ES2645455T3 - Medio cromogénico para detección e identificación de enterococos resistentes a vancomicina y procedimiento asociado - Google Patents

Abstract

Un medio de identificar y distinguir especies de enterococos colocadas en el medio que comprende: (a) un primer sustrato conjugado con una primera fracción para formación de imágenes, en el que el primer sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con una primera enzima que se produce por una primera especie de enterococos en comparación con una segunda enzima que se produce por una segunda especie de enterococos; y (b) un segundo sustrato conjugado con una segunda fracción para formación de imágenes, en el que el segundo sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con la segunda enzima que se produce por la segunda especie de enterococos en comparación con la primera enzima que se produce por la primera especie de enterococos; en el que la primera fracción para formación de imágenes produce la imagen de un primer indicador cuando el primer sustrato interactúa con la primera enzima y la segunda fracción para formación de imágenes produce la imagen de un segundo indicador cuando el segundo sustrato interactúa con la segunda enzima y el primer indicador es diferente, por percepción, del segundo indicador; y (c) o bien un tercer sustrato, o bien un tercer sustrato y una cefalosporina, en el que el tercer sustrato induce la producción de la primera enzima por parte de al menos una tercera especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fracción para formación de imágenes y la segunda fracción para formación de imágenes produce una imagen de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por parte de al menos la tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicador son diferentes unos de otros, por percepción, y el tercer sustrato no tiene un cromógeno adherido al mismo; o (c') un inhibidor de enterococos no resistente a vancomicina que comprende vancomicina y al menos una cefalosporina, en el que la cefalosporina inhibe el crecimiento de la tercera especie de enterococos pero no el crecimiento de la primera o de la segunda especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fracción para formación de imágenes y la segunda fracción para formación de imágenes forman la imagen de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por la al menos tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicadores son diferentes unos de otros, por percepción.

Description

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DESCRIPCION

Medio cromogenico para deteccion e identificacion de enterococos resistentes a vancomicina y procedimiento asociado

Antecedentes de la invencion

La invencion se refiere, en general, a un medio adecuado para la deteccion e identificacion de enterococos resistentes a vancomicina.

Los enterococos son habitantes normales del tracto gastrointestinal (GI) de seres humanos y de la mayona de los animales. Estan esparcidos en la naturaleza y pueden encontrarse en suelo, agua y vegetacion. Dependiendo de la localizacion geografica, la especie predominante que habita el tracto GI es o bien Enterococcus faecalis o E. faecium. La colonizacion con estos organismos frecuentemente precede a una infeccion, incluyendo una infeccion del tracto urinario, de la cavidad intraabdominal y el revestimiento del corazon (es decir, endocarditis).

Los enterococos son resistentes a muchos antibioticos y el tratamiento actual de eleccion es frecuentemente vancomicina. Sin embargo, los enterococos tambien han comenzado a desarrollar resistencia a esta. Estas cepas de enterococos resistentes a vancomicina (VRE) han sido asociadas con mortalidad incrementada.

Hay dos tipos de resistencia a vancomicina. Una es intrmseca, la otra es adquirida. La resistencia intrmseca se codifica por los genes vanC, y no es transferible. La resistencia intrmseca se ve de la manera mas comun en E. casseliflavus y E. gallinarum. Por contraste, la resistencia adquirida, codificada por los genes vanA o vanB, puede transferirse y se ve comunmente en E. faecium y E. faecalis. Las especies de enterococos asociadas con resistencia adquirida son una causa de preocupacion.

VRE fueron reportados por primera vez en Europa 1988 y en los Estados Unidos en 1989. Ha habido un rapido incremento en la incidencia de infeccion y colonizacion de VRE. La deteccion de VRE en el ambito de la atencion medica es un reto principal. Los actuales lineamientos de CDC recomiendan el cribado de muestras de heces o de frotis rectal en el ambito de la atencion medica con el fin de identificar pacientes que son positivos para VRE. Ademas, una vez se identifica VRE, se recomienda que el paciente afectado se coloque en aislamiento. Esta practica permite la contencion de los genes de resistencia transferibles. Poner en aislamiento todos los pacientes positivos para VRE tan pronto como sea posible reduce el riesgo de transferencia de genes vanA y vanB. Sin embargo, no todas las especies de enterococos que tienen concentraciones inhibitorias mmimas (MIC) elevadas a la vancomicina poseen un gen de resistencia transferible. Por lo tanto, ser capaz de distinguir entre las especies impedira el aislamiento no garantizado y los costes asociados de aquellos pacientes que dan positivo para E. casseliflavus o E. gallinarum (estos poseen tfpicamente la resistencia intrmseca conferida por el gen vanC) versus E. faecium o E. faecalis (estos poseen tfpicamente la resistencia transferible conferida por los genes vanA y/o vanB). E. casseliflavus y E. gallinarum no son epidemiologicamente significativos en comparacion con E. faecium o E. faecalis.

En la actualidad, se encuentran disponibles varios procedimientos para detectar VRE. Algunos procedimientos permiten la identificacion de VRE al nivel de especie mientras que otros detectan solamente el genero o grupos de especies dentro del genero. Algunos procedimientos utilizan muestras biologicas obtenidas directamente de la fuente (por ejemplo, heces de un paciente), mientras que otros requieren un aislado puro de la muestra inicial antes que pueda hacerse cualquier identificacion. Por ejemplo, para obtener un aislado puro de un paciente, puede ser necesario un tratamiento adicional de especimen de paciente, tal como el aislamiento a un medio secundario. Una vez ha sido obtenido un aislado puro, puede realizarse la prueba de identificacion y/o de susceptibilidad. Para aquellos con habilidad en la tecnica son bien conocidos los procedimientos para obtener aislados puros a partir de las muestras que, se cree, contienen cualquier cantidad de microorganismos, y no se describen adicionalmente en la presente.

Los procedimientos basicos para confirmar un aislado bacteriano como resistente a la vancomicina son bien conocidos por aquellos con habilidad en la tecnica y no se describen adicionalmente aqrn. (Veanse, por ejemplo, las recomendaciones proporcionadas por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)). Estos procedimientos de susceptibilidad requieren un aislado puro y, por lo tanto, no pueden realizarse directamente en una muestra clmica (biologica).

Mientras que los procedimientos basicos para cribar una muestra clmica para VRE proporcionan poca o ninguna identificacion al nivel del genero o de la especie, la incorporacion de esculina al medio base que contiene vancomicina puede proporcionar una identificacion probable al nivel del genero (es decir, Enterococcus) debido a que todos los enterococos hidrolizan esculina y, en presencia de citrato ferrico, producen una colonia marron a negra. Estos tipos de medios se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, en BD Diagnostic Systems, Sparks, MD) e incluyen Agar Enterococcal con vancomicina y agar de azida de esculina biliar con vancomicina.

Tambien se han usado medios de caldo que contienen esculina para cribar para VRE. Igual que las placas de cribado, estos medios tambien se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, caldo de enterococos y caldo de VRE), y ofrecen solamente una identificacion probable a nivel del genero.

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Otro procedimiento para detectar VRE utiliza CHROMagar Orientation (CHROMagar Company, Pans). CHROMagar Orientation no modificado contiene dos sustratos cromogenicos, beta-D-glucopiranosido y beta-D-galactopiranosido. Con el fin de hacerlo util en el cribado para VRE, CHROMagar Orientation fue modificado adicionando azida de sodio y vancomicina. Beta-D-glucopiranosido es un sustrato que se hidroliza por parte de casi todas las especies de enterococos. Beta-D-galactopiranosido, mientras en algunos ambientes se hidroliza espedficamente por E. faecium, no se hidroliza o se hidroliza de modo mmimo en presencia de beta-D-glucopiranosido. Aunque CHROMagar Orientation modificada puede distinguir entre diversos generos bacterianos (por ejemplo, Enterococcus de Escherichia), no puede diferenciar entre las especies de enterococos, y por lo tanto, no puede diferenciar entre las especies clmicamente significativas que contienen los genes vanA y vanB. Algo similar se encuentra en la publicacion WO2006/085027.

Chen et al. (patentes estadounidenses 5,620,865, 6,355,449 y 7,018,807) describen un medio para la deteccion de VRE utilizando un medio basico para la deteccion de resistencia a la vancomicina al cual han sido adicionados indicadores nutrientes espedficos para enterococos. Sin embargo, los indicadores nutrientes sugeridos en las patentes de Chen son universales para enterococo y de esta manera proporcionan solamente la deteccion a nivel del genero y no a nivel de especie.

Otros medios que no estan dirigidos a cribado directo de espedmenes tambien han sido evaluados (por ejemplo, agar de campilobacter y agar de cribado de cancomicina). No obstante, estos medios son selectivos y facilitan la recuperacion de VRE; no pueden ofrecer identificacion a nivel del genero ni a nivel de la especie. Con el fin de hacer esto, con frecuencia se usan ensayos adicionales que incluyen tinturado de Gram y pirrolidonilo arilamidasa (el ensayo PIR). Ademas, una vez el organismo ha sido probablemente identificado como una especie de enterococo, se necesitan ensayos adicionales tales como aquellos para motilidad o acidificacion para distinguir E. casseliflavus y E. gallinarum de E. faecium y E. faecalis.

Procedimientos moleculares tales como reaccion de cadena de polimerasa (PCR) y tecnologfa de sonda de ciclo se encuentran disponibles para la deteccion de genes de resistencia a vancomicina. Estos procedimientos ofrecen un alto grado de sensibilidad y especificidad asf como tambien un plazo reducido en comparacion con el cultivo de rutina. Sin embargo, con frecuencia solamente detectan los genes van y no proporcionan una identificacion a nivel de especie. Ademas, muchos laboratorios no tienen las instalaciones, el entrenamiento o el volumen para justificar la realizacion de tales procedimientos costosos, complejos.

La identificacion (ID) al nivel de especie puede llevarse a cabo usando un sistema de ID comercialmente disponible, automatizado o manual, aunque se ha notado que algunos de los sistemas comerciales pueden no siempre identificar E. faecium de manera exacta. Todos estos sistemas requieren un aislado puro y pueden durar hasta 24 horas para obtener una identificacion definitiva. Los sistemas automatizados tales como Phoenix (BD Diagnostic Systems), Vitek (bioMerieux) y Microscan (Dade) proporcionan una identificacion a nivel de especie en 2-24 horas. Los sistemas manuales tales como Crystal (BD Diagnostic Systems) y API/ATB (bioMerieux) tambien proporcionaran una identificacion definitiva a nivel de especie en 4-24 horas.

Otros procedimientos incluyen un ensayo de vancomicina por quimioluminiscencia y concentracion inhibidora minima (MIC) (Eiken Chemicals). De acuerdo con un estudio de Nagasawa, et al., este ensayo de quimioluminiscencia puede diferenciar aislados de vanA, vanB y vanC, con base en sus MICs, en 2-4 horas. Otro procedimiento de MIC que emplea resazurina como un indicador de crecimiento debe usarse para determinar rapidamente las susceptibilidades a vancomicina. Sin embargo, estos dos procedimientos de ensayo de susceptibilidad requieren un aislado puro y, por lo tanto, no son adecuados para usar con la muestra original del paciente.

Tal como se ha discutido previamente, los procedimientos actuales para detectar e identificar VRE al nivel de especies requieren un aislado puro y/o ensayos multiples. Por lo tanto, se desea un procedimiento para especiacion de enterococos mas que proporcionar una identificacion a nivel de genero del especimen original del paciente.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un medio para identificar y distinguir especies de enterococos colocadas en el medio. El medio (es decir un solido o un lfquido y los componentes de crecimiento) comprende (a) un primer sustrato conjugado con una primera fraccion de formacion de imagenes, en el que el primer sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con una primera enzima que se produce por una primera especie de enterococos en comparacion con una segunda enzima que se produce por una segunda especie de enterococos; y (b) un segundo sustrato conjugado con una segunda fraccion de formacion de imagenes, en el que el segundo sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con la segunda enzima que se produce por la segunda especie de enterococos en comparacion con la primera enzima que se produce por la primera especie de enterococos, en el que la primera fraccion de formacion de imagenes que forma la imagen de un primer indicador cuando el primer sustrato interactua con la primera enzima y la segunda fraccion de formacion de imagenes forma la imagen de un segundo indicador cuando el segundo sustrato interactua con la segunda enzima y el primer indicador es diferente, por percepcion, del segundo indicador; y (c) o bien un tercer sustrato, o bien un tercer sustrato y cefalosporina, en el que el tercer sustrato induce la produccion de la primera enzima por parte de al menos una tercera especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fraccion de formacion de imagenes y la segunda fraccion de

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formacion de imagenes forman imagenes de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por al menos una tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicador son diferentes unos de otros por percepcion, y en el que el tercer sustrato no tiene un cromogeno adherido al mismo; o (c') un inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina que comprende vancomicina y al menos una cefalosporina, en el cual la cefalosporina inhibe el crecimiento de la tercera especie de enterococos pero no el crecimiento de la primera o de la segunda especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fraccion de formacion de imagenes y la segunda fraccion de formacion de imagenes forman imagenes de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por al menos una tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicador son diferentes unos de otros por percepcion.

"Imagenes", tal como se usa en la presente memoria, significa un efecto observable. Ejemplos de efectos observables incluyen la emision de un color o una fluorescencia. En formas de realizacion preferidas en la presente memoria, las fracciones son cromoforos.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la deteccion de VRE directamente a partir de una mezcla biologica, el cual comprende combinar una muestra biologica con un medio, como es definido antes, y detectar la presencia o ausencia de al menos la primera y la segunda especies del enterococo resistente a vancomicina directamente del medio. La deteccion puede durar tan poco como 24 horas. El medio facilita la identificacion y diferenciacion directas entre dos o mas especies de VRE (por ejemplo, E. faecium de E. faecalis) dentro de la muestra sin recurrir a procedimientos de ensayo adicionales. El medio proporciona un veldculo para detectar VRE en terminos generales y ciertas especies de VRE espedficamente (por ejemplo, E. faecium, E. faecalis, y E. gallinarum / E. casseliflavus) a partir de una muestra biologica usando un solo procedimiento de ensayo.

El medio puede comprender ademas componentes de crecimiento tales como aminoacidos, vitaminas, sal y elementos en forma de trazas, en cantidades suficientes para permitir la viabilidad y la reproduccion de enterococos en presencia de una pluralidad de sustratos. Un primer sustrato es espedfico para una enzima producida por una primera especie de enterococos. Un segundo sustrato es espedfico para una enzima producida por una segunda especie de enterococos. Es ventajoso si al menos dos de los sustratos se conjugan con una especie cromogenica. El sustrato conjugado con la especie cromogenica se denomina sustrato cromogenico en la presente. Los sustratos cromogenicos son proporcionados en una cantidad suficiente para permitir una senal caractenstica detectable que va a producirse en el medio por el crecimiento de la especie de enterococo que es espedfica para el sustrato cromogenico. El medio puede contener ademas un inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina, el cual comprende vancomicina y al menos una cefalosporina. En una forma de realizacion, el inhibidor de enterococo no resistente a vancomicina es una combinacion de vancomicina y cefoxitina. En otras modalidades, el inhibidor de enterococos no resistente a vancomicina comprende ademas otros inhibidores (agentes selectivos) que seleccionaran organismos que no son dianas, que pueden "abrirse camino" de otra manera y crecer y producir un falso positivo. En una forma de realizacion, el agente selectivo es eritromicina. La eritromicina impide a los lactobacilos crecer en los medios. Dejada sin seleccionar, una colonia de lactobacilos podna crecer y producir una falsa indicacion de que VRE esta presente en la muestra. La invencion contempla muchos agentes selectivos diferentes.

El procedimiento de la invencion puede llevarse a cabo en un contenedor en un solo paso. En el procedimiento, una muestra biologica se combina con el medio de la invencion. Para VRE, esa muestra es frecuentemente un frotis rectal. En esta forma de realizacion, se emplea un medio selectivo de VRE. Como tal, vancomicina es un componente del medio. En una forma de realizacion, el medio es agar con nutrientes para apoyar tal crecimiento y agentes selectivos para suprimir el crecimiento de organismos que no son VRE. El medio contiene antibioticos adicionales para suprimir o eliminar el crecimiento de organismos que no son dianas que pueden crecer en presencia de vancomicina. El medio tambien contiene al menos dos sustratos que se seleccionan para enzimas producidas por los organismos que son dianas, tal como se ha descrito antes. El medio se expone luego a condiciones que causan el crecimiento de los organismos diana. El medio se inspecciona luego directamente para una indicacion de la presencia de una o mas especies de VRE, sin someter el medio a ensayos adicionales.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 representa una placa de agar en la cual se visualizan dos colores distintos de colonia que identifican dos especies diferentes de VRE.

La figura 2 representa una placa de agar en la cual se visualizan tres colores distintos de colonia que identifican tres especies diferentes de VRE.

La figura 3 un diagrama de flujo que representa una forma de realizacion de la presente invencion que forma imagen y diferencia claramente tres especies de VRE.

La figura 4 compara colonias que forman imagen en placas de agar que tienen diferentes formulaciones que seleccionan para VRE.

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Descripcion detallada

Las siguientes definiciones son empleadas para propositos de esta divulgacion.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "medio" (plural "medios") se refiere a una mezcla solida, semisolida, en polvo o lfquida, que contiene todos o sustancialmente todos los componentes necesarios para permitir que un microbio crezca y se reproduzca. El medio puede ser esteril o no esteril tal como requiere generalmente la practica aceptada.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "muestra biologica" se refiere a cualquier muestra tomada o proveniente de una sustancia que, se espera, puede contener bacterias y/u otros microorganismos, e incluye muestras del ambiente (por ejemplo, suelo o agua), o muestras de humanos (por ejemplo, muestras clmicas tales como heces, frotis rectal, orina, sangre, heridas).

Tal como se usa en la presente memoria, el termino microorganismos se refiere a organismos microscopicos e incluye bacterias, hongos, levaduras, mohos y virus.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "infiltracion" se refiere al acto de introducir una muestra a la superficie de una placa de agar rozando una herramienta adecuada (tal como un bucle de inoculacion) a traves de la superficie de la placa de agar.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "cantidad efectiva de nutriente" se refiere a una cantidad dentro del intervalo que permite o promueve el crecimiento de la reproduccion de un microorganismo diana. Es decir, una cantidad que permite que los microbios u otros organismos se adapten al medio, sinteticen los componentes necesarios para reproduccion y a continuacion se reproduzcan.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "cantidad efectiva de sustrato" se refiere a la cantidad de sustrato requerido para lograr el efecto deseado sin interferir con la actividad deseada de otros sustratos que pueden estar presentes en el medio.

Los terminos "vitaminas", "aminoacidos", "elementos de trazas" y "sales" pretenden incluir todas las moleculas, compuestos y sustancias (en lo sucesivo sustancias), clasificados en cada categona por aquellos con habilidad en la tecnica, ya sean organicos o inorganicos, y las categonas no se refieren a si tales sustancias son necesarias o propicias o no para mantener vida.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "fraccion que forma imagen" se refiere a una fraccion que al activarse proporciona una senal detectable tal como un cambio de color, fluorescencia o un cambio en el pH.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino sustrato cromogenico o cromogeno se refiere a un sustrato conjugado con un cromoforo. Al disociarse de un sustrato, el cromoforo se oxida y produce un color visible. De manera similar, un sustrato fluorogenico o fluorogeno se refiere a un sustrato acoplado a un fluoroforo. Un fluoroforo, como el nombre lo indica, proporciona una senal fluorescente. El uso de sustratos fluorogenicos en la presente invencion tambien es contemplado como adecuado.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "sustrato inductor" se refiere a un sustrato capaz de inducir la expresion de una enzima o enzimas que de otra manera permanecenan no expresadas.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "senal caractenstica detectable" se refiere a cualquier cambio en una muestra que puede ser detectada por uno o mas de los sentidos humanos. El termino incluye tales ejemplos como cambio de color en los intervalos de longitud de onda visible o invisible, un cambio en el estado tal como entre solido, lfquido, gas, una emision de gases o un cambio en el olor.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "microbio diana" se refiere al microorganismo cuya presencia o ausencia busca ser detectada.

El medio descrito en la presente permite la deteccion y la identificacion de VRE a nivel de especie proporcionando sustratos cromogenicos en un medio capaz de soportar el crecimiento de una pluralidad de especies de VRE. El medio inhibe el crecimiento de organismos que no son VRE y, opcionalmente, algunas especies de organismos VRE.

En general, un medio capaz de soportar el crecimiento de microbios contiene una variedad de componentes. En un mmimo, tales medios deben incluir aminoacidos, sales, vitaminas, una fuente de carbono y otras fracciones inorganicas. Los aminoacidos se encuentran disponibles a partir de una variedad de fuentes que incluyen fuentes naturales (por ejemplo, digeridos de tejido animal). Pueden proporcionarse como mezclas o en forma purificada. Las mezclas de aminoacidos obtenidos a partir de fuentes naturales contienen con frecuencia cantidades variables de cada aminoacido. No todos los aminoacidos tienen que ser proporcionados y la cantidad relativa puede variar. A continuacion se proporciona un listado de componentes del medio y sus cantidades, que se ofrecen como una grna y no como una limitacion.

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El medio puede contener al menos los siguientes aminoacidos en aproximadamente las siguientes cantidades (gramos por litro de medio {g/l}): alanina (0,1 a 0,3 g/l), arginina (0,1 a 0,3 g/l), acido aspartico (0,4 a 0,7 g/l), cistina (0,01 a 0,015 g/l), acido glutamico (1,0 a 1,6 g/l), glicina (0,12 a 0,17 g/l), histidina (0,116 a 0.17 g/l), isoleucina (0,25 a 0,37 g/l), leucina (0,4 a 0,6 g/l), lisina (0,37 a 0,56 g/l), metionina (0,13 a 0,19 g/l), fenilalanina (0,2 a 0,3 g/l), prolina (0,4 a 0.6 g/l), serina (0,18 a 0,26 g/l), treonina (0,19 a 0,28 g/l), tritofano (0,05 a 0,07 g/l), tirosina (0,12 a 0,18 g/l), y valina (0,29 a 0,44 g/l).

Pueden proporcionarse sales al medio como una fuente de iones despues de disociacion. Tales sales pueden incluir (por 1 de medio): cloruro de potasio (0,5 a 1,5 g), sulfato de cobre (40 a 50 microgramos (pg)), sulfato de amonio (4,0 a 6,0 g), yoduro de potasio (50 a 150 pg), sulfato de manganeso (300 a 500 pg), molibdato de sodio (150 a 250 pg), sulfato de zinc (300 a 500 pg), y cloruro de sodio (0,05 a 0,15 g).

Tambien deben proporcionarse vitaminas requeridas para el crecimiento y la reproduccion del microorganismo cuya deteccion se busca. Estas pueden proporcionarse en forma purificada o como mezclas. Tales vitaminas pueden incluir (por 1 de medio): biotina (220 a 330 pg), acido pantotenico (44 a 66 pg), piridoxina (9 a 14 miligramos (mg)), riboflavina (11 a 17 mg), acido folico (6 a 8 mg), tiamina (16 a 24 mg), niacina (15 a 23 mg), y elementos de trazas (menos de aproximadamente 10 pg) de cianocobalamina.

Una fuente de carbono tambien puede proporcionarse. Puede proporcionarse azucar como la fuente de carbono, ejemplos de los cuales incluyen (g/l): dextrosa (0,1 a 10), sacarosa (0,1 a 10), maltosa (0,1 a 10), lactosa (0,1 a 10), xilosa (0,1 a 10), galactosa (0,1 a 10) y almidon (0,1 a 10). Otros nutrientes incluyen peptonas tales como peptonas de casema, peptonas de soja y peptonas de carne.

Los medios pueden incluir opcionalmente otras sustancias inorganicas para ayudar en el crecimiento microbiano. Estas incluyen (en la medida que no se proporcionen en las fuentes anteriores, por 1 de medio): fosforo (0,5 mg), potasio (0,4 mg), sodio (30 a 60 mg), y cantidades de trazas (menos de 10 pg) de calcio, magnesio, aluminio, bario, cloruro, cobalto, cobre, hierro, plomo, manganeso, sulfato, azufre, estano y zinc.

Ademas de los componentes que promueven el crecimiento de microbios diana, tambien pueden incluirse en componentes que inhiben el crecimiento de microbios no diana (y que causan por lo tanto que los medios se seleccionen para VRE). Estos componentes se diferencian entre los organismos diana (por ejemplo enterococos que contienen vanA y vanB) y organismos que no son diana (es decir, organismos que no son vRe). Por ejemplo, y no a manera de limitacion, (en g/l), colistina (0,005 a 0,04), acido nalidfxico (0,003 a 0,01), y anfotericina B (0,006 a 0,02) pueden adicionarse ademas a la vancomicina que se encuentra presente en una concentracion ejemplar de 0,004 a 0,016 g/l para inhibir o impedir el crecimiento de no enterococos y enterococos sensibles a vancomicina en el medio. Preferiblemente, el medio tiene una concentracion de vancomicina de 0,006 a 0,01 g/l. Los microbios que no son diana que pueden interactuar con los sustratos en el medio para producir un efecto observable (tal como un color) que es similar al color producido por la interaccion de VRE con los sustratos cromogenicos en los medios son de interes particular. Los lactobacilos, si estan presentes, interactuaran con los sustratos en los medios y la colonia tendra un color similar al color de una especie VRE diana. Por lo tanto, es ventajoso si el medio contiene una cantidad de eritromicina (0,0001 a 0,01 g/l) que suprime el crecimiento de lactobacilos pero no afecta adversamente el crecimiento de los organismos diana o la diferenciacion de especie de los organismos diana en los medios.

La tabla 1 dada a continuacion tambien incluye una cefalosporina (por ejemplo cefoxitina). La cefoxitina, en combinacion con la vancomicina, inhibira selectivamente las cepas que contienen vanC, dejando las cepas que contienen vanA y vanB a distinguirse una de otra con base en la interaccion selectiva de cada una con su sustrato cromogenicos respectivo. En determinadas configuraciones, se prefiere suprimir el crecimiento de las cepas que contienen vanC, antes que permitir que crezcan las cepas que contienen vanC en un ambiente en el cual puedan distinguirse de las cepas que contienen vanA y vanB. Cefoxitina se encuentra presente en una cantidad de 0,002 g/l a 0,04 g/l para llevar a cabo este objetivo. Preferiblemente, la cefoxitina se encuentra presente en una cantidad de 0,004 g/l a 0,02 g/l para llevar a cabo este objetivo.

Pueden proporcionarse medios en varias formas que incluyen, por ejemplo, solidos, polvos (Ray hidratados antes de usarse), semisolidos (por ejemplo, medio a base de agar) o lfquidos (por ejemplo caldo).

Un medio semisolido, adecuado para promover el crecimiento de VRE mientras se suprime el crecimiento de no VRE (incluyendo generos distintos de Enterococcus) se describe en la Tabla 1 dada a continuacion.

TABLA 1

Componente

Cantidad (g/l)

A. Soporte del crecimiento de VRE

Peptona de casema

5 a 30

Sulfato de magnesio

aproximadamente 0,4

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20

25

Componente

Cantidad (g/l)

Cloruro de sodio

aproximadamente 3,95

Agar

aproximadamente 13,45

Dextrosa

aproximadamente 1,05

Extracto de carnede vacuno

aproximadamente 0,25

Peptona de soja

5 a 25

Almidon soluble

aproximadamente 0,5

Extracto de levadura

aproximadamente 0,075

Piruvato de sodio

aproximadamente

Peptona de carne

10 a 25

Fosfato de sodio dibasico

aproximadamente 1,3

B. Inhibicion del crecimiento de organismos que no son VRE

Vancomicina

0,004 a 0,016

Colistina

0,005 a 0,04

Acido nalidfxico

0,003 a 0,01

Anfotericina B

0,006 a 0,02

Cefoxitina

0,004 a 0,02

La formulacion descrita antes se proporciona para propositos ilustrativos. Alguien habil en la tecnica reconocera que hay muchas alternativas adecuadas para los componentes espedficos enumerados en la tabla anterior. Por ejemplo, polimixina B (en una concentracion de 0,012 a 0,075 g/l) y aztreonam (en una concentracion de 0,005 a 0,1 g/l), son contemplados como ejemplos de alternativas a la colistina y acido nalid^xico, respectivamente, en el medio. Sin embargo, en determinadas formas de realizacion preferidas aztreonam se encuentra presente ademas de colistina, acido nalidfxico y los otros componentes que inhiben el crecimiento de organismos que no son VRE. Polimixina B y aztreonam son capaces de realizar la misma funcion (es decir, suprimir barras gramnegativas) en el medio que la colistina y el acido nalidfxico. Sin embargo, la polimixina B como una alternativa en la actualidad es, en cierto modo, menos preferida, desde una perspectiva de fabricacion y de estabilidad, que la colistina y el acido nalidfxico. Otro antibiotico contemplado para suprimir el crecimiento de organismos que no son VRE (por ejemplo Lactobacillus) es eritromicina. Mientras que muchos antibioticos son conocidos por suprimir el crecimiento de Lactobacillus, (por ejemplo clindamicina), eritromicina lo hace sin inhibir o afectar de alguna otra manera el crecimiento de VRE en los medios.

Mientras que el medio descrito en la tabla 1 es capaz de detectar la presencia de VRE, no puede identificar que organismo se encuentra presente. A fin de diferenciar entre especies de VRE en una muestra biologica, tienen que anadirse sustratos cromogenicos espedficos y unicos para las bacterias diana. Por lo tanto, el medio descrito en la presente tiene sustratos cromogenicos espedficos adicionados al mismo. Los sustratos cromogenicos son bien conocidos por aquellos con habilidad en la tecnica y se encuentran comercialmente disponibles.

Los sustratos cromogenicos, como se describen en la presente memoria, tienen dos componentes basicos: i) el sustrato (por ejemplo, nominalmente alfa-D-glucopiranosido); y ii) un cromoforo conjugado con el sustrato. Los sustratos descritos en la presente son ejemplos espedficos de una gran clase de sustratos cromogenicos conocidos, generalmente denominados sustratos de indolilo). Alguien habil en la tecnica esta consciente de que tales sustratos de indolilo se encuentran comercialmente disponibles. Un cromogeno, tal como se usa en la presente es una sustancia que es capaz de conversion en un pigmento. Enzimas espedficas hidrolizan sustratos espedficos. Despues de hidrolisis, el cromoforo se libera del sustrato y produce una senal caractenstica (por ejemplo, presenta un color distinto). Como se ha notado previamente, el hecho de si se hidrolizara o no un sustrato cromogenico y de si el cromoforo liberado, se ve afectado por varios factores. Un factores la presencia de otros sustratos, por ejemplo

5

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45

50

55

60

beta-D-galactopiranosido no se hidroliza o se hidroliza menos por especies de enterococos cuando esta presente beta-D-glucopiranosido. Asimismo, no todos los cromogenos presentaran su senal caractenstica en presencia de otros cromogenos (por ejemplo, determinados cromoforos fluorescentes apagaran la fluorescencia de otros cromoforos cuando ambos se expresen simultaneamente). Muchos sustratos no son espedficos para una especie pero en lugar de esto son espedficos para un genero, por ejemplo esculina y PIR son espedficos para genero para Enterococcus pero no hacen especiacion dentro del genero. Por lo tanto, la seleccion y la cantidad de cualquier sustrato cromogenicos de este tipo es cntico para la identificacion ultima de VRE al nivel de especie.

Aunque no desea vincularse a una teona particular, la solicitante cree que la identificacion de dos o mas especies de VRE se lleva a cabo con el medio inventivo debido a que VRE espedficos producen enzimas espedficas para la especie, ya sea naturalmente o de manera inducida. Cada enzima asociada a la especie es espedfica para un sustrato en los medios. Dichos sustratos se conjugan con diferentes cromoforos, seleccionados por su capacidad de percibirse visualmente de manera simultanea. Cuando la enzima producida por VRE interactua selectivamente con su sustrato espedfico, se emite el cromoforo conjugado con dicho sustrato y se produce su senal caractenstica detectable visualmente. Como se ha notado previamente, la senal caractenstica es discernible incluso si otros cromogenos forman imagenes simultaneamente.

En una forma de realizacion de la presente invencion, los medios contienen dos sustratos cromogenicos. El primer sustrato es espedfico para un enzima que se produce por una especie de enterococos y el segundo sustrato es espedfico para una enzima producida por una especie diferente de enterococos. En esta forma de realizacion, ambas especies de enterococos son colectivamente los microbios diana. La alfa-D-glucosidasa y la beta-D- galactosidasa son las enzimas producidas por estos microbios. Cada microbio diana hidroliza selectivamente el respectivo sustrato cromogenicos en el medio para producir una senal detectable, distintiva.

Alguien versado en la materia apreciara que el efecto observado (es decir, el cambio de color) asociado con la hidrolisis, espedfica para la enzima, del sustrato cromogenico es local. Por local se quiere decir que el cambio de color ocurrira en esa region del sustrato donde se encuentra localizada la especie de microbio que produce la enzima. Si se encuentran localizadas cerca dos especies juntas, ambas formaran imagenes debido a que los sustratos cromogenicos se seleccionan para asegurar que cada cromogeno formara imagenes independientemente incluso si la formacion de imagenes es proxima a la del otro cromogeno. Como se ha notado previamente, el cambio de color puede ser dentro del intervalo visible de longitud de ondas. Para fluorogenos, las senales fluorescente y, por lo tanto, es visible en un intervalo de longitudes de onda despues de exposicion a una fuente de luz de excitacion.

En una forma ejemplar de realizacion para producir imagenes selectivamente de las especies de E. faecium y E. faecalis de enterococos, los sustratos cromogenicos proporcionados en los medios son un indolilo-beta D- galactopiranosido y un indolilo-alfa D-glucopiranosido (los sustratos cromogenicos se encuentran comercialmente disponibles por parte de una variedad de proveedores). El medio resultante no solo indicara la presencia de VRE, sino tambien distinguira visualmente entre E. faecalis y E. faecium si ambas presencias se encuentran presentes. Si solamente una de E. faecalis o E. faecium se encuentra presente, el color exhibido por el medio y/o la colonia, se hay alguna, indicaran cual de E. faecalis o E. faecium se encuentra presente.

En otra forma de realizacion, dos sustratos cromogenicos y un tercer sustrato se adicionan al medio espedfico de VRE. En referencia a la FIG. 3, en esta forma de realizacion cada sustrato (nominalmente sustrato A (30), sustrato B (31) e inductor (32)) interactua espedficamente con determinadas enzimas (enzima A (41), enzima B (42) producidas por diferentes especies de enterococos (E. faecalis, E. faecium, y E. gallinarum/E. casseliflavus en FIG. 3), de modo que la visualizacion de las fracciones cromogenicas no interfiere unas con otras. En esta forma de realizacion, el tercer sustrato (inductor) (32) induce la produccion de una enzima (enzima A (41)) en una tercera especie de enterococos (por ejemplo, E. gallinarum o E. casseliflavus). El tercer sustrato (32) no tiene un cromogeno adherido al mismo. Es por esta razon que el tercer sustrato, en esta forma de realizacion, se denomina sustrato inductor.

En una forma ejemplar de realizacion, la especie de enterococos que los sustratos identifican son las especies previamente mencionadas de enterococos resistentes a vancomicina (es decir, que distinguen E. faecalis de E. faecium de E. gallinarum/E. casseliflavus). Los sustratos cromogenicos son indolilo-beta D-galactopiranosido (Mag B gal) e indolilo-alfa D-glucopiranosido (X-alfa glu). Como previamente se ha notado, estos sustratos de indolilo se encuentran comercialmente disponibles. El sustrato inductor es metil-alfa-D-glucopiranosido (MGP). El sustrato inductor (32) causa que las especies E. gallinarum y E. casseliflavus produzcan la enzima A (41) ademas de la enzima B (42). La enzima A hidroliza indolilo-alfa D-glucopiranosido para producir el color A (50). Puesto que E. casseliflavus y E. gallinarum ya producen la enzima, beta-D-galactopiranosidasa, la enzima B (42) tambien se hidroliza. Por consiguiente, si se encuentra presente E. faecalis en esta forma de realizacion, los medios formaran imagenes de un primer color (50) de colonias de E. faecalis. Si se encuentra presente E. faecium, los medios formaran imagenes de un segundo color (51) de las colonias de E. faecium. Si se encuentran presentes E. gallinarum y/o E. casseliflavus, los medios formaran la imagen de un tercer color (52) de las colonias de E. gallinarum y/o de E. casseliflavus. El tercer color (52) es una combinacion del primer color (50) y del segundo color (51). En referencia a la FIG. 2, se ilustran los diferentes colores (50, 51, y 52) para las tres colonias (E. faecalis, E. faecium y E. gallinarum y/o E. casseliflavus).

5

10

15

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25

30

35

El medio resultante permitira la deteccion de VRE y la identificacion de al menos tres especies diferentes, espedficas de VRE utilizando una muestra y un ensayo.

En otra forma de realizacion, dos sustratos cromogenicos y cefalosporina (una clase de una clase de antibioticos de 13-lactama) se adicionan al medio espedfico de VRE. En esta modalidad, la combinacion de cefalosporina con vancomicina inhiben selectivamente sepas que contienen vanC, dejando que se distingan una de otra las cepas que contienen vanA y vanB despues de la interaccion selectiva de cada una con su sustrato cromogenico respectivo.

En una forma de realizacion ejemplar, la especie de enterococos para cuya identificacion se seleccionan los sustratos cromogenicos son las especies previamente mencionadas de enterococos resistentes a vancomicina (es decir, E. faecalis y E. faecium). Los sustratos cromogenicos son indolilo-beta D-galactopiranosido e indolilo-alfa D- glucopiranosido. La cefalosporina es cefoxitina. Cefoxitina se encuentra comercialmente disponible a partir de una variedad de fuentes. Si se encuentra presente E. faecium, los medios forman imagenes de un primer color de las colonias de E. faecium. Si se encuentra presente E. faecalis, los medios formaran imagen de un segundo color de las colonias de E. faecalis. El crecimiento de organismos que contienen vanC (E. gallinarum y/o E. casseliflavus) es inhibido por la presencia de la cefalosporina (por ejemplo cefoxitina) en combinacion con la vancomicina.

La invencion, tal como se ha descrito antes en terminos de determinadas formas de realizacion, se entiende aun mas con referencia a los siguientes ejemplos.

La figura 1 representa una placa de aplicacion por rozamiento en la cual pueden verse dos colores de colonia distintos. Una muestra mezclada que contiene E. faecium y E. faecalis fue rayada sobre una placa de cribado que comprendfa el medio descrito en la tabla 1 al cual se adicionaron los sustratos cromogenicos (indolilo- beta-D- galactopiranosido e indolilo-alfa-D-glucopiranosido) (0,2 y 0,1 g/l, respectivamente). Las colonias de color malva que fueron obtenidas indicaron la hidrolisis de indolilo- beta-D-galactopiranosido por parte de E. faecium mientras que las colonias verdes que fueron obtenidas indicaron la hidrolisis de indolilo-alfa-D-glucopiranosido por parte de E. faecalis.

La figura 2 representa una placa de aplicacion por rozamiento en la cual se observaron tres colores de colonia distintos. Una muestra mezclada que contiene E. faecium, E. faecalis y E. gallinarum/E. casseliflavus fue aplicada rozando sobre una placa de cribado que comprendfa el medio descrito en la tabla 1 a la cual se habfan adicionado los sustratos cromogenicos, indolilo-beta-D-galactopiranosido e indolilo-alfa-D-glucopiranosido, el sustrato inductor MGP ((0,2, 0,1 y 5,0 g/l, respectivamente). Como en la figura 1, las colonias de color malva indican la hidrolisis de indolilo- beta-D-galactopiranosido por parte de E. faecium mientras que las colonias verdes indican la hidrolisis de indolilo-alfa-D-glucopiranosido por parte de E. faecalis. Las colonias coloreadas de azul indican la hidrolisis tanto de indolilo- beta-D-galactopiranosido como de indolilo-alfa-D-glucopiranosido por parte de E. casseliflavus y E. gallinarum. La figura 2 demuestra como pueden distinguirse las especies de enterococos epidemiologicamente importantes, E. faecium y E. faecalis, de las especies de enterococos epidemiologicamente insignificantes, E. casseliflavus y E. gallinarum.

Un medio semi-solido, adecuado para promover el crecimiento de VRE mientras se suprime el crecimiento de no- VRE (incluyendo generos distintos de Enterococcus) se describe en la tabla 2 dada a continuacion.

TABLA 2

Componente

Cantidad (g/l)

A. Soporte del crecimiento de VRE

Peptona de casema

5 a 30

Sulfato de magnesio

aproximadamente 0,4

Cloruro de sodio

aproximadamente 3,95

Agar de sexetam

13,45

Dextrosa

1,05

Extracto de carne de vacuno

0,25

Peptona de soja

5 a 25

Almidon soluble

aproximadamente 0,5

Extracto de levadura

aproximadamente

Componente

Cantidad (g/l)

0,075

Piruvato de sodio

aproximadamente 0,25

peptona de carne

10 a 25

Fosfato de sodio dibasico

aproximadamente 1.3

B. Inhibicion del crecimiento de organismos que no son VRE

Vancomicina

0,004 a 0,016

Aztreonam

0,001 a 0,01

Colistina

0,0005 a 0,04

Acido nalidfxico

0,003 a 0,01

Anfotericina B

0,006 a 0,2

Eritromicina

0,0001 a 0,01

Cefoxitina

0,004 a 0,02

Esta formulacion contiene los antibioticos aztreonam y eritromicina ademas de los inhibidores listados en la tabla 1. Ejemplo 1: Titulacion de vancomicina y adicion con cefoxitina

Se prepararon medios para evaluar el efecto de incrementar la concentracion de vancomicina sobre la sensibilidad 5 de las especies de enterococos que contienen vanA, vanB (es decir E. faecium y E. faecalis), y vanC (es decir E. casseliflavus / E. gallinarum). Fueron obtenidos aislados de los organismos diana de interes (E. faecium, E. faecalis, E. casseliflavus y E. gallinarum). Se preparo una suspension para cada aislado que era equivalente a una McFarland 0,5 (108). Las suspensiones fueron diluidas de acuerdo con los lineamientos en el documento M22-A3 del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

10 Fueron preparados medios tal como se describen en la tabla 3 dada a continuacion. Para aislamiento de las muestras se uso un procedimiento de aplicacion por rozamiento estandar para inoculacion. Cada aislado fue inoculado acadia formulacion de medios. Las placas fueron luego incubadas en aire ambiente (35°C) y observadas despues de 24 h de incubacion.

TABLA 3

Componente

Cantidad (g)

A. Soporte del crecimiento de VRE

A B C D E F G H

peptona de casema

30 30 30 30 30 30 30 30

Sulfato de magnesio

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Cloruro de sodio

5 5 5 5 5 5 5 5

Peptona de carne

10 10 10 10 10 10 10 10

Agar de sexetam

13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5

peptona de soja

6 6 6 6 6 6 6 6

Almidon soluble

5 5 5 5 5 5 5 5

Extracto de levadura

2 2 2 2 2 2 2 2

Piruvato de sodio

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Componente

Cantidad (g)

Infusion de cerebro corazon (BHI)

5 5 5 5 5 5 5 5

Fosfato de sodio dibasico

5 5 5 5 5 5 5 5

B. Inhibicion del crecimiento de organismos que no son VRE

Vancomicina

0,005 0,0055 0,006 0,01 0,013 0,016 0,005 0,005

Colistina

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Acido nalidfxico

0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,006

Anfotericina B

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Cefoxitina

0 0 0 0 0 0 0,006 0

Aztreonam

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Sustratos de C.

MGP

3 3 3 3 3 3 3 3

X-alfa glu

0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

Mag B gal

3 3 3 3 3 3 3 3

D. Otros

Agua (ml)

1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Fueron preparados diversos antibioticos como soluciones madre. Fueron hechas diluciones apropiadas a partir de cada solucion madre para lograr las concentraciones especificadas en la tabla anterior.

Se observo que la formulacion A, que contema 5 pg de vancomicina tema el color mas distintivo (azul) para los aislados que conteman vanC. Sin embargo, las colonias de dos cepas de E. gallinarum teman un color verde. Hubo 5 alguna dificultad al distinguir el color verde producido por estas dos cepas de las especies E. faecalis en esta formulacion. Incrementar la concentracion de vancomicina causo que el medio perdiera sensibilidad en la recuperacion de aislados de vanA y vanB.

La muestra G produjo un resultado sorprendente. Mientras que los aislados de E. faecalis y E. faecium fueron recuperados sobre los medios, 8 de los 10 aislados de las especies que conteman vanC fueron suprimidos. La 10 muestra G era la unica muestra que contema el antibiotico cefoxitina.

Ejemplo 2: Ensayo de sinergia de vancomicina-cefalosporina

Con el fin de entender mejor el efecto de cefoxitina en los aislados de vanC, fueron evaluados los medios que teman diferentes cefalosporinas con y sin vancomicina. Las cefalosporinas ensayadas representaron cada una de las cuatro generaciones: cefalotin (1a gen.), cefoxitina (2a gen.), cefotaxima (3a gen.), y cefipima (4a gen.). Tambien se 15 evaluaron los medios que conteman penicilina con y sin vancomicina.

Las formulaciones para los medios evaluados se presentan en la tabla 4 dada a continuacion. Fueron obtenidos aislados de interes (principalmente enterococos que contienen vanA, vanB, y vanC). Cada aislado fue inoculado en cada formulacion de medio punto las placas fueron incubadas luego en aire ambiente (35°C) y observadas despues de 24 h de incubacion.

20 TABLA 4

Componentes

Cantidades (g/L)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Peptona de casema

30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

BHI

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Peptona de carne

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Componentes

Cantidades (g/L)

Extracto de levadura

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Peptona de soja

6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

Agar de sexetam

13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5

Almidon soluble

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Fosfato de potasio

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Sulfato de magnesio

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Cloruro de sodio

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Piruvato de sodio

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

MGP

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

X-alfa-glu

0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

Mag-B-Gal

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Vancomicina

0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006

Anfotericina B

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Acido nalidfxico

0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006

Colistina

0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

Cefoxitina

0,02 0,02

Cefotaxima

0,02 0,02

Cefipima

0,02 0,02

Cefalotin

0,02 0,02

Penicillina

0,02 0,02

Agua (cant. en ml)

1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Los diversos antibioticos fueron preparados como soluciones madre. Fueron hechas diluciones apropiadas a partir de cada solucion madre con el fin de lograr la concentracion final tal como se especifica en la formulacion.

Los medios, despues de incubacion en placas de Petri tal como se ha descrito antes, fueron observados para 5 determinar que colonias se desarrollaron y el color de aquellas colonias. Algunos resultados son ilustrados en la FIG.4. Espedficamente, la placa 100, que contema la formulacion 1 anterior (solo vancomicina), tema colonias de color azul brillante (indicadas mediante sombreado horizontal cruzado). Esto indica que las especies de enterococos que contienen vanC no fueron inhibidas por la vancomicina en la formulacion 1. Fueron observados resultados similares en la placa de Petri 110 para la formulacion 2 (que no contema vancomicina pero sf contema cefoxitina). 10 Esta formulacion no inhida las especies de enterococos que conteman vanC. La placa 120 contema la formulacion 7 (vancomicina y cefoxitina). La completa ausencia de colonias azules indico que la formulacion 7 (la combinacion de vancomicina y cefoxitina sin otros inhibidores de VRE) inhibio completamente los enterococos que conteman vanC.

El efecto de las formulaciones 1, 2, y 7 en aislados que conteman vanA y vanB se ilustra en las placas 130-150, Espedficamente, ninguna de las formulaciones inhibio el crecimiento de las especies que conteman vanA y vanB. 15 Las colonias de E. faecium se indican por medio del color malva (sombreado vertical cruzado). Las colonias de E. faecalis son indicadas por el color verde (sombreado diagonal cruzado). Por consiguiente, no se observo que las formulaciones ensayadas con vancomicina sola, cefoxitina sola y una combinacion de cefoxitina y vancomicina suprimieran coincidieran el crecimiento de enterococos que conteman vanA y vanB.

Las otras cefalosporinas ensayadas, con vancomicina, no produjeron el mismo efecto que cefoxitina (inhibicion de 20 aislados que conteman vanC mientras que permitieron la recuperacion de aislados de vanA y vanB). Mientras que

se observo (para la mayor parte) que inhibfan los aislados de vanC, tambien se observo que inhi^an muchos de los aislados de vanA y vanB.

En referencia a las formulaciones 6 y 11 (sin y con vancomicina, respectivamente), se encontro que los medios que conteman en histidina eran demasiado inhibidores, que suprimieran casi todos los aislados.

5 Aunque cefoxitina fue la unica cefalosporina que produjo los resultados deseados en este experimento, otras cefalosporinas ademas de cefoxitina, distintas de aquellas ensayadas, son contempladas con probabilidad de producir inhibicion aceptable de aislados de vanC sin inhibir aislados de vanA y vanB.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un medio de identificar y distinguir especies de enterococos colocadas en el medio que comprende:

   (a) un primer sustrato conjugado con una primera fraccion para formacion de imagenes, en el que el primer sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con una primera enzima que se produce por una primera especie de enterococos en comparacion con una segunda enzima que se produce por una segunda especie de enterococos; y

   (b) un segundo sustrato conjugado con una segunda fraccion para formacion de imagenes, en el que el segundo sustrato se selecciona para interactuar preferencialmente con la segunda enzima que se produce por la segunda especie de enterococos en comparacion con la primera enzima que se produce por la primera especie de enterococos;

   en el que la primera fraccion para formacion de imagenes produce la imagen de un primer indicador cuando el primer sustrato interactua con la primera enzima y la segunda fraccion para formacion de imagenes produce la imagen de un segundo indicador cuando el segundo sustrato interactua con la segunda enzima y el primer indicador es diferente, por percepcion, del segundo indicador; y

   (c) o bien un tercer sustrato, o bien un tercer sustrato y una cefalosporina, en el que el tercer sustrato induce la produccion de la primera enzima por parte de al menos una tercera especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fraccion para formacion de imagenes y la segunda fraccion para formacion de imagenes produce una imagen de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por parte de al menos la tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicador son diferentes unos de otros, por percepcion, y el tercer sustrato no tiene un cromogeno adherido al mismo; o

   (c') un inhibidor de enterococos no resistente a vancomicina que comprende vancomicina y al menos una cefalosporina, en el que la cefalosporina inhibe el crecimiento de la tercera especie de enterococos pero no el crecimiento de la primera o de la segunda especie de enterococos, y la presencia combinada de la primera fraccion para formacion de imagenes y la segunda fraccion para formacion de imagenes forman la imagen de un tercer indicador en la presencia combinada de la primera enzima y la segunda enzima producidas por la al menos tercera especie de enterococos, en el que el primero, el segundo y el tercer indicadores son diferentes unos de otros, por percepcion.
2. 2. El medio de la reivindicacion 1, en el cual la primera fraccion para formacion de imagenes es un primer cromoforo y la segunda fraccion para formacion de imagenes es un segundo cromoforo, y el medio comprende ademas un tercer sustrato que interactua con al menos una tercera especie de enterococos para formar la imagen de un tercer indicador que es diferente por percepcion del primer indicador o del segundo indicador.
3. 3. El medio de la reivindicacion 2, en el cual la tercera especie de enterococos produce una enzima normalmente reprimida en respuesta a la interaccion con el tercer sustrato, en el que la enzima reprimida normalmente interactua de forma preferencial con el primer sustrato para formar la imagen del primer indicador.
4. 4. El medio de la reivindicacion 3 en el cual

   (i) la tercera especie de enterococos produce una enzima que es la misma o diferente de la segunda enzima y que interactua preferencialmente por el segundo sustrato para formar la imagen del segundo indicador y en el que el primer indicador y el segundo indicador conjuntamente son el tercer indicador; o

   (ii) el tercer sustrato induce la tercera especie para producir la primera enzima, en el que la primera enzima es alfa- D-glucopiranosidasa, y en el que la al menos tercera especie de enterococos se selecciona de E. casseliflavus y E. gallinarum.
5. 5. El medio de la reivindicacion 1 que comprende ademas inhibidores de enterococos no resistentes a vancomicina.
6. 6. El medio de la reivindicacion 5 en el cual los inhibidores comprenden vancomicina.
7. 7. El medio de la reivindicacion 6 en el cual

   (i) la vancomicina esta presente en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de al menos algunos enterococos que no son resistentes a vancomicina y de manera no significativa inhiben el crecimiento de enterococos resistentes a vancomicina; o

   (ii) los inhibidores comprenden ademas eritromicina; los inhibidores comprenden preferiblemente ademas al menos un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en colistina, acido nalidfxico, aztreonam, y anfotericina B y combinaciones de los mismos.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45
8. 8. El medio de la reivindicacion 6 que comprende ademas un inhibidor de enterococos que contienen vanC en el cual el inhibidor de los enterococos que contienen vanC comprende una cefalosporina, preferiblemente

   (i) la cefalosporina es cefoxitina, mas preferiblemente la cefoxitina se encuentra presente en una cantidad efectiva para suprimir el crecimiento de los enterococos que contienen vanC, de la manera mas preferible la cantidad de cefoxitina no suprime significativamente el crecimiento de un enterococo resistente a vancomicina seleccionado de enterococos resistentes a vancomicina que contienen un gen vanA y enterococos resistentes a vancomicina que contienen un gen vanB; o

   (ii) los inhibidores comprenden ademas eritromicina; o

   (iii) el segundo sustrato es beta-D-galactopiranosido y la segunda enzima es beta-D-galactopiranosidasa, mas preferiblemente el segundo microorganismo es una segunda especie de enterococos resistentes a vancomicina, de la manera mas preferible la segunda especie de enterococos resistentes a vancomicina es E. faecium.
9. 9. El medio de la reivindicacion 1, en el cual el primer sustrato es alfa-D-glucopiranosido y la primera enzima es alfa- D-glucopiranosidasa, preferiblemente el primer microorganismo es una primer especie de enterococos resistentes a vancomicina, del modo mas preferible la primera especie de enterococos resistentes a vancomicina es E. faecalis.
10. 10. El medio de la reivindicacion 1 que comprende:

    un inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina que comprende vancomicina y en el que la cefalosporina inhibe el crecimiento de la tercera especie de enterococos pero no el crecimiento de la primera o de la segunda especie de enterococos.
11. 11. El medio de la reivindicacion 10 en el cual

    (i) la primera y la segunda fraccion de formacion de imagenes se seleccionan de cromoforos y fluoroforos, preferiblemente la primera fraccion de formacion de imagenes conjugada con el primer sustrato es un primer cromogeno y la segunda fraccion de formacion de imagenes conjugada con el segundo sustrato es un segundo cromogeno; o

    (ii) el primer sustrato es alfa-D-glucopiranosido y la primera enzima es alfa-D-glucopiranosidasa; o

    (iii) el segundo sustrato es beta-D-galactopiranosido y la segunda enzima es beta-D-galactopiranosidasa; o

    (iv) el tercer sustrato es metil-alfa-D-glucopiranosido.
12. 12. El medio de la reivindicacion 10 en el cual

    (i) la primera especie de microorganismo es una primer especie de enterococos resistente a vancomicina, preferiblemente la primera especie de enterococo resistente a vancomicina es E. faecalis; o

    (ii) la segunda especie de microorganismo es una segunda especie de enterococos resistentes vancomicina, preferiblemente la segunda especie de enterococos resistente a vancomicina es E. faecium; o

    (iii) la al menos tercera especie de microorganismo es una tercera especie de enterococos resistentes a vancomicina seleccionada de E. casseliflavus, E. gallinarum y combinaciones de los mismos.
13. 13. El medio de la reivindicacion 10 en el cual el inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina comprende ademas un inhibidor seleccionado de colistina, acido nalidfxico, aztreonam, anfotericina B, y combinaciones de los mismos, preferiblemente la cefalosporina es cefoxitina, de la manera mas preferible el inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina comprende ademas eritromicina.
14. 14. Un procedimiento para detectar la presencia de una especie de enterococos resistentes a vancomicina, el cual comprende:

    combinar una muestra biologica con un medio tal como se ha definido en la reivindicacion 1, y detectar la presencia o la ausencia de al menos la primera y la segunda especie de los enterococos resistentes a vancomicina directamente del medio.
15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 14 en el cual

    (i) la primera y la segunda fraccion para formacion de imagenes se seleccionan de cromoforos y fluoroforos; o

    (ii) la primera fraccion para formacion de imagenes conjugada con el primer sustrato es un primer cromogeno y la segunda fraccion para formacion de imagenes conjugada con el segundo sustrato es un segundo cromogeno; o

    (iii) el primer sustrato es alfa-D-glucopiranosido y la primera enzima es alfa-D-glucopiranosidasa; o

    (iv) el segundo sustrato es beta-D-galactopiranosido y la segunda enzima es beta-D-galactopiranosidasa; o

    (v) el tercer sustrato es metil-alfa-D-glucopiranosido; o

    (vi) la primera especie de enterococos resistentes a vancomicina es E. faecalis; o

    (vii) la segunda especie de enterococos resistentes a vancomicina es E. faecium; o

    5 (viii) la tercera especie de enterococos resistentes a vancomicina se selecciona del grupo que consiste en E. casseliflavus, E. gallinarum y combinaciones de los mismos; o

    (ix) el inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina comprende ademas un inhibidor seleccionado de colistina, acido nalidfxico, aztreonam, eritromicina, anfotericina B, y combinaciones de los mismos, preferiblemente la cefalosporina es cefoxitina; o

    10 (x) el inhibidor de enterococos no resistentes a vancomicina comprende ademas eritromicina.