ES2647768T3 - Antígeno de cáncer - Google Patents
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Abstract
Una proteína aislada expresada por células cancerosas cuando se tratan con un agente seleccionado de Mycobacterium w, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina y una combinación de los mismos para uso en el tratamiento de cáncer, en la que dicha proteína es un antígeno de cáncer seleccionado de una proteína de 45 kDa expresada por células de cáncer pancreático y una proteína de 36 kDa expresada por células de melanoma.
Description
14. Proteína de 36 kDa de células cancerosas de melanoma – 50 μg
Tampón de fosfato 10 mM NaCl 300 mM 5 Excipiente qs.
15. Proteína de 45 kDa de células de cáncer pancreático – 500 μg
Tampón de Tris 50 mM 10 Excipiente qs.
16. Proteína de 36 kDa de células cancerosas de melanoma – 500 μg
Tampón de Tris 50 mM 15 Excipiente qs.
La formulación anterior se usa sola o en combinación opcionalmente con adyuvante para inducir una respuesta inmunitaria deseada por administración apropiada.
20 Ejemplo 4: Inducción de respuesta inmunitaria mediada por células por el antígeno de cáncer expresado/sobreexpresado habitualmente: inmunogenicidad de antígeno de cáncer.
La respuesta inmunológica a la proteína de 45 kDa (expresada/sobreexpresada habitualmente) se evaluó inmunizando ratones por vía intradérmica el día 0 y 21 con la formulación 1 del ejemplo 3, 10 μg de proteína de 45
25 kDa. Los ratones de control recibieron PBS. La suspensión de esplenocitos (107 células/ml) de ratones individuales se preparó el día 28 del estudio para estimar las células secretoras de IFN-g por ELISPOT. Se realizó ensayo de ELISPOT de esplenocitos de grupos tanto de control como de ensayo.
La imagen de la placa se capturó en el Lector de Puntos CTL. Los puntos en cada pocillo se autocontaron. Se 30 realizó QC de placas usando los parámetros de sensibilidad y fondo y se analizaron los resultados. Se halló una liberación de IFN-g dos veces mayor en respuesta a inmunización de proteína de 45 kDa como se muestra en la Fig.
1.
Ejemplo 5: Inducción de respuesta inmunitaria humoral por el antígeno de cáncer expresado/sobreexpresado 35 habitualmente: inmunogenicidad de antígeno de cáncer.
a. Se evaluó la generación de inmunidad humoral contra el antígeno de cáncer. Los ratones se seleccionaron aleatoriamente en dos grupos. El primer grupo de ratones se inmunizó por vía intradérmica el día 0 y 21 con la formulación 15 del ejemplo 3, mientras que el segundo grupo, es decir, el grupo de control se mantuvo 40 inmunizado con PBS. Se aislaron muestras de suero de todos los ratones el día 28 del estudio para detectar la generación de anticuerpo contra la vacuna. Se realizó transferencia de Western del lisado de MiaPaCa-2 con suero de ratones inmunizados con células cancerosas MiaPaCa-2 tratadas que expresaban proteína de 45 kDa y PBS (control). Para la detección de anticuerpo primario unido con proteína de lisado, se usó anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HPR con DAB (Diamino Benzidina) como agente colorante. A partir del análisis
45 de transferencia de Western se descubrió que la inmunización con vacuna de cáncer MiaPaCa-2 genera respuesta de anticuerpos contra antígeno de cáncer (Fig. 2).
b. Para generar altos títulos de anticuerpos en conejo se co-administró el antígeno de la formulación de cáncer melanoma 10 del ejemplo 3 (36 kDa) con adyuvante de Freund el día 0, 7 y 14. Se tomaron muestras
50 sanguíneas de los conejos inmunizados el día 21 y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo de transferencia puntual recubriendo la membrana de nitrocelulosa con el antígeno y usando sueros de conejos inmunizados como anticuerpo primario. Las transferencias se revelaron mediante conjugado de anticuerpo secundario – HRPO. Se descubrió que los títulos eran más de 10000 para anti-antígeno de melanoma.
55 c. Para generar un anticuerpo anti-antígeno de cáncer pancreático, los conejos se inmunizaron con formulación de antígeno de cáncer pancreático 8 del ejemplo 3 (proteína de ∼45 kDa) con adyuvante completo de Freund y el día 15 con adyuvante incompleto de Freund. Se tomaron muestras sanguíneas de los conejos inmunizados el día 30 y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo de transferencia puntual recubriendo la membrana de nitrocelulosa con el antígeno y usando sueros de conejos inmunizados como anticuerpo primario. Las
60 transferencias se revelaron mediante conjugado de anticuerpo secundario – HRPO. Se descubrió que los títulos eran más de 50000 para anti-antígeno de cáncer pancreático.
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El volumen tumoral en el grupo de tratamiento no aumentó en comparación con el grupo no tratado (Fig. 3). El grupo de tratamiento de hecho mostró reducción de tamaño tumoral lo que indica la resolución de la condición de enfermedad. En general se mejoró la supervivencia y se redujo el tamaño tumoral en ratones en el grupo de tratamiento.
2. Se usaron 20 ratones C57 macho (6-8 semanas) para el estudio. Los animales se seleccionaron aleatoriamente basándose en el peso corporal. Se realizó la inducción tumoral inyectando 1 x 105 células Pan 02 (línea celular de cáncer pancreático) en las extremidades posteriores de los ratones por vía subcutánea. Se
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permitió que los ratones desarrollaran un tamaño tumoral promedio de ∼200 mmy se seleccionaron aleatoriamente en 2 grupos de 10 ratones cada uno basándose en el tamaño del tumoral. El primer grupo de ratones se inmunizó por vía intradérmica con formulación de vacuna de cáncer pancreático 4 del ejemplo 3, 10 μg/ratón/dosis (proteína expresada habitualmente de 45 kDa) el día 0 y 10 después de la selección aleatoria mientras que el segundo grupo, es decir, ratones de control, se mantuvo sin inmunizar (sin tratamiento). Se registró el tamaño tumoral dos veces por semana hasta que el tamaño tumoral alcanzó el 10 % del peso corporal del animal.
El volumen tumoral en el grupo de tratamiento no aumentó en comparación con el grupo no tratado. En general se mejoró la supervivencia y se redujo el tamaño tumoral en ratones en el grupo de tratamiento. El grupo de tratamiento mostró progresión retardada de la masa tumoral en comparación con animales sin tratamiento.
3. Se usaron 10 ratones C57 macho (6-8 semanas) para el estudio. Los animales se seleccionaron aleatoriamente basándose en el peso corporal. El primer grupo de ratones se inmunizó por vía intradérmica con formulación de vacuna de cáncer pancreático 15 del ejemplo 3, 500 μg/ratón/dosis (proteína expresada habitualmente de 45 kDa) el día 0 y 10 después de la selección aleatoria mientras que el segundo grupo, es decir, ratones de control, se mantuvo sin inmunizar (sin tratamiento). Se realizó la inducción tumoral inyectando 1 x 105 células Pan 02 (línea celular de cáncer pancreático) en las extremidades posteriores de los ratones por vía subcutánea el día 10 después de la 1ª inyección de vacuna de cáncer pancreático.
Se registró el tamaño tumoral dos veces por semana hasta que el tamaño tumoral alcanzó el 10 % del peso corporal del animal.
El volumen tumoral en el grupo de tratamiento no aumentó en comparación con el grupo no tratado. En general la supervivencia fue mayor en el grupo tratado. El grupo de tratamiento mostró desarrollo retardado del tumor en comparación con animales sin tratamiento.
Ejemplo 8: La respuesta inmunitaria generada por proteína expresada/sobreexpresada habitualmente es específica para el tejido/órgano canceroso de origen.
Los ratones se inmunizaron por vía intradérmica el día 0 y 21 con la formulación de antígeno de cáncer 5 del ejemplo 3, 50 μg/ratón/dosis (proteína expresada habitualmente de 45 kDa). Se aislaron muestras de suero de ratones el día 28 del estudio. Se realizó transferencia de Western con lisados de MiaPaCa-2, AsPC-1, SW-1990 y cánceres de origen diferente como HEK-293 (riñón), PC-3 (Próstata), MCF-7 (Mama), A549 (Pulmón), PA-1 (Ovario) con anticuerpo primario generado en el ratón contra vacuna de cáncer terapéutico. Para detección de anticuerpo primario unido con antígeno o antígenos de lisado, se usó anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP con DAB (Diamino Benzidina) como agente de detección/colorante. El análisis de transferencia de Western muestra (Figura 4) que el anticuerpo generado por inmunización de (proteína expresada habitualmente de 45 kDa) tiene reactividad heterogénea con lisados de células cancerosas de origen pancreático (heterogéneas) mientras que no es reactivo con lisados de células cancerosas de diferente tejido/órgano. En el Gel 1 de la Figura 4 los carriles 2 a 4 son de células de cáncer pancreático de diferentes tipos que muestran reactividad con el suero de ratones inmunizados con antígeno de cáncer (proteína expresada habitualmente de 45 kDa) lo que indica reactividad heterogénea a células cancerosas del tejido/órgano de origen. Mientras tanto en el Gel 2 los carriles 1 a 5 no muestran reactividad con células cancerosas de diferente origen tisular, concretamente Próstata, Mama, Pulmón, Ovario y Piel lo que ilustra la seguridad de la vacuna que contiene antígeno de cáncer (proteína expresada habitualmente).
Sumario
La presente invención ha descubierto sorprendentemente que las células cancerosas tratadas con cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, Mycobacterium w o combinación de los mismos muestran un perfil proteico alterado. Además se ha descubierto que los perfiles proteicos de las células tratadas tienen al menos una proteína común (expresada/sobreexpresada habitualmente) independientemente del agente usado para el tratamiento, por ejemplo, Mycobacterium w, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina. La proteína (expresada/sobreexpresada habitualmente) es diferente para células cancerosas que se originan de diferente órgano/tejido.
De acuerdo con la presente invención, la proteína es una proteína de 45 kDa expresada por células de cáncer pancreático o una proteína de 36 kDa expresada por células de melanoma.
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Se ha descubierto que la proteína expresada habitualmente como se formula en una cantidad de más de 1 μg es inmunogénica e induce respuesta inmunitaria reactiva contra células cancerosas de las que deriva (homólogas) así como células cancerosas del mismo tejido/órgano pero con diferentes características celulares (heterólogas) como se ha descrito en el ejemplo anterior. La respuesta inmunitaria generada usando la línea celular de cáncer
5 pancreático no consigue generar una respuesta inmunitaria contra otro cáncer. Se ha descubierto que la administración de la proteína o las proteínas es segura en mamíferos. Opcionalmente para obtener una respuesta inmunitaria mejorada adicionalmente estas proteínas pueden combinarse con adyuvante antes de la administración a un mamífero.
10 La respuesta inmunitaria generada de este modo es capaz de proporcionar efectos profilácticos así como terapéuticos contra el cáncer pancreático.
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