ES2622366T3 - Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina, que comprende a) cultivar una célula eucariota que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor constante inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podría utilizar como máximo por las células en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante está disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentación de glucosa limitada, y b) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina glucosilada

En el presente documento se informa de un procedimiento en el campo de la produccion de inmunoglobulinas en celulas, por el que se puede modificar el patron de glucosilacion de la inmunoglobulina producida basandose en las condiciones de cultivo.

Antecedentes de la invencion

En los ultimos anos ha aumentado continuamente la produccion de inmunoglobulinas y es probable que las inmunoglobulinas lleguen a ser el mayor grupo de tratamientos disponible para el tratamiento de diversas enfermedades en el futuro cercano. El impacto de las inmunoglobulinas surge de su especificidad, que comprende su funcion de reconocimiento y union a dianas especfficas, ademas de la activacion de efectos especfficos simultaneamente con o despues de la union de antfgeno/receptor Fc.

El reconocimiento y union a dianas especfficas esta mediado por la region variable de la inmunoglobulina. Otras partes de la molecula de inmunoglobulina, de las que se originan los efectos, son modificaciones postraduccionales, tales como el patron de glucosilacion. Las modificaciones postraduccionales tienen una influencia sobre la eficacia, estabilidad, potencial inmunogenico, union, etc., de una inmunoglobulina. A proposito de esto, tienen que tratarse la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la induccion de la apoptosis.

Se ha informado que el patron de glucosilacion de inmunoglobulinas, es decir, la composicion de sacarido y el numero de glucoestructuras unidas, tiene una fuerte influencia sobre las propiedades biologicas (vease, por ejemplo, Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16). Las inmunoglobulinas producidas por celulas de mamffero contienen un 2-3 % en masa de carbohidratos (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). Esto es equivalente, por ejemplo, en una inmunoglobulina de clase G (IgG) a 2,3 restos de oligosacarido en una IgG de origen de raton (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) y a 2,8 restos de oligosacarido en una IgG de origen humano (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457), de los que generalmente dos se localizan en la region Fc y los restantes en la region variable (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).

En la region Fc de una inmunoglobulina de clase G, se pueden introducir restos de oligosacarido a traves de N- glucosilacion en el resto de aminoacido 297, que es un resto de asparagina (indicado como Asn297). Youings et al. han mostrado que existe otro sitio de N-glucosilacion en un 15 % a un 20 % de las moleculas de IgG policlonal en la region Fab (Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630; vease tambien, por ejemplo, Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940). Debido al procesamiento de oligosacaridos no homogeneos, es decir, asimetricos, existen multiples isoformas de una inmunoglobulina con diferente patron de glucosilacion (Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748). Simultaneamente, la estructura y distribucion de los oligosacaridos es tanto altamente reproducible (es decir, no aleatoria) como especffica de sitio (Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292).

Algunas caracterfsticas de una inmunoglobulina estan directamente asociadas a la glucosilacion de la region Fc (vease por ejemplo Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 49634969; Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Wright, A. y Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402), tales como, por ejemplo, estabilidad termica y solubilidad (West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20), antigenicidad (Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339), inmunogenicidad (Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351; Feizi, T. y Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11; Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72), tasa de eliminacion/semivida en la circulacion (Ashwell, G. y Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391; Chan, V.T. y Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62; Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182; Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908) y actividad especffica biologica (Jefferis, R. y Lund, J., en Antibody Engineering, ed. por Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128).

Se han investigado los factores que influyen en el patron de glucosilacion, tales como, por ejemplo, la presencia de suero de ternero fetal en el medio de fermentacion (Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131), condiciones de tamponamiento (Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334), concentracion de oxfgeno disuelto (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31; Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 5571; Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350), posicion y conformacion del oligosacarido, ademas del tipo de celula huesped y estado de crecimiento celular (Hahn, T.J. y Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987; Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981), metabolismo de azucares de nucleotidos celulares (Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251), limitaciones de nutrientes (Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544; Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335), especialmente restriccion de glucosa (Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157) y pH extracelular (Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724).

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Se han observado estructuras de oligomanosa elevadas, ademas de estructuras de oligosacarido truncadas, por la expresion recombinante de inmunoglobulinas, por ejemplo, en celulas NS0 de mieloma (Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735). En condiciones de privacion de glucosa, se han observado variaciones en la glucosilacion, tales como la union de oligosacaridos precursores mas pequenos o la ausencia completa de restos de oligosacarido, en celulas CHO, celulas 3T3 murinas, celulas de hepatoma de rata, celulas de rinon de rata y celulas de mieloma murino (Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261; Davidson, S.K. y Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468; Gershman, H. y Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780; Baumann, H. y Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949; Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771; Stark, N.J. y Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609). Se informo de una estrategia basada en bajas concentraciones de glutamina/glucosa por Wong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177.

La solicitud de patente japonesa JP 62-258252 informa de un cultivo de celulas de mamffero por perfusion, mientras que el documento US 5.443.968 informa de un procedimiento de cultivo semicontinuo para celulas que secretan protefna. En el documento WO 98/41611 se informa de un procedimiento de cultivo de celulas eficaz para adaptar las celulas a un estado metabolico caracterizado por baja produccion de lactato. Se informa de un procedimiento para cultivar celulas para producir sustancias en el documento WO 2004/048556. Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534, informa que las celulas de mamffero, cuando se incuban en ausencia de glucosa, transfieren estructuras que contienen manosa-5 en lugar de estructuras que contienen manosa-9 a protefnas. Se informa de la dependencia de las influencias de pCO2 durante la limitacion de glucosa en el crecimiento, metabolismo y produccion de IgG de celulas CHO por Takuma, S., et al. en Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488.

En el documento US 2006/127975 se informa de un procedimiento de cultivo de celulas para producir sustancias. En el mismo, se cultiva una lfnea celular que produce sustancias mientras se alimenta un medio nutritivo de tal manera que se produce limitacion de glucosa en la solucion de cultivo. Se informa de manipulacion de la region Fc por Peipp, M., et al., en Handbook of Therapeutic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, paginas 171-196). Venkiteshwarain, A., informo de Tocilizumab (MaBs 1 (2009) 432-438).

Sumario

Se ha encontrado que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion de un polipeptido producido por una celula eucariota se puede modificar basandose en la cantidad de glucosa proporcionada a la celula en el procedimiento de cultivo. Reduciendo la cantidad de glucosa disponible, por ejemplo, cambiando el valor de DGL de 1,0 a valores mas pequenos de, por ejemplo, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4 o 0,2, se puede obtener una modificacion en la cantidad de glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. El valor de DGL o, respectivamente, la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo tiene que mantenerse constante y a un valor reducido definido por unidad de tiempo.

En el presente documento se informa de un procedimiento para la produccion de un polipeptido, en un modo de realizacion de una inmunoglobulina, en una celula eucariota, que comprende las siguientes etapas

a) proporcionar una celula eucariota que comprende un acido nucleico que codifica el polipeptido,

b) cultivar la celula en condiciones en las que el grado de limitacion de glucosa (DGL) se mantiene constante y en las que el DGL es inferior a 0,8, y

c) recuperar el polipeptido del cultivo,

en el que la fraccion del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5 es de un 10 % o menos de la suma que comprende la cantidad del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) del polipeptido, la cantidad de la isoforma G(1) del polipeptido y la cantidad de la isoforma G(2) del polipeptido.

En un modo de realizacion, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0,8 a 0,2. En otro modo de realizacion, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0,6 a 0,4. En otro modo de realizacion, la fraccion del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5 es de un 8 % o menos de la suma que comprende el polipeptido con una glucoestructura de manosa-5, la isoforma G(0) del polipeptido, la isoforma G(1) del polipeptido y la isoforma G(2) del polipeptido. En otro modo de realizacion adicional, el polipeptido es una inmunoglobulina, en un modo de realizacion una inmunoglobulina de clase G o E.

Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una celula de mamffero que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina,

b) cultivar la celula en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo

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por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a menos de un 80 % y mas de un 20 % de la cantidad que se podna utilizar como maximo por las celulas en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa restringida, y

c) recuperar la inmunoglobulina de las celulas o el medio de cultivo.

En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor en el intervalo de un 60 % a un 40 %. En otro modo de realizacion, las celulas en el medio de cultivo son las celulas viables en el medio de cultivo.

En un modo de realizacion de los aspectos, como se informa en el presente documento, la celula eucariota se selecciona de celulas CHO, celulas NS0, celulas HEK, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas de insecto o celulas Sp2/0. En un modo de realizacion, la celula eucariota es una celula de ovario de hamster chino (CHO). En otro modo de realizacion de los aspectos, como se informa en el presente documento, el cultivo es a un valor de pH en el intervalo de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 7,2.

En otro modo de realizacion adicional de los aspectos, como se informa en el presente documento, el cultivo es un cultivo continuo o semicontinuo. Los procedimientos pueden comprender, en otro modo de realizacion, una etapa final de purificacion del polipeptido. En otro modo de realizacion adicional, la celula se cultiva durante seis a veinte dfas o durante seis a quince dfas. En otro modo de realizacion, la celula se cultiva durante seis a ocho dfas.

En el presente documento se informa de una composicion que comprende una inmunoglobulina, en la que la composicion se ha preparado con un procedimiento, como se informa en el presente documento.

En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R. En otro modo de realizacion, el anticuerpo anti-IL-6R comprende Tocilizumab. En otro modo de realizacion, la glucoestructura de manosa-5 unida al anticuerpo anti-IL-6R es de un 8 % o menos. En otro un modo de realizacion adicional, la glucoestructura de manosa-5 es de un 6 % o menos. En otro modo de realizacion, la glucoestructura de manosa-5 es de un 4 % o menos. En otro modo de realizacion, la glucoestructura G(0) unida al anticuerpo anti-IL-6R esta en el intervalo de un 40 % a un 46 % y la glucoestructura G(2) unida al anticuerpo anti-IL-6R esta en el intervalo de un 9 % a un 11 %.

Descripcion detallada

En el presente documento se informa de un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una celula de mairnfero que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo a un DGL constante inferior a 0,8 (es decir, la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo es constante y a un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo), y

b) recuperar la inmunoglobulina de las celulas o el medio de cultivo.

Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede obtener una inmunoglobulina en el que la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5 depende del valor de DGL ajustado, y en el que la cantidad es la fraccion de la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa- 5, y de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, y de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina, y de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. En un modo de realizacion, el DGL es de 0,8 a 0,2. En este modo de realizacion, la fraccion es de un 10 % o menos. En otro modo de realizacion, el DGL es de 0,6 a 0,4. En este modo de realizacion, la fraccion es de un 6 % o menos. Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede obtener una inmunoglobulina en la que la fraccion de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5 es de un 10 % o menos de la suma que comprende la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. En otro modo de realizacion, la fraccion es la fraccion en % de area determinada en un procedimiento de cromatograffa de lfquidos. En un modo de realizacion, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,8 a 0,2. En otro modo de realizacion, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,6 a 0,2. En otro modo de realizacion adicional, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,6 a 0,4. En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo es la cantidad promedio de glucosa que se utiliza en un cultivo en el que todos los compuestos estan disponibles en exceso, es decir, ningun compuesto es limitante del crecimiento de la celula, determinado basandose en al menos cinco cultivos. En un modo de realizacion, la fraccion se determina en el dfa siete de cultivo.

Se describen procedimientos y tecnicas conocidos para un experto en la tecnica, que son utiles para llevar a cabo la presente invencion, por ejemplo, en Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumenes I a III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring

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Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Glover, N.D. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (1985); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986); Miller, J.H. y Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Segunda Edicion, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. (ed.), Cell Biology, Segunda Edicion, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Segunda Edicion, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).

El uso de tecnologfa de ADN recombinante permite la produccion de numerosos derivados de un polipeptido. Dichos derivados se pueden modificar, por ejemplo, en posiciones de aminoacidos individuales o varias posiciones de aminoacidos por sustitucion, alteracion o intercambio. La derivatizacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de mutagenesis dirigida al sitio. Dichas variaciones se pueden llevar a cabo facilmente por un experto en la tecnica (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE. UU. (2001); Hames, B.D. y Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra).

La expresion "acido nucleico" indica una molecula de acido nucleico que existe de forma natural o que existe parcial o completamente de forma no natural que codifica un polipeptido. El acido nucleico puede estar constituido por fragmentos de ADN que se afslan o sintetizan por medios qufmicos. El acido nucleico se puede integrar en otro acido nucleico, por ejemplo, en un plasmido de expresion o el genoma/cromosoma de una celula eucariota. El termino "plasmido" incluye plasmidos lanzadera y de expresion. Tfpicamente, el plasmido tambien comprendera una unidad de propagacion procariota que comprende un origen de replicacion (por ejemplo, origen de replicacion CoIE1) y un marcador de seleccion (por ejemplo, gen de resistencia a ampicilina o tetraciclina), para la replicacion y seleccion, respectivamente, del plasmido en celulas procariotas. Para un experto en la tecnica, son muy conocidos los procedimientos para convertir una secuencia de aminoacidos, por ejemplo, de un polipeptido, en un acido nucleico correspondiente que codifica la secuencia de aminoacidos respectiva. Por tanto, un acido nucleico se caracteriza por su secuencia de acido nucleico que consiste en nucleotidos individuales y, asimismo, por la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificada por la misma.

La expresion "casete de expresion" indica un acido nucleico que contiene los elementos necesarios para la expresion y, opcionalmente, para la secrecion de al menos el gen estructural contenido en/de una celula, tal como un promotor, sitio de poliadenilacion y regiones no traducidas 3' y 5'.

El termino "gen" indica, por ejemplo, un segmento en un cromosoma o en un plasmido, que es necesario para la expresion de un polipeptido. Ademas de la region codificante, un gen comprende otros elementos funcionales que incluyen un promotor, intrones y uno o mas terminadores de la transcripcion. Un "gen estructural" indica la region codificante de un gen sin una secuencia senal.

El termino "expresion" indica la transcripcion y la traduccion de un gen estructural dentro de una celula. El nivel de transcripcion de un gen estructural en una celula se puede determinar basandose en la cantidad de ARNm correspondiente que esta presente en la celula. Por ejemplo, el ARNm transcrito de un acido nucleico seleccionado se puede cuantificar por PCR o por hibridacion de Northern (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (anteriormente)). Un polipeptido codificado por un acido nucleico se puede cuantificar por diversos procedimientos, por ejemplo, por ELISA, determinando la actividad biologica del polipeptido o empleando procedimientos que son independientes de dicha actividad, tal como transferencia de Western o radioinmunoensayo, usando anticuerpos que reconocen y se unen al polipeptido (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (anteriormente)).

El termino "celula" indica una celula en la que se ha introducido un acido nucleico que codifica un polipeptido, en un modo de realizacion un polipeptido heterologo. El termino "celula" incluye tanto celulas procariotas usadas para la propagacion de plasmidos/vectores como celulas eucariotas usadas para la expresion del gen estructural. En un modo de realizacion, una celula eucariota para la expresion de una inmunoglobulina es una celula de mamffero. En otro modo de realizacion, la celula de mamffero se selecciona de celulas CHO, celulas NS0, celulas Sp2/0, celulas COS, celulas HEK, celulas BHK, celulas PER.C6® y celulas de hibridoma. Una celula eucariota se puede seleccionar ademas de celulas de insecto, tales como celulas de oruga (Spodoptera frugiperda, celulas sf), celulas de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), celulas de mosquito (Aedes aegypti, Aedes albopictus) y celulas de gusano de seda (Bombyx mori) y similares.

El termino "polipeptido" indica un polfmero de restos de aminoacido unidos por enlaces peptfdicos, tanto si se producen de forma natural como sintetica. Los polipeptidos de menos de aproximadamente 20 restos de aminoacido se pueden denominar "peptidos". Los polipeptidos de mas de 100 restos de aminoacido o agregados covalentes y no covalentes que comprenden mas de un polipeptido se pueden denominar "protefnas". Los polipeptidos pueden comprender componentes que no son aminoacidos, tales como grupos carbohidrato. Los componentes que no son aminoacidos se pueden anadir al polipeptido por la celula en la que se produce el polipeptido, y pueden variar con el tipo de celula. Los polipeptidos se definen en el presente documento en terminos de su secuencia de aminoacidos en la direccion del extremo N al C. Las adiciones a estos, tales como los grupos carbohidrato, generalmente no se especifican, pero sin embargo puede estar presentes.

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La expresion "ADN heterologo" o "polipeptido heterologo" indica una molecula de ADN o un polipeptido, o una poblacion de moleculas de ADN o una poblacion de polipeptidos, que no existen de forma natural dentro de una celula dada. Las moleculas de ADN heterologas para una celula particular pueden contener ADN derivado de la especie de la celula (es decir, ADN endogeno) siempre que el ADN se combine con el ADN que no es del huesped (es decir, ADN exogeno). Por ejemplo, una molecula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es de la celula, por ejemplo, que codifica un polipeptido, enlazado de forma funcional a un segmento de ADN de la celula, por ejemplo, que comprende un promotor, se considera que es una molecula de ADN heterologo. Asimismo, una molecula de ADN heterologo puede comprender un gen estructural endogeno enlazado de forma funcional a un promotor exogeno. Un polipeptido codificado por una molecula de ADN heterologo es un polipeptido "heterologo".

La expresion "plasmido de expresion" indica un acido nucleico que comprende al menos un gen estructural que codifica un polipeptido que se va a expresar. Tfpicamente, un plasmido de expresion comprende una unidad de propagacion de plasmido procariota, que incluye un origen de replicacion y un marcador de seleccion, por ejemplo, para E. coli, un marcador de seleccion eucariota y uno o mas casetes de expresion para la expresion del (de los) gen(es) estructural(es) de interes, que comprende cada uno, a su vez, un promotor, al menos un gen estructural y un terminador de la transcripcion que incluye una senal de poliadenilacion. La expresion genica se pone normalmente bajo el control de un promotor, y dicho gen estructural debe estar "enlazado de forma funcional a" el promotor. Similarmente, un elemento regulador y un promotor central estan enlazados de forma funcional si el elemento regulador modula la actividad del promotor central.

La expresion "polipeptido aislado" indica un polipeptido que esta esencialmente libre de componentes celulares asociados, tales como carbohidratos, lfpidos u otras impurezas protefnicas o no protefnicas, que no estan asociadas covalentemente al polipeptido. Tfpicamente, una preparacion de un polipeptido aislado contiene en, ciertos modos de realizacion, el polipeptido en una forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente un 80 % pura, al menos aproximadamente un 90 % pura, al menos aproximadamente un 95 % pura, superior a un 95 % pura o superior a un 99 % pura. Una forma de mostrar que una preparacion de protefna particular contiene un polipeptido aislado es por la aparicion de una unica banda despues de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio- poliacrilamida (SDS-page) de la preparacion y tincion con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el termino "aislado" no excluye la presencia del mismo polipeptido en formas ffsicas alternativas, tales como dfmeros o, de forma alternativa, formas glucosiladas o derivatizadas.

Las inmunoglobulinas, en general, estan asignadas a cinco clases diferentes: IgA (inmunoglobulina de clase A), IgD, IgE, IgG e IgM. Entre estas clases, las inmunoglobulinas se diferencian en su estructura y/o secuencia de aminoacidos global, pero tienen los mismos elementos estructurales. Las inmunoglobulinas completas estan constituidas por dos pares de cadenas de polipeptido, que comprende, cada una, una cadena de polipeptido ligera de inmunoglobulina (abreviado: cadena ligera) y una cadena de polipeptido pesada de inmunoglobulina (abreviado: cadena pesada). A su vez, las cadenas comprenden una region variable y una region constante. En una cadena ligera ambas regiones consisten en un dominio, mientras que en una cadena pesada la region variable consiste en un dominio y la region constante comprende hasta cinco dominios (en la direccion del extremo N al C): el dominio Ch1, opcionalmente el dominio de region bisagra, el dominio Ch2, el dominio Ch3 y opcionalmente el dominio Ch4. Una inmunoglobulina se puede diseccionar en una region Fab y una Fc. La cadena ligera entera, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio Ch1 se denominan region Fab (region de union al antfgeno del fragmento). La region Fc comprende el dominio Ch2, Ch3 y opcionalmente Ch4.

Como se usa en el presente documento, el termino "inmunoglobulina" indica una protefna que consiste en uno o mas polipeptidos. Los genes de inmunoglobulina codificantes incluyen los diferentes genes de la region constante, ademas de los innumerables genes de la region variable de inmunoglobulina. El termino "inmunoglobulina" comprende, en un modo de realizacion, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, tales como una cadena pesada aislada o una region constante de la cadena pesada, ademas de polipeptidos de fusion que comprenden al menos un dominio Ch2 de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un modo de realizacion del procedimiento, como se informa en el presente documento, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina completa, en otro modo de realizacion la inmunoglobulina es una region Fc de una inmunoglobulina completa. En otro modo de realizacion, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina.

La expresion "fragmento de inmunoglobulina" indica un polipeptido que comprende al menos el dominio Ch2 de una cadena pesada delta, epsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio Ch3 de una cadena pesada epsilon o delta de inmunoglobulina. Tambien estan englobados derivados y variantes de los mismos en los que el motivo de N- glucosilacion Asn-Xaa-Ser/Thr en el dominio Ch2 o Ch3 no esta cambiado.

La expresion "conjugado de inmunoglobulina" indica un polipeptido que comprende al menos el dominio Ch2 de una cadena pesada delta, epsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio Ch3 de una cadena pesada epsilon o delta de inmunoglobulina fusionado con un polipeptido que no es de inmunoglobulina. En el mismo, el motivo de N- glucosilacion Asn-Xaa-Ser/Thr en el dominio Ch2 o Ch3 no esta cambiado.

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Los oligosacaridos unidos a Asn297 (IgG, IgE) o Asn263 (IgA) de un dominio Ch2 y/o a Asn394, Asn445 o Asn496 (IgE, IgD) de un dominio Ch3 de una cadena pesada de inmunoglobulina tienen una estructura biantenaria (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394), es decir, consisten en una estructura central de

Man(a1 -4)GlcNAc(pi-4)GlcNAc^Asn

con un enlace Fuc(a1-6) opcional en el resto GlcNAc terminal. Dos brazos externos estan conectados a la manosa terminal de la estructura central que tiene la formula

Gal(p1-4)GlcNAc(p1-2)Man(a1-6)^Man, y Gal(p1-4)GlcNAc(p1-2)Man(a1-3)^Man,

en la que los restos de galactosa terminales son opcionales (Man = manosa, GlcNAc = N-acetil-glucosa, Gal = galactosa; Fuc = fucosa).

Tabla 1: Sitios de glucosilacion de inmunoglobulinas.

clase de inmunoglobulina

resto al que se puede unir una glucoestructura

IgG

Asn 297

IgE

Asn 255, Asn 297, Asn 361, Asn 371, Asn 394

IgA

Asn 263, Asn 459

IgD

Asn 445, Asn 496

IgM

Asn 395

La expresion "la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina" indica la suma de las cantidades de los diferentes oligosacaridos biantenarios heterogeneos N-unidos a una asparagina (Asn) de una inmunoglobulina. La isoforma G(2) tiene un resto de galactosa terminal en cada uno de los brazos externos de la estructura de oligosacarido, la isoforma G(1) posee solo un resto de galactosa en cualquiera del brazo externo unido (a1-6) o (a1- 3) y la isoforma G(0) no posee resto de galactosa en ninguno de los brazos externos.

La expresion "glucoestructura de manosa-5" indica una estructura de oligomanosa unida a un resto de Asn de un polipeptido que comprende o que consiste en cinco restos de manosa y dos restos centrales de N-acetilglucosa, que forman una estructura triantenaria.

Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una celula eucariota, preferentemente una celula de mamffero, que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podrfa ser utilizar como maximo por las celulas eucariotas en el cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa limitada, y

b) recuperar la inmunoglobulina de la celula o el medio de cultivo y producir de ese modo una inmunoglobulina.

Con este procedimiento se obtiene una inmunoglobulina que comprende como maximo un 10 % de una inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5. El 10 % se calcula basandose en la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina.

Las expresiones "grado de limitacion de glucosa" y su abreviatura "DGL", que se pueden usar indistintamente en el presente documento, indican la proporcion de la tasa de consumo de glucosa especffica existente de una celula individual en un cultivo con respecto a la tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida de la celula individual o una celula individual del mismo tipo. El grado de limitacion de glucosa se define como

qGIc

DGL =...................

qGlCmji

con qGlc = tasa de consumo de glucosa especffica existente de una celula individual;

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qGlOmax = tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida para esta celula individual o una celula individual del mismo tipo.

El DGL puede variar entre DGLmantenimiento y 1 por lo que DGLmantenimiento (< 1 y > 0) indica limitacion del crecimiento completa y 1 indica ausencia de limitacion o exceso de glucosa completo.

La introduccion de glucoestructuras en polipeptidos, por ejemplo, inmunoglobulinas, es una modificacion postraduccional. Debido a la incompletitud del procedimiento de glucosilacion de la celula respectiva, cada polipeptido expresado se obtiene con un patron de glucosilacion que comprende diferentes glucoestructuras. Por tanto, un polipeptido se obtiene de una celula que lo expresa en forma de una composicion que comprende formas glucosiladas de forma diferente del polipeptido, es decir, con la misma secuencia de aminoacidos. La suma de las glucoestructuras individuales se indica como el patron de glucosilacion que comprende, por ejemplo, polipeptidos con glucoestructuras completamente ausentes, glucoestructuras procesadas de forma diferente y/o glucoestructuras compuestas de forma diferente.

Una glucoestructura es la glucoestructura de manosa-5 (tambien indicada como de alta manosa, Man5, M5 u oligo- manosa). Se ha informado que la fraccion de polipeptidos producidos de forma recombinante con la glucoestructura de manosa-5 aumenta con tiempo de cultivo prolongado o en condiciones de privacion de glucosa (Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735; Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534).

Se ha encontrado que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion de un polipeptido producido por una celula eucariota se puede modificar basandose en la cantidad de glucosa proporcionada a la celula en el procedimiento de cultivo. Se ha encontrado que reduciendo la cantidad de glucosa, es decir, cambiando el valor de DGL de 1,0 a valores mas pequenos de, por ejemplo, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4 o 0,2, se puede lograr una modificacion en la cantidad de glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. En un modo de realizacion, el valor de DGL se mantiene constante a un valor dentro de un intervalo, tal como de 0,8 a 0,2, o de 0,6 a 0,4. Es decir, la produccion de un polipeptido, en un modo de realizacion de una inmunoglobulina, se puede realizar en condiciones en las que esta disponible una cantidad de glucosa limitada para la celula cultivada para obtener el polipeptido con una cantidad definida de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. Se ha encontrado que un cultivo con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por las celulas por unidad de tiempo, en un modo de realizacion cultivando exponencialmente las celulas, es decir, con un DGL de 0,8 o menos, proporciona un polipeptido con un patron de glucosilacion en el que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 esta cambiada en comparacion con un cultivo con un DGL de 1,0. En un modo de realizacion, la densidad celular es la densidad de celulas viables. Adicionalmente, se aumenta el rendimiento de polipeptido obtenido.

La expresion "la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por la celula por unidad de tiempo" indica la cantidad de glucosa que se consume o utiliza o metaboliza como maximo por unidad de tiempo por una celula individual en condiciones de crecimiento optimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitacion de nutrientes. Por tanto, la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar determinando la cantidad de glucosa que se metaboliza por unidad de tiempo por una celula en condiciones de crecimiento optimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitacion de nutrientes. Un aumento adicional de la cantidad disponible de glucosa no aumentara adicionalmente, es decir, cambiara, la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo. Esta cantidad define el nivel maximo de consumo de glucosa de una celula individual. Esto no indica que una version modificada geneticamente de la celula no pueda tener un nivel maximo, incluso mas alto, de consumo de glucosa. De forma alternativa, la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar basandose en los cultivos previos y los datos sometidos a control.

El procedimiento, como se informa en el presente documento, es particularmente simple de llevar a cabo, asociado a un esfuerzo mfnimo de medicion y control, y particularmente economico.

Sin restricciones, por ejemplo, suministro de nutrientes insuficiente, las celulas cultivadas crecen y consumen nutrientes a tasas maximas de una manera poco rentable. Uno de los nutrientes de medio de cultivo consumido es la glucosa, que se metaboliza por las celulas cultivadas para producir energfa y elementos estructurales para el metabolismo de las celulas. En presencia de un exceso de glucosa, el metabolismo de la celula esta funcionando a la maxima tasa de recambio para la glucosa. La cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar, por ejemplo, a partir del consumo de glucosa de celulas en crecimiento exponencial en presencia de un exceso de glucosa cultivadas con o en las mismas condiciones de cultivo que tambien se usaran en el cultivo con glucosa limitada, es decir, con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que es mas pequena que la que se puede utilizar por la celula. Esta cantidad maxima se puede calcular facilmente determinando la densidad celular y la concentracion de glucosa al principio y al final de un intervalo de tiempo fijo. El valor normalmente esta en un intervalo de 0,006 a 190 mmol/hora/109 celulas (Baker, K.N., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 188-202; documento WO 98/41611; Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334; documento WO 2004/048556). En un modo de realizacion, la qGlcmax es aproximadamente 0,142 mmol/hora/109 celulas en condiciones de procedimiento estandar a pH 7,0.

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El procedimiento, como se informa en el presente documento, se realiza en condiciones en las que la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo se mantiene constante y a un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo (0,8 > DGL > 0), en un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante y a un 60 % o menos (0,6 > DGL > 0), en otro modo de realizacion a un 50 % o menos (0,5 > DGL > 0) y en otro modo de realizacion adicional a aproximadamente un 40 %. El termino "aproximadamente", como se usa dentro de la presente solicitud, indica que el valor no es un valor exacto, es simplemente el punto central de un intervalo en el que el valor puede variar hasta un 10 %, es decir, la expresion "aproximadamente un 40 %" indica un intervalo de un 44 % a un 36 % (DGL = 0,44 - 0,36).

En un modo de realizacion, el cultivo es con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que se mantiene constante en un intervalo entre un 80 % y un 10 % de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo (0,8 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 60 % y un 10 % (0,6 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 50 % y un 10 % (0,5 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 45 % y un 20 % (0,45 > DGL > 0,2). En tambien un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene entre un 80 % y un 60 % (0,8 > DGL > 0,6).

En un modo de realizacion, el procedimiento comprende la etapa de cultivar la celula en condiciones en las que el DGL se mantiene constante y a un valor de aproximadamente 0,4, por lo que el cultivo comprende empezar con un DGL entre 1,0 y 0,5, reducir el DGL a un valor de aproximadamente 0,4, y mantener el DGL constante despues de esto. En un modo de realizacion, reducir el DGL esta dentro de un periodo de tiempo de 100 horas. La expresion "mantener el DGL constante" y equivalentes gramaticales de la misma indican que el valor de DGL se mantiene durante un periodo de tiempo, es decir, la variacion del valor de DGL esta dentro de un 10 % del valor (vease, por ejemplo, la figura 2).

La inmunoglobulina se recupera despues de la produccion, directamente o despues de la disgregacion de la celula. La inmunoglobulina recuperada se purifica, en un modo de realizacion, con un procedimiento conocido para un experto en la tecnica. Diferentes procedimientos estan bien establecidos y se usan de forma generalizada para la purificacion de protefnas, tales como cromatograffa de afinidad con protefnas microbianas (por ejemplo, cromatograffa de afinidad con protefna A o protefna G), cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, intercambio cationico (resinas de carboximetilo), intercambio anionico (resinas de aminoetilo) e intercambio en modo mixto), adsorcion tiofila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatograffa de interaccion hidrofoba o de adsorcion aromatica (por ejemplo, con fenil-Sepharose, resinas aza-arenofilas, o acido m- aminofenilboronico), cromatograffa de afinidad por quelatos metalicos (por ejemplo, con material de afinidad por Ni(II) y Cu(II)), cromatograffa de exclusion por tamano y procedimientos electroforeticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Por ejemplo, un procedimiento de purificacion para las inmunoglobulinas, en general, comprende una parte cromatografica de multiples etapas. En la primera etapa, los polipeptidos que no son inmunoglobulina se separan de la fraccion de inmunoglobulina por una cromatograffa de afinidad, por ejemplo, con protefna A o G. Despues de esto, por ejemplo, se puede realizar cromatograffa de intercambio ionico para separar las clases de inmunoglobulina individuales y para eliminar las trazas de protefna A, que ha coeluido de la primera columna. Finalmente, se emplea una etapa cromatografica para separar monomeros de inmunoglobulina de multfmeros y fragmentos de la misma clase.

Los procedimientos cromatograficos generales y su uso son conocidos para un experto en la tecnica. Veanse, por ejemplo, Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5.a edicion, Parte A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, Pafses Bajos, (1998); Poole, C. F. y Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); o Ausubel, F. M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1990).

En un modo de realizacion, la inmunoglobulina recuperada se caracteriza por la cantidad de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5 con respecto a la cantidad de una poblacion, que es la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5 es, en un modo de realizacion, un 10 % o menos de la poblacion, en otro modo de realizacion, un 8 % o menos de la poblacion, y en otro modo de realizacion, un 6 % o menos de la poblacion.

El procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar, en ciertos modos de realizacion, como cultivo continuo, como cultivo semicontinuo o como combinacion de los mismos, por ejemplo, empezando

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como cultivo semicontinuo con paso posterior a un cultivo continuo. Adicionalmente, el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, en un modo de realizacion, antes del cultivo en condiciones con un valor de DGL inferior a 1,0, es decir, por ejemplo, en condiciones en las que la cantidad disponible de glucosa es de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula en el cultivo por unidad de tiempo, el cultivo es con un exceso de glucosa, es decir, un valor de DGL de 1,0. En otro modo de realizacion, el cultivo se inicia con una cantidad de glucosa igual a la contenida en medios de cultivo estandar, por ejemplo, entre 1 y 10 g/l de medio de cultivo, por ejemplo, para obtener una densidad celular predeterminada, por ejemplo, en un modo de realizacion, de 105 celulas/ml. En otro modo de realizacion, el inicio del cultivo es en presencia de una cantidad en exceso de glucosa, es decir, un DGL de 1,0, y se anade una cantidad de glucosa por unidad de tiempo, que es de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por unidad de tiempo por las celulas en el cultivo. En otro modo de realizacion, la alimentacion empieza una vez la cantidad de glucosa presente en el medio de cultivo ha disminuido a o por debajo de un valor prefijado en el cultivo. En los dos ultimos casos, la cantidad de glucosa disponible en el cultivo se reduce por el metabolismo de las celulas en el cultivo.

En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que esta disponible o se anade por unidad de tiempo y que es inferior a la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo, se mantiene al mismo valor, es decir, constante, en el procedimiento, como se informa en el presente documento. Por ejemplo, si esta disponible una cantidad de un 50 % de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por unidad de tiempo, esta cantidad esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza una alimentacion de glucosa limitada. Tiene que senalarse que este valor es un valor relativo. Sin embargo, segun cambia la densidad de celulas viables durante el cultivo (es decir, aumenta al principio, alcanza un maximo y disminuye despues de esto otra vez), cambia en consecuencia la cantidad absoluta de glucosa disponible, ya que es un valor relativo que depende de la densidad de celulas viables absoluta. Como el valor relativo se mantiene constante (es decir, por ejemplo, a un 80 %), pero cambia el valor de referencia absoluto (es decir, por ejemplo, aumentando la densidad de celulas viables), tambien cambia el valor absoluto relativo (es decir, tambien esta aumentando el 80 % de un valor creciente).

La expresion "por unidad de tiempo" indica un intervalo fijo de tiempo, tal como 1 minuto, 1 hora, 6 horas, 12 horas o 24 horas. En un modo de realizacion, la unidad de tiempo es 12 horas o 24 horas. La expresion "cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo", como se usa dentro de la presente solicitud, indica la suma de 1) la cantidad de glucosa contenida en el medio de cultivo de un cultivo al principio de un intervalo de tiempo fijo y 2) la cantidad de glucosa anadida, es decir, alimentada, durante la unidad de tiempo. Por tanto, se anade una cantidad de glucosa al medio de cultivo celular, por ejemplo, al recipiente de cultivo, lo que aumenta la cantidad de glucosa en el medio de cultivo al principio del intervalo de tiempo fijo a la cantidad predeterminada. Esta cantidad de glucosa se puede anadir, por ejemplo, como un solido, disuelta en agua, disuelta en un tampon o disuelta en un medio nutritivo, por lo que el agua y el tampon no deben contener glucosa. La cantidad de glucosa que va a anadirse se corresponde con la cantidad de glucosa que va a estar disponible reducida por la cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente de cultivo. El procedimiento de anadir la cantidad de glucosa se puede realizar como una unica adicion y tambien como una adicion multiple de pequenas fracciones iguales, o como una adicion continua durante una unidad de tiempo como se describe anteriormente.

El procedimiento, como se informa en el presente documento, es adecuado para cualquier tipo de cultivo y cualquier escala de cultivo. Por ejemplo, en un modo de realizacion, el procedimiento se usa para procedimientos continuos o semicontinuos; en otro modo de realizacion, el volumen de cultivo es de 100 ml a 50.000 l, en otro modo de realizacion de 100 l a 10.000 l. El procedimiento, como se informa en el presente documento, es util para la produccion de inmunoglobulinas con un 10 % o menos, o un 8 % o menos, o un 6 % o menos de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5. En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina G o E. El procedimiento, como se informa en el presente documento, comprende una celula eucariota, en la que la celula comprende, a su vez, un acido nucleico que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma y un acido nucleico que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. La celula eucariota se selecciona, en un modo de realizacion, de celulas CHO, celulas NS0, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas Sp2/0, celulas HEK y celulas de insecto.

Un experto en la tecnica esta familiarizado con composiciones y componentes de medios, ademas de con concentraciones de nutrientes requeridas por diferentes celulas para el crecimiento optimo, ademas de la cantidad de glucosa, y elegira un medio apropiado para el cultivo de la celula (vease, por ejemplo, Mather, J.P., et al., en Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2 (1999) 777-785).

En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que tiene que estar disponible para las celulas en un cultivo de acuerdo con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se calcula multiplicando la densidad de celulas viables, que se puede lograr normalmente en el recipiente de cultivo en un cierto momento temporal del cultivo, con el volumen del recipiente de cultivo y la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por las celulas en crecimiento exponencial por unidad de tiempo y por el DGL previsto. En mas detalle, del transcurso de la concentracion de glucosa en el cultivo y el transcurso de la densidad celular en el cultivo antes del momento temporal exacto se predice el transcurso futuro de la concentracion de glucosa y la densidad celular. Con esta

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prediccion se calcula la cantidad de glucosa que tiene que anadirse al cultivo para lograr el DGL previsto, con la siguiente formula:

(glucosa que se va a anadir [pg de glucosa/ml/h]) =

(densidad celular existente [celulas/ml]) x

(tasa maxima de consumo de glucosa de la celula [pg de glucosa/celula/h]) x (valor de DGL) -

cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente de cultivo.

En un modo de realizacion, el valor de pH del cultivo esta entre pH 6,5 y pH 7,8. En otro modo de realizacion, el valor de pH esta entre pH 6,9 y pH 7,3. En otro modo de realizacion, el valor de pH esta entre pH 7,0 y 7,2. Se ha encontrado, como se expone brevemente en el ejemplo 1 que, en combinacion con una alimentacion de glucosa limitada con un valor de pH de 7,0 en el procedimiento de alimentacion constante, el contenido de M5 se puede regular de manera eficaz a valores definidos, es decir, inferiores a un 8 %, en comparacion con un valor de pH de 7,2. En los cultivos en el procedimiento semicontinuo a valores de pH de 7,0 o 7,2, respectivamente, se encontro que con el procedimiento de control de DGL el contenido de M5 podrfa regularse para ser inferior a un 5,5 %. Se ha encontrado que con una reduccion del valor de pH del cultivo se puede recorrer un aumento de la cantidad de M5 debido a la reduccion del valor de DGL.

El cultivo se realiza, en un modo de realizacion, a una temperatura entre 27 °C y 39 °C, en otro modo de realizacion, entre 35 °C y 37,5 °C.

Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede producir cualquier polipeptido que contiene una glucoestructura, tal como inmunoglobulinas, interferones, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, activador de plasminogeno, eritropoyetina y similares.

El cultivo en el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar usando cualquier dispositivo de cultivo agitado o removido para el cultivo de celulas de mamffero, por ejemplo, un dispositivo de cultivo en tanque de tipo fermentador, un dispositivo de cultivo de tipo columna de aire, un dispositivo de cultivo de tipo matraz de cultivo, un dispositivo de cultivo de tipo matraz de agitacion, un dispositivo de cultivo de tipo microportador, un dispositivo de cultivo de tipo lecho fluidizado, un dispositivo de cultivo de tipo fibra hueca, un dispositivo de cultivo de tipo botella rotatoria o un dispositivo de cultivo de tipo lecho compacto.

El procedimiento, como se informa en el presente documento, se realiza, en un modo de realizacion, durante hasta 15 dfas. En otro modo de realizacion, el cultivo es durante 6 a 15 dfas. En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.

El procedimiento, como se informa en el presente documento, se ejemplifica con un anticuerpo contra el receptor de interleucina-6 humana como se informa, por ejemplo, en los documentos EP 0 409 607, EP 0 628 639, US 5.670.373 o US 5.795.965 (incorporados por la presente por referencia en su totalidad) ya que este anticuerpo y la lfnea celular que lo expresa estaban disponibles en una cantidad suficiente en el laboratorio de los presentes inventores en el momento de la invencion. Esto no pretende limitar el alcance de la invencion.

Los siguientes ejemplos y figuras estan disponibles para ayudar en el entendimiento de la presente invencion, cuyo alcance verdadero se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripcion de las figuras

Figura 1 Densidad de celulas viables (a) y perfiles de viabilidad celular (b) en el modo semicontinuo usando el control de DGL; cfrculo blanco: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo relleno: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado blanco: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.

Figura 2 Transcursos de tiempo de DGL en el modo semicontinuo en la produccion de inmunoglobulina; cfrculo: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.

Figura 3 Perfiles de alimentacion basados en DGL por el modo semicontinuo en la produccion de inmunoglobulina; cfrculos: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.

Figura 4 Perfiles de produccion de inmunoglobulina por el modo semicontinuo en el control de DGL; cfrculos blancos: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo relleno: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado blanco: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml; cfrculo pequeno relleno: procedimiento de alimentacion constante: FR = 0,02 g de glucosa/h (control)

Figura 5 Transcurso de tiempo de DGL durante un cultivo semicontinuo de una celula: rombo: alimentacion diaria de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

alimentacion unica, cuadrado: alimentacion diaria de alimentacion doble; triangulo: alimentacion de perfil de alimentacion unica; X: alimentacion de perfil de alimentacion doble.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Linea celular:

Una linea celular CHO a modo de ejemplo en la que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 de una inmunoglobulina producida de forma recombinante se puede modificar es una linea celular CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de acuerdo con los documentos EP 0 409 607 y US 5.795.965. Para el cultivo de la celula CHO recombinante se puede usar cualquier medio de cultivo, siempre que se pueda realizar la suplementacion de glucosa de acuerdo con el procedimiento de la invencion. Los medios de cultivo a modo de ejemplo son IMDM, DMEM o medio F12 de Ham o combinaciones de los mismos, que se han adaptado al procedimiento, como se informa en el presente documento, en la medida en que se adopten las proporciones de masa de los componentes del medio de cultivo con respecto a la glucosa. Asimismo, es posible excluir la glucosa del medio de cultivo y anadirla al cultivo por separado.

Cultivo:

Se cultivaron celulas CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-6R en un recipiente de fermentacion de 1 l o 2 l. El medio de alimentacion contenfa de 15 a 40 g/l de glucosa. La glucosa se podrfa alimentar con una solucion concentrada separada que contiene, por ejemplo, 400 g/l de glucosa. El cultivo se realizo a un valor de pH en el intervalo de pH 7,0 a pH 7,2.

Determinacion de la glucoestructura:

Para el analisis del patron de glucosilacion de IgG se uso un procedimiento de acuerdo con Kondo et al. (Kondo, A., et al., Agric. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170). La IgG se purifico del sobrenadante centrifugado del medio de cultivo usando una columna de protefna A a pequena escala. El oligosacarido de la IgG purificada se libero usando N-glucosidasa F (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se marco con 2-aminopiridina en el extremo reductor. El oligosacarido marcado se analizo por cromatograffa de fase inversa (HPLC). Cada pico se asigno tanto por espectrometrfa de masas como por estandares para los oligosacaridos.

Determinacion de glucosa:

La concentracion de glucosa se determino usando un analizador YSI 2700 SELECT™ (YSI, Yellow Springs, OH, EE. UU.) con un procedimiento de acuerdo con el manual del fabricante.

Determinacion de la densidad de celulas viables:

Se determino la densidad de celulas viables usando un sistema automatico de procesamiento y analisis de imagenes (CEDEX®; Innovatis, Alemania) y el procedimiento de exclusion con colorante azul de tripano.

Ejemplo 1

Efectos del control de DGL y el pH sobre la produccion de anticuerpos y el contenido de glucoestructura de manosa-5 (M5)

Se realizo una prueba usando una cepa de celulas CHO que produce anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 humana (Tocilizumab, RoACTEMRA®), que se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 2 de referencia de la publicacion de patente sin examinar japonesa n.° 99902/1996 usando el promotor del factor de elongacion humano la, como se informa en el ejemplo 10 de la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759 (correspondiente a los documentos US 5.795.965, US 5.817.790 y US 7.479.543).

En el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante, se observaron los efectos de control del pH sobre la produccion de inmunoglobulina. La tabla 2 muestra los efectos de control del pH sobre la produccion de oligosacaridos de anticuerpo y el contenido de M5 en el modo de alimentacion constante.

Tabla 2: Efectos de control del pH en el modo de ^ alimentacion de cantidad absoluta constante.

N.°

Muestra en [el dfa] Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%]

1

7 7,0 0,80-0,45 90,1 3,6

2

7 7,0 0,49-0,21 100 5,4

5

10

15

20

25

30

35

N.°

Muestra en Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de Contenido de M5

[el dfa]

anticuerpo [%] [%]

3

7 7,2 0,73-0,35 135,1 11,7

4

7 7,2 0,69-0,30 120 10,8

5

7 7,2 0,35-0,29 127 25,2

6

7 7,2 0,64-0,25 122,5 8,7

A pH 7,0, la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 (M5) se regulo a menos de un 5,5 %. El valor de DGL disminuyo de 0,80 a 0,21 debido al cambio de densidad celular. Por otra parte, a pH 7,2, la cantidad de M5 fluctuo entre un 8,7 % y un 25,2 % y fue superior que a pH 7,0. El valor de DGL a pH 7,2 vario de 0,73 a 0,25. Ademas, en este caso, la produccion de inmunoglobulina a pH 7,2 fue superior a un 120 % (valor relativo en comparacion con pH 7,0). Una produccion mas alta de inmunoglobulina en el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante induce un contenido de M5 mas alto de mas de un 8 %. Por tanto, con un control de pH 7,0 en el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante, el contenido de M5 se podrfa regular de forma eficaz a valores mas bajos, es decir, inferiores a un 8 %, en comparacion con el procedimiento de control a pH 7,2.

El procedimiento de control de DGL (= procedimiento de alimentacion de cantidad relativa constante) tambien se uso para la produccion de inmunoglobulina por modo semicontinuo a diversos valores de pH, y se analizo el contenido de M5. La tabla 3 muestra los efectos del control de DGL despues del inicio de la alimentacion en el dfa 2-3 y del pH sobre la produccion de inmunoglobulina y el contenido de M5.

Tabla 3: Efectos del control de DGL y del pH en el modo semicontinuo.

N.°

Muestra en [el dfa] Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%]

1

7 7,0 0,8 102,7 2,9

2

7 7,0 0,6 96,2 2,7

3

7 7,0 0,4 100,0 3,3

4

7 7,0 0,3 91,1 3,9

5

7 7,0 0,2 83,0 4,0

6

7 7,2 0,6 100,9 4,4

7

7

7,2 0,4 90,1 5,3

A pH 7,0, se aplico el procedimiento de control de DGL en el intervalo de un DGL de 0,2 a 0,8. Como resultado, el contenido de M5 se regulo para ser igual o inferior a un 4,0 %. Por otra parte, a pH 7,2, el valor de DGL funciono en el intervalo de 0,4 a 0,6. En esta ocasion, el contenido de M5 se podrfa controlar para ser inferior a un 5,5 %.

Ejemplo 2

Cultivo con diferentes valores de DGL

Se realizo el cultivo de una celula CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R con diferentes valores de DGL. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 4.

Tabla 4: Efectos del valor de control DGL sobre la produccion de inmunoglobulina y el contenido de M5.

N.°

Muestra en [el dfa] DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%] Contenido de G(0) [%] Contenido de G(1) [%] Contenido de G(2) [%]

1

7 0,6-0,5 107,3 3,5 38,4 46,7 11,4

2

7 0,4 111,0 3,5 38,8 46,9 10,8

3

7 0,2 111,5 4,5 40,1 45,2 10,1

4

8 alimentacion constante 100,0 5,9 43,8 42,0 8,3

En comparacion con una alimentacion constante, la estrategia de DGL controlado con un valor de DGL de 0,4 a 0,6 muestra un contenido de manosa-5 reducido.

Ejemplo 3

Cultivo con diferentes estrategias de alimentacion

El cultivo de una celula CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R se realizo con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

un valor de DGL, pero con diferentes estrategias de alimentacion. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 5.

Tabla 5: Efectos de la estrategia de alimentacion sobre la viabilidad y densidad de celulas viables.

N.°

Muestra despues de [h] DGL Alimentacion Ajuste Viabilidad [%] Densidad de celulas viables [x 106 celulas/ml]

1

112 0,4 unica diario 71 5,1

2

115 0,4 doble diario 75 5,8

3

115 0,4 unica perfil 73 4,9

4

115 0,4 doble perfil 70 5,1

En los experimentos de alimentacion unica se uso una unica alimentacion que contenfa todos los nutrientes y glucosa. En los experimentos de alimentacion doble se usaron dos alimentaciones: la primera alimentacion contiene todos los nutrientes y glucosa a una baja concentracion de 15 g/l y la segunda alimentacion contiene una alta concentracion de glucosa. Estos experimentos de alimentacion diferentes se realizaron en un conjunto con un ajuste diario de la tasa de alimentacion y en otro conjunto siguiendo un perfil predeterminado basado en el registro del desarrollo de densidad de celulas viables en cultivos anteriores. Como se puede apreciar de la tabla 5, la viabilidad y la densidad de celulas viables son comparables independientemente de la estrategia de alimentacion empleada.

Ejemplo 4

Control del grado de limitacion de glucosa (DGL) para la produccion de inmunoglobulina por el modo semicontinuo

Se inocularon celulas CHO (8,0 - 12 x 105 celulas/ml) en medio de cultivo libre de suero como se describe anteriormente. Las celulas se cultivaron a 37 °C, 98 % de humedad relativa y 10 % de atmosfera de CO2. En el cultivo semicontinuo, el medio de alimentacion que contenfa glucosa se empezo a alimentar al fermentador principal en el 2.° y 3.° dfa desde el inicio del cultivo. La estrategia de alimentacion siguio el procedimiento para controlar el grado de limitacion de glucosa (DGL) de acuerdo con la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2006/0127975 A1. El DGL se puede definir como la proporcion de la tasa de consumo de glucosa especffica observada con respecto a la tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida cuando la glucosa esta disponible libremente para estas celulas (DGL = Q(glc)/Q(glc)max, en el que Q(glc) = tasa de consumo de glucosa especffica existente observada; Q(glc)max = tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida para estas celulas).

La figura 1 muestra la densidad de celulas viables y los perfiles de viabilidad celular del cultivo. El DGL se controlo para estar a un valor de 0,4 - 0,5 en diversas densidades celulares como se muestra en la figura 2. Las tasas de alimentacion se cambiaron una vez o dos veces al dfa dependiendo de la densidad celular en ese momento. La figura 3 muestra los perfiles de alimentacion basados en el DGL por el modo semicontinuo. La tasa de alimentacion se cambio entre 0,8 y 1,6 ml/h dependiendo de la densidad celular. Con esta estrategia de alimentacion aplicada, se obtuvo un perfil de produccion de inmunoglobulinas como se muestra en la figura 4. Usando el tamano de inoculacion de 10 x 105 celulas/ml y 12 x 105 celulas/ml, la produccion de inmunoglobulina fue casi la misma y superior a un 120 % de la produccion de inmunoglobulina en el procedimiento de alimentacion constante en el dfa siete como se muestra en la tabla 6 (tasa de alimentacion de 0,02 g de glucosa/h). A pesar de la diferencia de un 20 % en las densidades celulares iniciales, con el procedimiento de control de DGL fue posible obtener un tftulo de inmunoglobulina aproximadamente equivalente. Ademas, cuando el tamano de inoculacion se fijo a 8,0 x 105 celulas/ml, a pesar del retardo de 20 horas desde el momento del inicio de la alimentacion, la inmunoglobulina obtenida fue superior a un 110 % (valor relativo) en el dfa siete. En estos resultados, el procedimiento de control de DGL podrfa alcanzar una produccion de inmunoglobulina estable a diversos tamanos de inoculacion.

Ejemplo 5

Los efectos del control de DGL sobre la glucoestructura de manosa-5 y la galactosilacion de oligosacaridos

De la inmunoglobulina producida por cultivo semicontinuo usando el control de DGL, se analizo el patron de glucosilacion. La tabla 6 muestra el resultado del analisis de oligosacaridos para la inmunoglobulina obtenida del cultivo semicontinuo controlado por DGL en comparacion con el procedimiento de alimentacion constante (tasa de alimentacion: 0,02 g de glucosa/h). Al tamano de inoculacion de 8,0 x 105 celulas/ml, el contenido de glucoestructura de manosa-5 (M5) fue de un 2,8 %. Al tamano de inoculacion de 10 x 105 celulas/ml y 12 x 105 celulas/ml, el contenido de M5 fue de un 4,1 % y 3,8 %, respectivamente. A todas las condiciones de cultivo, el procedimiento de control de DGL fue capaz de regular el contenido de M5 a menos de un 5,0 %.

Mientras tanto, en cada condicion, la isoforma G(0) de la inmunoglobulina y la isoforma G(2) de la inmunoglobulina se controlaron al intervalo de un 40 % a un 46 % y de un 9,0 % a un 11 %, respectivamente.

Tabla 6: Efectos del valor de control de DGL sobre la produccion de inmunoglobulina y el patron de glucosilacion.

N.°

Muestra en [el dfa] DGL Densidad celular de inoculacion [x 105 celulas/ml] Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%] Contenido de G(0) [%] Contenido de G(1) [%] Contenido de G(2) [%]

1

7 alimentacion constante 10 100,0 3,5 45,7 41,5 9,2

2

7 0,4 8 112,5 2,8 41,7 44,7 10,8

3

7 0,4 10 122,6 4,1 42,9 43,1 9,8

4

7 0,4 12 127,1 3,8 45,5 41,5 9,1

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina, que comprende

   a) cultivar una celula eucariota que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor constante inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podrfa utilizar como maximo por las celulas en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa limitada, y

   b) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.
2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el cultivo es un cultivo semicontinuo.
3. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado por que el cultivo es un cultivo semicontinuo en el que la alimentacion empieza en el dfa 2 o dfa 3 del cultivo.
4. 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,5 a 7,5.
5. 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,9 a 7,3.
6. 6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,95 a pH 7,05 o a un valor de pH de pH 7,15 a pH 7,25.
7. 7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de clase G o clase E.
8. 8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la celula huesped eucariota se selecciona del grupo que comprende celulas CHO, celulas NS0, celulas HEK, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas de insecto y celulas Sp2/0.
9. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, caracterizado por que la celula eucariota es una celula de ovario de hamster chino (CHO).
10. 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el cultivo de la celula huesped se realiza durante seis a veinte dfas.
11. 11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.