ES2644599T3

ES2644599T3 - Injertos vasculares procedentes de matrices de tejido acelular

Info

Publication number: ES2644599T3
Application number: ES13198645.7T
Authority: ES
Inventors: Hui Xu; Cunqui Cui; Joshua Czeczuga; Jared Lombardi
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2017-11-29
Anticipated expiration: 2030-08-24
Also published as: US20200101195A1; EP2756853A2; EP2756853A3; US10525164B2; EP2473208A2; AU2010289856B2; CN102481390A; WO2011028521A2; JP2013503696A; EP2756853B1; US20110054588A1; ES2449890T3; WO2011028521A3; JP5930402B2; AU2010289856A1; EP2473208B1; CA2769188A1; CN102481390B; CA2769188C

Description

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DESCRIPCION

Injertos vasculares procedentes de matrices de tejido acelular

La presente descripcion se refiere de forma general a injertos vasculares, y mas espedficamente, a injertos vasculares procedentes de matrices de tejido acelular y metodos de fabricacion de los injertos, como se define en las reivindicaciones.

Los recientes avances en los campos de la bioingeniena y la investigacion cardiovascular han llevado al desarrollo de nuevas tecnicas y materiales para la construccion de conductos vasculares para cirugfa de derivacion, reparacion de vasos sangumeos danados o enfermos y otros procedimientos vasculares. Entre los injertos vasculares se incluye una amplia variedad de construcciones sinteticas y biologicas.

A pesar de los desarrollos en la tecnologfa de injertos, la reparacion o sustitucion de estructuras vasculares sigue siendo un reto, particularmente debido a las complicaciones derivadas del uso de injertos sinteticos, tales como formacion de fistulas entericas, embolizacion distal, infeccion y oclusion del injerto, durabilidad limitada y falta de elasticidad del injerto en torno a la anastomosis y, por tanto, necesita de intervencion adicional. La aplicacion de autoinjertos para sustitucion vascular se ve obstaculizada por la limitacion dimensional de los injertos recolectados, la morbilidad del sitio donante y los costes quirurgicos asociados con la recoleccion de vasos autologos. Ademas, un numero significativo de pacientes no tienen venas adecuadas para ser injertadas debido a la existencia de enfermedades vasculares previas, extirpacion venosa o procedimientos vasculares previos.

WO2005023321 describe injertos vasculares con laminas compuestas en capas dispuestas en forma tubular, que comprenden capas de membrana basal y ECM

La presente descripcion proporciona metodos y materiales mejorados para la construccion de injertos vasculares.

En un aspecto de la presente descripcion, se proporciona un injerto vascular para el tratamiento de un vaso sangumeo danado o enfermo. El injerto vascular comprende un conducto tubular que comprende una pared tubular que es impermeable a la sangre y delimita un lumen para el paso de sangre a su traves. La pared tubular comprende una lamina de matriz de tejido acelular que tiene una membrana basal. La membrana basal forma una superficie luminal del conducto tubular.

En otro aspecto de la presente descripcion, se proporciona un metodo de formacion de un injerto vascular. El metodo comprende las etapas de aporte de una lamina de matriz de tejido acelular que tiene una membrana basal y conformacion de la lamina en un conducto tubular. La membrana basal forma una superficie luminal interna del conducto tubular.

Se entiende que tanto la descripcion general anterior como la descripcion detallada siguiente son meramente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invencion, que se define por las reivindicaciones.

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran los metodos y formas de realizacion de la invencion y, junto con la descripcion, sirven para explicar los principios de diversos aspectos de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1A muestra una forma de realizacion ejemplar de un injerto vascular para el tratamiento de un vaso sangumeo danado o enfermo;

La FIG. 1B muestra una configuracion alternativa del injerto vascular representado en la FIG. 1;

La FIG. 2A muestra otra forma de realizacion ejemplar de un injerto vascular para el tratamiento de un vaso sangumeo danado o enfermo;

La FIG. 2B muestra otra forma mas de realizacion ejemplar de un injerto vascular para el tratamiento de un vaso sangumeo danado o enfermo;

La FIG. 3 ilustra un metodo de formacion de un injerto vascular de acuerdo con ciertas formas de realizacion;

Las FIG. 4A-4H son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con hematoxilina y eosina, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 5A-5F son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion de Verhoeff Van Geison, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 6A-6F son micrograffas electronicas de barrido de injertos vasculares explantados, tal y como se

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describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 7A y 7B son micrograffas electronicas de transmision de un injerto vascular explantado y una aorta de rata, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 8A-8D son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra celulas endoteliales, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 8E-8H son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra el factor Von Willebrand, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 9A-9E son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra celulas del musculo liso, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 9F-9J son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra fibroblastos, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 10A-10L son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra celulas T, celulas B y macrofagos de rata, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 11A-11E son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra IgG de rata, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

Las FIG. 11F-11G son imagenes de secciones histologicas de injertos vasculares explantados sometidos a tincion con anticuerpos contra IgM de rata, tal y como se describe en el Ejemplo 1;

La FIG. 12 muestra los resultados de la termoestabilidad de matrices dermicas acelulares pegadas, tal y como se describe en el Ejemplo 2; y

La FIG. 13 ilustra el efecto de los biopegamentos sobre la propiedad antitrombotica de matrices dermicas acelulares recubiertas de heparina, tal y como se describe en el Ejemplo 2;

Descripcion de las formas de realizacion ejemplares

A continuacion, se hara referencia en detalle a ciertas formas de realizacion de acuerdo con la presente descripcion, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se usaran los mismos numeros de referencia en todos los dibujos para referirse a las mismas partes o a partes similares.

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural, salvo que se indique espedficamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o”, salvo que se indique lo contrario. Asimismo, el uso del termino “incluyendo”, asf como de otras formas, tales como “incluye” e “incluido” no es limitante. Ademas, terminos tales como “elemento” o “componente” abarcan ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden mas de una subunidad, salvo que se indique espedficamente lo contrario. Ademas, el uso del termino “porcion” puede incluir parte de un resto o el resto completo.

Tal y como se usa en el presente documento, el termino “matriz de tejido acelular” se refiere generalmente a cualquier matriz tisular que este sustancialmente libre de celulas y otro material antigenico. En diversas formas de realizacion, las matrices de tejido acelular procedentes de fuentes humanas o xenogenicas se pueden usar para fabricar las matrices de soporte. Se puede usar piel, partes de la piel (por ejemplo, la dermis) y otros tejidos tales como vasos sangumeos, valvulas cardfacas, fascias y tejido conectivo nervioso para crear matrices acelulares para fabricar matrices de soporte tisulares dentro del alcance de la presente descripcion.

Los tftulos de seccion usados en el presente documento sirven meramente para propositos organizativos y no se deben interpretar como limitantes del tema descrito.

En diversas formas de realizacion, se proporcionan los materiales y metodos de construccion de injertos venosos o arteriales para el tratamiento de defectos en los vasos sangumeos. En diversas formas de realizacion, los injertos vasculares se usan para la sustitucion de una parte de un vaso sangumeo danado o enfermo, por ejemplo, para la sustitucion de una porcion debilitada de la aorta, el tratamiento de vasos sangumeos danados debido a un traumatismo, el tratamiento de enfermedades vasculares causadas por afecciones medicas (por ejemplo, diabetes, enfermedades autoinmunes, etc.). En algunas formas de realizacion, los injertos vasculares se usan para la derivacion y/o sustitucion de segmentos estenoticos o parcialmente ocluidos de un vaso sangumeo, por ejemplo, los injertos de derivacion arterial coronaria y de derivacion de arterias perifericas.

En algunas formas de realizacion, un injerto vascular comprende una lamina de material conformada en un conducto tubular. La pared tubular del injerto es impermeable a la sangre a las presiones

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hemodinamicas experimentadas por los vasos sangumeos nativos. En diversas formas de realizacion, la lamina de material que forma el injerto tubular tiene la suficiente resistencia y durabilidad para su uso en aplicaciones vasculares, y las propiedades mecanicas (por ejemplo, la elasticidad) son similares a las del vaso huesped adyacente. En ciertas formas de realizacion, el revestimiento luminal del injerto es antitrombotico. En algunas formas de realizacion, la lamina de material que forma el injerto soporta la remodelacion y repoblacion tisular del injerto con las celulas huesped. En ciertas formas de realizacion, el material que forma el injerto soporta la deposicion de celulas endoteliales en la superficie luminal y la integracion de celulas del musculo liso en la pared tubular del injerto.

Una membrana basal es una fina lamina de material extracelular contigua al aspecto basilar de las celulas epiteliales. Las laminas de celulas epiteliales agregadas forman un epitelio. De este modo, por ejemplo, el epitelio de la piel se denomina epidermis y la membrana basal cutanea se encuentra entre la epidermis y la dermis. La membrana basal es una matriz extracelular especializada que aporta una funcion de barrera y una superficie de fijacion para celulas similares a las epiteliales; sin embargo, no contribuye con un papel estructural o biomecanico significativo al tejido subyacente (por ejemplo, la dermis). Entre los componentes de las membranas basales se incluyen, por ejemplo, la laminina, el colageno tipo VII y el nidogeno. La organizacion espacial y temporal de la membrana basal epitelial la distinguen de, por ejemplo, la matriz extracelular dermica.

La lamina de material incluye una matriz de tejido acelular. La matriz de tejido acelular comprende una membrana basal intacta. La membrana basal forma la superficie luminal del conducto vascular. La membrana basal proporciona una superficie luminal no porosa y continua al injerto y, por consiguiente, impide la perdida de sangre desde el lumen del injerto. Ademas, la membrana basal puede soportar el crecimiento de celulas endoteliales e impedir la trombosis. La membrana basal puede, por lo tanto, permitir la formacion de un revestimiento endotelial que impida las perdidas y/o la trombosis, pero no necesita siembra o cultivo con celulas exogenas.

La matriz de tejido acelular se puede formar a partir de varios tejidos diferentes que incluyan una membrana basal. Por ejemplo, la matriz de tejido acelular se puede formar a partir de la piel, la vejiga urinaria, el intestino, el tejido pericardico, el peritoneo o combinaciones de tejidos. Un biomaterial adecuado para la formacion de la matriz acelular procede de piel humana, tal como ALLODERM®, que esta disponible en (LifeCell Corp, Branchburg, NJ). ALLODERM® es una matriz dermica acelular humana que ha sido procesada para eliminar tanto la epidermis como las celulas que pueden llevar al rechazo del tejido y al fallo del injerto, sin danar las protemas dermicas y la membrana basal. En otra forma de realizacion ejemplar, la matriz de tejido acelular comprende una matriz pericardica generada mediante procesamiento de tejido pericardico manteniendo la integridad de la membrana basal. En otra forma de realizacion mas, la matriz de tejido acelular procede de la membrana peritoneal, que se procesa para eliminar las celulas manteniendo la membrana basal intacta. La fabricacion de matrices de tejido acelular adecuadas se describe con mas detalle a continuacion.

En diversas formas de realizacion, la superficie luminal del injerto se modifica usando agentes antitromboticos y/o anticalcificacion para inhibir la oclusion del injerto tras la cirugfa. En otras formas de realizacion, la superficie luminal del injerto vascular se trata con factores de crecimiento que mejoran la proliferacion de celulas endoteliales a lo largo de la superficie luminal.

Para conformar una lamina de matriz de tejido acelular en un tubo, se adhieren los bordes opuestos de la lamina entre sf. Los bordes se adhieren entre sf usando un adhesivo biologicamente compatible o una combinacion de suturas y al menos un adhesivo, para formar una union hermetica a los fluidos que se extiende longitudinalmente a lo largo de la longitud del injerto. En algunas formas de realizacion, los bordes de la lamina enrollada se aseguran mediante tratamiento termico y con presion. Entre las suturas adecuadas se incluyen, por ejemplo, las suturas de polipropileno (PROLENE®), y pueden ser continuas o interrumpidas. Entre los adhesivos adecuados se incluyen, por ejemplo el pegamento de fibrina, los adhesivos tisulares a base de cianoacrilato (por ejemplo, DERMABoNd®) y los adhesivos tisulares de quitosano.

La FIG. 1A muestra una forma de realizacion ejemplar de un injerto vascular 10 de acuerdo con la presente descripcion. El injerto 10 comprende una lamina de material 12 que esta enrollada en una construccion tubular que define un lumen 13 y una pared tubular 15 que tiene una superficie luminal 17 y una superficie abluminal 19. Los bordes longitudinales 14, 16 de la lamina se ponen en contacto entre sf en el lado abluminal de la construccion tubular y se adhieren usando suturas quirurgicas bioadhesivas y bioadhesivos a lo largo de la longitud del injerto. La adhesion de los bordes longitudinales 14, 16 crea un cordon longitudinal 18 que sobresale por encima de la superficie abluminal 19 y se extiende a lo largo de la longitud del injerto tubular. En una forma de realizacion, el cordon longitudinal 18 esta doblado y adherido a la superficie abluminal 19 del injerto 10, tal y como se muestra en la FIG. 1B. El cordon longitudinal 18 se asegura a la pared tubular 15 a lo largo de la longitud del injerto usando suturas, adhesivos o una combinacion de ambos.

La FIG. 2A muestra una forma de realizacion ejemplar de un injerto vascular 20 de acuerdo con la presente descripcion (que no forma parte de la invencion). El injerto 20 comprende una lamina de material

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22 que esta enrollada en una estructura tubular que define un lumen 23. La lamina de material 22 forma una pared tubular 21 que tiene una superficie luminal 27 y una superficie abluminal 29. La lamina 22 comprende un primer borde longitudinal 24 y un segundo borde longitudinal 26 en los extremos opuestos de la lamina 22. Cuando la lamina 22 se enrolla en un tubo, el segundo borde longitudinal 26 se extiende por encima del primer borde 24 para definir una region solapada multicapa 25 que se extiende entre el primer borde 24 y el segundo borde 26. La region solapada 25 se sella a lo largo de la longitud del injerto usando suturas y/o adhesivos. En ciertas formas de realizacion, el intervalo de solapamiento es de al menos el 10% de la anchura de una lamina individual de material.

Se pueden formar injertos vasculares adecuados usando varias tecnicas. Generalmente, los injertos se fabricaran en base a un tamano, una longitud y unos requisitos biomecanicos deseados y necesarios para una determinada ubicacion del implante seleccionada. Por ejemplo, un injerto disenado para su uso como injerto vascular aortico, generalmente tendra un tamano y unas propiedades biomecanicas (por ejemplo, resistencia al estallido) superiores a las necesarias para otra ubicacion, que experimente presiones inferiores y transporte menos flujo de sangre.

En diversas formas de realizacion, el espesor de la lamina de material es consistente con el espesor de pared de un vaso sangumeo que se vaya a sustituir por el injerto vascular. En ciertas formas de realizacion, la lamina de material se dimensiona de forma que concuerde con el espesor de pared de un vaso sangumeo nativo.

En algunas formas de realizacion, los injertos se pueden formar enrollando una lamina de material a un tamano predeterminado (es decir, el diametro luminal). En algunas formas de realizacion, tal y como se ilustra en la Fig. 3, se puede formar un injerto vascular envolviendo una lamina de biomaterial 32 alrededor de la superficie exterior de un vastago o tubo cilmdrico 30. Una seccion longitudinal de la lamina 34 se dobla alrededor de un vastago cilmdrico 30. En una forma de realizacion, se coloca un vastago de bloqueo 35 paralelo al vastago cilmdrico 30, tal y como se muestra en la FIG. 3, para bloquear la seccion 34 contra el vastago cilmdrico. Tambien se puede usar una sutura tensa entre dos soportes para bloquear la seccion 34 contra el vastago cilmdrico. A continuacion, se enrolla el vastago al menos 360° en torno a un eje longitudinal 31 del vastago para envolver la lamina de material alrededor de la superficie exterior del vastago. En una forma de realizacion, la lamina 32 se envuelve alrededor del vastago multiples veces para formar un injerto multicapa. Una vez que la lamina esta envuelta alrededor del vastago cilmdrico, el borde externo 36 de la lamina se asegura a una capa subyacente de lamina, tal y como se ilustra en la FIG. 2 (que no forma parte de la invencion).

En una forma de realizacion, se adhieren tiras adhesivas 38 a la lamina 32 en multiples posiciones a lo largo del ancho de la lamina, tal y como se muestra en la FIG. 3. En tal forma de realizacion, las tiras adhesivas 38 unen la lamina 32 a una capa subyacente de material a medida que la lamina se envuelve alrededor del vastago cilmdrico 30.

El diametro interno del injerto tubular es sustancialmente igual al diametro externo del vastago o tubo cilmdrico 30. Por lo tanto, el diametro del vastago o tubo se selecciona de forma que coincida con el diametro luminal del vaso sangumeo nativo que se va a sustituir por la construccion de injerto. En una forma de realizacion, el diametro del vastago es de aproximadamente entre 4-5 mm, el cual se usa para la construccion de injertos vasculares de diametro pequeno (< 6 mm). En otra forma de realizacion, el espesor de pared del tubo es de 1 mm. Una vez que se ha envuelto la lamina alrededor del vastago y se ha(n) asegurado el(los) borde(s) longitudinal(es), el vastago se retira del interior de la lamina enrollada. En otra forma de realizacion, el tubo se estira longitudinalmente para deslizar la lamina fuera del tubo. El material del vastago cilmdrico se selecciona de tal forma que inhiba la adhesion de la lamina a la superficie exterior del vastago. En una forma de realizacion ejemplar, el vastago cilmdrico usado es un vastago de vidrio. En otra forma de realizacion, el tubo cilmdrico usado es un tubo de goma. En otra forma mas de realizacion, el tubo usado es un tubo de silicona.

Matrices de tejido acelular adecuadas

En algunas formas de realizacion, las matrices de tejido acelular adecuadas pueden, por ejemplo, retener ciertas funciones biologicas, tales como el reconocimiento celular, la union celular y la capacidad de soportar la propagacion celular, la proliferacion celular, la integracion celular y la diferenciacion celular. Tales funciones se pueden aportar, por ejemplo, mediante protemas colaginosas no desnaturalizadas (por ejemplo, colageno tipo I) y una variedad de moleculas no colaginosas (por ejemplo, protemas que sirvan como ligandos para moleculas tales como receptores de integrinas, moleculas con alta densidad de carga tales como glucosaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano) o proteoglicanos u otras adhesinas). En algunas formas de realizacion, las matrices de tejido acelular pueden retener ciertas funciones estructurales, entre las que se incluyen el mantenimiento de la arquitectura histologica y el mantenimiento de la disposicion tridimensional de los componentes tisulares. Las matrices de tejido acelular descritas en el presente documento tambien pueden, por ejemplo, exhibir caractensticas ffsicas deseables tales como resistencia, elasticidad, y durabilidad, porosidad definida y retencion de macromoleculas. Las matrices de tejido acelular adecuadas pueden ser entrecruzadas o no entrecruzadas.

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En algunas formas de realizacion, el material de injerto es susceptible de ser remodelado mediante infiltracion de celulas, tales como celulas diferenciadas del tejido huesped relevante, celulas madre tales como celulas madre mesenquimales o celulas progenitoras. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante formacion del material de matriz injertado a partir de tejido identico al tejido huesped circundante, pero tal identidad no es necesaria.

Tal remodelacion puede estar dirigida por los componentes de la matriz de tejido acelular y las senales procedentes del tejido huesped circundante (tales como citoquinas, componentes de la matriz extracelular, estfmulos biomecanicos y estfmulos bioelectricos) anteriormente descritos. Por ejemplo, la presencia de celulas madre mesenquimales en la medula osea y la circulacion periferica se ha documentado en la bibliograffa y han demostrado regenerar una variedad de tejidos musculoesqueleticos [Caplan (1991) J. Orthop. Res. 9:641-650; Caplan (1994) Clin. Plast. Surg. 21:429-435; y Caplan et al. (1997) Clin Orthop. 342:254-269]. Ademas, el injerto debena aportar cierto grado (superior al valor umbral) de resistencia a la traccion y resistencia biomecanica durante el procedimiento de remodelacion.

Las matrices de tejido acelular se pueden fabricar a partir de una variedad de tejidos de partida. Por ejemplo, la matriz de tejido acelular se puede producir a partir de cualquier tejido blando que contenga colageno y un esqueleto muscular (por ejemplo, dermis, fascias, pericardio, dura, cordones umbilicales, placenta, valvulas cardfacas, ligamentos, tendones, tejido vascular (arterias y venas tales como las venas safenas), tejido conectivo neural, tejido de la vejiga urinaria, tejido del ureter o tejido intestinal), siempre y cuando la matriz retenga las propiedades anteriormente descritas.

Aunque una matriz de tejido acelular se puede hacer a partir de uno o mas individuos de la misma especie como receptores del injerto de matriz de tejido acelular, esto no es necesariamente el caso. Por tanto, por ejemplo, una matriz de tejido acelular se puede hacer a partir de tejido porcino y se puede implantar en un paciente humano. Entre las especies que pueden servir como receptores de matrices de tejido acelular y como donantes de tejidos u organos para la fabricacion de la matriz de tejido acelular se incluyen, sin limitacion, los humanos, los primates no humanos (por ejemplo, los monos, los babuinos o los chimpances), los cerdos, las vacas, los caballos, las cabras, las ovejas, los perros, los gatos, los conejos, los conejillos de indias, los jerbos, los hamsteres, las ratas o los ratones. Resultan de particular interes como donantes los animales (por ejemplo, cerdos) que han sido modificados mediante ingeniena genetica para que no tengan el resto a-galactosa terminal. Para consultar descripciones de animales apropiados, vease la solicitud de Estados Unidos pendiente de tramitacion con numero de serie 10/896.594 y la patente de Estados Unidos No. 6.166.288, cuyas descripciones se incluyen como referencia en su totalidad en el presente documento.

En algunas formas de realizacion, LifeCell Corporation (Branchburg, NJ) fabrica una matriz de tejido acelular secada por congelacion a partir de dermis humana y la comercializa en forma de laminas pequenas como ALLODERM®. El crioprotector usado para la congelacion y secado del ALLODERM® es una solucion de maltodextrina al 35% y etilendiaminotetracetato (EDTA) 10 mM. Por tanto, el producto final secado contiene aproximadamente un 60% en peso de matriz de tejido acelular y aproximadamente un 40% en peso de maltodextrina. LifeCell Corporation tambien fabrica un producto analogo hecho de dermis porcina (denominado XENODERM) que tiene las mismas proporciones de matriz de tejido acelular y maltodextrina que el ALLODERM®.

Como alternativa al uso de tales animales disenados por ingeniena genetica como donantes, se pueden tratar tejidos y organos apropiados, antes o despues de su descelularizacion, con la enzima a- galactosidasa, que elimina los restos a-galactosa terminales (a-gal) de las cadenas de sacaridos de, por ejemplo, las glicoprotemas. Metodos de tratamiento de tejidos con a-galactosidasa para eliminar estos restos se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.331.319.

En una implementacion, bien antes o bien despues de que se hayan matado las celulas de la matriz de tejido acelular, el material que contiene colageno se somete a digestion in vitro del material que contiene colageno con una o mas glucosidasas, y particularmente galactosidasas, tales como la a-galactosidasa. En particular, se eliminan los epftopos a-gal mediante tratamiento enzimatico con a-galactosidasas.

Los residuos de N-acetilactosamina son epftopos que normalmente se expresan en las celulas humanas y de mairftferos y, por tanto, no son inmunogenicos. La digestion in vitro del material que contiene colageno con glucosidasas se puede lograr mediante diversos metodos. Por ejemplo, el material que contiene colageno se puede empapar o incubar en una solucion tamponada que contenga glucosidasa. Alternativamente, una solucion tamponada que contenga la glucosidasa se puede forzar a presion al interior del material que contiene colageno mediante un procedimiento de lavado pulsatil.

La eliminacion de los epftopos a-gal del material que contiene colageno puede disminuir la respuesta inmunitaria frente al material que contiene colageno. El epftopo a-gal se expresa en mairftferos no primates y en monos del Nuevo Mundo (monos de Sudamerica), asf como en macromoleculas tales como los proteoglicanos de los componentes extracelulares. U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988). Sin embargo, este epftopo esta ausente en los primates del Viejo Mundo (monos de Asia y Africa y simios) y los humanos. Id. Los anticuerpos anti-gal se producen en humanos y primates como resultado de una

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respuesta inmune a estructuras de carbohidratos de epftopo a-gal de bacterias gastrointestinales. U. Galili et al., Infect. Immun. 56: 1730 (1988); R. M. Hamadeh et al., J. Clin. Invest. 89: 1223 (1992).

Como los mamfteros que no son primates (por ejemplo, los cerdos) producen epftopos a-gal, el xenotrasplante mediante inyeccion de material que contiene colageno de estos mamferos en primates deriva, con frecuencia, en rechazo debido a la union de anti-gal de primate a estos epftopos en el material que contiene colageno. Esta union tiene como resultado la destruccion del material que contiene colageno por fijacion del complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. U. Galili et al., Immunology Today 14: 480 (1993); M. Sandrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11391 (1993); H. Good et al., Transplant. Proc. 24: 559 (1992); B. H. Collins et al., J. Immunol. 154: 5500 (1995). Asimismo, el xenotrasplante provoca una activacion importante del sistema inmune para producir mayores cantidades de anticuerpos anti-gal de alta afinidad. Por consiguiente, la eliminacion sustancial de los epftopos a-gal de las celulas y los componentes extracelulares del material que contiene colageno y la prevencion de la reexpresion de epftopos a-gal celulares pueden disminuir la respuesta inmune frente al material que contiene colageno asociada a la union del anticuerpo anti-gal a los epftopos a-gal.

Las matrices de tejidos acelulares adecuadas para su uso en la presente descripcion se pueden fabricar mediante una variedad de metodos, siempre y cuando su fabricacion de lugar a matrices con las propiedades biologicas y estructurales anteriormente descritas. En general, las etapas implicadas en la fabricacion de una matriz de tejido acelular incluyen la recoleccion del tejido de un donante, por ejemplo, un cadaver humano o de cualquiera de los mamfferos anteriormente citados), el tratamiento qmmico para estabilizar el tejido y evitar la degradacion estructural y bioqmmica junto con, o seguido de, la eliminacion celular en condiciones que preserven de manera similar la funcion estructural y biologica. La solucion estabilizante inicial detiene e impide la degradacion osmotica, hipoxica, autolftica y proteolftica, protege frente a la contaminacion microbiana y reduce el dano mecanico que se puede producir con tejidos que contengan, por ejemplo, componentes del musculo liso (por ejemplo, vasos sangumeos). La solucion estabilizante puede contener un tampon apropiado, uno o mas antioxidantes, uno o mas agentes oncoticos, uno o mas antibioticos, uno o mas inhibidores de proteasas y, en algunos casos, un relajante del musculo liso. En algunas formas de realizacion ejemplares, el tejido recolectado (por ejemplo, tejido dermico) se trata con una solucion qmmica desepitelizante para eliminar el epitelio de la muestra de tejido. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, se empapa una muestra que comprende tejido dermico humano o porcino durante toda la noche en una solucion de NaCl 1 M a temperatura ambiente para eliminar la capa epitelial. En ciertas formas de realizacion, la concentracion de la solucion de NaCl se aumenta a 1,5 M para garantizar la eliminacion completa de la capa epitelial.

A continuacion, se coloca el tejido en una solucion de descelularizacion para eliminar las celulas viables (por ejemplo, celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas del musculo liso y fibroblastos) de la matriz estructural sin danar el complejo de la membrana basal ni la integridad biologica y estructural de la matriz de colageno. La solucion de descelularizacion puede contener un tampon apropiado, sal, un antibiotico, uno o mas detergentes (por ejemplo, TRITON X-100™, desoxicolato sodico, monooleato de polioxietilen(20)sorbitano), uno o mas agentes para impedir el entrecruzamiento, uno o mas inhibidores de proteasas y/o una o mas enzimas. En algunas formas de realizacion, la solucion de descelularizacion comprende un 1% de TRITON X-100™ en un medio de RPMI con gentamicina y EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) 25 mM. En algunas formas de realizacion, el tejido se incuba en la solucion de descelularizacion durante toda la noche a 37°C con agitacion suave a 90 rpm. En ciertas formas de realizacion, se pueden usar detergentes adicionales para eliminar la grasa de la muestra de tejido. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, se anade desoxicolato sodico al 2% a la solucion de descelularizacion para el tratamiento de las membranas peritoneales.

Despues del proceso de descelularizacion, la muestra de tejido se lava a fondo con solucion salina. En algunas formas de realizacion ejemplares, por ejemplo, cuando se usa material xenogenico, a continuacion, se trata el tejido descelularizado durante toda la noche a temperatura ambiente con una solucion de desoxirribonucleasa (ADNasa). En algunas formas de realizacion, la muestra de tejido (por ejemplo, peritoneo y tejido pericardico) se trata con una disolucion de ADNasa preparada en tampon ADNasa (HEPES (acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico) 20 mM, CaCl2 20 mM y MgCh 20 mM). Opcionalmente, se puede anadir una solucion de antibiotico (por ejemplo, gentamicina) a la solucion de ADNasa.

Despues de lavar el tejido a fondo con solucion salina para eliminar la solucion de ADNasa, la muestra de tejido se puede someter a uno o mas tratamientos enzimaticos para eliminar cualquier antfgeno inmunogenico presente en la muestra. Como se ha indicado anteriormente, la muestra de tejido se puede tratar con una enzima a-galactosidasa para eliminar los epftopos a-gal presentes en el tejido. En algunas formas de realizacion, la muestra de tejido se trata con a-galactosidasa a una concentracion de 300 U/L preparada en tampon fosfato 100 mM a pH 6,0. En otras formas de realizacion, la concentracion de a- galactosidasa se incrementa a 400 U/L para que se produzca una eliminacion adecuada de los epftopos a-gal del tejido recolectado (por ejemplo, en el tratamiento de tejidos dermicos procedentes de porcino).

Tras la eliminacion completa de los componentes celulares muertos y/o lisado, de los antfgenos que

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pueden provocar inflamacion y de cualquier agente de eliminacion celular bioincompatible, la matriz se puede tratar con un agente de criopreservacion y se puede criopreservar y, opcionalmente, secar por congelacion otra vez en las condiciones necesarias para mantener las propiedades biologicas y estructurales de la matriz descritas. Despues de la criopreservacion o secado por congelacion, la matriz de tejido acelular se puede descongelar o rehidratar, respectivamente. Generalmente, todas las etapas se llevan a cabo en condiciones asepticas, preferentemente esteriles.

Una vez que se ha formado la matriz de tejido acelular, opcionalmente, se pueden sembrar celulas viables e histocompatibles en la matriz de tejido acelular para fabricar un injerto que posteriormente pueda ser remodelado por el huesped. En una forma de realizacion, las celulas viables e histocompatibles se pueden anadir a las matrices mediante tecnicas estandar de cocultivo celular in vitro antes de su trasplante, o mediante repoblacion in vivo despues de su trasplante. La repoblacion in vivo se puede hacer mediante migracion de las propias celulas del receptor a la matriz de tejido acelular o mediante infusion o inyeccion in situ de celulas obtenidas a partir del receptor o celulas histocompatibles de otro donante en la matriz de tejido acelular.

Los tipos de celulas seleccionados para su reconstitucion pueden depender de la naturaleza del tejido u organo cuya matriz de tejido acelular se esta remodelando. Por ejemplo, las celulas endoteliales son importantes para la reconstitucion de conductos vasculares. Tales celulas revisten la superficie interna del tejido y se pueden expandir en cultivo. Las celulas endoteliales pueden proceder directamente del paciente receptor previsto o de venas o arterias umbilicales, y se pueden usar para reconstituir una matriz de tejido acelular y la composicion resultante se puede injertar al receptor. Alternativamente, se pueden anadir celulas cultivadas (autologas o alogenicas) a la matriz de tejido acelular. Tales celulas se pueden, por ejemplo, hacer crecer en condiciones estandar de cultivo tisular y, a continuacion, anadir a la matriz de tejido acelular. En otra forma de realizacion, las celulas se pueden hacer crecer en y/o sobre una matriz de tejido acelular en un cultivo tisular. Las celulas que han crecido en y/o sobre una matriz de tejido acelular en un cultivo tisular se pueden obtener directamente de un donante apropiado (por ejemplo, el receptor previsto o un donante alogenico) o se pueden hacer crecer primero en un cultivo tisular en ausencia de la matriz de tejido acelular.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para dar una explicacion mejor de diversas formas de realizacion y no se deben interpretar en ningun modo como limitantes del alcance de la presente descripcion.

Ejemplo 1. Estudio funcional de injertos vasculares procedentes de matrices dermicas

Se formaron injertos vasculares usando ALLODERM®, que es una matriz dermica acelular humana (HADM, por sus siglas en ingles) disponible en LifeCell Corporation (Branchburg, NJ). La HADM se proporciono en laminas de un espesor comprendido entre 0,3-0,5 mm. La HADM se empapo en solucion salina durante 30 min y, a continuacion, se corto en una seccion de 0,5 x 1,5 cm. La HADm ALLODERM® incluye una membrana basal intacta y las secciones de HADM se enrollaron en tubos con la membrana basal a lo largo de la superficie luminal del tubo. Los tubos se suturaron a lo largo del borde de union para crear una construccion de tubo de una unica capa.

A continuacion, se ensayaron los injertos vasculares en un modelo de sustitucion de aorta abdominal de rata. Se anestesio a veinte ratas de Lewis macho adultas (9-11 semanas de edad) con 40 mg/kg de pentobarbital intraperitoneal y se realizo una incision en la lmea media abdominal de cada rata. Se extirpo un segmento de 1 cm de la aorta abdominal, desde debajo de las arterias renales hasta justo encima de la bifurcacion aortica, a traves de la incision en la lmea media. El segmento arterial extirpado se sustituyo por un injerto vascular procedente de HADM. Los injertos se implantaron en posicion ortotopica, con anastomosis de extremo a extremo usando suturas interrumpidas de nylon 9-0. La calidad del injerto y el grado de cicatrizacion del sitio de implantacion se registraron en cuatro puntos de valoracion del estudio (1, 3, 6 y 12 meses). Se sacrificaron cinco animales en cada punto de valoracion. Se extirpo 1 cm del injerto vascular y 0,5 cm de material de tejido huesped mas alla de las anastomosis (longitud total del explante de 2 cm) de cada animal sacrificado, junto con una muestra del bazo y el nodulo linfatico. Las secciones explantadas se usaron para analisis de histologfa, inmunohistoqmmica, MEB (microscopfa electronica de barrido) y MET (microscopfa electronica de transmision). Las muestras extirpadas, que representan la porcion media del injerto y la interfaz injerto-tejido huesped, se colocaron en formalina al 10% o glutaraldehfdo al 8% (para analisis MEB y MET) para su fijacion y posterior analisis.

Observacion clinica

Todos los animales que recibieron el injerto vascular tuvieron una recuperacion posquirurgica normal y se mantuvieron o ganaron peso durante el periodo de estudio, de forma similar a los animales no operados. Catorce animales sobrevivieron hasta su fecha de sacrificio predeterminada sin indicios clmicos de fallo del implante, que se evidenciaban por limitacion del movimiento de las piernas y cambios patologicos en las piernas. Un animal murio cuatro dfas despues de la implantacion debido a hemorragia interna. No hubo evidencia alguna de infeccion en el sitio quirurgico de ningun animal durante el estudio. La observacion general de los injertos vasculares explantados no evidencio estenosis, aneurisma, hiperplasia, dehiscencia de las suturas ni formacion de trombos. Ademas, la mayona de los injertos

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explantados teman superficies luminales lisas y no se observaron indicios de calcificacion. Dos de los injertos (explantados a los 6 y 12 meses) mostraron areas mas ngidas que la estructura vascular normal, que sugenan calcificacion vascular. Todos los injertos se integraron bien con la aorta nativa de rata en el sitio de anastomosis.

Histologia

Las secciones de injerto explantadas se procesaron con tincion H&E (hematoxilina y eosina) y tincion Verhoeff Van Geison. La tincion H&E de una seccion transversal de injerto representativa a los 3 meses (FIG. 4A y 4B) y a los 12 meses (FIG. 4C-4G) demostro la presencia de fibroblastos poblando los injertos y de unas pocas celulas endoteliales revistiendo la superficie luminal de los injertos. Las FIG. 4A-4E son secciones transversales de tinciones H&E tomadas en la porcion media de los injertos; las FIG. 4F y 4G son secciones transversales de tinciones H&E tomadas en el sitio de anastomosis y la FIG. 4H es una tincion H&E de un injerto que nunca se implanto y se uso como control en el estudio.

La histologfa del sitio de anastomosis extirpado mostro una integracion tisular completa y una transicion suave del injerto al vaso sangumeo huesped. Se observo una leve infiltracion de celulas inflamatorias al cabo de 1 mes, pero el nivel disminuyo a lo largo del tiempo y a los 3 meses no se observaron celulas inflamatorias, lo que indica que no se produjo inflamacion cronica inducida por los injertos implantados.

Las FIG. 5A y 5B muestran secciones transversales de tinciones de Verhoff tomadas en la porcion media de los injertos; las FIG. 5C y 5D muestran secciones transversales de tinciones de Verhoff tomadas en el sitio de anastomosis, la FIG. 5E muestra la tincion de Verhoff de una aorta normal de rata y la FIG: 5F muestra un injerto vascular preimplante usado como control. La tincion de Verhoff de las secciones transversales del injerto indico que la neomedia era rica en colageno y que las celulas paredan presentar una amplia deposicion de elastina.

Analisis MEB y MET

Las FIG. 6A-6F son micrograffas MEB de injertos vasculares fabricados tal y como se describe anteriormente. Las MEB de injertos preimplante no mostraron estructuras celulares en la superficie de la membrana basal, tal y como se muestra en la FIG. 6A. Los injertos vasculares explantados a 1 mes teman celulas endoteliales en sus superficies luminales (FIG. 6B) y a los 3 meses, las celulas de tipo endotelial cubnan completamente la superficie luminal (FIG. 6C). La interfaz del injerto y la aorta de rata mostraba la anastomosis intacta, tal y como se muestra en la FIG. 6D. La superficie del injerto a los 3 meses (FIG. 6E) estaba cubierta completamente de celulas y era indistinguible de la superficie de la aorta de rata (FIG. 6F).

De forma similar, las micrograffas MET de injertos vasculares representativos al cabo de 1 mes (FIG. 7A) mostraban celulas endoteliales planas con membrana basal (MB) adjunta revistiendo el lumen del injerto. Tambien se vefan claramente en las imagenes MET celulas del musculo liso (CML) con microfilamentos y cuerpos densos. En las micrograffas MET se observo el material de tincion oscura a lo largo de la superficie de las celulas del musculo liso, lo que es representativo de la formacion de fibras elasticas, aunque las fibras elasticas formadas eran inmaduras en comparacion con la lamina elastica interna (LEI) que se observa en la imagen MET de una aorta normal de rata (FIG. 7B).

Inmunotincion

El desarrollo de celulas endoteliales en la superficie luminal de los injertos se confirmo usando tincion de las celulas endoteliales y tincion vWF (factor de Von Willebrand). Se usaron anticuerpos espedficos contra celulas endoteliales de rata y el vWF para identificar la deposicion de celulas endoteliales en la superficie del lumen. Se observaron celulas endoteliales a 1 mes, pero no cubnan totalmente el lumen, tal y como se muestra en la FIG. 8A. Se observo deposicion significativa de celulas endoteliales a los 3 meses, 6 meses y 12 meses, tal y como se muestra en las FIG. 8B, 8C y 8D, respectivamente. La tincion inmunohistologica mediante vWF mostro que la totalidad de la superficie del injerto estaba revestida de endotelio, tal y como se muestra en las FIG. 8E-8H.

La repoblacion del injerto vascular con celulas del musculo liso y fibroblastos se verifico mediante tincion con anticuerpos espedficos contra a-actina y a-vimectina del musculo liso, respectivamente. Tambien se realizo tincion de secciones transversales de aorta abdominal de rata con anticuerpos contra a-actina del musculo liso y fibroblastos para su uso como control (FIG. 9A y 9F, respectivamente). Los injertos a 1 mes (FIG. 9B y 9G), 3 meses (FIG. 9C y 9H), 6 meses (FIG. 9D y 9I) y 12 meses (FIG. 9E y 9J) mostraron que la repoblacion del injerto con celulas del musculo liso y fibroblastos empezaba 1 mes despues de la implantacion.

Respuesta inmune e inflamatoria

Se realizo tincion de las secciones explantadas con anticuerpos anti-celulas T, celulas B y macrofagos de rata para identificar la respuesta inflamatoria del huesped frente al injerto implantado. Las FIG. 10A-10D representan los injertos con tincion con anticuerpos anti-celulas T de rata a 1 mes, 3 meses, 6 meses y 12 meses, respectivamente. De forma similar, las FIG. 10E-10H representan injertos con tincion con

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anticuerpos contra celulas B y las FIG. 10I-10L representan injertos con tincion con anticuerpos contra macrofagos. Se encontro que los tres tipos de celulas inflamatorias se infiltraban en los injertos implantados moderadamente al cabo de 1 mes, pero no se detecto infiltracion de celulas inflamatorias en la neomedia. Las celulas inflamatorias disminman significativamente a los 3 meses y las que se observaban estaban principalmente cerca de la periferia del injerto. No se observaron celulas inflamatorias despues de 6 meses.

De forma similar, se vio un nivel moderado de anticuerpo IgG en los injertos durante los 3 primeros meses, pero no en la neomedia. El IgG de rata (FIG. 11A-11E) y el IgM de rata (FIG. 11F-11J) unidos a los injertos vasculares se examinaron al cabo de 1 mes (FIG. llA y 11F), 3 meses (FIG. 11B y 11G), 6 meses (FIG. 11C y 11H) y 12 meses (FIG. 11D y 11I). Se uso como control aorta abdominal de rata (FIG. 11E y 11J). Tal y como se muestra en las FIG. 11A-11D, se descubrio un nivel moderado de anticuerpo IgG en el injerto durante los 3 primeros meses. Despues de 3 meses, el nivel de IgG disminuyo significativamente. No se encontro deposicion de IgM en ningun injerto durante el estudio.

Ejemplo 2. Evaluacion de la resistencia mecanica, la termoestabilidad y el efecto trombotico de injertos vasculares formados usando bioadhesivos.

Para este estudio se usaron injertos vasculares procedentes de matriz dermica acelular humana (HADM). Se enrollaron laminas de HADM en construcciones tubulares y los bordes de la lamina se adhirieron usando pegamento de fibrina. Se ensayo la resistencia al estallido de los injertos usando la prueba de estallido (Instituto Nacional Estadounidense de Estandares (ANSI) de codigo: ANSI/AAMI/ISO 7198:1998/2001/®2004). Se calculo que la resistencia al estallido maxima era de 1.639 ± 432 mmHg (n=2), lo que indicaba que los injertos vasculares formados usando bioadhesivos eran lo suficientemente fuertes como para mantener las presiones sangumeas fisiologicas.

Se determinaron las temperaturas de inicio de la desnaturalizacion del colageno en las matrices dermicas mediante calorimetna diferencial de barrido (CDB). Tal y como se muestra en la grafica de la FIG. 12, la temperatura de desnaturalizacion del colageno de los injertos vasculares pegados es mas favorable que la de las matrices dermicas acelulares humanas. La grafica incluye datos correspondientes a la temperatura de inicio de la desnaturalizacion de HADM no tratado, e injertos vasculares formados mediante pegado de HADM con DERMABOND®, adhesivos a base de fibrinogeno y quitosano. Los datos de este experimento indican que los bioadhesivos no alteraron las propiedades bioqmmicas de la matriz.

Se evaluo la eficacia de los agentes antitromboticos (por ejemplo, heparina) en injertos vasculares pegados usando un metodo de formacion de coagulos. Se llevo a cabo el recubrimiento de heparina mediante suspension de los injertos vasculares en una solucion salina de heparina sodica al 0,4% durante 24 horas a temperatura ambiente. Se anadieron 200 pl de sangre y 12,5 pl de CaCl2 100 mM a la superficie luminal de secciones de los injertos vasculares de 1 cm2 y, a continuacion, las secciones del injerto se colocaron en una incubadora durante 1 hora a 37°C con un 5% de CO2. Se eliminaron todos los coagulos visibles de la superficie con pinzas y se colocaron en un tubo, liofilizaron y pesaron. Tal y como se muestra en la grafica de la FIG. 13, la propiedad antitrombotica de la heparina no se ve afectada cuando la heparina entra en contacto con un bioadhesivo. La grafica incluye datos que corresponden al peso de coagulos sangumeos formados en HADM sin tratar, HADM tratada con heparina (HADM + Hep), pegamento de fibrinogeno (FG) y HADM tratada tanto con heparina como con adhesivo de fibrinogeno (HADM + FG + Hep). Tal y como se muestra en la grafica, la cantidad de coagulo sangumeo formado en la HADM tratada tanto con heparina como con pegamento de fibrinogeno resultaba favorable en comparacion con los datos de coagulo sangumeo procedentes de la HADM tratada con heparina, lo que indicaba que el pegamento de fibrinogeno no interfena con la funcion antitrombotica del recubrimiento de heparina de las matrices dermicas.

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REIVINDICACIONES

1. Injerto vascular, que comprende:

un conducto tubular que comprende una pared tubular, pared tubular que define un lumen para el paso de sangre a su traves y

donde la pared tubular comprende una matriz de tejido acelular que tiene una membrana basal, membrana basal que forma una superficie luminal de la pared tubular donde un primer borde longitudinal de la matriz de tejido acelular esta adherida a un segundo borde longitudinal de la matriz de tejido acelular con un adhesivo para formar una union hermetica a los fluidos que se extiende a lo largo de la longitud del injerto, donde la adhesion del primer y segundo bordes longitudinales crea un cordon longitudinal que sobresale de una superficie abluminal de la pared tubular.
2. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde el primer y segundo bordes se adhieren usando una combinacion de suturas y al menos un adhesivo.
3. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde la matriz de tejido acelular comprende una matriz dermica.
4. El injerto vascular de la reivindicacion 3, donde la matriz dermica procede de piel humana.
5. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde la matriz de tejido acelular comprende una matriz de tejido pericardico.
6. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde la matriz de tejido acelular comprende una membrana peritoneal.
7. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde la matriz de tejido acelular procede de tejido que es xenogenico para un receptor humano.
8. El injerto vascular de la reivindicacion 7, donde el tejido proviene de un cerdo deficiente en a1,3- galactosiltransferasa (a-1,3GT).
9. El injerto vascular de la reivindicacion 1, donde la matriz de tejido acelular procede de tejido que es alogenico para un receptor humano.
10. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde la membrana basal ademas comprende al menos un agente antitrombotico.
11. El dispositivo de la reivindicacion 10, donde el agente antitrombotico comprende heparina.