ES2642112T3 - Vector adenoviral que codifica un antígeno de malaria - Google Patents

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

rpm, en un equipo de incubación a 37 ºC, durante 48 horas. Las botellas giratorias se comprobaron diariamente en cuanto a la presencia de CPE. El CPE típico se acompaña por redondeamiento de células. Los cultivos celulares de control se comprobaron en cuanto a la ausencia de CPE.

Las botellas giratorias infectadas con virus se recolectaron tras una única ronda de replicación vírica y con apariencia de CPE total (48 horas). Las células infectadas por el virus se resuspendieron suavemente en el medio de cultivo para formar una suspensión celular que se aglomeró entonces por centrifugación durante 15 minutos a 2000 rpm a 20 ºC. El sobrenadante se retiró y el aglomerado celular se re-suspendió en 8,0 ml de tampón de lisis celular (10 mM de Tris, 135 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, pH 7,9 preparado en agua purificada CBF). El aglomerado celular se transfirió entonces a un tubo de polipropileno de 50 ml. El aglomerado celular se sometió a tres rondas de congelación descongelación (congelado en un baño de CO2 seco/IPA y luego se descongeló en un baño de agua a 37 ºC). El lisado celular se clarificó por centrifugación adicional a 3000 rpm durante 30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante (lisado celular) se congeló instantáneamente a -80 ºC en pequeñas alícuotas. Se tomó una muestra del lisado celular para el título de infección (3,34 x 108 ufp/ml). Las muestras de sobrenadante celular infectado y no infectado (ambos de 100 ml) se analizaron en cuanto a biocarga (siendo ambos negativos).

Fabricación de vectores de trabajo (WVS) 1 y 2 como materia prima

Se utilizó la materia prima de vector de pre-trabajo (pre-WVS) para fabricar la materia prima de vector de trabajo (WVS1) y se utilizó el WVS1 para fabricar el WVS2. Ambos se implicaron en una única ronda de replicación vírica en células HEK 293 adherentes uniformemente en las botellas giratorias Cellbind. El tamaño del WVS se calculó de manera que un lote de producción discontinua utiliza < 10 % del WVS2 total. Para el WVS1, se utilizaron 14 botellas giratorias de células HEK 293 con una densidad celular de 1,29 x 105/cm2 para la expansión vírica y para WVS2, se utilizaron 29 botellas giratorias con una densidad celular de 1,54 x 105/cm2. La especificación de fabricación para ambos WVS1 y WVS2 era la misma. El inóculo vírico (pre-WVS o WVS1 respectivamente) se diluyó con DMEM más glutamina y un 2 % de FBS hasta 113 ml/botella giratoria para WVS1 y hasta 20 ml/botella giratoria durante 2 horas y luego hasta 113 ml/botella giratoria final para WVS2. Los MOI finales eran 1,01 para WVS1 y 8,6 ufp/célula para WVS2, respectivamente). Las botellas se giraron una vez manualmente y luego se colocaron en un banco de giro a 0,1 rpm, a 37 ºC durante 48 y 71 horas, respectivamente. Las botellas giratorias se comprobaron diariamente en cuanto a la presencia de CPE. Se incluyó en ambos procedimientos una botella giratoria de control negativo que contenía células HEK 293 sin infectar para compararla y para el recuento de las células.

Los WVS1 se recolectaron 48 horas post-infección mientras que los WVS2 se recolectaron a las 71 post-infección. Las células infectadas con virus se resuspendieron suavemente en el sobrenadante celular para formar una suspensión celular que entonces se decantó en tubos de centrífuga y se aglomeraron por centrifugación durante 15 minutos a 2000 rpm a 20 ºC. Los sobrenadantes celulares se retiraron y cada aglomerado celular se re-suspendió en 8,0 ml de tampón de lisis celular (10 mM de Tris, 135 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, pH 7,9) por botella giratoria. Las suspensiones de aglomerado celular se agruparon entonces en tubos de polipropileno. Los tubos se sometieron a tres rondas de congelación descongelación (congelados en un baño de IPA/ CO2 seco y luego se descongelaron en un baño de agua a 37 ºC). El lisado celular resultante se clarificó por una centrifugación adicional a 3000 rpm durante 30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante (del lisado celular) que contenía los virus (WVS1 o WVS2) se agrupó, se muestreó, se repartió en alícuotas y se congeló instantáneamente a -80 ºC. Se prepararon volúmenes finales de 112 ml y 236 ml de cada materia prima.

Fabricación del lote clínico de recolección en masa de AdCh63 ME.TRAP

Se utilizó el WVS2 para fabricar los tres lotes de recolección en masa de AdCh63 ME.TRAP. Cada lote consistía en una única ronda de replicación vírica de WVS2. El procedimiento era similar a la fabricación de WVS2 que se ha descrito anteriormente con una inoculación inicial de 20 ml/botella giratoria durante 2 horas seguida por un rellenado hasta un volumen final de 113 ml/botella giratoria pero tenía la adición de Benzonasa tras el primer ciclo de congelación/descongelación durante la lisis celular. El inóculo vírico (WVS2) se diluyó con DMEM que contenía un 2 % de FBS y glutamina como se ha descrito previamente y se añadió a las botellas giratorias de HEK 293 en 20 ml (con una MOI de 2-3 ufp/célula). Las botellas se giraron una vez manualmente y luego se colocaron en un banco de giro que rotaba a 0,1 rpm, en una incubadora a 37 ºC durante un total de 71 horas. Las botellas giratorias se comprobaban diariamente en cuanto a la presencia de CPE y las botellas giratorias infectadas con virus se recolectaron tras la apariencia de CPE total. Las células infectadas con virus se re-suspendieron suavemente en el medio de cultivo para formar una suspensión celular. Una muestra de 2,5 ml de la suspensión celular y el sobrenadante se retiró de cada botella giratoria y se agruparon. Se marcó como lote 1, 2, o 3 del pre-agrupamiento de recolección en masa. Estas muestras de ‘recolección en masa’ se tomaron por un agrupamiento final para generar la muestra de recolección en masa para un proceso de ensayo externo de virus adventicios y para transcriptasa inversa. La suspensión restante se aglomeró entonces por centrifugación durante 30 minutos a 2000 rpm a 20 ºC. Los sobrenadantes se eliminaron y cada aglomerado celular se re-suspendió en 8,0 ml de tampón de lisis celular (10 mM Tris, 135 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, pH 7,9). Las suspensiones de aglomerados celulares se agruparon entonces y se dispensaron en tubos de polipropileno. Los tubos se sometieron a una ronda de congelación descongelación (congelados en un baño de IPA/ CO2 seco y luego se descongelaron en un baño de agua a 37 ºC). El tiempo mínimo de congelación era de 30 min. Se añadió entonces la Benzonasa para degradar el ADN residual de las células huésped antes de la purificación (1500 unidades por 8 ml de lisado celular). El lisado

10

imagen9

imagen10

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

comparación entre las respuestas de linfocitos T CD8+ (Fig. 4a, b) y las respuestas de anticuerpo producidas por regímenes de AdCh63-MVA y AdC9-MVA. Poco después de la inmunización (Fig. 4a), el AdCh63 presentaba altos niveles de respuestas CD8 y aunque las respuestas de AdC9 eran más potentes, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. El análisis de las respuestas a largo plazo presentaba la gran ventaja de un régimen de sensibilización-refuerzo sobre una única sensibilización. Como se muestra en la Figura 4b, las respuestas de CD8 se mantenían altas incluso el día 60 tras el refuerzo (> 25.000 SFC/millón de PBMC, Fig. 2). Seis meses después de un refuerzo con MVA, los niveles de inmunogenicidad se mantienen aún por encima de 10.000 puntos/millón de PBMC y no se encontraron diferencias significativas entre los dos vectores adenovirales de simio ensayados.

Aunque la eficacia de protección descansa en las respuestas inmunitarias celulares en este sistema, los vectores adenovirales ofrecen la ventaja adicional de inducir fuertes respuestas de anticuerpo específicas del transgén [17]. Esta característica es potencialmente importante cuando se utilizan los vectores adenovirales con fines vacunales en seres humanos debido a la protección extra que proporcionan los anticuerpos además de las respuestas inmunitarias celulares. Las repuestas humorales se evaluaron cuantificando la IgG producida por regímenes de sensibilización-refuerzo A-M. Como se muestra en la Figura 4c, las respuestas de anticuerpo eran altas con los dos regímenes ensayados y el uso de una combinación AdCh63-MVA daba como resultado niveles de IgG significativamente más altos en comparación con AdC9.

Como los niveles de inmunogenicidad mejoraban con los regímenes de sensibilización-refuerzo, los niveles de protección estéril se analizaron utilizando la misma estrategia de vacunación secuencial (Fig. 5). Se encontraron niveles superiores en intervalos cortos y largos tras el refuerzo en ambos regímenes. Sin embargo, el régimen ADCh63-MVA superaba el AdC9-MVA en todos los puntos de tiempo ensayados. Es interesante que el régimen AdCh63-MVA produjera una protección estéril en el 100 % de los animales a corto plazo. A pesar de que la protección disminuye con el tiempo, permanecía alta y sorprendentemente ambos regímenes inducían niveles superiores de protección incluso seis meses después de la vacunación con el refuerzo (Fig. 5c).

Inmunogenicidad en macacos Rhesus

En muchos ejemplos de la técnica anterior, se observó que la eficacia de las vacunas vectoriales disminuía cuando se ensayaban en primates no humanos y seres humanos, en comparación con las respuestas en ratones. Por lo tanto, se ensayó un régimen similar de sensibilización-refuerzo similar al descrito anteriormente en macacos Rhesus.

Se inmunizaron siete macacos Rhesus con una dosis de 5 x 1010 pv de AdCh63 ME.TRAP preparada de acuerdo con el Ejemplo 1. La vacuna se administró tanto intradérmica como intramuscularmente, pero como no se observaron diferencias en cuanto a la inmunogenicidad entre las vías, los datos se muestran combinados. En varios momentos tras la inmunización con AdCh63 ME.TRAP se administraron inmunizaciones de refuerzo con un vector vírico heterólogo, MVA que codifica ME.TRAP (véase la Figura 7). Los datos mostraban (Figura 8) que AdCh63 ME.TRAP era altamente inmunogénico en monos macacos, una especie que se considera ampliamente como útilmente predictiva de la inmunogenicidad vacunal en seres humanos. Tras una única inmunización se observó que la media de respuestas de linfocitos T era de aproximadamente 1000 SFU por millón de PBMC en los ensayos ELISpot, un nivel asociado previamente con la protección en seres humanos para esta inserción vacunal (Webster y col. PNAS 2005 102:4836-41). También se inducían fuertes títulos de anticuerpos por la vacunación. Las inmunizaciones de refuerzo heterólogas con MVA podían reforzar tanto las respuestas de linfocitos T como de anticuerpos con niveles incluso más altos. El análisis limitado al fenotipo de linfocitos T de los puntos de tiempo seleccionados mostraban que se inducían tanto linfocitos T CD8 como CD4 por los regímenes de vacunación y que estos podían ser células polifuncionales que expresaban el interferón gamma, TNF e IL2.

Como se muestra en la Figura 6a, la sensibilización con AdCh63 ME.TRAP producía respuestas de linfocitos T robustas que tenían un pico la semana 4 tras la vacunación. Es interesante que todos los macacos excepto uno (4073) eran juveniles que pesaban entre 3-4 kg, mientras que el animal mayor y más pesado nº 4073 (más de 10 kg) mostraba repuestas inmunitarias excepcionalmente buenas en la sensibilización. Es importante, que las respuestas de linfocitos T podían reforzarse con una vacunación posterior con MVA ME.TRAP y se encontraron diferencias de hasta cinco veces en algunos casos cuando se comparaba el pico de una sensibilización frente al pico tras un refuerzo. Se hicieron observaciones adicionales tras comparar las respuestas inmunitarias contra los agrupamientos peptídicos que abarcan la región ME.TRAP completa. Las respuestas de linfocitos T se enfocaron principalmente al agrupamiento T2 tras la sensibilización con AdCh63 (Figura 6b). Sin embargo, el refuerzo con MVA daba la ventaja adicional de un aumento de anchura de la respuesta inmunitaria a ME.TRAP, donde el foco principal era no solo a T2 sino también hacia la secuencia ME.TRAP completa (Figura 6c). De manera importante, estas fuertes respuestas de linfocitos T inducidas en los macacos eran probablemente las más fuertes que se hayan inducido jamás contra un antígeno de malaria y eran mucho más altas que las respuestas de linfocitos T inducidas contra ME.TRAP por cualquier ensayo clínico realizado hasta la fecha. Debido a que la magnitud de respuestas de linfocitos T inducidas contra TRAP se correlacionaba con la cantidad de protección medida en ensayos clínicos humanos (Webster y col. PNAS; Dunachie y col Infection and Immunity) los inventores anticiparon que este régimen vacunal debería ser más eficaz que cualquier vacuna ME.TRAP ensayada hasta la fecha en seres humanos.

14 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Uso de AdCh63 ME.TRAP en seres humanos

El vector adenoviral de simio AdCh63 ME.TRAP se ha evaluado en un ensayo clínico en fase I con seres humanos para ensayar la seguridad e inmunogenicidad en seres humanos por una única inmunización con AdCh63 ME.TRAP en un régimen de sensibilización-refuerzo que implica el adenovirus previo seguido por un refuerzo con MVA 8 semanas más tarde.

Todos los voluntarios reclutados eran varones adultos sanos. Como era la primera vez que se evaluaba un vector de adenovirus de chimpancé en seres humanos el primer grupo de vacunados recibió una dosis de vacuna muy baja, 108 pv. Esto se podía contrastar con la dosis de 5 x 1010 pv administrada a macacos y 1-10 x 1010 pv que se utilizó como una dosis normal en ensayos vacunales previos de vectores de adenovirus humanos. A esta dosis baja de 108 pv tanto la seguridad local como sistémica en los ocho primeros voluntarios era excelente. Cuatro de estos individuos recibieron una inmunización de refuerzo con MVA que codificaba ME.TRAP a una dosis de 2 x 108 ufp. El curso en el tiempo de la inmunogenicidad de linfocitos T en estos cuatro voluntarios, se muestra, como una media de la respuesta en la Figura 9. La inmunogenicidad se midió por ELISpot de interferón gamma ex vivo de agrupamientos de péptidos 15meros que solapan la inserción vacunal: T9/96 TRAP 15mero, y también con la misma secuencia que solapa 20meros peptídicos: T9/96 TRAP 20mero. También se muestra la respuestas de péptidos 10meros que representan una cepa heteróloga de P. falciparum: 3 D7 20mero TRAP. Finalmente, la respuesta contra la cadena corta de epítopos peptídicos de malaria principalmente nonámeros en la cadena ME poliepítopo (Gilbert y col. Nature Biotechnol. 1997 Nov;15:1280-4) se muestra: ME. Estos resultados muestran que incluso utilizando una dosificación muy baja se observaban respuestas de linfocitos T contra TRAP a las cuatro semanas tras una inmunización única con AdCh63 ME.TRAP en seres humanos. Adicionalmente, estas respuestas se pueden reforzar fuertemente por la vacuna MVA indicando que se sensibilizan linfocitos T de memoria en seres humanos por el vector adenoviral.

REFERENCIAS

1 Snow, R. W., Guerra, C. A., Noor, A. M., Myint, H. Y. y Hay, S. I., The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria. Nature 2005. 434: 214-217. 2 Hill, A. V., Pre-erythrocytic malaria vaccines: towards greater efficacy. Nat Rev Immunol 2006. 6: 21-32. 3 Tsuji, M. y Zavala, F., T cells as mediators of protective immunity against liver stages of Plasmodium. Trends Parasitol 2003. 19: 88-93. 4 Khusmith, S., Charoenvit, Y., Kumar, S., Sedegah, M., Beaudoin, R. L. y Hoffman, S. L., Protection against malaria by vaccination with sporozoite surface protein 2 plus CS protein. Science 1991. 252: 715-718. 5 Gilbert, S. C., Plebanski, M., Harris, S. J., Allsopp, C. E., Thomas, R., Layton, G. T. y Hill, A. V., A protein particle vaccine containing multiple malaria epitopes. Nat Biotechnol 1997. 15: 1280-1284. 6 Moorthy, V. S., McConkey, S., Roberts, M., Gothard, P., Arulanantham, N., Degano, P., Schneider, J., Hannan, C., Roy, M., Gilbert, S. C., Peto, T. E. y Hill, A. V., Safety of DNA and modified vaccinia virus Ankara vaccines against liver-stage P. falciparum malaria in non-immune volunteers. Vaccine 2003. 21: 1995-2002. 7 Rodrigues, E. G., Zavala, F., Eichinger, D., Wilson, J. M. y Tsuji, M., Single immunizing dose of recombinant adenovirus efficiently induces CD8+ T cell-mediated protective immunity against malaria. J Immunol 1997. 158: 1268-1274. 8 Zhi, Y., Figueredo, J., Kobinger, G. P., Hagan, H., Calcedo, R., Miller, J. R., Gao, G. y Wilson, J. M., Efficacy of Severe Acute Respiratory Syndrome Vaccine Based on a Nonhuman Primate Adenovirus in the Presence of Immunity Against Human Adenovirus. Hum Gene Ther 2006. 9 Fitzgerald, J. C., Gao, G. P., Reyes-Sandoval, A., Pavlakis, G. N., Xiang, Z. Q., Wlazlo, A. P., Giles-Davis, W., Wilson, J. M. y Ertl, H. C., A simian replication-defective adenoviral recombinant vaccine to HIV-1 gag. J Immunol 2003. 170: 1416-1422. 10 Reyes-Sandoval, A., Fitzgerald, J. C., Grant, R., Roy, S., Xiang, Z. Q., Li, Y., Gao, G. P., Wilson, J. M. y Ertl,

H. C., Human immunodeficiency virus type 1-specific immune responses in primates upon sequential immunization with adenoviral vaccine carriers of human and simian serotypes. J Virol 2004. 78: 7392-7399. 11 Gilbert, S. C., Schneider, J., Hannan, C. M., Hu, J. T., Plebanski, M., Sinden, R. y Hill, A. V., Enhanced CD8 T cell immunogenicity and protective efficacy in a mouse malaria model using a recombinant adenoviral vaccine in heterologous prime-boost immunisation regimes. Vaccine 2002. 20: 1039-1045. 12 McConkey, S. J., Reece, W. H., Moorthy, V. S., Webster, D., Dunachie, S., Butcher, G., Vuola, J. M., Blanchard, T. J., Gothard, P., Watkins, K., Hannan, C. M., Everaere, S., Brown, K., Kester, K. E., Cummings, J., Williams, J., Heppner, D. G., Pathan, A., Flanagan, K., Arulanantham, N., Roberts, M. T., Roy, M., Smith, G. L., Schneider, J., Peto, T., Sinden, R. E., Gilbert, S. C. y Hill, A. V., Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. Nat Med 2003. 9: 729-735. 13 Schneider, J., Gilbert, S. C., Blanchard, T. J., Hanke, T., Robson, K. J., Hannan, C. M., Becker, M., Sinden, R., Smith, G. L. y Hill, A. V., Enhanced immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete protective efficacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat Med 1998. 4: 397-402. 14 Roy, S., Gao, G., Lu, Y., Zhou, X., Lock, M., Calcedo, R. y Wilson, J. M., Characterization of a family of chimpanzee adenoviruses and development of molecular clones for gene transfer vectors. Hum Gene Ther 2004.

15: 519-530. 15 Moore, A. C., Gallimore, A., Draper, S. J., Watkins, K. R., Gilbert, S. C. y Hill, A. V., Anti-CD25 antibody enhancement of vaccine-induced immunogenicity: increased durable cellular immunity with reduced immunodom

15

Claims (1)

1. imagen1