ES2647452T3 - Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato - Google Patents

Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato Download PDF

Info

Publication number
ES2647452T3
ES2647452T3 ES07801562.5T ES07801562T ES2647452T3 ES 2647452 T3 ES2647452 T3 ES 2647452T3 ES 07801562 T ES07801562 T ES 07801562T ES 2647452 T3 ES2647452 T3 ES 2647452T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oligonucleotide
cells
rna
cell
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07801562.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Veit Hornung
Gunther Hartmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Bonn
Original Assignee
University of Bonn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38875059&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2647452(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from EP06021271A external-priority patent/EP1920775B1/en
Application filed by University of Bonn filed Critical University of Bonn
Application granted granted Critical
Publication of ES2647452T3 publication Critical patent/ES2647452T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido capaz de inducir la producción de un IFN tipo I, para uso en la inducción de la apoptosis de células tumorales, por medio de la unión a RIG-I en el tratamiento de un tumor en un animal vertebrado, en donde el oligonucleótido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, más preferiblemente al menos 6 ribonucleótidos en el extremo 5', en donde el oligonucleótido comprende un grupo trifosfato en el extremo 5', y en donde el grupo trifosfato está libre de cualquier caperuza o modificación, en donde el oligonucleótido es de al menos 21 nucleótidos de longitud, y en donde el oligonucleótido es un ligando de RIG-I.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se generaron oligonucleótidos de RNA trifosfato iniciados con adenosina con todas las permutaciones posibles de bases (A, C, G y U) de la 2ª, 3ª y 4ª posición de la secuencia (5’→ 3’) mediante transcripción in vitro (véase la Tabla 2). Posteriormente se aislaron los monocitos de tres donantes independientes y se transfectaron con los respectivos oligonucleótidos de RNA. 36 horas después de la transfección, se analizaron los sobrenadantes para producción de IFN-α. Los niveles de inducción de IFN-α obtenidos de todos los oligonucleótidos se normalizaron al nivel de inducción media de todos los oligonucleótidos (= 100 %). Los niveles de inducción normalizados obtenidos de los tres donantes se resumieron como valores medios ± SEM.
Figura 14: Cancelada
Figura 15: Combinación de funciones inmunoestimulantes potentes con actividad eficiente de silenciamiento génico en una molécula de RNA
(a)
Se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos. A una confluencia del 50 %, las células B16 se transfectaron con los siRNA sintetizados químicamente seleccionados (anti-Bcl-2 2.1, anti-Bcl-2 2.2 y anti-Bcl-2 2.3) a 1,2 µg/pocillo (100 pmol) usando lipofectamina 2000 (2,0 µl). 48 horas después de la transfección se analizó la expresión de proteínas de Bcl-2 murino por transferencia Western. Posteriormente, el siRNA anti-Bcl-2 2.2 (OH-2.2) fue transcrito in vitro (denominado 3p-2.2) y se analizó su capacidad para inducir el silenciamiento génico. El siRNA de control y el 3p-GC, un 3p-RNA de cadena doble no específico, sirvieron como control negativo. Se muestra un experimento representativo de cuatro.
(b)
Para determinar la expresión endógena de RIG-I, se estimularon células B16 con 3p-2.2 (1,2 µg/pocillo) e IFN-β murino (1000 U/ml). Después de 6 horas se lisaron las células y se analizaron para la expresión endógena de RIG-I por transferencia Western. Las células HEK293 que sobreexpresan RIG-I de longitud completa sirvieron como control positivo. Se muestra un experimento representativo de dos.
(c)
Para monitorizar la activación de IFN-β transitorio en células tumorales, se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos y se transfectaron con los plásmidos de expresión indicados utilizando PEI de alto peso molecular o lipofectamina 2000. Se estimularon 24 células con poli(I:C) (200 ng/pocillo), 3p-2.2 (200 ng/pocillo) y OH-2.2 (200 ng/pocillo). El IRF3-5D sirvió como control positivo. 16 h después de la transfección se analizaron las células para la actividad de luciferasa con un luminómetro de microplacas (LUMIstar, BMGLabtechnologies).Los datos se muestran como las medias ± SEM de tres experimentos independientes (*P<0,05 entre 3p-2.2, OH-2.2 y poli(I:C); ensayo t).
(d)
Se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos y se co-transfectaron con siRNA sintéticos (10 pmol) y los plásmidos de expresión indicados (200 ng) como se ha descrito. 24 horas después de la transfección se estimularon las células con 3p-2.2 durante 16 horas. Los datos se muestran como las medias ± SEM de tres experimentos independientes (*P<0,05 entre el control siRNA (siCO) + 3p-2.2 frente a RIG-I siRNA (siRIG-I) + 3p-2.2; ensayo t)
(e)
Se transfectaron células B16 con los plásmidos de expresión indicados durante 24 horas y se estimularon con 3p-2.2 durante 16 horas. Los datos se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes (*P<0,05, NS3-4A* + 3p-2.2 frente NS3-4A + 3p-2.2; ensayo t).
Figura 16: La transfección de 3p-2.2 desencadena directamente la apoptosis independiente de Cardif en las células tumorales, pero no en las células primarias
Se sembraron células B16 murinas en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 3p-2.2 (1,2 µg/pocillo), OH-2.2 (1,2 µg/pocillo) y siRNA de control (1,2 µg/pocillo) utilizando lipofectamina (2,0 µl). 24 horas después de la transfección se analizaron las células por citometría de flujo para la apoptosis mediante desconexión de las células anexina V-positivas. Se excluyeron las células anexina V-positivas y PI-positivas (últimas células apoptóticas o muertas).
(a)
Se muestra un análisis FACS representativo de cuatro experimentos independientes.
(b)
Los resultados de la apoptosis de las células B16 se muestran como las medias ± SEM de cuatro experimentos independientes (P**<0,01 3p-2.2 frente a OH-2.2 y el siRNA de control; ensayo t).
(c)
Se sembraron células B16 murinas en placas de 24 pocillos y se transfectaron con pNS3-4A y pNS3-4A* durante 24 h. Después, se lavaron las células y se estimularon durante 24 horas con 3p-2.2 y se determinó el número de células apoptóticas por análisis FACS. Los datos se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes.
(d)
Los resultados de la apoptosis en las PBMC humanas se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes.
(e)
Se incubaron células B16 con siRNA de control, 3p-2.2 y poli(I:C) durante 24 horas y se evaluaron para la actividad de caspasa-1 por medio de inmunotransferencia. Como control de carga sirvió α-Tublin. Se muestra un experimento representativo de tres.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Figura 17: La producción de IFN-α por 3p-2.2 requiere TLR7 en pDCs y RIG-I en cDCs y se limita a ciertos subconjuntos de células inmunitarias
Las cDCs derivadas de GMCSF de ratones naturales (WT), de ratones deficientes en RIG-I (a), de ratones deficientes en MDA5 (b) y de ratones deficientes en TLR7 (c), y las pDCs derivadas de Flt3-L de ratones deficientes en TLR7 (d) se transfectaron con 200 ng de 3p-2.2, dsDNA (Sigma; dAdT), poli(I:C) (Sigma) complejados con lipofectamina 2000 y CpG-A 2216 (3 µg/ml) en placas de 96 pocillos. Después de 24 h, se midió el IFN-α en los sobrenadantes mediante ELISA. Los datos se expresan como la media ± SEM de dos experimentos independientes.
(e) Se purificaron células B, células NK y células T CD8 procedentes de bazos de ratones naturales (WT) utilizando selección celular magnética y se estimularon con 200 ng de 3p-2.2. Las pDCs seleccionadas de cultivos de médula ósea inducidas por Flt3-L y las cDCs derivadas de GMCSF estimuladas con 3p-2.2 sirvieron como control positivo. Los datos se expresan como la media ± SEM de dos experimentos independientes.
Figura 18: El 3p-2.2 encapsulado conduce a la activación inmunitaria sistémica in vivo
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl que contenían 3p-2.2 o OH-2.2 (50 µg/ratón) complejado con jetPEI™. Posteriormente, se inyectaron los complejos en la vena retro-orbital. Se recogió el suero después de 6 horas a menos que se indique otra cosa. Se obtuvo sangre entera cortando la cola a los puntos de tiempo indicados. Los niveles de citocinas de IFN-α (a), IL-12p40 (b) y IFN-γ (c) se determinaron por ELISA. El CpG1826 sirvió como control positivo. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 6 experimentos independientes; P** <0,01 o P* <0,05. (d-e) Se inyectaron ratones C57BL/6 y TLR7-/-por vía intravenosa con 3p-2.2 y OH-2.2 (50 µg) complejados con jetPEI™ (Biomol). Después de 6 horas, se sacrificaron los ratones y se analizó el suero para la producción de IFN-α (d), IL-12p40 (e) e IFN-γ (f) por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 19: Activación dependiente de la dosis de subconjuntos de células inmunitarias por 3p-2.2 in vivo
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl de 3p-2.2 (25, 50 o 75 µg/ratón) complejado con jetPEI™ en la vena retro-orbital. Se recogió el suero después de 6 h a menos que se indique otra cosa.
(a) Los niveles de citocinas en suero de IFN-α, IL-12p40 y IFN-γ se determinaron por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 5 experimentos independientes.
(b-c) Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl de ácido nucleico (25, 50 o 75 µg/ratón) complejado con jetPEI™. Se aislaron células del bazo 48 horas después de la inyección y se analizó la expresión de CD86 o CD69 en pDCs, mDCs, células NK, células T CD4 y células T CD8 por citometría de flujo. La tinción del antígeno de superficie se realizó como se ha descrito previamente. (b) Histogramas de un experimento representativo después de la estimulación con 50 µg de 3p-2.2 (barra gris, ratones de control no estimulados), (c) La activación dependiente de la dosis por 3p-2.2 de diferentes subconjuntos de células inmunitarias. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 20: La estimulación por 3p-2.2 conduce a un aumento de niveles de IFN-α en suero durante menos de dos días e induce una trombocitopenia y leucopenia moderada in vivo.
(a)
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 50 µg de 3p-2.2 o de OH-2.2 complejado con jetPEI™. Se recogió el suero 12 h, 24 h, y 48 h después de la inyección a menos que se indique otra cosa. Los niveles séricos de IFN-α se determinaron por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
(b)
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 50 µg de 3p-2.2 complejado con jetPEI™. Se recogió la sangre después de 48 h y se procesó como plasma con EDTA para la medida de los leucocitos (WBC) y de las plaquetas. Se realizaron los recuentos de las células sanguíneas en el Laboratorio Central del Departamento de Medicina Interna, Universidad de Munich, en el punto de tiempo indicado (P** <0,01 entre el recuento de plaquetas de 3p-2.2 y CpG). Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 21: La administración de 3p-2.2 encapsulado produce la reducción de las metástasis de pulmón de melanoma B16 inducidas experimentalmente
(a)
Régimen terapéutico: Se enfrentaron los ratones con 4x105 células de melanoma B16 por vía intravenosa para inducir experimentalmente metástasis de pulmón el día 0. Se trataron los ratones por vía intravenosa con el ácido nucleico indicado complejado con jetPEI™ los días 3, 6 y 9 como se indica. 14 días después del enfrentamiento, se contó el número de metástasis de melanoma visibles macroscópicamente en la superficie de los pulmones con ayuda de un microscopio de disección o se calculó el peso del pulmón.
(b)
Se enfrentaron grupos de cinco ratones C57BL/6 con 4x105 B16 y se trataron como se describe. Se trataron los ratones intravenosamente los días 3, 6 y 9 con 50 µg de OH-2.2, 50 µg de 3p-2.2, 50 µg de 3p-GC (un 3p-RNA no específico de cadena doble) o 50 µg de ligando de oligonucleótido CpG, cada uno de ellos complejado con jetPEI™. Los grupos de control recibieron 100 µl de glucosa al 5 % o 50 µg de poliA complejado con jetPEI™. Se evaluó el
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
imagen10
imagen11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
sustituidos o arabinósidos 2'-sustituidos incluyen, sin limitación, 2'-amino-, 2'-fluoro-, 2'-alil-, y 2'-propargilribonucleósidos o arabinósidos.
El término "oligonucleótido" incluye oligonucleótidos híbridos y quiméricos. Un "oligonucleótido quimérico" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de enlace internucleósido. Un ejemplo preferido de tal oligonucleótido quimérico es un oligonucleótido quimérico que comprende una región fosforotioato, fosfodiéster o fosforoditioato y enlaces no iónicos tales como enlaces alquilfosfonato o alquilfosfonotioato (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.635.377 y 5.366.878).
Un "oligonucleótido híbrido" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de nucleósido. Un ejemplo preferido de tal oligonucleótido híbrido comprende un ribonucleótido o región de ribonucleótido 2' sustituido, y una región de desoxirribonucleótido (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.652.355, 6.346.614 y 6.143.881).
Los oligonucleótidos de RNA expuestos en la presente memoria incluyen por lo demás RNA sin modificar, así como RNA que ha sido modificado (por ejemplo, para mejorar la eficacia), y polímeros de sustitutos de nucleósidos.
El RNA sin modificar se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, a saber, azúcares, bases y restos de fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos que existen en la naturaleza, preferiblemente como existen naturalmente en el cuerpo humano. La técnica se ha referido a los RNA raros o inusuales, pero de origen natural, los RNA como RNA modificados, véase, por ejemplo, Limbach et al. 1994, Nucleic Acids Res 22: 2183-2196. Tales RNA raros o inusuales, denominados a menudo RNAs modificados (aparentemente porque son típicamente el resultado de una modificación postranscripcional) están dentro del término RNA sin modificar, como se usa en la presente memoria.
El RNA modificado como se utiliza aquí se refiere a una molécula en la que uno o más de los componentes del ácido nucleico, a saber, azúcares, bases y restos de fosfato, son diferentes de los que existen en la naturaleza, preferiblemente diferentes de los que existen en el cuerpo humano. Aunque se conocen como "RNA" modificados, por supuesto, debido a la modificación, incluyen moléculas que no son RNA.
Los sustitutos de nucleósidos son moléculas en las que la cadena principal de ribofosfato se reemplaza con un constructo de no ribofosfato que permite que las bases se presenten en la relación espacial correcta de tal modo que la hibridación es sustancialmente similar a la que se ve con una cadena principal de ribofosfato, por ejemplo, imitadores no cargados de la cadena principal de ribofosfato.
Todas las secuencias de ácido nucleico listadas en la presente memoria están en la dirección 5' a 3’ a menos que se indique otra cosa.
El oligonucleótido de RNA de la invención puede ser de cadena sencilla (ssRNA), de cadena doble (dsRNA), o parcialmente de cadena doble (parcialmente dsRNA).
Un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla puede contener secuencias autocomplementarias y forma una horquilla. Por ejemplo, 5'-GACCTAGCCTAAAACTAGGTC-3'. La secuencia autocomplementaria puede ser una secuencia palindrómica. Por ejemplo, 5’-AAAGATCCGGATCAAAA-3'.
Un oligonucleótido de RNA de cadena doble puede tener uno o dos nucleótidos que cuelgan en el extremo 5’ o 3' de una o ambas cadenas.
Un oligonucleótido de RNA parcialmente de cadena doble puede comprender dos cadenas de la misma o diferente longitud, en donde al menos una de las cadenas contiene nucleótidos fuera de la secuencia complementaria. Por ejemplo,
Ejemplo 1: 5’-AAAAGUUCAAAGCUCAAAA-3’
3’-CAAGUUUCGAG-5’ '
Ejemplo 2: 5’-UCAAAGUCAAAAGCUCAAAGUUGAAAGUUUAAA-3’
3'-GACUUGAAAAUUUCAGUUUUCGAGUUUAAGUUGAAAACUCG-5’
Ejemplo 3: 5'-UCAAAGUCAAAAGCUCAAAGUUGAAA-3'
3'-UUUCAGUUUUCGAGUUUAAGUUGAAAACUCG-5'
La longitud de un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla es el número de nucleótidos contenidos en el oligonucleótido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En el caso de un oligonucleótido de cadena doble o parcialmente de cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de las cadenas individuales. En otras palabras, un oligonucleótido parcialmente de cadena doble puede tener dos longitudes.
Aumento de la resistencia a la nucleasa
Para una mayor resistencia a las nucleasas y/o afinidad de unión a la diana, un oligonucleótido puede incluir, por ejemplo, unidades de ribosa 2’-modificada y/o enlace o enlaces de fosforotioato y/o enlace o enlaces de pirofosfato. Por ejemplo, el grupo 2' hidroxilo (OH) puede ser modificado o reemplazado con un número de diferentes sustituyentes “oxi” o “desoxi”.
Los ejemplos de modificaciones del grupo "oxi"-2' hidroxilo incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo, R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los cuales se conecta el 2’ hidroxilo, por ejemplo, mediante un puente de metileno, al carbono 4’ del mismo azúcar ribosa; O-amina y aminoalcoxi, O(CH2)namina, (por ejemplo, amina = NH2 ; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino, etilendiamina, poliamino). Es de destacar que los oligonucleótidos que contienen sólo el grupo metoxietilo (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), presentan estabilidades de nucleasa comparables a los modificados con la modificación robusta de fosforotioato.
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno (es decir, azúcares desoxirribosa, que son de particular relevancia para las porciones colgantes de los RNA parcialmente de cadena doble); halo (por ejemplo, fluoro); amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino, o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-amina (amina = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilamino, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con una función amino.
Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, y 2'-fluoro.
Para maximizar la resistencia a las nucleasas, se pueden utilizar las modificaciones en 2' en combinación con una o más modificaciones de enlaces fosfato (por ejemplo, fosforotioato). Los denominados oligonucleótidos "quiméricos" son aquellos que contienen dos o más modificaciones diferentes.
La inclusión de azúcares de furanosa en la cadena principal del oligonucleótido también puede disminuir la escisión endonucleolítica. Un agente oligonucleótido puede ser modificado además incluyendo un grupo catiónico en 3', o invirtiendo el nucleósido en el extremo 3' con un enlace 3'-3'. En otra alternativa, el extremo 3’ puede ser bloqueado con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un 3' C5-aminoalquilo dT. Otros conjugados en 3' pueden inhibir la escisión exonucleolítica en 3'-5'. Aunque sin limitarse a ninguna teoría, un conjugado en 3' , tal como el naproxeno o el ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente la exonucleasa de la unión al extremo 3' del oligonucleótido. Incluso las cadenas pequeñas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa etc.) pueden bloquear las 3'-5'-exonucleasas.
De manera similar, los conjugados en 5’ pueden inhibir la escisión exonucleolítica en 5'-3'. Aunque sin limitarse a ninguna teoría, un conjugado en 5', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente la exonucleasa de la unión al extremo 5’ del oligonucleótido. Incluso las cadenas pequeñas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa etc.) pueden bloquear las 5'-3'-exonucleasas.
Los oligonucleótidos de RNA de cadena sencilla que contienen secuencias autocomplementarias y que forman una estructura de horquilla han mejorado la resistencia a la nucleasa en comparación con los oligonucleótidos de cadena sencilla que no lo hacen.
Ligandos anclados
Los oligonucleótidos de RNA incluyen también aquellos con ligandos anclados. Las propiedades de un oligonucleótido de RNA, incluyendo sus propiedades farmacológicas, pueden ser influenciadas y adaptadas por la introducción de ligandos, por ejemplo, ligandos anclados.
Los ligandos se pueden acoplar, covalentemente o no covalentemente, preferiblemente covalentemente, ya sea directamente o indirectamente por medio de un anclaje intermedio, al oligonucleótido de RNA. En realizaciones preferidas, el ligando se une al oligonucleótido por medio de un anclaje intermedio.
En realizaciones preferidas, un ligando altera la distribución, orientación o vida útil de un oligonucleótido de RNA al que se incorpora. En realizaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad mejorada para una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo celular, un compartimento celular o de un órgano, un tejido, órgano o región del cuerpo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los ligandos preferidos pueden mejorar el transporte, la hibridación, y las propiedades de especificidad y pueden mejorar también la resistencia a las nucleasas del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en la presente memoria y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Se puede utilizar una amplia variedad de ligandos. Los ligandos pueden incluir agentes que permiten la orientación específica del oligonucleótido hacia un objetivo; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores que permiten la monitorización de la distribución del oligonucleótido; agentes de reticulación; restos que confieren resistencia a las nucleasas; y nucleobases naturales o inusuales. Ejemplos generales incluyen moléculas lipófilas, lípidos, lectinas, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, epifriedelanol, ácido litocólico derivatizado), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico), proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas dirigidas a integrinas, policatiónicos, péptidos, poliaminas y compuestos peptídicos miméticos.
El ligando puede ser una molécula de origen natural o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Ejemplos de poliaminoácidos incluyen, sin limitación, poli L-lisina, ácido poli-Laspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero poli (L-lactida-coglicol), copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de Nisopropilacrilamida, o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, poli lisina, espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudopéptido, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, restos catiónicos, por ejemplo, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos pueden incluir también grupos de dirección al objetivo, por ejemplo, un agente de direccionamiento a una célula o tejido, por ejemplo, una tirotropina, melanotropina, proteína surfactante A, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glucosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido RGD o péptido mimético de RGD.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo, lipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula de cáncer, célula endotelial, o célula ósea. Los ligandos pueden incluir también hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa, o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la absorción del agente oligonucleótido en la célula, por ejemplo, mediante la ruptura del citoesqueleto de la célula, por ejemplo, mediante la ruptura de microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, o mioservina.
En una realización, el ligando es un lípido o molécula basada en lípidos. Dicho lípido o molécula basada en lípido se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado en un tejido diana, por ejemplo, tejido hepático, incluyendo las células del parénquima del hígado. Otras moléculas que se pueden unir a HSA se pueden usar también como ligandos. Por ejemplo, se pueden utilizar neproxinao aspirina. Un ligando de lípidos o basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar la orientación o transporte a una célula o membrana celular diana, y/o (c) se puede utilizar para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.
Un ligando basado en lípidos puede ser utilizado para modular la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando basado en lípidos que se une a HSA con más fuerza será menos propenso a ser dirigido al riñón y por lo tanto menos probable que sea aclarado del cuerpo. Se puede utilizar un lípido o ligando basado en lípidos que se une a HSA menos fuertemente para dirigir el conjugado al riñón.
En otra realización, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina o un nutriente, que es absorbido por una célula diana, por ejemplo, una célula en proliferación. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación no deseada de células, por ejemplo, de tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E, y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen las vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, vitamina B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células cancerosas.
En otra realización, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación de células helicoidales. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennapedia. Si el agente es un péptido, puede ser modificado, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
enlaces de no péptidos o seudo-péptidos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipófila y una fase lipófoba.
En una realización preferida, el ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo que es específico para un resto presente en una célula a seleccionar. El resto puede ser una proteína, una estructura de carbohidrato, un polinucleótido, o una combinación de los mismos. El resto puede ser secretado, asociado con la membrana plasmática (por ejemplo, sobre la superficie extracelular o intracelular), citosólico, asociado a orgánulos intracelulares (por ejemplo, ER, complejo de Golgi, mitocondrias, endosoma, lisosoma, vesícula secretora) o nuclear. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser quimérico o humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena única. El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, o cualquier fragmento que retiene la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo intacto.
Actividad inmunoestimulante
Como se utiliza en la presente memoria, "actividad inmunoestimulante" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o una composición, para inducir una respuesta inmunitaria. En una realización, la actividad inmunoestimulante se refiere a la actividad inductora de IFN tipo I, en particular, la actividad inductora de IFN-α.
Como se usa en la presente memoria, "inducir una respuesta inmunitaria" significa iniciar o causar un aumento en una o más entre la activación de células B, activación de células T, activación de células asesinas naturales, activación de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células B, células dendríticas, monocitos y macrófagos), producción de citocinas, producción de quimiocinas, expresión de marcador de superficie celular específico, en particular, la expresión de moléculas co-estimulantes. En un aspecto, tal respuesta inmunitaria implica la producción de IFN tipo I (IFN-α y/o IFN-β), en particular, IFN-α, en células tales como PDC (células dendríticas plasmacitoides) y/o monocitos.
Como se usa en esta memoria, "actividad inductora de IFN tipo I" incluye la actividad inductora de IFN-α y/o la actividad inductora de IFN-β.
Como se usa en la presente memoria, "actividad inductora de IFN-α" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o composición, para inducir la producción de IFN-α a partir de una célula capaz de producir IFNα. Las células capaces de producir IFN-α incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (por ejemplo, células B, células dendríticas (células dendríticas mieloides y células dendríticas plasmacitoides), macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, granulocitos), células endoteliales, y líneas celulares.
Como se usa en esta memoria, "actividad inductora de IFN-β" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o composición, para inducir la producción de IFN-β de una célula capaz de producir IFN-β. Cualquier célula somática, tal como las PBMC, las células dendríticas mieloides, monocitos, PDC, fibroblastos, son capaces de producir IFN-β.
Respuesta antiviral
Como se usa en la presente memoria, "respuesta antiviral" se refiere a la respuesta de una célula, tejido u organismo a la infección por un virus con el fin de eliminar o incapacitar el virus. Las respuestas antivirales típicas incluyen, pero no se limitan a, producción de IFN tipo I, MIP1-a, MCP, RANTES, IL-8, IL-6, IP-10, e IFN-γ.
Respuesta antibacteriana
Una respuesta antibacteriana es la respuesta de una célula, tejido u organismo a la infección por una bacteria con el fin de eliminar o incapacitar la bacteria. Las respuestas antibacterianas típicas incluyen, pero no se limitan a, eliminación, mediada por las células T o por las células NK, de la célula infectada o por apoptosis mediada por el receptor o por apoptosis mediada por citocinas por medio de TNF o TRAIL, fagocitosis de macrófagos o monocitos.
Una respuesta antibacteriana, en particular, la producción de IFN tipo I y tipo II, puede ser inducida en células inmunitarias o en células no inmunitarias. Las células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células dendríticas plasmacitoides (PDC), células dendríticas mieloides (MDC), células B, macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, células NKT, células T CD4+, células T CD8+, granulocitos. Las células no inmunitarias incluyen, entre otras, células tumorales, células epiteliales, células endoteliales, y fibroblastos.
Genes, RNA y antígeno relacionados con un trastorno/enfermedad
Como se utiliza en la presente memoria, "gen relacionado con un trastorno/enfermedad" se refiere a un gen que se expresa o sobreexpresa en una enfermedad/trastorno y que no se expresa o se expresa en cantidad reducida en las células sanas normales . Por ejemplo, un gen CF mutante se expresa en pacientes con fibrosis quística, pero no en un individuo sin fibrosis quística; ErbB2 (o Her2) se sobreexpresa en las células de cáncer de mama en comparación con las células de mama normales; un gen vírico o un gen del hospedante inducido víricamente se expresa en las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
células infectadas, pero no en las células no infectadas. El producto génico del gen relacionado con el trastorno/ enfermedad se denomina aquí como el "antígeno relacionado con un trastorno/enfermedad". Un "RNA relacionado con un trastorno/ enfermedad" se refiere a una molécula de RNA que está presente o se presenta en un nivel elevado en una célula enferma y que no está presente o se presenta en un nivel reducido en una célula sana normal. Un RNA relacionado con un trastorno/enfermedad puede ser un mRNA, un miRNA, o otro RNA no codificante tal como rRNA o tRNA.
Mamífero
Como se utiliza en la presente memoria, el término "mamífero" incluye, sin limitación, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ovejas, ganado, vacas, cerdos, conejos, primates no humanos, y seres humanos.
Oligonucleótido
La presente divulgación proporciona un oligonucleótido capaz de inducir la producción de IFN tipo I, en donde el oligonucleótido comprende al menos tres grupos fosfato en el extremo 5' , en donde el grupo fosfato está libre de cualquier estructura o modificación de caperuza, en donde el oligonucleótido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, más preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, aún más preferiblemente al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, lo más preferiblemente al menos 18, 19, 20, 21 ribonucleótidos en el extremo 5', y en donde el oligonucleótido tiene al menos 21 nucleótidos de longitud.
El oligonucleótido puede ser de cadena sencilla, de cadena sencilla que contiene una secuencia autocomplementaria que puede formar una estructura de horquilla, de cadena doble, o parcialmente de cadena doble.
Cuando el oligonucleótido es de cadena sencilla, de cadena sencilla que contiene una secuencia autocomplementaria o cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de una sola cadena.
Cuando el oligonucleótido es parcialmente de cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de la cadena más larga. Por lo tanto, el oligonucleótido incluye oligonucleótidos parcialmente de cadena doble en donde al menos una de las cadenas es al menos de 21 nucleótidos de longitud.
En el oligonucleótido, el al menos 1 ribonucleótido en el extremo 5' comprende un trifosfato. En el caso de un oligonucleótido de cadena doble o parcialmente de cadena doble, al menos una de las cadenas comprende al menos un grupo 5' trifosfato. Cuando ambas cadenas comprenden grupos 5' fosfato, el número de grupos fosfato puede ser el mismo o puede ser diferente en las dos cadenas. Por lo tanto, los oligonucleótidos de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, o 6 grupos 5' fosfato en la forma de monofosfato, difosfato y/o trifosfato. En el caso de un oligonucleótido parcialmente de cadena doble, el al menos 1 ribonucleótido en el extremo 5' que comprende el al menos un 5’ trifosfato puede estar sobre la cadena larga o sobre la corta, en donde al menos la cadena larga es al menos de 21 nucleótidos de longitud.
En el oligonucleótido, los al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ribonucleótidos en el extremo 5' están en la misma cadena.
En una realización, al menos uno de los grupos 5' fosfato no está comprendido en un trifosfato. En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un grupo seleccionado de un monofosfato y un difosfato en el extremo 5' , en donde el monofosfato y/o difosfato está libre de cualquier caperuza o modificación.
En una realización, el primer ribonucleótido en el extremo 5' del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A, U, C y G. En una realización preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5' del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A, C y U. En una realización más preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5’ del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A y C. En la realización más preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5' comprende una adenina (A).
En realizaciones preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5’ del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, AGAA, AGCA, AACU, AUCG, AGGA, AUCA, AUGC, AGUA, AAGC, AACC, AGGU, AAAC, AUGU, ACUG, ACGA, ACAG, AAGG, ACAU, ACGC, AAAU, ACGG, AUUC, AGUG, ACAA, AUCC, AGUC, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En realizaciones más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5' del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, AGAA, AGCA, AACU, AUCG, AGGA, AUCA, AUGC, AGUA, AAGC, AACC, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En realizaciones aún más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5’ del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En las realizaciones más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5' del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otras realizaciones, el primer nucleótido de las secuencias de 4-nucleótidos en 5' listadas anteriormente es una U, C o G en lugar de A.
En una realización preferida, el oligonucleótido comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, más preferiblemente al menos 11, 12, 13, 14, 15, aún más preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20, y lo más preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24, 25 inosinas (I). En una realización, al menos 1, 2, 3, 4, 5 %, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 25, 30, más preferiblemente al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60 %, aún más preferiblemente al menos 70, 80, o 90 % de la adenosina (A) y/o de la guanosina (G) en el oligonucleótido se reemplaza con inosina (I).
El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido de RNA, o un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico. Un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Los ribonucleótidos y los desoxirribonucleótidos pueden estar en la misma cadena, o pueden estar en diferentes cadenas.
En una realización, el oligonucleótido (RNA o RNA-DNA quimérico) comprende una cadena principal de fosforotioato. En realizaciones preferidas, al menos 1, preferiblemente al menos 2, más preferiblemente al menos 3, aún más preferiblemente al menos 4 nucleótidos son fosforotioato.
En una realización preferida, el oligonucleótido no contiene ninguna modificación tal como pseudouridina, 2tiouridina, 2'-flúor-dNTP, NTP 2'-O-metilado, en particular, 2'-flúor-dCTP, 2’-flúor-dUTP, CTP 2'-O-metilado, UTP 2'O-metilado.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene actividad de silenciamiento génico. En una realización, el oligonucleótido es activo en la interferencia de RNA (RNAi), o es una molécula de RNAi. La molécula de RNAi puede ser un siRNA (RNA interferente pequeño, de cadena doble), shRNA (RNA pequeño de horquilla, de cadena sencilla con una estructura de horquilla) o miRNA (micro RNA, de cadena sencilla con una estructura de horquilla).
En una realización preferida, el oligonucleótido de RNA es un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla que no contiene ninguna secuencia que sea capaz de formar alguna estructura intramolecular o intermolecular de cadena doble consigo misma en condiciones fisiológicas, en particular, condiciones fisiológicas dentro de una célula, y la secuencia de nucleótidos del RNA de cadena sencilla es complementaria de un RNA en una célula diana.
En una realización, el RNA se expresa de una manera específica de un tejido, célula y/o etapa de desarrollo. En una realización preferida, el RNA es un RNA relacionado con una enfermedad/trastorno. En una realización, el RNA relacionado con una enfermedad/trastorno es un mRNA de un gen relacionado con una enfermedad/trastorno. En otra realización, el RNA relacionado con una enfermedad/trastorno es un miRNA. El RNA relacionado con una enfermedad/trastorno puede ser un RNA endógeno celular, un RNA vírico, un RNA de un microorganismo u organismo invasor tal como una bacteria, un hongo, o un parásito.
El grado de complementariedad es preferiblemente al menos 50 %, 60 %, 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, aún más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y lo más preferiblemente 100 %. Tal como se utiliza en la técnica, el término "grado de complementariedad" entre dos oligonucleótidos/polinucleótidos se refiere al porcentaje de bases complementarias en la región de solapamiento de los dos oligonucleótidos. Dos bases son complementarias entre sí si pueden formar un par de bases mediante enlaces de hidrógeno. Los pares de bases incluyen tanto pares de bases de Waston-Crick como pares de bases de balanceo. Los pares de bases de Waston-Crick incluyen A-T, C-G, A-U; los pares de bases de balanceo incluyen G-U, I-U, I-A, I-C. El grado de complementariedad puede ser determinado por los expertos utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, ya sea manualmente o automáticamente por diversos medios tales como BLAST. Por ejemplo, ATCG tiene 100 % de complementariedad con CGAT y CGATGG, y 75 % de complementariedad con CGTT y CGTTGG. En una realización preferida, existe complementariedad entre el oligonucleótido y el RNA diana en la célula diana en toda la longitud del oligonucleótido.
El término "condición fisiológica" se usa en la presente memoria como se entiende comúnmente en la técnica. Condición fisiológica dentro de una célula se refiere a parámetros tales como la fuerza iónica, osmolaridad, concentración de sal, pH, temperatura, que se encuentran normalmente dentro de una célula, es decir, en el citosol. La célula puede estar in vivo, in vitro o ex vivo. La célula puede ser una célula sana o normal o una célula enferma o anormal. Una célula enferma o anormal puede ser, por ejemplo, una célula infectada por bacterias o virus, una célula tumoral, una célula autoinmunitaria, una célula que tiene una respuesta inflamatoria. Condición fisiológica se refiere a las condiciones en el interior o en el exterior de una célula in vivo, in vitro o ex vivo. Las condiciones fisiológicas se pueden encontrar en un organismo, tejido, o célula vivos o se pueden obtener artificialmente en un laboratorio. Un ejemplo de una condición fisiológica es NaCl 150 ± 50 mM, pH 7,4 ± 0,8, y 20 ± 20 ºC.
Si un oligonucleótido de RNA contiene o no alguna estructura de cadena doble puede ser determinado fácilmente por un experto utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un espectrómetro para medir los espectros de absorción de la cadena doble frente a la cadena sencilla, mientras que se aumenta la temperatura. En ciertas realizaciones, el número de pares de bases dentro de la estructura de cadena doble es al menos 6, 7, 8, 9, preferiblemente al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, más preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, aún más preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25. Los pares de bases incluyen tanto pares de bases de Waston
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Crick como pares de bases de balanceo. Los pares de bases de Waston-Crick incluyen A-T, C-G, A-U; los pares de bases de balanceo incluyen G-U, I-U, I-A, I-C.
El oligonucleótido de RNA de cadena sencilla puede ser generado por síntesis química.
En una realización, el oligonucleótido de RNA de cadena sencilla no tiene ninguna actividad de silenciamiento génico.
En otra realización, el oligonucleótido de RNA de cadena sencilla tiene actividad de silenciamiento génico.
Como se usa en la presente memoria, el "precursor del oligonucleótido" se refiere a cualquier molécula que puede ser procesada para generar el oligonucleótido. Los precursores del oligonucleótido incluyen, pero no se limitan a, moléculas de DNA o RNA que pueden servir como moldes para la síntesis de los oligonucleótidos de RNA de la invención, moléculas de RNA o de RNA-DNA quiméricas que pueden ser escindidas enzimáticamente para producir los oligonucleótidos de la invención.
El oligonucleótido o su precursor pueden contener también motivos o firmas moleculares que son reconocidos por los TLR. Por ejemplo, los dsRNA largos (más de 30 bases) que llevan un 5' fosfato pueden servir como ligando tanto para RIG-I como para TLR3. Un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico que comprende un ssRNA que lleva un 5’ fosfato y un ssDNA que contiene CpG puede servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR9. Los ssRNA o dsRNA que llevan un 5’ fosfato y motivos definidos de secuencia (S. S. Diebold et al., Science 303, 1529 (Mar 5, 2004); F. Heil et al., Science 303, 1526 (Mar 5, 2004); V. Hornung et al., Nat Med 11, 263 (Mar, 2005); documento WO 03/086280; solicitud de patente europea nº 05020020.3) pueden servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR7. Los ssRNA que llevan un 5’ trifosfato y motivos ricos en GU (documento WO 03/086280, solicitud de patente europea nº 05 020 019.5) pueden servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR8.
En una realización, el oligonucleótido o precursor del mismo comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro, incluso más preferiblemente al menos cinco, y lo más preferiblemente al menos seis, de los motivos de 4-nucleótidos (4 meros) seleccionados del grupo que consiste en:
GUUC (Nº 1), GUCA (Nº 2), GCUC (Nº 3), GUUG (Nº 4), GUUU (Nº 5), GGUU (Nº 6), GUGU (Nº 7), GGUC (Nº 8), GUCU (Nº 9), GUCC (Nº 10), GCUU (Nº 11), UUGU (Nº 12), UGUC (Nº 13), CUGU (Nº 14), CGUC (Nº 15), UGUU (Nº 16), GUUA (Nº 17), UGUA (Nº 18), UUUC (Nº 19), UGUG (Nº 20), GGUA (Nº 21), GUCG (Nº 22), UUUG (Nº 23), UGGU (Nº 24), GUGG (Nº 25), GUGC (Nº 26), GUAC (Nº 27), GUAU (Nº 28), UAGU (Nº 29), GUAG (Nº 30), UUCA (Nº 31), UUGG (Nº 32), UCUC (Nº 33), CAGU (Nº 34), UUCG (Nº 35), CUUC (Nº 36), GAGU (Nº 37), GGUG (Nº 38), UUGC (Nº 39), UUUU (Nº 40), CUCA (Nº 41), UCGU (Nº 42), UUCU (Nº 43), UGGC (Nº 44), CGUU (Nº 45), CUUG (Nº 46), UUAC (No.47),
en donde las secuencias de nucleótidos de los motivos van de 5' →3',
en donde el oligonucleótido o precursor del mismo tiene entre 12 y 64, preferiblemente entre 12 y 50, más preferiblemente entre 14 y 40, aún más preferiblemente entre 16 y 36, y lo más preferiblemente entre 18 y 25 nucleótidos de longitud.
En una realización, los motivos de 4 meros se seleccionan del grupo que consiste en el Nº 1-19, Nº 1-18, Nº 1-17, Nº 1-16, preferiblemente, Nº 1-15, Nº 1-14, Nº 1-13, Nº 1-12, más preferiblemente, Nº 1-11, Nº 1-10, Nº 1-9, Nº 1-8, Nº 1-7, aún más preferiblemente, Nº 1-6, Nº 1-5, Nº 1-4, Nº 1-3, lo más preferiblemente, Nº 1-2 de los motivos de 4 meros.
El oligonucleótido o precursor del mismo puede comprender una o más copias del mismo motivo de 4 meros, o una
o más copias de diferentes motivos de 4 meros.
En otra realización, el oligonucleótido o un precursor del mismo comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro, incluso más preferiblemente al menos cinco, y lo más preferiblemente al menos seis, de los motivos de 4-nucleótidos (4 meros) seleccionados del grupo que consiste en:
UCGU (Nº 1), GUUG (Nº 2), UGGU (Nº 3), UGGC (Nº 4), GGUA (Nº 5), UGAU (Nº 6), UGCU (Nº 7), UUGC (Nº 8), UUGU (Nº 9), UAGU (Nº 10), GGUU (Nº 11), GUUU (Nº 12), UGUG (Nº 13), GUGU (Nº 14), UGCC ( Nº 15), GUAU (Nº 16), GUGC (Nº 17), UGUA (Nº 18), UGUC (Nº 19), CUGU (Nº 20), UGAC (Nº 21), UGUU (Nº 22), UAAU (Nº 23), GUAG (Nº 24), UCUU (Nº 25), UUGG (Nº 26), UUUG (Nº 27), GGAU (Nº 28), UUUU (Nº 29), CGUU (Nº 30), UUAU (Nº 31), GUUC (Nº 32), GUGG (Nº 33), GGUG (Nº 34), UAUU (Nº 35), UCUG (Nº 36 ), GUAC (Nº 37), UAGG (Nº 38), UCUC (Nº 39), UAGC (Nº 40), UAUC (Nº 41), CUAU (Nº 42), UACU (Nº 43) , CGGU (Nº 44), UGCG (Nº 45), UUUC (Nº 46), UAUG (Nº 47), UAAG (Nº 48), UACC (Nº 49), UUAG (Nº 50), GCUU (Nº 51), CAGU (Nº 52), UGAG (Nº 53), GAUU (Nº 54), GAGU (Nº 55), GUUA (Nº 56), UGCA (Nº 57), UUCU (Nº 58), GCCU (Nº 59), GGUC (Nº 60), GGCU (Nº 61), UUAC (Nº 62), UCAU (Nº 63), GCGU (Nº 64), GCAU (Nº 65), GAUG (Nº 66), GUCU (Nº 67), CGUA (Nº 68), CGAU (Nº 69),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en donde las secuencias de nucleótidos de los motivos van de 5' →3' ,
en donde el oligonucleótido o precursor el mismo tiene entre 12 y 64, preferiblemente entre 12 y 50, más preferiblemente entre 14 y 40, aún más preferiblemente entre 16 y 36, y lo más preferiblemente entre 18 y 30 nucleótidos de longitud.
En una realización, los motivos de 4 meros se seleccionan del grupo que consiste en el Nº 1-11, preferiblemente Nº 1-10, Nº 1-9, Nº 1-8, más preferiblemente Nº 1-7, Nº 1-6, Nº 1-5, Nº 1-4, aún más preferiblemente Nº 1-3, Nº 1-2 de los motivos de 4 meros listados anteriormente, lo más preferiblemente, el motivo de 4 meros es UCGU.
El oligonucleótido o precursor del mismo puede comprender una o más copias del mismo motivo de 4 meros, o una
o más copias de diferentes motivos de 4 meros.
El oligonucleótido o el precursor del mismo se puede utilizar para generar una gran cantidad de IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL-18 y/o IL-1β in vitro y/o in vivo. Dichas citocinas se pueden generar en altas cantidades a partir de diferentes fuentes celulares, incluyendo tanto las células inmunitarias como no inmunitarias, de diferentes especies de vertebrados.
El oligonucleótido y el precursor del mismo se pueden preparar por métodos sintéticos incluyendo, pero sin limitarse a, síntesis química, transcripción in vitro y transcripción in vivo. En la transcripción in vitro, se pueden utilizar polimerasas, incluyendo, pero sin limitarse a, una polimerasa de bacteriófago tal como polimerasa T7, polimerasa T3, polimerasa SP6, polimerasas víricas, y RNA polimerasa de E. coli. La transcripción in vivo se puede conseguir en las células infectadas por virus, o bacterias que son infectadas o no infectadas con un fago.
Además, los oligonucleótidos o sus precursores, en particular, los oligonucleótidos de RNA, para uso de la invención pueden ser unidos covalentemente o no covalentemente a uno o más grupos lipófilos que mejoran la estabilidad y/o la actividad y/o facilitan la administración de los oligonucleótidos o precursores de los mismos.
Tal como se utiliza aquí, el término "lipófilo" o "grupo lipófilo" se refiere en términos generales a cualquier compuesto
o resto químico que tiene una afinidad por los lípidos. Los grupos lipófilos engloban compuestos de muchos tipos diferentes, incluyendo aquellos que tienen características aromáticas, alifáticas o alicíclicas, y combinaciones de los mismos.
En realizaciones específicas, el grupo lipófilo es una sustancia alifática, alicíclica, o polialicíclica, tal como un esteroide (por ejemplo, esterol) o un hidrocarburo alifático ramificado. El grupo lipófilo comprende generalmente una cadena de hidrocarburo, que puede ser cíclico o acíclico. La cadena de hidrocarburo puede comprender varios sustituyentes y/o al menos un heteroátomo, tal como un átomo de oxígeno. Tales restos alifáticos lipófilos incluyen, sin limitación, ácidos grasos saturados o insaturados, ceras (por ejemplo, ésteres de alcohol monovalente de ácidos grasos y diamidas grasas), terpenos (por ejemplo, los terpenos C10, sesquiterpenos C15, diterpenos C20, triterpenos C30, y tetraterpenos C40), y otros hidrocarburos polialicíclicos.
El grupo lipófilo se puede unir por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo por medio de un agrupamiento funcional presente en o introducido en el oligonucleótido de RNA, tal como un grupo hidroxi (por ejemplo, -CO-CH2-OH). Se puede producir la conjugación del oligonucleótido de RNA y el grupo lipófilo, por ejemplo, mediante la formación de un enlace de éter o de éster carboxílico o de carbamoilo entre el hidroxi y un grupo alquilo R-, un grupo alcanoilo RCO-o un grupo carbamoilo sustituido KNHCO-. El grupo alquilo R puede ser cíclico (por ejemplo, ciclohexilo) o acíclico (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada; y saturado o insaturado). El grupo alquilo R puede ser un grupo butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo u octadecilo, o similares. Preferiblemente, el grupo lipófilo se conjuga con el grupo 5' hidroxilo del nucleótido terminal. En una realización preferida, el grupo lipófilo es bisdecilamida de ácido 12hidroxidodecanoico.
En otra realización, el grupo lipófilo es un esteroide, tal como esterol. Los esteroides son compuestos policíclicos que contienen un sistema de anillo perhidro-1,2-ciclopentanofenantreno. Los esteroides incluyen, sin limitación, ácidos biliares (por ejemplo, ácido cólico, ácido desoxicólico y ácido deshidrocólico), cortisona, digoxigenina, testosterona, colesterol y esteroides catiónicos, tales como la cortisona.
En una realización preferida, el grupo lipófilo es colesterol o un derivado del mismo. Un "derivado de colesterol" se refiere a un compuesto derivado de colesterol, por ejemplo, por sustitución, adición o separación de sustituyentes. El esteroide se puede unir al oligonucleótido de RNA mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización preferida, el grupo lipófilo es carbamato de (6-hidroxihexil)colesterilo.
En otra realización, el grupo lipófilo es un resto aromático. En este contexto, el término "aromático" se refiere en términos generales a hidrocarburos mono y poliaromáticos. Los grupos aromáticos incluyen, sin limitación, restos de arilo C6-14 que comprenden uno a tres anillos aromáticos, que pueden estar opcionalmente sustituidos; grupos “aralquilo” o "arilalquilo" que comprenden un grupo arilo unido covalentemente a un grupo alquilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente independientemente sustituido o no sustituido; y grupos "heteroarilo". Como se utiliza en la presente memoria, el término "heteroarilo" se refiere a grupos que tienen 5 a 14 átomos en el anillo,
imagen12
5
15
25
35
45
55
una realización preferida, el agente de complejación es un lípido catiónico. En otra realización preferida, el agente de complejación es polietilenimina (PEI) (K. Wu et al., Brain Research 1008 (2): 284-287 (May 22, 2004); B. Urban-Klein et al. Gene Therapy 12(5): 461-466 (2005)). Ejemplos adicionales de agente de complejación incluyen, pero no se limitan a, derivados de colágeno (Y. Minakuchi et al. Nucleic Acids Research 32(13):e109 (2004)), y microesferas biodegradables tales como liposomas (M. Sioud, D. Sorensen, Biochem Biophys Res Commun 312(4): 1220-1225 (2003); PY Chien et al. Cancer Gene Therapy 12(3): 321-328 (2005)), virosomas (J de Jonge et al. Gene Therapy,
13: 400-411 (2006)), SNALPs (JJ Rossi, Gene Therapy 13: 583-584 ( 2006)), SICOMATRIX® (CSL Limited) (I. D. Davis et al. PNAS 101 (29): 10697-10702 (July 20, 2004); MJ Pearse, D. Drane, Adv Drug Deliv Rev 57(3):465-474 (Jan 10, 2005)), y microesferas de copolímero de poli (D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA) (A. Khan et al. J Drug Target 12(6): 393-404 (2004)).
La polietilenimina (PEI) puede ser lineal o ramificada. En una realización preferida, PEI es jetPEI™ in vivo que es una PEI lineal desarrollada por PolyPlus-transfection para la administración eficaz y reproducible de oligonucleótidos aniónicos con baja toxicidad in vivo. Las vías de administración preferidas in vivo incluyen, pero no se limitan a las vías, intravenosa, intracerebral e intraperitoneal.
Los virosomas son envolturas víricas reconstituidas que se preparan a partir de virus con membrana de envoltura, en particular, virus de la gripe, por solubilización de la membrana vírica con un detergente adecuado, separación de las nucleocápsidas por ultracentrifugación y reconstitución de la envoltura vírica por medio de la extracción del detergente. Típicamente, los virosomas contienen lípidos víricos y glucoproteínas víricas (tales como hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) en el caso de virosomas de la gripe), se asemejan a las partículas de virus nativas en tamaño y morfología y retienen la especificidad del objetivo y la actividad fusogénica de las partículas víricas nativas.
Las SNALP indican partículas estables de ácido nucleico-lípido y contienen una bicapa lipídica compuesta de una mezcla de lípidos catiónicos y fusogénicos recubiertos con polietilenglicol difusible (PEG). Las SNALP están en el intervalo de tamaño de diámetro de 120 nanómetros, protegen al ácido nucleico incluido de las nucleasas séricas y permiten la absorción endosómica celular y la posterior liberación citoplasmática del ácido nucleico.
ISCOMATRIX® está hecho de saponina, colesterol y fosfolípidos en condiciones definidas y forma estructuras tipo jaula típicamente de 40 nm de diámetro. ISCOMATRIX® tiene la capacidad dual de facilitar la administración de la carga (por ejemplo, antígeno) y estimular el sistema inmunitario, tanto la respuesta inmunitaria celular como la humoral.
En otra realización, el agente de administración es un virus, preferiblemente un virus de replicación deficiente. En una realización, el oligonucleótido descrito en la invención está contenido en una cápsula vírica.
Los virus adecuados incluyen, pero no se limitan a, polimixovirus que se dirigen a los epitelios del tracto respiratorio superior y otras células, el virus de la hepatitis B que se dirige a las células del hígado, el virus de la gripe que se dirige a las células epiteliales y otras células, los adenovirus que se dirigen a una serie de diferentes tipos de células, los virus del papiloma que se dirigen a las células epiteliales y escamosas, el virus del herpes que se dirige a las neuronas, los retrovirus tales como el VIH que se dirige a las células T CD4+ y células dendríticas y otras células, y el virus Vaccinia Ankara modificado que se dirige a una variedad de células. Los virus pueden ser seleccionados en función de su especificidad de objetivo.
En una realización, el virus es un virus oncolítico. Los virus oncolíticos se dirigen a las células tumorales y causan la lisis de las células tumorales infectadas. Ejemplos de virus oncolíticos incluyen, pero no se limitan a, virus naturales de la enfermedad de Newcastle producida naturalmente (A. Phuangsab et al. Cancer Lett. 172: 27-36 (2001)), cepas atenuadas de reovirus (MC Coffey et al. Science 282: 1332-1334 (1998)) y virus de la estomatitis vesicular (VSV) (DF Stojdl et al. Nat Med. 6: 821-825 (2000)), mutantes de ingeniería genética de virus herpes simplex tipo 1 (HSV1), adenovirus, virus de la viruela y virus del sarampión (Chiocca EA Nat Rev Cancer 2: 938-950 (2002); Russell SJ Cancer gene Ther 9: 961-966 (2002); HJ Zen, DL Bartlett Cancer gene Ther 9: 1001-1012 (2002)).
Además de ser administrado por un agente de administración, el oligonucleótido o precursor del mismo puede ser administrado a las células por medio de medios físicos tales como la electroporación, administración por ondas de choque (Tschoep K et al., J Mol Med 2001; 79: 306-13), transfección desencadenada por ultrasonidos, y administración por pistola de genes con partículas de oro.
La composición farmacéutica puede comprender además otro agente tal como un agente que estabiliza el oligonucleótido, en particular, oligonucleótido de RNA, por ejemplo, una proteína que forma complejo con el agente oligonucleótido para formar una iRNP. Aún otros agentes incluyen quelantes, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para eliminar los cationes divalentes tales como Mg2+), sales, inhibidores de RNasa (por ejemplo, un inhibidor de RNasa de amplia especificidad tal como RNAsin) y así sucesivamente.
Una composición formulada puede asumir una variedad de estados. En algunos ejemplos, la composición es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina, y/o anhidra (por ejemplo, menos de 80, 50, 30, 20, o 10 % de agua). En otro ejemplo, el agente oligonucleótido está en una fase acuosa, por ejemplo, en una solución que incluye agua, siendo esta forma la forma preferida para la administración mediante inhalación.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La fase acuosa o las composiciones cristalinas se pueden incorporar a un vehículo de administración, por ejemplo, un liposoma (en particular para la fase acuosa), o una partícula (por ejemplo, una micropartícula que puede ser apropiada para una composición cristalina). Generalmente, la composición de oligonucleótidos se formula en una forma que sea compatible con el método de administración pretendido.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las vías oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, por vías respiratorias (aerosol), ocular, rectal, vaginal, y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas se administran por perfusión o inyección intravenosa o intraparenteral. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar también intraparenquimalmente, intratecalmente, y/o por inyección estereotáctica.
Para la administración oral, el oligonucleótido se proporcionará generalmente en forma de comprimidos o cápsulas, como un polvo o gránulos, o como una solución o suspensión acuosa.
Los comprimidos para uso oral pueden incluir los ingredientes activos mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.
Las cápsulas para uso oral incluyen cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido, y cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, las composiciones farmacéuticas generalmente se proporcionarán en soluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. Los vehículos acuosos adecuados incluyen solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Las suspensiones acuosas según la invención pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y de n-propilo.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también formulaciones encapsuladas para proteger el oligonucleótido contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilen-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos víricos) también se pueden utilizar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.522.811; en la publicación PCT WO 91/06309; y en la publicación de patente europea EP-A-43075.
En general, una dosis adecuada de un oligonucleótido estará en el intervalo de 0,001 a 500 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día (por ejemplo, de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo por kilogramo a aproximadamente 75 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 10 microgramos por kilogramo a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo, o de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo). La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el oligonucleótido se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día. En ese caso, el oligonucleótido contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede componer para administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida del agente durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
Los expertos apreciarán que ciertos factores pueden influir en la dosis y en el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad/trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades/trastornos presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis eficaces y las semividas in vivo para el oligonucleótido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
individual se pueden hacer utilizando metodologías convencionales o sobre la base de los ensayos in vivo utilizando un modelo animal apropiado.
La toxicidad y la eficacia terapéutica del oligonucleótido y de la composición farmacéutica se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren agentes oligonucleótidos que presenten altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. Las dosificaciones de las composiciones están preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente oligonucleótido para uso en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración circulante en plasma del agente oligonucleótido que incluye la IC50 (es decir, la concentración del agente oligonucleótido de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alta resolución.
El médico dispensador puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de la composición farmacéutica en base a los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria.
La composición farmacéutica se puede utilizar para generar una gran cantidad de IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL18 y/o IL-1β, in vitro y/o in vivo. El IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL-18 y/o IL-1β, se puede generar en altas cantidades a partir de diferentes fuentes celulares, incluyendo tanto las células inmunitarias como las no inmunitarias, de diferentes especies de vertebrados.
La composición farmacéutica se puede usar para prevenir y/o tratar una enfermedad y/o un trastorno en un animal vertebrado, en particular, un mamífero, en la práctica médica y/o veterinaria. La enfermedad y/o trastorno es un tumor.
Preparación combinada
La presente divulgación proporciona una preparación combinada que comprende un oligonucleótido y un agente farmacéuticamente activo, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial.
Los agentes farmacéuticamente activos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos de RNA inmunoestimulantes, oligonucleótidos de DNA inmunoestimulantes, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, antibióticos, factores antiangiogénicos, agentes quimioterapéuticos, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antiparasitarios, anticuerpos y agentes de silenciamiento génico.
La preparación combinada puede comprender uno o más agentes farmacéuticamente activos. Los uno o más agentes farmacéuticamente activos pueden ser de la misma o diferente categoría como se ha ejemplificado anteriormente.
En una realización, la preparación combinada comprende un oligonucleótido y un agente inmunoestimulante, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial. En una realización, la preparación combinada comprende además un agente antivírico y/o antitumoral.
En otra realización, la preparación combinada comprende un oligonucleótido y un agente antivírico y/o antibacteriano y/o antitumoral, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial. En una realización, la preparación combinada comprende además un agente inmunoestimulante.
El oligonucleótido y el agente farmacéuticamente activo pueden estar comprendidos en la misma composición o en composiciones separadas. Las composiciones separadas se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente.
La preparación combinada puede comprender además ácido retinoico y/o IFN tipo I. Se sabe que el ácido retinoico y/o el IFN tipo I regulan por incremento la expresión de RIG-I en la mayoría de tipos de células, incluyendo por ejemplo células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, células inmunitarias y células tumorales.
Un agente inmunoestimulante es un agente, tal como una molécula o una composición, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Los agentes inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos de RNA
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
moldes de más de 40 pb por medio de PCR utilizando el pBluescript KS como un molde (para una lista detallada de todos los moldes de transcripción in vitro véase la tabla 1). Los moldes obtenidos contenían un promotor de consenso de la RNA polimerasa T7 seguido por la secuencia de interés a ser transcrita. Se incubaron 20 pmol del molde de DNA con 30 U de RNA polimerasa T7, 40 U de inhibidor de RNasa, 0,3 U de pirofosfatasa inorgánica de 5 levadura en un tampón que contiene Tris-HCl 40 mM pH 8,0, DTT 10 mM, espermidina-HCl 2 mM (Sigma) y MgCI2 20 mM. El RNA con caperuza se transcribió utilizando el Kit Opti mRNA (Curevac). Para transcribir los RNA modificados en nucleósidos, se reemplazó la uridina-5'-trifosfato por pseudouridina-5'-trifosfato o por 2-tiouridina-5'trifosfato (ambas de TriLink, San Diego, USA) durante la reacción de transcripción in vitro. Para la incorporación de UTP 2'-O-metilado (Trilink), se utilizó polimerasa T7 R&DNA™ (Eipcentre, Madison, USA). Esta polimerasa tiene 10 mutaciones del sitio activo de una sola base que permiten la incorporación de los NTP con 2'-sustituyentes tales como 2'-O-metilo. La transcripción in vitro se llevó a cabo durante la noche a 37 ºC. El molde de DNA se sometió a digestión utilizando DNasa I (Fermentas) y, posteriormente, los RNA se purificaron utilizando el kit de aislamiento de RNA de alta pureza de Roche (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) con las siguientes modificaciones: El tampón de unión era tiocianato de guanidina 2,0 M en etanol al 70 % y el tampón de lavado fue sustituido por NaCl
15 100 mM, EDTA 4,5 mM, Tris HCl 10 mM en etanol al 70 %. Después de elución, el exceso de sales y los NTP se eliminaron haciendo pasar los RNA por medio de una columna Mini Quick Spin™ Oligo Column (Roche). El tamaño y la integridad del RNA se comprobó mediante electroforesis en gel.
Tabla 1
A: Oligonucleótidos de DNA para la generación de moldes de transcripción in vitro:
imagen18
imagen19
Cadenas correspondientes:
imagen20
B: Cebador de PCR para la generación de moldes de transcripción in vitro utilizando pBKS como el molde de PCR Cebador directo:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
imagen21
Cebador reverso:
imagen22
Extractos celulares
Se prepararon lisados celulares según Meister et al. (G. Meister et al., Mol Cell 15, 185 (Jul 23, 2004)) con modificaciones menores. Se transfectaron células HEK 293 utilizando polietilenimina de alto peso molecular (25 kDa) (PEI; Sigma, 40.872-7). A una confluencia del 80-90 %, se transfectaron las células con una relación PEI:DNA de 1,5:1. 24-36 horas después de la transfección se recogieron las células y el sedimento celular se resuspendió en cinco volúmenes de sedimento de KCI 10 mM, MgCl2 1,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, HEPES-NaOH 10 mM (pH 7,9), PMSF 0,5 mM y se incubó durante diez minutos en hielo. Posteriormente se lavaron las células y el sedimento celular se resuspendió en dos volúmenes de sedimento del tampón descrito anteriormente y se homogeneizó por trituración. Los núcleos de las células se retiraron del lisado de células por centrifugación a 2000 g durante diez minutos. El sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga y se aclaró adicionalmente por centrifugación a 2000 g durante diez minutos y centrifugación adicional durante 30 minutos a 20.000 g para obtener el extracto citoplasmático. La concentración de KCI del extracto se elevó posteriormente a 100 mM por adición de KCl 2 M y se añadió glicerol hasta un porcentaje del 10 %. Para la purificación de los complejos de RIG-IC marcados con FLAG, se incubaron los extractos citoplásmicos en perlas de agarosa FLAG M2 (Sigma). Las perlas de agarosa FLAG M2 se lavaron una vez con glicina 0,1 M (pH 3,5) y se equilibraron por lavado con Tris-HCl 1 M (pH 8,0). Después se resuspendieron las perlas en tampón C (KCI 0,1 M. MgCl2 5 mM, 10 % de glicerol, 10 % de Tween 20, ßmercaptoetanol 10 mM, PMSF 0,2 mM, y Tris-HCl 20 mM [pH 8,0]) y se incubaron con extractos citoplasmáticos durante cuatro horas a 4 ºC con rotación. Se recogieron las perlas y se lavaron dos veces en tampón de lavado (NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM [pH 7,5]) complementado con 0,1 % de NP40. Se eluyeron entonces los complejos unidos por afinidad agitando las perlas en 3x péptido FLAG a 0,2 µg/ml (Sigma) en tampón de lavado durante dos horas a 10 ºC y después de la centrifugación se recogió el eluato.
Estudios de unión a ligando
El lisado de células enteras o 25 µl de eluato de RIG-IC se incubó con 0,375 µg de RNA biotinilado en presencia de 40 U de inhibidor RNasa (Fermentas), PMSF 0,5 mM en un volumen final de 100 µl en tampón de lavado durante dos horas a 4 ºC con rotación. Se añadieron al lisado 50 µl de perlas recubiertas con estreptavidina (Pierce, Rockford, USA; 20347) durante otra hora a temperatura ambiente con rotación. Se lavaron entonces las perlas cuatro veces con tampón de lavado complementado con 0,1 % de NP40. Se lisaron el sobrenadante y las perlas en tampón de Laemli para su posterior análisis de inmunotransferencia.
Transferencia Western
Para la transferencia Western, se separaron muestras mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham-Biosciences, UK) mediante electrotransferencia semi-seca. Como anticuerpo primario, se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-Flag (Sigma). Como anticuerpo secundario, se utilizó anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Amersham-Biosciences). Los anticuerpos unidos se visualizaron por el sistema de quimioluminiscencia potenciada (ECL) según el protocolo del fabricante (Amersham-Biosciences).
Ensayos de reportero
12-16 horas antes de la transfección, se sembraron células HEK 293 en placas de 48 pocillos. A una confluencia del 80 %, se transfectaron las células HEK 293 utilizando PEI con 300 ng de un plásmido reportero (pIFNβ-luc), 500 ng de un plásmido de normalización (que expresa la β-galactosidasa del virus del sarcoma de Rous) y los plásmidos de expresión indicados dando un total de 1,5 µg de DNA/pocillo. 24 horas después de la transfección se aspiró el medio de cultivo y se lavaron las células una vez en 0,5 ml de PBS que contenía EDTA 10 mM. Después se lisaron las células en 50 µl de tampón de lisis de luciferasa (10 % de glicerol, 1 % de Triton-X, EDTA 2 mM, TrisHCI 25 mM [pH 7,8], DTT 2 mM). Se mezclaron 20 µl de cada muestra con 20 µl de reactivo de detección de luciferasa (Promega) y
imagen23
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29
imagen30
imagen31
imagen32
imagen33
Ejemplo 10: Cancelado
Ejemplo 11. Combinación de funciones inmunoestimulantes potentes con eficiente actividad de silenciamiento génico en una molécula de RNA
Se identificaron varias secuencias dirigidas a Bcl-2 murino y posteriormente se generaron tres siRNAs sintéticos (anti-Bcl-2.1, anti-Bcl-2.2, anti-Bcl-2.3) dirigidos a diferentes porciones del mRNA Bcl-2 murino (para una lista detallada de todos los oligonucleótidos de RNA sintetizados químicamente véase la Tabla 3).
Tabla 3. Secuencias de RNA sintetizadas químicamente
SEQ. ID. No.
Nombre Tipo Secuencia 5’→3
103
Bcl-2 murino 2.1 sentido RNA AUGCCUUUGUGGAACUAUA
104
Bcl-2 murino 2.1 antisentido RNA UAUAGUUCCACAAAGGCAU
105
Bcl-2 murino 2.2 sentido RNA GCAUGCGACCUCUGUUUGA
106
Bcl-2 murino 2.2 antisentido RNA UCAAACAGAGGUCGCAUGC
107
Bcl-2 murino 2.3 sentido RNA GGAUGACUGAGUACCUGAA
108
Bcl-2 murino 2.3 antisentido RNA UUCAGGUACUCAGUCAUCC
109
Poli-A RNA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
175
RIG-I murino sentido RNA GAAGCGUCUUCUAAUAAUU
176
RIG-I murino antisentido RNA AAUUAUUAGAAGACGCUUC
177
Control RNA UUCUCCGAACGUGUCACGU
178
Control antisentido RNA ACGUGACACGUUCGGAGAA
10 Después de la transfección de los diferentes anti-Bcl-2-siRNAs y un siRNA de control en células de melanoma B16, se determinó la regulación por disminución de Bcl-2 mediante transferencia de Western de los lisados celulares (Fig.15a, panel superior). Diferentes siRNAs mostraron diferentes eficiencias en la regulación por disminución objetivo. El tratamiento de las células de melanoma B16 con una dosis única de anti-Bcl-2.2 (denominado ahora OH2.2) dio como resultado una regulación por disminución eficiente de la expresión de Bcl-2 48 h después de la
15 transfección en comparación con el siRNA de control (Fig. 15a, panel superior). Esta reducción específica de Bcl-2 ya fue observada después de 18 h, se prolongó durante al menos 72 h y se confirmó por análisis FACS de Bcl-2 intracelular (no se muestran datos).
Posteriormente, el anti-Bcl-2.2 fue transcrito in vitro teniendo así 5’ trifosfatos (denominado ahora 3p-2.2; para una lista detallada de todos los moldes de transcripción in vitro véase la Tabla 4).
20 Tabla 4. Moldes de DNA para la transcripción in vitro
imagen34
imagen35
imagen36
imagen37
imagen38
imagen39

Claims (1)

  1. imagen1
ES07801562.5T 2006-08-08 2007-08-08 Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato Active ES2647452T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06016578 2006-08-08
EP06016578 2006-08-08
EP06021271 2006-10-10
EP06021271A EP1920775B1 (en) 2006-10-10 2006-10-10 5'Triphosphate oligonucleotide induces anti-viral response
PCT/EP2007/007024 WO2008017473A2 (en) 2006-08-08 2007-08-08 Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2647452T3 true ES2647452T3 (es) 2017-12-21

Family

ID=38875059

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17194752T Active ES2911034T3 (es) 2006-08-08 2007-08-08 Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato
ES07801562.5T Active ES2647452T3 (es) 2006-08-08 2007-08-08 Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17194752T Active ES2911034T3 (es) 2006-08-08 2007-08-08 Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato

Country Status (14)

Country Link
US (3) US20100178272A1 (es)
EP (3) EP2056845B1 (es)
JP (6) JP2010500011A (es)
AU (1) AU2007283022B2 (es)
CA (1) CA2660232C (es)
CY (1) CY1119608T1 (es)
DK (1) DK2056845T3 (es)
ES (2) ES2911034T3 (es)
HU (1) HUE037173T2 (es)
LT (1) LT2056845T (es)
PL (1) PL2056845T3 (es)
PT (1) PT2056845T (es)
SI (1) SI2056845T1 (es)
WO (1) WO2008017473A2 (es)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010500011A (ja) 2006-08-08 2010-01-07 ガンサー ハートマン ５’リン酸オリゴヌクレオチドの構造および使用
EP2338499A1 (en) 2006-10-10 2011-06-29 Gunther Hartmann 5' triphosphate oligonucleotide induces anti-viral response
US20120177610A1 (en) 2007-09-19 2012-07-12 Kieu Hoang Manufacturing and Purification Processes of Complex Protein found in Fraction IV to make a separated Apo, Transferrin , and Alpha 1 Anti strepsin (A1AT) or A combined Transferrin / Apo/Human Albumin/A1AT and all new found proteins
CN101424640B (zh) 2007-11-02 2012-07-25 江苏命码生物科技有限公司 血清中微小核糖核酸的检测方法和用于检测的试剂盒、生物芯片及其制作和应用方法
DK2518150T3 (en) 2008-05-21 2015-12-07 Univ Bonn 5'Trip phosphate triphosphate oligonucleotide and uses thereof
JP2017006144A (ja) * 2008-05-21 2017-01-12 ライニッシュ フリードリッヒ−ウィルヘルムズ−ユニバーシタット ボン 平滑末端を有する５’三リン酸オリゴヌクレオチドおよびその使用
US9738680B2 (en) 2008-05-21 2017-08-22 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
WO2010002851A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Silencing and rig-1 activation by dual function oligonucleotides
WO2010085665A2 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeted delivery system
EP3263707A1 (en) 2009-03-17 2018-01-03 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Tlr8 ligand and uses thereof
WO2011066651A1 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Snalp formulations containing antioxidants
WO2011106104A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for the detection and treatment of cancer involving mirnas and mirna inhibitors and targets
WO2011114346A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Chetan Balar Chitin and related compounds for use in treating bacterial and viral infections
US20120009130A1 (en) * 2010-05-06 2012-01-12 Nanoaxis Viral Therapy and Prophylaxis Using Nanotechnology Delivery Techniques
CN101892241B (zh) * 2010-07-09 2013-01-09 电子科技大学 一种草鱼白细胞介素1β基因和蛋白及其重组表达方法
US9040234B2 (en) 2010-08-30 2015-05-26 Spring Bank Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs as therapeutic agents
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US8916352B2 (en) * 2011-04-08 2014-12-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. PCR reaction mixtures with decreased non-specific activity
US9844592B2 (en) * 2011-07-18 2017-12-19 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Bacterial RNAs as vaccine adjuvants
JP2014532400A (ja) 2011-10-31 2014-12-08 リボックス・ゲーエムベーハー 免疫賦活用の二本鎖ｒｎａ
WO2013097965A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Riboxx Gmbh Triphosphate-containing double-stranded rna for immunostimulation
TW201335181A (zh) * 2012-01-31 2013-09-01 Kieu Hoang ５５種新發現的蛋白質之序列及其應用
EP2712870A1 (en) * 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
US20140287023A1 (en) * 2013-02-11 2014-09-25 Mcgill University 5'-triphosphate oligoribonucleotides
US10077439B2 (en) * 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
PL3019619T3 (pl) 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
US10457946B2 (en) * 2013-09-16 2019-10-29 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Methods for overcoming glucocorticoid resistance and for determining glucocorticoid resistance potential in cancer
EP3083962B1 (en) * 2013-12-16 2021-08-18 RiboxX GmbH Double-stranded polyc:poly(g/i) rna for immunostimulation and cancer treatment
JP2015142566A (ja) * 2013-12-26 2015-08-06 国立大学法人 鹿児島大学 養魚用飼料
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US9670489B2 (en) * 2014-07-14 2017-06-06 Kaohsiung Medical University Method for treating and/or preventing myopia
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
EP3172324A4 (en) 2014-07-18 2018-04-25 Oregon Health & Science University 5'-triphosphate oligoribonucleotides
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
CA2975855C (en) 2015-02-04 2025-09-23 Twist Bioscience Corporation SYNTHETIC GENE COMPOSITIONS AND ASSEMBLY METHODS
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
EP4101930A1 (en) 2015-09-17 2022-12-14 ModernaTX, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
KR20180050411A (ko) 2015-09-18 2018-05-14 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
WO2017053450A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
KR101899057B1 (ko) 2015-10-15 2018-09-14 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
WO2017065405A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제
WO2017065369A1 (ko) * 2015-10-15 2017-04-20 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제
KR101842679B1 (ko) 2015-10-15 2018-03-28 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제
KR101881502B1 (ko) 2015-10-15 2018-07-25 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제
EP3384077A4 (en) 2015-12-01 2019-05-08 Twist Bioscience Corporation FUNCTIONALIZED SURFACES AND MANUFACTURE THEREOF
US12385034B2 (en) 2016-06-24 2025-08-12 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
WO2018038772A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
EP4664304A3 (en) 2016-09-21 2026-01-21 Atlas Data Storage, Inc. Nucleic acid based data storage
GB2573069A (en) 2016-12-16 2019-10-23 Twist Bioscience Corp Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018156792A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
CA3056388A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018172546A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Rigontec Gmbh Method for designing rig-i ligands
BR112019021520A2 (pt) 2017-04-14 2020-08-04 Tollnine, Inc. oligonucleotídeo, composto, polinucleotídeo imunomodulador, composição, conjugado, método para modular um receptor, método de tratamento de um tumor, método de tratamento de câncer, método para tratar um tumor, método de prevenção de câncer, método para induzir uma resposta imune
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
IL271205B2 (en) 2017-06-12 2025-02-01 Twist Bioscience Corp Methods for assembling continuous nucleic acids
CN111566125A (zh) 2017-09-11 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 Gpcr结合蛋白及其合成
CN111565834B (zh) 2017-10-20 2022-08-26 特韦斯特生物科学公司 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔
JP7386161B2 (ja) * 2017-12-19 2023-11-24 ブレイズ バイオサイエンス， インコーポレイテッド 腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチド免疫抗がん剤複合体、ならびにそれらの使用方法
IL312616B2 (en) 2018-01-04 2025-08-01 Twist Bioscience Corp Dna-based digital information storage
AU2019215191B2 (en) * 2018-02-02 2025-08-14 University Of Washington Compositions and methods for inducing tripartite motif-containing protein 16 (trim16) signaling
CN119286871A (zh) 2018-04-19 2025-01-10 查美特制药公司 合成rig-i样受体激动剂
EP3814497A4 (en) 2018-05-18 2022-03-02 Twist Bioscience Corporation POLYNUCLEOTIDES, REAGENTS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION
EP3863675A4 (en) * 2018-10-09 2023-09-06 Yale University RIG-I AGONISTS AND METHODS OF USE THEREOF
EP3902816A4 (en) 2018-12-26 2022-09-14 Twist Bioscience Corporation HIGH-PRECISION DE NOVO POLYNUCLEOTIDE SYNTHESIS
KR20210144698A (ko) 2019-02-26 2021-11-30 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 항체 최적화를 위한 변이 핵산 라이브러리
CA3131689A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
WO2020225779A1 (en) * 2019-05-09 2020-11-12 Istituto Pasteur Italia - Fondazione Cenci Bolognetti Rig-i agonists for cancer treatment and immunotherapy
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
WO2020260547A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 Rigontec Gmbh Design method for optimized rig-i ligands
WO2021028439A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Curevac Ag Rna combinations and compositions with decreased immunostimulatory properties
CN115023440B (zh) 2019-09-23 2025-09-12 特韦斯特生物科学公司 结合CD3ε的抗体
US12091777B2 (en) 2019-09-23 2024-09-17 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
CA3155202A1 (en) 2019-10-23 2021-04-29 Arthur M. Krieg Synthetic rig-i-like receptor agonists
AU2020400030B2 (en) 2019-12-09 2026-05-21 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for adenosine receptors
IL295759A (en) 2020-02-28 2022-10-01 Tallac Therapeutics Inc Transglutaminase mediated coupling
EP3909612A1 (en) 2020-05-12 2021-11-17 Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG Composition of nanoparticles
CN115916978A (zh) * 2020-05-19 2023-04-04 哈德森医学研究所 寡核苷酸
WO2021237067A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 President And Fellows Of Harvard College Interferon- inducing oligonucleotide duplexes and methods of use
AU2021413862A1 (en) * 2020-12-30 2023-07-27 Transcode Therapeutics, Inc. Template directed immunomodulation for cancer therapy
KR20240043747A (ko) 2021-07-02 2024-04-03 예일 유니버시티 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2024532621A (ja) 2021-08-31 2024-09-05 イエール ユニバーシティ がんを治療するための組成物および方法
AU2023228912A1 (en) 2022-03-03 2024-09-19 Yale University Humanized 3e10 antibodies, variants, and antigen binding fragments thereof
WO2026039779A1 (en) 2024-08-15 2026-02-19 Yale University Humanized 3e10 antibodies and antigen binding fragments optimized for rad51 binding
WO2026047025A1 (en) 2024-08-27 2026-03-05 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Photocontrollable conjugate, pharmaceutical composition and kit comprising the same, and uses thereof

Family Cites Families (220)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3534017A (en) 1967-03-14 1970-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for the preparation of nucleoside-5'-diphosphates and triphosphates and mono- and oligo-nucleotidyl-nucleoside-5'-diphosphates and triphosphates
US4210746A (en) 1978-08-10 1980-07-01 National Research Development Corporation Nucleotide inhibitor of protein synthesis
US4285605A (en) 1979-07-02 1981-08-25 International Business Machines Corporation Escapement mechanism and backspace mechanism for a moving paper carriage typewriter having dual pitch capability
FR2471785A1 (fr) * 1979-12-21 1981-06-26 Fabre Sa Pierre Preparations immunostimulantes a base d'arn ribosomaux et procede de preparation des arn
DE3023787A1 (de) 1980-06-25 1982-01-21 Studiengesellschaft Kohle mbH, 4330 Mülheim Verfahren zur erhoehung der inkorporation und der expression von genetischem material in die kerne von intakten zellen mit hilfe von liposomen
EP0081099A3 (en) 1981-12-04 1983-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Capped oligonucleotide anti-viral agents
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
WO1989008146A1 (en) 1988-02-26 1989-09-08 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of htlv-iii by exogenous oligonucleotides
DE68929306T2 (de) 1988-04-27 2002-05-02 Isis Pharmaceutical, Inc. H-Phosphonat Ribonucleotid-Derivate
JP2976436B2 (ja) 1988-04-27 1999-11-10 味の素株式会社 新規オリゴリボヌクレオチド誘導体及び抗ウイルス剤への使用
DE3907562A1 (de) 1989-03-09 1990-09-13 Bayer Ag Antisense-oligonukleotide zur inhibierung der transaktivatorzielsequenz (tar) und der synthese des transaktivatorproteins (tat) aus hiv-1 und deren verwendung
WO1990014353A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Microprobe Corporation Crosslinking oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
EP0452457B1 (en) 1989-11-03 1997-08-20 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
CA2078659A1 (en) 1990-03-21 1991-09-22 David J. Ecker Reagents and methods for modulating gene expression through rna mimicry
US5292875A (en) 1990-04-20 1994-03-08 Lynx Therapeutics, Inc. Method of synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
NZ239252A (en) 1990-08-09 1997-07-27 Genta Inc Reagent for attaching a psoralen-containing moiety to an oligonucleotide(derivative); oligonucleotide(derivative)-psoralen conjugates
JPH06501843A (ja) 1990-08-14 1994-03-03 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド アンチセンスオリゴヌクレオチドによるインフルエンザａ型ウイルス，アン・アーバｈ２ｎ２株の阻害
US5271941A (en) 1990-11-02 1993-12-21 Cho Chung Yoon S Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases
DE4110085A1 (de) 1991-03-27 1992-10-01 Boehringer Ingelheim Int 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide
HUT66828A (en) 1991-03-27 1995-01-30 Res Corp Technologies Inc Single-stranded circular oligonucleotides
US5646267A (en) 1991-08-05 1997-07-08 Polish Academy Of Sciences Method of making oligonucleotides and oligonucleotide analogs using phospholanes and enantiomerically resolved phospholane analogues
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US7119184B2 (en) 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
AU2874892A (en) 1991-10-15 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
NZ244820A (en) 1991-10-25 1994-01-26 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotide inhibitor of epstein-barr virus.
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
CA2135646A1 (en) 1992-05-11 1993-11-25 Kenneth G. Draper Method and reagent for inhibiting viral replication
US5606049A (en) 1992-06-03 1997-02-25 Genta Incorporated Method of preparing 2'-O-methyl cytidine monomers useful in oligomer synthesis
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
ATE256143T1 (de) 1992-07-23 2003-12-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-0-alkyl-nukleoside und-phosphoramidite, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen
TW244371B (es) 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
IL108206A0 (en) 1993-01-06 1994-04-12 Univ Johns Hopkins Oligomers having improved stability at acid ph
DK0677056T3 (da) 1993-01-25 1996-08-05 Hybridon Inc Oligonukleotid-alkylphosphonater og -alkylphosphonothioater
EP0695306A1 (en) 1993-04-19 1996-02-07 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
JPH09500787A (ja) 1993-07-19 1997-01-28 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 蛋白生産、細胞増殖および／または感染症病原体の増殖に対するオリゴヌクレオチド阻害の促進
JPH0799976A (ja) 1993-09-30 1995-04-18 Takeda Chem Ind Ltd 修飾オリゴヌクレオチド
US5801235A (en) 1994-05-25 1998-09-01 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity
AU2591495A (en) 1994-05-27 1995-12-21 Hybridon, Inc. Use of oligonucleotide phosphorothioate for depleting complement and for reducing blood pressure
US5866699A (en) 1994-07-18 1999-02-02 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-MDR-1 gene activity
ATE202569T1 (de) 1994-09-07 2001-07-15 Hybridon Inc Prodrug-oligonukleotide
GB2293088B (en) 1994-09-16 1998-02-04 Alliedsignal Ltd Guide loop height adjustment for vehicle passenger seat belts
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
JPH08154687A (ja) 1994-12-12 1996-06-18 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤
CA2207593A1 (en) 1994-12-13 1996-06-20 John Gustofson Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
AU4514696A (en) 1994-12-22 1996-07-10 Hybridon, Inc. Synthesis of stereospecific oligonucleotide phosphorothioates
US6111095A (en) * 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
GB9511720D0 (en) * 1995-06-09 1995-08-02 Isis Innovation Oligonucleotide phosphorylation method and products
US20040234999A1 (en) 1996-04-02 2004-11-25 Farrar Gwenyth Jane Genetic suppression and replacement
US6127535A (en) 1997-11-05 2000-10-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides
EP1626086A2 (en) 1998-04-20 2006-02-15 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
JP2002512794A (ja) 1998-04-29 2002-05-08 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ヌクレオチド三リン酸およびリボザイム内へのそれらの取り込み
EP1493818A3 (en) 1998-04-29 2006-02-15 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US6344323B1 (en) * 1998-09-16 2002-02-05 Vitagenix, Inc. Compositions and methods for inhibiting cox-2 expression and treating cox-2 associated disorders by using cox-2 antisense oligonucleotides
EP1212416A2 (en) 1999-08-31 2002-06-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
IL148844A0 (en) 1999-09-27 2002-09-12 Coley Pharm Group Inc Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US20020028784A1 (en) * 2000-03-10 2002-03-07 Nest Gary Van Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences
DE10013600A1 (de) 2000-03-18 2002-01-10 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Reaktive Monomere für die Oligonucleotid- und Polynucleotidsynthese, modifizierte Oligonucleotide und Polynucleotiden und ein Verfahren zu deren Herstellung
US6686461B1 (en) 2000-03-22 2004-02-03 Solulink Bioscience, Inc. Triphosphate oligonucleotide modification reagents and uses thereof
US20030077609A1 (en) 2001-03-25 2003-04-24 Jakobsen Mogens Havsteen Modified oligonucleotides and uses thereof
US6900308B2 (en) 2001-07-16 2005-05-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. α-modified nucleoside triphosphates
WO2003012052A2 (en) 2001-07-30 2003-02-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas
FR2832154B1 (fr) 2001-11-09 2007-03-16 Centre Nat Rech Scient Oligonucleotides inhibiteurs et leur utilisation pour reprimer specifiquement un gene
US20030203868A1 (en) 2002-02-06 2003-10-30 Bushman Frederic D. Inhibition of pathogen replication by RNA interference
RU2004128943A (ru) 2002-02-28 2005-04-20 Байота, Инк. (Us) Средства, имитирующие нуклеотиды, и их пролекарственные формы
AU2003218181A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Immunostimulatory double stranded RNA and methods of inducing, enhancing or modulating the immune response
NZ535952A (en) 2002-04-04 2009-01-31 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US20050222061A1 (en) 2002-04-18 2005-10-06 Schulte Ralf W Means and methods for the specific inhibition of genes in cells and tissue of the cns and/or eye
KR20050026384A (ko) 2002-04-26 2005-03-15 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 ＲＮＡｉ효과를 가지는 스템 루프 형 ＲＮＡ 분자 발현 시스템
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
CN1685063B (zh) 2002-08-12 2011-12-21 新英格兰生物实验室公司 与基因沉默相关的方法和组合物
US7109316B2 (en) 2002-08-23 2006-09-19 Ce Healthcare Bio-Sciences Corp. Oligonucleotide tagged nucleoside triphosphates (OTNTPs) for genetic analysis
EP1546402A4 (en) 2002-09-04 2006-12-27 Johnson & Johnson Res Pty Ltd METHODS OF USING DNADS IN INTERFERENT RNA MEDIATION (RNAi)
ES2456696T3 (es) 2002-09-11 2014-04-23 Genentech, Inc. Composiciones y métodos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores
EP2305813A3 (en) 2002-11-14 2012-03-28 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US7217807B2 (en) 2002-11-26 2007-05-15 Rosetta Genomics Ltd Bioinformatically detectable group of novel HIV regulatory genes and uses thereof
US20130130231A1 (en) 2002-11-26 2013-05-23 Isaac Bentwich Bioinformatically detectable group of novel viral regulatory genes and uses thereof
US7696334B1 (en) 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
DE602004015064D1 (de) 2003-01-06 2008-08-28 Wyeth Corp Zusammensetzungen und verfahren zur diagnose und behandlung von kolonkrebs
WO2004074441A2 (en) 2003-02-19 2004-09-02 Government Of The United States Of America Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Amplification or overexpression of mll septin-like fusion (msf) and septin9 and methods related thereto
CN1176937C (zh) 2003-02-21 2004-11-24 复旦大学附属中山医院 一种双链rna及其用途
US20040261149A1 (en) 2003-02-24 2004-12-23 Fauquet Claude M. siRNA-mediated inhibition of gene expression in plant cells
EP1605961A4 (en) 2003-03-12 2009-11-11 Vasgene Therapeutics Inc POLYPEPTIDE COMPOUNDS FOR INHIBITING ANGIOGENESIS AND TUMOR GROWTH
US7381410B2 (en) 2003-03-12 2008-06-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
AU2004221760B2 (en) 2003-03-21 2010-03-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Short interfering RNA (siRNA) analogues
US20040220130A1 (en) 2003-03-24 2004-11-04 Robbins Paul D. Compact synthetic expression vector comprising double-stranded DNA molecules and methods of use thereof
US8969543B2 (en) 2003-04-03 2015-03-03 Bioneer Corporation SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
US20050042641A1 (en) 2003-05-27 2005-02-24 Cold Spring Harbor Laboratory In vivo high throughput selection of RNAi probes
US20050059044A1 (en) 2003-06-03 2005-03-17 Graham Michael Wayne Double-stranded nucleic acid
WO2004108921A1 (ja) 2003-06-06 2004-12-16 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 核酸導入法
JP4874801B2 (ja) 2003-06-11 2012-02-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
FR2857013B1 (fr) 2003-07-02 2005-09-30 Commissariat Energie Atomique Petits arn interferents specifiques des sous-unites alpha, alpha prime et beta de la proteine kinase ck2 et leurs applications
CN1882693B (zh) * 2003-09-15 2012-08-15 普洛体维生物治疗公司 聚乙二醇修饰的脂质化合物及其应用
AU2005213464A1 (en) 2004-02-06 2005-08-25 Wyeth Diagnosis and therapeutics for cancer
US20050182005A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
CA2559955C (en) 2004-03-15 2016-02-16 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
AU2005323437B2 (en) * 2004-04-30 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a C5-modified pyrimidine
CA2565685A1 (en) 2004-05-04 2005-12-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
US20060035815A1 (en) 2004-05-04 2006-02-16 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
WO2005108573A2 (en) 2004-05-12 2005-11-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method to induce rnai in prokaryotic organisms
AU2005259799A1 (en) 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory siRNA molecules and uses therefor
WO2006016574A1 (ja) 2004-08-12 2006-02-16 Kumamoto University ＲＮＡｉを利用した抗腫瘍剤
DE602004032245D1 (de) 2004-11-16 2011-05-26 Qiagen Gmbh Genabschaltung (Gene silencing) durch hybride Sens-DNA und Antisens-RNA Konstrukte, gekoppelt an ein Peptid zur erleichterten Aufnahme in Zellen
WO2006063252A2 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inducing an immune response in a mammal and methods of avoiding an immune response to oligonucleotide agents such as short interfering rnas
AR051895A1 (es) 2005-01-07 2007-02-14 Ard Of Higher Education On Beh Metodo para disparar la interferencia de arn
US20100015041A1 (en) 2005-01-18 2010-01-21 Caltagirone Gaetano T Class of Supramolecular Drug Molecules and Methods of Identification and Use Thereof
US20060178334A1 (en) 2005-02-04 2006-08-10 City Of Hope Double-stranded and single-stranded RNA molecules with 5 ' triphosphates and their use for inducing interferon
US7998684B2 (en) 2005-02-07 2011-08-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Screening method for an agent for treatment of neurodegenerative disease
JP4645234B2 (ja) 2005-03-03 2011-03-09 和光純薬工業株式会社 架橋剤、それを用いた架橋方法、遺伝子発現調節方法および遺伝子機能調査方法
PL1866414T3 (pl) 2005-03-31 2012-10-31 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitory podjednostki 2 reduktazy rybonukleotydowej i ich zastosowania
JP2008537752A (ja) 2005-04-12 2008-09-25 イントラディグム コーポレイション がんおよび他の新血管形成疾患を処置するためのＲＮＡｉ治療用の組成物および方法
US7893244B2 (en) 2005-04-12 2011-02-22 Intradigm Corporation Composition and methods of RNAi therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases
US20070066521A1 (en) 2005-04-13 2007-03-22 Fauquet Claude M Short RNA-binding proteins
WO2006119643A1 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Replicor Inc. Anti-ocular angiogenesis molecules and their uses
WO2006122409A1 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Replicor Inc. Antimicrobial molecules and their uses
CN101213300B (zh) * 2005-06-01 2013-01-23 聚加转染股份有限公司 用于rna干扰的寡核苷酸及其生物学应用
WO2006130949A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Replicor Inc. Anti amyloid-related disease molecules and their uses
AU2006267841B2 (en) 2005-07-07 2011-12-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acid agents for downregulating H19, and methods of using same
CN101287835A (zh) 2005-08-17 2008-10-15 株式会社百奥尼 用于siRNA细胞内输送的siRNA-亲水性聚合物结合物及其方法
JP2009507852A (ja) 2005-09-08 2009-02-26 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド リボ核酸の細胞への送達用医薬組成物
EP1764107A1 (en) 2005-09-14 2007-03-21 Gunther Hartmann Compositions comprising immunostimulatory RNA oligonucleotides and methods for producing said RNA oligonucleotides
EP1924284A1 (en) 2005-09-14 2008-05-28 Hartmann, Gunther Compositions comprising immunostimulatory rna oligonucleotides and methods for producing said rna oligonucleotides
EP1764108A1 (en) 2005-09-14 2007-03-21 Gunther Hartmann Compositions comprising immunostimulatory RNA oligonucleotides and methods for producing said RNA oligonucleotides
WO2007107304A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Novosom Ag An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
WO2007038788A2 (en) 2005-09-29 2007-04-05 The Cleveland Clinic Foundation Small interfering rnas as non-specific drugs
EP1948674A4 (en) 2005-11-02 2009-02-04 Protiva Biotherapeutics Inc MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
CA2629664A1 (en) 2005-11-17 2007-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal dna
CA2634046A1 (en) 2005-12-12 2007-06-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Micrornas that regulate muscle cell proliferation and differentiation
WO2007080457A2 (en) 2005-12-30 2007-07-19 Institut Gustave Roussy Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors
CA2648585C (en) 2006-04-07 2017-07-25 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory rna (simra) compounds for tlr7 and tlr8
JP5558811B2 (ja) 2006-06-01 2014-07-23 トリリンク バイオテクノロジーズ 核酸増幅のための化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー
JP2010507361A (ja) 2006-07-31 2010-03-11 キュアバック ゲーエムベーハー 具体的には免疫刺激剤／アジュバントとしての、一般式（Ｉ）：ＧｌＸｍＧｎ、または一般式（ＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎで表される核酸
JP2010500011A (ja) 2006-08-08 2010-01-07 ガンサー ハートマン ５’リン酸オリゴヌクレオチドの構造および使用
EP2069500B1 (en) 2006-10-04 2014-09-24 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
EP2338499A1 (en) 2006-10-10 2011-06-29 Gunther Hartmann 5' triphosphate oligonucleotide induces anti-viral response
WO2008045576A2 (en) 2006-10-12 2008-04-17 Yijia Liu Compositions and methods of rnai therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases
CN101190944A (zh) 2006-12-01 2008-06-04 北京诺赛基因组研究中心有限公司 人类新细胞因子及其用途
WO2008080091A2 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Vical Incorporated Activation of rig-i pathway
WO2008076127A1 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Intradigm Corporation Inhibitory polynucleotide compositions and methods for treating cancer
EP2111449B1 (en) 2007-01-16 2012-03-07 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem H19 silencing nucleic acid agents for treating rheumatoid arthritis
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
WO2008099396A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of h19-silencing nucleic acid agents for treating restenosis
WO2008102728A1 (ja) 2007-02-19 2008-08-28 Kyoto University 核酸導入用導電性基板および核酸導入方法
MY173854A (en) 2007-03-13 2020-02-25 Malaysian Palm Oil Board Expression regulatory elements
US7880063B2 (en) 2007-04-06 2011-02-01 Stine Seed Farm, Inc. Soybean cultivar 6342078
US20090226525A1 (en) 2007-04-09 2009-09-10 Chimeros Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
CN101088565A (zh) 2007-04-17 2007-12-19 华东师范大学 miRNA－34a的用途
WO2008134593A1 (en) 2007-04-25 2008-11-06 President And Fellows Of Harvard College Molecular circuits
KR101738655B1 (ko) 2007-05-01 2017-05-22 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 Ｔｎｆ 슈퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질병 치료에 있어서의 그의 용도
AU2008262478B9 (en) 2007-05-29 2014-06-19 Aldevron, L.L.C. Vectors and methods for genetic immunization
EP2178896A1 (en) 2007-07-31 2010-04-28 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
US8367815B2 (en) 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US20110082185A1 (en) 2007-09-17 2011-04-07 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Cancer-testis gene silencing agents and uses thereof
JP2011500005A (ja) 2007-10-11 2011-01-06 ユニバーシティー ヘルス ネットワーク ヒト造血幹細胞の生着を増加させるためのＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の調節およびそのための化合物
JP2011500023A (ja) 2007-10-12 2011-01-06 イントラダイム コーポレイション インビトロ及びインビボでＶＥＧＦＲ１発現を低減するための治療用ｓｉＲＮＡ分子
DE102007052114B4 (de) 2007-10-30 2011-01-05 T2Cure Gmbh Verfahren zur Modulation der Funktion, des Wachstums oder der Differenzierung einer Zelle
MX2010004984A (es) 2007-11-05 2010-07-29 Baltic Technology Dev Ltd Uso de oligonucleotidos con bases modificadas en hibridacion de acidos nucleicos.
WO2009060281A2 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Coley Pharmaceutical Gmbh Immune stimulatory oligoribonucleotide analogs containing modified oligophosphate moieties
ES2545963T3 (es) 2007-11-06 2015-09-17 Sirnaomics, Inc. Terapéutica con ARNi multidirigidos para la cicatrización de heridas de la piel sin cicatriz
WO2009064590A2 (en) 2007-11-12 2009-05-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapeutic applications of p53 isoforms in regenerative medicine, aging and cancer
ATE554186T1 (de) 2007-11-29 2012-05-15 Molecular Health Gmbh Eph-b4 spezifische sirna zur reduktion von epo- induziertem tumorzellwachstum während anämiebehandlung in krebspatienten, gewebeschutz- erythropoietin-rezeptor (nepor) und verfahren zu seiner verwendung
US8357501B2 (en) 2007-11-29 2013-01-22 Molecular Health Gmbh Tissue protective erythropoietin receptor (NEPOR) and methods of use
GB0725321D0 (en) 2007-12-31 2008-02-06 Syntaxin Ltd Delivery vehicles
JP5721441B2 (ja) 2008-01-31 2015-05-20 キュアバック ゲーエムベーハーＣｕｒｅｖａｃ Ｇｍｂｈ 免疫賦活剤／アジュバントとしての式（Ｉ）（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａで表される核酸分子及びその誘導体
US9738680B2 (en) 2008-05-21 2017-08-22 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
DK2518150T3 (en) 2008-05-21 2015-12-07 Univ Bonn 5'Trip phosphate triphosphate oligonucleotide and uses thereof
CA2635187A1 (en) 2008-06-05 2009-12-05 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Oligonucleotide duplexes and uses thereof
US20110152352A1 (en) 2008-06-10 2011-06-23 Tufts University Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation
CN101632833B (zh) 2008-07-25 2013-11-06 上海市计划生育科学研究所 一种前列腺癌相关的基因及其用途
WO2011028218A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Process for triphosphate oligonucleotide synthesis
AU2009288078B2 (en) 2008-09-02 2014-10-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Synthetic methods and derivatives of triphosphate oligonucleotides
WO2010042742A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042751A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042749A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042755A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
CN102264898B (zh) 2008-10-23 2013-10-16 国立大学法人东京大学 微小rna的功能抑制方法
WO2010062502A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 University Of Utah Research Foundation Carriers for the delivery of nucleic acids to cells and methods of use thereof
JP2012518997A (ja) 2009-02-26 2012-08-23 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 喫煙未経験者におけるマイクロｒｎａ、ならびに関連する材料および方法
US8987222B2 (en) 2009-04-08 2015-03-24 University Of Massachusetts Single nucleotide polymorphism (SNP) targeting therapies for the treatment of huntington'S disease
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US20100323018A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Branched DNA/RNA monomers and uses thereof
ES2386855T3 (es) 2009-07-09 2012-09-03 Marina Biotech, Inc. Emulación de estructuras de lipoproteínas
US9238811B2 (en) 2009-07-14 2016-01-19 Northeastern University siRNA phospholipid conjugate
WO2011011716A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 The Trustees Of Princeton University Inhibitors of mtor kinase as anti-viral agents
EP2327783A1 (en) 2009-11-27 2011-06-01 Universitätsklinikum Freiburg Pharmaceutical composition comprising miRNA-100 and its use in the modulation of blood vessel growth
DE202009015670U1 (de) 2009-11-30 2011-04-14 Mcairlaid's Vliesstoffe Gmbh & Co. Kg Absorptionskörper zur Auflage auf Wunden
US20110247091A1 (en) 2010-03-26 2011-10-06 The Governors Of The University Of Alberta Transgenic Cells and Chickens Expressing RIG-I
WO2011133559A2 (en) 2010-04-19 2011-10-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Alpha tubulin acetyltransferase
EP2385120A1 (en) 2010-05-04 2011-11-09 Justus-Liebig- Universitat Giessen Use of anti-miRNA antisense oligonucleotides for the treatment of pulmonary hypertension
US9642873B2 (en) 2010-05-04 2017-05-09 Sirnaomics, Inc. Combinations of TGFβ and COX-2 inhibitors and methods for their therapeutic application
CN101974529B (zh) 2010-09-21 2013-04-03 南京大学（苏州）高新技术研究院 含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用
WO2012056440A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
WO2012056441A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. Compositions and methods for specific cleavage of exogenous rna in a cell
CN102475892A (zh) 2010-11-22 2012-05-30 大连创达技术交易市场有限公司 作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途
WO2012091523A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Carrier for negatively charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof
US8461224B2 (en) 2011-03-04 2013-06-11 National Health Research Institutes Single monomer derived linear-like copolymer comprising polyethylenimine and poly(ethylene glycol) for nucleic acid delivery
WO2012125987A2 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Massachusetts Institute Of Technology Delivery system
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
WO2013003887A1 (en) 2011-07-04 2013-01-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Nucleic acid complex
EP2551354A1 (en) 2011-07-25 2013-01-30 Universität Heidelberg Functionalization of RNA oligonucleotides
US20130189367A1 (en) 2011-07-29 2013-07-25 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Nanovectors for targeted gene silencing and cytotoxic effect in cancer cells
US9579394B2 (en) 2011-08-08 2017-02-28 Universitaet Regensburg Polyanion nanocomplexes for therapeutic applications
WO2013053481A1 (de) 2011-10-11 2013-04-18 Secutech International Pte. Ltd. Dimethylsulfoxid als lösungsmittel für nukleinsäuren
EP2765983A1 (de) 2011-10-11 2014-08-20 Hans Kosak Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen
JP2014532400A (ja) 2011-10-31 2014-12-08 リボックス・ゲーエムベーハー 免疫賦活用の二本鎖ｒｎａ
EP2780455B1 (en) 2011-11-17 2017-07-05 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Auto-recognizing therapeutic rna/dna chimeric nanoparticles (np)
US9193971B2 (en) 2012-04-10 2015-11-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis
US20130302252A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Polyarginine-coated magnetic nanovector and methods of use thereof
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
US20140287023A1 (en) 2013-02-11 2014-09-25 Mcgill University 5'-triphosphate oligoribonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
US20160051573A1 (en) 2016-02-25
SI2056845T1 (en) 2018-02-28
LT2056845T (lt) 2017-11-27
PT2056845T (pt) 2017-11-17
EP2056845A2 (en) 2009-05-13
AU2007283022A1 (en) 2008-02-14
JP2021050214A (ja) 2021-04-01
JP7071299B2 (ja) 2022-05-18
HUE037173T2 (hu) 2018-08-28
EP4082551A1 (en) 2022-11-02
PL2056845T3 (pl) 2018-01-31
WO2008017473A3 (en) 2008-06-05
US10238682B2 (en) 2019-03-26
JP2019077709A (ja) 2019-05-23
JP7108011B2 (ja) 2022-07-27
DK2056845T3 (da) 2017-11-27
JP2016189790A (ja) 2016-11-10
WO2008017473A2 (en) 2008-02-14
US9381208B2 (en) 2016-07-05
JP2014207906A (ja) 2014-11-06
AU2007283022B2 (en) 2011-07-28
US20100178272A1 (en) 2010-07-15
ES2911034T3 (es) 2022-05-17
CA2660232C (en) 2019-05-21
CY1119608T1 (el) 2018-04-04
CA2660232A1 (en) 2008-02-14
EP2056845B1 (en) 2017-10-11
JP2018082706A (ja) 2018-05-31
JP6748629B2 (ja) 2020-09-02
EP3342415B1 (en) 2022-01-26
EP3342415A1 (en) 2018-07-04
JP2010500011A (ja) 2010-01-07
US20120288476A1 (en) 2012-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2911034T3 (es) Estructura y uso de oligonucleótidos 5&#39; fosfato
ES2553284T5 (es) Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos
ES2544958T3 (es) Análogos de oligonucleótidos CpG que contienen análogos de T hidrófobos con actividad inmunoestimuladora potenciada
ES2486298T3 (es) Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados
BRPI0622298A2 (pt) oligorribonucleotìdeo para estimular a produção de uma citocina pró-inflamatória, uso do mesmo e composição contendo tal oligorribonucleotìdeo
JP2025120300A (ja) 合成ｒｉｇ－ｉ様受容体アゴニスト
CA3110102A1 (en) Rig-i agonists and treatments using same
KR20090057468A (ko) 톨-유사 수용체(ｔｌｒ) 리간드 및 항바이러스제의 조성물
JP2010507386A (ja) オリゴリボヌクレオチドおよびその使用
BRPI0617254A2 (pt) &#34;oligonucleotìdeo de filamento único, composição farmacêutica, métodos para estimular a atividade de tlr7 em uma célula que expressa tlr7, para estimular a atividade de tlr8 em uma célula que expressa tlr8, e, para estimular uma resposta imune em um paciente
ES2544484T3 (es) Análogos de oligonucleótidos modificados con fosfato con actividad inmunoestimulante
CA3079157A1 (en) Oligonucleotide constructs and uses thereof
EP1924283A1 (en) Compositions comprising immunostimulatory rna oligonucleotides and methods for producing said rna oligonucleotides
JP2024505151A (ja) 脂質ナノ粒子球状核酸
BRPI0814260B1 (pt) composição compreendendo um polímero de fita única, método compreendendo contatar uma célula com tal polímero e uso de tal polímero
EP1920775B1 (en) 5&#39;Triphosphate oligonucleotide induces anti-viral response
AU2011244863B2 (en) Structure and use of 5&#39; phosphate oligonucleotides