ES2642184T3

ES2642184T3 - Péptidos para su uso en el tratamiento y diagnóstico de cánceres positivos a IDH1 R132H

Info

Publication number: ES2642184T3
Application number: ES13700266.3T
Authority: ES
Inventors: Michael Platten; Theresa SCHUMACHER; Wolfgang Wick
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2013-01-03
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2033-01-03
Also published as: HK1203825A1; CN105142662A; BR112014016612A2; CN105142662B; US10161940B2; EA201491324A1; KR102055463B1; AU2013207191A1; US20150023991A1; EP2800580B1; AU2013207191B2; CA2859078A1; JP6316755B2; EP2800580A1; MX2014008306A; KR20140120324A; MX349494B; JP2015505246A; WO2013102641A1; SG11201403877PA

Description

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b) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 120 a 134 (SEQ ID NO: 2); c) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 122 a 136 (SEQ ID NO: 3); d) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 124 a 138 (SEQ ID NO: 4); e) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 126 a 140 (SEQ ID NO: 5);

5 f) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 128 a 142 (SEQ ID NO: 6); g) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 130 a 144 (SEQ ID NO: 7); y h) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 132 a 146 (SEQ ID NO: 8).

El componente celular al que se hace referencia de acuerdo con la presente invención como componente del sistema inmunitario es una célula del sistema inmunitario que es capaz de unirse específicamente a un péptido

10 antigénico. Las células del sistema inmunitario capaces de unirse específicamente a un péptido antigénico, preferentemente, son linfocitos T, linfocitos B, o células dendríticas. Más preferentemente, el componente del sistema inmunitario es un linfocito y, más preferentemente, un linfocito T positivo a CD4, un linfocito T positivo a CD8, o un linfocito B comprendido en la muestra de sangre.

Si se va a determinar un componente celular del sistema inmunitario de acuerdo con el procedimiento de la presente

15 invención, dicho péptido que se va a aplicar en el procedimiento, preferentemente, consiste entre 10 y 20 aminoácidos de longitud que están presentes como una secuencia de aminoácidos contigua en la IDH1 humana y comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 118 a 132 (SEQ ID NO: 1); b) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 120 a 134 (SEQ ID NO: 2);

20 c) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 122 a 136 (SEQ ID NO: 3); d) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 124 a 138 (SEQ ID NO: 4); e) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 126 a 140 (SEQ ID NO: 5); f) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 128 a 142 (SEQ ID NO: 6); g) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 130 a 144 (SEQ ID NO: 7);

25 h) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 132 a 146 (SEQ ID NO: 8); i) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 123 a 132 (SEQ ID NO: 10); j) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 124 a 133 (SEQ ID NO: 11); k) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 125 a 134 (SEQ ID NO: 12); l) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 126 a 135 (SEQ ID NO: 13);

30 m) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 127 a 136 (SEQ ID NO: 14); n) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 128 a 137 (SEQ ID NO: 15) o) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 129 a 138 (SEQ ID NO: 16); p) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 130 a 139 (SEQ ID NO: 17); q) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 131 a 140 (SEQ ID NO: 18); y

35 r) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 132 a 141 (SEQ ID NO: 19).

El término “sujeto” como se utiliza en el presente documento se refiere a animales, preferentemente mamíferos, y más preferentemente, seres humanos. Preferentemente, el procedimiento de la presente invención se aplicará a sujetos sospechosos de padecer cualquiera de los tipos de cáncer mencionados anteriormente a la luz de síntomas clínicamente aparentes o sujetos sospechosos de padecer dicho cáncer debido al aumento de una predisposición

40 potencial.

Los péptidos adecuados comprenden al menos 10 aminoácidos de longitud que están presentes como una secuencia de aminoácidos contigua en la IDH1, en la que dichos péptidos tienen al menos un intercambio de aminoácidos de R por H en una posición correspondiente con la posición 132 se especifican en otra parte del presente documento. Los péptidos específicamente preferidos se han detallado anteriormente.

45 Poner en contacto la muestra, como se hace referencia en el presente documento se refiere a poner en contacto físico el péptido y la muestra permitiendo de esta manera la unión específica de un componente del sistema inmunitario comprendido en la muestra, o no, con el péptido. Se entenderá que poner en contacto como significa en el presente documento se lleva a cabo durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el componente se una específicamente al péptido. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, pueden ser necesarias

50 unas etapas de pre-tratamiento de manera que el componente tenga acceso y se pueda unir específicamente al péptido. Además, dependiendo del tipo de muestra, la manipulación puede ser diferente. Por ejemplo, si el componente del sistema inmunitario es un componente no celular como se ha especificado en otro sitio del presente documento, se puede obtener primero el suero o plasma de una muestra de sangre completa. Si el componente es un componente celular, puede ser necesaria la concentración y/o separación de las células apropiadas.

55 Preferentemente, el péptido que se va a poner en contacto con la muestra de sangre está inmovilizado en un soporte sólido. Preferentemente, la inmovilización permite llevar a cabo etapas de lavado que retiren la muestra de sangre tras la puesta en contacto con el fin de mejorar la sensibilidad y/o especificidad de la detección y con el fin de eliminar el ruido de fondo. Además, dicha etapa de puesta en contacto se puede llevar a cabo de manera automática, preferentemente, en una unidad de análisis de un dispositivo de la invención como se especifica en otro

60 sitio del presente documento. Sin embargo, también preferentemente, los componentes del sistema inmunitario presentes en una muestra de sangre se pueden inmovilizar y ponerlos en contacto con, por ejemplo, una solución

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Figuras

Figura 1: Respuesta inmunitaria restringida al MHC natural clase II contra IDH1 R132H en un paciente con un glioma mutado con IDH1 R132H. Ensayo ELISpot (a la izquierda) de la sangre periférica estimulada con el péptido IDH de tipo silvestre (ts) o mutado. Una mezcla de péptidos y la fitohemaglutinina (PHA) funcionaban como controles. Citometría de flujo (a la derecha) que analiza la expresión en la superficie celular de CD4 y CD8 en linfocitos T expandidos tras la estimulación con el péptido IDH1 R132H.

Figura 2: Epítopos IDH1 R132H inmunogénicos restringidos al MHC clase II en ratones humanizados MHC clase

II. La respuesta inmunitaria periférica en ratones transgénicos desprovistos del MHC clase I y II de ratón pero transgénicos para A2 y DR1 humanos tras la inmunización con los péptidos IDH1 R132H 123-142 (panel 2), 124138 (panel 2), 122-136 (panel 3) o falsamente inmunizados (panel 4) y re-estimulación ex vivo con las secuencias peptídicas IDH1 R132H indicadas. Los péptidos IDH1 123-142 de tipo silvestre, DMSO y un péptido de mielina inmunogénico restringido al MHC clase II (MOG) funcionaban como controles.

Figura 3: Respuesta de anticuerpos específicos de IDH1 R132H en ratones humanizados MHC clase II. Respuesta de anticuerpos IgG específicos de IDH1 R132H en el suero de ratones transgénicos desprovistos del MHC clase I y II pero transgénicos para A2 y DR1 humanos tras la inmunización con péptidos IDH1 R132H 123142 (azul oscuro), 124-138 (verde), 122-136 (azul claro) o falsamente inmunizados (rojo) y la unión a las secuencias peptídicas IDH1 R132H indicadas. Los péptidos IDH de tipo silvestre 122-136 y 126-140, DMSO y un péptido de mielina inmunogénico restringido a MHC clase II (MOG) funcionaban como controles.

Figura 4: Respuesta de anticuerpos específica de IDH1 R132H natural en pacientes con gliomas mutados con IDH1 R132H. Respuesta de anticuerpos IgG específicos de IDH1 R132H natural contra los péptidos IDH1 R132H 126-140 en el suero de pacientes con gliomas con IDH1 mutada, gliomas IDH1 de tipo silvestre (ts), gliomas con estado IDH1 desconocido o controles sanos. La información del haplotipo del MHC clase II y el tipo de tumor se indica cuando está disponible.

Figura 5: Especificidad de epítopo de la respuesta de anticuerpos específica de IDH1 R132H en pacientes con gliomas mutados con IDH1 R132H. Respuesta de anticuerpos IgG específicos de IDH1 R132H natural contra el tipo silvestre indicado (ts) o péptidos (RH) IDH1 R132H en el suero de cinco pacientes con IDH1 R132H (codificados por color) con gliomas con IDH1 mutada.

Figura 6: La vacunación con el péptido IDH1 R132H induce respuestas Th1 y CTL

Se inmunizaron ratones A2.DR1 con 100 µg de péptido IDH1 R132H123-142 en Montanide ISA51, 300 mg de GM-CSF y 50 µl de crema Aldara (Imiquimod al 5 %) y se reforzaron tras 14 días sin GM-CSF. Los ratones de control se trataron de la misma manera sin el péptido. Tras 14 días adicionales, se extirparon los bazos y ganglios linfáticos para el análisis. A) las células de ganglios linfáticos se estimularon con 10 µg/ml de los péptidos IDH1 R132H, IDH1 ts, péptido de control negativo (MOG), con solo el vehículo o con 200 µg/ml de lisado proteico de células GL261 tratadas con IFNg, que sobre-expresaban IDH ts o IDH1 R132H durante 38 h. Se midió la producción de IFNγ se midió por ELISpot. A la izquierda, vacunación con IDH1 R132H; derecha, vacunación con el control de vacunación. B) Se confirmó la respuesta de linfocitos T IFNγ en esplenocitos que se estimularon como en (A) y con 20 ng/ml de PMA y 1 µg/ml de ionomicina como control positivo durante 72 h. Los sobrenadantes se recolectaron y se cuantificó el IFNγ colorimétrico por triplicado en un ELISA revestido con anti-IFNγ utilizando una curva de referencia con anti-IFNγ biotinilado, estreptavidina-HRP y TMB. C) Los esplenocitos que producen IFNγ se analizaron por medio de citometría de flujo citocina. Se estimularon los esplenocitos ex vivo con IDH1 R132H123-142 o el vehículo de control, se re-estimularon con 20 ng/ml de PMA y 1 µg/ml de Ionomicina durante 5 h que incluyen el inhibidor de transporte de Golgi 5 µg/ml Brefeldin A par la inhibición de la secreción. Se tiñeron los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8, y para la tinción intracelular se permeabilizaron y fijaron y se tiñó el IFNγ. Las células se analizaron en un citómetro de flujo. Paneles superiores, ratones vacunados con IDH1 R132H; paneles inferiores, ratón vacunado con vehículo de control. Se muestran los resultados representativos de un ratón.

Figura 7: La vacunación con el péptido IDH1 R132H no induce respuestas de citocinas de Th1 ni Th17

Se inmunizaron ratones A2.DR1 con 100 µg de péptido IDH1 R132H123-142 en Montanide ISA51, 300 mg de GM-CSF y 50 µl de crema Aldara (Imiquimod al 5 %) y se reforzaron tras 14 días sin GM-CSF. Los ratones de control se trataron de la misma manera sin el péptido. Tras 14 días adicionales, se extirparon los bazos y ganglios linfáticos para el análisis. A) Los esplenocitos se estimularon con 10 µg/ml de los péptidos IDH1 R132H, IDH1 ts, péptido de control negativo (MOG), con solo el vehículo o con 20 ng/ml de PMA y 1 µg/ml de ionomicina como control positivo durante 72 h. Los sobrenadantes se recolectaron y se cuantificaron las citocinas colorimétricamente por triplicado en un ELISA revestido con anti-citocinas utilizando una curva de referencia con anticuerpo anti-citocinas biotinilado, estreptavidina-HRP y TMB. B) Los esplenocitos que producían IFNγ se analizaron por medio de citometría de flujo de la citocina. Se estimularon los esplenocitos ex vivo con IDH1 R132H123-142 o el vehículo de control, se re-estimularon con 20 ng/ml de PMA y 1 µg/ml de Ionomicina durante 5 h que incluía el inhibidor de transporte al Golgi 5 µg/ml Brefeldin A para la inhibición de la secreción. Se tiñeron

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los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD25, y para la tinción intracelular se permeabilizaron y fijaron y se tiñeron la IL4, IL17, y FoxP3. Las células se analizaron en un citómetro de flujo. Paneles superiores, ratones vacunados con IDH1 R132H; paneles inferiores, ratón vacunado con vehículo de control. Izquierda: Th2 y Th17; derecha: Treg. Se muestran los resultados representativos de un ratón.

Figura 8: La vacunación con el péptido IDH1 R132H induce la producción de IgG

Se inmunizaron ratones A2.DR1 con 100 µg de péptido IDH1 R132H123-142 en Montanide ISA51, 300 mg de GM-CSF y 50 µl de crema Aldara (Imiquimod al 5 %) y se reforzaron tras 14 días sin GM-CSF. Los ratones de control (DMSO) se trataron de la misma manera sin el péptido. Tras 14 días adicionales, se les extrajo sangre de la vena submandibular para la obtención de suero. El suero de los vacunados con IDH1 R132H y los ratones vacunados con el vehículo de control se ensayaron en cuanto a la IgG total unida a IDH1 (A) y los subtipos de IgG (B) en un ELISA revestido con el péptido IDH1 R132H o IDH1 ts utilizando anticuerpo anti-IgG acoplado con HRP y TMB.

Figura 9: La línea celular de linfocitos T CD4 es dependiente de DR MHC clase II y específica de la mutación

Se inmunizaron ratones A2.DR1 con 100 µg de péptido IDH1 R132H123-142 en Montanide ISA51, 300 mg de GM-CSF y 50 µl de crema Aldara (Imiquimod al 5 %) y se reforzaron tras 14 días sin GM-CSF. Los ratones de control se trataron de la misma manera sin el péptido. Tras 14 días adicionales, se extirparon los bazos y se estimularon con 10 µg/ml de IDH1 R132H. Para generar una línea celular de linfocitos T específica de IDH1 R132H123-142, las células se re-estimularon cada 4 semanas con esplenocitos isogénicos radiados cargados con 2 µg/ml de IDH1 R132H123-142 y ConA y se analizaron tras 3 re-estimulaciones. A) Se generaron 105 blastos de linfocitos B a partir de los esplenocitos isogénicos durante 3 días con 2 µg/ml de LPS y 7 µg/ml de dextransulfato, cargados con 0,1

o 1,0 µg/ml (A) IDH1 R132H123-142, IDH1 ts123-142, péptido de control (MOG), o con el vehículo y se utilizaron para la estimulación de 250 células de la línea celular de linfocitos T CD4+. B) La estimulación con los blastos de linfocitos B cargados con 0,1 µg/ml (A) IDH1 R132H123-142, se inhibió con 0,2 µg/ml de anticuerpos bloqueantes de HLA-A o HLA-DR. La producción de IFNγ se midió tras 38 h por ELISpot. *** p<0,005. C) La expresión de CD4 por los linfocitos T específicos de IDH1 R132H123-142 se confirmó por tinción de los marcadores de superficie CD3, CD4, y CD25 y citometría de flujo. D) Los linfocitos T específicos de IDH1 R132H123-142 se estimularon durante 5 h con 20 ng/ml de PMA y 1 µg/ml de ionomicina que incluía el inhibidor de transporte de Golgi 5 µg/ml Brefeldin A para la inhibición de la secreción. Los marcadores de superficie CD3, CDD4, y CD25 se tiñeron y para la tinción intracelular se permeabilizaron y fijaron y se tiñeron el IFNγ, IL4, IL17, y FoxP3. Las células se analizaron en un citómetro de flujo. E) Los linfocitos T específicos de IDH1 R132H123-142 se estimularon con DC isogénico (linfocitos T: DC 1:5), que se habían generalo en la médula ósea con 20 ng/ml GM-CSF durante 5 días, cargados con 4 µg/ml de IDH1 R132H123-142. Para la tinción de citocinas intracelulares, las células se trataron con 5 µg/ml de Brefeldin A para la inhibición de la secreción y se tiño para la citometría de flujo como en (D).

Figura 10: Clon de linfocito T CD4 que es dependiente de DR MHC clase II y específico de mutación

Se generaron clones de célula única a partir de la línea celular de linfocitos T CD4+ específica de IDH1 R132H123-142 y se re-estimularon cada 4 semanas con esplenocitos isogénicos radiados cargados con 2 µg/ml de IDH1 R132H123-142 y ConA. A) Se generaron 105 blastos de linfocitos B a partir de los esplenocitos isogénicos durante 3 días con 2 µg/ml de LPS y 7 µg/ml de dextransulfato, cargados con 0,1 o 1,0 µg/ml (A) de los péptidos IDH1 R132H123-142, IDH1 ts123-142, control negativo (MOG) o con el vehículo y se utilizaron para la estimulación de 2500 células del clon de linfocito T CD4+. B) La estimulación con blastos de linfocitos B cargados con 0,1 µg/ml

(A) de IDH1 R132H123-142 se inhibió con 0,2 µg/ml de anticuerpos bloqueantes de HLA-A o HLA-DR. La producción de IFNγ se midió tras 38 h por ELISpot. ** p<0,01; *** p<0,005.

Figura 11: La respuesta de IFNγ específica de IDH1 R132H en pacientes con GBM está mediada por Th-1

A) Se aislaron 107 PBMC de la sangre periférica de un paciente de GBM IDH1 R132H+ y se estimularon durante 6 h con 40 µg/ml de IDH1 R132H123-142, péptido de control negativo MOG o 1 µg/ml de Enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) como control positivo, y se aislaron las células que producían IFNγ mediante un ensayo de captura. Las células se marcaron con anticuerpo anti-IFNγ como reactivo de captura para capturar el IFNγ secretado en la superficie celular durante un periodo de secreción de 45 min. Las células se marcaron con un anticuerpo específico de IFNγ acoplado a PE y microperlas anti-PE y se ordenaron magnéticamente. Las productoras de IFNγ se tiñeron con los marcadores de superficie CD3, CD4, y CD8 por citometría de flujo, se utilizaron células negativas a IFNγ (APC) como controles. B) Se estimularon 5*105 PBMC del mismo paciente con 20 µg/ml IDH1 R132H123-142, IDH1 ts123-142 o péptido de control negativo (MOG) durante 38 h y se midió la producción de IFNγ por ELISpot. ** p<0,01. C) Se tiñeron linfocitos T infiltrados en el tumor CD3+ en tejido tumoral del mismo paciente (a la izquierda) y de un paciente con glioma anaplásico (AIII).

Figura 12: Respuesta humoral y celular contra IDH1 R132H en pacientes de glioma IDH1 R132H+

A) Los sueros de pacientes de glioma IDH1 R132H+ e IDH1 ts se ensayaron en cuanto a IgG específica de IDH1 R132H con un ELISA del péptido IDH1 R132H123-142. La placa se revistió con 1 µg del péptido IDH1 R132H123-142 por pocillo, se bloqueó con un 3 % de FBS y se incubó el suero para la unión de la IgG al péptido. Se detectó la IgG colorimétricamente con un anticuerpo anti-IgG humana acoplado a HRP y TMB.

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Claims

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