ES2644606T3 - Compuestos bicíclicos de fenil amino pirimidina y usos de los mismos - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Compuestos bidclicos de fenil amino pirimidina y usos de los mismos Campo
La presente invencion se refiere a compuestos bidclicos de fenil amino pirimidina que son inhibidores de protema quinasas, que incluyen quinasas JAK. En particular los compuestos son activos contra quinasas JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Los inhibidores de quinasa se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmicas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
Antecedentes
Las JAK son quinasas que fosforilan un grupo de protemas llamado transduccion de senal y activadores de transcripcion o STATS. Cuando se fosforilan, los STAT se dimerizan, se translocan al nucleo y activan la expresion de genes que conducen a, entre otras cosas, la proliferacion celular.
La funcion central desempenada por la familia JAK de protema tirosina quinasas en la regulacion dependiente de citoquinas tanto de la proliferacion como la funcion final de diversos tipos de celulas importantes indica que los agentes capaces de inhibir las quinasas JAK son utiles en la prevencion y el tratamiento quimioterapeutico de estados de enfermedad dependientes de estas enzimas. Inhibidores potentes y espedficos de cada uno de los cuatro miembros de la familia JAK actualmente conocidas proporcionaran un medio para inhibir la accion de las citoquinas que llevan a enfermedades inmunologicas y enfermedades inflamatorias y enfermedades hiperproliferativas como el cancer.
Los trastornos mieloproliferativos (MPD) incluyen, entre otros, policitemia vera (PV), mielofibrosis primaria, trombocitemia, trombocitemia esencial (ET), mielofibrosis idiopatica (IMF), leucemia mielogena cronica (CML), mastocitosis sistemica (SM), leucemia neutrofflica cronica (CNL), smdrome mielodisplasico (MDS) y enfermedad sistemica de mastocitos (SMCD). JAK2 es un miembro de la familia de quinasas JAK en la que se ha encontrado una mutacion espedfica (JAK2V617F) en el 99% de pacientes con policitemia vera (PV) y 50% de la trombocitopenia esencial (ET) y mielofibrosis idiopatica (MF). Se considera que esta mutacion activa JAK2, dando peso a la proposicion de que un inhibidor de JAK2 sera util en el tratamiento de estos tipos de enfermedades.
El asma es un trastorno complejo que se caracteriza por inflamacion alergica local y sistemica y la obstruccion reversible de las vfas respiratorias. Los smtomas del asma, especialmente la falta de aire, son una consecuencia de la obstruccion de las vfas respiratorias, y la muerte casi siempre se debe a la asfixia. La Hipersensibilidad de las Vfas Respiratorias (AHR), y la hipersecrecion de moco por las celulas caliciformes son dos de las principales causas de la obstruccion de las vfas respiratorias en pacientes con asma. Curiosamente el trabajo reciente en modelos experimentales con animales de asma ha subrayado la importancia de la IL-13 como un actor clave en la patogenesis del asma. Utilizando un bloqueador IL-13 espedfico, se ha demostrado que la IL-13 actua de manera independiente de la IL-4 y puede ser capaz de inducir todo el fenotipo de asma alergica, sin la induccion de IgE (es decir, de una manera no atopica). Este y otros modelos han senalado un importante segundo mecanismo de nivel para provocar la fisiopatologfa del asma, que no es dependiente de la produccion de IgE mediante celulas B residentes o la presencia de eosinofilos. Una induccion directa de AHR por IL-13, representa un proceso importante que es probable sea un objetivo excelente para la intervencion de nuevas terapias. Un efecto contemplado de un inhibidor de JAK1, JAK2 y/o TYK2 a los pulmones dana lugar a la supresion de la liberacion local de produccion de IgE mediada por IL-13, y por lo tanto la reduccion en la liberacion de histamina por los mastocitos y eosinofilos. Estas y otras consecuencias de la ausencia de IL-13 indican que muchos de los efectos del asma se pueden aliviar a traves de la administracion de un inhibidor de JAK1, JAK2 y/o TYK2 a los pulmones.
La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (COPD) es un termino que se refiere a un gran grupo de enfermedades pulmonares que pueden interferir con la respiracion normal. Las directrices clmicas actuales definen la COPD como un estado de enfermedad caracterizado por una limitacion del flujo de aire que no es totalmente reversible. La limitacion del flujo de aire es generalmente progresiva y se asociada con una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a partmulas y gases nocivos, particularmente el humo del cigarrillo y la contaminacion. Diversos estudios han senalado una asociacion entre el aumento de produccion de IL-13 y la COPD, lo que lleva a respaldar la proposicion de que el alivio potencial de los smtomas del asma mediante el uso de un inhibidor de JAK2, tambien se puede conseguir en la COPD. Los pacientes con COPD tienen una variedad de smtomas que incluyen tos, falta de aliento, y la produccion excesiva de esputo. La COPD incluye diversos smdromes respiratorios clmicos, que incluyen bronquitis cronica y enfisema.
La bronquitis cronica es una inflamacion de los bronquios de larga duracion que provoca un aumento de la produccion de moco y otros cambios. Los smtomas del paciente son tos y expectoracion de esputo. La bronquitis cronica puede conducir a infecciones respiratorias mas frecuentes y graves, estrechamiento y obstruccion de los bronquios, dificultad para respirar y discapacidad.
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El enfisema es una enfermedad pulmonar cronica que afecta a los alveolos y/o los extremos mas pequenos de los bronquios. El pulmon pierde su elasticidad y por lo tanto se agrandan estas areas de los pulmones. Estas areas agrandadas atrapan el aire viciado y no se presenta un intercambio efectivo con aire fresco. Esto resulta en respiracion diffcil y puede dar como resultado insuficiencia del oxfgeno que se suministra a la sangre. El smtoma predominante en los pacientes con enfisema es la falta de aire.
Adicionalmente, se proporciona evidencia de la activacion de STAT en los tumores malignos, entre ellos cancer de pulmon, mama, colon, ovario, prostata e hugado, asf como linfoma de Hodgkin, mieloma multiple y carcinoma hepatocelular. Las translocaciones cromosomicas que implican fusiones de JAK2 a Tel, Bcr y PCM1 se han descrito en una serie de tumores malignos hematopoyeticos que incluyen leucemia mielogena cronica (CML), leucemia mielogena aguda (AML), cronica leucemia eosinofflica (CEL), smdrome mielodisplasico (MDS), enfermedad mieloproliferativa (MPD) y leucemia linfocftica aguda (ALL). Esto sugiere que se indica el tratamiento de trastornos hiperproliferativos tales como canceres, que incluyen mieloma multiple; cancer de prostata, mama y pulmon; linfoma de Hodgkin; CML; AML; CEL; MDS; ALL; leucemia linfocftica cronica de celulas B; melanoma metastasico; glioma; y hepatoma, por los inhibidores de JAK.
Los inhibidores potentes de JAK2, ademas de lo anterior, tambien son utiles en la enfermedad vascular tal como hipertension, hipertrofia, isquemia cardiaca, insuficiencia cardfaca (que incluyen insuficiencia cardfaca sistolica y insuficiencia cardfaca diastolica), migrana y trastornos cerebrovasculares relacionados, accidente cerebrovascular, fenomeno de Raynaud, smdrome de POEMs, angina de Prinzmetal, vasculitis, tales como arteritis de Takayasu y granulomatosis de Wegener, enfermedad arterial periferica, enfermedad cardiaca e hipertension arterial pulmonar.
La hipertension arterial pulmonar (PAH) es una enfermedad vascular pulmonar que afecta a las arteriolas pulmonares que resultan en una elevacion en la presion arterial pulmonar y resistencia vascular pulmonar, pero con presiones de llenado de los lados izquierdos normales o solo ligeramente elevados. La PAH es provocada por una constelacion de enfermedades que afectan la vasculatura pulmonar. La PAH puede ser provocada por o asociada con trastornos vasculares del colageno, tales como esclerosis sistemica (esclerodermia), enfermedad cardiaca congenita sin corregir, enfermedad hepatica, hipertension portal, infeccion por VIH, Hepatitis C, ciertas toxinas, esplenectoirfta, telangiectasia hemorragica hereditaria, y anomaftas geneticas primarias. En particular, se ha identificado una mutacion en el receptor tipo 2 de protema morfogenetica osea (un receptor de TGF-b) como una causa de la hipertension pulmonar primaria familiar (PPH). Se estima que el 6% de los casos de PPH son familiares, y que el resto son “esporadicos”. La incidencia de la PPH se estima en aproximadamente 1 caso por 1 millon de habitantes. Las causas secundarias de PAH tienen una incidencia mucho mayor. La firma patologica de PAH es la lesion plexiforme del pulmon que consiste en la proliferacion de celulas endoteliales obliterantes y la hipertrofia de celulas del musculo liso vascular en pequenas arteriolas pulmonares precapilares. La PAH es una enfermedad progresiva asociada con una alta mortalidad. Los pacientes con PAH pueden desarrollar insuficiencia del ventnculo derecho (RV). El grado de insuficiencia del RV predice el resultado. La ruta de JAK/STAT ha sido implicada recientemente en la fisiopatologfa de la PAH. Las JAK son quinasas que fosforilan un grupo de protemas llamadas transduccion de senales y activadores de transcripcion o STATS. Cuando se fosforilan, las STAT dimerizan, translocan al nucleo y activan la expresion de genes que conducen a proliferacion de celulas endoteliales y celulas del musculo liso, y provocan hipertrofia de los miocitos cardfacos. Existen tres isoformas diferentes de JAK: JAK1, JAK2, y JAK3. Otra protema con alta homologfa a las JAK se designa Tyk2. Un cuerpo emergente de datos ha mostrado que la fosforilacion de STAT3, un sustrato para JAK2, se aumenta en modelos animales de PAH. En el modelo de monocrotalino de rata, se aumento la fosforilacion del factor de transcripcion STAT3 promitogenico. En este mismo estudio las celulas endoteliales arteriales pulmonares (PAEC) tratadas con monocrotalina desarrollaron hiperactivacion de STAT3. Un agente o protema promitogenica es un agente o protema que induce o contribuye a la induccion de la proliferacion celular. Por lo tanto, uno de los efectos de la inhibicion de JAK2 es reducir la proliferacion de celulas endoteliales u otras celulas, tales como celulas musculares lisas. Un efecto contemplado de un inhibidor de JAK2 es el de reducir la proliferacion de celulas endoteliales u otras celulas que obstruyen el lumen arteriolar pulmonar. Al disminuir la proliferacion obstructiva de las celulas, un inhibidor de JAK2 podna ser un tratamiento eficaz de la PAH.
Adicionalmente se indica el uso de inhibidores de la quinasa JAK para el tratamiento de enfermedades virales y enfermedades metabolicas.
Aunque los otros miembros de la familia JAK son expresados por esencialmente todos los tejidos, la expresion de JAK3 parece estar limitada a las celulas hematopoyeticas. Esto es consistente con su funcion esencial en la senalizacion a traves de los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 por asociacion no covalente de JAK3 con la cadena gamma comun a estos receptores multicadena. Los hombres con inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (XSCID) tienen defectos en el gen de la cadena gamma del receptor de citoquina comun (gamma c) que codifica un componente compartido, esencial de los receptores de la interleuquina-2 (IL-2), IL-4, IL-7, IL-9 e IL- 15. Un smdrome XSCID en el que se ha identificado pacientes con cualquiera de los niveles severamente mutados o reducidos de la protema JAK3, lo que sugiere que la inmunosupresion debena resultar de bloquear la senalizacion a traves de la ruta de JAK3. Los estudios de genes inactivados en ratones han sugerido que JAK3 no solo cumple una funcion crftica en la maduracion de los linfocitos B y T, sino que la JAK3 es constitutivamente necesaria para mantener la funcion de las celulas T. Tomada junto con la evidencia bioqmmica de la implicacion de JAK3 en la direccion 3' de eventos de senalizacion del receptor IL-2 e IL-4, estos estudios de mutacion humanas y de raton
sugieren que la modulacion de la actividad inmunitaria a traves de la inhibicion de JAK3 podna resultar util en el tratamiento de trastornos proliferativos de celulas T y celulas B tales como el rechazo de trasplantes y enfermedades autoinmunitarias.
Aunque la inhibicion de diversos tipos de protemas quinasas, dirigidas a un rango de estados de enfermedad, es 5 claramente beneficiosa, se ha demostrado hasta la fecha que la identificacion de un compuesto que sea selectivo para una protema quinasa de interes, y tenga buenas propiedades “similares a farmaco” tales como alta biodisponibilidad oral, es un objetivo diffcilo. Adicionalmente, esta bien establecido que la previsibilidad o selectividad de inhibicion en el desarrollo de inhibidores de quinasa es bastante baja, independientemente de la similitud de secuencia de nivel entre las enzimas que son objetivo.
10 La JAK1, en combinacion con JAK2 esta implicada en la transduccion de senales en direccion 3' de los receptores IL-6, IL-11 e IFN-y entre otros. La JAK1, en combinacion con JAK3, es esencial para la transduccion de senales en direccion 3' de los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15, entre otros. La JAK1, en combinacion con TYK2, es responsable de la transduccion de senales en direccion 3' de los receptores IL-10, IL-22 y IFN-a entre otros. TYK2 esta implicado en la transduccion de senales en direccion 3' de los receptores IL-12 e IL-23, entre otros. La 15 produccion de IFNy por las celulas T, mediadas por senalizacion de IL-12, es altamente dependiente de TYK2. Estas citoquinas y receptores estan implicados en las respuestas pro-inflamatorias asociadas con enfermedades inmunologicas. Por lo tanto, la inhibicion de la JAK1 tiene potencial para el tratamiento de enfermedades como la artritis reumatoide, esclerosis multiple, psoriasis y enfermedad de Crohn.
Los retos en el desarrollo de inhibidores de JAK terapeuticamente apropiados para uso en el tratamiento de 20 enfermedades asociadas a quinasa tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares que incluyen disenar un compuesto con especificidad apropiada que tambien tiene buena semejanza a farmaco.
Por lo tanto, subsiste una continua necesidad de disenar y/o identificar los compuestos que inhiben espedficamente 25 la familia de quinasas JAK, y particularmente compuestos que son activos contra quinasas JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Subsiste la necesidad de dichos compuestos para el tratamiento de un rango de enfermedades.
El documento WO2009103032 divulga compuestos y procedimientos para utilizar los compuestos en el tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con la actividad de JAK2.
Resumen
30 En un primer aspecto, se proporciona un compuesto de la formula I
imagen1
en la que
R1 es un heterociclilo bidclico sustituido o no sustituido, en el que el heterociclilo bidclico tiene dos anillos conectados que contienen por lo menos un heteroatomo y que es un anillo bidclico no aromatico;
35 R2 se selecciona de H, halogeno, alquilo C1-4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-4 sustituido o no sustituido con CF3,
CON(R)2, CN y CO2R;
R se selecciona de H y alquilo C1-4 sustituido o no sustituido, o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En un segundo aspecto, se proporciona un proceso para la preparacion del compuesto de la formula I como se 40 definio anteriormente que comprende
(i) acoplar un compuesto de la formula II
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imagen2
en la que
R2 es como se definio anteriormente y X es un grupo saliente, con un compuesto de la formula III
imagen3
en la que
R1 es como se definio anteriormente; o (ii) acoplar un compuesto de la formula IV
imagen4
en la que
R2, X y R son como se definieron anteriormente,
con un compuesto de la formula III como se definio anteriormente para preparar un compuesto de la formula V
imagen5
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en la que
R1, R2 y R son como se definieron anteriormente; y
acoplar el compuesto de la formula V como se definio anteriormente con
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Tambien se divulga el compuesto de la formula V definido anteriormente.
Los compuestos de la formula I son inhibidores de quinasa, es decir inhibidores de JAK, preferiblemente inhibidores de quinasa JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Estos compuestos son utiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
En un cuarto aspecto, se proporciona un agente farmaceutico que comprende el compuesto de la formula I definido anteriormente.
Tambien se proporciona el uso del compuesto de la formula I como un agente farmaceutico.
Se proporciona adicionalmente el compuesto de la formula I como se definio anteriormente para uso como un agente farmaceutico.
En un quinto aspecto, se proporciona un inhibidor de quinasa que comprende el compuesto de la formula I definido anteriormente.
Se proporciona adicionalmente el compuesto de la formula I como se definio anteriormente para uso como un inhibidor de quinasa.
En un sexto aspecto, se proporciona un compuesto de la formula 1 como se definio anteriormente para uso como un agente farmaceutico.
El compuesto de la formula I tambien se puede administrar en la forma de una composicion farmaceutica junto con un portador farmaceuticamente aceptable.
en un septimo aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la formula I como se definio anteriormente y un portador farmaceuticamente aceptable.
En una realizacion, la composicion farmaceutica tambien comprende uno o mas agentes terapeuticos adicionales.
El compuesto de la formula I puede estar contenido dentro o adherido a un implante, tal como un estent liberador de farmaco. Por ejemplo, cuando el compuesto se utiliza para el tratamiento de hipertension arterial pulmonar (PAH), el compuesto puede estar contenido dentro o adherido a un estent de la arteria pulmonar, que puede actuar localmente, o liberarse del estent en la circulacion pulmonar donde el compuesto ejerce su actividad terapeutica en la vasculatura pulmonar.
En un octavo aspecto, se proporciona un implante que comprende el compuesto de la formula I definido anteriormente.
Tambien se divulga un metodo para el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto de la formula I o una composicion farmaceutica como se definio anteriormente a un sujeto en necesidad del mismo.
Tambien se proporciona el uso del compuesto de la formula I o una composicion farmaceutica como se definio anteriormente en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
Tambien se divulga el uso del compuesto de la formula I o una composicion farmaceutica como se definio anteriormente en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
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En un noveno aspecto, se proporciona el compuesto de la formula I o una composicion farmaceutica como se definio anteriormente para uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
Tambien se divulga un metodo o para inhibir una quinasa en una celula que comprende poner en contacto la celula con el compuesto de la formula I definido anteriormente.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 muestra la alineacion de secuencias de aminoacidos de las quinasas JAK seleccionadas. Las secuencias mostradas son J2H = JAK2 (SEC. ID. NO. 1), jlh = JAK1 (SEC. ID, NO. 2), j3h = JAK3 (SEC. ID. NO. 3), y Tyk2 = TYK2 (SEC. ID. NO. 4). Las secuencias se numeran con la posicion 1 a partir de aminoacido 833 de la secuencia de JAK2 (tomado de secuencia de Genbank NP_004963) y los extremos en el aminoacido de terminal C. Las secuencias mostradas corresponden al dominio de quinasa de C.
La figura 2 es una grafica que muestra los datos de IC50 (nM) para los compuestos 1 a 10.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a compuestos de la formula I que inhiben las quinasas, que incluyen quinasas JAK tales como JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2 y son utiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasas tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
Compuestos
La presente invencion se refiere a compuestos de la formula I.
En una realizacion, el compuesto de la formula I tiene la formula Ia:
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en la que
R1 y R2 son como se definieron anteriormente, o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otra realizacion, el compuesto de la formula Ia tiene la formula Ib:
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en la que
R1 y R2 son como se definieron anteriormente,
o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En una realizacion, R1 es un heterociclilo bidclico o espirodclico fusionado o puenteado saturado de 6 a 12 miembros que contiene por lo menos un heteroatomo seleccionado de N, O y/o S, preferiblemente N en un anillo y O 5 en el otro anillo. Cada anillo del heterociclilo bidclico puede tener 4-6 miembros con el heterociclilo que contiene N que incluye azetidina, pirrolidina y piperidina y el heterociclilo que contiene O que incluye oxetano, oxolano, (tetrahidrofurano) y dihidropirano o pirano. El atomo de N en el heterociclilo que contiene N preferiblemente se adhiere al anillo fenilo de la formula I o la. Ejemplos de heterociclilos bidclicos fusionados saturados que contienen N y O de 6 a 12 miembros incluyen 6-oxa-3-azabiciclo[3.2.0]heptano, hexahidro-2H-furo[2,3-c]pirrol y 8-oxa-3- 10 azabiciclo[4.2.0]octano. Ejemplos de heterociclilos bidclicos puenteados saturados que contienen N y O de 6 a 12 miembros incluyen 6-oxa-3-aza-biciclo [3.1.1] heptano, 8-oxa-3-azabiciclo [3.2.1] octano, 2-oxa-5-azabiciclo [2.2.1] heptano, 3-oxa-8-azabiciclo[3.2.1]octano y 3-oxa-6-azabiciclo[3.1.1]heptano. Ejemplos de heterociclilos espirodclicos saturados que contienen N y O de 6 a 12 miembros incluyen 1-oxa-6-azaespiro [3.3] heptano, 2-oxa-6- azaespiro [3.3] heptano, 1-oxa-6-ozaspiro [3.3] heptano, 1-oxa-6-azaespiro [3.4] octano, 1-oxa-6-azapiro [3.5] 15 nonano y 1-oxa-7-azaespiro [3.5] nonano.
En una realizacion, R2 es H, metil Cl, Br o F, preferiblemente H o metilo. Ejemplos de compuestos de la formula I o la incluye, pero no se limitan a, los siguientes:
Tabla 1
Numero del compuesto
Estructura Nombre
1
0 ri-wNTN^jO^S^'1 4-(2-((4-(1 -oxa-6-azaespiro[3.3]heptan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4- il)-N- (cianometil)benzamida
2
a 4-(2-((4-(1-oxa-7-azaespiro[3.5]nonan-7- il)fenil)amino)pirimidin-4- il)-N- (cianometil)benzamida
3
0 a „ nVx 4-(2-((4-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3- il)fenil)amino)pirimidin-4- il)-N- (cianometil)benzamida
4
4-(2-((4-(8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octan-3- il)fenil)amino)pirimidin-4- il)-N- (cianometil)benzamida
5
a H (S)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4- il)-N- (cianometil)benzamida
6
0 (R)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
7
0 r^rRY"jCr|,^N (S)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.4]octan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
8
0 a n (R)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.4]octan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
9
O h Lrwy^ 4- (2-((4-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan- 5- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
10
0 h m CrV^ 4- (2-((4-((1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan- 5- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
11
0 h frVx cP 4-(2-((4-(2-oxa-6-azaespiro[3.3]heptan-6- il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N- (cianometil)benzamida
El termino "alquilo C1-4" se refiere a grupos de hidrocarburo de cadena lineal o de cadena ramificada que tienen de 1 a 4 atomos de carbono. Ejemplos incluyen etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo y tert-butilo.
El termino “alcoxi C1-4” se refiere a grupos que contienen oxi de cadena lineal o ramificada que tienen porciones 5 alquilo de 1 a 4 atomos de carbono. Ejemplos incluyen metoxi, etoxi, propoxi, butoxi y tert-butoxi.
El termino “heterociclilo bidclico” se refiere a compuestos que tienen dos anillos conectados que contienen por lo menos un heteroatomo. La conexion de los anillos se puede producir a traves de un enlace entre dos atomos adyacentes (heterociclilo biciclico fusionado), a traves de una secuencia de atomos (heterociclilo bidclico puenteado) o en un solo atomo (heterociclilo espirodclico).
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El heterociclilo bidclico es un anillo bidclico no aromatico que puede estar saturado o contiene una o mas unidades de insaturacion. El anillo bidclico puede contener 6 a 12 atomos en el anillo en los que uno o mas carbonos en el anillo se reemplazan por un heteroatomo tal como N, S y/u O, por ejemplo, N y/u O.
Los atomos de C, N y S se pueden oxidar opcionalmente y los atomos de N se pueden cuaternizar opcionalmente.
Ejemplos incluyen sistemas heterociclilo biciclo [4-6, 4-6] tales como sistemas heterociclilo biciclo [4,4], [4,5], [5,4], [5,6], [6,4], [6,5] o [6,6].
Heterociclilos que contienen N de 4-6 miembros adecuados incluyen aquellos que contienen un atomo de N, tal como azetidina (anillo de 4 miembros); pirrolidina (tetrahidropirrol), pirrolina (por ejemplo, 3-pirrolina, 2,5- dihidropirrol), 2H-pirrol o 3H-pirrol (isopirrol, isoazol) (anillos de 5 miembros); y piperidina, dihidropiridina o tetrahidropiridina (anillos de 6 miembros); o aquellos que contienen dos atomos de N, tales como imidazolina, pirazolidina (diazolidina), imidazolina o pirazolina (dihidropirazol) (anillos de 5 miembros) y piperazina (anillo de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen O de 4-6 miembros adecuados incluyen aquellos que contienen un atomo de O tal como oxetano (anillo de 4 miembros); oxolano (tetrahidrofurano) o oxol (dihidrofurano) (anillos de 5 miembros); y oxano (tetrahidropirano), dihidropirano o pirano (anillos de 6 miembros); aquellos que contienen dos atomos de O, tales como dioxolano (anillo de 5 miembros) y dioxano (anillo de 6 miembros); o aquellos que contienen tres atomos de O, tales como trioxano (anillo de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen S de 4-6 miembros adecuados incluyen aquellos que un atomo de S, tales como tietano (anillo de 4 miembros); tiolano (tetrahidrotiofeno) (anillo de 5 miembros); y tiano (tetrahidrotiopirano) (anillo de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen N y O de 4-6 miembros adecuados incluyen aquellos que contienen uno atomo de N y uno de O tal como tetrahidrooxazol, dihidrooxazol, tetrahidroisoxazol o dihidroisoxazol (anillos de 5 miembros); y morfolina, tetrahidrooxazina, dihidrooxazina o oxazina (anillos de 6 miembros); o aquellos que contienen dos atomos de N y un atomo de O atomo tal como oxadiazina (anillo de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen N y S de 4-6 miembros adecuados incluyen incluyen tiazolina, tiazolidina (anillos de 5 miembros); y tiomorfolina (anillos de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen O y S de 4-6 miembros adecuados incluyen oxatiol (anillo de 5 miembros); y oxatiano (tioxano) (anillo de 6 miembros).
Heterociclilos que contienen N, O y S de 4-6 miembros adecuados incluyen oxatiazina (anillo de 6 miembros).
En una realizacion, el heterociclilo bidclico contiene N en un anillo y O en el otro anillo.
El sistema de anillos que contiene N puede tener de 4-6 miembros y preferiblemente es saturado y unido directamente al anillo de fenilo adecuadamente mediante el atomo de N. Ejemplos de heterociclilos saturados que contienen N de 4-6 miembros incluyen azetidina, pirrolidina y piperidina.
El sistema de anillos que contiene O puede tener 4-6 miembros y esta saturado y unido al anillo que contiene N a traves de un enlace entre dos atomos de carbono para formar un grupo heterociclilo bidclico fusionado que contiene N y O bidclico saturado de 6-12 miembros; a traves de una secuencia de 3-4 o 3-5 atomos de carbono (incluyendo los atomos de union del anillo) opcionalmente sustituido por uno o mas atomos de O para formar un heterociclilo bidclico puenteado que contiene N y O saturado de 6-12 miembros; o en un solo atomo de carbono para formar un heterociclilo espirodclico que contiene N y O saturado de 6-12 miembros. Ejemplos de heterociclilos que contienen O saturados de 4-6 miembros incluyen oxetano, oxolano (tetrahidrofurano) y dihidropirano o pirano.
Heterociclilos bidclicos fusionados que contienen N y O saturados de 6-12 miembros adecuados incluyen aquellos que contienen los heterociclilos que contienen N y O que contienen N y O saturados de 4-6 miembros descritos anteriormente tales como sistemas biciclo [5,4], por ejemplo 6-oxa-3-azabiciclo [3.2.0] heptano; sistemas biciclo [5,5], por ejemplo hexahidro-2H-furo [2,3-c]pirrol; y sistemas biciclo [6,4], por ejemplo 8-oxa-3-azabiciclo [4.2.0]octano.
Heterociclilos bidclicos puenteados que contienen N y O saturados de 6-12 miembros adecuados incluyen sistemas biciclo [6,4] por ejemplo 6-oxa-3-azabiciclo [3.1.1] heptano; sistemas biciclo [6,5] por ejemplo 8-oxa-3-azabiciclo [3.2.1] octano; sistemas biciclo [5,5], por ejemplo, 2-oxa-5-azabiciclo [2.2.1] heptano; y sistemas biciclo [5,6] por ejemplo 3-oxa-8-azabiciclo [3.2.1] octano.
Heterociclilos bidclicos espirodclicos que contienen N y O saturados de 6-12 miembros adecuados incluyen sistemas biciclo [4,4], por ejemplo, 1-oxa-6-azaespiro [3,3] heptano, 2-oxa-6-azaespiro[3,3]heptano y 1-oxa-6- azaespiro [3,3] heptano; sistemas biciclo [5,4], por ejemplo, 1-oxa-6-azaespiro [3,4] octano; y sistemas biciclo [6,4], por ejemplo, 1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonano y 1-oxa-7-azaespiro[3.5] nonano.
El termino “halogeno” se refiere a fluor, cloro, bromo y yodo.
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El termino “sustituido” se refiere a un grupo que se sustituye con uno o mas grupos seleccionados de alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilarilo C1-6, arilo, halo, haloalquilo C1-6, halocicloalquilo C3-6, haloalquenilo C2-6, haloalquinilo C2-6, haloarilo, hidroxi, alcoxi C1-6, alqueniloxi C2-6, alquiniloxi C2-6, ariloxi, carboxi, haloalcoxi C1-6, haloalqueniloxi C2-6, haloalquiniloxi C2-6, haloariloxi, oxo, nitro, nitroalquilo C1-6, nitroalquenilo C2-6, nitroarilo, azido, amino, alquilamino C1-6, alquenilamino C2-6, alquinilamino C2-6, arilamino, alquilacilo C1-6, alquenilacilo C2-6, alquinilacilo C2-6, arilacilo, acilamino, aciloxi, aldehndo, alquilsulfonilo C1-6, arilsulfonilo, alquilsulfonilamino C1-6, arilsulfonilamino, alquilsulfoniloxi C1-6, arilsulfoniloxi, alquilsulfenilo C1-6, arilsulfenilo, carboalcoxi, carboariloxi, mercapto, alquiltio C1-6, ariltio, aciltio, y ciano. Los sustituyentes preferidos se seleccionan del grupo que consiste de alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilarilo C1-6, arilo, halo, oxo, haloarilo, hidroxi, alcoxi C1-4, ariloxi, carboxi, amino, alquilacilo C1-6, arilacilo, acilamino, aciloxi, alquilsulfenilo C1-6, arilsulfonil y ciano.
Los compuestos de la invencion tambien se pueden preparar en forma de sales que son farmaceuticamente aceptables, pero se apreciara que las sales no farmaceuticamente aceptables tambien caen dentro del alcance de la presente invencion, ya que estas son utiles como intermedios en la preparacion de sales farmaceuticamente aceptables. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales de cationes farmaceuticamente aceptables tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio; sales de adicion de acido de acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables tales como acido clorhfdrico, ortofosforico, sulfurico, fosforico, mtrico, carbonico, borico, sulfamico y bromhndrico; o sales de acidos organicos farmaceuticamente aceptables tales como los acidos acetico, propionico, butrnco, tartarico, maleico, hidroximaleico, fumarico, cftrico, lactico, mucico, gluconico, benzoico, succmico, oxalico, fenilacetico, metanosulfonico, trihalometanosulfonico, toluenosulfonico, bencenosulfonico, isetionico, salicilico, sulfamlico, aspartico, glutamico, edetico, estearico, palmftico, oleico, laurico, pantotenico, tanico, ascorbico, valerico y acidos orotico. Las sales de grupos amina tambien pueden comprender sales de amonio cuaternario en el que el atomo de nitrogeno amino lleva un grupo organico adecuado tal como un grupo funcional alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo.
Las sales se pueden formar por medios convencionales, tal como al hacer reaccionar la forma de base libre del compuesto con uno o mas equivalentes del acido apropiado en un solvente o medio en el que la sal es insoluble, o en un solvente tal como agua que se elimina a vacfo o por liofilizacion o por intercambio de aniones de una sal existente por otro anion sobre una resina de intercambio ionico adecuada.
Cuando un compuesto posee un centro quiral, el compuesto se puede utilizar como un enantiomero purificado o diastereomero, o como una mezcla de cualquier relacion de estereoisomeros. Sin embargo, se prefiere que la mezcla comprenda por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5% o 99% del isomero preferido, donde el isomero preferido da el nivel deseado de potencia y selectividad.
Esta divulgacion tambien abarca profarmacos de los compuestos de formula I. La divulgacion tambien abarca metodos de tratamiento de trastornos que se pueden tratar mediante la inhibicion de proterna quinasas, tales como JAK que comprende administrar farmacos o profarmacos de los compuestos de la invencion. Por ejemplo, los compuestos de formula I que tienen grupos amino, amido, hidroxi o acido carboxflico se pueden convertir en profarmacos. Los profarmacos incluyen compuestos en los que un residuo de aminoacido, o una cadena de polipeptidos de dos o mas (por ejemplo, dos, tres o cuatro) residuos de aminoacidos que estan unidos covalentemente a traves de enlaces peptfdicos a grupos amino, hidroxi y grupos de acido carboxflicos de compuestos de la invencion. Los residuos de aminoacidos incluyen los 20 aminoacidos de origen natural comunmente designados por sfmbolos de tres letras y tambien incluyen, 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvlin, beta-alanina, acido gamma-aminobutrnco, citrulina, homocistema, homoserina, ornitina y metioina sulfona. Los profarmacos tambien incluyen compuestos en los que los carbonatos, carbamatos, amidas y esteres de alquilo se unen covalentemente a los sustituyentes anteriores de los compuestos de la presente invencion a traves de la cadena lateral de profarmaco de carbono carbonilo. Los profarmacos tambien incluyen derivados de fosfato de compuestos (tales como acidos, sales de acidos o esteres) unidos a traves de un enlace fosforo-oxfgeno a un hidroxilo libre de los compuestos de formula I. Los profarmacos tambien pueden incluir N- oxidos y S-oxidos de atomos de nitrogeno y de azufre apropiados en la formula I.
Procesos
Los compuestos de la formula general I se preparan al acoplar el compuesto de la formula II o IV con el compuesto de la formula III. Cuando el compuesto de la formula IV se utiliza, entonces se prepara el compuesto de la formula V que luego se acopla con
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para preparar los compuestos de la formula I.
El compuesto de formula II o IV se puede preparar generalmente por una reaccion de acoplamiento cruzado entre una 2,4-dicloropirimidina y un socio de acoplamiento adecuadamente funcionalizado. Alternativamente la dicloropirimidina se puede convertir en un diyodopirimidina, que luego se acopla con un socio de acoplamiento
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adecuadamente funcionalizado. Los socios de acoplamiento tipicos son los acidos organoboronicos o esteres (acoplamiento de Suzuki: vease por ejemplo Miyaura, N. and Suzuki, Chem Rev. 1995, 95 2457), organoestannanos (acoplamiento de Stille: vease, por ejemplo, S Stille, J.K., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1986, 25, 508), reactivos de Grignard (acoplamiento de Kumada: Kumada, M.; Tamao, K.; Sumitani, K. Org. Synth. 1988, Coll. Vol.6, 407.) o especies de organozinc (acoplamiento de Negishi: Negishi, E.; J. Organomet. Chem. 2002, 653, 34). El acoplamiento de Suzuki es el metodo de acoplamiento preferido y se realiza normalmente en un solvente tal como DME, THF, DMF, etanol, propanol, tolueno, acetonitrilo o 1,4-dioxano, con o sin agua agregada, en presencia de una base tal como carbonato de sodio o potasio, hidroxido de litio, carbonato de cesio, hidroxido de sodio, fluoruro de potasio o fosfato de potasio. La reaccion se puede llevar a cabo a temperaturas elevadas y el catalizador de paladio empleado se puede seleccionar a partir de Pd(PPh3)4, Pd(OAc)2, [PdCh(dppf)], Pd2(dba)3/P(t-Bu)3.
La segunda etapa del proceso implica una reaccion de sustitucion aromatica nucleofila del compuesto de formula II o IV con una anilina adecuadamente sustituida. La sustitucion aromatica nucleofila se lleva a cabo normalmente mediante la adicion de la anilina al intermedio heterodclico monohalo obtenido de la primera reaccion en un solvente tal como etanol, n/propanol, isopropanol, tert-butanol, dioxano, THF, DMF, tolueno o xileno. La reaccion se realiza normalmente a temperatura elevada en presencia de un acido tal como HCl o acido p-toluenosulfonico o en presencia de una base tal como una base no nucleofila tal como trietilamina o diisopropiletilamina, o una base inorganica tal como carbonato de potasio o carbonato de sodio.
Alternativamente, el sustituyente anilina se puede introducir a traves de una reaccion de aminacion catalizada por metal de transicion. Los catalizadores tfpicos para tales transformaciones incluyen Pd(OAc)2/P(t-Bu)3, Pd2(dba)3/BINAP y Pd(OAc)2/BINAP. Estas reacciones se llevan a cabo normalmente en solventes tales como tolueno o dioxano, en presencia de bases tales como carbonato de cesio o sodio o tert-butoxido de potasio a temperaturas que vanan desde temperatura ambiente hasta reflujo (por ejemplo, Hartwig, J.F., Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2046).
Las anilinas empleadas en la primera etapa de la smtesis de estos compuestos se pueden sintetizar a traves de la adicion de amino dclico a 1 -fluoro-4-nitro-anilina y reduccion posterior del grupo nitro utilizando metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Los productos formados a partir de cualquiera de las etapas de reaccion se pueden derivar adicionalmente utilizando tecnicas conocidas por aquellos expertos en la tecnica. Alternativamente, la derivacion del intermedio mono-halo se puede llevar a cabo antes del desplazamiento del sustituyente halo. Los expertos en la tecnica apreciaran que el orden de las reacciones descritas para las smtesis anteriores se puede cambiar en determinadas circunstancias y que ciertas funcionalidades pueden necesitar ser derivadas (es decir, protegidas) en ciertos casos para las reacciones descritas anteriormente o proceder con un rendimiento y eficiencia razonable. Los tipos de proteccion de funcionalidad son bien conocidos por aquellos expertos en la tecnica y se describen por ejemplo en Greene (Greene, T., Wuts, P. (1999) Protective Groups in Organic Synthesis. Wiley-Interscience; 3rd edition.).
El grupo saliente en el compuesto de formula II o IV que es un intermedio utilizado en el proceso de la presente invencion puede ser cualquier tipo conocido adecuado, tal como aquellos descritos en J. March, “Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure” 4th Edition, pp 352-357, John Wiley & Sons, New York, 1992. Preferiblemente, el grupo saliente es un halogeno, mas preferiblemente cloro o yodo.
Inhibicion de JAK
Los compuestos de formula I tienen actividad contra las protemas quinasas, que incluyen las quinasas JAK y mas particularmente son activos contra JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Un inhibidor de JAK2 es cualquier compuesto que inhibe selectivamente la actividad de JAK2. Una actividad de JAK2 es fosforilar una protema STAT. Por lo tanto, un ejemplo de un efecto de un inhibidor de JAK2 es disminuir la fosforilacion de una o mas protemas STAT. El inhibidor puede inhibir la forma fosforilada de JAK2 o la forma no fosforilada de JAK2.
La presente invencion tambien proporciona el uso del compuesto de formula I como inhibidores de la quinasa tales como inhibidores de quinasa JAK, en particular inhibidores de JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2.
Composiciones farmaceuticas
La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden por lo menos uno de los compuestos de la formula I y un portador farmaceuticamente aceptable. El portador debe ser “farmaceuticamente aceptable” lo que significa que es compatible con los otros ingredientes de la composicion y no es perjudicial para un sujeto. Las composiciones de la presente invencion pueden contener otros agentes terapeuticos como se describe a continuacion, y se pueden formular, por ejemplo, al emplear vehmulos solidos o lfquidos convencionales o diluyentes, asf como aditivos farmaceuticos de un tipo apropiado para el modo de administracion deseada (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, sabores, etc.) de acuerdo con tecnicas tales como aquellas bien conocidas en la tecnica de formulacion farmaceutica (Vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins).
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Los compuestos de la invencion se pueden administrar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por v^a oral, tal como en forma de comprimidos, capsulas, granulos o polvos; por via sublingual; bucal; parenteral, tal como por inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra(trans) dermica, o tecnicas de inyeccion o infusion intracisternal (por ejemplo, inyectable esteril acuosa o como soluciones o suspensiones no acuosas); por via nasal tal como mediante pulverizador de inhalacion o insuflacion; via topica, tal como en la forma de una crema o unguento ocular, en la forma de una solucion o suspension; por via vaginal en forma de pesarios, tampones o cremas; o por via rectal tal como en forma de supositorios; en formulaciones de dosificacion unitarias que contienen vetnculos no toxicos, o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Los compuestos se pueden, por ejemplo, administrar en una forma adecuada para liberacion inmediata o liberacion prolongada. La liberacion inmediata o liberacion prolongada se puede conseguir mediante el uso de composiciones farmaceuticas adecuadas que comprenden los presentes compuestos, o, particularmente en el caso de la liberacion prolongada, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutaneos o bombas osmoticas.
Las composiciones farmaceuticas para la administracion de los compuestos de la invencion se pueden presentar convenientemente en forma de dosificacion unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de farmacia. Estos metodos generalmente incluyen la etapa de poner el compuesto de formula I en asociacion con el portador que constituye uno o mas ingredientes accesorios. En general, las composiciones farmaceuticas se preparan al asociar uniforme e mtimamente el compuesto de formula I en asociacion con un portador lfquido o un portador solido finamente dividido o ambos, y despues, si es necesario, dando forma al producto en la formulacion deseada. En la composicion farmaceutica el compuesto objeto activo se incluye en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso o estado de las enfermedades. Como se utiliza aqrn, el termino “composicion” pretende abarcar un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, asf como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinacion de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.
Las composiciones farmaceuticas que contienen el compuesto de formula I puede estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabricacion de composiciones farmaceuticas y dichas composiciones pueden contener uno o mas agentes tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, por ejemplo, para proporcionar preparaciones farmaceuticamente estables y de sabor agradable. Los comprimidos contienen el compuesto de formula I en mezcla con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo, almidon de mafz, o acido algmico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidon, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante tecnicas conocidas para retrasar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal y proporcionar asf una accion sostenida durante un penodo mas largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Tambien se pueden recubrir para formar comprimidos terapeuticos osmoticos para liberacion controlada.
Las formulaciones para uso oral tambien se pueden presentar como capsulas duras de gelatina en las que el compuesto de formula I se mezcla con un diluyente solido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolm, o como capsulas de gelatina blanda en las que el compuesto de formula I se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina lfquida, o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspension, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, povidona, goma de tragacanto y goma arabiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfatido de origen natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o condensacion productos de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y antndridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilen sorbitan. Las suspensiones acuosas tambien pueden contener uno o mas conservantes, por ejemplo, etilo, o n-propilo, p-hidroxibenzoato, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes aromatizantes, y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas se pueden formular al suspender el compuesto de formula I en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina lfquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetflico. Los agentes edulcorantes tales como aquellos expuestos anteriormente, y agentes aromatizantes se pueden agregar para proporcionar una preparacion oral de sabor agradable. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adicion de un antioxidante tal como acido ascorbico.
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Los polvos dispersables y granulos adecuados para preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan el compuesto de formula I en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y de suspension se ejemplifican por aquellos ya mencionados anteriormente. Tambien pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, edulcorantes, aromatizantes y agentes colorantes.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina lfquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma de acacia o goma tragacanto, fosfatidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina, y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y antndridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitan, y productos de condensacion de dichos esteres parciales con oxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitan. Las emulsiones tambien pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.
Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones tambien pueden contener un emoliente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes.
Las composiciones farmaceuticas pueden estar en la forma de una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension se puede formular de acuerdo con la tecnica conocida utilizando los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension que se han mencionado anteriormente. La preparacion inyectable esteril puede ser tambien una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente parenteralmente aceptable no toxico o solvente, por ejemplo, como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vetnculos y solventes aceptables que se pueden emplear estan agua, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro de sodio. Adicionalmente, los aceites fijos esteriles se emplean convencionalmente como medio solvente o de suspension. Para este proposito cualquier aceite fijo blando se puede emplear incluyendo mono- o digliceridos sinteticos. Adicionalmente, los acidos grasos tales como acido oleico encuentran uso en la preparacion de formulaciones inyectables.
Para la administracion al tracto respiratorio, que incluye la administracion intranasal, el compuesto activo se puede administrar por cualquiera de los metodos y formulaciones empleadas en la tecnica para la administracion al tracto respiratorio.
Por lo tanto, en general, el compuesto activo se puede administrar en forma de una solucion o una suspension o como un polvo seco.
Las soluciones y suspensiones seran generalmente acuosas, por ejemplo, preparadas a partir de solo agua (por ejemplo agua esteril o libre de pirogenos) o agua y un cosolvente fisiologicamente aceptable (por ejemplo etanol, propilenglicol o polietilenglicoles tales como PEG 400).
Dichas soluciones o suspensiones pueden contener adicionalmente otros excipientes por ejemplo conservantes (tales como cloruro de benzalconio), agentes solubilizantes/surfactantes tales como polisorbatos (por ejemplo, Tween 80, Span 80, cloruro de benzalconio), agentes reguladores, agentes de isotonicidad de ajuste (por ejemplo, cloruro de sodio), potenciadores de absorcion y potenciadores de viscosidad. Las suspensiones pueden contener adicionalmente agentes de suspension (por ejemplo, celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio).
Las soluciones o suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo, con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma unica o multidosis. En el ultimo caso deseablemente se proporciona un medio de medicion de dosis. En el caso de un cuentagotas o pipeta esto se puede conseguir por el sujeto administrando un volumen predeterminado apropiado de la solucion o suspension. En el caso de un pulverizador esto se puede lograr por ejemplo por medio de una bomba dosificadora de pulverizacion de atomizacion.
La administracion tambien se puede lograr por medio de una formulacion en aerosol en la que el compuesto se proporciona en un empaque presurizado con un propelente adecuado, al tracto respiratorio tal como un clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol tambien puede contener convenientemente un surfactante tal como lecitina. La dosis de compuesto activo se puede controlar mediante la provision de una valvula dosificadora.
Alternativamente, el compuesto activo se puede proporcionar en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo del compuesto en una base en polvo adecuada tal como lactosa, almidon, derivados de almidon tales como hidroxipropilmetil celulosa y polivinilpirrolidina (PVP). Convenientemente, el portador en polvo formara un gel en la cavidad nasal. La composicion en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en capsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o empaques blister a partir del cual el polvo se puede administrar por medio de un inhalador.
En las formulaciones destinadas a administracion al tracto respiratorio, que incluyen formulaciones intranasales, el compuesto activo tendra generalmente un tamano de partfcula pequeno, por ejemplo, del orden de 5 micras o
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menos. Dicho tamano de partfcula se puede obtener por medios conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante micronizacion.
Cuando se desee, se pueden emplear formulaciones adaptadas para proporcionar una liberacion sostenida del compuesto activo.
El compuesto activo se puede administrar por inhalacion oral como un polvo de flujo libre a traves de un “Diskhaler” (marca registrada de Glaxo Group Ltd) o un inhalador de aerosol de dosis dosificada.
Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar en forma de supositorios para la administracion rectal del farmaco. Estas composiciones se pueden preparar al mezclar el farmaco con un excipiente no irritante adecuado que es solido a temperaturas ordinarias pero lfquido a la temperatura rectal y por tanto se fundira en el recto para liberar el farmaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
Las composiciones adecuadas para administracion vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen ademas del ingrediente activo, dichos portadores que se conocen en la tecnica por ser apropiados.
Para uso topico, se emplean cremas, pomadas, jaleas, soluciones o suspensiones, etc., que contienen los compuestos de la presente invencion. (Para los propositos de esta solicitud, la aplicacion topica incluira enjuagues bucales y gargaras).
Para aplicacion al ojo, el compuesto activo puede estar en la forma de una solucion o suspension en un vehnculo acuoso o no acuoso esteril adecuado. Tambien se pueden incluir aditivos, por ejemplo, reguladores, conservantes que incluyen agentes bactericidas y fungicidas, tales como acetato o nitrato fenil mercurico, cloruro de benzalconio, o clorohexidina y agentes espesantes tales como hipromelosa.
Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar en forma de liposomas. Como se conoce en la tecnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas. Los liposomas estan formados por cristales lfquidos mono- o multilamelares hidratados que se dispersan en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, ademas de un compuesto de la presente invencion, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lfpidos preferidos son los fosfolfpidos y las fosfatidil colinas, tanto naturales como sinteticas. Los metodos para formar liposomas son conocidos en la tecnica.
La eficacia de esta clase de compuestos puede ser aplicable a estents liberadores de farmacos. Las aplicaciones potenciales a estents liberadores de farmacos con estos compuestos incluyen estenosis de la arteria pulmonar, estenosis de la vena pulmonar, asf como estenosis de la arteria coronaria. Los estents liberadores de farmacos tambien se pueden utilizar en injertos de vena safena o injertos o conductos arteriales. Los estents liberadores de farmacos que liberan esta clase de compuestos tambien pueden ser aplicables para el tratamiento de estenosis de la aorta o arterias perifericas, tal como la arteria ilfaca, la arteria femoral o la arteria poplftea. El compuesto se puede unir al estent liberador de farmaco mediante cualquiera de diversos metodos conocidos en la tecnica. Ejemplos de dichos metodos incluyen polfmeros, fosforil colina, y ceramicas. El compuesto tambien se puede impregnar en un estent bioabsorbible.
Los compuestos activos tambien se pueden presentar para uso en la forma de composiciones veterinarias, que se pueden preparar, por ejemplo, por metodos que son convencionales en la tecnica. Ejemplos de dichas composiciones veterinarias incluyen aquellas adaptadas para:
(a) administracion oral, aplicacion externa, por ejemplo, soluciones orales (por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas); comprimidos o bolos; polvos, granulos o bolitas para mezcla con las materias de alimentacion; pastas para aplicacion a la lengua;
(b) administracion parenteral por ejemplo por inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa, por ejemplo, como una solucion o suspension esteril; o (cuando sea apropiado) por inyeccion intramamaria donde se introduce una suspension o disolucion en la ubre a traves de la mama;
(c) aplicaciones topicas, por ejemplo, como una crema, unguento o pulverizador aplicado a la piel; o
(d) por via rectal o intravaginal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma.
La composicion farmaceutica y el metodo de la presente invencion pueden comprender ademas otros compuestos terapeuticamente activos como se ha senalado aqrn que normalmente se aplican en el tratamiento de las condiciones patologicas mencionadas anteriormente. La seleccion de los agentes apropiados para su uso en terapia de combinacion puede ser realizada por una persona medianamente experta en la tecnica, de acuerdo con principios farmaceuticos convencionales. La combinacion de agentes terapeuticos puede actuar sinergicamente para efectuar el tratamiento o la prevencion de los diversos trastornos descritos anteriormente. Utilizando este enfoque,
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se puede ser capaz de lograr eficacia terapeutica con dosificaciones menores de cada agente, reduciendo de esta manera los potenciales efectos secundarios adversos.
Ejemplos de otros agentes terapeuticos incluyen los siguientes: antagonistas de los receptores de endotelina (por ejemplo, ambrisentan, bosentan, sitaxsentan), inhibidores de PDE-V (por ejemplo, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo), bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amlodipino, felodipino, varepamilo, diltiazem, mentol), prostaciclina, treprostinil, iloprost, beraprost, oxido mtrico, ox^geno, heparina, warfarina, diureticos, digoxina, ciclosporinas (por ejemplo, ciclosporina A), CTLA4-Ig, anticuerpos tales como ICAM-3, receptor de anti-IL-2 (anti- Tac), anti-CD45RB, anti-CD2, anti-CD3 (OKT-3), anti-CD4, anti-CD80, anti-CD86, agentes que bloquean la interaccion entre CD40 y gp39, tales como anticuerpos espedficos para CD40 y/o gp39 (es decir, CD154), protemas de fusion construidas a partir de CD40 y gp39 (CD401g y CD8gp39), inhibidores, tales como inhibidores nucleares de translocacion, de funcion B NF-kappa, tales como desoxiespergualina (DSG), inhibidores de biosmtesis de colesterol tales como inhibidores de inhibidores de la HMG CoA reductasa (lovastatina y simvastatina), farmacos antiinflamatorios no esteroide (NSAID) tales como ibuprofeno, aspirina, acetaminofen, leflunomida, desoxiespergualina, inhibidores de ciclooxigenasa tales como celecoxib, esteroides tales como prednisolona o dexametasona, compuestos de oro, beta-agonistas tales como salbutamol, LABA tales como salmeterol, antagonistas de leucotrienos tales como montelukast, agentes antiproliferativos tales como metotrexato, FK506 (tacrolimus, Prograf), micofenolato mofetilo, farmacos citotoxicos tales como azatioprina, VP-16, etoposido, fludarabina, doxorrubina, adriamicina, amsacrina, camptotecina, citarabina, gemcitabina, fluorodesoxiuridina, melfalan y ciclofosfamida, antimetabolitos tales como metotrexato, inhibidores de topoisomerasa tales como camptotecina, agentes alquilantes de ADN tales como cisplatino, inhibidores de quinasa tales como sorafenib, venenos de microtubulos tales como paclitaxel, inhibidores de TNF-a tales como tenidap, anticuerpos anti-TNF o receptor de TNF soluble, urea hidroxi y rapamicina (sirolimus o Rapamune) o derivados de los mismos.
Cuando se emplean otros agentes terapeuticos en combinacion con los compuestos de la presente invencion se pueden utilizar por ejemplo en cantidades como se indica en la Physician Desk Reference (PDR) o como se determina de otro modo por un experto medianamente versado en la tecnica.
Metodos de tratamiento
Los compuestos de formula I se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades asociadas a quinasa que incluyen enfermedades asociadas quinasa JAK tales como enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organos; enfermedades hiperproliferativas, que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades virales; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
En general, el termino “tratamiento” significa que afecta a un sujeto, tejido o celula para obtener un efecto farmacologico y/o efecto fisiologico deseado e incluyen: (a) prevenir que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero aun no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar o mejorar los efectos de la enfermedad, es decir, provocar la regresion de los efectos de la enfermedad.
El termino “sujeto” se refiere a cualquier animal que tiene una enfermedad que requiere tratamiento con el compuesto de formula I.
Ademas de los primates, como los humanos, se puede tratar una variedad de otros marnfferos utilizando los compuestos, composiciones y metodos de la presente invencion. Por ejemplo, mairnferos que incluyen, pero no se limitan a, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas se pueden tratar otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, de roedores o especies murinas. Sin embargo, la invencion tambien se puede practicar en otras especies, tales como especies aviares (por ejemplo, pollos).
Se debe entender que el termino “administracion” significa proporcionar un compuesto de la invencion a un sujeto en necesidad de tratamiento.
El termino “enfermedades asociadas a quinasa” se refiere a un trastorno o trastornos que se dan como resultado directo o indirecto de o se agravan por la actividad aberrante de la quinasa, en particular actividad de JAK y/o que se alivian mediante la inhibicion de una o mas de estas enzimas quinasa.
En una realizacion preferida, los estados de enfermedad asociados a quinasa implican una o mas de las quinasas JAK, JAK1, JAK2, JAK3 o TYK2. En una realizacion particularmente preferida, la enfermedad implica quinasa JAK2. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, aquellas enumeradas en la Tabla a continuacion.
Activacion de la ruta de JAK/STAT en diversas patologfas
Tipo de enfermedad
Tipos de celulas citoquinas quinasa JAK Caractensticas
implicadas implicadas implicada
Tipo de enfermedad
Tipos de celulas implicadas citoquinas implicadas quinasa JAK implicada Caractensticas
Atopia asma alergica, dermatitis atopica (eczema), rinitis alergica,
mastocitos, eosinofilos, celulas T, celulas B, IL-4, IL-5, IL- 6, IL- 7, IL-13 JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2 activacion de celulas T, de celulas B, seguido por activacion mediada por IgE de los mastocitos y eosinofilos residentes
CMI Dermatitis alergica de contacto, neumonitis por hipersensibilidad
celulas T, celulas B, macrofagos, neutrofilos IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFNy, TNF, IL-7, IL-13, JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2 activacion de celulas B y/o celulas Tdh de macrofagos/activacion de granulocitos
Enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias esclerosis multiple, Glomerulonefritis lupus eritematoso sistemico (SLE), artritis reumatoide, artritis juvenil, smdrome de Sjogren, esclerodermia polimiositis, espondilitis anquilosante, artritis psoriasica
celulas B, celulas T, monocitos, macrofagos, neutrofilos, mastocitos, eosinofilos, IL-2, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-10, IL-13, IFNy, tnf, gm- CSF; G-CSF, JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2 produccion de citoquina (por ejemplo, TNFa/p, IL- 1, CSF-1 de GM- CSF), activacion de celulas T, activacion de celulas B, activacion de JAK/STAT
Trasplante rechazo de aloinjerto GvHD
celulas T, celulas B, macrofagos IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-13, TNF JAK1, JAK2, JAK3, necrosis mediada por macrofagos/celulas T, apoptosis mediada por celulas Tc, y opsonizacion mediada por celulas B/Ig/necrosis de injerto extrano
Enfermedades virales
Citoquinas Virales, IL-2, JAK1, JAK2, JAK3 Mediacion de JAK/STAT
Virus de Epstein Barr (EBV)
linfocitos
hepatitis B
hepatocitos
hepatitis C
hepatocitos
VIH
linfocitos
HTLV 1
linfocitos
virus varicela-zoster (VZV)
fibroblastos
Virus de papiloma humano (HPV)
celulas epiteliales
enfermedades hiperproliferativas -cancer
leucemia
Leucocitos diversas citoquinas autocrinas, activacion intrmseca JAK1, JAK2, JAK3 produccion de citoquinas, activacion JAK/STAT
linfoma
linfocitos
mieloma multiple
diversos
cancer de prostata
diversos
cancer de mama
diversos
linfoma de hodgkins
diversos
Tipo de enfermedad
Tipos de celulas implicadas citoquinas implicadas quinasa JAK implicada Caractensticas
leucemia linfocftica cronica de celulas B
diversos
cancer de pulmon
diversos
hepatoma
diversos
melanoma metastasico
diversos
Glioma
diversos
Enfermedades mieloproliferativas policitemia vera (PV), mielofibrosis primaria, trombocitemia, trombocitemia esencial (ET), mielofibrosis idiopatica, leucemia mielogena cronica, mastocitosis sistemica (SM), leucemia neutrofflica cronica (CNL), smdrome mielodisplasico (MDS), enfermedad de mastocitos sistemica (SMCD)
hematopoyeticas interleuquina-3, eritropoyetina, trombopoyetina mutacion de JAK2 activacionde JAK /STAT
Enfermedad Vascular hipertension, hipertrofia, insuficiencia cardfaca, isquemia, hipertension arterial pulmonar,
celulas endoteliales, celulas del musculo liso que incluyen celulas de la arteria pulmonar del musculo liso, miocitos cardiacos, fibroblastos, celulas endoteliales IL6, angiotensina II, LIF, TNF-alfa, serotonina, caveolina-1, JAK1 JAK2, TYK2 activacion de JAK/STAT
Enfermedad metabolica obesidad, smdrome metabolico
adipocitos, celulas de pituitaria, neuronas, monolitos leptina JAK2 activacion de JAK/STAT
El termino “enfermedad inmunologica e inflamatoria” se refiere a una enfermedad inmunologica, inflamatoria o autoinmunitaria, que incluye pero no se limita a artritis reumatoide, poliartritis, espondilitis reumatoide, osteoartritis, gota, asma, bronquitis, rinitis alergica, enfermedad obstructiva cronica pulmonar (COPD), fibrosis pulmonar, fibrosis 5 qmstica, enfermedad inflamatoria del intestino, smdrome de intestino irritable, colitis mucosa, colitis ulcerosa, colitis
diabrotica, enfermedad de Crohn, trastornos de la tiroides autoinmunes, gastritis, esofagitis, hepatitis, pancreatitis, nefritis, psoriasis, eczema, acne vulgaris, dermatitis, urticaria, esclerosis multiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de nuerona motora (enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de Paget, sepsis, conjuntivitis, catarro nasal, artrorreumatismo cronico, smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), polimiositis, dermatomiositis 10 (DM), Polaritis nodosa (PN), polimialgia reumatica, trastorno del tejido conjuntivo mixto (MCTD), smdrome de
Sjoegren, smdrome de Crouzon, acondroplasia, lupus eritematoso sistemico, esclerodermia, vasculitis, displasia tanatoforica, resistencia a la insulina, diabetes de tipo I y complicaciones de diabetes y smdrome metabolico.
El termino “enfermedades hiperproliferativas” incluye cancer y estados de enfermedades mieloproliferativas tales como estados de enfermedad celular-proliferativa, que incluye pero no se limita a: Cardiaca: sarcoma 15 (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma;
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Pulmonar: carcinoma broncogenico (celulas epidermoides, celulas pequenas no diferenciadas, celulas grandes no diferenciadas, adenocarcinoma), alveolar (bronquiolar) carcinoma, adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hanlartoma condromatoso, inesotelioma; Gastrointestinal: esofago (carcinoma de celulas epidermoides, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estomago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), pancreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); del tracto genitourinario: rinon (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia), vejiga y uretra (carcinoma de celulas epidermoides, carcinoma de celulas de transicion, adenocarcinoma), prostata (adenocarcinoma, sarcoma), testmulo (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de celulas intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); del Hfgado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; Oseas: sarcoma osteogenico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de celulas reticulares), mieloma multiple, cordoma de tumor celular maligno gigante, osteochronfrorna (exostosis osteocartilaginosas), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoide osteoma y tumores de celulas gigantes; del Sistema nervioso: craneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, defornians osteitis), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congenitos), neurofibroma de la medula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); Ginecologicas: utero (carcinoma endometrial), cuello uterino (carcinoma cervical, displasia cervical pretumoral), ovarios (carcinoma de ovario [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma no clasificado], tumores de celulas granulosatecales, tumores de celulas SertoliLeydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de celulas epidermoides, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de celulas claras, carcinoma de celulas epidermoides, sarcoma botrioide [rabdomiosarcoma embrional]), trompas de Falopio (carcinoma); Hematologicas: sangre (leucemia mieloide [aguda y cronica], leucemia linfoblastica aguda, leucemia linfodtica cronica, mieloma multiple, smdrome mielodisplasico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin de [linfoma maligno; de Piel: melanoma maligno, carcinoma de celulas basales, carcinoma de celulas epidermoides, sarcoma de Kaposi, lunares displasicos nevi, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, psoriasis; de Glandulas suprarrenales: neuroblastoma; y enfermedades Mieloproliferativas tales como policitemia vera (PV), mielofibrosis primaria, trombocitemia, trombocitemia esencial (ET), agnoneic metaplasia mieloide (AMM), tambien denominada mielofibrosis idiopatica (IMF), leucemia mielogena cronica (CML), mastocitosis sistemica (SM), leucemia cronica neutrofflica (CNL), leucemia mielomonodtica cronica (CMML), smdrome mielodisplasico (MDS) y enfermedad de mastocitos sistemica (SMCD).
El termino “enfermedades vasculares” se refiere a enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardiovasculares, hipertension, hipertrofia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, trastornos tromboticos, apoplejfa, fenomeno de Raynaud, smdrome de POEMS, angina, isquemia, migrana, enfermedad arterial periferica, falla cardiaca, reestenosis, aterosclerosis, hipertrofia ventricular izquierda, infarto de miocardio, enfermedades isquemicas del corazon, rinon, hngado y el cerebro, e hipertension arterial pulmonar.
Las enfermedades preferidas para inhibidores de JAK2 incluyen enfermedades inmunologicas e inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, dermatitis atopica, asma, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, smdrome de Crouzon, acondroplasia, lupus eritematoso sistemico, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, vasculitis, displasia tanatoforica y la diabetes; trastornos hiperproliferativos tales como cancer por ejemplo cancer de prostata, cancer de colon, cancer de mama, cancer de hngado tales como hepatoma, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello, tales como glioma, cancer de piel tal como melanoma metastasico, leucemia, linfoma, mieloma multiple y enfermedades mieloproliferativas tales como policitemia vera (PV), mielofibrosis, trombocitemia, trombocitemia esencial (ET), metaplasia mieloide agnogenica (AMM), tambien denominada mielofibrosis idiopatica (IMF) y leucemia mielogena cronica (CML); y enfermedades vasculares tales como la hipertension, hipertrofia, apoplejfa, fenomeno de Raynaud, smdrome de POEMS, angina, isquemia, migrana, enfermedad arterial periferica, insuficiencia cardfaca, restenosis, aterosclerosis e hipertension arterial pulmonar.
Las enfermedades preferidas para los inhibidores de JAK1 y TYK2 incluyen enfermedades inmunologicas e inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, artritis reumatica, esclerosis multiple, psoriasis, enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria del intestino. Los inhibidores de JAK1 tambien se pueden utilizar para tratar trastornos hiperproliferativos tales como el cancer, por ejemplo cancer de prostata, cancer de colon, cancer de mama, cancer de tngado tales como hepatoma, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello, tales como glioma, cancer de piel tales como melanoma metastasico, leucemia, linfoma, mieloma multiple y enfermedades mieloproliferativas tales como policitemia vera (PV), mielofibrosis, trombocitemia, trombocitemia esencial (ET), metaplasia mieloide agnoneica (AMM), tambien denominada mielofibrosis idiopatica (IMF) y leucemia mielogena cronica (CML).
Las enfermedades preferidas para los inhibidores de JAK3 son enfermedades inmunologicas e inflamatorias, que incluyen enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistemico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerodermia, esclerosis multiple, neuritis autoinmune, artritis reumatoide, psoriasis, resistencia a la insulina, diabetes tipo I y complicaciones de la diabetes, smdrome metabolico, asma, dermatitis atopica, trastornos
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autoinmunes de tirades, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad de Alzheimer, y otras indicaciones en las que la inmunosupresion puede ser deseable tal como trasplantes de organos y enfermedad injerto contra anfitrion. Adicionalmnete los inhibidores espedficos de JAK3 pueden encontrar aplicacion para los tratamientos terapeuticos para enfermedades hiperproliferativas tales como leucemia y linfoma donde se hiperactiva el JAK3.
Dosis
El termino “cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de formula I y II que provocara la respuesta biologica o medica de un tejido, sistema, animal o humano que esta siendo buscada por el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro clmico.
En el tratamiento o prevencion de afecciones que requieren inhibicion de la quinasa un nivel de dosificacion apropiado sera generalmente aproximadamente 0.01 a 500 mg por kg de peso corporal del paciente por dfa que se puede administrar en una unica o multiples dosis. Preferiblemente, el nivel de dosificacion sera aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg/kg por dfa; mas preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100 mg/kg por dfa. Un nivel de dosificacion adecuado puede ser aproximadamente 0.01 a 250 mg/kg por dfa, aproximadamente 0.05 a 100 mg/kg por dfa, o aproximadamente 0.1 a 50 mg/kg por dfa. Dentro de este rango la dosificacion puede ser 0.05 a 0.5, 0.5 a 5 o 5 a 50 mg/kg por dfa. Para administracion oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos que contienen 1.0 a 1000 miligramos del ingrediente activo, particularmente 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, y 1000.0 miligramos del ingrediente activo. La dosis se puede seleccionar, por ejemplo, para cualquier dosis dentro de cualquiera de estos rangos, para la eficacia terapeutica y/o ajuste sintomatico de la dosificacion al paciente que se va a tratar. Los compuestos se administraran preferiblemente en un regimen de 1 a 4 veces por dfa, preferiblemente una o dos veces por dfa.
Se entendera que el nivel de dosis espedfico y la frecuencia de dosificacion para cualquier paciente particular se puede variar y dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto espedfico empleado, la estabilidad metabolica y la duracion de accion de ese compuesto, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administracion, velocidad de excrecion, combinacion de farmacos, gravedad de la afeccion particular y la terapia a la que se somete el anfitrion.
En realizaciones, un compuesto de la presente invencion es para uso en un metodo para el tratamiento de la “enfermedad mieloproliferativa” y “neoplasmas mieloproliferativos (MPN)” mas notablemente la policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (PMF). Un grupo de trabajo internacional para la investigacion sobre neoplasma mieloproliferativo y tratamiento (GTI-MRT) se ha establecido para delimitar y definir estas afecciones (vease, por ejemplo, Vannucchi et al, CA Cancer J. Clin., 2009, 59:171-191), y aquellas definiciones de la enfermedad se aplicaran para los propositos de esta especificacion. Los sujetos “en riesgo de” una forma particular de la MPN son sujetos que tienen una forma de etapa temprana de la enfermedad, y puede incluir, por ejemplo, sujetos que tienen un marcador genetico de los mismos, tales como el alelo JAK2V617F que se asocia con PV (>95%), con ET (60%) y con PMF (60%). Los sujetos tambien se consideran “en riesgo de” una forma de NMF si ellos ya manifiestan smtomas de una forma etapa anterior. Por lo tanto, los sujetos que presentan NMF estan en riesgo de post-PV y post-ET, las cuales se desarrollan siguiendo MPN. Para el tratamiento de dichos sujetos, un compuesto de la presente invencion se puede administrar en forma de comprimidos en una dosis unitaria dentro del rango de 50 mg a 500 mg, que incluye en particular 150 mg o 300 mg, y a una frecuencia de dosificacion de 1 a 4 veces al dfa, tal como una vez o dos veces al dfa. Dichos sujetos tambien se pueden tratar en combinacion con otros farmacos utiles en el tratamiento de la afeccion en particular, que incluyen dichos farmacos como talidomida, lenalidomida, otros inhibidores de quinasa JAK2 o JAK1/2, hidroxiurea o anagrelida, o en combinacion con bisfosfonatos para reducir la fibrosis de medula osea. Adicionalmente, estos pacientes tambien se pueden someter a terapia de radiacion o trasplante de medula osea alogenica, como parte de la terapia general que incluye la dosificacion con un compuesto presente.
En otra realizacion, un compuesto de la presente invencion es para uso en un metodo para el tratamiento espedficamente de smdrome mielodisplasico (MDS). El smdrome mielodisplasico (MDS) es un termino utilizado para describir un grupo de enfermedades caracterizadas por la hematopoyesis ineficaz que conduce a citopenias de la sangre y la medula osea hipercelular. El MDS se ha considerado tradicionalmente como sinonimo de 'preleucemia' debido al mayor riesgo de transformacion en leucemia mielogena aguda (AML). La evolucion de la LMA y las consecuencias clmicas de citopenias son las principales causas de morbilidad y mortalidad en los MDS. Los smtomas debilitantes de MDS incluyen fatiga, palidez, infeccion y sangrado. La anemia, neutropenia y trombocitopenia son tambien manifestaciones clmicas comunes de MDS. Para el tratamiento de dichos sujetos, un compuesto de la presente invencion se puede administrar en forma de comprimidos en una dosis unitaria dentro del rango de 50 mg a 500 mg, que incluye en particular 150 mg o 300 mg, y a una frecuencia de dosificacion de 1 a 4 veces al dfa, tal como una vez o dos veces al dfa.
En otras realizaciones, un compuesto de la presente invencion es para uso en el metodo para el tratamiento de anemia, incluyendo anemia asociada con enfermedad mieloproliferativa, para lograr una respuesta eficaz de la anemia. Por “respuesta de anemia” se entiende un aumento en el nivel de hemoglobina del paciente o un paciente que era dependiente de transfusion se convierte en independiente de transfusion. De forma deseable, se logra un
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aumento mmimo en la hemoglobina de 2.0 g/dl de una duracion mmima de 8 semanas, que es el nivel de mejora especificado en los criterios de consenso de Grupo de Trabajo Internacional (GTI). Sin embargo, mas pequeno, pero aun medicamente significativo, el aumento de la hemoglobina tambien se considera dentro del alcance de la presente invencion. Los sujetos anemicos que se beneficianan del tratamiento con un compuesto presente incluyen sujetos que se han sometido o estan sometidos a quimioterapia o radioterapia, tales como pacientes con cancer. Una amplia variedad de agentes quimioterapeuticos son conocidos por tener la consecuencia de reducir el nivel de funcionamiento de las celulas rojas de la sangre. Adicionalmente, los sujetos que son candidatos de tratamiento son los afectados por trastornos de la sangre, que incluyen canceres de la sangre que resultan en, o estan asociados con, una reduccion en el recuento de globulos rojos. En realizaciones, los sujetos que se van a tratar son sujetos que tienen anemia asociada con o que resulta de dichas afecciones de la sangre como el smdrome mielodisplasico. En otras realizaciones, los sujetos que se van a tratar son sujetos que tienen anemia asociada con o que resulta de dichas afecciones de la sangre como anemias asociadas con otras neoplasias malignas hematologicas, anemia aplasica, anemia de enfermedad cronica que afectan a las celulas rojas de la sangre y similares. La anemia de enfermedad cronica se asocia con enfermedades tales como ciertos tipos de cancer, que incluyen linfomas y la enfermedad de Hodgkin; enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad inflamatoria del intestino y polimialgia reumatica; infecciones a largo plazo, tales como infeccion del tracto urinario, VIH y osteomielitis; insuficiencia cardfaca; y enfermedad renal cronica. Adicionalmente, los pacientes con anemia resultante de condiciones asociadas con aumento de la destruccion, supervivencia de globulos rojos acortada y secuestro esplenico tambien se podnan beneficiar del tratamiento con un compuesto presente. En ciertas realizaciones, el sujeto que se va a tratar es un sujeto anemico que experimenta talasemia. En otras realizaciones, el sujeto que se va a tratar es un sujeto diferente de un sujeto que experimenta talasemia. Los pacientes que sufren de estas afecciones por lo tanto se pueden tratar para mejorar su estado de disminucion o deficiencia de hemoglobina. Para el tratamiento de dichos sujetos, un compuesto de la presente invencion se puede administrar en forma de comprimidos en una dosis unitaria dentro del rango de 50 mg a 500 mg, que incluye en particular 150 mg o 300 mg, y a una frecuencia de dosificacion de 1 a 4 veces al dfa, tal como una vez o dos veces al dfa. Para el tratamiento de sujetos anemicos, un compuesto presente se puede administrar en combinacion con un farmaco, compuesto o modalidad para tratamiento de anemia seleccionado de transfusion de sangre, suplementos de hierro, terapia con eritropoyetina o darbapoietina, y similares.
En otra realizacion, un compuesto de la presente invencion es para uso en un metodo para el tratamiento de mieloma multiple (MM), que incluye en particular celulas de MM que tienen un fenotipo CD45 negativo (CD45), y/o celulas de mM que se consideran IL-6 no sensibles. Las celulas de MM son celulas de la enfermedad que forman tumores de plasmacitoma que son el sello del mieloma multiple. “Fenotipo CD45-” se refiere a una celula Mm que se pone a prueba negativa o debil, a diferencia de intermedio a brillante, para la expresion de superficie del marcador de protema conocido como CD45, que es un marcador bien conocido de todas las celulas hematopoyeticas. El fenotipo CD45 tambien se atribuye aqrn con referencia a una poblacion de celulas de MM en el que la prevalencia de celulas CD45 dentro de esa poblacion es superior a por lo menos aproximadamente 10% de la poblacion, tal como por lo menos aproximadamente 15%, o 20%, o 25%, o 30%, o 35%, o 40%, o 45% o por lo menos aproximadamente 50% de esa poblacion. La deteccion de CD45 en la superficie celular se consigue facilmente utilizando anticuerpo marcado con fluorescencia CD45 monoclonal y las tecnicas establecidas de clasificacion de celulas por activacion de fluorescencia (FACS) o cualquier medio relacionado para identificar celulas que unen el anticuerpo CD45. Se puede hacer referencia por ejemplo a los artfculos publicados por Moreau et al, Haematologica, 2004, 89(5):547, y por Kumar et al, Leukemia, 2005, 19:1466.
Las celulas de MM que son “no sensibles a IL-6” se identifican como celulas que no dependen para su supervivencia de la presencia de la interleuquina-6 (IL-6). Por lo tanto, una celula MM que no es sensible a IL-6 muestra respuesta insustancial, en terminos tales como estimulacion del receptor de IL-6 o eventos de senalizacion en direccion 3', cuando se incuban con una cantidad de otra forma estimulante de IL-6. Dichas celulas de MM pueden incluir particularmente aquellas celulas MM que son residentes en el entorno de la medula osea, y que de este modo crecen en el mismo entorno que las celulas estromales de la medula osea, pero tambien incluyen celulas de MM en circulacion que no estan expuestas al entorno oseo.
En el ambito de MM y su progresion y desarrollo, el CD45 representa un marcador temprano de la enfermedad de celulas de MM. A medida que la enfermedad progresa, se produce un cambio en el fenotipo CD45 de las celulas, en las que el predominio de celulas CD45+ se desvanece, y la poblacion de celulas plasmaticas enfermas se vuelve predominantemente a CD45- (vease Kumar et al, Leukemia, 2005, 19(8): 1466). Tambien se produce un cambio en el numero de celulas IL-6 no sensibles, con esta forma de celulas que se vuelve predominante en las etapas posteriores de la enfermedad.
En el presente metodo, se propone el uso de los presentes compuestos para el tratamiento de celulas de MM, y tumores de plasmacitoma que surgen de las mismas, que han adquirido fenotipo no sensible a CD45- y/o IL-6. Para el tratamiento de dichos sujetos, un compuesto de la presente invencion se puede administrar en forma de comprimidos en una dosis unitaria dentro del rango de 50 mg a 500 mg, que incluye en particular 150 mg o 300 mg, y a una frecuencia de dosificacion de 1 a 4 veces al dfa, tal como una vez o dos veces al dfa. Para el tratamiento de sujetos MM, un compuesto presente se puede administrar en combinacion con otro farmaco, compuesto o modalidad para tratamiento de MM tal como melfalan y bortezomib, y similares.
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Con el fin de ejemplificar la naturaleza de la presente invencion de tal que se pueda entender mas claramente, se proporcionan los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Smtesis del Compuesto
Los compuestos de la invencion se pueden preparar por metodos bien conocidos por aquellos expertos en la tecnica, y como se describe en los procedimientos sinteticos y experimentales mostrados a continuacion para los compuestos seleccionados.
Definiciones:
DMAP 4-dimetilaminopiridina
DLM diclorometano
TEA trietilamina
DIPEA o DIEA diisopropiletilamina
DMSO dimetilsulfoxido
THF tetrahidrofurano
KHMDS hexametil disilazida de potasio
TBAF fluoruro de tetrabutilamonio
TBSCL cloruro de terbutil dimetilsililo
TMSOI yoduro de trimetilsulfoxonio
Ejemplo 1 - Smtesis del compuesto 1
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Cbz-CI
THF/HaO
Na2COs
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A una solucion agitada del intermedio A (10.00 g, 91 mmol,) en H2O y THF (200 mL) se agrego Na2CO3 (19.5 g 0.18 mol), seguido por Cbz-Cl (18.40 g, 0.11 moL). La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reaccion se detuvo mediante adicion de HCl ac. 1 M. La capa acuosa se extrajo dos veces con CH2Cl2 y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa de columna (EtOAc/Eter de petroleo 1:4) para
obtener el compuesto 1-1 (13.60 g, 72%) como un solido blanco. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. TLC:Rf=0.3 (gel de s^lice, EA:PE=1:2, v/v) LC-MS: [M+1]+=208; [M+Na]=230.
Smtesis de 1-2
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A una solucion agitada del intermedio 1-1 (13.60 g, 66 mmol) en DCM (100 mL) a 0°C se agrego DIPEA (57.5 mL 0.33 mol) en forma de gotas, seguida por piridina trioxido de azufre (24.20 g, 0.15 mol) en DMSO (70 mL). La mezcla resultante se agito a 0°C durante 1 h. La mezcla luego se vertio en hielo-agua y la capa acuosa se extrajo dos veces con DCM. Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina y se secaron (Na2SO4), se filtraron y se 10 concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa de columna (EtOAc/Eter de petroleo 1:2) para obtener el compuesto 1-2 (6.50 g 48%) como solido amarillo. La estructura se confirmo por espectro de H-RMN. TLC:Rf=0.7 (gel de sHice, EA:PE=1:1, v/v). 1H-RMN (400 MHz, CDCls) 8(ppm):7.38 (m, 5H),5.17 (s, 2H),4.76 (s, 4H).
Smtesis de 1-3
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A una solucion agitada de yoduro de trimetilsulfoxonio (4.20 g, 20.5 mmol) en t-BuOH (100 mL) se agrego KOtBu (11.00 g 50.0 mmol) y la reaccion se calento a 50°C durante 1h. Se agrego 1-2 (4.80 g, 42.8 mmol) y la mezcla resultante se agito a 50°C durante unas 48 h adicionales, luego se detuvo mediante adicion de NH4Cl saturado y EA. La capa acuosa se extrajo dos veces con EA y las capas organicas combinadas luego se lavaron con solucion 20 salina, se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa flash (EA/PE,1:2) para obtener el compuesto D (530 mg, 11%) como aceite amarillo.
TLC:Rf=0.36 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+1]+ = 234; [M+Na]=256
1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8(ppm): 7.36 - 7.32 (m, 5H), 5.08(s,2H), 4.51(t, J=7.5 Hz, 2H), 4.23-4.14 (m, 4H), 2.83 (t, 25 J=7.5 Hz, 2 H).
Smtesis de 1-4
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A una solucion agitada del intermedio 1-3 (860 mg, 3.7 mmol) en MeOH (40 mL) se agrego 10% de Pd/C (100 mg) y 30 la reaccion se agito bajo H2 (50 psi) a 60°C durante 3 dfas. La reaccion se filtro a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con MeOH. El filtrado se concentro bajo presion reducida para obtener el compuesto 1-4 (360 mg, 98%) como un aceite. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. TLC: Rf =0.04 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+1]+=100
Smtesis de 1-5
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A una solucion agitada del intermedio 1-4 (430 mg, 4.34 mmol) en THF (50 mL) se agrego K2CO3 (720 mg 5.21 5 mmol), seguido por 1-fluoro-4-nitrobenceno (612 mg, 34.34 mmol). La mezcla resultante se agito a 80°C durante 5h. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se vertio en agua. La capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc/Eter de petroleo=1:2) para dar 1-5 (226 mg 28%) como solido amarillo. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS.
10 TLC:Rf=0.4 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+H]+ = 221, [M+Na]= 243
Smtesis de 1-6
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15 A una solucion agitada del intermedio F (226 mg, 1.0 mmoL, 1.0 eq) en MeOH (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (20 mg) y la reaccion se agito bajo 1 atmosfera de H2 a 50°C durante 3 dfas. La mezcla de reaccion se filtro a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con MeOH. El filtrado se evaporo bajo presion reducida para dar 1-6 (192 mg, 98%) como solido rojo. La estructura se confirmo por espectro de LC-Ms y se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
20 TLC: Rf =0.25 (gel de sHice, EA:PE=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=191 Smtesis del compuesto 1
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25 A una solucion agitada del intermedio 1-6 (192 mg, 1.0 mmol) en dioxano (40 mL) se agrego Cs2CO3 (658 mg 2.0 mmol) y X-phos (48 mg 0.1 mmol), seguido por Pd2(dba)3 (92 mg 0.1 mmol). La mezcla resultante se calento a 100°C durante 6h bajo N2. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de una
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almohadilla de Celita y se lavo con EtOAc. El filtrado se vertio en agua y la capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas organicas combinadas luego se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa flash (MeOH/DCM=1:50) para dar el analogo 1 (41 mg 10%) como solido amarillo. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de 1H-RMN.
TLC:Rf=0.4 (gel de sHice, MeOH/DCM=1:20, v/v)
LC-MS: [M+1]+=427
1H-RMN(400 MHz, MeOD) 6(ppm): 8.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.55 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 4.59 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.36 (s, 2H), 4.12 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 3.90 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H).
Ejemplo 2 - Smtesis del compuesto 2
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A una solucion de 2-1 (5.00 g, 25.1 mmol) en EtOAc (10 mL) se agrego HCl 4 M -EtOAc (20 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2h. El precipitado solido se recolecto mediante filtracion y se lavo con EtOAc. La torta de filtro se seco bajo presion reducida para dar un solido blanco (3.40 g, 100%). Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
A una solucion de 2-2 (3.40 g, 25 mmol) en THF/H2O (50 mL/50 mL) se agrego 1-fluoro-4-nitrobenceno (3.54 g, 25 mmol) y K2CO3 (7.60 g, 55 mmol) y la mezcla se calento a reflujo durante la noche. Se permitio que la mezcla se enfriara a temperatura ambiente y se extrajo con EtOAc (200 mL x 3). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina (150 mL), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo crudo obtenido se lavo con EtOAc (10 mL) para dar un solido amarillo (4.6 g, 83%). La estructura se confirmo por espectro de LC- MS. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
TLC:Rf=0.20 (gel de sflice, EtOAc/Eter de petroleo =1/1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=221
Smtesis de 2-4
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A una solucion de yoduro de trimetilsulfoxonio (11.50 g, 52 mmol) en t-BuOH (100 mL) se agrego t-BuOK (5.00 g, 52 mmol) y la reaccion se agito a 50°C durante 1.5 h. Se agrego 2-3 (4.60 g, 21 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a 50°C durante unas 48 h adicionales. La mezcla se vertio en H2O (300 mL) y se extrajo con EtOAc (200 mL x 3). 5 Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina (200 mL), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se lavo con EtOAc (20 mL) y el solido amarillo obtenido se seco bajo presion reducida para proporcionar el producto (2.30 g, 44%). La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
TLC:Rf=0.20 (gel de sflice, EtOAc/Eter de petroleo =1/1, v/v)
10 LC-MS: [M+1]+=249
Smtesis de 2-5
imagen22
A una solucion de 2-4 (2.30 g, 9.3 mmol) en CH3OH (30 ml) se agrego 10% de Pd/C (230 mg) y la reaccion se agito 15 bajo una atmosfera de hidrogeno durante la noche. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con MeOH. El filtrado se concentro y el residuo se purifico mediante cromatograffa de columna con gel de silice (CH2Cl2/CH3OH=80/1-20/1) para dar 2-5 (320 mg, 16%) como solido rojo. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC:Rf=0.3 (gel de sflice, EA:PE=1:2, v/v)
20 LC-MS: [M+1]+=219
Smtesis del compuesto 2
imagen23
A una solucion de 2-5 (160 mg, 0.73 mmol) y el intermedio clave A (200 mg, 0.73 mmol) en dioxano (30 mL) bajo N2, 25 se agrego Pd(PPh3)4 (84 mg, 0.073 mmol), Cs2CO3 (587 mg, 1.46 mmol) y Xphos (35 mg, 0.073 mmol). La mezcla se calento a reflujo durante 3h. Se permitio que la reaccion se enfriara a temperatura ambiente y se vertio en H2O (50 mL). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (50 mL x 2) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina (30 mL), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo crudo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna con gel de sflice (CH2Cl2/CH3OH=40/1-40/3) para dar el analogo 2 (80 mg, 24%) 30 como solido amarillo palido. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC:Rf=0.32 (gel de sflice, MeOH/CH2Cl2=1/40, v/v)
LC-MS: [M+1]+=455
1H-RMN(400 MHz, da-DMSO) 8(ppm): 9.49 (s, 1 H), 9.37 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 8.53 (d, J = 5.0 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.46 - 4.31 (m, 4H), 3.19 (dd, J = 8.5, 3.8 Hz, 2H), 2.98 (dd, J = 4.8, 2.5 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.87 (dd, J = 13.7, 5 6.9 Hz, 4H).
Ejemplo 3 - Smtesis del compuesto 3
imagen24
10
imagen25
Una mezcla de A (50 g, 364.5 mmol) y B (34 g, 367.5 mmol) en hexano (80 mL) se agito a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se filtro y la torta de filtro se lavo con hexano y MTBE para dar el producto deseado (40 g, 48%) como un solido blanco. LC-MS: 229.9 ([M+1]+).
15 Smtesis de 6-Clorometil-4-(4-metoxi-bencil)-morfolin-3-ona
imagen26
A una solucion de C (18 g, 78.4 mmol) en DCM (200 mL) se agrego NaOH ac. 1 M (85 mL) y la solucion se enfrio a 0°C. Una solucion de ClCH2COCl (8.5 mL, 112.9 mmol) en DCM (50 mL) se agrego en forma de gotas y la reaccion 20 se agito a 0°C durante 1h. La reaccion se calento a temperatura ambiente y se agrego NaOH ac. 10.0 M (60 mL), la
mezcla se agito durante unas 4 h adicionales, luego se diluyo con agua y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con DCM y las capas organicas combinadas se lavaron con agua, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar el producto crudo, que se purifico sobre gel de sflice con Eter de petroleo/EtOAc (10:1 a 4:1) para dar el producto deseado (11 g, 52%) como un aceite amarillo claro.
5 LC-MS: 291.8 ([M+Na]+).
Smtesis de 3-(4-Metoxi-bencil)-6-oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptan-2-ona
imagen27
A una solucion agitada de D (8 g, 29.7 mmol) en THF (140 mL) y tolueno (140 mL) a 0°C se agrego en forma de 10 gotas una solucion de KHMDS (1.0 M en THF 50 mL) y la reaccion se agito durante 1 h. La reaccion se detuvo mediante adicion de NH4Cl ac. (150 mL), y durante 20 minutos a 0°C. La mezcla se filtro y la torta de filtro se lavo con EtOAc. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc, las capas organicas combinadas se lavaron con agua, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para dar el producto crudo (7.5 g, 100%) que se utilizo directamente en la siguiente etapa sin ninguna purificacion adicional. LC-MS: 255.8 ([M+Na]+).
15 Smtesis de 3-(4-Metoxi-bencil)-6-oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptano
imagen28
A una solucion de E (5.6 g, 24 mmol) en THF (130 mL) se agrego en forma de gotas BH3 2.0 M en Me2S (30.9 mL) a 0°C. La reaccion luego se calento a temperatura ambiente y se agito durante la noche. La reaccion se detuvo 20 mediante adicion de MeOH y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agrego y K2CO3 acuoso y la mezcla se calento a 60°C durante 30 minutos. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y la mezcla se extrajo con EtOAc, las capas organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron para dar el producto crudo que se purifico sobre gel de silice con Eter de petroleo /EtOAc(8:1 a 1:1) para dar F (2.5 g, 47%) como un aceite incoloro. LC-MS: 220.0 ([M+1]+).
25 Smtesis de ester de tert-butino de acido 6-Oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptano-3-carboxflico
imagen29
A una solucion de F (1.0 g, 4.6 mmol) en MeOH (60 mL) se agrego Boc2O (2.0 g, 9.3 mmol) y Pd(OH)2 sobre carbon activado (1.0 g, 10%) y la mezcla se agito a 50°C bajo una atmosfera de H2 (50 psi) durante la noche. El LCMS 30 mostro que se completo la reaccion. La mezcla se filtro y la torta de filtro se lavo con MeOH. El filtrado se concentro para dar el producto crudo (1.1 g, 100%) como un aceite incoloro sin ninguna purificacion. LC-MS: 222.0 ([M+Na]+.
Smtesis de 6-Oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptano
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A una solucion de G (900 mg, 4.5 mmol) en DCM (20 mL) se agrego en forma de gotas una solucion de CF3COOH (6.0 g) en DCM (10 mL) a 0°C. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 h. El LCMS mostro que se completo la reaccion. El solvente se elimino en vacm para dar el producto crudo (1.3 g, 100%) como aceite incoloro que se utilizo directamente en la siguiente etapa. LC-MS: 99.8 ([M+1]+).
Smtesis de (1S,5R)-3-(4-nitrofenil)-6-oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptano
imagen31
A una mezcla agitada de H (720 mg, 3.41 mmol) en DMSO (20 mL) se agrego 1-fluoro-4-nitrobenceno (481 mg, 3.41 mmol) y K2CO3 (1.89 g, 13.64 mmol). La mezcla se calento a 90°C y se agito durante 4 h. El TLC mostro que se completo la reaccion. La mezcla se vertio en agua (50 mL) y se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4) se filtraron y se concentraron. Un precipitado se formo durante evaporacion del solvente y se recolecto para conseguir 130 mg del producto. El filtrado se concentro y se purifico mediante columna de gel de sflice (Eter de petroleo /EtOAc=5/1) para conseguir unos 50 mg adicionales del producto deseado (rendimiento total 180 mg 24%). LC-MS: 220.9 ([M+1]+).
Smtesis de 4-((1S,5R)-6-oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptan-3-il)benzenamina
imagen32
J
A una solucion de I (180 mg, 0.82 mmol) en CH3OH (30 mL) se agrego Pd/C (10%, 18 mg) y la mezcla se agito bajo una atmosfera de H2 a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celita y la torta de filtro se lavo con CH3OH. El filtrado se concentro para dar el producto deseado (140 mg, 90%) como un solido marron. LCMS: 191.0 ([M+1]+).
Smtesis de 4-(6-(4-((1S,5R)-6-oxa-3-aza-biciclo[3.1.1]heptan-3-il)fenilamino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil) benzamida
imagen33
A una solucion de J (140 mg, 0.74 mmol) y K (202 mg, 0.74 mmol) en dioxano (20 mL) se agrego Pd2(dba)3 (64 mg, 0.07 mmol), X-phos (33 mg, 0.07 mmol) y Cs2CO3 (531 mg, 1.63 mmol) a temperatura ambiente bajo N2. La mezcla se calento a 100°C y se agito durante 5 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se filtro; al filtrado se
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agrego H2O (50 mL). El producto se extrajo con EtOAc y las capas organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron para dar el producto crudo que se purifico mediante cromatograffa sobre gel de silice
(PE/EA=1/1----CH2WCH3OH = 50/1) para conseguir el producto deseado (100 mg, 32%). LC-MS: 426.2 ([M+1]+),
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 9.38 (s, 1 H), 9.34 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 8.50 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.26 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.72 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.70 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.54 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 3.34 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 3.10 (q, J = 6.8 Hz, 1 H), 1.94 (d, J = 8.4 Hz, 1 H). Ejemplo 4 -
Smtesis del compuesto 4
imagen34
imagen35
A una solucion de A (200 mg, 1.34 mmol) y B (226 mg, 1.60 mmol) en DMSO (20 mL) se agrego K2CO3 (221 mg, 1.60 mmol) y la mezcla se agito a 80°C durante la noche. A la mezcla se agrego H2O (50 mL) y el producto se extrajo con EtOAc (50 mL). La fase organica se lavo con solucion salina (50 mL), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro para dar el producto crudo que se lavo con 2-metoxi-2-metilpropano (15 mL) para dar el producto (240 mg, 76%) como un solido amarillo. LC-Ms: [M+1]+ 234.9.
Smtesis de 4-(8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octan-3-il)anilina
imagen36
A una solucion de C (550 mg, 2.2 mmol) en CH3OH (30 mL) se agrego Pd/C (10%, 55 mg) y la mezcla se agito bajo una atmosfera de H2 a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de celita y el filtrado se concentro para dar el producto crudo (480 mg) como un solido marron que se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion. lC-MS: 205.1 ([M+1]+).
Smtesis de 4-(2-((4-(8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octan-3-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida
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A una solucion de D (220 mg, 1.08 mmol) y E (294 mg, 1.08 mmol) en dioxano (30 mL) se agrego Pd2(dba)3 (100 mg, 0.11 mmol), X-phos (52.4 mg, 0.11 mmol) y Cs2CO3 (870 mg, 2.16 mmol) bajo N2. La mezcla se agito a 80°C durante 8 h. A la mezcla se agrego H2O (50 mL) y el producto se extrajo con C^Ch (50 mL x 3). La capa organica se lavo con solucion salina (100 mL), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro para conseguir el producto crudo, que se purifico mediante cromatograffa de columna (gel de sflice, CH2Cl2/CH3OH = 50/1 - 30/1) para proporcionar el producto (72 mg, 15%) como un solido amarillo. LC-MS: 441.2 ([M+1]+), 1H-RMN: 8.46 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.07 (s, 1 H), 6.84 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.60 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 4.50 (s, 2H), 4.42 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.31 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 3.01 (dd, J1=2.4 Hz, J2=11.6 H, 2H), 1.97 (s, 4H)
Ejemplo 5 - Smtesis del compuesto 5
imagen38
imagen39
A una solucion 5-A (10.00 g, 73 mmol) en THF/H2O (50 mL/50 mL), se agrego Na2CO3 (23.10 g, 218 mmol). Se agrego en forma de gotas CbzCl (14.90 g, 87 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5h. La mezcla se extrajo con EtOAc (100 mL x 3) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna con gel de sflice EtOAc/Eter de petroleo =1/100~1/4 para dar 5-B (16.50 g 96 %) como un aceite incoloro. TLC: Rf=0.65 gel de sflice EtOAc/Eter de petroleo =1/1 v/v
Smtesis de 5-C
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Una mezcla agitada de 5-B (16.50 g, 70 mmol) en CH2CI2 (90 mL) se enfrio a 0 y se agrego DIPEA (45.30 g, 0.35 mol). Se agrego en forma de gotas piridina trioxido de azufre (25.70 g, 0.16 mol) en DMSO (100 mL) a esa temperatura y la mezcla de reaccion se agito a 0 durante 2h. La mezcla se vertio en HCl 4M y se extrajo con CH2CI2 (100 mL x 3). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron 5 y se concentraron. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna con gel de sflice EtOAc/Eter de petroleo =1/100~1/6 para dar (14.90 g. 90%) como solido blancuzco. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. LC-MS: [M+1]+= 234
Smtesis de 5-D
rr° ~t J<
X 1
Cbz U' SCyC
HO"'''
10
A una suspension de yoduro de trimetilsulfoxonio (35.20 g, 0.16 mol) en t-BuOH (150 mL) se agrego t-BuOK (17.95 g, 0.16 mol) a 50°C, la mezcla se volvio una suspension turbia. La mezcla se agito a la misma temperatura durante 1.5h. El compuesto 5-C (14.90 g, 64 mmol) luego se agrego a esa temperatura y la mezcla se agito a 50°C durante otras 48h. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se sometio a particion entre NH4Cl acuoso 15 saturado y EtOAc. La fase organica se separo, se seco (MgSO4), se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo obtenido se purifico gel de sflice cromatograffa de columna (EtOAc/Eter de petroleo =1/6) para dar (2.0 g, 11%) como aceite incoloro. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC: Rf=0.52 gel de sflice EtOAc/Eter de petroleo =1/1
LC-MS: 262 ([M+1]+),
20 H-RMN: 7.33 (m, 5H), 5.14 (s, 2H), 4.66 - 4.43 (m, 2H), 3.82 (d, J = 13.0 Hz, 1 H), 3.67 - 3.07 (m, 3H), 2.37 (m, 2H), 1.99- 1.35 (m, 4H).
Separacion con HPLC quiral
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Cbz
5-0
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25 1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonano-6-carboxilato de bencilo racemico se sometio a cromatograffa preparativa para separacion enantiomerica utilizando una columna CHIRALPAK ADH (0.46cm I.D. x 15 cm L) y 100% de EtOH como eluyente (fndice de flujo: 0.5 mL/min). La concentracion en vacfo proporciona el pico 1 (0.90 g) como un aceite y pico 2 (0.76 g) como un aceite.
Smtesis de 5-2
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imagen43
A una solucion de 5-1 (900 mg, 3.44 mmol) en CH3OH (15 mL) se agrego 10% de Pd/C (180 mg) y la reaccion se agito bajo una atmosfera de hidrogeno (45 psi) a 80°C durante 5 horas. La mezcla de reaccion se filtro a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro para dar 5-2 (438 mg, 100%) que se utilizo
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para la siguiente etapa sin purificacion adicional. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. LC-MS: [M+1]+=128, [2M+1]+=255.
Smtesis de 5-3
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A una solucion de 5-2 (438 mg, 3.05 mmol) en DMSO (15 mL) se agrego 1-fluoro-4-mtrobenceno (430 mg, 3.05 mmol) y K2CO3 (506 mg, 3.66 mmol). La mezcla se agito a 80°C durante 5 horas. Se permitio que la mezcla de reaccion se enfriara a temperatura ambiente. Se agrego agua y la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas se combinaron, se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo crudo se purifico mediante cromatograffa de columna (Eter de petroleo /EtOAc, 6:1 ~4:1) para dar 5-3 (469 mg, 62%). TLC: Rf=0.37 (gel de s^lice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=249, [M+Na]=271.
Smtesis de 5-4
imagen45
A una solucion de 5-3 (360 mg, 1.45 mmol) en THF (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (53 mg) y la reaccion se agito bajo una atmosfera de hidrogeno durante la noche. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida para dar 5-4 (317 mg, 100%), que se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional. La estructura se confirmo por espectro de LC- MS.
TLC: Rf=0.30 (gel de sflice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=219.
Smtesis del compuesto 5
imagen46
Compuesto 5
PcMdteb
Xphos
Cs2COi
Oioxano
CN
refill
ntermedio clave
A una solucion de 5-4 (250 mg, 1.14 mmol), el intermedio clave A (312 mg, 1.14 mmol) y Cs2CO3(750 mg, 2.28 mmol) en dioxano (15 mL) se agrego Xphos(55 mg. 0.114 mmol) y Pd2(dba)3 (105 mg, 0.114 mmol). La mezcla de
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reaccion se agito bajo una atmosfera de nitrogeno a 100°C durante 7 horas. Se permitio que la reaccion se enfriara a temperatura ambiente, se filtro a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con EtOAc. La mezcla se sometio a particion entre EtOAc y H2O y la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron bajo presion reducida. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna (Eter de petroleo /EtOAc= 5:1 ~1:1 luego CH2Cl2:CH3OH=50:1) para dar un solido amarillo palido. El solido obtenido se suspendio en metanol (5 mL) y se agito durante 30 min, se filtro, se lavo con MTBE y se seco bajo presion reducida para dar el analogo 5 (65 mg, 8%) como solido amarillo palido. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC: Rf=0.13(gel de sflice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=455
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5(ppm):. 8.47 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.18 - 7.05 (m, 2H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.66 (t, J = 5.3 Hz, 1 H), 4.61 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.44 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 3.21 - 3.12 (m, 1 H), 3.07 (d, J = 11.5 Hz, 1 H), 2.89 (m, 1 H), 2.48 (m, 2H), 2.03- 1.62 (m, 4H).
Ejemplo 6 - Smtesis del compuesto 6
imagen47
imagen48
A una solucion de 6-1 (766 mg, 2.93 mmol) en CH3OH (15 mL) se agrego 10% de Pd/C (180 mg) y la reaccion se agito a 80°C bajo una atmosfera de hidrogeno durante 5 horas. Se permitio que la mezcla de reaccion se enfriara a temperatura ambiente y el catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita. El filtrado se concentro para dar 6-2 (372 mg, 100%) de producto crudo que se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. LC-MS: [M+1]=128
Smtesis de 6-3
imagen49
Una solucion de 6-2(330 mg, 2.59 mmol) en DMSO (15 mL) se agrego 1-fluoro-4-nitrobenceno (370 mg, 2.59 mmol) y K2CO3 (429 mg, 3.11 mmol). La mezcla se agito a 80°C durante 5 horas luego se dejo enfriar a temperatura
ambiente. Se agrego agua y la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron bajo presion reducida. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna (Eter de petroleo: EtOAc= 6:1 ~4:1) para dar 6-2 (318 mg, 49%). La estructura se confirmo por espectro de LCMS. TLC: Rf=0.37 (gel de sflice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v)
5 LC-MS: [M+1]=249.
Smtesis de 6-4
imagen50
A una solucion de 6-3 (318 mg, 1.28 mmol) en THF (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (32 mg) y la reaccion se agito a 10 temperatura ambiente bajo una atmosfera de hidrogeno durante la noche. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y la almohadilla de filtro se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida para dar 6-4 (280 mg, 100%) de producto crudo, que se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. TLC: Rf=0.30 (gel de silice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v) LC-MS: [M+1]+=219
15 Smtesis del compuesto 6
imagen51
A una solucion de 6-4(150 mg, 0.69 mmol), el intermedio clave A (188 mg, 0.69 mmol) y Cs2CO3(448 mg, 1.38 mmol) en dioxano (15 mL) se agrego Xphos (33 mg. 0.069 mmol) y Pd2(dba)3 (63 mg, 0.069 mmol). La reaccion se 20 agito bajo una atmosfera de nitrogeno a 100°C durante 7 horas. Se permitio que la reaccion se enfriara a temperatura ambiente, se filtro a traves de una almohadilla de Celita y se lavo con EtOAc. Se agrego agua y la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron bajo presion reducida. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna (Eter de petroleo /EtOAc= 5:1 ~1:1 luego CH2C^:CH3OH=80:1) para proporcionar un solido amarillo 25 palido. El solido se suspendio en metanol (2 mL) y se agito durante 30 min y se recolecto mediante filtracion, se lavo con MTBE. El solido se seco bajo presion reducida para dar el analogo 5 (83 mg, 26%) como solido amarillo palido. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN. TLC: Rf=0.13 (gel de silice, Eter de petroleo: EtOAc=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+=455
30 1H RMN (400 MHz, CDCh) 6(ppm): 8.44 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.51
(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.16 (s, 1 H), 7.08 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.96 (m, 2H), 4.67 - 4.53 (m, 2H), 4.40 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.39 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 3.11 (m, 2H), 2.93 (m, 1 H), 2.57-2.38 (m, 2H), 2.01 -1.66 (m, 4H). Ejemplo 7 -
Ejemplo 7 - Smtesis del compuesto 7
imagen52
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5 A una solucion agitada del intermedio A (10.00 g, 81 mmol) en H2O/THF=1/1(200 mL) se agrego Na2CO3 (24.30 g 0.23 mol) y Cbz-Cl (23.50 g, 0.14 mol). La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 h. La reaccion se detuvo mediante adicion de HCl 1 M y la capa acuosa se extrajo dos veces con DCM. Las capas organicas combinadas luego se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4) se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc/Eter de petroleo =1:4) para dar B (15.50 g 87%) 10 como solido blanco. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. TLC:RF=0.3 (gel de sflice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+H]+= 222 ; [M+23]= 244.
Srntesis de C
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15 A una solucion agitada del intermedio B (15.50 g, 0.07 mol) en DCM (100 mL) se agrego DIPEA (35.2 mL 0.21 mol) a 0°C. Una solucion de piridina trioxido de azufre (25.2g, 0.16 mol) en DMSO (70 mL) se agrego en forma de gotas y la mezcla resultante se agito a 0°C durante 1h. La reaccion se detuvo mediante adicion de H2O y la capa acuosa se extrajo dos veces con DCM. Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El producto crudo obtenido se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc/Eter de 20 petroleo =1:2) para dar compuesto C (13.80 g, 90%) como solido amarillo. Su estructura se confirmo por espectro de LC-MS.
TLC:Rf=0.7 (gel de sflice, EA:PE=1:1, v/v)
LC-MS: [M+23]= 242.
Srntesis de D 25
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A una solucion agitada de yoduro de trimetilsulfoxonio (32.70 g, 0.15 mol) en (100 mL) se agrego t-BuOK (14.30 g 0.13) y la reaccion se agito a 50°C durante 1h. Luego se agrego el intermedio C (13.00 g 60 mmol) y la mezcla resultante se agito a 50°C durante unas 48 h adicionales. La mezcla de reaccion se detuvo mediante adicion de solucion saturada de NH4Cl y se sometio a particion contra EtOAc. La capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc 5 y las capas organicas combinadas luego se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc /Eter de petroleo =1:2) para dar D (2.70 g 18%) como aceite amarillo. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC:Rf=0.36 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+H]+=248 ; [M+Na]=270
10 H-RMN(400 MHz, CDCla) 6(ppm): 7.37 (m,5H), 5.14 (d, 2H), 4.53 (m, 2H), 3.85-3.47 (m, 4H), 2.67 (m, 2H), 2.38-1.98
(m, 2H).
Separacion con HPLC quiral
imagen57
15 1-oxa-6-azaespiro[3.4]octano-6-carboxilato de bencilo racemico se sometio a cromatograffa preparativa utilizando una columna ChiRaLPAK AYH (0.46cm I.D. x 15 cm L). Hexano/EtOH =50/50 se utilizaron como eluyente (fndice de flujo: 1 mL/min). La concentracion en vado da el pico 1 (1.12 g) como un aceite y el pico 2 (1.33 g) como un aceite.
Smtesis de 7-2
20
A una solucion agitada del intermedio 7-1 (1.10 g, 4.5 mmol) en MeOH (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (110 mg) y la reaccion se calento a reflujo bajo una atmosfera de hidrogeno durante 2 dfas. Se permitio que la reaccion se enfriara a temperatura ambiente y luego se filtro a traves de una almohadilla de Celita. La almohadilla de filtro se lavo con MeOH y el filtrado se concentro bajo presion reducida para dar 7-2 (490 mg, 97%) como un aceite. La 25 estructura se confirmo por LC-MS. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
TLC: Rf =0.04 (gel de sflice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+1]+= 114.
Smtesis de 7-3
30
A una solucion agitada de 7-2 (490 mg, 4.3 mmol) en THF (50 mL) se agrego K2CO3 (718 mg, 5.2 mmol), seguido por 1-fluoro-4-nitrobenceno (612 mg, 4.3 mmol). La mezcla resultante se agito a 80°C durante 5h. Se permitio que la reaccion se enfriara a temperatura ambiente y se vertio en agua. La capa acuosa se extrajo con EtOAc y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El 35 producto crudo obtenido se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc/Eter de petroleo =1:2) para dar 7-3 (560 mg 55%) como solido amarillo. La estructura se confirmo por LC-MS.
TLC:Rf=0.4 (gel de sflice, EA:PE=1:2, v/v)
imagen58
imagen59
LC-MS: [M+H]+= 235; [M+Na]= 257 Smtesis de 7-4
imagen60
5 A una solucion agitada de 7-3 (560 mg, 2.4 mmol) en MeOH (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (50 mg) y la reaccion se agito bajo una atmosfera de hidrogeno durante la noche. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de Celita y el filtrado se concentro bajo presion reducida para dar 7-4 (486 mg, 99%) como solido rojo. La estructura se confirmo por LCMS. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
TLC: Rf =0.25 (gel de sHice, EA:PE=1:1, v/v)
10 LC-MS: [M+H]+=205.
Smtesis del compuesto 7
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A una solucion agitada de 7-4 (243mg, 1.19 mmol) en dioxano (40 mL) se agrego Cs2CO3 (775 mg 2.38 mmol) y X- 15 phos (57 mg 0.119 mmol), seguido por Pd2(dba)3 (109 mg, 0.119mmol). La mezcla resultante se calento a 100°C durante 6h bajo N2. La reaccion se filtro a traves de una almohadilla de celita y la almohadilla de filtro se lavo con EtOAc. El filtrado se sometio a particion contra agua y la capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El producto crudo obtenido se purifico mediante cromatograffa flash (MeOH/DCM=1:50) para dar el analogo 7 (165 mg, 20 31%) como un solido amarillo. La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC:Rf=0.4 (gel de sHice, MeOH/DCM=1:20, v/v)
LC-MS: [M+H]+= 441
H-RMN(400 MHz, d4-DMSO) 8(ppm):9.36 (s, 2H), 8.51 (d, J = 4.2 Hz, 1 H), 8.26 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.01 - 7.98 (m, 2H), 7.66 - 7.52 (m, 2H), 7.37 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 6.60 - 6.48 (m, 2H), 4.50 - 4.31 (m, 4H), 3.58 - 3.52 (m, 1 H), 3.29 25 - 3.22 (m, 2H), 2.81 - 2.62 (m, 2H), 2.39 - 2.11 (m, 2H).
Ejemplo 8 - Smtesis del compuesto 8
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H, PtJ.'C MeOH
B-2
5 A una solucion agitada de 8-1 (1.33 g, 5.4 mmol) en MeOH (20 mL) se agrego 10% de Pd/C (130 mg) y la reaccion se calento a 80°C bajo una atmosfera de hidrogeno durante 2 dfas. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y la almohadilla de filtro se lavo con MeOH. El filtrado se evaporo bajo presion reducida para dar 8-2 (608 mg 100%) como un aceite. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
10 TLC: Rf =0.04 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+1]+= 114.
Smtesis de 8-3
imagen63
imagen64
imagen65
H THF KsCOj
3-2 8-3
15 A una solucion agitada de 8-2 (623 mg, 5.5 mmol) en THF (50 mL) se agrego K2CO3 (914 mg 6.6 mmol), seguido por 1-fluoro-4-nitrobenceno (777 mg, 5.5 mmol). La mezcla resultante se agito a 80°C durante 5h. Se permitio que la mezcla de reaccion se enfriara a temperatura ambiente y se vertio en agua. La capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc y las capas organicas combinadas luego se lavaron con solucion salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron para proporcionar el producto crudo que se purifico mediante cromatograffa flash (EtOAc/Eter de 20 petroleo=1:2) para dar 8-3 (677 mg, 52%) como solido amarillo. La estructura se confirmo por espectro de LC-MS.
TLC:Rf=0.4 (gel de sHice, EA:PE=1:2, v/v)
LC-MS: [M+H]+=235, [M+Na]= 257.
Smtesis de 8-4
5
10
15
20
25
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A una solucion agitada de 8-3 (677 mg, 2.9 mmol) en MeOH (50 mL) se agrego 10% de Pd/C (60 mg) y la reaccion se agito bajo una atmOsfera de hidrOgeno durante la noche. El catalizador se eliminO mediante filtraciOn a traves de una almohadilla de Celita y la almohadilla de filtro se lavO con MeOH. El filtrado se concentrO bajo presiOn reducida para dar 8-4 (554 mg, 93%) como sOlido rojo. La estructura se confirmO por espectro de LC-MS. tLC: Rf =0.25 (gel de sflice, EA:Pe=1:1, v/v)
LC-MS: [M+1]+= 205.
Smtesis del compuesto 8
imagen67
A una soluciOn agitada de 8-4 (286 mg, 1.4 mmol) en dioxano (40 mL) se agregO Cs2CO3 (912 mg 2. 8 mmol) y X- phos (67 mg 0.14 mmol), seguido por Pd2(dba)3 (128 mg, 0.14mmol). La mezcla resultante se calentO a 100°C durante 6h bajo una atmOsfera de nitrOgeno. El catalizador se eliminO mediante filtraciOn a traves de una almohadilla de celita y la almohadilla se lavO con EtOAc. El filtrado se sometiO a particiOn contra agua y se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas organicas combinadas luego se lavaron con soluciOn salina, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron bajo presiOn reducida. El producto crudo se purificO mediante cromatograffa flash (MeOH/DCM=1:50) para dar el analogo 8 (167 mg, 27%) como sOlido amarillo. La estructura se confirmO por LC-MS y espectro de H- RMN.
TLC:Rf=0.4 (gel de sflice, MeOH/DCM=1:20, v/v).
LC-MS: 441 ([M+1]+).
H-RMN(400 MHz, d6-DMSO) 6(ppm):9.36 (s, 2H), 8.51 (d, J = 4.2 Hz, 1 H), 8.26 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.09 - 7.98 (m, 2H), 7.66 - 7.52 (m, 2H), 7.37 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.60 - 6.48 (m, 2H), 4.50 - 4.31 (m, 4H), 3.58 - 3.52 (m, 2H), 3.29 - 3.22 (m, 2H), 2.81 - 2.62 (m, 2H), 2.39 - 2.11 (m, 2H).
Ejemplo 9 - Smtesis del compuesto 9
imagen68
imagen69
5 A una solucion de A (50 g, 381.6 mmol) en MeOH (350 mL) se agrego SOCI2 (30 mL) a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se agito durante 1 h y luego se calento a 65°C durante la noche. El solvente se evaporo y el residuo se disolvio en CH2Cl2 (800 mL). La mezcla se enfrio a 0°C, se agrego TEA (130 mL) y luego CbzCl (62.2 mL) se agrego en forma de gotas. Despues de agitacion a 0°C durante 30 minutos, la reaccion se detuvo al verter en una solucion acuosa de acido citrico (10%, 800 mL) y el producto se extrajo con CH2O2. Las capas organicas 10 combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar el producto crudo (64 g, 60%) como aceite amarillo claro, que se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional. LC-MS: 301.8 ([M+Na]+).
Smtesis de 2-metil 4-(metilsulfoniloxi)pirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2S,4R)-1-bencilo
MsCI; TEA
i DMAP, DCM
Cbz *
B C
15 A una solucion de B (50 g, 179 mmol) en DCM (1500 mL) se agrego en forma de gotas TEA (29 mL) a 0°C, seguido por MsCl (18.8 mL). Una cantidad catalttica de DMAP (6.8 g) se agrego y la mezcla se agito a 0°C durante 1 h, luego a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reaccion se vertio en agua helada y el producto se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con ac. HCl al 10%, NaHCO3 ac. al 5% y agua, se secaron
imagen70
imagen71
(Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar el producto crudo (65 g, 100%) como aceite incoloro. LC-MS: 379.8 ([M+Na]+).
Smtesis de 2-metil 4-(benzoiloxi)pirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2S,4S)-1-bencilo
5
imagen72
A una solucion de C (60.00 g, 0.16 mol) en DMSO (600 mL) se agrego BzONa (49.00 g, 0.34 mol) a temperatura ambiente y la mezcla de reaccion se calento a 90°C durante la noche. La mezcla de reaccion se vertio en agua y EtOAc. La fase organica se separo y la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatograffa de columna (Eter de 10 petroleo /EtOAc =10:1 a 5:1) para dar el producto (28 g, 46%) como un solido blanco. LC-MS: 383.9 ([M+1]+).
Smtesis de 2-metil 4-hidroxipirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2S,4S)-1-bencilo
imagen73
A una solucion de D (23 g, 65.8 mmol) en MeOH (100 mL) se agrego K2CO3 (9.1 g, 65.8mmol) a 0°C, y la mezcla se 15 agito a temperatura ambiente durante 1 h. El TLC mostro que se completo la reaccion. La mezcla se filtro, el filtrado se concentro en vacfo para eliminar MeOH, el residuo se disolvio en EtOAc, se lavo con agua, solucion salina, se seco (MgSO4) se filtro y se concentro para dar el producto crudo que se purifico mediante cromatograffa sobre gel de sflice (Eter de petroleo /EtOAc=4/1-1/1) para conseguir el producto deseado (12.6 g, 70%) como aceite amarillo claro.
20 Smtesis de 2-metil 4-(tert-butildimetilsililoxi)pirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2S,4S)-1-bencilo
imagen74
A una solucion de E (11.50 g, 41 mmol) en CH2Cl2 (170 mL) se agrego imidazol (5.60 g, 82 mmol) y TBSCI (11.2 g, 74mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1.5 h. La mezcla de reaccion se vertio en 25 agua y EtOAc, la capa organica se separo, se lavo con agua, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para dar el producto deseado (15.9 g, 99%) como aceite incoloro.
Smtesis de 4-(tert-butildimetilsililoxi)-2-(hidroximetil)-pirrolidina-1 -carboxilato de (2S,4S)-bencilo
5
10
15
20
25
imagen75
A una solucion de F (15.0 g, 38 mmol) en THF (50 mL) se agrego LiBH4 (1.9 g, 87 mmol) a 0°C, la mezcla se calento a temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 4 h, El TLC mostro que se completo la reaccion y agua se agrego. El producto se extrajo con EtOAc y la capa organica se lavo con solucion salina, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para dar el producto crudo (13.2 g, 95%) como aceite incoloro, que se utilizo directamente en la siguiente etapa.
Smtesis de 4-(tert-butildimetilsililoxi)-2-((metilsulfoniloxi)-metil)pirrolidina-1 -carboxilato de (2S,4S)-bencilo
imagen76
Una solucion de G (13.0 g, 35.6 mmol) y DIPEA (12.5 mL) en CH2Cl2 (150 mL) se trato con MsCl (4.2 mL) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 15 minutos, luego a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. La reaccion se diluyo con CH2Ch, se lavo con agua, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para dar el producto crudo (16.5 g, 100%) como aceite amarillo claro que se utilizo en la siguiente etapa sin ninguna purificacion. LC-MS: 465.7 ([M+Na]+).
Smtesis de 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptano-5-carboxilato de (1S, 4S)-bencilo
imagen77
Una solucion de H (15.6 g, 35.2 mmol) en THF (400 mL) se trato con TBAF (30.0 g, 114.7 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se enfrio a 0°C y se agrego NaH (1.5 g, 62.5 mmol). Se continuo la agitacion a temperatura ambiente durante 24 h. La reaccion se detuvo al verter la mezcla en agua y el producto se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco (Na2SO4), se filtro y se evaporo en vacm para dar el producto crudo purificado mediante cromatograffa flash (gel de sflice, eter de petroleo /EtOAc = 10:1 ~3:1) para dar el producto deseado (6.2 g, 76%) como aceite amarillo claro. LC-MS: 255.8 ([M+Na]+).
Smtesis de (1S,4S)-2-oxa-5-aza-biciclo[2.2.1]heptano
5
10
15
20
25
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Una solucion de G (1.80 g, 7.7 mmol) en MeOH (50 mL) se hidrogeno en la presencia de Pd/C (10%, 0.9 g) bajo una atmosfera de H2 a 50°C. La mezcla de reaccion se agito durante la noche. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celita y el solvente se elimino en vado para dar el producto crudo (1.3 g, 100%) como aceite, que se utilizo directamente en la siguiente etapa sin ninguna purificacion. LC-MS: 99.9 ([M+1]+).
Smtesis de (1S, 4S)-2-(4-nitrofenil)-5-oxa-2-aza-biciclo[2.2.1]heptano
imagen79
Una mezcla de K (1.3 g, 13.1 mmol), 1-fluoro-4-nitrobenceno (2.2 g, 15.7 mmol) y K2CO3 (2.16 g, 15.7 mmol) en DMSO (40 mL) se calento a 80°C durante 4 h. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente, se agrego agua y se agito durante 10 minutos. El producto se extrajo con EtOAc y la capa organica se lavo con agua se seco (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron para dar el producto crudo que se lavo con MTBE para dar el producto deseado (1.2 g, 42%) como un solido amarillo. LC-mS: 221 ([M+1]+).
Smtesis de 4-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)anilina
imagen80
A una solucion de L (600 mg, 2.7 mmol) en CH3OH (50 mL) se agrego Pd/C (60 mg) y la mezcla se agito bajo una atmosfera de H2 a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla se filtro a traves de Celita para eliminar el catalizador y el filtrado se concentro para dar el producto deseado (500 mg, 96%) como un solido rojo. LC-MS: 191.0 ([M+1]+).
Smtesis de 4-(6-((4-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)fenil)amino)-pirimidin-4-il)-N-(cianometil) benzamida
imagen81
A una solucion de M (315 mg, 1.66 mmol) y N (450 mg, 1.66 mmol) en dioxano (50 mL), se agrego Pd2(dba)3 (150 mg, 0.17 mmol), X-phos (78 mg, 0.16 mmol) y Cs2CO3 (1.21 g, 3.7 mmol) a temperatura ambiente bajo N2. La mezcla se calento a reflujo y se agito durante 5h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de papel de filtro; el filtrado se sometio a particion contra agua (50 mL). La capa acuosa se extrajo con EtOAc, las capas organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron para dar el producto crudo que se purifico mediante gel de sflice (PE/EA=1/1 luego CH2Cl2/CH3OH=50/1) para conseguir el producto deseado (70 mg, 10%) como un solido amarillo. LC-MS: 441.2 ([M+1]+), 1H RMN (400 MHz, DMSO) 8 9.39 (s, 1H), 9.36 (t, J = 6.0 Hz),
8.51 (d, J = 5.1 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.62 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.60 (s, 1 H), 4.51 (s, 1 H), 4.36 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.72 (ABq, J = 7.0 Hz, Av= 21.2 Hz, 2H), 3.51 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 2.94 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 1.95-1.82 (m, 1 H).
Ejemplo 10 - Smtesis del compuesto 10
5
imagen82
Smtesis de (1R,4R)-5-acetil-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-3-ona
imagen83
Una mezcla agitada de A (50 g, 381.6 mmol) y AC2O (305 mL) se calento a 90°C durante 16 h bajo N2, el solvente se evaporo bajo presion reducida, el residuo se disolvio en EtOAc y se lavo con agua. La capa acuosa se extrajo
5
10
15
20
25
adicionalmente con CHCI3 y las capas organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron. El residuo obtenido se recristalizo a partir de EtOAc para obtener el producto (24 g, 40%) como un solido blanco.
Smtesis de clorhidrato de acido (2R,4R)-4-hidroxipirrolidina-2-carbox^lico
imagen84
La mezcla de B (14 g, 90.3 mmol) enHCl 2N (160 mL) se agito durante la noche a 100°C, El LCMS mostro que se completo la reaccion, el solvente se elimino en vacm y el residuo se recristalizo en EtOAc para dar el producto deseado como un solido blanco. LC-MS: 205.1 ([M+1]+).
Smtesis de clorhidrato de 4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato de (2R,4R)-metilo
imagen85
A una solucion de A (16.56 g, 98.8 mmol) en CH3OH (150 mL) se agrego SOCl2 (35.26 g, 296.4 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se calento a reflujo durante 3 h. El solvente se elimino en vacm y el solido blancuzco obtenido se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
Smtesis de 4-hidroxipirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2R,4R)-1-bencil 2-metilo
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A una solucion de D (17.94 g, 98.8 mmol) y Na2CO3 (10.5 g, 98.8 mmol) en THF/H2O (150 mL/50 mL) se agrego CbzCl (20.2 g, 118.56 mmol) a 0°C y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se filtro a traves de papel de filtro y el filtrado se concentro. Se agrego agua (200 mL) y el producto se extrajo con EtOAc (100 ml x 3). Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron, y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatograffa de columna (gel de silice, Eter de petroleo /EtOAc=5/1- 2/1) para conseguir el producto deseado (7.4 g, 27%) como un aceite amarillo claro. LC-MS: 279.9 ([M+1]+).
Smtesis de 2-metil 4-((tert-butildimetilsilil)oxi)pirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2R,4R)-1-bencilo
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A una solucion de E (7.4 g, 26.5 mmol) en diclorometano (70 mL) se agrego imidazol (3.6 g, 53 mmol). TBSCI en CH2CI2 (30 mL) se agrego a la solucion a 0°C y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion se lavo con agua (200 mL), solucion salina (200 mL) y la capa organica se seco (MgSO4), se filtro y se concentro para conseguir el producto crudo (10.4 g) como aceite amarillo claro, que se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion. LC-MS: 415.9 ([M+23]+).
Smtesis de 4-(tert-butildimetilsililoxi)-2-(hidroximetil)pirrolidina-1-carboxilato de (2R,4R)-bencilo
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A una solucion de F (10.4 g, 26.5 mmol) en THF anhidro (150 mL) se agrego LiBH4 (0.92 g, 42.4 mmol) a 0°C, la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h. La reaccion se sometio a particion contra H2O (100 mL) y el producto se extrajo con EtOAc (100 mL x 3). Las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina (100 mL), se secaron (MgSO4), se concentraron y el residuo obtenido se purifico mediante columna de gel de sflice (eter de petroleo/EtOAc=100/0-60/10) para conseguir producto deseado (8.84 g, 91%) como aceite amarillo claro. LC-MS: 365.9 ([M+1]+).
Smtesis de 4-(tert-butildimetilsililoxi)-2-((metilsulfoniloxi)-Ometil)pirrolidina-1-carboxilato de (2R,4R)-bencilo
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A una solucion de G (8.32 g, 22.8 mmol) en CH2Cl2 (200 mL) y Et3N (4.6 g, 45.6 mmol) a 0°C, se agrego MsCl (3.13 g, 27.3 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2h. La reaccion luego se sometio a particion contra H2O (200 mL), se extrajo con CH2Cl2 (100 mL x 3), y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina (100 mL), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para dar el producto crudo (10.11 g, 100%), que se utilizo directamente en la siguiente etapa. LC-MS: 443.8 ([M+1]+).
Smtesis de 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptano-5-carboxilato de (1R,4R)-bencilo
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A una solucion de H (10.11 g, 22.8 mmol) en THF (200 mL) se agrego TBAF (23.8 g, 91.2 mmol), y la mezcla se calento a 50°C durante 3 h. Se agrego NaH (1.37 g, 34.2 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentro para eliminar THF, luego se diluyo con EtOAc y se sometio a particion contra agua. La capa acuosa se extrajo con EA (100 mL x 3) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina (100 mL), se secaron (MgSO4), se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante columna de gel de silice (Eter de
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petroleo/ EtOAc = 10:1 a 5:1) para conseguir el producto (4.3 g, 81%) como aceite amarillo claro. LC-MS: 233.9 ([M+1]+).
Smtesis de (1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptano
Pd/C, H2
CH3OH
T J
Cbz
J K
A una solucion de J (2 g, 8.6 mmol) en CH3OH (20 mL) se agrego Pd/C (0.2 g), la mezcla se agito bajo balon de H2 a 50°C durante 4 h. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y el filtrado se concentro para conseguir el producto crudo (1.1 g, 100%) como aceite incoloro, que se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion. LC-MS: 100.5 ([M+1]+).
Smtesis de (1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptano
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K L
A una solucion de K (0.85 g, 8.6 mmol) en DMSO (30 mL) se agrego 1-fluoro-4-nitrobenceno (1.46 g, 10.32 mmol) y carbonato de potasio (1.43 g, 10.32 mmol), la mezcla se calento a 80°C y se agito durante 4 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente, y se agrego H2O (50 mL), la mezcla se extrajo con EA (50 mL x 3), y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para conseguir un solido amarillo, que se lavo con 2-metoxi-2-metilpropano (10 mL) para conseguir el producto (1.4 g, 74% de J) como un solido amarillo. LC-MS: 221 ([M+1]+).
Smtesis de 4-((1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)anilina
imagen92
imagen93
imagen94
A una solucion de L (1.31 g, 6.0 mmol) en CH3OH (30 mL) se agrego Pd/C (10%, 0.13g), la mezcla se agito bajo una atmosfera de H2 durante 4 h. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de una almohadilla de Celita y el filtrado se concentro para conseguir producto crudo (1.01 g, 88.6%) como un solido marron, se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion. LC-MS: 191.0 ([M+1]+).
Smtesis de 4-(6-((4-((1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil) benzamida
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A una solucion de M (293 mg, 2.2 mmol) y N (420 mg, 2.2 mmol) en Dioxano (60 mL), se agrego Pd2(dba)3 (200 mg, 0.22 mmol), X-phos (104 mg, 0.22 mmol) y Cs2CO (1.61 g, 4.4 mmol) bajo N2, la mezcla se calento a 100°C y se agito durante 6 h. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente, y se agrego EA (50 mL). La mezcla resultante se 5 filtro a traves de papel de filtro para eliminar el solido y el filtrado se sometio a particion contra agua H2O (100 mL). La capa acuosa se extrajo con EA (50 mL x 3) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron y se purificaron mediante columna de gel de sflice (Eter de petroleo
/EtOAc=1/1----CH2Cl2/CH3OH=50/1) para conseguir el producto deseado (123 mg, 13.1%) como un solido amarillo.
LC-MS: 441.2 ([M+1]+)
10 1H-RMN(400 MHz, DMSO-d6) 89.37 (s, 1 H), 9.34 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.50 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.25 (d, J = 8.4 Hz,
2H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.36 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 6.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.58 (s, 1 H), 4.49 (s, 1 H), 4.35 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.70 (Abq, J = 7.2 Hz, Av=22 Hz, 2H), 3.49 (dd, J1 =1.2 Hz, J2 = 9.2 Hz, 1 H), 2.92 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 1.93 - 1.80 (m, 2H).
Ejemplo 11- Smtesis del compuesto 11
15
imagen96
<x>-
Mg,MeOH * .
Tos ' 7 °\X/
MH
se somete a scnicacion.
B
5 Se agrego Mg (4.84 g, 0.20 mol) a una mezcla del compuesto A (7.3g, 28.8 mmol) en MeOH (500 mL) y se sometio a sonicacion durante 1 h. Casi todo el solvente se elimino bajo presion reducida de la mezcla de reaccion gris para dar un residuo gris viscoso que se diluyo con eter (500 mL) y se agito durante 1 h. Se agrego decahidrato de sulfato de sodio (15.00 g) y la mezcla gris clara resultante se agito vigorosamente durante 30 mins. Los solidos se eliminaron mediante filtracion y la torta de filtro se lavo con eter, el filtrado se concentro para dar un aceite (1.50 g, 10 53 %). Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional. TLC: Rf=0.02 (gel de sflice, acetato de etilo: eter
de petroleo = 1:1, v/v)
Smtesis de C
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Una solucion de B (1.5 g, 15.1 mmol), 1-fluoro-4-nitrobenceno (2.10 g, 15.1 mmol) y K2CO3 (2.50 g, 18 mmol) en THF seco (30 mL) se calento a reflujo durante 2 h. El TLC mostro que se consumio completamente el 1-fluoro-4- nitrobenceno. Se permitio que la mezcla de reaccion se enfriara a temperatura ambiente y se concentro bajo presion 5 reducida. El residuo se vertio en agua y se extrajo con DCM (3*50 mL). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con solucion salina, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna flash (eter de petroleo/EtOAc, 50/1 a 10/1, v/v) para dar un solido amarillo (1.15 g, 36 %). La estructura se confirmo porespectro de H-RMN.
TLC: Rf=0.2 (gel de sflice, acetato de etilo: eter de petroleo = 1:5, v/v)
10 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 8.11 (d, J=9.2 Hz, 2H), 6.32 (d, J=9.2 Hz, 2H), 4.89 (s, 4H), 4.22 (s, 4H).
Smtesis de D
imagen98
Una solucion de C (1.50 g, 6.8 mmol) y 10% de Pd/C (90 mg) en una mezcla de MeOH (20 mL) y THF (20 mL) se 15 coloco bajo una atmosfera de H2 y se agito a temperatura ambiente durante la noche. El tLc mostro que el compuesto de C se consumio completamente. El catalizador se elimino mediante filtracion a traves de celita y la torta de filtro se lavo con MeOH. El filtrado se concentro bajo presion reducida y el residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa para dar un solido amarillo (1.05 g, 81 %). La estructura se confirmo por espectro de H-RMN.
TLC: Rf=0.2 (gel de sflice, acetato de etilo: eter de petroleo =1: 2, v/v)
20 1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm): 6.65 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.36 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.83 (s, 4H), 3.93 (s, 4H).
Smtesis de G
imagen99
A una mezcla de E (1.00 g, 5.55 mmol) y F (1.65 g, 11.11 mmol) en una mezcla de tolueno (20 mL), n-PrOH (6.5 mL) 25 y Na2CO3 2M (5 mL) se agrego Pd(PPhs)4 (0.65 g, 0.056 mmol). La reaccion se agito bajo nitrogeno y se calento a reflujo durante 24 horas. El TLC mostro que el compuesto de E se consumio completamente. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se vertio en una mezcla de H2O y EtOAc. Esta mezcla se filtro a traves de celita y se lavo con EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (50 mL*3) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se purifico 30 mediante cromatograffa de columna (DCM/Me-OH, 100:0 a 98:2, v/v) para dar el producto como un solido blanco (800 mg, 61%). La estructura se confirmo por espectro de LC-MS.
TLC: Rf = 0.5 (gel de sflice, eter de petroleo /acetato de etilo =10/1, v/v)
LC-MS: [M+1]+: 249.1/251.1=3/1
Smtesis de H
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imagen100
A una mezcla agitada de G (800 mg, 3.23 mmol, D (675 mg, 3.23 mmol) y CS2CO3 (2.09 g, 6.42mmol) en dioxano (30 mL) se agrego Xantphos (186 mg, 0.32 mmol) y Pd(PPh3)4 (372 mg, 0.32mmol). La reaccion se calento a reflujo durante 16 hs. El TLC mostro que el compuesto E se consumio completamente. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se vertio en una mezcla de H2O y EtOAc. Esta mezcla se filtro a traves de celita y se lavo con EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (50 mL *3) y las capas organicas combinadas se lavaron con solucion salina, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna (DCM:Me- OH=100:1/50:1) para dar un compuesto viscoso (680 mg, 52%) La estructura se confirmo por espectro de LC-MS y el LCMS mostro que contema poca impureza. Se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion adicional.
TLC: Rf= 0.5 (gel de sflice, eter de petroleo :/acetato de etilo = 1/1, v/v)
LC-MS: [M+1]+:403.0 Smtesis de H
imagen101
Una solucion de H (650 g, 1.61 mmol) en MeOH (8 mL) y NaOH 3 M (8 mL) se calento a 70°C durante 2 h. El TLC mostro que el compuesto de H se consumio completamente. El solvente organico se elimino en vado y la solucion acuosa que permanecio se vertio en agua y se extrajo con EtOAc. La capa organica se desecho y el pH de la solucion acuosa restante se ajusto a PH=5 con HCl 2N (ac). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 30 min. El precipitado que se formo se recolecto mediante filtracion se lavo con agua y se seco en vado para dar un solido gris (230 mg, 37%). La estructura se confirmo por espectro de LC-MS.
TLC: Rf = 0.4 (gel de sflice=DCM/MeOH=15/1, v/v)
LC-MS: [M+1]+:389.0
Smtesis del compuesto 11
imagen102
Compuesto 11
A una solucion de I (220 mg, 0.57 mmol) y clorhidrato de 2-aminoacetonitrilo (104mg, 1.13 mmol) en DMF (5 mL) se agregaron TEA (434 mg, 3.39 mmol) HOBT (91 mg, 0.68 mmol) y EDC.HCl (239 mg, 1.24 mmol). La mezcla de reaccion se agito y se calento a 100°C durante 2 h. El TLC mostro que se consumio la mayona de I y la reaccion se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se vertio en agua (10 mL) y se extrajo con DCM (3*20 mL). Las capas organicas se combinaron, se lavaron con solucion salina, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y
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se concentraron. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa de columna (DCM:MeOH=100:1/50:1) para dar un solido amarillo (123 mg, 51% de rendimiento). La estructura se confirmo por LC-MS y espectro de H-RMN.
TLC: Rf= 0.5 (gel de sHice, MeOH/CH2Cl2 = 1/15 v/v)
LC-MS: [M+1]+:427
1H-RMN (400 MHz, da-DMSO) 8 (ppm): 9.41 (s, 1 H), 9.35 (t, J=5.2 Hz, 1 H), 8.51 (d, J=5.2 Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.4 Hz, 2H), 8.02 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.58 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.38 (d, J=4.8 Hz, 1H) 6.44 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.73 (s, 4H), 4.36 (d, J=5.2 Hz, 2H), 3.94 (s, 4H).
Analisis del Compuesto
Se adquirieron datos de 1H y 13C RMN en un espectrometro de RMN Brucker AV-300 AVANCE.
LC-EI-MS y EI-MS Parametros generales:
Los datos de CL-EM-EI y EI-MS se adquirieron en un Waters 2795 Alliance HPLC acoplado a un detector de matriz de fotodiodos Waters 2996 y Espectrometro de Masas de impacto electronico TMD con Integridad que opera bajo control del software Wathers Millenium32 version 4.0 con los ajustes descritos a continuacion.
Parametros del espectrometro de masas:
Flujo de helio de aproximadamente 0.36 L/min.; modo de adquisicion configurado para analizar; velocidad de muestreo de 1 espectros/seg; temperatura de la fuente 200°C; temperatura de nebulizador 80°C; temperatura de region de expansion 75°C; rango de masas m/z 100 a 550, m/z 100 a 650 o m/z 100-700 segun se requiera.
Parametros de HPLC
Los parametros de LC-MS fueron como se describio para cada uno de los metodos descritos a continuacion. Las muestras EI-MS se inyectaron y se analizaron son columna presente, con un mdice de flujo de solvente de 0.25 mL/min.
Metodo A1 (LC-EI-MS)
Gradiente de Solvente:
Tiempo
% de agua MilliQ % de ACN % de (acido formico ac. al 0.5%) Curva
0
90 0 10 -
0.5
90 0 10 6
7.5
0 90 10 6
10.5
0 90 10 6
11.5
90 0 10 6
14.5
90 0 10 6
Indice de flujo: 0.25 mL/min.
Columna: una de
• Alltima HP C-is 2.1 x 150 mm, 5 micras
• XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 micras
• XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 micras Metodo A2 (LC-EI-MS)
Gradiente de Solvente:
Tiempo
% de agua MilliQ % de ACN Curva
0
90 10 -
7
0 100 6
9
0 100 6
10
90 10 6
13
90 10 6
Indice de flujo: 0.25 mL/min Columna: una de
• Alltima HP C18 2.1 x 150 mm, 5 micras
5 • XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 micras
• XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 micras LC-ESI-MS
Parametros generales:
Los datos de LC-ESI-MS se adquirieron en un Waters 2695Xe HPLC acoplado a un Detector de matriz de fotodiodos 10 Waters 2996 y Espectrometro de Masas Waters ZQ que opera bajo condiciones de ionizacion de electropulverizador con software Masslynx version 4.1 con los ajustes descritos a continuacion.
Parametros de espectrometro de masas
Rango de masas:
Tiempo de exploracion:
Inter exploracion de retardo: Gas de desolvatacion:
Gas de cono:
Temperatura de desolvatacion: Temperatura de Fuente: Voltaje de cono:
m/z 100 a 650
0.5
0.1
500 L/h de N2 100 L/h de N2 400°C 120°C
30 V para el modo positivo ESI, o -45 V para el modo negativo ESI
Parametros de HPLC:
Fueron uno de los siguientes conjuntos de condiciones descritas a continuacion.
15 Metodo B
Gradiente de Solvente:
Tiempo % de agua MilliQ % de ACN Curva
0
90 10 1
5
0 100 6
6
0 100
6
7
90 10 6
10
90 10 6
Indice de flujo : 0.25 mL/min.
Columna: XTerra MS C18, 2.1 x 50 mm, 3.5 micras
Metodo C
Gradiente de Solvente:
Tiempo
% de agua MilliQ % de ACN % de acido formico (ac.) al 0,5% Curva
0
90 0 10 1
0.5
90 0 10 1
5.5
0 90 10 1
7.5
0 90 10 6
8.5
90 0 10 6
11.5
90 0 10 6
Indice de flujo: 0.25 mL/min.
Columna: XTerra MS Ci8, 2.1 x 50 mm, 3.5 micras
5 Metodo D
Gradiente de Solvente:
Tiempo
% de agua MilliQ % de ACN Curva
0
90 10 1
10
0 100 6
12
0 100 6
13
90 10 6
16
90 10 6
Indice de flujo : 0.25 mL/min. Columna: XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm,
3.5 micras
Ejemplo 12 - Cribado de enzimas Protocolo de ensayo
5
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15
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25
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Se realizaron ensayos de quinasa con base en el metodo reportado por Anastassiadis, T; et al Nature Biotechnology (2011); 29 (11); p1039-p1045 (doi: 10.1038/nbt.2017).
Resultados
Los datos de IC50 se muestran en la Tabla 2.
Compuesto No
JAK1 JAK2 JAK3 TYK2
Datos 1
Datos 2 Datos 1 Datos 2 Datos 1 Datos 2 Datos 1 Datos 2
1
224.50 215.20 108.00 102.60 213.40 194.00 38.01 34.98
2
30.64 37.92 22.20 24.48 41.79 44.80 5.09 5.65
3
32.27 41.68 47.01 44.99 80.06 82.42 6.83 7.30
4
28.83 28.57 29.35 29.08 92.29 80.80 5.22 6.17
5
10.09 10.18 30.04 25.95 60.92 56.31 0.69 0.91
6
17.53 19.76 14.22 14.05 33.41 32.70 2.94 2.14
7
31.54 29.18 30.31 34.03 60.88 50.75 4.87 4.29
8
56.90 35.72 43.54 46.40 79.32 78.46 9.98 9.98
9
22.37 21.68 11.05 13.44 12.83 14.00 8.07 7.40
10
16.03 15.94 16.98 16.76 22.06 27.01 4.31 2.58
11
32.83 47.37 10.55 10.76 33.76 26.25 9.47 8.54
Los compuestos de mayor interes son los compuestos 5, 6 y 9.
Ejemplo 13 - Cribado celular
El principio del ensayo celular se basa en el metodo descrito por Daley y Baltimore (Daley and Baltimore; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85(23):9312-6). En este ensayo basado en celulas, las celulas Ba/F3 dependiente de IL3 se transforman mediante transfeccion de un gen de quinasa humana recombinante y a su vez las celulas modificadas son dependientes de la actividad de quinasa recombinante para la supervivencia y proliferacion. Los efectos que tienen los compuestos de prueba sobre la proliferacion se evaluan a traves de lecturas convencionales, tales como ensayos de Alamar Blue y MTT de recambio metabolico.
Ejemplo 14- Clasificador de celulas activadas con fluorescencia (FACS)
Analisis de citometna de flujo con multiparametro intracelular de fosforilacion STAT 5.
La estirpe de celulas eritroleucemicas humanas, HEL 92.1.7 (ATCC, TIB-180), se cultiva en medio RPMI 1640 que contiene FCS al 10% suplementado con piruvato de sodio 1 mM. Para la determinacion fosforo-STAT 5, las celulas HEL se cultivan en RPMI 1640 + 1% de FCS durante 18 horas a 37°C y 2 X 105 celulas por punto de ensayo se exponen a compuestos de DMSO/prueba durante 2 horas a 37°C. Las celulas se centrifugan a 1300 rpm durante 3 minutos y se fijan en paraformaldelddo (concentracion final al 2%) durante 15 minutos a 37°C. Despues de centrifugacion, las celulas se permeabilizaron en metanol al 90% a 4°C durante 30 minutos. Despues de tres lavados en PBS-FCS al 2%, se realiza tincion como sigue utilizando control de isotipo de inmunoglobulina de raton conjugada con ficoeritrina BD PharMingen (Cat. No. 551436 y anticuerpo IgG1 de raton conjugado con ficoeritrina a STAt 5 (Y694) (Cat.No. 612567). La tincion procede durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad, seguida por 3 lavados en PBS-FCS al 2%. Las celulas luego se resuspendieron en 800 pL de PBS-FCS para analisis FACS. La citometna de flujo se realiza utilizando un Sistema Beckman Cell Lab Quanta SC con 3 capacidades de dispersion de color y laterales. El analisis de datos se realiza con software de analisis de CXP (version 2.2). La intensidad de fluorescencia media (MFI) se utiliza para determinar las veces de cambio luego del tratamiento de celulas con compuestos inhibidores espedficos, calculados como la relacion MFIestimada/MFIno estimada para el canal de fluorescencia de anticuerpo fosfoespedfico (FL2)
Ejemplo 15 -. Transferencias Western
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Experimento 1 Metodologfa
La estirpe de celulas pro-B de murino BaF3 se mantiene de forma rutinaria en medio RPMI 1640 que contienen 10% de FCS. En el dfa del experimento, las celulas se lavaron dos veces en PBS, y se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contema 0.1% de FCS. Despues de 2 horas de privacion de suero, las celulas se trataron con la concentracion deseada del compuesto 3, el compuesto de control, o velmculo solo (DMSO) durante 2 horas adicionales. Luego se agrega IL-3 de raton a las celulas a una concentracion final de 5 ng/ml durante 15 minutos. Despues las celulas se colocaron sobre hielo y se lavaron dos veces en PBS enfriado en hielo. Los sedimentos celulares lavados se congelaron rapidamente en nitrogeno lfquido y se almacenaron a -80°C.
Los sedimentos celulares se lisan en hielo en regulador RIPA, y los lisados se clarificaron por centrifugacion (20.000 x g, 4°C, 5 min). La concentracion de protema de los lisados se determino mediante el metodo Bradford, y se separaron cantidades iguales de protema (60 pg/carril) por SDS-PAGE. La protema se transfiere a continuacion a PRVF, y realizo transferencia Western utilizando un anticuerpo que reconoce espedficamente STAT5 fosforilada en tirosina 694. La membrana luego se separa y se vuelve a sondear con un anticuerpo que reconoce la protema total STAT5.
Experimento 2
Metodologfa
La estirpe celular eritroleucemica humana HEL 92.1.7 se mantiene de forma rutinaria en medio RPMI 1640 que contienen 10% de FCS. El dfa antes del experimento, las celulas se lavan dos veces en PBS, se resuspenden en RPMI 1640 que contema FCS al 1%, y se cultivan durante la noche.
El dfa siguiente, las celulas se tratan con la concentracion deseada del compuesto 3, el compuesto de control, o velmculo solo (DMSO) durante 2 horas. Luego las celulas se colocaron en hielo y se lavaron dos veces en PBS enfriado en hielo. Los sedimentos de las celulas lavadas se congelaron rapidamente en nitrogeno lfquido y se almacenaron a -80°C.
Los sedimentos celulares se lisan en hielo en regulador RIPA, y los lisados se clarificaron por centrifugacion (20.000 x g, 4°C, 5 min). La concentracion de protema de los lisados se determino mediante el metodo Bradford, y se separaron cantidades iguales de protema (60 pg/carril) por SDS-PAGE. La protema se transfiere a continuacion a PRVF, y se realizo transferencia Western utilizando un anticuerpo que reconoce espedficamente la STAT5 fosforilada en tirosina 694. La membrana se pelo y se volvio a sondear con un anticuerpo que reconoce la protema STAT5 total.
Ejemplo 16 - Evaluacion del compuesto adicional
Los compuestos tambien se pueden probar en un modelo murino de enfermedad mieloproliferativa positiva a JAK2V617F (MPD)
Establecimiento de MPD positiva a JAK2V617F.
La medula osea de ratones Balb/c machos tratados con 5-fluorouracilo puede estar infectada con un retrovirus JAK2-V617F-GFP y los receptores hembras se inyectan retroorbitalmente e irradian letalmente. A partir del dfa 21 los ratones se pueden monitorizar por inspeccion diaria y los recuentos de sangre se monitorizan dos veces por semana + FACS para celulas positivas a GFP. Se esperana que pueda ocurrir un aumento en el hematocrito alrededor del dfa 28 y un aumento del recuento de leucocitos alrededor del dfa 40.
Tratamiento con compuestos
Grupo de intervencion temprana: El tratamiento comenzana el dfa 21 con el compuesto o portador dado por via administracion forzada oral (12 ratones en cada grupo). Los ratones se pueden monitorizar mediante inspeccion diaria y los recuentos de sangre se monitorizana dos veces por semana + FACS de celulas positivas a GFP. Los animales se sacrificaron en el dfa 60 8-12 h despues de la ultima dosis de farmaco. Los ratones moribundos o ratones con un recuento de globulos blancos sobre 200.000/nl o perdida de peso >20% se pueden sacrificar antes.
Grupo de intervencion tardfa: Grupos de 3 ratones se pueden sacrificar en el dfa 29, 36, 43, 50 y 57 y la medula osea y el bazo se pueden analizar para fibrosis de reticulina. El tratamiento puede comenzar con el compuesto o portador dado mediante administracion forzada oral tan pronto se documenta fibrosis en 3/3 ratones. Los ratones se pueden monitorizar mediante inspeccion diaria y los recuentos de sangre dos veces por semana + FACS para celulas positivas a GFP. Los animales se pueden sacrificar despues de 30 dfas de terapia 8-12 h despues de la ultima dosis de farmaco. Los ratones moribundos o ratones con un recuento de globulos blancos sobre 200.000/nl o perdida de peso >20% se pueden sacrificar antes. Los animales se pueden someter a necropsia.
Analisis de tejidos y supervivencia
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Se pueden determinar los pesos del hngado y bazo. Las secciones de tejido de medula osea, hngado y bazo se pueden analizar por Tincion HE. La medula y el bazo tambien se pueden tenir con plata para evaluar la fibrosis de reticulina. Las celulas de bazo y medula osea se pueden analizar por FACS para GFP, marcadores de linaje, fosforilacion de JAK2 y STAT5. La sangre se puede recolectar por puncion en el corazon y plasma se separan y congelan para la medicion de concentracion de farmaco. La supervivencia entre los grupos se puede comparar con el metodo de Kaplan-Meyer.
Evaluacion de la actividad de los inhibidores de JAK2 en ensayos de formacion de colonias de celulas hematopoyeticas humanas
Las celulas mononucleares perifericas de sangre de pacientes con MPD (predominantemente mielofibrosis) con y sin mutacion de JAK2V617F (N = 10 para cada uno) y 5 controles normales (proveedor comercial) se pueden aislar mediante centrifugacion en gradiente de densidad (Ficoll). Las celulas CD34+ se pueden seleccionar utilizando kits comerciales para enriquecer las celulas progenitoras. Las celulas CD34+ se pueden sembrar por triplicado en metilcelulosa suplementada con suero bovino fetal y citoquinas (+/- EPO). Despues de incubacion de las placas durante 2 semanas se puede evaluar la formacion de colonias eritroides y mieloides en un microscopio invertido.
Cancer
El efecto de los compuestos sobre la iniciacion, progresion y metastasis del tumor se puede evaluar en modelos de eficacia en animales in vivo relevantes. Los modelos pueden ser modelos de xenoinjertos humanos de tumores en ratones inmunodeficientes, a partir de estirpes celulares tumorales humanas o preferiblemente de tumores humanos primarios o metastasicos. Otros modelos pueden ser xenoinjertos de tumores humanos que crecen en sitios ortotopicos, modelos de enfermedad diseminada y los modelos de tumores marcados o transgenicos. Los modelos tambien pueden incluir la reseccion quirurgica del tumor primario y la evaluacion de la enfermedad metastasica.
Se pueden seleccionar los modelos para asegurar que se expresa el farmaco molecular espedfico. Ejemplos de tumores que muestran la desregulacion de la ruta JAK/STAT incluyen carcinoma de prostata, cancer de mama, carcinoma de colon, que incluyen leucemia, linfoma, mieloma, tumores de ovario, melanoma, carcinoma de pulmon, glioma, tumores de celulas renal.
La eficacia se puede medir en estos modelos por diversos resultados dependiendo del tipo de tumor (solido, leucemia o metastasico) y puede incluir la medida de la aparicion del tumor, tasa de crecimiento del tumor, carga tumoral, retardo en el crecimiento del tumor, muerte de celulas tumorales, incidencia de metastasis, formacion de imagenes del tumor e invasividad/metastasis por diversos enfoques, que incluyen celulas o reactivos marcados, supervivencia, angiogenesis, histopatologfa.
Los modelos de eficacia animal in vivo tambien pueden ser utilizados para la determinacion de la aditividad o sinergia del efecto de los compuestos en combinacion con otros farmacos,
El asma se limita a la especie humana, pero los modelos animales se utilizan a menudo para investigar aspectos particulares de esta enfermedad humana. Se ha demostrado que Las biopsias bronquiales y el lfquido de lavado broncoalveolar (BAL) recuperados de los pacientes con asma contienen un mayor numero de celulas T activadas, celulas B, eosinofilos y mastocitos. Muchos pacientes con asma estan sensibilizados y tienen anticuerpos espedficos a inmunoglobulina E (IgE) para uno o mas alergenos inhalados. La atopia se considera como una de las principales causas del asma. En los individuos atopicos, la inhalacion de alergenos induce preferiblemente una respuesta de celulas T2 auxiliares (Th2). En la mayona de los modelos actuales, los ratones se sensibilizan mediante inyeccion intraperitoneal (ip) de ovoalbumina (OVA), a menudo junto con un adyuvante sesgado Th2, tal como alumbre. En el modelo clasico de raton para el asma, los ratones C57/BL6 se sensibilizan activamente el dfa 0 mediante inyeccion ip de 10 mg de OVA absorbida en 1 mg de alumbre. A partir del dfa 14-21 los ratones estan expuestos diariamente a OVA en aerosol durante un penodo de 30 minutos. En el dfa 22, la inflamacion de las vfas respiratorias es evidente. El fluido BAL recuperado de estos animales demuestran un aumento en el espacio peribronquiolar que consta de infiltrados celulares mixtos de celulas mononucleares y eosinofilos. Los anticuerpos IgE espedficos de OVA se pueden mostrar en el suero de animales sensibilizados. La poblacion de celulas mononucleares se compone principalmente de celulas de citoquinas IL-4 e IL-5 que secretan fenotipo Th2. la IL-4 promueve el cambio de isotipo de las celulas B hacia la smtesis de IgE y la IL-5 influye en la produccion, maduracion y activacion de eosinofilos.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad cronica de las articulaciones, inflamatoria poliarticular destructiva caracterizada por proliferacion sinovial pasiva e infiltracion subintimal de celulas inflamatorias. Aunque la etiologfa que queda por esclarecer, se reconoce generalmente que la AR es una enfermedad autoinmunitaria y la artritis es una consecuencia de la perdida de tolerancia frente a un autoanrtgeno espedfico de cartflago. En este contexto, se ha establecido que los modelos animales evolucionan alrededor de la induccion de RA por un autoanrtgeno tal como 1. Artritis tipo II inducida por colageno (CIA) y 2. una combinacion de un anrtgeno de bacterias gram-ve (LPS) con un panel de 4 anticuerpos monoclonales (mAb). Un tercer modelo de la artritis es la artritis inducida por adyuvante (AIA), que se lleva a cabo principalmente en ratas. El mecanismo subyacente de la AIA sigue siendo controvertido. Sin embargo, se demostro que la protema de choque termico miobacterianda de 65 kD comparte una secuencia no
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peptidica en la molecula de la protema del nucleo de proteoglicanos, y sugiere que la AIA es tambien una enfermedad inducible por el antfgeno autologo.
En la AIA, se da a ratas Lewis de ocho semanas de edad adyuvante completo de Freund (CFA) preparado al suspender una emulsion de Mycobacterium butyricum muertas por calor en parafina lfquida a 12 mg/ml. La artritis inducida por CFA puede ser estimulada por la inyeccion de 50 pl de CFA por via intradermica en emulsion, ya sea en la almohadilla de la pata o en la base de la cola. Desde el dfa 7 (inicio de la artritis), las ratas se examinan diariamente para puntuacion de artritis clmica en una escala 0-4: 0, normal; 1, inflamacion minima; 2, inflamacion media; 3, inflamacion grave; y 4, severa y que no soporta peso. Para cada extremidad, la pata delantera media, la muneca, las articulaciones de los dedos, la parte media del pie, el tobillo y las articulaciones de los dedos se puntuan dando una puntuacion clmica maxima de 48 por rata. Los animales se sacrifican en dfa 17 y las patas traseras se amputan y se fijan en 7.4% de formalina. Despues de descalcificacion e incorporacion en parafina, las extremidades se seccionan en un plano sagital medio, se tinen con eosina y hematoxilina y se examinan microscopicamente para la formacion de pannus (cartflago y erosion osea y destruccion), vascularizacion (formacion de vasos sangumeos mediante tincion con CD31) y infiltracion de celulas mononucleares (T, B y macrofagos).
En CIA, se utilizan ratones DBA/1 que llevan haplotipo MHC H-2q ya que son mas susceptibles a CIA. En general se utiliza, el colageno heterologo, ya que son mas inmunogenicos/artitoenicos que el colageno de tipo II homologo. Los ratones se cebaron con una emulsion que consiste en colageno de bovino tipo II y adyuvante completo de Freund en una relacion 1:1 (concentracion final=2 mg/ml). La emulsion (0.1 ml) se inyecta en la cola de cada raton aproximadamente 1-2 cm de la base. Un bolo blanquecino debajo de la dermis debe ser visible. Un refuerzo de colageno de tipo II (200 pg por raton) se proporciona por via intraperitoneal en PBS en el dfa 21. Los ratones altamente susceptibles a CIA (DBA/1) generalmente desarrollan artritis 4-5 semanas despues del cebado inicial. Se puede observar artritis totalmente desarrollada que incluye patas rojas e hinchadas, 3-5 dfas despues de aparicion y la artritis inflamatoria activa persiste mas de 3-4 semanas. Aunque la inflamacion con el tiempo desaparece, el dano en las articulaciones como se ve en la anquilosis es permanente. La evaluacion de los smtomas de CIA es esencialmente similar al modelo de AIA en el que a los signos clmicos se les asigna la puntuacion clmica (0-4) en base a la gravedad de la enfermedad. Tambien se pueden realizar mediciones histologicas en las articulaciones fijadas con formalina para evaluar erosion, infiltrados celulares e hiperplasia.
En artritis inducida por LPS-mAB combinada, se puede inducir una artritis severa y coherente en ratones mediante una combinacion de coctel de LPS y mAB que reconoce epttopos individuales agrupados dentro de un fragmento de peptido de 83 aminoacidos situado dentro de la region CB11 de colageno de tipo II. Este modelo fue desarrollado en base a la hipotesis de que la toxina(s) bacteriana absorbida a traves del tracto GI cumple una funcion sinergica y patologica con niveles sub-artritogenicos de autoanticuerpos al colageno de tipo II en la activacion de AR. Las ventajas de este modelo son: 1. se induce rapidamente la artritis sincronizada (100%) dentro de los 7 dfas 2. se pueden utilizar una variedad de cepas de raton como la administracion de coctel mAB con colageno anti-tipo II que pasa el requisito para la generacion de autoanticuerpos del anfitrion en el colageno tipo II. Por lo tanto, se puede inducir la artritis en ratones que no poseen haplotipos MHC susceptibles a CIA y 3. facilidad de administracion de mAB y LPS por cualquiera de las rutas IV e IP.
Las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) que incluyen enfermedad de Crohn (CD) y colitis ulcerosa (UC) representan un grupo de trastornos cronicos caracterizados por la inflamacion del tracto gastrointestinal. La CD puede afectar cualquier parte del tracto digestivo, mientras que la UC solo afecta el colon y el recto. La UC provoca inflamacion y ulceras por lo general en el colon sigmoide y el recto. Los infiltrados celulares son complejos y son evidentes citoquinas pro-inflamatorias en CD y UC.
Un modelo experimental de UC se establece en ratones Balb/C mediante la administracion de sulfato de sodio dextrano (3% de DSS) aislado de Leuconostoc spp. en el agua potable. El experimento tiene un curso temporal relativamente corto (8 dfas) y los parametros para la evaluacion de la colitis incluyen la perdida de peso corporal, consistencia de heces, hemorragia rectal, acortamiento de la longitud del colon, dano de cripta y analisis de citoquinas de los anillos del colon.
En CD, los ratones Balb/c se sensibilizaron en el dfa 0 con 2 x 50 pl de 5 mg/ml de dinitrofluobenceno (DNFB) por via epicutanea en el abdomen y patas afeitadas en dos dfas consecutivos. El DNFB normalmente se solubilizo en acetona: aceite de oliva (4:1). En el dfa 5, los ratones se inocularon por via intracolonica con 50 pl de acido dinitrobenceno sulfonico (DNS) a 6 mg/ml en 10% de etanol. Los ratones se sacrifican en el dfa 8. Los parametros que se van a medir incluyen supresion de la cantidad total de celulas de sangre y tipos de celulas, proteasa de mastocitos de mucosa 1 (MMCP-1) en suero, el nivel de TNFa en homogeneizado de colon, consistencia de heces, permeabilidad vascular y cantidad de parches de colon. La cantidad de neutrofilos y mastocitos es indicativa de dano del colon y la afluencia celular tambien sera evaluado mediante examenes histologicos y microscopicos.
Ejemplo 17 - Analisis ex vivo en celulas de pacientes positivos a JAK2V617F
Para evaluar la actividad de los inhibidores de moleculas pequenas de JAK2 se ha desarrollado un ensayo para cuantificar la actividad de la ruta JAK-STAT al medir el estado de fosforilacion de la protema STAT5 en direccion 3'. Despues de la union de ligando, un receptor de citoquina hematopoyetica experimenta un cambio conformacional de
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la protema activadora JAK2 asociada. La JAK2 activada fosforila la porcion intracelular del receptor de la formacion de sitios de union para el reclutamiento de las protemas de senalizacion intracelulares. La STAT5 es una protema que se recluto para el complejo de receptor de citoquinas activado, donde se fosforila y luego se transloca al nucleo para regular la expresion de un conjunto de genes que median el crecimiento y diferenciacion celular.
Se puede utilizar citometna de flujo intracelular para medir la tirosina fosforilada STAT5 (pYSTAT5) en poblaciones de celulas espedficas mediante activacion sobre marcadores de superficie hematopoyeticos de linaje espedfico. Esto es particularmente importante para la enfermedad mieloproliferativa positiva a JAK2V617F ya que el clon que contiene la mutacion solo forma una fraccion variable de todas las celulas hematopoyeticas en la medula osea. Se han seleccionado celulas eritroides para examen en este estudio ya que este linaje es hiperplasico en PV.
Metodos
Se recolecta medula osea de la cresta ileal de pacientes con enfermedad mieloproliferativa positiva a JAK2V617F. Los ensayos de citometna de flujo se realizan en muestras de medula osea frescas en el dfa del procedimiento de biopsia. Se recolectan celulas mononucleares de medula osea mediante centrifugacion en gradiente de densidad y luego se incubaron 0.75-1.0 celulasx106 con compuestos de prueba a diversas concentraciones durante una hora en RPMI libre de indicador a 37°C. Las celulas se estimularon maximamente con eritropoyetina durante 10 minutos y despues se fijaron mediante adicion de 4% de formaldelddo directamente en el medio de cultivo. Despues las celulas se permeabilizaron con metanol fno y despues se agregan concentraciones optimas de anticuerpos marcados con fluorescencia. Las celulas eritroides se seleccionan para medicion de pYSTAT5 con base en la expresion de protemas de la superficie celular (poblacion CD45lD, CD7lhi.).
Cualquier discusion de documentos, actos, materiales, dispositivos, artmulos o similares que se han incluido en la presente especificacion es solo con el proposito de proporcionar un contexto para la presente invencion. No se debe tomar como una admision de que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la base de la tecnica anterior o que eran del conocimiento general comun en el campo relevante a la presente invencion tal como existfa en Australia o en otro lugar antes de la fecha de prioridad de cada reivindicacion de esta solicitud.
En las reivindicaciones que siguen y en la descripcion precedente de la invencion, excepto cuando el contexto requiera de otra forma expresar idioma o implicacion necesaria, la palabra “comprenden” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende” se utiliza en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las caractensticas indicadas pero no excluye la presencia o adicion de caractensticas adicionales en realizaciones adicionales de la invencion.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> YM BioSciences Australia Pty Ltd
<120> COMPUESTOS BICfcLICOS DE FENIL AMINO PIRIMIDINA Y USOS DE LOS MISMOS
<130> P065379EP
<140> 13809739.9
<141> 2013-06-26
<150> US 61/666,725
<151> 2012-06-29
<150> US 13/830,152
<151> 2013-03-14
<150> AU 2013201780
<151> 2013-03-21
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 300
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<221> caractenstica_misc <223> Quinasa JAK2j2h <400> 1
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Lys Glu Arg lie Asp His lie Lys Leu Leu Gin Tyr Thr Ser Gin lie

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Gys Lys Gly Met Glu Tyr Leu Gly Thr Lys Arg Tyr lie His Arg Asp 130 135 140

Leu Ala Thr Arg Asn lie Leu Val Glu Asn Glu Asn Arg Val Lye lie 145 150 155 160

Gly Asp Phe Gly Leu Thr Lys Val Leu Pro Gin Asp Lys Glu Tyr Tyr 165 170 175

Lys val Lys Glu Pro Gly Glu Ser Pro He Phe Trp Tyr Ala Pro Glu " 130 135 190

Ser Leu Thr Glu Ser Lys Phe Ser Val Ala Ser Asp Val Trp Ser Phe 195 200 205

Gly val val Leu Tyr Glu Leu Phe Thr Tyr He Glu Lys Ser Lys Ser 210 215 220

pro Pro Ala Glu Phe Met Arg Met He Gly Asn Asp Lys Gin Gly Gin 225 230 235 240
Met lie Val Phe His Leu lie Glu Leu Leu Lys Asn Asn Gly Arg Leu

245 250 255

pro Arg pro Asp Gly Cys Pro Asp Glu He ryr Met He Met Thr Glu 260 265 270
Cys Trp Asn Asn Asn Val Asn Gin Arg Pro Ser Phe Arg Asp Leu Ala

' 275 230 235
Leu Arg val Asp Gin lie Arg Asp Asn Met Ala Gly

290 295 300
<210>2 <211> 295 <212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> caractenstica_misc <223> Quinasa JAK1 j1h <400>2

Claims (11)

1. Un compuesto de la formula I
imagen1
en la que
5 R1 es un heterociclilo bidclico sustituido o no sustituido, en el que el heterocicMio bidclico tiene dos anillos
conectados que contienen por lo menos un heteroatomo y que es un anillo biciclico no aromatico;
R2 se selecciona de H, halogeno, alquilo C1-4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-4 sustituido o no sustituido con CF3, CON(R)2, CN y CO2R; y
R se selecciona de H y alquilo C1-4 sustituido o no sustituido;
10 en la que “sustituido” se refiere a un grupo que se sustituye con uno o mas grupos seleccionados de alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilarilo C1-6, arilo, halo, halOalquilo C1-6, halocicloalquilo C3-6, haloalquenilo C2-6, haloalquinilo C2-6, haloarilo, hidroxi, alcoxi C1-6, alqueniloxi C2-6, alquiniloxi C2-6, ariloxi, carboxi, haloalcoxi C1-6, haloalqueniloxi C2-6, haloalquiniloxi C2-6, haloariloxi, oxo, nitro, nitroalquilo C1-6, nitroalquenilo C2-6, nitroarilo, azido, amino, alquilamino C1-6, alquenilamino C2-6, alquinilamino C2-6, arilamino, alquilacilo C1-6, 15 alquenilacilo C2-6, alquinilacilo C2-6, arilacilo, acilamino, aciloxi, aldehfdo, alquilsulfonilo C1-6, arilsulfonilo, alquilsulfonilamino C1-6, arilsulfonilamino, alquilsulfoniloxi C1-6, arilsulfoniloxi, alquilsulfenilo C1-6, arilsulfenilo, carboalcoxi, carboariloxi, mercapto, alquiltio C1-6, ariltio, aciltio, y ciano,
o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el compuesto de la formula I tiene la formula la:
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imagen2
en la que
R1 y R2 son como se define en la reivindicacion 1,
o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el compuesto de la formula I tiene la Formula lb
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imagen3
en la que R1 y R2 son como se define en la reivindicacion 1, o un enantiomero del mismo o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, que se selecciona de 4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.3]heptan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; 4-(2-((4-(2-oxa-6-azaespiro[3.3]heptan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; (S)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.4]octan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; (R)-4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.4]octan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida;
(R) -4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida;
(S) -4-(2-((4-(1-oxa-6-azaespiro[3.5]nonan-6-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; 4-(2-((4-(1-oxa-7-azaespiro[3.5]nonan-7-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; 4-(2-((4-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; 4-(2-((4-(8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octan-3-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; 4-(2-((4-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida; y 4-(2-((4-((1R,4R)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptan-5-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-N-(cianometil)benzamida.
5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste de alquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilarilo C1.6, arilo, halo, oxo, haloarilo, hidroxi, alcoxi C1-4, ariloxi, carboxi, amino, alquilacilo C1-6, arilacilo, acilamino, aciloxi, alquilsulfenilo C1-6, arilsulfonil y ciano.
6. Un proceso para la preparacion del compuesto de la formula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende
(i) acoplar un compuesto de la formula II
imagen4
en la que
R2 es como se define en la reivindicacion 1 y X es un grupo saliente, con un compuesto de la formula III
en la que
R1 es como se define en la reivindicacion 1; o
imagen5
5
(ii) acoplar un compuesto de la formula IV
imagen6
en la que
R2, X y R son como se definieron anteriormente,
con un compuesto de la formula III como se definio anteriormente para preparar un compuesto de la formula V
o
RCi
R7
V
imagen7
10 en la que
R1, R2 y R son como se define en la reivindicacion 1; y
acoplar el compuesto de la formula V como se definio anteriormente con
imagen8
7. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que X en el compuesto de la formula II es cloro que luego se 15 convierte en yodo antes de acoplarse con el compuesto de la formula III.
8. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador farmaceuticamente aceptable.
9. Un implante que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composicion farmaceutica de 20 acuerdo con la reivindicacion 8 para uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad asociada a quinasa
seleccionada de enfermedades inmunologicas e inflamatorias que incluyen trasplantes de organo; enfermedades proliferativas que incluyen cancer y enfermedades mieloproliferativas; enfermedades vmcas; enfermedades metabolicas; y enfermedades vasculares.
11. El compuesto o composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la enfermedad asociada a quinasa es una enfermedad inmunologica o inflamatoria seleccionada de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad inflamatoria del intestino, polimialgia reumatica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y fibrosis pulmonar.
5 12. El compuesto o composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la enfermedad asociada a
quinasa es una enfermedad mieloproliferativa seleccionada de policitemia vera, mielofibrosis primaria, trombocitemia, trombocitemia esencial, mielofibrosis idiopatica, leucemia mielogena cronica, mastocitosis sistemica, leucemia neutrofflica cronica, smdrome mielodisplasico y enfermedad sistemica de mastocitos.
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