ES2646090T3 - Uso de baja temperatura y/o bajo pH en cultivo celular - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de una proteína en un cultivo celular que comprende: (a) cultivar células en cultivo celular a una temperatura reducida, en el que la temperatura reducida se encuentra dentro de un intervalo de 27,0°C a menos de 30,0°C; y (b) cultivar células en el cultivo celular a pH reducido, en el que el pH reducido se encuentra dentro de un intervalo de 6,80 a menos de 7,00; para reducir la producción de proteínas mal plegadas y/o proteínas agregadas, en el que el cultivo celular es un cultivo de células de mamífero, en el que la proteína producida es un receptor soluble, en el que dicho receptor soluble es TNFR-Fc o sIL-13R.
Description
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DESCRIPCION
Uso de baja temperature y/o bajo pH en cultivo celular
Esta solicitud reivindica las ventajas de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° de Serie 60/913.382, presentada lunes, 23 de abril de 2007, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La presente invencion proporciona procedimientos para mejorar la produccion de protemas por celulas cultivadas, especialmente celulas de mairnfero. Espedficamente, la presente invencion se refiere a procedimientos para preparar productos protemicos, por ejemplo, productos de glucoprotemas, en los que las caractensticas del producto protemico se controlan manipulando el ambiente de cultivo celular. La invencion tambien se refiere a procedimientos para mejorar la eficacia terapeutica y/o la inmunogenicidad de los productos protemicos, por ejemplo, los productos de glucoprotemas, producidos en celulas de mai^ero, por ejemplo, manipulando la glucosilacion de la protema y reduciendo la agregacion y el mal plegado de las protemas, mediante la reduccion de la temperatura y/o del pH del cultivo celular.
Tecnica antecedente relacionada
Una gran proporcion de los productos biotecnologicos, ya se encuentren disponibles comercialmente o en desarrollo, son agentes terapeuticos protemicos. Existe una demanda grande y creciente de produccion de protemas en cultivos de celulas animales y de procedimientos mejorados relacionados con dicha produccion. Dichos procedimientos mejorados son necesarios debido a que normalmente es necesaria la maquinaria celular de una celula animal para producir diversas formas de agentes terapeuticos protemicos, tales como protemas modificadas postraduccionalmente, en particular, protemas glucosiladas.
Un problema comun encontrado en los procedimientos de produccion de protemas a gran escala es que una parte significativa del producto proteico se produce en forma mal plegada o agregada, es decir, en forma de un agregado de alto peso molecular ("HMWA"). Por ejemplo, la sobreexpresion recombinante de polipeptidos en celulas puede sobrecargar a la maquinaria del retmulo endoplasmatico (RE), posibilitando que un mayor numero de protemas mal plegadas y/o agregadas se evadan de las vfas degradativas y salgan del RE. Por lo tanto, los procedimientos de produccion de protemas actuales pueden dar como resultado una gran proporcion de producto que se encuentra agregado, no funcional y por lo tanto, no usable en su forma producida. La presencia de protema mal plegada y/o agregada no es deseable debido a que puede dar lugar a acontecimientos adversos tras su administracion, incluyendo, pero sin limitacion, un potencial de inmunogenicidad tras su administracion (por ejemplo, activacion de complemento o anafilaxia). Por lo tanto, un exceso de mal plegamiento y/o agregacion de protema terapeutica puede conducir a un fracaso en, por ejemplo, ensayos clmicos. Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de nuevos procedimientos para limitar o reducir el mal plegamiento y/o la agregacion de protemas.
La glucosilacion de protemas es un proceso de modificacion postraduccional comun mediante el cual se anaden restos complejos de azucar sobre una protema a traves de la accion de una serie de enzimas especializadas (glucosiltransferasas y glucosidasas) en el RE. Este proceso puede controlar el plegamiento adecuado de los polipeptidos recientemente sintetizados, de tal forma que salen del RE unicamente los polipeptidos correctamente plegados, mientras que las protemas mal plegadas se degradan. Los patrones de glucosilacion de protemas afectan al direccionamiento de la protema, la estructura, la estabilidad termodinamica y la actividad enzimatica (vease, por ejemplo, Sola y col. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2133-52; Sola y Griebenow (2006) FEBS Lett. 580:1685-90). Por ejemplo, la sialilacion de W-glucano se asocia con un aumento del tiempo de vida de las glucoprotemas debido a que dichas glucoprotemas no son reconocidas por los receptores de asialoglucoprotemas, que dirigen a las protemas no sialiladas a su degradacion (vease, por ejemplo, Bork y col. (2007) FEBS Letters 581:4195-98). Por lo tanto, las alteraciones en la glucosilacion de protemas pueden afectar a la calidad y la eficacia del producto.
Ademas, la glucosilacion aberrante de las protemas puede dar como resultado inmunogenicidad del producto proteico terapeutico final. Las protemas producidas en condiciones no naturales suboptimas pueden adquirir azucares y patrones de azucar no hallados de manera natural en las protemas humanas y por lo tanto, pueden dar como resultado una reaccion inmunogenica en el sujeto (Jefferis (2006) Biotechnol. Prog. 21:11-16). Dichas glucosilaciones no naturales son especialmente prevalentes en agentes terapeuticos proteicos, tales como agentes terapeuticos de anticuerpos o agentes terapeuticos de Fc-protema de fusion, por ejemplo, agentes terapeuticos de receptor de Fc soluble-protema de fusion.
Por estos motivos, la FDA requiere que se mantengan dentro de lfmites estrictos los perfiles de glucoforma de las protemas terapeuticas. Por lo tanto, existe la necesidad en la industria farmaceutica de un procedimiento de produccion de protemas terapeuticas en cultivo celular que permita el control del nivel de glucosilacion de protemas.
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Sumario de la invencion
1] Por lo tanto, la invencion es un procedimiento para producir una protema en un cultivo celular que comprende:
(a) cultivar celulas en cultivo celular a una temperatura reducida, en el que la temperatura reducida se encuentra dentro de un intervalo de 27,0°C a menos de 30,0°C; y
(b) cultivar celulas en el cultivo celular a pH reducido, en el que el pH reducido se encuentra dentro de un intervalo de 6,80 a menos de 7,00; para reducir la produccion de protemas mal plegadas y/o protemas agregadas,
en el que el cultivo celular es un cultivo celular de mamftero,
en el que la protema producida es un receptor soluble, en el que dicho receptor soluble es TNFR-Fc o sIL-13R.
En realizaciones preferidas, la invencion se refiere a modificar los parametros de pH y temperatura para reducir la produccion de protemas mal plegadas y/o agregadas en cultivo de celulas de mamftero y especialmente, en cultivo de celulas de ovario de hamster chino ("CHO").
En otro aspecto, la divulgacion es un procedimiento para producir una protema en un cultivo celular, en el que el nivel de glucosilacion de protema de la protema producida se controla modificando la temperatura y/o el pH del cultivo celular. Por lo tanto, puede aumentarse el nivel de glucosilacion, tal como, sin limitacion sialilacion de N- glucano, aumentando la temperatura y/o el pH o reducirse, reduciendo la temperatura y/o el pH.
En otro aspecto, la invencion es un procedimiento para producir una protema terapeutica controlando los parametros descritos anteriormente. Aun en otro aspecto, la invencion es una composicion farmaceutica que comprende una protema terapeutica producida mediante dicho procedimiento y un veldculo farmaceuticamente aceptable.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1A representa los numeros integrados de celulas viables (eje Y; IVC [celulas e9 normalizadas * dfa/l]), normalizados al IVC medio del dfa de recogida, de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a 27,0°C [♦], 28.0°C [▲], 29,0°C [■] o 30,0°C [o] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo en dfas [d]); La FIG. 1B representa la viabilidad celular (eje Y) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 2A representa el perfil de glucosa residual (eje Y; glucosa [g/l]) en el cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a 27,0°C [♦], 28.0°C [▲], 29,0°C [■] o 30,0°C [o] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]);
La FIG. 2B representa el perfil de glutamina (eje Y; glutamina [mM]) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 3A representa la concentracion de lactato en el medio (eje Y; lactato [g/l]) del cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a 27,0°C [♦], 28.0°C [▲], 29,0°C [♦] o 30,0°C [o] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]);
La FIG. 3B representa el perfil de amonio (eje Y; NH4+ [mM]) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 4A representa las productividades espedficas de celulas, representadas por la Qp media acumulativa (eje X; Qp. med. acum. [mg normalizados/e9 celulas/dfa]), normalizado a la media de Qp media acumulativa del dfa de cultivo, del cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a 27,0°C [♦], 28,0°C [A], 29,0°C [■] o 30,0°C [o] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]); mientras que la FIG. 4B representa el tftulo de TNFR-Fc (eje X; tftulo de producto [mg normalizados/l]), normalizados al tftulo medio del dfa de recogida, de las mismas celulas frente al tiempo (tiempo de cultivo [d]).
El efecto de variar las temperaturas de produccion (eje X; [°C]) en el cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc sobre la produccion de TNFR-Fc mal plegado y/o agregado (eje Y; % de producto mal plegado/agregado) se demuestra en la FIG. 5A; mientras que el efecto de las temperaturas sobre la produccion de HMWA (eje Y; % de especies de alto peso molecular) se demuestra en la FIG. 5B.
El efecto de variar las temperaturas de produccion (eje X; temperatura [°C]) en el cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc sobre el porcentaje de sialilacion total (sialilacion unida a N y O) de TNFR-Fc (eje Y; porcentaje de sialilacion total del material de referencia) se demuestra en la FIG. 6A. El material de referencia usado fue una aftcuota espedfica de TNFR-Fc con un patron de glucosilacion conocido y preferible con el que pueden compararse los resultados del ensayo. La FIG. 6B demuestra el efecto de variar las temperaturas de produccion (eje X; temperatura [°C]) en el cultivo celular de las mismas celulas sobre el porcentaje de glucanos unidos en N sialilados (□) o no sialilados (•) (eje Y; porcentaje de glucanos unidos en N totales).
La FIG. 7 demuestra el efecto de cultivar celulas a diferentes temperaturas (27,0°C [♦], 28.0°C [▲], 29,0°C [■] o 30,0°C[o]) sobre el pH del cultivo de celulas CHO (eje Y) frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 8A representa los numeros integrados de celulas viables (eje Y; IVC [celulas e9 normalizadas * dfa/l]), normalizados al IVC medio del dfa de recogida, de las celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a un punto de pH ajustado de 7,20 [0], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [▲] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]); mientras que la FIG. 8B representa la viabilidad celular (eje Y) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 9A representa el perfil de glucosa (eje Y; glucosa [g/l]) del cultivo celular de celulas CHO transfectadas
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con TNFR-Fc, cultivadas a un punto de pH ajustado de 7,20 [0], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [▲] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]); mientras que la FIG. 9B representa el perfil de glutamina (eje Y; glutamina [mM]) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 10A representa la concentracion de lactato en el medio (eje Y; lactato [g/l]) del cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a un pH fijo de 7,20 [□], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [▲] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]); mientras que la FlG. 10B representa el perfil de amonio (eje Y; nH4+ [mM]) de las mismas celulas frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 11A representa las deviaciones del pH del cultivo celular respecto del punto de pH ajustado (eje X; pH del cultivo), donde las celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc se cultivaron a un punto de pH ajustado de 7,20 [0], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [A] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]). La FlG. 11B representa la osmolaridad (eje X; osmolaridad [mOsm/kg]) de las mismas celulas cultivadas a un punto fijo de pH de 7,20 [0], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [▲] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 12A representa las productividades espedficas de celulas, representadas por la Qp media acumulativa (eje X; Qp. med. acum. [mg normalizados/e9 celulas/dfa]), normalizado a la media de Qp media acumulativa del dfa de cultivo, del cultivo celular de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc cultivadas a un punto de pH ajustado de 7,20 [0], 7,10 [■], 7,00 [♦], 6,90 [•] o 6,80 [▲] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]); mientras que la FIG. 12B representa el fftulo de TNFR-Fc (eje X; fftulo de producto [mg normalizados/l]), normalizados al fftulo medio del dfa de recogida, de las mismas celulas frente al tiempo (tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 13A representa el efecto de variar el punto ajustado de pH del cultivo (eje X; pH) de celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc sobre la produccion de TNFR-Fc mal plegado/agregado (eje Y; % de producto mal plegado/agregado). La FIG. 13B representa el efecto de variar el punto ajustado de pH del cultivo celular (eje X; pH) sobre la produccion de HMWA (eje Y; % de especies de alto peso molecular).
El efecto de varar el punto ajustado de pH (eje X; pH) en el cultivo de celulas CHO transfectadas con el TNFR-Fc sobre el porcentaje de sialilacion total de TNFR-Fc (eje Y; porcentaje de sialilacion total del material de referencia) se demuestra en la FIG. 14A. La FIG. 14B demuestra el efecto de variar el punto ajustado de pH del cultivo celular (eje X; pH) en el cultivo celular de las mismas celulas sobre el porcentaje de glucanos unidos en N sialilados (□) o no sialilados (•) (eje Y; porcentaje de glucanos unidos en N totales).
La FIG. 15 ilustra un perfil ffpico de fluorescencia (eje Y; fluorescencia, medida en mV) frente al tiempo de retencion (eje X; minutos) que ilustra la sialilacion unida a N de glucanos observada al someter a glucoformas de protema marcadas con 2-aminobenzamida-(2-AB) liberadas por hidrazaina a cromatograffa en fase normal.
La FIG. 16 ilustra los perfiles de fluorescencia (eje Y; mV) frente al tiempo de retencion (eje X; minutos) que ilustran la sialilacion unida a N de glucanos observada al someter a glucoformas de protema marcadas con 2- aminobenzamida-(2-AB) liberadas por hidrazaina a cromatograffa en fase normal de las celulas CHO transfectadas con TNFR-Fc a diversos puntos ajustados de pH del cultivo.
La FIG. 17 representa (A) la densidad de celulas viables (eje Y; celulas/ml), (B) la densidad celular total, que incluye las celulas tanto viables como no viables, (eje Y; celulas/ml), (C) la viabilidad celular (eje Y) y (D) los numeros integrados de celulas viables (IVC) (eje Y; e9 celulas*dfa/l) del cultivo celular de celulas que sobreexpresan sIL-13R cultivadas a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 18 representa el fftulo de sIL-13R, tanto en forma de dfmero como de HMWA, (eje Y; sIL-13R [mg/l]) para los cultivos celulares que sobreexpresan sIL-13R, cultivados a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 19A representa la velocidad de produccion diaria espedfica de sIL-13R (eje Y; Qp [ug/e9 celulas/d]) durante diversos intervalos de tiempo (eje X) para cultivos celulares que sobreexpresan sIL-13R, cultivados a 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C, 31,0°C, 29,0°C o TA. La FIG. 19B representa las productividades medias acumulativas espedficas de celulas (eje Y; Qp med. acum. [mg/e9 celulas/dfa]) frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]) para cultivos celulares que sobreexpresan sIL-13R, cultivadas a 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C, 31,0°C, 29,0°C o TA.
La FIG. 20 representa la velocidad de consumo de glucosa espedfica diaria (eje Y; Qglc [g/e9 celulas/d]) durante diferentes intervalos de tiempo (eje X) para cultivos celulares que sobreexpresan sIL-13R, cultivadas a 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C, 31,0°C, 29,0°C o TA.
La FIG. 21 representa la velocidad de consumo de glutamina espedfica diaria (eje Y; Qgln [mmol/e9 celulas/d]) durante diferentes intervalos de tiempo (eje X) para cultivos celulares que sobreexpresan sIL-13R, cultivadas a 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C, 31,0°C, 29,0°C o TA.
La FIG. 22 representa la concentracion de lactato (eje Y; lactato [g/l]) en el medio de cultivo celular de celulas que sobreexpresan sIL-13R, cultivados a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 23 representa la concentracion de amonio (eje Y; amoniaco [mM]) en el medio de cultivo celular de celulas que sobreexpresan sIL-13R, cultivados a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 24 representa el efecto de la temperatura de cultivo (eje X; temperatura de produccion [°C]) sobre la produccion de HMWA (eje Y; % de especies de alto peso molecular) en el dfa 9 de cultivo de celulas que sobreexpresan sIL-13R.
La FIG. 25 representa el efecto de la temperatura de cultivo (eje X; temperatura de produccion [°C]) sobre la produccion de HMWA (eje Y; % de especies de alto peso molecular) en el dfa 18 de cultivo de celulas que sobreexpresan sIL-13R.
La FIG. 26A representa el porcentaje del dfmero de sIL-13R (eje Y; % de dfmero de sIL-13R) recuperado de la
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protema sIL-13R total producida en el medio condicionado de celulas que sobreexpresan sIL-13R cultivadas a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]). La FIG. 26B representa el porcentaje de HMWA (eje Y; % de especies de elevado peso molecular) en relacion con sIL-13R total en el medio condicionado de celulas que sobreexpresan sIL-13R frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
La FIG. 27 representa el tftulo de dfmero de sIL-13R (eje Y; solo dfmero de sIL-13R [mg/l]) en el medio condicionado de celulas cultivadas a 37,0°C [♦], 33,0°C [■], 32,0°C [•], 31,0°C [0], 29,0°C [A] o TA [□] frente al tiempo (eje X; tiempo de cultivo [d]).
Descripcion detallada de la invencion
La creencia predominante para producir protemas terapeuticas en un cultivo de celulas de mairnfero es que la temperatura durante la fase de produccion debe ser de al menos 30,0°C y el pH debe ser de al menos 7,00. Sin embargo, el cultivo de celulas en un cultivo celular durante una fase de produccion a temperaturas superiores a 30,0°C y a un pH por encima de 7,00 puede dar lugar a un aumento de la agregacion de protemas (tambien citada en el presente documento como formacion de agregados de alto peso molecular o HMWA) y al mal plegamiento de protemas y por lo tanto, a la produccion de una menor cantidad de protema funcional y usable.
La presente invencion proporciona un procedimiento novedoso para la produccion de protemas en un cultivo celular, en el que el procedimiento da como resultado una reduccion del mal plegado de protemas y/o una reduccion de la agregacion de protemas. En otro aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos para controlar el nivel de glucosilacion de protemas.
Protemas producidas mediante los procedimientos de la divulgacion
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "polipeptido" y "producto polipeptidico" son sinonimas de los terminos "protema" y "producto proteico", respectivamente y, tal como se entiende de manera general en la tecnica, se refieren a al menos una cadena de aminoacidos unidos mediante enlaces peptfdicos secuenciales. En ciertas realizaciones, una "protema de interes" o un "polipeptido de interes" o similares es una protema codificada por una molecula de acido nucleico exogena que se ha transfectado o transformado en una celula hospedadora, por ejemplo, se ha transfectado o transformado de manera transitoria o estable en una celula hospedadora. En ciertas realizaciones, en las que un ADN exogeno con el que se ha transfectado o transformado la celula hospedadora codifica la "protema de interes", la secuencia de acido nucleico del ADN exogeno determina la secuencia de aminoacidos. Esta secuencia puede ser una secuencia que se produzca en la naturaleza o, como alternativa, puede ser una secuencia disenada por el hombre. En ciertas realizaciones, una "protema de interes" es una protema codificada por una molecula de acido nucleico que es exogena para la celula hospedadora. La expresion de dicha protema exogena de interes puede alterarse transfectando a una celula hospedadora con una molecula de acido nucleico exogena que puede, por ejemplo, contener una o mas secuencias reguladoras y/o codificar una protema que potencia la expresion de la protema de interes. En las realizaciones de la presente invencion, se produce un polipeptido de interes en el cultivo celular, por ejemplo, para su posterior purificacion.
El termino "glucoprotema", "protema glucosilada" y similares se refiere a protemas que tienen restos de azucar, por ejemplo, restos de oligosacaridos, unidos a sus cadenas laterales de asparagina (W-glucosilacion) o a sus cadenas laterales de serina y/o treonina (O-glucosilacion). Por ejemplo, un tipo comun de W-glucosilacion de protemas es la sialilacion de protemas (tambien conocida como sialilacion de W-glucanos). La mayona de las protemas secretoras y de membrana (por ejemplo, receptores de membrana) se glucosilan en el RE y/o el aparato de Golgi. Es conocido en la tecnica que la glucosilacion controla el plegamiento de las protemas y su liberacion en el RE. Ademas, en el Golgi se producen multiples etapas de glucosilacion/desglucosilacion. Los conocimientos actuales acerca de los procesos de glucosilacion de protemas tanto en el RE como en el Golgi se revisan en Helenius y col. (2001) Science 291:2364-69; Parodi (2000) Biochem. J. 348:1-13; y Parodi (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:69-93. Por lo tanto, en determinadas realizaciones de la presente invencion, el polipeptido de interes es una glucoprotema de interes y la glucoprotema de interes se produce en cultivo celular, por ejemplo, para su posterior purificacion. En una realizacion de la presente divulgacion, la glucoprotema de interes es un receptor y puede ser un receptor soluble.
Pueden usarse los procedimientos y las composiciones de la presente divulgacion para producir cualquier protema de interes incluyendo, pero sin limitacion, protemas que tienen propiedades farmaceuticas, de diagnostico, agncolas y/o cualquiera de una serie de propiedades diferentes que son utiles en aplicaciones comerciales, experimentales y/u otras. Ademas, una protema de interes puede ser un agente terapeutico proteico. A saber, un agente terapeutico proteico (o una protema terapeutica) es una protema que tiene un efecto biologico en una region del organismo sobre la que actua o en una region del organismo sobre la que actua de manera remota a traves de intermedios. En ciertas realizaciones, las protemas producidas usando procedimientos y/o composiciones de la presente invencion puede procesarse y/o modificarse, antes de su administracion a un sujeto en forma de una protema terapeutica.
La presente divulgacion puede usarse para cultivar celulas para la produccion ventajosa de cualquier protema terapeutica, tal como enzimas, receptores, fusiones de receptor, receptores solubles, fusiones de receptor soluble, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales), fragmentos de union a antfgeno de un anticuerpo, protemas de fusion de Fc, SMIP, citocinas, hormonas, factores reguladores, factores de crecimiento,
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factores de coagulacion o agentes de union a antigeno farmaceutica o comercialmente relevantes. La lista anterior de protemas es unicamente ilustrativa en cuanto a su naturaleza y no pretende ser una cita limitante. Una persona normalmente versada en la materia conocera otras protemas que pueden producirse de acuerdo con la presente divulgacion y seran capaces de usar los procedimientos desvelados en el presente documento para producir dichas protemas.
El termino "anticuerpo" incluye una protema que comprende al menos uno y tipicamente dos, dominios VH o porciones de los mismos y/o al menos uno y tipicamente dos, dominios VL o porciones de los mismos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un tetramero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, en el que las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina se interconectan mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro. Los anticuerpos o una porcion de los mismos pueden obtenerse de cualquier origen, incluyendo, pero sin limitacion, roedor, primate (por ejemplo, primate humano y no humano), camelido, tiburon asf como producidos de manera recombinante, por ejemplo, quimericos, humanizados y/o generados in vitro, por ejemplo, mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.
La divulgacion tambien abarca "fragmentos de union a anrtgeno de anticuerpos", que incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro a la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo unico de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; (vi) un dominio variable de camelido o camelizado, por ejemplo, un dominio VHH; (vii) un Fv monocatenario (scFv); (viii) un anticuerpo biespedfico; e (ix) uno o mas fragmentos de union a anrtgeno de una inmunoglobulina fusionado a una region Fc. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estan codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que permite fabricarlos como una protema monocatenaria en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); vease, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-26; Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). Se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios esten abarcados en la expresion "fragmento de union a anrtgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y se evalua la funcion de los fragmentos del mismo modo que los anticuerpos intactos.
La divulgacion tambien abarca anticuerpos de un solo dominio. Los anticuerpos de un solo dominio pueden incluir anticuerpos cuyas regiones determinantes de la complementariedad forman parte de un polipeptido de un solo dominio. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos naturalmente desprovistos de cadenas ligeras, anticuerpos de un solo dominio derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, anticuerpos disenados y armazones de un solo dominio distintos de los obtenidos de anticuerpos. Los anticuerpos de un solo dominio pueden cualquiera de la tecnica o cualquier anticuerpo de un solo dominio futuro. Los anticuerpos de un solo dominio pueden proceder de cualquier especie incluyendo, pero sin limitacion, raton, humano, camello, llama, cabra, conejo, vaca y tiburon. De acuerdo con un aspecto de la divulgacion, un anticuerpo de un solo dominio tal como se usa en el presente documento es un anticuerpo de un solo dominio de origen natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Dichos anticuerpos de un solo dominio se divulgan, por ejemplo, en el documento WO 9404678. Por motivos de claridad, este dominio variable procedente de un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de manera naturalmente de cadenas ligeras se conoce en el presente documento como un VHH o nanobody para distinguirlo de la VH convencional o las inmunoglobulinas de cuatro dominios. Dicha molecula VHH puede proceder de anticuerpos generados en especies de camelidos, por ejemplo, en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies aparte de los camelidos pueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos naturalmente de cadena ligera; dichos VHH se encuentran dentro del alcance de la divulgacion. Los anticuerpos de un solo dominio tambien incluyen IgNAR de tiburon; vease, por ejemplo, Dooley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:1846-1851 (2006).
Aparte de los anticuerpos "biespedficos" o "bifuncionales", se entiende que un anticuerpo tiene cada uno de sus sitios de union identicos. Un anticuerpo "biespedfico" o "bifuncional" es un Idbrido de anticuerpo artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespedficos pueden producirse mediante una diversidad de procedimientos que incluyen fusion de hibridomas o union de fragmentos Fab'. Veanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y col., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
En las realizaciones donde la protema es un anticuerpo o un fragmento del mismo, este puede incluir al menos una o dos cadenas pesadas de longitud completa y al menos una o dos cadenas ligeras. Como alternativa, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos pueden incluir unicamente un fragmento de union a anrtgeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario). El anticuerpo o el fragmento del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal o de una sola especificidad. El anticuerpo o el fragmento del mismo tambien puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimerico, con CDR injertadas o generado in vitro. En otras realizaciones mas, el anticuerpo tiene una region constante de cadena pesada seleccionada entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otra realizacion, el anticuerpo tiene una cadena ligera seleccionada entre, por ejemplo, kappa o lambda. En una realizacion, la region constante se encuentra alterada, por ejemplo, mutada, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o reducir uno o mas de: la union al receptor Fc, la glucosilacion del
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anticuerpo, el numero de restos de cistema, la funcion celular efectora o la funcion de complemento). ^picamente, el anticuerpo o el fragmento del mismo se une espedficamente a un antigeno predeterminado, por ejemplo, un antigeno asociado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno neurodegenerativo, metabolico, inflamatorio, autoinmunitario y/o maligno.
Las protemas descritas en el presente documento, opcionalmente, incluyen ademas un resto que potencia uno o mas de, por ejemplo, estabilidad, funcion celular efectora o fijacion a complemento. Por ejemplo, un anticuerpo o una protema de union a antfgeno puede incluir ademas un resto pegilado, albumina o una region constante de cande pesada y/o ligera.
Los anticuerpos se producen generalmente, por ejemplo, mediante tecnicas de hibridoma tradicionales (Kohler y col., Nature 256:495 499 (1975)), procedimientos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567) o tecnicas de presentacion en fagos usando bibliotecas de anticuerpos (Clackson y col., Nature 352:624 628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581 597 (1991)). Para varias otras tecnicas de produccion de anticuerpos, vease Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow y col., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Ademas, los anticuerpos pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Estos marcadores incluyen radioetiquetas (por ejemplo, 131I o 99Tc), etiquetas enzimaticas (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina) y otros restos qdmicos (por ejemplo, biotina).
Los farmacos "inmunofarmaceuticos modulares pequenos" (SMIP™) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA) son polipeptidos monocatenarios compuestos de un dominio de union para una estructura afm, tal como un antfgeno, un contrarreceptor o similares, un polipeptido de region bisagra que tiene uno o ningun resto de cistema y dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina (vease tambien
www.trubion.com). Los SMIP y sus usos y aplicaciones se desvelan en, por ejemplo, las Solicitudes Publicadas de Patente de los Estados Unidos n.° 2007/002159, 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 y 2005/0238646 y la familia de patentes relacionadas con las mismas, todas las cuales se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad.
www.trubion.com). Los SMIP y sus usos y aplicaciones se desvelan en, por ejemplo, las Solicitudes Publicadas de Patente de los Estados Unidos n.° 2007/002159, 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 y 2005/0238646 y la familia de patentes relacionadas con las mismas, todas las cuales se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad.
En una realizacion de la divulgacion, la protema de interes es un receptor soluble, por ejemplo, una protema de fusion de receptor soluble. Las protemas de membrana, por ejemplo, receptores, son normalmente protemas glucosiladas. Por lo tanto, los procedimientos de la presente invencion son particularmente beneficiosos para producir protemas de fusion de receptor soluble no agregadas, plegadas adecuadamente y glucosiladas.
Las protemas solubles, por ejemplo, receptores solubles, pueden producirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica. En una realizacion de la divulgacion, un receptor soluble comprende una region extracelular del receptor o un fragmento de la region extracelular del receptor. En otra realizacion de la divulgacion, un receptor soluble comprende dos polipeptidos. El primer polipeptido comprende un receptor de longitud completa; como alternativa, el primer polipeptido comprende menos de la longitud completa del receptor, por ejemplo, una porcion extracelular del receptor. En una realizacion de la divulgacion, el primer polipeptido es un receptor de citocinas de longitud completa; como alternativa, el primer polipeptido tiene menos de la longitud completa del receptor de citocinas, por ejemplo, una porcion extracelular del receptor de citocinas. Dicho receptor soluble tambien puede comprender un polipeptido adicional, por ejemplo, una secuencia de polipeptido de GST, Lex-A, MBP o una cadena de inmunoglobulina, incluyendo, por ejemplo, un fragmento Fc, una region constante de cadena pesada de los diversos isotipos, incluyendo: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE.
En una realizacion de la divulgacion, un segundo polipeptido es preferentemente soluble. En algunas realizaciones, el segundo polipeptido potencia la semivida, (por ejemplo, la semivida en suero o en circulacion) del polipeptido unido. En realizaciones preferidas, el segundo polipeptido incluye al menos una region de un polipeptido de inmunoglobulina. Se conocen en la tecnica polipeptidos de fusion de inmunoglobulina y se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.516.964; 5.225.538; 5.428.130; 5.514.582; 5.714.147; y 5.455.165. Se sabe que las protemas de fusion solubles son susceptibles a la agregacion durante la produccion y por lo tanto, los procedimientos de acuerdo con la divulgacion proporcionan un beneficio particular en relacion con cultivos celulares que producen protemas de este tipo.
En algunas realizaciones, el segundo polipeptido comprende un polipeptido de inmunoglobulina de longitud completa. Como alternativa, el segundo polipeptido comprende menos de la longitud completa del polipeptido de inmunoglobulina, por ejemplo, una cadena pesada, cadena ligera, Fab, Fab2, Fv o Fc. El segundo polinucleotido puede incluir la cadena pesada de un polipeptido de inmunoglobulina. El segundo polipeptido puede incluir la region Fc de un polipeptido de inmunoglobulina.
En una realizacion de la invencion, una protema de fusion de receptor soluble comprende un inhibidor de factor de necrosis tumoral. En ciertas realizaciones, los inhibidores de factor de necrosis tumoral, en forma de receptores alfa y beta de factor de necrosis tumoral (TNFR-1; documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo de 1991; y TNFR-2, documento EP 417.014, publicado el 20 de marzo de 1991, cada uno de los cuales se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad) se expresan de acuerdo con sistemas y procedimientos de la presente invencion (para una revision, vease Naismith y Sprang, J. Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96, incorporado al presente
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documento por referencia en su totalidad). De acuerdo con algunas realizaciones, un inhibidor de factor de necrosis tumoral comprende un receptor de TNF soluble. En ciertas realizaciones, los inhibidores de TNF de la presente invencion son formas solubles de TNFRI y TNFRII. En ciertas realizaciones, los inhibidores de TNF de la presente invencion son protemas de union a TNF solubles. En ciertas realizaciones, los inhibidores de TNF de la presente invencion son protemas de fusion de TNFR, por ejemplo, TNFR-Ig o TNFR-Fc. Tal como se usa en el presente documento, "etanercept", se refiere a un TNFR-Fc, que es un dfmero de dos moleculas de la porcion extracelular del receptor de TNF-alfa p75, consistiendo cada molecula en una porcion de Fc de 235 aminoacidos de IgG1 humana. De acuerdo con la invencion, las celulas que expresan TNFR-Fc se cultivan en un cultivo celular a una temperatura reducida y/o a un pH reducido para reducir la cantidad de protema mal plegada y/o de agregados de alto peso molecular durante la produccion de TNFR-Fc. En ciertas realizaciones, las celulas que expresan TNFR-Fc se cultivan en un cultivo celular a una temperatura reducida y/o a un pH reducido para modular la glucosilacion durante la produccion de TNFR-Fc.
En otra realizacion de la invencion, la protema de fusion de receptor soluble es el sIL-13R. Tal como se usa en el presente documento, el receptor soluble de IL-13 (sIL-13R) se refiere a una protema de fusion recombinante que incluye el dominio extracelular (ECD) del receptor de la interleucina (IL)-13-alfa2 humana y la region Fc de la cadena pesada de IgG1. sIL-13R esta compuesto de dos cadenas de polipeptido identicas (es decir, dfmero de dos cadenas de polipeptido) que parece estar unido mediante enlaces disulfuro intermoleculares. La protema de fusion de receptor sIL-13R soluble y sus usos se divulgan en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.710.023, incorporada al presente documento por referencia en su totalidad.
En algunas realizaciones, el segundo polipeptido tiene menos funcion efectora que la funcion efectora de una region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina de tipo silvestre. La funcion efectora de Fc incluye, por ejemplo, la union al receptor Fc, fijacion al complemento y actividad eliminadora de linfocitos T (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.136.310). Los procedimientos para evaluar la actividad eliminadora de linfocitos T, la funcion efectora de Fc y la estabilidad de los anticuerpos se conocen en la tecnica. En una realizacion, el segundo polipeptido tiene una afinidad baja o nula por el receptor de Fc. En una realizacion alternativa, el segundo polipeptido tiene una afinidad baja o nula por la protema de complemento C1q.
Las protemas de fusion, por ejemplo, protemas de fusion de receptor soluble, pueden incluir adicionalmente una secuencia enlazadora que une el receptor soluble o un fragmento del mismo al segundo resto. Por ejemplo, la protema de fusion puede incluir un enlazador peptfdico, por ejemplo, un enlazador peptfdico de aproximadamente 2 a 20, mas preferentemente de aproximadamente 5 a 10, aminoacidos de longitud.
En otras realizaciones, pueden anadirse secuencias de aminoacidos adicionales al extremo N o C-terminal de la protema de fusion para facilitar su expresion, deteccion y/o aislamiento o purificacion. Por ejemplo, la protema de fusion de receptor soluble puede unirse a uno o mas restos adicionales, por ejemplo, GST, etiqueta His6, etiqueta FLAG. Por ejemplo, la protema de fusion puede unirse adicionalmente a una protema de fusion de GST en la que las secuencias de la protema de fusion estan fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias de GST (es decir, glutation-s-transferasa). Dichas protemas de fusion pueden facilitar la solubilidad, es decir, aumentan el plegamiento preciso y por lo tanto, mejoran la purificacion de la protema de fusion.
Procedimientos de produccion de protemas en cultivo celular
Los terminos "cultivo" y "cultivo celular" se usan en el presente documento para referirse a una poblacion de celulas que se pone en contacto con un medio de cultivo celular en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento de la poblacion celular. Tal como se usa en el presente documento, estos terminos pueden referirse a la combinacion que comprende la poblacion celular (por ejemplo, el cultivo de celulas animales) y el medio con el que se pone en contacto la poblacion.
Las celulas usadas en la presente invencion pueden ser celulas hospedadoras recombinantes, por ejemplo, celulas hospedadoras eucariotas, es decir, celulas transfectadas con una construccion de expresion que contiene un acido nucleico que codifica un polipeptido de interes, incluyendo celulas animales. La expresion "celulas animales" abarca celulas de invertebrado, de vertebrado no marnffero (por ejemplo, de ave, reptil y anfibio) y de mairnfero. Los ejemplos no limitantes de celulas de invertebrado incluyen las siguientes celulas de insecto: Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (gusano de seda/polilla de la seda). En realizaciones preferidas, el cultivo celular es un cultivo de celulas de mai^ero.
Una serie de lmeas celulares de marnffero son celulas hospedadoras adecuadas para la expresion recombinante de polipeptidos de interes. Las lmeas celulares hospedadoras de mamffero incluyen, por ejemplo, COS, PER.C6, TM4, VERO076, MDCK, BRL-3A, W138, Hep G2, MMT, MRC 5, FS4, CHO, 293T, A431, 3T3, CV-1, C3H10T1/2, Colo205, 293, HeLa, celulas L, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, celulas Jurkat, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, mielomas murinos (por ejemplo, SP2/0 y NS0) y celulas C2C12, asf como lmeas celulares de primate transformadas, hibridomas, celulas diploides normales y cepas celulares procedentes del cultivo in vitro de tejido primario y de explantes primarios. Puede usarse cualquier celula eucariota que sea capaz de expresar el polipeptido de interes en los procedimientos divulgados. Hay disponibles numerosas lmeas celulares de fuentes comerciales, tales como la
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American Type Culture Collection (ATCC). En una realizacion de la invencion, el cultivo celular, por ejemplo, el cultivo celular a gran escala, emplea celulas CHO.
Aunque en determinadas realizaciones el cultivo celular comprende celulas de mairnfero, un experto en la materia comprendera que es posible producir de manera recombinante polipeptidos de interes en eucariotas inferiores, tales como levaduras o en procariotas, tales como bacterias. Un experto en la materia sabra que las condiciones de cultivo para los cultivos celulares de levaduras y bacterias diferiran de las condiciones de cultivo de celulas animales y comprenderan como han de ajustarse estas condiciones para optimizar el cultivo celular y/o la produccion de protema.
Las cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar el polipeptido de interes. La expresion en bacterias puede dar como resultado la formacion de cuerpos de inclusion que incorporan la protema recombinante. Por lo tanto, puede ser necesario el replegamiento de la protema recombinante para producir un material activo o mas activo. Se conocen en la tecnica varios procedimientos para obtener protemas heterologas plegadas de manera adecuada a partir de cuerpos de inclusion bacterianos. Estos procedimientos implican generalmente solubilizar la protema de los cuerpos de inclusion, despues, desnaturalizar la protema completamente usando un agente caotropico. Cuando hay presentes restos de cistema en la secuencia de aminoacidos primaria de la protema, normalmente es necesario llevar a cabo el replegamiento en un ambiente que permite la correcta formacion de enlaces disulfuro (un sistema redox). Se conocen en la tecnica procedimientos generales de replegamiento y se divulgan en, por ejemplo, Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95, el documento EP 0433225 y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.399.677.
Las cepas de levadura adecuadas para la produccion de polipeptidos incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, cepas de Kluyveromyces, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de expresar el polipeptido de interes.
El termino "biorreactor", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier vaso usado para el cultivo de un cultivo de celulas eucariotas, por ejemplo, un cultivo de celulas animales (por ejemplo, un cultivo de celulas de mai^ero). El biorreactor puede ser de cualquier tamano en tanto que sea util para el cultivo de celulas, por ejemplo, celulas de marnffero. Tfpicamente, el biorreactor sera de al menos 30 ml y puede ser de al menos de 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o mas o cualquier volumen intermedio. Las condiciones internas del biorreactor, incluyendo, pero sin limitacion, el pH y la temperatura, se controlan tfpicamente durante el periodo de cultivo. La expresion "biorreactor de produccion", tal como se usa en el presente documento, se refiere al biorreactor final usado en la produccion del polipeptido o la protema de interes. El volumen de un biorreactor de produccion de cultivo celular a gran escala es por lo general mayor de 100 ml, tfpicamente de al menos aproximadamente 10 litros y puede ser de 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o mas o de cualquier volumen intermedio. Un biorreactor o biorreactor de produccion adecuado puede estar compuesto de (es decir, hecho de) cualquier material que sea adecuado para contener cultivos celulares suspendidos en medio en las condiciones de cultivo de la presente invencion y favorezca el crecimiento y la viabilidad celular, incluyendo vidrio, plastico o metal; los materiales no deben interferir con la expresion o la estabilidad del producto producido, por ejemplo, un producto de protema terapeutica. Una persona normalmente versada en la materia sera consciente de, y sera capaz de seleccionar, biorreactores adecuados para su uso en la practica de la presente invencion.
Los terminos "medio", "medio de cultivo celular", y "medio de cultivo", tal como se usan en el presente documento, se refiere a una solucion que contiene nutrientes que alimentan a las celulas animales en crecimiento, por ejemplo, celulas de mamffero y tambien puede referirse a medio en combinacion con celulas. La expresion "medio de inoculacion" se refiere al medio que se usa para formar un cultivo celular. El medio de inoculacion puede diferir o no en la composicion del medio usado durante el resto de la fase de crecimiento celular. Tfpicamente, las soluciones de medio proporcionan, sin limitacion, aminoacidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energfa, lfpidos y oligoelementos que necesita la celula para un crecimiento al menos mmimo y/o su supervivencia. La solucion tambien puede contener componentes que potencian el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa normal, incluyendo hormonas y factores de crecimiento. La solucion se formula, preferentemente, con un pH y una concentracion de sal optima para la supervivencia y la proliferacion celular. En al menos una realizacion, el medio es un medio definido. Los medios definidos son medios en los que todos los componentes tienen una estructura qmmica conocida. En otras realizaciones de la invencion, el medio puede contener aminoacidos procedentes de cualquier fuente o procedimiento conocido en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, aminoacidos procedentes de adiciones de un solo aminoacido o de adiciones de peptona o de hidrolizado de protema (incluyendo fuentes animales o vegetales). En otras realizaciones mas de la invencion, el medio usado durante la fase de crecimiento celular puede contener medio concentrado, es decir, medio que contiene una concentracion mayor de nutrientes que la normalmente necesaria y proporcionada normalmente a un cultivo en crecimiento. Un experto en la materia reconocera que medio celular, medio de inoculacion, etc. es adecuado para cultivar una celula particular, por ejemplo, celulas animales (por ejemplo, celulas CHO) y la cantidad de glucosa y otros nutrientes (por ejemplo, glutamina, hierro, oligoelementos D) o agentes disenados para controlar otras variables de cultivo (por ejemplo, la cantidad de espumante, osmolalidad) que debe contener el medio (vease, por ejemplo, Mather, J.P., y col. (1999) "Culture media, animal cells, large scale production", Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2:777-85; Solicitud de Patente publicada de los Estados Unidos n.° 2006/0121568; incorporandose ambas al presente documento por referencia en su totalidad). La presente invencion
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tambien contempla variantes de dichos medios conocidos, incluyendo, por ejemplo, variantes enriquecidas en nutrientes de dichos medios. La expresion "densidad celular", tal como se usa en el presente documento, se refiere al numero de celulas presentes en un volumen dado de medio. La expresion "densidad celular viable", tal como se usa en el presente documento, se refiere al numero de celulas vivas presentes en un volumen de medio dado bajo un conjunto de condiciones experimentales determinado.
La expresion "viabilidad celular", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de las celulas en cultivo para sobrevivir bajo un conjunto dado de condiciones de cultivo o de variaciones experimentales. La expresion, tal como se usa en el presente documento, tambien se refiere a aquella porcion de celulas que se encuentran vivas en un momento concreto en relacion con el numero total de celulas, vivas y muertas, en el cultivo en ese momento.
Las expresiones "densidad celular viable integrada", "numero integrado de celulas viables" o "IVC", tal como se usa en el presente documento, se refieren a la densidad media de celulas viables a lo largo del cultivo multiplicado por la cantidad de tiempo que se ha llevado a cabo el cultivo. Cuando la cantidad de protema producida es proporcional al numero de celulas viables presentes durante el transcurso del cultivo, la densidad de celulas viables integrada es una herramienta util para estimar la cantidad de protema producida durante el transcurso del cultivo celular.
Los procedimientos de la presente invencion pueden aplicarse a celulas cultivadas en un cultivo discontinuo, un cultivo discontinuo alimentado, un cultivo en perfusion, un cultivo discontinuo alimentado modificado (vease la Solicitud Provisional de los Estados Unidos numero 60/954.922), cultivo discontinuo realimentado o cualquier combinacion de los mismos.
La expresion "cultivo discontinuo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que todos los componentes que se usaran en ultima instancia para cultivar las celulas, incluyendo el medio asf como las propias celulas, se proporcionan al inicio del proceso de cultivo. Normalmente, un cultivo discontinuo se interrumpe en un momento concreto y se recogen las celulas y/o los componentes en el medio y opcionalmente, se purifican.
La expresion "cultivo discontinuo alimentado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que se proporcionan componentes adicionales al cultivo en un momento determinado posterior al inicio del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados comprenden tfpicamente suplementos nutricionales para las celulas que se han agotado durante el proceso de cultivo. Normalmente, un cultivo discontinuo alimentado se interrumpe en un momento concreto y se recogen las celulas y/o los componentes en el medio y opcionalmente, se purifican.
La expresion "cultivo en perfusion", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que se proporciona medio fresco adicional, ya sea de manera continua durante un periodo de tiempo concreto o de manera intermitente durante un periodo de tiempo concreto, al cultivo (posterior al comienzo del proceso de cultivo) y simultaneamente, se retira el medio gastado. El medio fresco normalmente proporciona suplementos nutricionales para las celulas que se han agotado durante el proceso de cultivo. El producto polipeptfdico, que puede estar presente en el medio gastado, se purifica opcionalmente. La perfusion tambien permite la eliminacion de productos de desecho celular (aclarado) del cultivo celular que crece en el biorreactor.
La expresion "cultivo discontinuo alimentado modificado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento para cultivar celulas que combina tanto el procedimiento de cultivo discontinuo alimentado como el procedimiento de cultivo de perfusion. El procedimiento de cultivo discontinuo alimentado se describe en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos numero 60/954.922, incorporada al presente documento por referencia en su totalidad.
La invencion tambien puede ponerse en practica con procedimientos de realimentacion discontinuos. Se cree que el pH reducido proporcionara un mejor manejo para reducir el mal plegamiento y/o la agregacion de protemas y para modificar la glucosilacion en este tipo de cultivo celular.
En una realizacion de la presente invencion, el procedimiento comprende inocular, en primer lugar, el cultivo celular con el medio de inoculacion durante la fase de crecimiento del cultivo celular y posteriormente, cambiar las celulas a la fase de produccion, en el que se ajusta la temperatura y/o el pH del cultivo celular a una temperatura reducida y/o a un pH reducido. La fase de crecimiento, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una etapa en el cultivo celular en la que las celulas se cultivan para lograr la densidad celular optima para la produccion de protemas.
En otra realizacion, despues de la fase de crecimiento, puede cambiarse a las celulas a la fase de produccion, que puede producirse a una temperatura diferentes y/o a un pH diferente a la fase de crecimiento, por ejemplo, a temperatura reducida y/o a pH reducido. En realizaciones, el cultivo celular puede cambiarse de la fase de crecimiento a la fase de produccion un dfa despues de la inoculacion. En otras realizaciones, el cultivo celular puede cambiarse de la fase de crecimiento a la fase de produccion cinco dfas despues de la inoculacion. Cuando se cambia el cultivo celular de la fase de crecimiento a la fase de produccion, el cambio puede ser relativamente gradual. Como alternativa, el cambio puede ser abrupto. Con un cambio gradual, pueden ajustarse la temperatura
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y/o el pH escalonadamente, por ejemplo, reducirse. Como alternativa, pueden ajustarse la temperatura y/o el pH mediante intervalos discretos.
La fase de produccion del cultivo celular es una etapa en el cultivo celular en el que las celulas se cultivan en condiciones optimas para producir el polipeptido de interes, por ejemplo, una protema terapeutica. Durante la fase de produccion, la temperatura y/o el pH reducido del cultivo celular pueden seleccionarse basandose en la temperatura y/o el pH al cual el cultivo celular permanece viable, al cual se produce un alto nivel de protema, al cual la produccion y la acumulacion de productos de desecho metabolicos, por ejemplo, acido lactico y amoniaco, se minimizan, al cual la calidad del producto de la protema se ha controlado de manera adecuada y/o cualquier combinacion de estos u otros factores considerados como importantes por el experto en la materia.
En una realizacion alternativa de la invencion, el procedimiento de la invencion comprende inocular el cultivo celular a una temperatura reducida y/o a un pH reducido, de tal forma que no es necesario un cambio de temperatura o pH al comienzo de la fase de produccion. Un experto en la materia sabra controlar la temperatura y el pH del cultivo celular de tal forma que la temperatura y el pH no se desvfen respecto de los puntos ajustados de temperatura y pH establecidos. Por ejemplo, un experto en la materia sabra usar una base, por ejemplo, base de carbonato de sodio, para impedir que los cultivos se desvfen por debajo del pH establecido.
En los ejemplos mas adelante en el presente documento, el medio de cultivo celular comenzo a un pH por encima del punto establecido de pH diana y no se produjo un ajuste deliberado del punto establecido de pH. Sin embargo, tambien podna incluirse el uso de un ajuste de pH durante el transcurso del cultivo celular, tal como comprenderan los expertos en la materia. De forma analoga, tambien es posible iniciar el cultivo a baja temperatura sin ajuste. Por ejemplo, el proceso puede comprender unicamente una fase de produccion.
"Temperatura reducida", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una temperatura por debajo de la temperatura convencional para el cultivo celular (la temperatura a la que normalmente se cultivan las celulas) para ese tipo de celula. Por ejemplo, en realizaciones de la presente divulgacion, donde las celulas son celulas de mairnfero, el cultivo celular en la fase de produccion se encuentra preferentemente dentro del intervalo de 24,0°C a menos de 30,0°C y mas preferentemente, en un intervalo de 27,0°C a menos de 30,0°C. Por ejemplo, la temperatura reducida del cultivo celular es de 24,0°C, 24,5°C, 25,0°C, 25,5°C, 26,0°C, 26,5°C, 27,0°C, 27,5°C, 28,0°C, 28,5°C, 29,0°C, 29,5°C, 29,6°C, 29,7°C, 29,8°C y 29,9°C. En la realizacion mas preferida de la invencion descrita en el presente documento, la temperatura reducida del cultivo celular es una temperatura de aproximadamente 29,5°C. La temperatura reducida para celulas distintas de las de mamffero puede determinarse individualmente para cada caso por una persona normalmente versada en la materia.
"pH reducido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un punto establecido de pH por debajo del pH convencional para el cultivo celular (el pH al que normalmente se cultivan las celulas) de ese tipo de celula concreto. En realizaciones de la presente divulgacion, donde las celulas son celulas de mamffero, el pH del cultivo celular en la fase de produccion es inferior a 7,00. En realizaciones de la divulgacion, el pH reducido del cultivo celular se encuentra en un intervalo de 6,50 a menos de 7,00, preferentemente, en un intervalo de 6,80 a menos de 7,00. Por ejemplo, el pH reducido del cultivo celular es de 6,80, 6,85, 6,90, 6,95, 6,96, 6,97, 6,98 y 6,99. En la realizacion mas preferida de la invencion, el pH reducido del cultivo celular es de aproximadamente 6,95. El pH reducido para celulas distintas de las de mamffero puede determinarse individualmente para cada caso por una persona normalmente versada en la materia.
Un experto en la materia entendera que, dependiendo del tipo celular del cultivo celular, diferiran la temperatura y el pH convencionales (a diferencia de la temperatura y el pH reducido). Por ejemplo, la temperatura y el pH convencionales para la mayona de celulas de mamffero, por ejemplo, celulas CHO, es superior a 30,0° (tal como, por ejemplo, 37,0°C) y por encima de 7,00 (tal como, por ejemplo, 7,20), respectivamente. Un experto en la materia tambien entendera que debido a que la temperatura y el pH convencionales para otros tipos celulares, por ejemplo, celulas de insecto, pueden diferir respecto de la temperatura convencional para celulas de mamffero, los procedimientos de la invencion utilizaran una temperatura reducida diferente y un pH reducido diferente para dichas celulas.
En determinadas realizaciones de la presente invencion, el experto en la materia considerara beneficioso o necesario controlar periodicamente las condiciones particulares del cultivo celular en crecimiento. A modo de ejemplos no limitantes, puede ser necesario o beneficioso controlar, por ejemplo, la temperatura, el pH, el oxfgeno disuelto, la densidad celular, la viabilidad celular, la densidad celular viable integrada, los niveles de lactato, los niveles de amonio, los niveles de glucosa, los niveles de glutamina, la osmolalidad, el tttulo del polipeptido expresado, etc. Los expertos en la materia conocen numerosas tecnicas para medir dichas condiciones/criterios. Por ejemplo, la densidad celular puede medirse usando un hemocitometro, un dispositivo de recuento de celulas automatizado (por ejemplo, un contador Coulter, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) o el examen de la densidad celular (por ejemplo, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA). La densidad de celulas viables puede determinarse tinendo una muestra de cultivo con azul de tripano. Los niveles de lactato, amonio, glucosa y glutamina, asf como el oxfgeno disuelto y el pH pueden medirse, por ejemplo, con el analizador de qmmica BioProfile 400 (Nova Biochemical, Waltham, MA), que toma mediciones de nutrientes clave, metabolitos y gases en el medio de cultivo celular. El oxfgeno disuelto y el pH tambien pueden medirse usando, por ejemplo, un analizador de gases en sangre (por
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ejemplo, un analizador de pH/gases en sangre Rapidlab 248 de Bayer (Bayer Healthcare LLC, East Walpole, MA)). La temperatura, el pH y el oxfgeno disuelto tambien pueden medirse mediante, por ejemplo, diversos tipos de sondas in situ. La osmolalidad del cultivo celular puede medirse mediante, por ejemplo, un osmometro de punto de congelacion. Puede usarse HPLC para determinar, por ejemplo, los niveles de lactato, amonio o del polipeptido o protema expresado. En una realizacion de la invencion, pueden determinarse los niveles de polipeptido expresado usando, por ejemplo, HPLC de protema A. Como alternativa, puede determinarse el nivel de polipeptido o protema expresado mediante tecnicas convencionales, tales como tincion de Coomassie de geles de SDS-PAGE, transferencia de Western, ensayos Bradford, ensayos Lowry, ensayos biuret y absorbancia de UV. Puede ser necesario monitorizar las modificaciones postraduccionales del polipeptido o la protema expresado, por ejemplo, glucosilacion. Tambien puede ser beneficioso monitorizar otras modificaciones postraduccionales de la protema, por ejemplo, la fosforilacion, etc. Para monitorizar determinadas condiciones de cultivo, puede ser necesario retirar pequenas aftcuotas del cultivo para su analisis. Una persona normalmente versada en la materia entendera que dicha retirada puede potencialmente introducir contaminacion en el cultivo celular y tomara las precauciones adecuadas para minimizar el riesgo de dicha contaminacion.
En una realizacion de la invencion, un experto en la materia monitorizara el numero integrado de celulas viables a la temperatura reducida de cultivo celular y/o al pH reducido. Preferentemente, el cultivo de celulas a temperatura reducida y/o a pH reducido reduce la densidad integrada de celulas viables en un 20%, mas preferentemente menos de un 20% (por ejemplo, un 15%). En otra realizacion de la invencion, un experto en la materia monitorizara la viabilidad celular a la temperatura reducida de cultivo celular y/o al pH reducido. Preferentemente, el cultivo de celulas a temperatura reducida y/o a pH reducido reduce la viabilidad celular menos de un 15%, mas preferentemente menos de un 5%.
La glucosa es la principal fuente de energfa para el cultivo celular. Una desviacion significativa en el consumo de glucosa en el cultivo celular podna indicar un efecto negativo de las condiciones de cultivo celular sobre la salud del cultivo celular. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el cultivo de celulas a la temperatura reducida y/o al pH reducido da como resultado un cambio mmimo, por ejemplo, reduccion, en el consumo de glucosa del cultivo celular.
La glutamina es una fuente de energfa alternativa para el cultivo celular y es una fuente importante de nitrogeno para diversas moleculas, por ejemplo, aminoacidos, en el cultivo celular. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el cultivo de celulas a la temperatura reducida y/o al pH reducido da como resultado un cambio mmimo, por ejemplo, reduccion, en el consumo de glutamina del cultivo celular.
En otra realizacion de la invencion, un experto monitorizara la produccion de productos de desecho, por ejemplo, la produccion de lactato y amoniaco, en el cultivo celular. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el cultivo de celulas a la temperatura y/o al pH reducidos da como resultado un cambio mmimo, por ejemplo, aumento, en la produccion de lactato y amoniaco. En algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de celulas a una temperatura y/o un pH reducidos puede minimizar la produccion de lactato y amoniaco.
Ademas, en una realizacion preferida de la presente invencion, el cultivo de celulas a una temperatura y/o un pH reducidos da como resultado una reduccion en la productividad media acumulativa y en el tftulo del producto. El termino "tftulo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad total del polipeptido de interes, por ejemplo, una glucoprotema de interes, producida por un cultivo celular (por ejemplo, un cultivo de celulas animales), dividida entre una cantidad dada de volumen de medio; por lo tanto, "tftulo" se refiere a una concentracion. El tftulo se expresa tfpicamente en unidades de miligramos de polipeptido por litro de medio. Preferentemente, cualquier reduccion en la productividad celular y en el tftulo del producto experimentados en el cultivo celular se ve compensada por la reduccion en la produccion de producto proteico agregado o mal plegado, por ejemplo, una produccion reducida de HMWA.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "protema agregada" se refiere a los agrupamientos de protema, es decir, agregados de elevado peso molecular, que producen un producto proteico no funcional, suboptimo o no deseado. La expresion "protema mal plegada" se refiere a una protema plegada de un modo inadecuado, normalmente, una protema que ya no puede mostrar una actividad biologica normal, por ejemplo, una actividad enzimatica normal. Un experto en la materia sabra que los agregados de protema pueden comprender protemas tanto correctamente plegadas como mal plegadas. Las protemas agregadas o mal plegadas se forman normalmente en cultivo celular de sobreexpresion, por ejemplo, un cultivo celular que sobreexpresa una protema de interes, por ejemplo, una glucoprotema de interes. Por ejemplo, la agregacion puede estar causada por interacciones hidrofobas no espedficas de cadenas polipepftdicas no plegadas o mediante la interaccion con intermedios de plegamiento. En una realizacion de la invencion, el cultivo de celulas a la temperatura reducida y/o al pH reducido da como resultado una reduccion de al menos el 50% en el mal plegamiento/la agregacion de la protema, preferentemente, una reduccion de aproximadamente el 60% en el mal plegamiento/la agregacion de protema. Un experto en la materia conocera las tecnicas necesarias para monitorizar la agregacion/el mal plegamiento de la protema, por ejemplo, HPLC de interaccion hidrofoba (HIC-HPLC).
La expresion "agregado de alto peso molecular" (HMWA) se refiere a un subproducto no deseado de la produccion de protema que es el resultado de la asociacion entre al menos dos protemas. Un "agregado de alto peso molecular"
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puede ser una asociacion entre al menos dos de las mismas protemas y/o la asociacion entre la protema de interes y otras protemas halladas en el cultivo celular, por ejemplo, protemas de la celula hospedadora. La asociacion puede surgir mediante cualquier procedimiento, incluyendo, pero sin limitacion, reticulacion covalente, no covalente, por disulfuro y/o no reducible. Un experto en la materia comprendera que cuando una protema se encuentra activa en una forma multimerica (por ejemplo, una forma de dfmero), es decir, cuando se necesita mas de una cadena de polipeptido para la actividad de la protema, la expresion "agregados de alto peso molecular" se referira a una asociacion entre dos o mas de dichas formas multimericas. En una realizacion de la invencion, una protema que esta activa en una forma multimerica es un receptor, por ejemplo, un receptor de citocinas (por ejemplo, sIL-13R). En una realizacion, el cultivo de celulas a una temperatura y/o un pH reducidos da como resultado una reduccion de aproximadamente un 10%, preferentemente una reduccion de aproximadamente un 40%, mas preferentemente, una reduccion de aproximadamente un 50% y aun mas preferentemente una reduccion de aproximadamente un 80% o mas en los agregados de alto peso molecular o cualquier valor intermedio. Un experto en la materia conocera las tecnicas necesarias para monitorizar la produccion de agregados de alto peso molecular, por ejemplo, cromatograffa ftquida de alto rendimiento de exclusion por tamanos (SEC-HPLC).
En otro aspecto de la divulgacion, la temperatura y/o el pH en un cultivo celular se usan para cambiar la glucosilacion de protemas, por ejemplo, la sialilacion de protemas, a un nivel predeterminado. Por ejemplo, la reduccion del pH y/o la temperatura del cultivo celular puede dar lugar a la reduccion en la glucosilacion tanto unida a N como a O, por ejemplo, una reduccion en la sialilacion de N-glucano. El cambio en la glucosilacion de protemas (por ejemplo, sialilacion) puede afectar a la estabilidad, la actividad enzimatica, el tiempo de vida en circulacion y la inmunogenicidad de la protema terapeutica. Un experto en la materia puede controlar el grado de glucosilacion (por ejemplo, sialilacion) para asegurar que el cambio de la temperatura y/o el pH logra un tipo y nivel deseado de glucosilacion de las protemas. Pueden usarse tecnicas cromatograficas, por ejemplo, cromatograffa en fase normal (NPC) para monitorizar la glucosilacion de protema del producto proteico.
Al final de la fase de produccion, se cosechan las celulas y se recoge y purifica el polipeptido de interes. Preferentemente, al final de la fase de produccion, el polipeptido de interes muestra un mal plegamiento y/o una agregacion reducidos, a la vez que se conserva un patron de glucosilacion aceptable. En una realizacion de la invencion, el polipeptido de interes al final del proceso de produccion se encuentra en una forma soluble (por ejemplo, el polipeptido de interes es un receptor soluble, por ejemplo, un receptor soluble de citocinas). Dichas formas solubles del polipeptido pueden purificarse a partir de un medio condicionado.
Las formas unidas a membrana del polipeptido pueden purificarse preparando una fraccion total de membrana de las celulas expresoras y extrayendo las membranas con un detergente no ionico, tal como TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, CA). Las protemas citosolicas o nucleares pueden prepararse lisando las celulas hospedadoras (mediante fuerza mecanica, Parrbomb, sonicacion, detergente, etc.), retirando la fraccion de membrana celular por centrifugacion y reteniendo el sobrenadante.
El polipeptido puede purificarse usando otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede concentrarse un polipeptido producido mediante los procedimientos divulgados usando un filtro para la concentracion de protemas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion AMICON® o PELLICON® (Millipore, Billerica, MA). Despues de la etapa de concentracion, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificacion, tal como un medio de filtracion en gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio anionico (por ejemplo, una columna MonoQ, Amersham Biosciences, Piscataway, NH); dicha resina contiene una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) o polietilenimina (PEI) colgantes. Las matrices usadas para la purificacion pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comunmente en la purificacion de protemas. Como alternativa, puede usarse una etapa de intercambio cationico para la purificacion de protemas. Los intercambiadores cationicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo (por ejemplo, columnas S-SEPHAROSE®, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
La purificacion del polipeptido del sobrenadante de cultivo tambien puede incluir una o mas etapas en columna sobre resinas de afinidad, tales como concanavalina A-agarosa, AF-HEPARIN650, heparina-TOYOPEARL® o azul Cibacron 3GA SEPHAROSE® (Tosoh Biosciences, San Francisco, CA); columnas de cromatograffa de interaccion hidrofoba usando resinas tales como eter de fenilo, eter de butilo o eter de propilo; o columnas de inmunoafinidad usando anticuerpos para la protema marcada. Finalmente, pueden usarse una o mas etapas HPLC que emplean medio HPLC hidrofobo, por ejemplo, gel de sflice que tiene grupos metilo u otros grupos alifaticos colgantes (por ejemplo, columnas de Ni-NTA), para purificar adicionalmente la protema. Como alternativa, los polipeptidos pueden expresarse de manera recombinante en una forma que facilita su purificacion. Por ejemplo, los polipeptidos pueden expresarse en forma de una fusion con protemas, tales como protema de union a maltosa (MBP), glutation-S- transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX); se encuentran comercialmente disponibles kits para la expresion y purificacion de dichas protemas de fusion de New England BioLabs (Beverly, Ma), Pharmacia (Piscataway, NJ) e Invitrogen (Carlsbad, CA), respectivamente. Las protemas tambien pueden etiquetarse con un epftopo pequeno (por ejemplo, etiquetas His, myc o Flag) y posteriormente identificarse o purificarse usando un anticuerpo espedfico para el epftopo seleccionado. Hay disponibles de numerosas fuentes comerciales anticuerpos para epftopos comunes. Pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificacion anteriores en diversas combinaciones o con otros procedimientos conocidos, para purificar un polipeptido de interes, por ejemplo, una protema terapeutica, producida
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mediante los procedimientos de la presente invencion.
Composiciones farmaceuticas
En determinadas realizaciones de la invencion, las protemas producidas de acuerdo con uno o mas procedimientos de la presente invencion pueden ser utiles en la preparacion de agentes farmaceuticos. Las protemas producidas de acuerdo con uno o mas procedimientos de la presente invencion pueden administrate a un sujeto o pueden formularse en primer lugar para su suministro por cualquier ruta disponible, incluyendo, pero sin limitacion, por ejemplo, la ruta parenteral (por ejemplo, intravenosa), intradermica, subcutanea, oral, nasal, bronquial, oftalmica, transdermica (topica), transmucosa, rectal y vaginal. Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen tfpicamente una protema purificada expresada por una lmea celular de mairnfero, un agente de suministro (por ejemplo, un polfmero cationico, transportador molecular peptfdico, tensioactivo, etc., como se ha descrito anteriormente) en combinacion con un vehroulo farmaceuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "vehroulo farmaceuticamente aceptable" incluye materiales no toxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biologica de los principios activos, por ejemplo, disolventes, medio de dispersion, recubrimiento, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Las caractensticas del transportador dependeran de la via de administracion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos complementarios a las composiciones.
Una composicion farmaceutica se formula para que sea compatible con la via de administracion prevista. Cuando se administra la protema terapeutica producida de acuerdo con uno o mas procedimientos de la presente invencion en una forma oral, la composicion farmaceutica se encontrara en forma de comprimido, capsula, polvo, solucion o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composicion farmaceutica de la invencion puede contener ademas un vehroulo solido, tal como una gelatina o un adyuvante. El comprimido, la capsula y el polvo contendran de aproximadamente un 5 a un 95% de agente de union y preferentemente, de aproximadamente un 25 a un 90% de agente de union. Cuando se administra en forma lfquida, puede anadirse un vehroulo lfquido, tal como agua, petroleo, aceites de origen animal o vegetal, tales como aceite de sesamo, aceite de cacahuete (teniendo en cuenta la aparicion de reacciones alergicas en la poblacion), aceite mineral, aceite de soja, aceite de sesamo o aceites sinteticos. La forma lfquida de la composicion farmaceutica puede contener ademas solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de sacaridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma lfquida, la composicion farmaceutica contiene de aproximadamente un 0,5 a un 90% en peso del agente de union y preferentemente, de aproximadamente un 1 a un 50% en peso del agente de union.
Cuando se administra la protema terapeutica producida de acuerdo con uno o mas procedimientos de la presente invencion mediante inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea, la protema terapeutica se encontrara en forma de una solucion acuosa despirogenada, parenteralmente aceptable. La preparacion de dichas soluciones de protema parenteralmente aceptables, en lo referente al pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, se encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Una composicion farmaceutica preferida para inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea debe contener, ademas de la protema terapeutica, un vehroulo isotonico, tal como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de dextrosa, inyeccion de dextrosa y cloruro de sodio, inyeccion de Ringer lactada u otros vehroulos que se conocen en la materia. La composicion farmaceutica de la presente invencion tambien puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otro aditivo conocido por los expertos en la materia.
La formulacion adicional de las composiciones farmaceuticas que comprenden las protemas terapeuticas producidas mediante uno o mas procedimientos de la presente invencion sera conocida por los expertos en la materia. Una persona normalmente versada en la materia sera consciente de las formulaciones en dosis unitaria adecuadas para protemas producidas de acuerdo con la presente invencion.
Los contenidos mtegros de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente citadas a lo largo de la presente solicitud se incorporan al presente documento por referencia.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se exponen para ayudar a comprender la invencion pero no pretenden ser y no deben interpretarse de modo alguno como, limitantes del alcance de la invencion. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de procedimientos convencionales, por ejemplo, clonacion, transfeccion y aspectos basicos de procedimientos para sobreexpresar protemas en lmeas celulares. Dichos procedimientos son de sobra conocidos por los expertos en la materia.
Ejemplo 1
Produccion de protema TNFR-Fc
Ejemplo 1.1: Efectos de la temperatura reducida en el rendimiento de cultivo celular de celulas CHO recombinantes y sobre la cantidad de producto de protema de fusion de TNFR-Fc
Ejemplo 1.1.1: Materiales y procedimientos
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Se inocularon celulas de ovario de hamster chino (CHO) que sobreexpresaban la glucoprotema recombinante TNFR- Fc a concentraciones y en condiciones identicas en cuatro biorreactores de laboratorio separados a 37,0°C. Las celulas se cultivaron en un cultivo discontinuo alimentado durante un d^a, seguido de un cambio de temperatura a 30,0°C, 29,0°C, 28,0°C o 27,0°C. El ftmite inferior de punto de pH establecido del cultivo fue de 7,00. Se retiro una muestra de celulas del cultivo cada dfa para medir diversas condiciones del cultivo celular, por ejemplo, numeros integrados de celulas viables, viabilidades celulares, perfil de glucosa residual, perfil de glutamina residual, concentraciones de lactato y amoniaco, productividad celular media acumulativa (Qp), tftulo de producto, niveles de producto mal plegado/agregado, niveles de agregados de elevado peso molecular, niveles de sialilacion y pH.
Los numeros integrados de celulas viables (IVC) se calcularon midiendo la densidad celular usando examen de la densidad celular (por ejemplo, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA) y se normalizaron al IVC medio del dfa de recogida. El IVC medio del dfa de recogida se determino calculando la media aritmetica de la densidad integrada de celulas viables del dfa de recogida (por ejemplo, el dfa 10) para todas las condiciones experimentales ensayadas. Despues, se escalaron todos los valores de IVC individuales al IVC medio en la recogida para generar valores normalizados.
Las viabilidades celulares se midieron tinendo con azul de tripano usando examen de la densidad celular (por ejemplo, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA). Ademas, se midieron el perfil de glucosa residual y el perfil de glutamina residual en el cultivo celular usando el analizador de qmmica BioProfile (Nova Biochemical, Waltham, MA). Las concentraciones de los productos de desecho, lactato y amoniaco, se midieron usando el analizador de qmmica BioProfile (Nova Biochemical, Waltham, MA).
La productividad celular media acumulativa (Qp) y el tftulo de producto se midieron usando HPLC de protema A y se normalizaron a la Qp media acumulativa y al tftulo medio del dfa de la recogida. El tftulo medio del dfa de la recogida se determino calculando la media aritmetica del tftulo del dfa de la recogida (por ejemplo, dfa 10) para todas las condiciones experimentales ensayadas. Despues, se escalaron todos los valores del tftulo individuales al tftulo medio en el dfa de la recogida para generar valores normalizados. La Qp media acumulativa en el dfa de la recogida se determino calculando la media aritmetica de la Qp media acumulativa del dfa de la recogida para todas las condiciones experimentales ensayadas. Despues, se escalaron todos los valores individuales al tftulo medio en el dfa de la recogida para generar valores normalizados.
Los niveles de producto mal plegado/agregado se midieron usando HIC-HPLC y los niveles de agregados de elevado peso molecular se midieron usando SEC-HPLC. Se midieron los niveles de sialilacion de glucano total y unida a N sometiendo a glucoformas de protema marcadas con 2-aminobenzamida (2-AB) a cromatograffa en fase normal (NPC). La cantidad de sialilacion normal (unida a N y O) se definio como el porcentaje en relacion a la cantidad de sialilacion total del material de referencia, es decir, una aftcuota de TNFR-Fc con un patron de sialilacion conocido y preferible. El pH del cultivo celular se determino mediante una medicion off-line mediante un analizador de gases en sangre (analizador de pH/gases en sangre Rapidlab 248 de Bayer (Bayer Healthcare LLC, East Walpole, MA)).
Ejemplo 1.1.2: Resultados
El cultivo de celulas a una temperatura reducida tuvo efectos mmimos en el numero de IVC. Espedficamente, las menores temperaturas operativas dieron como resultado un numero de IVC final menor; sin embargo, el efecto de reducir la temperatura de cultivo celular a 27°C fue menor, se observo una reduccion de solo el 20% en el numero de IVC (FIG. 1A). Las viabilidades celulares no se vieron afectadas en gran medida mediante la reduccion de la temperatura; la condicion de temperatura minima (es decir, 27°C) proporciono una viabilidad en el dfa de la recogida un 5% menor (FIG. 1B).
Ademas, las temperaturas operativas reducidas dieron como resultado un perfil de glucosa residual mayor, que indico un menor consumo de glucosa del cultivo celular (FIG. 2A); sin embargo, los perfiles de glutamina no se alteraron significativamente mediante las temperaturas reducidas (FIG. 2B).
En algunos casos, mas tarde en el cultivo celular, tambien pueden consumirse el acido lactico y el amoniaco por el cultivo celular. El cese de la produccion de acido lactico y amoniaco o el consumo de acido lactico y amoniaco promueven la viabilidad celular, la productividad celular y pueden tener el efecto de aumentar el tftulo de producto polipeptfdico. El cultivo de celulas a la temperatura reducida tuvo el efecto de alterar el consumo neto de lactato en la segunda mitad del cultivo discontinuo alimentado (FIG. 3A). Las temperaturas reducidas tambien dieron como resultado una mayor produccion de amoniaco (FIG. 3B). Las temperaturas reducidas dieron como resultado menores productividades espedficas de celulas (Qp menor) (FIG. 4A) y un menor tftulo de producto (FIG. 4B). El menor tftulo de producto es el resultado de una menor productividad celular espedfica y de un menor numero integrado de celulas viables. Sin embargo, el tftulo de producto y la productividad celular reducidos se vieron compensados por una proporcion significativamente reducida de producto mal plegado y agregado (FIG. 5A). Ademas, la reduccion de la temperatura del cultivo celular redujo significativamente la proporcion de los agregados de elevado peso molecular en el cultivo celular (FIG. 5B). Por lo tanto, la reduccion de la temperatura dio como resultado un producto de protema TNFR-Fc mejorado.
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Esta reduccion de la temperatura se correlaciono con una reduccion en la sialilacion total de producto (sialilacion unida tanto a N como a O) (FIG. 6A). De hecho, hubo una relacion directa entre reducir la temperatura de cultivo celular y reducir la proporcion de glucanos unidos a N sialilados (FIG. 6B), lo que indica que la temperatura de produccion ha de seleccionarse para equilibrar el efecto beneficioso de reducir los HMWA y el mal plegamiento de protemas y el efecto desfavorable de reducir la glucosilacion. Por ejemplo, el cultivo de celulas a una temperatura reducida de 29,5°C redujo significativamente la concentracion de TNFR-Fc tanto mal plegado como agregado, a la vez que tuvo efectos mmimos en la glucosilacion de TNFR-Fc.
Las diferencias en el consumo neto de lactato entre los cultivos celulares cultivados a diferentes temperaturas dieron lugar a una diferencia en el pH del cultivo celular en el momento de la recogida (FIG. 7). Esto se debe al hecho de que un mayor consumo neto de lactato (acido lactico) ocasiono un mayor aumento en el pH de cultivo ya que el acido se estaba retirando del ambiente.
Ejemplo 1.2: Efectos del pH reducido en el rendimiento de cultivo celular de celulas CHO recombinantes y sobre la cantidad de producto de protema de fusion de TNFR-Fc
Ejemplo 1.2.1: Materiales y procedimientos.
Se inocularon celulas CHO que sobreexpresaban la glucoprotema recombinante TNFR-Fc a concentraciones identicas a 37,0°C y a un punto establecido de pH de 7,20, 7,10, 7,00, 6,90 o 6,80. Se utilizo la adicion de base de carbonato de sodio para impedir que los cultivos se desviasen por debajo del punto establecido de pH. No se utilizo control de pH por encima del punto de pH establecido. Se cambio la temperatura de los biorreactores a 30,0°C en el dfa 1 (dfa uno despues de la inoculacion, es decir, un dfa despues del comienzo del experimento). Como se describe en el ejemplo 1.1.1, se midieron diversas condiciones del cultivo celular.
Ejemplo 1.2.2: Resultados
El cultivo de celulas a puntos de pH establecidos desviados en 0,2 unidades de pH del pH 7,00 ocasiono un IVC ligeramente reducido; espedficamente, el cultivo de celulas a un pH de 6,80 dio lugar a una reduccion de aproximadamente el 15% en el IVC en comparacion con celulas cultivadas a un pH de 7,00 (FIG. 8A). Ademas, el cultivo de celulas a un pH de 7,20 dio lugar a una menor viabilidad celular (FIG. 8B).
Ademas, los menores puntos de pH establecidos operativos dieron como resultado un menor consumo de glucosa (FIG. 9A). Los perfiles de glutamina no se vieron alterados de manera significativa al cultivar celulas a puntos de pH establecidos de 6,80 a 7,10 (FIG. 9B).
No es sorprendente que, unos mayores puntos de pH establecidos operativos ocasionaron una mayor produccion de lactato (FIG. 10A). A un punto establecido de pH de 6,80, no se produjo consumo neto de lactato en la segunda mitad del cultivo discontinuo alimentado. Los menores puntos de pH establecidos operativos dieron como resultado una mayor produccion de amoniaco (FIG. 10B).
Las diferencias en el consumo neto de lactato en la segunda mitad del experimento ocasionaron una desviacion del pH de los cultivos respecto del punto de pH establecido operativo, ya que solo se uso adicion de base y no de acido para mantener el pH (FIG. 11A). Como consecuencia de las diferencias en los puntos de pH establecidos, los perfiles de lactato y las adiciones de agente de titulacion, la osmolaridad tambien difirio entre las condiciones de pH (FIG. 11B).
La operacion de cultivos a puntos de pH establecidos de 0,2 unidades de pH respecto del pH 7,00 dieron lugar a productividades espedficas de celulas (es decir, Qp) ligeramente menores (FIG. 12A). La utilizacion de un punto de pH establecido de 6,80 o 7,20 dio como resultado menores tttulos de producto debido tanto a la menor productividad espedfica de celulas como a menores numeros integrados de celulas viables (FIG. 12B).
Sin embargo, los menores puntos de pH establecidos operativos dieron como resultado una reduccion en el mal plegamiento y la agregacion del producto (FIG. 13A). Ademas, se observo una reduccion significativa en la proporcion de agregados de elevado peso molecular a puntos de pH establecidos mas bajos (FIG. 13B).
Los menores puntos de pH establecidos operativos dieron como resultado una menor sialilacion total (glucanos unidos tanto a N como a O) (FIG. 14A), asf como una menor proporcion de sialilacion de glucanos unida a N (FIG. 14B). Debido a que la cantidad de sialilacion normal (unida a N y O) se definio como el porcentaje en relacion a la cantidad de sialilacion total del material de referencia, cualquier valor por debajo del 100% represento una reduccion en la sialilacion total y los valores por encima del 100% representaron un aumento en la sialilacion total. El patron de glucosilacion puede ilustrarse como el perfil de glucanos de la glucoprotema (FIG. 15). El cultivo de celulas al pH reducido dio como resultado una alteracion significativa del perfil de glucosilacion general (FIG. 16). Aunque no se detectaron glucoformas nuevas al pH reducido, las proporciones de glucoformas presentes se alteraron de manera significativa; el cultivo de celulas al pH reducido dio como resultado la reduccion de glucoformas complejas di y mono-sialiladas. Debido al efecto potencialmente desfavorable del pH reducido en la glucosilacion de protemas, el pH del cultivo celular ha de seleccionarse de tal modo que se compensen los efectos perjudiciales de la glucosilacion de protemas por los efectos beneficiosos de la reduccion de protemas mal plegadas y/o agregadas. Por ejemplo, el
cultivo de celulas a un pH reducido de 6,95 redujo significativamente la proporcion de protema TNFR-Fc mal plegada y agregada, a la vez que tuvo efectos mmimos en la glucosilacion de TNFR-Fc.
Ejemplo 1.3: Discusion
Estos estudios demuestran que dentro de un intervalo de temperatura de 27,0°C a 30,0°C o dentro de un intervalo 5 de punto establecido de pH de 6,80 a 7,20, el cultivo celular y la productividad espedfica del cultivo celular pueden verse afectados de manera significativa. Sin embargo, aunque la alteracion de la temperatura fue tan solo de 1-2°C y de los puntos de pH establecidos de tan solo 0,1-0,2, esta no afecta significativamente al crecimiento celular y a la productividad espedfica, puede observarse una diferencia significativa (favorable) en el plegamiento de protema y la agregacion de protema. Por lo tanto, las pequenas diferencias en las condiciones de cultivo celular que no afectan 10 significativamente al crecimiento celular, la viabilidad o la productividad, pueden alterar significativamente la calidad del producto, por ejemplo, reducir el plegamiento de protemas y la agregacion de protemas o afectar a la glucosilacion.
Ejemplo 2
Efectos de la temperatura en la produccion de sIL-13R y evaluacion de una nueva lmea celular productora de slL- 15 13R
Ejemplo 2.1: Materiales y procedimientos
Se sembraron celulas de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas de manera estable que expresaban glucoprotema recombinante sIL-13R en biorreactores Applikon a razon de 3x105 celulas/ml en un medio de inoculacion con antiespumante (Dow Corning Corporation, Midland, Ml). Se anadio antiespumante adicional segun 20 fuese necesario. Se uso un medio nutriente concentrado como medio de alimentacion. El lfmite inferior del punto de pH establecido fue de 6,80. El punto establecido de dO2 fue del 23% utilizando un 7% de CO2/93% de gas de burbujeo, mientras que la agitacion fue a 200 rpm. Se cambio la temperatura de los biorreactores de 37,0°C en el dfa 5. La temperatura de la fase de produccion fue de 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C, 28,0°C o temperatura ambiente (TA; aproximadamente 24,0°C). Las pautas de alimentacion para las condiciones experimentales se resumen en la tabla 25 1. Los volumenes de alimentacion se listan como porcentaje de volumen de cultivo en el biorreactor. El cambio de
temperatura para los cultivos celulares se produjo a aproximadamente 6x106 celulas/ml.
Tabla 1. Pautas de alimentacion de biorreactor
- Condicion experimental:
- 37,0°C 33,0°C 32,0°C 31,0°C 29,0°C TR
- DfA
- 3
- 10,2% 10,2% 10,2% 10,2% 10,2% 10,2%
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- 5% 5% 5% 5% 5% 5%
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- 10,2% 5% 5% 5% 5% 5%
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- 5% 5% 5% 5% 5% 5%
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- 5% 5% 5% 5%
Ejemplo 2,2. Resultados
Las densidades de celulas viabilidades logradas despues del cambio de temperatura fueron ligeramente menores a 30 TA (aproximadamente 6x106 celulas/ml) y a 29,0°C (aproximadamente 7x106 celulas/ml) que a temperaturas mayores (aproximadamente 8x106 celulas/ml) (FIG. 17A). De forma analoga, las densidades celulares totales logradas despues del cambio de temperatura fueron ligeramente menores a TA (aproximadamente 6,5x106 celulas/ml) y a 29,0°C (aproximadamente 7,5x106 celulas/ml) que a temperaturas mayores (aproximadamente de 8 a 9x106 celulas/ml) (FIG. 17B). Las viabilidades se mantuvieron mejor a lo largo del cultivo discontinuo alimentado a 35 menores temperaturas (FIG. 17C). La velocidad de reduccion de la viabilidad vario dependiendo de la temperatura; los perfiles de viabilidad de los cultivos a TA y a 29,0°C fueron significativamente mayores que los cultivos restantes a 31,0°C, 32,0°C, 33,0°C y 37,0°C (FIG. 17C).
Al final del cultivo discontinuo alimentado de 18 dfas, se logro el tttulo mas elevado (tftulo de dfmero y HMWA de slL- 13R combinados) mediante el cultivo a 31,0°C, seguido del cultivo a 32,0°C (188 mg/l), el cultivo a 29,0°C (178 mg/l) 40 y el cultivo a 33,0°C (151 mg/l) (FIG. 18). Los cultivos a TA y a 37,0°C tuvieron tftulos significativamente menores. La productividad celular espedfica o la velocidad de produccion espedfica de sIL-13R diaria (Qp), de la lmea celular
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productora de sIL-13R se redujo significativamente a TA y a 37,0°C (FIG. 19A). Ademas, las productividades espedficas acumulativas medias o la Qp media acumulativa, tambien fueron menores a 37,0°C y a TA (FIG. 19B). De manera interesante, los grandes aumentos en las productividades espedficas observados al final de los cultivos a 37,0°C, 33,0°C, 32,0°C y 31,0°C correspondieron a reducciones significativas en las viabilidades del cultivo (datos no mostrados).
El consumo espedfico de glucosa (Qglc) se redujo a medida que se redujo la temperatura (FIG. 20). El consumo espedfico de glutamina (Qgln) tambien parecio reducirse a medida que se redujo la temperatura (FIG. 21). Sin embargo, cabe destacar que los datos acerca del consumo espedfico de glutamina no tuvieron en cuenta la degradacion de la glutamina en el medio, que se produjo en mayor medida con el aumento de la temperatura. Por lo tanto, el impacto de la temperatura en el consumo espedfico de glutamina puede estar sesgado. Los perfiles de concentracion de lactato para los cultivos a TA, 29,0°C, 31,0°C y 32,0°C fueron similares, alcanzando la concentracion de lactato un maximo aproximadamente en el dfa del cambio de temperatura, y despues reduciendose a entre 0,7 y 2,0 g/l en el dfa 18 (FIG. 22). Para los cultivos a 33,0°C y 37,0°C, los perfiles de lactato fueron similares a los otros cultivos durante la fase de crecimiento, pero fueron significativamente diferentes durante la fase de produccion. Para el cultivo a 33,0°C, la concentracion de lactato no se redujo despues del cambio de temperatura y en su lugar, permanecio esencialmente constante. Para el cultivo a 37,0°C, el lactato aumento durante toda la duracion del cultivo discontinuo alimentado.
La concentracion de amoniaco vario durante la fase de produccion de manera acorde a la temperatura (FIG. 23). Para el cultivo a 29,0°C, la concentracion de amoniaco alcanzo un maximo aproximadamente en el dfa del cambio de temperatura, se redujo durante la etapa intermedia del cultivo discontinuo alimentado y despues aumento durante la ultima etapa del cultivo discontinuo alimentado. Con el aumento de la temperatura por encima de los 29,0°C, el aumento de la concentracion de amoniaco en la ultima etapa del cultivo discontinuo alimentado fue mayor y se produjo de una manera mas temprana. Para el cultivo a 37,0°C, la concentracion de amoniaco aumento durante todo el transcurso del cultivo discontinuo alimentado. Para el cultivo a TA, los niveles de amoniaco permanecieron aproximadamente constantes despues del cambio de temperatura.
Las muestras de medio condicionado de estos ciclos de biorreactor se analizaron respecto de los agregados de elevado peso molecular (HMWA) mediante cromatograffa de exclusion por tamanos (SEC) de eluatos del lote unidos a protema A. Una tendencia evidente extrafda de os resultados de la lrnea celular fue el aumento relativo en el porcentaje de HMWA presente en el medio condicionado a medida que se aumento la temperatura (FIG. 24 y FIG. 25). Por lo tanto, el hecho de llevar a cabo los cultivos a temperaturas mas bajas dio como resultado una reduccion de la agregacion de producto de sIL-13R.
La reduccion en el porcentaje de dfmero sIL-13R se correlaciono con el aumento en el porcentaje de HMWA. (FIG. 26A y 26B). El cultivo a TA tuvo un menor % de HMWA que otros cultivos (FIG. 26B), asf como un mayor porcentaje de formacion de dfmero. (FIG. 26A). El cultivo a TA y el cultivo a 31,0°C proporcionaron un tftulo similar de solo dfmero, mientras que el cultivo a 29,0°C proporciono el tftulo mas elevado de solo dfmero (FIG. 27).
Para corroborar las conclusiones extrafdas del analisis de SEC, se analizaron muestras de medio condicionado usando transferencias de Western. Se examinaron las diferencias cualitativas en la cantidad de sIL-13R presente en forma de especies de HMWA frente a dfmero. Las transferencias de Western demuestran la tendencia de que la cantidad de agregados de HMWA presente en el medio condicionado en relacion con la cantidad de dfmero presente aumento a medida que aumento la temperatura (datos no mostrados).
Estos experimentos demuestran la importancia de la interrelacion entre las variables de la viabilidad dependientes de la temperatura y la densidad de celulas viables, la productividad espedfica y la formacion de HMWA en la produccion volumetrica de dfmero de sIL-13R. Aunque el cultivo a 31,0°C logro el tftulo mas elevado (las medidas incluyeron HMWA y dfmero), los cultivos a menores temperaturas (por ejemplo, 29,0°C) pueden proporcionar una productividad volumetrica comparable o mejorada cuando se mide en terminos unicamente de dfmero.
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento de produccion de una protema en un cultivo celular que comprende:(a) cultivar celulas en cultivo celular a una temperature reducida, en el que la temperature reducida se encuentra dentro de un intervalo de 27,0°C a menos de 30,0°C; y5 (b) cultivar celulas en el cultivo celular a pH reducido, en el que el pH reducido se encuentra dentro de unintervalo de 6,80 a menos de 7,00; para reducir la produccion de proternas mal plegadas y/o proternas agregadas,en el que el cultivo celular es un cultivo de celulas de mairnfero,en el que la protema producida es un receptor soluble, en el que dicho receptor soluble es TNFR-Fc o sIL-13R.10 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el cultivo es un cultivo de celulas CHO.
- 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que el receptor soluble es TNFR-Fc.
- 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la temperatura reducida es de 29,5°C.
- 5. El procedimiento de la reivindicacion 3 o 4, en el que el pH reducido es de 6,95.
- 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el receptor soluble es sIL-13R.15 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que ademas comprende una etapa deaislar la protema del cultivo celular.
- 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que la protema se purifica o procesa adicionalmente para su formulacion.
- 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la protema se formula en una composicion 20 farmaceutica.
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