos de la región constante se introduce en el genoma de la célula bien como una primera etapa de introducción que va seguida por sustitución de los genes V-D-J endógenos por segmentos génicos V no endógenos o en el orden opuesto, es decir, introducción de segmentos génicos V no endógenos seguido por la introducción de la construcción que comprende los segmentos génicos de la región constante generados como se describe en el presente documento.

Cuando se usa más de una construcción para introducir segmentos génicos de Ig no endógenos, el contenido del locus Ig no está restringido solo a segmentos génicos de la región constante en una construcción y segmentos génicos de la región variable en la otra. Por ejemplo, una construcción que comprende segmentos génicos C también puede comprender uno o más segmentos génicos J, segmentos génicos D y/o segmentos génicos V. De forma similar, una construcción que comprende segmentos génicos V puede comprender además uno o más segmentos génicos D, segmentos génicos J y/o segmentos génicos C.

Las construcciones que llevan los genes de la región constante se pueden generar in vitro, en E. coli o S. cerevisiae

o sintetizar in vitro antes de la introducción en células ES de modo que se delecione cualquier segmento génico no deseado o no necesario, tal como los genes Cε y Cα. Esto obligaría a los animales a hacer Cµ y Cδ para respuestas inmunitarias primarias e isotipos Cγ para respuestas inmunitarias secundarias, maduradas por afinidad, de los que típicamente se recuperarían candidatos a anticuerpos terapéuticos.

Además, las construcciones incluyen secuencias polinucleotídicas tanto codificantes como no codificantes de las que las secuencias polinucleotídicas no codificantes pueden ser secuencias polinucleotídicas no endógenas o singénicas. Por ejemplo, la región de control de locus (LCR) 3’ de IgH endógena (es decir, singénica), o una parte de la misma, se incluye después del gen CH más 3’, Eµ, o una parte de la misma se incluye entre el JH más 3’ y Cµ, y todo o una parte de las regiones Sµ y Sγ, promotores antes de segmentos génicos tal como segmentos génicos V y regiones de cambio CH y secuencias señal de recombinasas (RSS). Además, es ventajoso incluir otras regiones intergénicas que se ha hipotetizado que tienen función de regulación génica tal como la región intergénica entre el gen VH más 3’ el inicio del complejo D y la región intergénica entre Cδ y la primera región de cambio Cg. Existen

elementos correspondientes en los loci de la cadena ligera de Ig con función y localización documentadas, por ejemplo, Eκ, Igκ3’LCR y Ed. Debido a que el locus de la cadena ligera Igλ de ratón endógeno posee 3’LCR defectuosas, es ventajoso usar una 3’LCR de Igλ funcional ortóloga de otra especie, por ejemplo, humana, roedor diferente de ratón, o mutar la 3’LCR de ratón para restablecer la unión a NFκb.

Se emplean estrategias similares para el locus Igκ endógeno excepto que un gen Cκ no endógeno completo se puede incorporar en la construcción, produciendo de esta manera cadenas Igκ completamente no endógenas. Un locus Cλ no endógeno también se podría incorporar de una manera similar. Por ejemplo, se puede generar una construcción que comprende segmentos génicos Vκ y Cκ que codifica una cadena Igκ completamente humana. De forma similar, se puede generar una construcción que comprende segmentos génicos Vλ y Cλ que codifica una cadena Igλ completamente humana.

Aún otro aspecto comprende incorporar loci de Ig completamente humanos, incluyendo regiones C humanas, en lugar de los loci de Ig endógenos completos. En una forma de realización adicional, un complejo de genes FcR endógenos también se sustituye con un complejo ortólogo de genes FcR humanos usando ingeniería genética basada en BAC similar en células competentes para recombinación homóloga, tal como células ES de ratón. El complejo de genes FcγR endógenos se puede sustituir directamente en la misma célula ES en la que el locus de IgH humano o partes del mismo han sustituido el locus endógeno o en una célula ES separada. Alternativamente, el complejo de genes FcγR endógenos se puede sustituir funcionalmente en la misma célula ES en la que el locus de IgH humano o partes del mismo han sustituido el locus endógeno o en una célula ES separada. En el último caso, los ratones derivarían de dichas células ES y se cruzarían con ratones que llevan el locus (loci) de Ig manipulado de modo que se produzcan ratones que hacen anticuerpos IgG humanos que se unen a FcγR humano en lugar de genes FcγR de ratón. De cualquier manera, se producirían anticuerpos completamente humanos y durante una respuesta inmunitaria serían capaces de involucrar receptores FcR humanos normalmente. Tales animales transgénicos también tendrían el beneficio de ser útiles para ensayar la actividad y función efectora de candidatos Acm terapéuticos en modelos de enfermedad cuando se cruzan con los antecedentes genéticos apropiados para el modelo, es decir, ratones SCID, nu/nu, nod, y lpr. Además, la secuencia génica diana humana puede sustituir el gen endógeno usando tecnología de direccionamiento de BAC en células competentes para recombinación homóloga, proporcionando modelos para validación de dianas y ensayo funcional del anticuerpo. En este caso, los genes CH humanos se pueden manipular para que tengan segmentos génicos de dominios citoplásmico y/o de membrana de ratón u otras especies ortólogas para facilitar la transducción de señal nativa en la célula B. Alternativamente a sustituir el locus FcγR endógeno entero con el complemento completo de genes de tipo salvaje en el locus FcγR humano, ciertos FcγR se podrían mutar para tener función atenuada o delecionar por completo. Por ejemplo, la mutación para hacer inactivo el FcγR2b humano inhibidor y tener simultáneamente inactivación del ortólogo de ratón haría al ratón genéticamente manipulado que lleva ambas mutaciones más susceptible a desarrollar células B autorreactivas, con un consecuente beneficio potencial de ampliar la respuesta de anticuerpos completamente humanos contra antígenos.

Además, otro aspecto se refiere al diseño de la región V humana deseada. En particular, un reportorio de dominios V entero, o una parte del mismo, se puede incorporar en el genoma de la célula, o un repertorio de dominios V adaptado se puede incorporar. Por ejemplo, en ciertas formas de realización se prefiere omitir segmentos génicos del dominio V que faltan de algunos haplotipos humanos y en lugar de adaptar el repertorio de dominios V para que esté compuesto de solo los segmentos génicos V funcionales comunes a través de todos los haplotipos humanos conocidos. Hacer esto proporciona candidatos a fármacos anticuerpos con dominios V que son mejor inmunotolerados a través de todos los potenciales pacientes, previniendo de esta manera la inducción de una respuesta inmunitaria peligrosa tras la administración del anticuerpo codificado al sujeto. Uno o más segmentos génicos de dominio V se pueden incorporar en el genoma de una célula.

En ciertas formas de realización de la invención, se usan construcciones que contienen los segmentos génicos de loci de Ig deseados para incorporar la información genética en el genoma celular diana a través de recombinación homóloga. En particular, la naturaleza de manipulación con BAC en E. coli proporciona oportunidades adicionales para adaptar finamente los loci de inmunoglobulinas antes de la introducción en células competentes. Están disponibles genotecas en BAC y la secuencia completa de los loci de Ig para muchas especies. Las construcciones sintéticas también se pueden adaptar finamente como se describe en el presente documento.

La capacidad de adaptar finamente las construcciones descritas en el presente documento proporciona la capacidad para introducir componentes no endógenos y singénicos específicos. Por ejemplo, el complejo DH no endógeno se puede sustituir o suplementar con genes D de otras especies, tal como de primate no humano, conejo, rata, camélido, hámster, etc. Se pueden definir segmentos génicos D en los loci de IgH de información de secuencia o estructura genética públicamente disponible, o por ensayos usando sondas o cebadores específicos de D apropiados. Los complejos génicos D ortólogos o partes de los mismos se pueden recombinar homólogamente en las construcciones o ensamblar in silico y después sintetizar, sustituyendo o añadiendo de esta manera al complejo de segmentos génicos D no endógenos.

Debido a la diversificación significativa que se produce al hacer la región determinante de complementariedad-3 (CDR3) y porque la estructura de la región V es tal que la CDR3 es relativamente inaccesible al solvente, la

inmunogenicidad de la secuencia CDR3 produce menor preocupación. Por tanto, los aminoácidos codificados por los genes D no humanos incorporados en la CDR3 es menos probable que sean inmunógenos tras la administración a un ser humano. Los genes D derivados de otra especie podrían conferir una ventaja al producir nuevas estructuras de CDR3 que expandirían la gama de especificidades y afinidades de epítopo en un panel de anticuerpos específicos de antígeno, ampliando de esta manera la calidad de actividades mediadas por un panel de Acm.

De forma similar, el complejo génico JH, es decir, uno o más segmentos génicos JH, pueden ser de una especie no endógena diferente debido a la relativa conservación de secuencia a través de los mamíferos. El segmento génico JH puede derivar de cualquier animal, por ejemplo, humano, primate no humano, conejo, oveja, rata, hámster, camélido y ratón. En formas de realización particulares, el segmento génico JH es humano.

En aspectos adicionales, después de generar las construcciones de loci de Ig, se introducen en células de mamífero no humano y se integran aleatoriamente en el genoma. Los métodos para introducir una o más construcciones que comprenden el locus de Ig alterado, o una parte del mismo, incluyen, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, fusión de esferoplastos de E. coli, fusión de esferoplastos de levadura y microinyección, ya sea en el pronúcleo de un huevo fertilizado para hacer animales transgénicos directamente o en células cultivadas in vitro. En ciertas formas de realización, la construcción se manipula para que lleve un gen marcador seleccionable, por ejemplo, G418R, higromicinaR, puromicinaR, 5’ del gen V más 5’. Un gen marcador seleccionable también puede estar 3’ del gen V más 5’. El gen de marcador seleccionable puede estar flanqueado por secuencias de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, que, si se ponen en presencia de recombinasa, se recombinarán y delecionarán el marcador seleccionable intermedio. Esto es particularmente importante si un casete de marcador seleccionable está localizado 3’ del gen V más 5’ y cerca de una secuencia potenciadora de modo que no atenúe la función del potenciador.

En ciertas formas de realización, dos o más construcciones, tal como BAC, se introducen en la célula en una única etapa. Si dos construcciones se introducen en la célula simultáneamente, típicamente se cointegrarán. Algunas de las construcciones cointegradas se integrarán de una manera funcional cabeza a cola con, por ejemplo, segmentos V, (D) y J operativamente orientados 5’ de segmentos génicos de la región C. Las construcciones cointroducidas pueden ser cualquier combinación de BAC, YAC, plásmidos, bacteriófagos, P1, etc. En algunos casos, habrá una integración de copia única de las dos construcciones, creando un transgén de copia única. En otros casos, habrá una integración multicopia de las dos construcciones. La integración multicopia no es necesariamente indeseable ya que puede dar consecuencias beneficiosas, tal como expresión aumentada del transgén, produciendo más del producto génico deseado. Sin embargo, si se desea una copia única del transgén, hay procesos in vitro e in vivo para hacerlo así.

Por ejemplo, si se coloca una secuencia de recombinasa específica de sitio en el extremo 3’ de la construcción 5’ y si se coloca una secuencia de recombinasa específica de sitio en el extremo 5’ de la construcción 3’, los cointegrantes resultantes de la construcción 5’ y la construcción 3’ ambas orientadas de la forma 5’ a 3’ tendrán secuencias de recombinasa específica de sitio de modo que cualquier secuencia intermedia entre la construcción 5’ terminal y la construcción 3’ terminal se delecionaría tras la exposición a la recombinasa específica de sitio, y por tanto la construcción 5’ terminal se une operativamente a la construcción 3’ terminal, produciendo un transgén de copia única. Este proceso se puede realizar in vitro en células de mamífero en cultivo o in vivo en animales transgénicos que expresan la recombinasa (para ejemplo de resolver un transgén de copia única multicopia en un transgén de copia única in vivo, véase, Janssens et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2006) 103: 15130-15135). También se pueden hacer transgenes funcionales por comicroinyección pronuclear de 3 o más construcciones (véase la publicación de solicitud de patente en EE UU No. 2010/0077497).

Después de introducir el locus o loci de Ig descrito en el presente documento en el genoma de una célula para sustituir (por ejemplo, sustituir funcionalmente) un locus de Ig endógeno, o parte del mismo, se puede producir un animal no humano. Si las células de mamífero no humano son células madre embrionarias, se pueden producir mamíferos no humanos genéticamente manipulados, tal como ratones y ratas, de las células por métodos tal como microinyección de blastocistos seguido por cruce de animales quiméricos, agregación de mórula. Si las células son células somáticas, se pueden usar metodologías de clonación, tal como transferencia nuclear de células somáticas, para producir un animal transgénico. Se usa el cruce multifásico para producir animales heterocigotos o hemicigotos para loci de IgH e IgL modificados (Igκ o Igλ, o tanto Igκ como Igλ). Los ratones con loci de IgH e IgL modificados se pueden cruzar adicionalmente para producir ratones homocigotos para IgH e IgL (Igκ o Igλ, o tanto Igκ como Igλ).

Los loci de Ig manipulados descritos en el presente documento funcionarán en los animales no humanos. Usando reactivos de detección apropiados, por ejemplo, anticuerpos anti-dominio CH1 humano o anticuerpos anti-CL humano, es posible detectar los anticuerpos producidos por el locus manipulado incluso en presencia de anticuerpos expresados de un locus endógeno activo. Además, en un ratón, por ejemplo, es posible usar secuencias alotípicas en la parte de ratón de la región constante del transgén que sean diferentes de la secuencia alotípica de la región constante de la cepa de ratón receptora, por ejemplo, alotipos a de IgH de ratón (Balb/c) frente a alotipos b de IgH (C57BL/6).

Inactivación de los loci de Ig endógenos

En ciertas formas de realización, puede ser deseable inactivar funcionalmente uno o más de los loci de Ig endógenos en el mamífero no humano receptor. Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para inactivar los loci de Ig endógenos. Un animal que comprende un transgén de Ig manipulado se cruza con un animal que comprende uno o más loci endógenos inactivados para derivar un animal capaz de expresar anticuerpos del transgén de Ig y sin producción de la inmunoglobulina nativa completa de los loci endógenos inactivados con el transgén de Ig sustituyendo allí funcionalmente el locus endógeno inactivado.

La adaptación muy precisa de las secuencias de ADN combinando recombinación in silico con síntesis de ADN in vitro y tecnologías de ensamblaje permite la deleción y/o modificación precisa de las secuencias diana homólogas. Por ejemplo, se pueden alterar o delecionar secuencias señal de recombinación o secuencias donantes de ayuste para segmentos génicos específicos, por ejemplo, gen J.

Los componentes de un locus de IgH que se pueden alterar para disminuir y/o anular la función del locus incluye el complejo JH (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior) (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.939.598), Eµ, Cµ y Cδ, el complejo génico D (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior), los genes VH (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior), y todos los genes de la región constante. Colocar un promotor constitutivo fuerte tal como PGK en la posición de elementos potenciadores críticos tal como Eµ puede tener consecuencias dañinas graves en la función del locus, produciendo eficazmente la inactivación.

Componentes de un locus Igκ para disminuir y/o anular la función del locus que también se pueden alterar incluyen el complejo Jκ (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior), Eκ, Cκ y los genes Vκ (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior).

Los componentes de un locus Igλ que se pueden alterar para disminuir y/o anular la función del locus incluye el complejo Jκ (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior), Eλ, Cλ y los genes Vλ (deleción completa, eliminación de secuencias señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste o todo o parte de lo anterior). La deleción de unidades mayores tal como el locus Igλ entero, el repertorio de genes VH entero del locus de IgH, etc., se puede efectuar por inserción en serie de secuencias de recombinación específica de sitio (loxP o frt) adyacente a los extremos 5’ y 3’ de la secuencia que se va a delecionar seguido por expresión transitoria de la recombinasa relevante, por ejemplo, CRE o FLP. Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para inactivar los loci de Ig endógenos. Véase, por ejemplo: Chen J., et al. Int lmmunol. Jun 1993;5(6):647-56; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 2551-2555; Nitschke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 1887-1891; Patente en EE UU No. 5.591.669; Afshar et al., J. lmmunol. (2006) 176: 2439-2447; Perlot et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2005) 97: 14362-14367; Roes y Rajewsky

J. Exp Med. (1993) 177: 45-55; Lutz et al. Nature (1998) 393: 797-801; Ren et al. Genomics (2004) 84: 686-695; Zou et al. EMBO J. (1993) 12: 811-820; Takeda et al. EMBO J. (1993) 12: 2329-2336; Chen et al. EMBO J. (1993) 12: 821-830; Zou et al., J. lmmunol. (2003) 170: 1354-1361; Zheng et al. Molec. Cell. Biol. (2000) 20: 648-655; Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 1137-1142; Puech et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 10090-10095; LePage et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 10471-10476; Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93: 6158-6162.

En algunas formas de realización, se introducen múltiples deleciones o múltiples mutaciones en un locus de Ig endógeno para inactivar el locus de inmunoglobulina endógeno, resolviendo de esta manera el problema de inactivar parcialmente un locus de Ig endógeno. En particular, las dos o más mutaciones perjudican tanto la formación de un dominio variable funcional como la formación de una región constante capaz de dirigir el desarrollo de células B primarias. Las mutaciones perjudican el desarrollo de células B primarias porque la secuencia de Ig resultante previene la formación de una IgH capaz de mediar la transducción de señales (por si misma o en asociación con Igα y/o Igβ), por ejemplo, se bloquea la reorganización génica, la transcripción o traducción de un producto completo falla, o el producto no puede señalizar).

En un caso, los genes J, Eµ, Cµ y Cδ endógenos se delecionan. En otro caso, los genes J, Eµ, Cµ y Cδ endógenos se sustituyen todos con un casete de resistencia a fármaco que es transcripcionalmente activo en células ES y células B. Un ejemplo de un casete de resistencia a fármaco para uso en ratones es el casete de resistencia a neomicina PGK-G418 que comprende el promotor de ratón pgk-1. En conjunto, esta deleción bloquea la recombinación V-D-J (deleción de J y sustitución de Eµ por un casete de expresión activo) y señalización de receptor de células B (deleción de Cµ y Cδ) y anclaje en la membrana de células B. La inactivación de múltiples componentes produce múltiples capas de redundancia para inactivar el locus de IgH en diferentes estadios del desarrollo, creando un sistema protegido contra cualquier actividad residual que rescata el desarrollo de células B.

También se pueden realizar otras combinaciones de deleciones o mutaciones. Por ejemplo, se puede delecionar el complejo génico C entero en combinación con una deleción de JH. La deleción del complejo D entero en combinación con Cµ y Cδ también sería eficaz. Se contempla cualquier combinación de una o más mutaciones en el

presente documento siempre que las mutaciones resultantes dañen la formación de una región variable funcional y la formación de una región constante de cadena pesada anclada a la membrana capaz de transducción de señales, sea directamente o en combinación con las proteínas de transducción de señales accesorias Igα y/o Igβ.

No se necesita delecionar todo de cada módulo. Por ejemplo, se puede dejar una parte de los genes J, Eµ, Cµ o Cδ en el locus de la inmunoglobulina siempre que uno o más elementos reguladores en cis tal como secuencias de señal de recombinación (RSS), secuencias donantes de ayuste y aceptoras de ayuste, se delecionen o muten o la formación de un marco abierto de lectura funcional se obvie. Las metodologías actuales para mutar o sintetizar secuencias de ADN precisas permiten la creación de mutaciones muy específicas, incluso de un solo nucleótido, que se van a introducir. Esto proporciona el beneficio de permitir el posicionamiento óptimo de los brazos de ADN que dirigen la recombinación homóloga en células ES mientras que aun inactivan el locus.

La deleción de partes del locus de IgH se puede hacer en células usando técnicas de recombinación homóloga que ahora son estándar para ingeniería genética. Se pueden hacer deleciones en una etapa o en múltiples etapas, y se pueden generar usando una o más construcciones. Las deleciones también se podrían hacer usando sistemas de recombinasas específicos de sitio tal como Cre-lox o Flp-Frt. Se puede usar una combinación de recombinación homóloga y sistemas de recombinasas específicas de sitio. Se pueden usar otros sistemas tal como nucleasas con dedos de zinc manipuladas inyectadas en huevos fertilizados para generar deleciones en los genes, en una o más etapas para acumular el número de módulos delecionados o mutados del locus de IgH.

Se puede emplear una estrategia similar para inactivar la cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda de inmunoglobulina endógena. Los módulos importantes para inactivación están conservados, particularmente las regiones J, E (potenciador intrónico) y C, entre todos los loci de Ig. En formas de realización que se refieren a la inactivación de un locus de cadena ligera de Ig, la inactivación de la región constante prevendrá la formación de una molécula de anticuerpo completa o un dominio Fab en que la región constante de la cadena ligera es incapaz de formar un enlace disulfuro con la cadena pesada.

Por ejemplo, se puede inactivar un locus de Igκ endógeno sustituyendo los genes J, Eκ y Cκ con un único casete de resistencia a fármaco que es transcripcionalmente activo en células ES y células B, tal como el casete de resistencia a neomicina PGK-G418. En conjunto, esta deleción bloquea la recombinación V-J (deleción de J y sustitución de Eκ por un casete de expresión activo) y emparejamiento de una cadena ligera Igκ con una cadena pesada en un anticuerpo (deleción de Cκ). Se contempla cualquier combinación de una o más mutaciones en el presente documento siempre que las mutaciones resultantes dañen la formación de una región variable funcional y la formación de una región constante de cadena ligera capaz de formar un enlace disulfuro con una cadena pesada.

En otra forma de realización, todos los pares J-C del locus de Igλ 3’ del segmento génico Vλ se pueden delecionar usando un sistema de recombinasa específica de sitio, tal como Cre/loxP. La deleción de todos los genes del segmento J previene la reorganización V-J, y, por tanto, daña la formación de una región variable funcional. La deleción de los segmentos génicos Cλ previene la formación de una región constante funcional, previniendo de esta manera la formación de una región constante capaz de formar un enlace disulfuro con cualquier cadena H. En aún otra forma de realización, la inactivación de Igλ de ratón se alcanza mediante dos inactivaciones separadas. La primera inactivación es de Vλ1 y la segunda inactivación es de tanto Vλ2 como Vλx. La segunda inactivación se puede hacer antes de la primera inactivación. La inactivación se puede alcanzar mediante inactivación de RSS 5’ o 3’ de cada uno de los genes Vλ, inactivación de los promotores 5’ de cada gen, o inactivación de las secuencias codificantes. La inactivación puede ser mediante mutación, sea puntual, inserción o deleción, para hacer no funcional, o deleción completa.

El locus de Ig endógeno de una célula no humana se puede inactivar por recombinación homóloga con una o más construcciones diseñadas para introducir las deleciones o mutaciones capaces de dañar tanto la formación de un dominio variable funcional como la formación de una región constante capaz de dirigir el desarrollo de células B primarias. Los métodos para efectuar la recombinación homóloga en células ES de ratón y rata se conocen en la técnica. Tras la recombinación homóloga entre las regiones flanqueantes localizadas en la construcción y las correspondientes secuencias de ADN endógenas homólogas en la célula, las deleciones o mutaciones deseadas se incorporan en el locus de Ig endógeno.

Se pueden cribar las células que han experimentado un suceso de recombinación correcto usando marcadores de selección positiva y negativa, tal como resistencia a fármacos. Para confirmar adicionalmente la recombinación homóloga, se recupera el ADN genómico de clones aislados y se realiza análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) por una técnica tal como transferencia Southern con una sonda de ADN de los loci endógenos, dicha sonda mapea fuera de la región sustituida. El análisis de RFLP muestra diferencias alélicas entre dos alelos, el ADN endógeno y el ADN de entrada, cuando la recombinación homóloga se produce mediante la introducción un nuevo sitio de restricción en el ADN sustituyente.

Se pueden usar varios ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, ELISA y microscopía de fluorescencia, para confirmar que las mutaciones introducidas en el locus de Ig endógeno dañan la expresión de una cadena pesada o ligera de Ig funcional por la célula. Una ausencia de cadena pesada o ligera de Ig endógena indica

que su expresión está disminuida. Otros ensayos bien conocidos, tal como RT-PCR, pueden determinar si el locus modificado es capaz de ser transcrito o no.

Se pueden usar células que tienen uno o más loci de Ig inactivados para producir animales no humanos transgénicos, por ejemplo, ratones, que tienen uno o más loci de Ig inactivados. Después de añadir el locus de Ig mutado a células no humanas para delecionar o sustituir partes de los loci de Ig endógenos, se pueden producir animales no humanos genéticamente manipulados, tal como ratones, por métodos ahora estándar como microinyección de blastocistos seguido por cruce de animales quiméricos, agregación de mórula o metodologías de clonación, tal como transferencia nuclear de células somáticas.

Estrategias de cruce

Ciertas formas de realización proporcionan un método para producir un mamífero no humano que tiene un genoma que codifica segmentos génicos VH y CH1 no endógenos y un locus de cadena ligera de Ig no endógeno que comprende las etapas de cruzar un mamífero no humano que comprende un locus de cadena pesada de Ig quimérica, en donde el locus de cadena pesada de Ig comprende los segmentos génicos VH y CH1 no endógenos, con un mamífero no humano que comprende un locus de cadena ligera de Ig no endógeno; seleccionar la descendencia que tiene un genoma que comprende el locus de cadena pesada de Ig quimérica y el locus de cadena ligera de Ig no endógeno; cruzar adicionalmente la descendencia; y producir descendencia que tiene un genoma homocigoto para los loci de cadena pesada quimérica y ligera no endógena. En formas de realización relacionadas, el genoma del mamífero también codifica un segmento génico JH no endógeno.

Formas de realización adicionales comprenden seleccionar descendencia que tiene un genoma que comprende el locus de cadena pesada de Ig quimérica y el locus de cadena ligera de Ig no endógena; cruzar adicionalmente la descendencia con mamíferos no humanos que tienen loci de Ig endógenos funcionalmente inactivados; y producir descendencia y cruzar adicionalmente para producir descendencia que tiene un genoma homocigoto para loci de Ig endógenos funcionalmente inactivados, los loci de cadena pesada quimérica y ligera no endógena. En formas de realización relacionadas, el genoma del mamífero también codifica un segmento génico JH no endógeno.

Las estrategias de ingeniería genética descritas en el presente documento se pueden aplicar a la manipulación de ratones y otros animales de modo que expresen regiones V de secuencia no endógena acoplados con regiones C xenogénicas, o anticuerpos completamente no endógenos, o algún intermedio de los mismos. Para animales para los que hay una falta actual de tecnología de células ES para manipulación genética mediante microinyección de blastocistos o agregación de mórula, los loci endógenos se pueden modificar en células sensibles a varias tecnologías de clonación o reprogramación de desarrollo (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas, IPS). La frecuencia aumentada de recombinación homóloga proporcionada por la tecnología BAC proporciona la capacidad de encontrar loci doblemente sustituidos en las células, y los animales clonados derivados de las mismas serían homocigotos para la mutación, ahorrando de esta manera tiempo y costes especialmente cuando se cruzan animales grandes con tiempos de generación largos. Las sustituciones repetitivas en las células cultivadas podrían proporcionar todo el requisito de manipular en múltiples loci y después producción directa de animales usando clonación o tecnología IPS, sin cruces, para producir el genotipo apropiado. La capacidad de adaptar finamente los genes de Ig introducidos y también especificar finamente los sitios en los que se introducen proporciona la capacidad para generar mejoras que proporcionan mejor función. Los animales manipulados tal como cabras, bovinos, ovinos, equinos, conejos, llamas, perros, etc., son una fuente de anticuerpos policlonales completamente humanos.

Además, si se introducen BAC en E. coli con componentes de ADN requeridos para la función cromosómica, por ejemplo, telómeros y un centrómero, preferiblemente, pero no requerido, de la especie receptora para función óptima, por ejemplo, telómeros de ratón y un centrómero de ratón, se pueden introducir en la célula receptora por electroporación, microinyección etc., y funcionar como cromosomas artificiales. Estos cromosomas artificiales basados en BAC también se pueden usar como una base para posteriores rondas de recombinación homóloga para construir cromosomas artificiales mayores.

El locus o loci de Ig manipulado descrito en el presente documento proporcionado en vectores tal como plásmidos, BAC o YAC también se pueden usar como transgenes estándares introducidos a través de microinyección en el pronúcleo de un embrión tal como un ratón, conejo, rata o hámster. Varios BAC, YAC, plásmidos o cualquier combinación de los mismos se pueden co-microinyectar y se co-integrarán para hacer un locus funcional. Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento para inactivar los loci de Ig endógenos y los animales con un transgén de Ig manipulado cruzarse con esos con uno o más loci endógenos inactivados para derivar genotipos que expresan anticuerpos del transgén y sin la producción de inmunoglobulina nativa completa de los loci endógenos inactivados.

Anticuerpos

Un anticuerpo quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se divulga en el presente documento comprende un dominio variable no endógeno y una región constante de cadena pesada quimérica. En particular, la

región constante de la cadena pesada quimérica comprende un dominio CH1 no endógeno. En ciertas formas de realización, el anticuerpo quimérico comprende una cadena pesada quimérica y una cadena ligera no endógena. En otras formas de realización, el anticuerpo quimérico comprende una cadena pasada quimérica y una cadena ligera endógena. En una forma de realización, la región variable de la cadena pesada quimérica está codificada por secuencias polinucleotídicas derivadas de dos o más especies no endógenas.

En ciertas formas de realización, la cadena pesada quimérica comprende una región bisagra superior no endógena. En una forma de realización relacionada, la cadena pesada quimérica comprende regiones bisagra superior y media no endógenas.

Transgenes eucariotas que comprenden secuencias diseñadas in silico y hechas sintéticamente

La capacidad para obtener secuencias, para genes, loci y genomas completos, y secuencias de transcriptoma, sea de bases de datos públicas con anotaciones, o derivadas usando tecnología de secuenciación comercialmente disponible, o derivadas mediante operación comercial realizando secuenciación en una base contractual, significa que secuencias de ADN se pueden manipular fácilmente in silico, por ejemplo, separar y volver a ensamblar, dentro de genes o loci, o entre genes o loci, a través de la misma especie, diferentes cepas de una especie, o a través de dos o más especies diferentes. Hasta ahora los transgenes eucariotas, particularmente de metazoos, se han construido de ADN derivados de una fuente natural. Estos ADN de fuente natural incluyen genotecas de ADN genómico clonadas en varios vectores tal como plásmidos, bacteriófagos, P1, cósmidos, BAC, YAC y MAC y genotecas de ADNc clonadas en vectores, generalmente plásmidos o bacteriófagos. Las metodologías para recombinar los ADN portados en estos vectores y para introducir pequeñas alteraciones tal como mutaciones dirigidas se conocen bien en la técnica y se han utilizado para hacer transgenes compuestos de secuencia que en conjunto se ajusta a la secuencia del ADN parental en la genoteca de la se aislaron. En algunos casos, partes del ADN faltan de la genoteca, o una genoteca del animal deseado, cepa o haplotipo del mismo puede no estar disponible y no poderse construir usando las habilidades normales en la técnica.

Por ejemplo, puede haber variantes alélicas preferidas que se van a incluir en un transgén y dicha variante alélica no está disponible en ninguna genoteca y, además, el ácido nucleico fuente tal como ARN, o ADN puede no estar disponible. En loci complejos con muchos genes o exones y elementos reguladores en cis, puede ser técnicamente imposible obtener y recombinar en un transgén los ADN que codifican tal si son de diferentes especies y cepas o haplotipos. Por tanto, el medio por el que crear ADN de diseño complejamente generado, particularmente de un diseño completamente in silico, no es posible usando metodologías estándar.

Se han descrito medios sintéticos para crear secuencias de ADN, están comercialmente disponibles y se pueden usar para hacer secuencias de ADN basadas en un diseño completamente in silico. Sin embargo, si se pueden introducir y, en particular, expresar en eucariotas, particularmente metazoos, hasta ahora se desconoce.

Algunas de las construcciones de transgenes de Ig divulgadas en el presente documento comprenden tal composición de secuencia compleja que no se pueden generar con la precisión y exactitud deseadas por medios previamente descritos. Estructuras de transgenes contempladas adicionales incluyen un ADN configurado en línea germinal en el que se sustituyen solo secuencias codificantes, todo o parte de las mismas, por secuencias codificantes no endógenas de modo que todos las secuencias reguladores en cis son endógenas, reteniendo regulación génica completamente nativa óptima para regulación génica independiente de posición, dependiente del número de copias, específica de tejido, específica de desarrollo, por ejemplo, una secuencia IgH que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican secuencias VH, DH, JH, CH1 y bisagra superior humanas que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia de FcγR que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican FcγR humano que sustituye a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgH que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican secuencias VH, DH, JH de camélido que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgH que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican secuencias VH, JH, CH1 y bisagra superior humanas que sustituyen a sus ortólogos de ratón y secuencias codificantes de DH no de ratón no humanas, por ejemplo, de conejo, que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgH que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican VH, DH, JH, de una especie relevante a asistencia sanitaria animal, por ejemplo, canino, felino, ovino, bovino, porcino, que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgL que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican VL, JL, y opcionalmente CL, humanas que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgL que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican VL, JL, y opcionalmente CL, de camélidos que sustituyen a sus ortólogos de ratón; una secuencia IgL que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican VL, JL, y opcionalmente CL, de una especie relevante a asistencia sanitaria animal, por ejemplo, canino, felino, ovino, bovino, porcino, que sustituyen a sus ortólogos de ratón. Otros ejemplos incluyen delecionar secuencias de ADN no necesarias o indeseables, por ejemplo, genes V que son pseudogenes, genes V que producen productos que se pueden plegar mal, genes V que está ausentes de algunos haplotipos humanos, tramos grandes de ADN no regulador, genes CH no terapéuticamente importantes. Otros ejemplos incluyen alterar secuencias de ADN para optimizar la función del transgén o producir un producto deseado del mismo, por ejemplo, usar el alelo más prevalente de un gen V, reparar el potenciador 3’ de Igλ de ratón para restablecer la unión a NFκb.

Los transgenes pueden comprender partes que son sintéticas y partes que son de fuentes naturales. Los ADN para inactivar genes también pueden comprender ADN sintético, todo o en parte. Además, el método para la construcción de transgenes descrito en el presente documento no está limitado a loci de inmunoglobulinas. Se puede construir cualquier transgén mediante las etapas de primero usar métodos in silico para recombinar y ensamblar la secuencia de varias secuencias de ADN y segundo emplear métodos de ADN sintéticos disponibles para crear el ADN físico.

Métodos de producir anticuerpos

Un animal que porta el locus o loci modificado se puede inmunizar con un antígeno usando varios métodos disponibles en la técnica. Los antígenos se pueden seleccionar para el tratamiento o prevención de una enfermedad

o trastorno particular, tal como varios tipos de cáncer, enfermedad del injerto contra el huésped, enfermedades cardiovasculares y trastornos asociados, enfermedades y trastornos neurológicos, trastornos autoinmunitarios e inflamatorios, e infecciones patogénicas. En otras formas de realización, los antígenos diana se pueden seleccionar para desarrollar un anticuerpo que sería útil como un agente diagnóstico para la detección de una de las enfermedades o trastornos anteriormente mencionados.

Se pueden recuperar repertorios específicos de antígeno de animales inmunizados por tecnología de hibridoma, RT-PCR de célula única para células B seleccionadas, por tecnologías de presentación de anticuerpos, y oros métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para recuperar Acm quiméricos humanos/de ratón de hibridomas derivados de ratón, se secreta un anticuerpo V-CH1 humano-bisagra+CH2+CH3 de ratón o un anticuerpo V-CH1-bisagra superior/media humano-bisagra inferior+CH2+CH3 de ratón (dependiendo de la manipulación del locus IgH) en el sobrenadante del cultivo y se puede purificar por medios conocidos en la técnica tal como cromatografía en columna usando proteína A, proteína G, etc. El anticuerpo purificado se puede usar para ensayo y caracterización adicionales del anticuerpo para determinar la potencia in vitro e in vivo, afinidad, etc.

Además, puesto que se pueden detectar con un anticuerpo específico para la región constante endógena usada como agentes secundarios, un Acm V-CH1 (bisagra superior/media) humano-CH2-CH3 no humano puede ser útil para ensayos de inmunoquímica de tejidos humanos para evaluar la distribución y expresión en tejidos del antígeno diana. Esta característica de los anticuerpos quiméricos de la presente invención permite la confirmación de especificidad del Acm quimérico sobre Acm completamente humanos debido a los desafíos ocasionales al usar agentes de detección secundarios anti-región constante humana contra tejidos que contienen Ig humana normal y de la unión de las regiones Fc humanas a FcR humano expresado en células en algunos tejidos.

Las regiones variables no endógenas de los Acm se pueden recuperar y secuenciar por métodos estándar. Ya sea antes o después de identificar Acm candidatos de partida, los genes, ADN genómico o ADNc, para los dominios VH y VL no endógenos se pueden recuperar por varios métodos de biología molecular, tal como RT-PCR, y después añadir a ADN que codifica la parte restante de la región constante no endógena, produciendo de esta manera un Acm completamente no endógeno. Por ejemplo, se puede generar un Acm completamente humano. Los ADN que codifican el ahora VH-CH completamente no endógeno y VL-CL no endógeno se clonarían en vectores de expresión adecuados conocidos en la técnica o que se pueden hacer a medida y transfectar en células de mamífero, células de levadura tal como Pichia, oros hongos, etc., para secretar anticuerpo en el sobrenadante de cultivo. Otros métodos de producción tal como ascitis usando células de hibridoma en ratones, animales transgénicos que secretan el anticuerpo en la leche o huevos, y plantas transgénicas que hacen el anticuerpo en el fruto, raíces u hojas también se pueden usar para expresión. El anticuerpo recombinante completamente no endógeno se puede purificar por varios métodos tal como cromatografía en columna usando proteína A, proteína G, etc.

Un anticuerpo purificado se puede liofilizar para almacenamiento o formular en varias soluciones conocidas en la técnica para solubilidad y estabilidad y consistente con administración segura en animales, incluyendo seres humanos. El anticuerpo recombinante purificado se puede usar para caracterización adicional usando ensayos in vitro para eficacia, afinidad, especificidad, etc., modelos animales para eficacia, toxicología y farmacocinética, etc. Además, el anticuerpo purificado se puede administrar a seres humanos y animales no humanos para fines clínicos tal como terapias y diagnóstico para enfermedad.

Se pueden aislar varios fragmentos de los Acm V-CH1-(bisagra superior/media) no endógeno-CH2-CH3 endógeno por métodos que incluyen corte enzimático, tecnologías recombinantes, etc., para varios fines incluyendo reactivos, diagnóstico y terapéutico. El ADNc para el repertorio de dominios variables + CH1 no endógeno o solo los dominios variables no endógenos se puede aislar de los mamíferos no humanos manipulados descritos anteriormente, específicamente de ARN de órganos linfoides secundarios tal como bazo y ganglios linfáticos, y los ADNc de VH y VL implementar en varios sistemas de presentación de anticuerpos tal como fagos, ribosomas, E. coli, levadura, mamíferos, etc. Los mamíferos transgénicos pueden ser inmunológicamente no sometidos a experimentación u óptimamente se pueden inmunizar contra el antígeno de elección. Usando los cebadores de PCR apropiados, tal como 5’ en la región líder o marco 1 del dominio variable y 3’ en el CH1 humano de los genes Cγ, las regiones V somáticamente maduradas se pueden recuperar para presentar solamente el repertorio madurado por afinidad. Los anticuerpos presentados se pueden seleccionar contra el antígeno diana para recuperar eficazmente Fv o Fab específicos de antígeno de alta afinidad, y carecen de dominios CH2-CH3 endógenos que estarían presentes si los Acm se recuperaran directamente de los mamíferos. Además, no es necesario que los animales que portan el

transgén de IgH e IgL se inactiven funcionalmente para los loci de Ig endógenos. Los animales heterocigotos para los loci de IgH e IgL, o los animales que portan los transgenes de IgH e IgL y son heterocigotos para los loci de IgH e IgL inactivados, que producen los anticuerpo quiméricos descritos en el presente documento, así como tanto anticuerpos completamente endógenos (por ejemplo, anticuerpo de ratón) como anticuerpos endógenos y no endógenos mezclados (por ejemplo, anticuerpos humanos-de ratón), también se pueden usar para generar Acm V no endógeno-C endógeno específicos de antígeno (por ejemplo, Acm V humano-C de ratón). Los animales que portan solo un transgén de Ig, por ejemplo, IgH, se podrían usar como una fuente de dominios VH (VH-CH1) no endógenos (por ejemplo, humanos) y otros animales que portan solo un transgén de Ig diferente, por ejemplo, IgL, ya sea Igκ o Igλ, se podrían usar como fuente de dominios VL (VL-CL) no endógenos (por ejemplo, humanos) y después las secuencias VH-CH1 y VL-CL combinarse en una genoteca de presentación de anticuerpos para presentar anticuerpos completamente humanos. En tales animales, ambos, uno o ninguno de los loci de Ig endógenos pueden estar activados. Los animales se pueden inmunizar de modo que se permita la recuperación de VH y VL madurados por afinidad. Por ejemplo, una genoteca de presentación de anticuerpos de dos ratones separados – uno con VH-CH1 humano-CH2-CH3 de ratón y el otro con VκCκ humano – se podrían usar para recuperar anticuerpos completamente humanos usando técnicas bien establecidas en biología molecular.

Métodos de uso

Los anticuerpos purificados divulgados en el presente documento se pueden administrar a un sujeto para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno particular, tal como varios tipos de cáncer, enfermedad del injerto contra el huésped, enfermedades cardiovasculares y trastornos asociados, enfermedades y trastornos neurológicos, trastornos autoinmunitarios e inflamatorios, alergias e infecciones patogénicas. En formas de realización preferidas, el sujeto es un ser humano.

Se administran composiciones de anticuerpos a sujetos a concentraciones desde aproximadamente 0,1 a 100 mg/ml, preferiblemente desde aproximadamente 1 a 10 mg/ml. Se puede administrar una composición de anticuerpos por vía tópica, intranasal o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraocular o subcutánea. Un modo de administración preferido es inyección. La administración de puede producir en una única inyección o una infusión a lo largo del tiempo, es decir, de aproximadamente 10 minutos a 24 horas, preferiblemente de 30 minutos a aproximadamente 6 horas. Se puede administrar una dosis eficaz una vez o mediante una serie de inyecciones. Se pueden administrar dosis repetidas dos veces al día, una vez al día, una vez a la semana, bisemanalmente, trisemanalmente, una vez al mes, o una vez cada tres meses dependiendo de la farmacocinética, farmacodinámica e indicaciones clínicas. La terapia puede seguir durante periodos de tiempo extendidos, incluso en ausencia de cualquier síntoma.

Una composición de anticuerpo purificado puede comprender anticuerpos policlonales o monoclonales. Una composición de anticuerpo puede contener anticuerpos de múltiples isotipos o anticuerpos de un único isotipo. Una composición de anticuerpos puede contener anticuerpos quiméricos sin modificar, o los anticuerpos se pueden haber modificado de alguna manera, por ejemplo, química o enzimáticamente. Una composición de anticuerpos puede contener anticuerpos humanos sin modificar o los anticuerpos humanos se pueden haber modificado de alguna manera, por ejemplo, química o enzimáticamente. Por tanto, una composición de anticuerpos puede contener moléculas de Ig intactas o fragmentos de las mismas, es decir, dominios Fab, F(ab’)2, o Fc.

La administración de una composición de anticuerpos contra un agente infeccioso, sola o en combinación con otro agente terapéutico, produce la eliminación del agente infeccioso del sujeto. La administración de una composición de anticuerpos reduce el número de organismos infecciosos presentes en el sujeto de 10 a 100 veces y preferiblemente 1.000 veces, y más de 1.000 veces.

De forma similar, la administración de una composición de anticuerpos contra células cancerosas, sola o en combinación con otro agente quimioterapéutico, produce la eliminación de células cancerosas del sujeto. La administración de una composición de anticuerpos reduce el número de células cancerosas presentes en el sujeto de 10 a 100 veces y preferiblemente 1.000 veces, y más de 1.000 veces.

En ciertos aspectos, un anticuerpo también se puede utilizar para que se una a y neutralice moléculas antigénicas, sean solubles o unidas a la superficie celular. Tal neutralización puede aumentar la depuración de la molécula antigénica de la circulación. Las moléculas antigénicas diana para neutralización incluyen, pero no están limitadas a, toxinas, moléculas endocrinas, citoquinas, quimioquinas, proteínas del complemento, bacterias, virus, hongos, y parásito. Tal anticuerpo se puede administrar solo o en combinación con otros agentes terapéuticos incluyendo otros anticuerpos, otros fármacos biológicos, o agentes químicos.

También se contempla que un anticuerpo se pueda usar para aumentar o inhibir la señalización de receptores de superficie celular. Un anticuerpo específico para un receptor de superficie celular se puede utilizar como un agente terapéutico o herramienta de investigación. Los ejemplos de receptores de superficie celular incluyen, pero no están limitados a, receptores de células inmunitarias, receptores de adenosina, receptores adrenérgicos, receptores de angiotensina, receptores de dopamina y serotonina, receptores de quimioquinas, receptores de citoquinas,

receptores de histamina, etc. Tal anticuerpo se puede administrar solo o en combinación con otros agentes terapéuticos incluyendo otros anticuerpos, otros fármacos biológicos, o agentes químicos.

También se contempla que un anticuerpo se pueda modificar adicionalmente para aumentar el potencial terapéutico. Las modificaciones pueden incluir conjugación directa y/o indirecta a sustancias químicas, tal como agentes quimioterapéuticos, ARNip, ARN bicatenarios, etc. Otras modificaciones pueden incluir regiones Fc manipuladas para citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada o disminuida, citotoxicidad celular dependiente del complemento aumentada o disminuida, o semivida circulante aumentada o disminuida.

En otras formas de realización, se puede usar un anticuerpo como un agente diagnóstico para la detección de una de las enfermedades o trastornos anteriores. Se puede detectar un anticuerpo quimérico usando un agente de detección secundario que reconozca una parte del anticuerpo, tal como un dominio Fc o Fab. En el caso de la región constante, la parte reconocida puede ser un dominio CH1, CH2 o CH3. El dominio Cκ y Cλ también pueden ser reconocidos para detección. Los ensayos inmunohistoquímicos, tal como evaluar la distribución tisular del antígeno diana, pueden aprovechar la naturaleza quimérica de un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, cuando se evalúa una muestra de tejido humano, el reactivo agente de detección secundario reconoce la parte no humana de la molécula de Ig, reduciendo de esta manera el fondo o unión no específica a moléculas de Ig humanas que pueden estar presentes en la muestra de tejido.

Composiciones farmacéuticas y kits

También se divulgan en el presente documento composiciones farmacéuticas y métodos de uso. Las composiciones farmacéuticas incluyen un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en un soporte farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar in vivo para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden incluir uno o más agentes para uso en combinación, o se pueden administrar junto con uno o más agentes.

También se divulgan kits que se refieren a cualquiera de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o métodos descritos en el presente documento. Se pueden usar kits para métodos diagnósticos o de tratamiento. Un kit puede proporcionar además instrucciones para el uso de una composición o anticuerpo y embalaje.

Un kit puede incluir dispositivos, reactivos, envases u otros componentes. Además, un kit también requiere el uso de un aparato, instrumento o dispositivo, incluyendo un ordenador.

Ejemplos

Se proporcionan los siguientes ejemplos como ilustraciones adicionales y no limitaciones de la presente invención. Las enseñanzas de todas las referencias, patentes y solicitudes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como las figuras se incorporan al presente documento mediante referencia.

Ejemplo 1

Construcción de BAC C5P12

Un vector BAC se basa en el factor F encontrado en E. coli. El factor F y el vector BAC derivado de él se mantienen como plásmidos de baja copia, generalmente encontrados como una o dos copias por célula dependiendo de su ciclo vital. Tanto el factor F como el vector BAC muestran el fenotipo fl+, que excluye una copia adicional del plásmido en la célula. Mediante este mecanismo, cuando E. coli ya porta y mantiene un BAC, y después se introduce un BAC adicional en la E. coli, la célula mantiene solo un BAC, ya sea el BAC previamente existente en la célula o el BAC externo recién introducido. Esta característica es extremadamente útil para aislar selectivamente BAC homólogamente recombinados como se describe a continuación.

La recombinación homóloga en E. coli requiere el producto génico RecA funcional. En este ejemplo, el gen RecA tenía una mutación sensible a temperatura (recAts) de modo que la proteína RecA era solo funcional cuando la temperatura de incubación estaba por debajo de 37ºC. Cuando la temperatura de incubación estaba por encima de 37ºC, la proteína RecA era no funcional o tenía actividad de recombinación muy reducida. Esta recombinación sensible a la temperatura permitía la manipulación de la función de RecA en E. coli de modo que se activa la recombinación homóloga condicional solo cuando se deseaba. También es posible obtener, seleccionar o manipular mutaciones sensibles al frío de la proteína RecA de modo que la proteína solo es funcional por encima de una cierta temperatura, por ejemplo, 37ºC. En este estado, se haría crecer E. coli a menor temperatura, aunque con un tiempo de generación más lento, y la recombinación se desencadenaría incubando por encima de 37ºC durante un periodo de tiempo corto para permitir solo un intervalo de recombinación corto.

La recombinación homóloga en E. coli se llevó a cabo proporcionando sustratos de ADN solapantes que se encuentran en dos BAC circulares. BAC P12 (genoteca de BAC de Instituto de Tecnología de California) tenía 182 kb de tamaño total de los que 172 kb eran un inserto de ADN genómico humano que comprendía genes Vκ humanos (de IGKV1-5 a IGKV1-12, figura 1). BAC P12 estaba portado por el vector pBeloBAC2 que tenía un gen de resistencia a zeocina ZeoR. BAC C5 (genoteca de BAC de Instituto de Tecnología de California) portaba un casete transposón de resistencia a kanamicina (kanR) para selección en E. coli, KAN-2 (Epicentre Biotecnologies). BAC C5 tenía 225 kb de tamaño total de los que 218 kb era un inserto de ADN genómico humano que comprendía genes Vκ humanos (de IGKV4-1 a IGKV1-6), el complejo Jκ, Cκ y elementos reguladores 3’. Los BAC C5 y P12 portaban 70 kb de homología en el inserto de ADN. BAC C5 estaba portado en E. coli recAts.

Se electroporó ADN de BAC P12 purificado en E. coli recAts que portaba BAC C5. Las células se incubaron a 30ºC, la temperatura permisiva para actividad recAts, durante 30 minutos. Se seleccionaron E. coli que portaban recombinantes homólogos de los dos BAC (kanRzeoR) sembrando en placas de medio LB bajo en sal selectivo (Invitrogen) que contenía zeocina (50 µg/ml) y kanamicina (25 µg/ml) y se incubaron a 40ºC, una temperatura no permisiva para la actividad recAts. Los recombinantes homólogos en la homología de 70 kb compartida entre C5 y P12 produjeron un único BAC de 407 kb de tamaño total, de los que 320 kb representan los insertos recombinados de C5 y P12 (Fig. 1). Como se esperaba, el suceso de recombinación homóloga creó una duplicación del solapamiento de 70 kb, una de cuyas copias estaba situada entre las copias repetidas de las secuencias del vector pBeloBAC y la otra copia ahora uniendo los dos fragmentos de ADN humano el locus de Igκ en un segmento contiguo (Fig. 1). Las colonias de E. coli que crecieron en las placas de doble selección mostraron kanRzeoR, se recogieron y el ADN del BAC se aisló por miniprep. El ADN de BAC se digirió con NotI y se corrió en geles de campo pulsado. Los clones mostraron el patrón de bandas esperado (Figura 2, mapa de BAC a la izquierda y foto de gel a la izquierda).

La repetición de 70 kb entre las dos copias del vector pBeloBAC se cortó usando recombinasa CRE que actúa en los dos sitios loxP que existen en pBeloBAC (Fig. 2). El ADN de BAC (C5+P12) purificado se trató con recombinasa CRE (New England Biolabs) in vitro según las condiciones recomendadas por el fabricante. El ADN tratado se introdujo en una cepa de E. coli deficiente en RecA (recA-) mediante electroporación y las bacterias resultantes se sembraron en placas que contenían cloranfenicol (Cm) y se incubaron a 37ºC. Todos los vectores pBeloBAC portan el gen CmR. El BAC resuelto había perdido la duplicación del solapamiento de 70 kb y la secuencia para pBeloBAC vector 2 (Fig. 2, mapa de BAC a mano derecha). El BAC correctamente resuelto perdió ambos marcadores ZeoR y KmR.

Las colonias de E. coli que crecieron en placas mostraron CmR, se cogieron y se aisló el ADN de BAC por miniprep. El ADN de BAC se digirió con NotI y se corrió en geles de campo pulsado. Los clones mostraron el patrón de bandas esperado (Fig. 2, mapa de BAC a la derecha y foto de gel a la derecha). El BAC resuelto (C5P12) tenía 327 kb de tamaño total de los que 320 kb es ADN genómico humano de, en orden 5’ a 3’, Vκ1-12 hasta las regiones reguladoras en cis 3’, incluyendo 8 genes Vκ funcionales, el complejo Jκ entero y Cκ. Para hacer BAC (véase, C5P12C20 en el ejemplo 2), se insertó Tpn-Zeo a 15 kb de la unión del vector (Fig. 3). Tpn-Zeo se construyó insertando el gen ZeoR en el vector de construcción de transposón (Epicentre Biotecnologies), plásmido pMOD-3<R6Kγori/MCS>.

Ejemplo 2

Construcción de un BAC de 489 kb que comprende la mayoría del locus Igκ humano

La recombinación homóloga en E. coli se llevó a cabo proporcionando sustratos de ADN solapantes que se encuentran en dos BAC circulares. BAC C20 (genoteca de BAC de Instituto de Tecnología de California) tenía 218 kb de tamaño total de los cuales 206 kb era un inserto de ADN genómico humano que comprende genes Vκ. BAC C20 portaba el casete de transposón de resistencia a kanamicina KAN-2 (kanR) para selección en E. coli. BAC C5P12 hecho en el ejemplo 1 llevaba un casete de transposón de resistencia a zeocina (zeoR) para selección en E. coli. C20 y C5P12 llevaban 44 kb de homología nativa en el ADN del inserto. BAC C5P12 se portaba en E. coli recAts.

Se electroporó ADN de BAC C20 purificado en E. coli recAts que portaba BAC C5P12. Las células se incubaron a 30ºC, la temperatura permisiva para actividad recAts, durante 30 minutos. El fenotipo fi+ conferido por el vector pBeloBAC prohibía el mantenimiento de más de un BAC en la célula, dando una población de E. coli que llevaba solo C20 (kanRzeoS), solo C5P12 (kanSzeoR), recombinantes entre los dos BAC (kanRzeoR) o sin BAC (kanSzeoS). Se seleccionaron E. coli que llevaba recombinantes homólogos de los dos BAC sembrando en placas de LB bajo en sal selectivo (Invitrogen) que contenía zeocina (50 µg/ml) y kanamicina (25 µg/ml) y se incubaron a 40ºC, una temperatura no permisiva para la actividad recAts.

Los recombinantes homólogos en la homología de 44 kb compartida entre C20 y C5P12 produjeron un único BAC de 545 kb de tamaño total (“C”), de los que 482 kb representan los insertos recombinados de C20 y C5P12 (véase, la figura 4). Como se esperaba, el suceso de recombinación homóloga creó una duplicación del solapamiento de 44

kb, una de cuyas copias estaba situada entre las copias repetidas de las secuencias del vector pBeloBAC y la otra copia ahora uniendo los dos fragmentos de ADN humano el locus de Igκ en un segmento contiguo (Fig. 4).

Las colonias de E. coli que crecieron en las placas de doble selección mostraron kanRzeoR, se recogieron y el ADN del BAC se aisló por miniprep. El ADN de BAC se digirió con NotI y se corrió en geles de campo pulsado. Los clones mostraron el patrón de bandas esperado (Figura 5, mapa de BAC a la izquierda y foto de gel a la izquierda).

La repetición de 44 kb entre las dos copias del vector pBeloBAC se cortó usando recombinasa CRE que actúa en los dos sitios loxP que existen en pBeloBAC (Fig. 5). El ADN de BAC C purificado se trató con recombinasa CRE (New England Biolabs) in vitro según las condiciones recomendadas por el fabricante. El ADN tratado se introdujo en una cepa de E. coli deficiente en RecA (recA-) mediante electroporación y las bacterias resultantes se sembraron en placas de doble selección zeocina/kanamicina y se incubaron a 37ºC.

El BAC resuelto había perdido la duplicación del solapamiento de 44 kb y la secuencia para pBeloBAC vector 3 (Fig. 5, mapa de BAC a mano derecha). Las colonias de E. coli que crecieron en las placas de doble selección mostraron KmRzeoR, se cogieron y se aisló el ADN de BAC por miniprep. El ADN de BAC se digirió con NotI y se corrió en geles de campo pulsado. Los clones mostraron el patrón de bandas esperado (Fig. 5, mapa de BAC a la derecha y foto de gel a la derecha). El BAC resuelto tenía 489 kb de tamaño total de los que 467 kb es ADN genómico humano de, en orden 5’ a 3’, Vκ2-30 hasta las regiones reguladoras cis 3’, incluyendo 16 genes Vκ funcionales, el complejo Jκ entero y Cκ.

Ejemplo 3

Ensamblaje in silico de la secuencia de un transgén de la cadena ligera lambda de Ig humana sintética de 194 kb funcional

La secuencia anotada completa del locus de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana (Igλ) está disponible. Por ejemplo, véase el número de acceso de GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) NG_000002. Hay disponible información detallada adicional, incluyendo referencias científicas bibliográficas de apoyo en varios sitios web de dominio público incluyendo Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) e IMGT (http://imgt.cines.fr/). Esta información incluye datos para el contenido genético y fenotípico del locus Igλ humano, por ejemplo, incluyendo, pero no limitado a, identificación de secuencias génicas expresadas, pseudogenes, variantes alélicas, y genes que pueden codificar dominios propensos a mal plegamiento.

Usando tal información pública, es posible ensamblar secuencias de ADN in silico usando software comúnmente disponible para manipulación de secuencias de ADN (por ejemplo, MacVector, DNASIS) que codifican un locus ligero Igλ humano que comprende solo genes Vλ humanos expresados en unión operativa con desde uno a los 7 pares Jλ-Cλ y el potenciador 3’ de Igλ humano funcional entero (3’ E). Los elementos reguladores en cis que controlan la expresión génica de Vλ se pueden capturar en tan poco como 500 pb de ADN inmediatamente 5’ del inicio de la región 5’ no traducida (UTR) y 500 pb o menos de ADN inmediatamente 3’ a la secuencia de señal de recombinación (RSS) inmediatamente 3’ del final de la secuencia codificante de cada gen Vλ. Preferiblemente, se puede usar una región más larga de ADN 5’ del inicio de la 5’ UTR para aumentar la distancia entre segmentos génicos V y para capturar por completo cualquier elemento regulador en cis.

Además, la región entre el más 3’ de los genes Vλ humanos (V3-1) y Jλ1-Cλ1, el primer par Jλ-Cλ, y hasta el 3’ E se captura en configuración de línea germinal. Alternativamente, la distancia de la secuencia entre Vλ3-1 y Jλ1-Cλ1 y/o la distancia entre Jλ7-Cλ7, el último par Jλ-Cλ en el locus humano, y el 3’ E puede estar truncada. Las distancias específicas no son tan importantes como la captura de los elementos codificantes deseados y elementos reguladores en cis críticos incluyendo aceptores de ayuste y donantes de ayuste, RSS, promotor intrónico y potenciador 3’, preferiblemente los 3 sitios hipersensibles a DNasaI. Además, los pseudogenes de Igλ humanos, Jλ4-Cλ4, Jλ5-Cλ5 y/o Jλ6-Cλ6 se pueden excluir de la secuencia ensamblada in silico. Hay un requisito de mínimo para un par Jλ-Cλ funcional, sea Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 o Jλ7-Cλ7.

Se pueden introducir sitios de enzimas de restricción específicos al final de la secuencia. También se pueden introducir o delecionar sitios de enzimas de restricción específicos internamente mediante inserción, deleción o modificación de secuencia siempre que no perturben la expresión génica o codificación. Estos sitios de enzimas pueden incluir secuencias útiles para ensamblar la secuencia sintetizada in vitro, cortar el ADN del vector o para varias metodologías de cribado, tal como transferencia Southern de gel de agarosa usando electroforesis estándar, electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE), y electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

Las secuencias insertadas también pueden incluir sitios de unión a cebadores para facilitar métodos de cribado basados en PCR incluyendo qPCR, para la integración deseada e intacta en el genoma. Opcionalmente, se introducen un sitio(s) de recombinasa específica de sitio tal como loxP o cualquiera de sus variantes o frt para facilitar la deleción de las secuencias intermedias para hacer un transgén de copia única, para facilitar la introducción de ADN adicional a través de recombinación específica, o para facilitar otros diseños de ingeniería genética conocidos en la técnica. También pueden estar opcionalmente incluidas secuencias para casetes de

selección de fármacos para células de mamíferos tal como un marcador de selección positiva para resistencia a un fármaco tal como higromicina o un casete de selección negativa tal como timidina quinasa.

Usando la estrategia esbozada anteriormente, se ensambló un núcleo de secuencia de 191 kilobases (“Lambda Prime”) in silico, que comprende 29 genes Vλ humanos funcionales en aproximadamente unidades de ~5 kb, los 7 pares Jλ-Cλ humanos y el potenciador del locus Igλ 3’ humano, con la secuencia de 57 kilobases entre Vλ3-1 y el potenciador 3’ humano en configuración de línea germinal. Se documentó que los 29 genes Vλ humanos elegidos se expresaban en seres humanos y estaban presentes en todos los haplotipos humanos conocidos determinado por investigación de la bibliografía científica. Se eligieron secuencias para los alelos más comúnmente usados que codifican regiones variables que se pliegan apropiadamente.

En casos en los que dos genes Vλ funcionales se colocaron en proximidad de menos de 5 kb de distancia en la configuración de línea germinal humana, se usó la secuencia entera que comprende los dos genes Vλ, desde aproximadamente 4 kb 5’ de la 5’ UTR del gen más 5’ y aproximadamente 500 pb 3’ de la RSS del gen Vλ más 3’. Las regiones codificante y no codificante de la secuencia eran suficientes para dirigir la regulación y expresión de desarrollo apropiadas y para generar diversidad de cadenas ligaras Igλ humanas una vez introducida en el genoma de ratón.

Una secuencia para un casete de expresión de resistencia a higromicina se insertó 5’ del casete Vλ más 5’. Para facilidad de escisión del vector BAC y para confirmar la integración intacta, se insertaron enzimas de restricción de corte raro en la secuencia, en el extremo 5’, secuencias de reconocimiento para StuI/EcoRV/AsisSI/PvuI y sitios AgeI/PacI/AseI/BsaBI 5’ y 3’ del casete hygR, respectivamente, y en el extremo 3’ después del potenciador 3’, se insertaron secuencias de reconocimiento para AsiSi, AleI, EcoRI Bsa BI.

Ejemplo 4

Ensamblaje in silico de la secuencia de dos transgenes de la cadena ligera lambda de Ig humana sintética derivada de la secuencia de Lambda Prime de Ig

Usando la secuencia Lambda Prime descrita en el ejemplo 3, se diseñaron dos transgenes adicionales. Se ensambló una secuencia núcleo de 94 kilobases (“Lambda 3”) in silico, que comprende 8 genes Vλ humanos funcionales en aproximadamente unidades de ~5 kb, los 7 pares Jλ-Cλ humanos y el potenciador del locus Igλ 3’ humano, con la secuencia de 57 kilobases entre Vλ3-1 y el potenciador 3’ humano en configuración de línea germinal. Se documento que los 8 genes Vλ humanos elegidos se expresaban en seres humanos. Se eligieron secuencias para los alelos más comúnmente usados que codifican regiones variables que se pliegan apropiadamente. Las regiones codificantes y no codificantes de la secuencia eran suficientes para dirigir la regulación y expresión de desarrollo apropiadas y para generar diversidad de cadenas ligeras Igλ humanas una vez introducida en el genoma de ratón. Se insertó un sitio frt 5’ del casete Vλ más 5’. Para facilidad de escisión del vector BAC y para confirmar la integración intacta, se insertaron enzimas de restricción de corte raro en la secuencia, en el extremo 5’, se insertaron secuencias de reconocimiento para sitios ApaLI/AvrII/EcoRI 5’ del primer sitio frt y una secuencia de reconocimiento para FseI se insertó 3’ del primer sitio frt, en el extremo 3’, se retuvieron las secuencias de reconocimiento para AsiSi, AleI, EcoRI Bsa BI descritas en el ejemplo 3.

Usando la secuencia Lambda Prime descrita en el ejemplo 3, se ensambló una secuencia (“Lambda 5”) in silico, que comprende 21 genes Vλ humanos con expresión y funcionalidad demostrada, y sin alelos o variación haplotípica no funcionales conocida a través de seres humanos individuales. Los casetes Vλ tenían en general aproximadamente 5 kb, de tamaño. Las regiones codificantes y no codificantes de la secuencia eran suficientes para dirigir la regulación y expresión de desarrollo apropiadas y para generar diversidad de cadenas ligaras Igλ humanas una vez introducida en el genoma de ratón en unión operativa con cualquier construcción de ADN que comprende al menos un par Jλ-Cλ funcional y preferiblemente un 3’ E funcional. Se eligieron secuencias para los alelos más comúnmente usados que codifican regiones variables que se pliegan apropiadamente.

Se retuvo una secuencia para un casete de expresión de resistencia a higromicina 5’ del casete Vλ más 5’ como se describe en el ejemplo 3. Se insertó la secuencia de un sitio frt 3’ del casete Vλ más 3’. Para facilidad de escisión del vector BAC y para confirmar la integración intacta, se insertaron enzimas de restricción de corte raro en la secuencia, sitios StuI/EcoRV/AsisSI/PvuI 5’ del casete hygR, y sitios AgeI/PacI/AseI/BsaBI 3’ del casete hygR, como se describe en el ejemplo 3, y sitios FseI/PvuI 5’ del sitio frt y sitios KpnI/NheI 3’ del sitio frt.

Ejemplo 5

Síntesis y ensamblaje de ADN que comprenden los transgenes lambda 3 y lambda 5

Se portan ADN de más de aproximadamente 30-40 kb de tamaño en BAC. El ejemplo 2 documenta la creación de un BAC de 545 kb de tamaño. Además, se pueden usar otros vectores de clonación capaces de portar trozos grandes de ADN tal como YAC, PAC, MAC. La ingeniería genética y la recuperación física de ADN grandes en todos estos vectores está bien documentada en la bibliografía.

Proveedores de servicio por contrato sintetizan y ensamblan trozos de ADN muy grandes. La secuencia de ADN de lambda 3 se transmitió a DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA). La secuencia se sintetizó en ADN físico y se ensambló. La secuencia final completamente ensamblada se portó en un BAC con pBeloBAC como el esqueleto del vector. El BAC completo fue secuenciado por SeqWright, Inc. (Houston, TX) usando tecnología de secuenciación 454 (454 Life Sciences, Roche). La secuencia del ADN de lambda 3 sintético se confirmó frente a la secuencia de referencia. Seis desviaciones de secuencia de la secuencia in silico eran probablemente errores de lectura de secuenciación 454 debido a secuencias homopoliméricas o dipoliméricas largas. Las desviaciones, incluso aunque muy probablemente no mutaciones en al ADN sintético físico real, mapeaban a regiones no codificantes, no reguladoras.

La secuencia de ADN de lambda 5 se transmitió a DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA). La secuencia se sintetizó y ensambló. La secuencia final completamente ensamblada se portó en un BAC con pBeloBAC como el esqueleto del vector. El BAC completo fue secuenciado por SeqWright, Inc. (Houston, TX) usando tecnología de secuenciación 454 (454 Life Sciences, Roche). La secuencia del ADN de lambda 5 sintético se confirmó frente a la secuencia de referencia. Se encontraron desviaciones mínimas de la secuencia in silico. Cualquier desviación era probablemente errores de lectura de secuenciación 454 debido a secuencias homopoliméricas o dipoliméricas largas. Las desviaciones, incluso aunque muy probablemente no mutaciones en al ADN sintético físico real, mapeaban a regiones no codificantes, no reguladoras.

Ejemplo 6

Generación de ratones transgénicos que portan el transgén sintético lambda 3

Se digirió el BAC lambda 3 con FseI y AsiSI y el inserto lambda 3 humano sintético se purificó de la secuencia del vector por electroforesis en gel en campo pulsado. La banda del gel de 94 kb que contenía la secuencia lambda 3 se cortó del gel y se purificó del gel. El ADN purificado, concentrado se microinyectó en el pronúcleo de huevos de ratón fertilizados. De los 758 embriones transferidos, nacieron 138 ratones vivos. Se usaron ensayos de PCR para detectar la secuencia de Igλ humana que comprendían los extremos 5’ y 3’ y en el medio del transgén lambda 3 para cribar los ADN aislados de tejido de la cola de crías de ratón para cribar para la presencia del ADN en el 5’, 3’ y el medio del transgén lambda 3. Se confirmó que veinticuatro crías de ratón eran positivas para los tres productos de PCR. Se realizó ELISA específico para Igλ humana en muestras de suero de los ratones fundadores. Se encontró que veinte ratones fundadores independientes tenían niveles circulantes significativos de Igλ humana en suero, confirmando la función del transgén lambda 3. Los ratones fundadores se cruzaron para producir descendencia transgénica.

Ejemplo 7

Expresión de una diversidad de cadenas ligeras lambda de Ig humana del transgén lambda 3 humano sintético en ratones

Se confirmó que muestras de suero de la descendencia transgénica de los ratones fundadores tenían el transgén lambda 3 intacto y expresado como se describe en el ejemplo 6.

Se saca sangre de ratones transgénicos lambda 3 y se recoge en tubos heparinizados. Se separan los linfocitos y se concentran mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Lympholyte M. Los linfocitos se tratan con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra un marcador de células B de ratón, por ejemplo, B220 o CD19, y un anticuerpo específico para Igλ humana. Se detectan células B de ratón que expresan cadenas ligeras Igλ humanas en su superficie por FACS. El porcentaje de células B positivas para Igλ humana varía del 1 al 40% o más.

Se aísla ARNm de tejido linfoide, por ejemplo, bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, sangre, de los ratones transgénicos lambda 3 y se usa RT-PCR usando cebadores específicos para Vλ y Cλ humanas para amplificar el repertorio expresado de regiones variables humanas del transgén lambda 3. Los ADNc de Vλ se clonan en un vector de clonación tal como TA (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ADNc de Vλ humana se secuencian. Se muestra que los 8 genes Vλ y Jλ-Cλ humano funcional están representados en el repertorio expresado. La secuencia de los ADNc tiene un marco abierto de lectura y codifica regiones variables completamente humanas, consistente con recombinación funcional de Vλ-Jλ y regulación de desarrollo apropiada del transgén Igλ humano.

Se inmunizan ratones transgénicos para lambda 3 con antígeno usando métodos conocidos en la técnica. El ARNm se aísla de tejido linfoide secundario, por ejemplo, bazo, ganglios linfáticos, de los ratones transgénicos lambda 3 y se usa RT-PCR usando cebadores específicos para Vλ y Cλ humanas para amplificar el repertorio expresado de regiones variables humanas del transgén lambda 3. Los ADNc de Vλ se clonan en un vector de clonación tal como TA. Los ADNc de Vλ humana se secuencian. Se encuentra que las regiones Vλ humanas están mutadas comparadas con la secuencia de la línea germinal, indicativo de sucesos de mutación somáticos consistentes con maduración por afinidad.

En conjunto, estos datos demuestran que el transgén lambda 3 se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igλ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

Ejemplo 8

Generación de ratones transgénicos que portan un transgén de Ig lambda humana sintético, Lambda Prime, por comicroinyección pronuclear

Se digiere el BAC sintético, de secuencia confirmada lambda 5 con AsiSI y FseI, se corre en un gel de agarosa en PFGE y el ADN que comprende la secuencia lambda 5 se aísla como en el ejemplo 6. Este ADN se comicroinyecta con ADN que comprende la secuencia lambda 3, aislada como en el ejemplo 6, en el pronúcleo de huevos de ratón fertilizados. Los ADN comicroinyectado se cointegran en el genoma del ratón, con una proporción significativa de los sucesos de integración que comprenden lambda 5 y lambda 3 orientados en unión operativa, es decir, ambos están orientados en la misma orientación 5’ a 3’ uno respecto al otro y lambda 5 se integra en 5’ de lambda 3, es decir, el extremo 3’ de lambda 5 se yuxtapone al extremo 5’ de lambda 3. Por tanto, se crea la secuencia humana contigua de Lambda Prime, 194 kb de ADN sintético en unión operativa, que comprende 29 secuencias Vλ humanas funcionales, todos los Jλ-Cλ humanos y la secuencia del potenciador 3’ humano. Se confirma la integración intacta en unión operativa por transferencias Southern de ADN genómicos cortados con enzimas de restricción de corte raro, se corren en geles estándar y PGFE y se ensayan con secuencias específicas para lambda 5 y lambda 3. Puesto que la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia Lambda Prime cointegrada operativamente unida se conoce por completo, la predicción in silico de patrones de fragmentos de restricción se logra fácilmente para confirmar la unión intacta y operativa, facilitada por los sitios de enzimas de restricción de corte raro diseñados en las secuencias como se esboza en el ejemplo 4. La función del transgén se confirma por ELISA para Igλ humana en el suero.

Se cruzan ratones fundadores y se produce descendencia transgénica. El número de copia se evalúa fácilmente por métodos tal como qPCR o barrido densitométrico de transferencias Southern de ADN genómico. Si se desea, en líneas en las que se integran transgenes lambda 5-3 multicopia, los ratones transgénicos se cruzan con ratones transgénicos que expresan la recombinasa FLP. Los sitios frt presentes en los transgenes lambda 5 y lambda 3 se recombinan específicamente por sitio, particular en células de línea germinal. Se producen gametos que tienen un transgén de copia única resuelto de lambda 5-lambda 3 operativamente unido y estos gametos transmiten la secuencia de Lambda Prime resuelta de copia única a la siguiente generación.

Se ensayan ratones transgénicos, sean multicopia o de copia única, para función de Lambda Prime como se describe en el ejemplo 7. Los datos demuestran que el transgén Lambda Prime se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igλ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

Ejemplo 9

Generación de ratones transgénicos que portan un transgén de Ig lambda humana sintético por cotransfección en células ES

Se aíslan los ADN que comprenden las secuencias de lambda 3 y lambda 5 como en el ejemplo 8. Estos ADN se conintroducen en células ES de ratón por un método tal como lipofección o electroporación. La presencia de un casete de marcador seleccionable positivo 5’ del gen Vλ más 5’ en lambda 5, por ejemplo, higromicina, permite la selección positiva para integración de lambda 5. El ADN cointroducido se cointegra aleatoriamente en el genoma de ratón, con una proporción significativa de los sucesos de integración que comprenden lambda 5 y lambda 3 orientados en unión operativa, es decir, ambos están orientados en la misma orientación 5’ a 3’ uno respecto al otro y lambda 5 se integra 5’ respecto a lambda 3, es decir, el extremo 3’ de lambda 5 se yuxtapone al extremo 5’ de lambda 3. Por tanto, se crea la secuencia humana contigua de Lambda Prime de 194 kb de ADN sintético en unión operativa.

Se confirma la integración intacta en unión operativa por transferencias Southern de ADN genómicos cortados con enzimas de restricción de corte raro, corridos en geles estándar y PGFE y ensayados con secuencias específicas a lambda 5 y lambda 3. Puesto que la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia Lambda Prime cointegrada operativamente unida se conoce por completo, la predicción in silico de patrones de fragmentos de restricción se logra fácilmente para confirmar unión intacta y operativa, facilitada por los sitios de enzimas de restricción de corte raro diseñados en las secuencias como se esboza en el ejemplo 4. El número de copia se evalúa fácilmente por métodos tal como qPCR o barrido densitométrico de transferencias Southern de ADN genómico. Si se desea, en clones en los que se integran transgenes lambda 5-3 multicopia, la recombinasa FLP se expresa de forma transitoria en los clones. Los sitios frt presentes en los transgenes lambda 5 y lambda 3 se recombinan específicamente por sitio. Se producen clones que tienen un transgén de copia única resuelta de lambda 5-lambda 3 operativamente unidos.

Se usan células ES que portan la secuencia del transgén Lambda Prime operativamente unida para generar ratones transgénicos usando métodos bien establecidos. Por ejemplo, las células ES se microinyectan en blastocistos de ratón, que se implantan después en hembras de acogida pseudogestantes. Nacen crías quiméricas. Los ratones quiméricos se cruzan y la descendencia resultante se criba para la presencia del transgén Lambda Prime.

Ejemplo 10

Síntesis y ensamblaje de un ADN que comprende el transgén Lambda Prime y generación de ratones transgénicos del mismo

Proveedores de servicio por contrato sintetizan y ensamblan trozos de ADN muy grandes. La secuencia de ADN de Lambda Prime se transmite a DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA). La secuencia se sintetiza en ADN físico y se ensambla. La secuencia final completamente ensamblada se porta en un BAC con pBeloBAC como el esqueleto del vector. El BAC completo fue secuenciado por SeqWright, Inc. (Houston, TX) usando tecnología de secuenciación 454 (454 Life Sciences, Roche) o secuenciación aleatoria estándar. La secuencia del ADN de Lambda Prime sintético se confirma frente a la secuencia de referencia. Cualquier desviación de secuencia de la secuencia in silico son probablemente errores de lectura de secuenciación 454 debido a secuencias homopoliméricas o dipoliméricas largas. Las desviaciones, incluso aunque muy probablemente no mutaciones en el ADN sintético físico real, mapean a regiones no codificantes, no reguladoras.

Alternativamente, lambda 3 y lambda 5 se pueden recombinar in vitro usando técnicas como se describe en los ejemplos 1 y 2. También se pueden recombinar usando otros métodos de manipulación de BAC tal como recombinería, o ligación de fragmentos de restricción estándar en pBeloBAC seguido por transfección en E. coli.

Se generan ratones transgénicos como se describe en el ejemplo 6 o por introducción en células ES tal como por electroporación, lipofección, etc., como se ejemplifica en el ejemplo 9. Se ensayan ratones transgénicos, sean multicopia o de copia única, para función de Lambda Prime como se describe en el ejemplo 8. Los datos demuestran que el transgén Lambda Prime se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igλ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

Ejemplo 11

Creación de un transgén de IgL humana mediante cointroducción de lambda 3 con ADN genómico que comprende repertorio V lambda humano adicional

Genotecas de ADN genómico humano están disponibles comercialmente o mediante licencia y están bien caracterizadas. Estas incluyen la genoteca genómica humana portada en BAC de CalTech y varias genotecas genómicas humanas portadas en YAC. Los clones en BAC de la genoteca humana de CalTech de genotecas B, C y D se pueden pedir a través de Invitrogen (Carlsbad, CA). También están disponibles genotecas genómicas humanas portadas en cósmidos, fago, P1, PAC, etc. Todos estos vectores se pueden modificar antes de la cointroducción usando métodos fácilmente disponibles en la técnica.

Debido a las instalaciones listas por las que se pueden secuenciar fragmentos grandes de ADN, los insertos genómicos en estos BAC o YAC se pueden confirmar por secuenciado usando un proveedor de servicio por contrato como se ha descrito anteriormente. Se puede aislar el inserto de ADN humano completo. Alternativamente, se puede aislar un subfragmento usando sitios de enzimas de restricción de corte raro disponibles en el ADN genómico. Un ejemplo de un YAC adecuado es L1 (Patente en EE UU 7.435.871). Se describen otros clones de YAC, BAC y cósmidos adecuados para uso en Kawasaki et al., (Gen. Res. (1995) 5: 125-135) y Frippiat et al. (Hum. Mol. Genet. (1995) 4: 983-991). Se cointroducen uno o más BAC o YAC que comprenden genes Vλ humanos adicionales con la construcción lambda 3. Opcionalmente, el ADN de lambda 3 se cointroduce con dos o más otras construcciones con genes Vλ adicionales. Se confirma que las dos o más construcciones cointroducidas se cointegran en unión operativa como se esboza en los ejemplos 8 y 9. La funcionalidad del transgén se confirma como en el ejemplo 7. Por tanto, un transgén humano Igλ puede ser parcialmente sintético y parcialmente derivado de una genoteca genómica, con el núcleo Jλ-Cλ y secuencias reguladoras en cis 3’ creadas por medios sintéticos y todo o parte del repertorio Vλ derivado de una genoteca genómica.

Ejemplo 12

Creación de un transgén de IgL humana mediante cointroducción de lambda 5 con una secuencia de ADN genómico que comprende al menos un par JL-CL humano funcional

Debido a las instalaciones listas por las que se pueden secuenciar fragmentos grandes de ADN, los insertos genómicos en estos BAC o YAC se pueden confirmar por secuenciado usando un proveedor de servicio por contrato como se ha descrito anteriormente. Se puede aislar el inserto de ADN humano completo. Alternativamente, se puede aislar un subfragmento usando sitios de enzimas de restricción de corte raro disponibles en el ADN genómico. Un ejemplo de un YAC adecuado es L2 (Patente en EE UU 7.435.871), que contiene los 7 pares Jλ-Cλ y el potenciador 3’ humano. Se describen otros clones de YAC, BAC y cósmidos adecuados para uso en Kawasaki et al., (Gen. Res. (1995) 5: 125-135) y Frippiat et al. (Hum. Mol. Genet. (1995) 4: 983-991).

La construcción central contiene al menos un par Jλ-Cλ humano funcional y preferiblemente un potenciador 3’ funcional. El ADN de lambda 5 se cointroduce con el ADN aislado de la construcción central y, opcionalmente, una o más de otras construcciones con genes Vλ adicionales. Se confirma que las dos o más construcciones cointroducidas se cointegran en unión operativa como se esboza en los ejemplos 8 y 8. La funcionalidad del transgén se confirma como en el ejemplo 7. Por tanto, un transgén humano Igλ puede ser parcialmente sintético y parcialmente derivado de una genoteca genómica, con el núcleo Jλ-Cλ y secuencias reguladoras en cis 3’ derivadas de una genoteca genómica y todo o parte del repertorio Vλ creado por medios sintéticos.

Ejemplo 13

Uso del sistema CRE-lox para recombinar transgenes

La secuencia del transgén lambda 3 se diseña in silico como se describe en el ejemplo 4 con la alteración de una adición de un sitio loxP o variante del mismo sustituyendo la secuencia del sitio frt o colocado adyacente al mismo, y una actividad de casete de resistencia a fármaco en células de mamífero tal como resistencia a puromicina se inserta 5’ del sitio loxP, creando lambda 3P. La secuencia de lambda 3P se sintetiza y ensambla a ADN físico como se describe en el ejemplo 5. El ADN de lambda 3P se aísla del ADN del vector, se introduce en células ES, se seleccionan colonias con resistencia a puromicina, se cogen y se criban molecularmente para integración intacta de lambda 3P.

La secuencia del transgén lambda 5 se diseña in silico como se describe en el ejemplo 4 con la alteración de una adición de un sitio loxP o variante del mismo sustituyendo la secuencia del sitio frt o colocado adyacente al mismo, creando lambda 3P. La secuencia de lambda 5P se sintetiza y ensambla a ADN físico como se describe en el ejemplo 5 excepto que la secuencia del vector BAC, tal como pBeloBAC, tiene un sitio loxP delecionado o porta una versión incompatible para recombinación con esa en la secuencia lambda 5P. El ADN del BAC lambda 5P circular se aísla y cotransfecta con recombinasa CRE en clones de ES lambda 3P. La recombinasa CRE genera recombinación específica de sitio entre los sitios loxP, produciendo la integración del ADN de lambda 5P en unión operativa antes del ADN de lambda 3P, reconstituyendo de esta manera la secuencia de Lambda Prime. Los clones de ES positivos para lambda 5P se seleccionan para resistencia a puromicina, se cogen y se criban molecularmente para la inserción de lambda 5P en lambda 3P como se describe en el ejemplo 9. Se generan ratones transgénicos de las células ES y se confirma la función del transgén Lambda Prime como se describe en el ejemplo 9.

Este proceso para la inserción de repertorio Vλ adicional antes de secuencia central Jλ-Cλ funcional es aplicable para cualquier vector existente como un ADN circular, por ejemplo, plásmido, cósmido, BAC, o circularizable, tal como un YAC, siempre que el sitio loxP esté 3’ del gen Vλ más 3’ deseado que se una operativamente a la secuencia central Jλ-Cλ.

Ejemplo 15

Generación de ratones transgénicos que expresan Ig lambda humana de un transgén de ADN sintético que comprende una secuencia de ADN muy quimérica humana-de ratón

La secuencia anotada del locus de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina de ratón está disponible en el dominio público, véase el número de acceso de GenBank NC_000082. Debido a la estructura única del locus de Igλ de ratón, que está compuesto de dos unidades separadas (véase, Selsing et al., lmmunoglobulin Genes 1989 Acad.

Press Ltd., pp. 111-122), se selecciona la secuencia de una de las unidades del locus de Igλ de ratón. Se aísla una secuencia de 60.000 nucleótidos (nt) que comprende 4 kb antes del codón de inicio de Vλ1 y 5 kb después del potenciador 3’ in silico. Se identifica una subsecuencia de 4 kb antes del codón de inicio de Vλ2 de ratón y 500 pb después de la RSS (“casete de expresión de Vλ”). La figura 1 de Ramsden y Wu (Proc. Natl. Acad. Sci. 1991 88: 10721-10725) identifica la RSS de Vλ2 y la RSS para Jλ3 y Jλ1. La secuencia de 39 nucleótidos de RSS de Vλ1 de ratón se sustituye en la orientación funcional con la RSS funcional de un Vλ humano, por ejemplo, Vλ3-1. Esta secuencia de aproximadamente 5.000 nucleótidos que comprende 4.000 nt antes del codón de inicio, RSS humana hasta 500 nt después de la RSS, es la construcción de expresión de Vλ central.

La secuencia de 28 nucleótidos de Jλ3 y Jλ1 de ratón se sustituye en la orientación funcional con la RSS funcional de Jλ3 y Jλ1 humanos. Las secuencias codificantes de Jλ3 y Jλ1 de ratón se sustituyen por las secuencias codificantes de Jλ3 y Jλ1 humanos. Las secuencias codificantes de Cλ3 y Cλ1 de ratón se sustituyen por las secuencias codificantes de Cλ3 y Cλ1 humanos. La secuencia codificante de Vλ1 de ratón se sustituyen por la secuencia codificante de un gen Vλ humano, por ejemplo, Vλ3-1. La secuencia que comprende el potenciador 3’ de ratón se sustituye con una secuencia de 7.562 nucleótidos que comprende los 3 sitios hipersensibles a DNasaI del potenciador 3’ de Igλ humana. Esta secuencia es la construcción Igl quimérica central. Combriato y Klobeck (J. lmmunol. 2002 168:1259-1266) enseñan otros cambios de secuencia para restablecer actividad de potenciador óptima al potenciador 3’ de ratón.

Se añade repertorio Vλ adicional in silico mediante unión de la secuencia de la construcción de expresión Vλ central 5’ a la construcción Igλ quimérica central. En cada construcción de expresión de Vλ añadida, la secuencia codificante Vλ1 de ratón se sustituye con secuencia codificante Vλ humana. Se puede añadir el repertorio Vλ humano entero secuencialmente in silico dando una secuencia de aproximadamente 205.000 nt.

La secuencia o dos partes de la miasma se sintetiza y ensambla a ADN físico como se describe en ejemplos previos. El ADN se usa para construir ratones transgénicos como se describe en ejemplos previos. Los ratones transgénicos se analizan para expresión y función del transgén como se describe en ejemplos previos. Los datos demuestran que el transgén se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igλ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

El ejemplo precedente ilustra la metodología por la cual secuencias manipuladas de forma exquisita, precisa y compleja se componen in silico y después un proceso para hacer animales transgénicos que comprenden esa secuencia. La metodología no está limitada a la secuencia descrita.

Ejemplo 14

Ensamblaje in silico de la secuencia de un transgén de cadena ligera kappa de Ig humana sintética funcional

Las metodologías descritas en los ejemplos precedentes son ampliamente aplicables para el ensamblaje in silico y posterior síntesis de cualquier secuencia hasta la capacidad de clonación de un BAC, que como se demostró en el ejemplo 2, es al menos 500 kb. Como se describió en el ejemplo 3, se ensambló una secuencia que codifica un transgén Igκ humano de información públicamente disponible sobre la secuencia de los loci de Igκ humano y de ratón. Se accedió a la secuencia anotada para el locus de Igκ completo de GenBank, número de acceso NG_000834. La secuencia comprende el complejo Vκ proximal completo hasta los elementos reguladores 3’, potenciador 3’, Ed y RS. Hay disponible información detallada adicional, incluyendo referencias científicas bibliográficas de apoyo en varios sitios web de dominio público incluyendo Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) e IMGT (http://imgt.cines.fr/). Esta información incluye datos para el contenido genético y fenotípico del locus Igκ humano, por ejemplo, incluyendo, pero no limitado a, identificación de secuencias génicas expresadas, pseudogenes, variantes alélicas, y genes que pueden codificar dominios propensos a mal plegamiento.

Una secuencia de 30.000 nt que comprende 4 kb antes de Vκ4-1 humano hasta el complejo Jκ humano completo hasta 1.000 nt 3’ de Cκ estaba en configuración de línea germinal. Se añadió in silico 3’ de Cκ humano una secuencia de ADN de ratón configurada en línea germinal de 25.600 nt que comprendía el potenciador 3’ de Igκ, Ed y RS. Esta secuencia sirvió como el casete de expresión de Igκ central.

Para expandir el repertorio, secuencia para casetes de expresión de Vκ adicionales como unidades de ~5.000 nt se añadieron 5’ de Vκ4-1. En casos en los que dos genes Vκ funcionales se colocaron en proximidad de menos de 5 kb de distancia en la configuración de línea germinal humana, se usó la secuencia entera que comprende dos genes Vκ, desde aproximadamente 4 kb 5’ de la 5’ UTR del gen más 5’ y aproximadamente 500 pb 3’ de la RSS del gen Vκ más 3’. Como se describe en el ejemplo 3, se introdujeron secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción específicas en los extremos de la secuencia. Las secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción específicas se introdujeron y delecionaron internamente mediante inserción, deleción o modificación de secuencia; estas no perturbaron la expresión génica o codificación.

Ejemplo 16

Generación de ratones transgénicos para un locus que expresa Igκ humana, dicho locus comprende ADN sintético

Usando metodología descrita en cualquiera de los ejemplos precedentes 1-2 y ejemplos 4-14 y el proceso para ensamblaje in silico de secuencias descrito en los ejemplos 3 y 15, ADN físico que codifica cadenas ligeras Igκ humanas se sintetiza y usa para crear ratones transgénicos. Los ratones transgénicos se analizan para expresión y función del transgén como se describe en ejemplos previos usando reactivos apropiados para uso en estudiar expresión de Igκ humana a nivel de ácido nucleico y proteína. Los datos demuestran que el transgén se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igκ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

Ejemplo 17

Generación de ratones que expresan Igκ humana de un transgén de ADN sintético que comprende una secuencia de ADN muy quimérica humana-de ratón

La secuencia anotada del locus de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana está públicamente disponible, véase el número de acceso de GenBank NG_000834. La secuencia anotada del locus de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina de ratón está públicamente disponible, véase el número de acceso de GenBank NC_005612. Se usan otras fuentes tal como el sitio web de repertorio IMGT (http://imgt.cines.fr/) como recurso en el mapa y funcionalidad de los componentes individuales en los loci. Una secuencia de ADN de ratón de aproximadamente 50.000 bases, que comprende un Vκ, preferiblemente el Vκ de ratón más proximal, Vκ3-1, el complejo Jκ, Cκ hasta regiones reguladoras 3’, se aísla in silico. Aunque esta secuencia está preferiblemente en configuración de línea germinal, se pueden delecionar regiones intergénicas de ADN para hacer una secuencia global menor siempre que las regiones reguladoras críticas tal como el potenciador intrónico de Igκ, potenciador 3’, Ed y RS, cuya secuencia y localización están documentadas públicamente, no se perturben.

Los exones de ratón para Vκ, Jκ y Cκ se sustituyen con sus análogos humanos. Los exones Vκ humanos que sustituyen a los exones Vκ de ratón pueden ser Vκ4-1, que es el Vκ humano más proximal al complejo Jκ humano, pero esto no es absolutamente necesario. Cualquier secuencia de exón Vκ humano se puede usar. Se indica que Vκ4-1 humano y el siguiente gen Vκ más proximal, Vκ5-2, están invertidos 3’-5’ relativo al complejo Jκ humano en la configuración de línea germinal. Los exones Vκ4-1 humanos estarían orientados en el contexto de Vκ de ratón en la orientación 5’-3’ relativo al locus Jκ de ratón en la secuencia construida in silico. El locus Jκ de ratón comprende 5 secuencias Jκ pero Jκ3 puede no expresarse debido a una secuencia donante de ayuste no canónica. El locus Jκ humano comprende 5 secuencias Jκ, todas las cuales son funcionales. La incorporación del exón Jκ3 humano traería consigo la secuencia donante de ayuste apropiada, particular para ayuste con su secuencia aceptora de ayuste análoga en Cκ humana.

Se añade repertorio Vκ adicional in silico mediante la identificación de unidades de aproximadamente 5 kb que comprenden en orden de proximal a distal los genes Vκ de ratón funcionales. Este número de unidades de secuencia de 5 kb es equivalente al número de genes Vκ humanos que van a estar representados en los transgenes. Los pseudogenes de ratón se eliminan. En cada construcción de expresión de Vκ añadida, la secuencia codificante de Vκ de ratón se sustituye con secuencia codificante de Vκ humana. La unidad de 5 kb también puede ser una unidad repetida de modo que secuencias no codificantes idénticas comprenden cada unidad y las unidades solo se distinguen por la secuencia de exón Vκ humano único. Cada unidad se añade sobre la secuencia central 5’ de la precedente, construyendo secuencialmente la secuencia del locus artificial, de proximal a distal.

El repertorio Vκ humano proximal entero se puede añadir secuencialmente in silico dando una secuencia de aproximadamente 140.000 bases. El complejo distal invertido de genes Vκ humanos también se puede incluir, aunque puesto que son duplicaciones de los genes en el complejo proximal, contribuyen a <10% del repertorio de Igκ humano expresado, y puesto que faltan en algunos haplotipos humanos, su inclusión no es necesaria y puede ser indeseada para posterior desarrollo de fármacos de anticuerpo.

La secuencia o dos partes de la misma se sintetiza y ensambla a ADN físico como se describe en los ejemplos previos. El ADN se usa para construir ratones transgénicos como se describe en ejemplos previos. Los ratones transgénicos se analizan para expresión y función del transgén como se describe en ejemplos previos. Los datos demuestran que el transgén se expresa en células B, expresa una diversidad de cadenas ligeras Igκ humanas, y es un molde para sucesos de mutación somática indicativo de que experimenta maduración por afinidad en la respuesta inmunitaria secundaria.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula de ratón que comprende un transgén sintético que sustituye funcionalmente segmentos génicos de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el transgén sintético comprende una 5 secuencia polinucleotídica de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada humana, uno o más segmentos génicos D humanos, uno o más segmentos génicos J humanos, un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de región bisagra superior humana que sustituyen los ortólogos de ratón, en donde el transgén comprende un segmento génico CH2 de ratón y un segmento CH3 de ratón, 10 en donde el transgén sintético experimenta reorganización génica para producir una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica que comprende un dominio CH1 humano, una región bisagra superior humana, un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón, en donde las secuencias de la región constante de ratón del transgén son alotípicamente diferentes del locus de la cadena pesada de

15 inmunoglobulina endógeno, en donde el transgén sintético está integrado aleatoriamente en el genoma de la célula, y en donde la célula comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivado.
2. La célula según la reivindicación 1, que comprende además un segundo transgén sintético que codifica una

cadena ligera de inmunoglobulina humana. 20
3.

La célula según la reivindicación 2, que comprende una cadena ligera Igκ humana y/o una cadena ligera Igλ humana.
4.

Un ratón que comprende (1) un primer transgén sintético que sustituye funcionalmente segmentos génicos de

25 un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el primer transgén sintético comprende una secuencia polinucleotídica de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada humana, uno o más segmentos génicos D humanos, uno o más segmentos génicos J humanos, un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de región bisagra superior humana que sustituyen los ortólogos

30 de ratón, en donde el primer transgén comprende un segmento génico CH2 de ratón y un segmento CH3 de ratón, en donde el primer transgén sintético experimenta reorganización génica para producir una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende un dominio variable de cadena pesada humano y una región constante de cadena pesada quimérica que comprende un dominio CH1 humano, una región bisagra superior humana, un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón, en donde las secuencias de la región

35 constante de ratón del primer transgén son alotípicamente diferentes del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el primer transgén sintético está integrado aleatoriamente en el genoma de la célula, y en donde la célula comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivado, y (2) un segundo transgén sintético que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humana.

40 5. Un método de producir una célula de ratón que comprende un transgén de cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que sustituye funcionalmente un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivado, en donde el transgén está aleatoriamente integrado en el genoma de la célula, y en donde la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica comprende un dominio variable pesado humano y una región constante quimérica, dicho método comprende las etapas de:

45 diseñar una construcción de ADN in silico, en donde dicha construcción comprende una secuencia polinucleotídica de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende ADN completamente de ratón excepto para secuencias que codifican uno o más segmentos génicos V, D y J pesados humanos sin reorganizar y un segmento génico CH1 humano, y un segmento génico de región bisagra superior humana que sustituyen a

50 los ortólogos de ratón, en donde la construcción comprende un segmento génico CH2 de ratón, y un segmento génico CH3 de ratón, en donde las secuencias de la región constante de ratón de la construcción son alotípicamente diferentes del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno; producir dicha construcción de ADN; introducir la construcción en el genoma de una célula; y

55 cribar para una célula que tiene la secuencia polinucleotídica de la cadena pesada de inmunoglobulina integrada aleatoriamente en su genoma.
6. El método según la reivindicación 5, que comprende además las etapas de:

60 diseñar una segunda construcción de ADN in silico, en donde dicha construcción comprende una cadena ligera de inmunoglobulina humana; producir dicha segunda construcción de ADN; e introducir la segunda construcción en el genoma de la célula.
7. El método según la reivindicación 6, en donde la cadena ligera comprende uno o más segmentos génicos Vκ humanos, en donde preferiblemente la cadena ligera comprende además uno o más segmentos génicos Jκ y Cκ humanos.

FIGURAS