ES2646413T3 - Detección y recuento de microorganismos - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar y hacer el recuento de microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos, en el que la muestra se obtiene a partir de cualquiera del grupo seleccionado entre aguas de refrigeración industrial, aguas potables, y aguas naturales, que comprende (1) Poner en contacto dichos microorganismos de dicha muestra con compuestos de reparación y un medio de crecimiento, (2) Incubar el producto de las etapas (1), y (3) Detectar y cuantificar dichos microorganismos viables, en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila, y en el que los compuestos de reparación comprenden (a) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de serina; (b) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de treonina; (c) un compuesto que contiene iones de calcio a una dosis de 10-6 a 10-2 mM; (d) un compuesto que contiene iones de magnesio a una dosis de 10-6 a 10-2 mM; (e) un compuesto que contiene iones de potasio. (f) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de ácido glutámico o una sal del mismo; y (g) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de ácido pirúvico o sal del mismo.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion y recuento de microorganismos
La presente invencion se refiere a un metodo para detectar y hacer un recuento de microorganismos viables de las especies de Legionella pneumophila en una muestra. La divulgacion tambien incluye un kit adecuado para su uso en un metodo de este tipo. Este metodo y kit permiten la cuantificacion de microorganismos viables de una forma mas rapida.
Las bacterias de Legionella son estan extendidas en entornos humedos o humedecidos tales como suelo y habitats acuaticos no marinos. Tambien se pueden encontrar en instalaciones de agua caliente y frla, torres de refrigeracion de sistemas de aire acondicionado y humidificador es de agua.
La Legionella, especialmente Legionella pneumophila, son agentes patogenos que pueden producir una neumonla bacteriana aguda, conocida generalmente como "enfermedad del legionario", que a menudo es letal para los individuos infectados.
Tradicionalmente la deteccion y recuento de Legionella pneumophila se consiguen mediante cultivo celular. Este metodo se puede conseguir midiendo las bacterias cultivables usando recuento de placas o medicion de microcolonias empleando un metodo de membrana de filtro. Estas tecnicas evaluan las bacterias viables por su capacidad para formar una colonia o microcolonia. Desafortunadamente, los metodos de este tipo por lo general requieren entre 3 y 10 dlas para permitir la formacion de colonias o microcolonias. En lugares en los que las instalaciones de agua aun estan en funcionamiento existe un riesgo inaceptable de infeccion humana durante este tiempo.
Otros metodos para detectar los microorganismos totales de Legionella incluyen tecnicas de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa). La PCR emplea ADN polimerasa para amplificar un trozo de ADN mediante replicacion enzimatica in vitro. Durante el desarrollo de la tecnica, el ADN generado se usa como molde para la replicacion que provoca una reaccion en cadena en la que el mol de de ADN se amplifica de manera exponencial. La PCR permite que una o varias copias de un trozo de ADN se amplifiquen generando millones o mas copias del trozo de aDn. Por lo general, un metodo de este tipo es descrito por Diederen et al., J Med Microbiol. Enero de 2007; 56 (Pt 1): 94-101.
Sin embargo, un inconveniente de la PCR es que las muestras tienden a contener inhibidores de la reaccion de polimerizacion y, por lo tanto, no proporcionan resultados cuantitativos de forma coherente. Ademas, la tecnica se basa en una etapa previa de purificacion del ADN que puede dar como resultado la perdida de ADN con la consiguiente subestimacion de la Legionella presente. Hasta cierto punto, estas desventajas se superan mediante PCR en tiempo real que es cuantitativa. Sin embargo, la tecnica no puede distinguir entre celulas viables y celulas no viables.
Otra tecnica es la hibridacion fluorescente in situ (FISH) en la que una sonda oligonucleotldica etiquetada con una sustancia fluorescente penetra en las celulas bacterianas. Cuando los acidos nucleicos ribosomicos (ARNr) tienen la secuencia correcta para la sonda conocida como diana, la sonda se unira por si misma a su diana y no se eliminara mediante ninguna etapa de lavado posterior. A continuacion las bacterias en las que se fija la sonda emitiran una senal fluorescente. Esta senal fluorescente se puede cuantificar posteriormente mediante tecnicas tales como la citometrla de flujo, citometrla en fase solida, o microscopla epifluorescente. Una tecnica habitual de FISH es descrita por Dutil S et al., J Appl Microbiol. Mayo de 2006; 100 (5): 955-63. Sin embargo, usando la tecnica FISH solo se pudo detectar el Indice total de Legionella pneumophila viable pero desafortunadamente el metodo no pudo identificar exclusivamente a las bacterias de Legionella pneumophila capaces de dividirse y, en consecuencia, crear una colonia.
Un metodo adicional para hacer un recuento de Legionella pneumophila viable implica Chem-Chrome V6 y es descrito por Delgado-Viscogliosi et al., Appl Environ Microbiol. Julio de 2005; 71 (7): 4086-96. Este metodo permite la cuantificacion de Legionella pneumophila, as! como la diferenciacion entre bacterias viables y no viables. Combina la deteccion especlfica de celulas de Legionella usando anticuerpos y un marcador de viabilidad bacteriana (Chem- Chrome V6) y empleando microscopla epifluorescente para el recuento. Sin embargo, aunque esta tecnica distingue entre celulas viables y no viables, no es capaz de identificar por separado esas bacterias formadoras de colonias.
El documento US 20070218522 describe metodos y composiciones para detectar y cuantificar Legionella viable y otras bacterias aerobias heterotrofas. El metodo incluye el uso de deslizamientos de portaobjetos de inmersion que incluyen un medio absorbente, sustancias promotoras del crecimiento y selectivas del crecimiento para la deteccion y cuantificacion rapidas de microcolonias de Legionella. Esta tecnica podrla no hacer el recuento de las bacterias danadas.
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El documento EP 1329515 se refiere a un metodo para someter a ensayo la presencia de microorganismos en un entorno gaseoso que comprende peroxido de hidrogeno poniendo el entorno gaseoso en contacto con un medio de crecimiento de agar que comprende una sal de acido piruvico y que permite el desarrollo de colonias de los microorganismos.
En general se considera que las tecnicas que implican el crecimiento de colonias en un medio de crecimiento, tal como una placa de agar con nutrientes son mas precisas. En consecuencia, el metodo de recuento de placas sigue siendo la eleccion preferida del metodo para obtener el recuento viable total. Por lo general esto significa la aplicacion de una muestra de la que se sospecha que contiene el microorganismo en una placa que contiene una fuente de nutriente solido o medio de crecimiento. Por lo general una tecnica de este tipo se denomina siembra en placas. Por recuento viable total los inventores hacen referencia al Indice total de bacterias capaces de producir una poblacion discernible por el observador. Por lo general esto hara referencia a una colonia visible en la superficie de un medio de crecimiento tal como una placa de agar con nutrientes.
Sin embargo, los microorganismos tales como Legionella pneumophila en el medio pueden estar sujetos a una o mas tensiones que evitan que el microorganismo crezca y se multiplique en su situacion ambiental. Los microorganismos estresados de este tipo no se podrlan dividir en absoluto mi podrlan formar una colonia visible en condiciones de cultivo normales. En el medio, una proporcion de celulas de microorganismos por lo general se estresaran debido a las condiciones ambientales, tales como inanicion, presencia de biocidas, choque termico y desecacion. Ademas, estas celulas pueden estar en un estado fisiologico vulnerable en el que la tecnica de siembra en placas de los microorganismos puede empeorar el estres de las celulas de los microorganismos ya estresados debido a la presencia de oxlgeno atmosferico. Ademas, esto podrla conducir a la muerte de las bacterias estresadas producida por cualquier circunstancia, lo que conduce a una subestimacion del recuento total viable.
Ademas, la subestimacion del metodo viable de siembra en placas de Legionella pneumophila podrla llegar a ser peligrosa en cuanto a su patogenicidad.
Desde la decada de 1970, se ha informado que los neutralizadores de especies reactivas de oxlgeno (ROS) se deberlan usar para limitar el efecto del estres oxidativo durante el proceso de siembra en placas. Esto fue informado por Speck et al., enumeration of injured coliforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975); Martin et al., Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 (1976); Brewer et al., Beneficial effects of catalase or pyruvate in a most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonald et al., Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983); Marthi et al.) Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991); Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992); y Dukan et al., Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999).
Sin embargo, en todos los casos mencionados, los inventores de la presente invencion creen que las ROS se podrlan reducir mediante una ruta directa en la que el compuesto reacciona de forma qulmica con ROS.
Berube et al., "Rapid detection and identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay", Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641 describe la deteccion e identificacion de Legionella pneumophila mediante un ensayo de inmunotransferencia usando un anticuerpo monoclonal. No se proporciona ningun medio para tratar el problema de las bacterias lesionadas.
Un artlculo de Pine et al., (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986)) describe la necesidad de la adicion de cetoacidos y la reduccion de enzima neutralizante de oxlgeno reducido para optimizar el crecimiento de Legionella pneumophila y sugerla el uso de estos materiales en el medio usado para el recuento estandar de este microorganismo.
Sin embargo, el uso de cetoacidos y enzima neutralizante de oxlgeno reducido solo es insuficiente para reparar las celulas estresadas de Legionella pneumophila a reparar y permitir un recuento precisa. Esto es especialmente as! cuando se usa un medio de crecimiento especlfico para Legionella pneumophila, tal como el medio de crecimiento tamponado con carbon vegetal y extracto de levadura (BCYE). De hecho, no hay datos disponibles sobre la optimizacion de un medio estandar util para el recuento preciso de Legionella pneumophila.
El documento WO 2009 121726 describe un metodo para detectar y hacer el recuento de microorganismos viables de Legionella pneumophila en una muestra poniendo en contacto los microorganismos con al menos un compuesto de reparacion y un medio de crecimiento seguido de las etapas de incubacion y deteccion y cuantificacion de microorganismos viables. El compuesto de reparacion causa directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para reducir el estres oxidativo del microorganismo. Existen sugerencias de compuestos de reparacion incluyendo piruvato y acido glicolico. El metodo proporciona un medio excelente para hacer el recuento de Legionella
pneumophila viable de forma mas precisa en un lapso de tiempo mas corto que los metodos anteriores.
Sin embargo, seria deseable proporcionar un metodo mejorado para hacer el recuento viable de Legionella pneumophila incluso de forma mas precisa e incluso de forma mas rapida. Ademas, tambien podria ser deseable conseguir esto a traves de un espectro mas amplio de cepas de Legionella pneumophila.
5 Por lo tanto de acuerdo con la presente invention los inventores proporcionan un metodo para detectar y hacer un recuento de microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos, en el que la muestra se obtiene a partir de cualquiera del grupo seleccionado entre aguas de refrigeration industrial, aguas potables, y aguas naturales, que comprende
(1) Poner en contacto dichos microorganismos de dicha muestra con compuestos de reparation y un medio de 10 crecimiento,
(2) Incubar el producto de las etapas (1), y
(3) Detectar y cuantificar dichos microorganismos viables,
en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila, y en el que los compuestos de reparacion comprenden
15 (a) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de serina;
(b) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de treonina;
(c) un compuesto que contiene iones de calcio a una dosis de 10'6 a 10'2 mM;
(d) un compuesto que contiene iones de magnesio a una dosis de 10'6 a 10'2 mM;
(e) un compuesto que contiene iones de potasio.
20 (f) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de acido glutamico o una sal del mismo,
y
(g) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de acido piruvico o sal del mismo.
Los inventores han encontrado que el uso de estos compuestos en conjunto con compuestos de reparacion en el presente metodo reduce de forma significativa el periodo de latencia de los micro organismos de Legionella 25 pneumophila. De hecho. Los inventores han encontrado que esto se consigue a traves de un amplio espectro de cepas de Legionella pneumophila.
Sin quedar limitado a la teoria, se cree que la combination de piruvato, glutamato y las concentraciones especificas de calcio e iones de magnesio que provocan un efecto beneficioso en la elimination o en la reduction del estres oxidativo directa o indirectamente y se cree que los iones de potasio disminuyen el shock osmotico mientras que la 30 serina y la treonina aumentan el metabolismo. Se cree que esta combinacion especial de compuestos de reparacion proporciona una mejora sinergica de la eliminacion o reduccion del estres oxidativo, una disminucion del shock osmotico y un aumento del metabolismo consiguiendo de ese modo los objetivos de la presente invencion.
En la invencion la dosis deseada de serina o treonina esta entre un 0,1 % y un 1 % basandose en el peso del compuesto de reparacion por volumen de muestra.
35 El acido glutamico (o sal del mismo) y/o acido piruvico (o sal del mismo) se usan a una dosis deseada entre un 0,1 % y un 1 % basandose en el peso del compuesto de reparacion por volumen de muestra.
Cada uno de los compuestos que contienen los iones de calcio, iones de magnesio o iones de potasio puede ser cualquier sal adecuada. De forma deseable estos deberian ser solubles en agua al menos lo suficiente como para permitir la dosis requerida. Las sales pueden tener cualquier contraion adecuado. En cualquier caso, el experto en la 40 materia podria observar que los contraiones no deberian ser toxinas conocidas para microorganismos tales como Legionella pneumophila. Por lo general, los contraiones incluiran, pero no se limitaran, cloruro, sulfato, nitrato, etc.
Como se ha indicado anteriormente, cuando el compuesto contiene iones de calcio, este se deberia usar a una dosis de 10'6 mM a 10'2 mM, preferentemente este deberia estar dentro del intervalo de 10'5 mM a 10'3 mM, mas
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preferentemente de 5 x 10'4 mM a 5 x 10'3 mM, especialmente aproximadamente 10'4 mM. Con respecto a un compuesto que contiene iones de magnesio, como se ha indicado anteriormente, la dosis deberla ser de 10'6 mM a 10'2 mM, preferentemente esta deberla estar en el intervalo de 10'5 mM a 10'3 mM, mas preferentemente de 5 x 104 mM a 5 x 10'3 mM, especialmente aproximadamente 10'4 mM.
De forma deseable, el compuesto de reparacion que contiene iones de potasio se deberla usar a una dosis que puede ser de 1 mM a 10'4 mM, por ejemplo entre 10'1 mM y 10'3 mM, mas preferentemente entre 5 x 10'1 mM y 5 x 10'2 mM, especialmente aproximadamente 10'2 mM.
Los compuestos de reparacion se usan en conjunto, lo que significa que se pueden usar de forma simultanea o de forma secuencial. Por forma secuencial los inventores hacen referencia a anadir cada compuesto sustancialmente uno detras del otro. Por forma simultanea, los inventores hacen referencia a anadir esos dos o mas compuestos de reparacion a la muestra al mismo tiempo. Tambien puede ser deseable combinar los dos o mas dos compuestos de reparacion en una formulacion y de ese modo anular las adiciones separadas de los compuestos de reparacion.
Los inventores creen que los compuestos de reparacion que contienen piruvato, glutamato, calcio y magnesio actuan directa o indirectamente en el metabolismo del microorganismo en un modo tal que reduce el estres oxidativo del microorganismo. De este modo, los inventores creen que los compuestos de reparacion que contienen piruvato, glutamato, calcio magnesio actuan de forma endogena en el microorganismo.
Por estres oxidativo los inventores hacen referencia a un desequilibrio entre la concentracion de ROS (production endogenetica o aduccion exogenica) y la capacidad de los microorganismos para purificar facilmente los compuestos intermedios reactivos o para preparar de forma eficaz el dano resultante.
Una alteration de este tipo de los procesos metabolicos normales del microorganismo puede producir efectos toxicos debidos a la formation de radicales libres y agentes oxidantes, tales como peroxidos, que pueden conducir al ano a los componentes de las celulas de los microorganismos, por ejemplo ADN, protelnas y llpidos.
Producir un efecto en el metabolismo del microorganismo hace referencia a desencadenar cambios en los procesos qulmicos internos naturales dentro de la celula del microorganismo.
La referencia a de forma endogena significa que se producen cambios dentro de la celula del microorganismo para reducir el estres oxidativo. Estos podrlan ser cambios, por ejemplo, en dos procesos metabolicos dentro del microorganismo. Tambien pueden incluir la elimination de ROS dentro de la celula del microorganismo.
Ademas, se cree que el piruvato, glutamato, iones de calcio e iones de magnesio pueden inhibir directa o indirectamente la formacion de y/o degradan las ROS. Un compuesto de este tipo que ejerce un efecto indirecto en las ROS puede hacer esto interfiriendo con el metabolismo del microorganismo. Se puede contemplar que una combination de compuestos de reparacion de este tipo reduce indirectamente las ROS por via endogena, por ejemplo durante la respiration aerobia.
Los compuestos de potasio ayudan a reducir el shock osmotico. Por shock osmotico los inventores hacen referencia al desequilibrio de la concentracion de soluto entre el entorno que rodea a una celula y el interior de la celula. Este desequilibrio produce un cambio rapido en el movimiento del agua a traves de la membrana celular y podrla conducir a dano celular. Las celulas lesionadas o las celulas alteradas son mucho mas sensibles al estres osmotico y podrlan perder la viabilidad debido a este tipo de estres.
Se cree que la serina y la treonina modifican el metabolismo del microorganismo. Con esto los inventores hacen referencia a que la serina y la treonina estan implicadas en una ruta metabolica que se cree que induce directa o indirectamente un aumento de la tasa metabolica en celulas que tienen un metabolismo limitado o reducido. Usando estas dos moleculas, las celulas fueron capaces de presentar un aumento del crecimiento.
De forma deseable, la combinacion de compuestos de reparacion mencionada anteriormente de acuerdo con la presente invention aumenta de forma sinergica la combinacion de ROS reductoras o de eliminacion, reduciendo el shock osmotico y aumentando el metabolismo. Esto es especialmente cierto para un espectro mas amplio de cepas de Legionella pneumophila que el que era posible anteriormente.
Los inventores han encontrado que el presente metodo induce la reparacion de celulas de Legionella pneumophila estresadas a traves de un espectro mas amplio de cepas de Legionella pneumophila y de este modo proporciona un recuento viable total mas preciso. De forma inesperada los inventores tambien han encontrado que el metodo reduce adicionalmente la cantidad de tiempo de incubation necesario. En general los inventores encuentran que el metodo puede reducir el tiempo de incubacion en muchas horas en algunos casos al menos uno o dos dlas.
De forma inesperada los inventores tambien han encontrado que el metodo de la invencion puede provocar una
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reduccion de microorganismo de interferencia, es decir, los microorganismos que son distintos a Legionella pneumophila.
El metodo de la presente invencion que de forma adecuada implica poner en contacto celulas estresadas del microorganismo Legionella pneumophila con una combinacion de los compuestos de reparacion de acuerdo con la presente invencion de forma deseable inhibe la formacion de y/o reduce y/o elimina las ROS y reduce el shock osmotico y mejora el metabolismo y esto tiende a inducir la reparacion de las celulas estresadas.
El microorganismo Legionella pneumophila se puede poner directamente en contacto con el compuesto de reparacion despues de la recogida de la muestra. Por lo tanto, el recipiente en el que la muestra de agua, de la que se cree que contiene el microorganismo, se recoge ya puede contener los compuestos de reparacion. Como alternativa una vez que se ha recogido una muestra de agua que contiene la Legionella pneumophila, esta se puede diluir con compuestos de reparacion que contienen agua de dilucion con fines de analisis. En una alternativa adicional, la muestra, que opcionalmente se ha diluido, se puede poner en contacto con el medio de crecimiento que contiene los compuestos de reparacion o los compuestos de reparacion se pueden aplicar despues de poner en contacto del microorganismo con el medio de crecimiento. Una vez que la muestra se ha recogido, puede ser deseable ponerla en almacenamiento hasta que sea conveniente realizar el metodo de acuerdo con la presente invencion. Puede ser deseable incorporar todos los compuestos de reparacion durante el almacenamiento.
Preferentemente, todos los compuestos de reparacion usados en conjunto de acuerdo con la presente invencion se deberlan poner en contacto con los microorganismos durante la etapa de dilucion o durante el almacenamiento de la muestra.
Una forma de la presente invencion implica de forma deseable poner en contacto dicha muestra con un medio de reparacion, preferentemente un medio de reparacion no selectivo, que contiene dicho compuesto de reparacion y a continuacion poner esto en contacto con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento selectivo. Preferentemente el medio de reparacion es un llquido y mas preferentemente un caldo de cultivo. Cuando el medio de reparacion es un llquido, este se denomina de forma adecuada metodo de reparacion llquido. Por lo general, en un metodo de reparacion llquido, la muestra se introduce en primer lugar en un medio llquido que contiene la combinacion de acuerdo con la presente invencion. De forma ideal, el metodo de reparacion llquido permite la reparacion de las bacterias estresadas en un medio llquido no selectivo. Preferentemente, el metodo de reparacion llquido usara un caldo de cultivo como medio llquido. En general el medio llquido que contiene los microorganismos Legionella pneumophila se transferira a continuacion a un medio de crecimiento. Los microorganismos estresados se podrlan haber reparado antes de la transferencia al medio de crecimiento o se podrlan reparar despues del contacto con el medio de crecimiento. Mas preferentemente el medio de crecimiento es un medio de crecimiento selectivo. Por lo general el medio llquido que contiene los microorganismos se sembrara en placas en una placa de medio de crecimiento selectivo tal como una placa de medio de crecimiento de agar selectivo.
En una forma preferente alternativa, la etapa (1) comprende poner en contacto dicha muestra con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento no selectivo que contiene dicha combinacion de compuestos de reparacion, y a continuacion poner esto en contacto con un medio de reparacion que tambien que contiene dicho compuesto de reparacion. Preferentemente el medio de reparacion es un medio de reparacion no selectivo, mas preferentemente un solido, y de forma particularmente preferente un medio de crecimiento de agar selectivo. Cuando el medio de reparacion es un solido este se podrla denominar metodo de reparacion solido. Por lo general el metodo de reparacion solido implicara poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento no selectivo que contiene la combinacion de compuestos de reparacion de acuerdo con la presente invencion. Posteriormente esto se puede poner en contacto con un medio de crecimiento selectivo que contiene el compuesto de reparacion o combinacion de compuestos de reparacion. En esta forma, los ingredientes selectivos y el compuesto o compuestos, lo que evita la formacion, reduce o elimina las ROS, se difundiran a traves del medio no selectivo. De forma deseable el medio de crecimiento no selectivo puede ser un medio de crecimiento de agar no selectivo. De forma adecuada, en esta forma, la muestra se puede sembrar en placas sobre cualquier agar no selectivo y a continuacion un medio de crecimiento de agar selectivo que contiene el compuesto o compuestos que evitan la formacion, reduce o elimina las ROS se reviste sobre el medio de crecimiento de agar no selectivo.
En una forma alternativa adicional, la muestra se puede aplicar a un medio de crecimiento selectivo que ya contiene la combinacion de compuestos de reparacion. Un medio de crecimiento selectivo de este tipo puede ser un medio de crecimiento de agar selectivo. La siembra en placas de la muestra se puede realizar como se ha descrito anteriormente.
En una forma alternativa adicional, la muestra se puede recoger del agua en forma de aerosol. Por lo general con el aerosol se puede localizar en una torre de refrigeration o acondicionador de aire. De forma deseable, el agua condensada del aerosol se puede recoger antes del ensayo de acuerdo con el metodo de la presente invencion. En una forma preferente alternativa, la etapa (1) comprende poner en contacto dicha muestra de aerosol con un medio de reparacion que contiene agua de dilucion, preferentemente un medio de reparacion no selectivo que contiene
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dicha combination de compuestos de reparation, y a continuation poner esto en contacto con un medio de crecimiento que tambien contiene dicha combinacion de compuestos de reparacion.
En todas las formas de la invention mencionadas anteriormente, en medio de crecimiento deberla ser adecuado para el crecimiento de Legionella pneumophila. En la bibliografla se documentan algunos tipos de medio de crecimiento adecuados y son bien conocidos por la persona experta en la materia. Normalmente, el medio de crecimiento deberla contener carbon activado y cistelna.
Es preferente que el medio de crecimiento selectivo sea un medio de crecimiento de agar selectivo y mas preferentemente es un medio de crecimiento de agar tamponado con carbon vegetal y extracto de levadura (BCYE). El medio de crecimiento de BCYE se harla selectivo mediante la adicion de suplemento de antibioticos. Un medio de crecimiento de BCYE altamente deseable con antibioticos se conoce como GVPC (Glicina, Vancomicina, Polimixina B, Cicloheximida).
El metodo de siembra en placas esta documentado en la bibliografla y es bien conocido por la persona con experiencia en la materia. Por lo general, el metodo implicara la aplicacion de una cantidad de estas muestras de agua sobre gel de agar que se ha colocado en una placa de Petri. Este se puede denominar metodo de placa de Petri o metodo de siembra en placas de agar. El objeto de la siembra en placas de agar es propagar una allcuota, por lo general de 100 pl de agua de la que sospecha que contiene el microorganismo, denominada suspension bacteriana, en un medio solido en una placa de Petri. Para propagar la suspension bacteriana en la placa de agar se pueden usar perlas de vidrio o un raspador celular. Despues de la propagation, la mayor parte de llquido es absorbido por el agar y una fina capa con bacterias permanece en la superficie del agar. Mediante la incubation, en la superficie del agar se desarrolla un crecimiento bacteriano en forma de colonias. La incubacion se producla. La una temperatura que se haga mas adecuada para el microorganismo, que esta bien documentada en la bibliografla y es bien conocida por la persona con experiencia en la materia. Por lo general, la temperatura estara entre 30 °C y 50 °C, por ejemplo aproximadamente 37 °C.
La combinacion de compuestos de reparacion se deberla anadir en una cantidad eficaz para reducir el estres oxidativo del microorganismo. Preferentemente esta sera una cantidad eficaz para reducir a o eliminar de forma sustancial las ROS en la celula del microorganismo.
De hecho, los inventores han encontrado que el uso de una combinacion de compuestos de reparacion provoca una reduction significativa del desfase de tiempo durante el desarrollo de la Legionella pneumophila, en particular en un medio llquido. Una reduccion del desfase en medio llquido de este tipo da como resultado una reduccion del tiempo necesario para obtener una colonia visible en placas de agar.
Tambien puede ser deseable incluir un cetoacido y/o una enzima neutralizante de oxlgeno reducido con el medio de reparacion y/o medio de crecimiento. Un cetoacido y/o una enzima neutralizante de oxlgeno reducido no se consideran un compuesto de reparacion de acuerdo con la presente invencion. Sin embargo, puede ser beneficioso incluir uno o ambos de estos compuestos con cualquiera de las combinaciones de compuestos de reparacion mencionadas anteriormente.
La detection y la cuantificacion de los microorganismos viables se pueden realizar mediante cualquier tecnica conocida que este documentada en la bibliografla. Por lo general esto hara referencia al recuento de las colonias visibles de la superficie del medio de crecimiento, tal como placa de agar con nutrientes.
El metodo de acuerdo con la presente invencion facilita la determination cuantitativa precisa para la existencia de Legionella pneumophila. Ademas, el tiempo de incubacion se puede reducir de forma significativa. El metodo es adecuado para detectar Legionella pneumophila en muestras obtenidas a partir de cualquiera del grupo seleccionado entre aguas de refrigeration industrial, aguas potables, y aguas naturales.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.
Ejemplos
Selection de compuestos y determinacion de sus concentraciones optimas
Para medir los efectos de diferentes compuestos, se comparan 2 criterios: la latencia y la tasa de crecimiento se observan con el medio de cultivo y el cultivo sin suplementar con medio suplementado. Por cuestiones de simplicidad, la latencia se calcula como el tiempo necesario para obtener una densidad optica de 0,1 a 600 nm. Para todos los compuestos sometidos a ensayo, el aumento de latencia (indicado por GT) se obtiene mediante la diferencia entre las latencias obtenidas en el medio de referencia (YEC) y las obtenidas en el medio suplementado. En las mismas condiciones, la proportion de la tasa de crecimiento (indicada como RVC) se define como la proportion entre la tasa de crecimiento obtenida en el medio de referencia y la obtenida en el medio suplementado
(YEC + X). En el medio de referenda (YEC), las cepas de L. pneumophila tienen un desfase de tiempo entre 5 h y 15 h y requieren aproximadamente 10 horas para alcanzar una densidad optica (indicada como DO) entre 0,1 y 0,3.
Cuando se usa serina o treonina como los compuestos de reparacion en cada caso, se observan mejoras en la latencia y/o tasa de crecimiento para una diversidad de cepas de Legionella pneumophila. Las mejoras se observan 5 en un intervalo de dosis, por ejemplo entre un 0,01 % y un 5 % basandose en el peso del compuesto por volumen de muestra con la dosis optima siendo aproximadamente 1 g por litro.
Se observan mejoras en la latencia y/o tasa de crecimiento para numerosas cepas de Legionella pneumophila cuando se usa cloruro calcico o cloruro de magnesio a dosis entre 10'6 mM y 10'2 mM, especialmente 10'4 mM.
Se observan mejoras en la latencia y/o tasa de crecimiento para un numero de cepas de Legionella pneumophila 10 cuando se usa cloruro potasico a dosis entre 1 mM y 10'4 mM, en especial aproximadamente 10'2 mM.
Las combinaciones particularmente eficaces de los compuestos de reparacion incluyen:
Combinacion A
1 g por litro de piruvato, 1 g por litro de serina, 1 g por litro de treonina, 1 g por litro de acido glutamico, cloruro calcico 10'4 mM, cloruro de magnesio 10'4 mM.
15 Combinacion B
1,5 g por litro de piruvato, 1,5 g por litro de serina, 1,5 g por litro de treonina, 1 g por litro de acido glutamico, cloruro calcico 10'4 mM y cloruro de magnesio 10'4 mM.
Combinacion C
2 g por litro de piruvato, 2,5 g por litro de serina, 1 g por litro de treonina, 1 g por litro de acido glutamico, cloruro 20 calcico 10'4 mM, cloruro de magnesio 10'4 mM y cloruro potasico 1,16 x 10'2 mM.
Los resultados mostraran que varias combinaciones son beneficiosas para el crecimiento en especial en medio llquido que contiene diferentes cepas.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar y hacer el recuento de microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos, en el que la muestra se obtiene a partir de cualquiera del grupo seleccionado entre aguas de refrigeracion industrial, aguas potables, y aguas naturales, que comprende
    5 (1) Poner en contacto dichos microorganismos de dicha muestra con compuestos de reparacion y un medio de
    crecimiento,
    (2) Incubar el producto de las etapas (1), y
    (3) Detectar y cuantificar dichos microorganismos viables,
    en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila, y en el que los compuestos de reparacion 10 comprenden
    (a) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de serina;
    (b) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de treonina;
    (c) un compuesto que contiene iones de calcio a una dosis de 10'6 a 10'2 mM;
    (d) un compuesto que contiene iones de magnesio a una dosis de 10'6 a 10'2 mM;
    15 (e) un compuesto que contiene iones de potasio.
    (f) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de acido glutamico o una sal del mismo;
    y
    (g) de un 0,1 a un 1 % en peso/volumen de acido piruvico o sal del mismo.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que la etapa (1) comprende poner en
    20 contacto dicha muestra con un medio de reparacion, preferentemente un medio de reparacion no selectivo, que
    contiene dicho compuesto de reparacion y a continuacion poner esto en contacto con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento selectivo.
  3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2 en el que el medio de reparacion es un llquido, preferentemente un caldo de cultivo.
    25 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que la etapa (1) comprende poner en contacto dicha muestra
    con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento no selectivo, y a continuacion poner esto en contacto con un medio de reparacion que contiene dicho compuesto de reparacion.
  4. 5. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que el medio de reparacion es un medio de reparacion selectivo, preferentemente un solido, y mas preferentemente un medio de crecimiento de agar selectivo.
    30 6. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que la etapa (1) comprende poner en
    contacto dicha muestra con un medio de crecimiento que contiene dicho compuesto de reparacion.
  5. 7. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que el medio de crecimiento es un medio tamponado con carbon vegetal y extracto de levadura (BCYE) o medio de crecimiento de agar GVPC.
  6. 8. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que el medio de reparacion y/o el medio de 35 crecimiento incluye un cetoacido y/o una enzima neutralizante de oxlgeno reducido.
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