ES2647785T3 - Producción de alquenos mediante descarboxilación enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos - Google Patents

Producción de alquenos mediante descarboxilación enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos Download PDF

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Abstract

Procedimiento de producción de un alqueno terminal, caracterizado porque comprende una etapa de conversión de un 3-hidroxi-alcanoato mediante una enzima que tiene actividad mevalonato difosfato descarboxilasa, en el que el 3-hidroxi-alcanoato es un compuesto de la fórmula HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH o O--CO-CH2-C(R1)(R2)-OH en las que R1 y R2 se seleccionan, independientemente, entre un átomo de hidrógeno, un resto metilo y un resto etilo, y en el que la conversión se realiza en presencia de un cosustrato, siendo dicho cosustrato ATP, un rNTP, un dNTP o una mezcla de varias de estas moléculas, un polifosfato, o pirofosfato.

Description

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homología de secuencia, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, aún más preferentemente, al menos un 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de homología de secuencia con una de las secuencias primarias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16. El grado de homología de secuencia se puede determinar por diferentes procedimientos y mediante programas informáticos conocidos del experto en la técnica, como por ejemplo, según el procedimiento CLUSTAL o los programas informáticos BLAST o derivados, o utilizando un algoritmo de comparación de secuencias como el de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 1970 48:443)
o de Smith et Waterman (J. Mol. Biol. 1981 147:195).
Una descarboxilasa preferida de la invención se representa por la enzima de la secuencia SEQ ID NO: 6, así como cualquier enzima que presente una homología de secuencia significativa con la anterior. Las enzimas preferidas incluyen, ventajosamente, al menos un 50% de homología de secuencia, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, aún más preferentemente, al menos un 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de homología de secuencia con la secuencia primaria SEQ ID NO: 6. Esta enzima se ha clonado de Picrophilus torridus y se ha producido de forma recombinante en el marco de la presente invención. Como se ilustra en los ejemplos, esta enzima es especialmente eficaz para producir los compuestos alcanos terminales de acuerdo con la presente invención. En concreto, un objeto de la invención es el uso de una enzima descarboxilasa que comprende todo o parte de la SEQ ID NO:6 o de una enzima que tenga una homología de secuencia significativa y, preferentemente, de al menos un 15% con la SEQ ID NO:6, en la producción de compuestos alcanos terminales a partir de los 3hidroxi-alcanoatos como se han definido anteriormente. Por homología de secuencia significativa, se entiende una homología de secuencia detectable mediante el uso de los algoritmos anteriormente citados, y preferentemente una homología de secuencia superior al 15%. Los organismos filogenéticamente más cercanos a Picrophilus torridus, como Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium y Picrophilus oshimae son susceptibles de producir las MDP descarboxilasas más cercanas de las que tienen la SEQ ID NO 6. La homología de secuencia con respecto a la SEQ ID NO 6 de la MDP descarboxilasa de Thermoplasma acidophilum (número AC Q9HIN1) es, por tanto, del 38%; la de Thermoplasma volcanium (Q97BY2) es homóloga de la SEQ ID NO 6 en aproximadamente un 42%. El uso de estas MDP descarboxilasas se considera completamente incluido en la presente invención.
Otras enzimas del tipo mevalonato difosfato descarboxilasa, naturales o sintéticas, se pueden seleccionar dependiendo de su capacidad para producir alcanos terminales de acuerdo con la invención. De este modo, un ensayo de selección comprende la puesta en contacto de la enzima purificada, o de un microorganismo que produce la enzima, con el sustrato de la reacción, y medir la producción del compuesto alqueno terminal. Los ejemplos de este tipo de ensayos se proporcionan en la parte experimental, que incluye ensayos sobre más de 60 enzimas diferentes.
La enzima aplicada puede ser cualquier mevalonato difosfato descarboxilasa natural o producida u optimizada de forma artificial. En particular, se utiliza ventajosamente una mevalonato difosfato descarboxilasa que muestra una actividad optimizada con respecto a uno o varios 3-hidroxi-alcanoatos como se han definido anteriormente. La enzima se puede producir o seleccionar, a partir de una mevalonato difosfato descarboxilasa de referencia (natural o ya sintética u optimizada), según técnicas de ingeniería de proteínas tales como la mutagénesis aleatoria, la mutagénesis masiva, la mutagénesis dirigida, el intercambio de ADN, el intercambio sintético, la evolución in vivo, o la síntesis completa de genes. A este respecto, también se describe un procedimiento de preparación de una enzima que tenga una actividad mevalonato difosfato descarboxilasa con respecto a un sustrato 3-hidroxi-alcanoato como se ha definido anteriormente, comprendiendo el procedimiento una etapa de tratamiento de una fuente de la enzima y la selección de una enzima que tenga propiedades aumentadas con respecto a dicho sustrato, por comparación con la enzima no tratada. De esta forma, la enzima utilizada en la invención puede ser natural o sintética, y producida de forma química, biológica o genética. También puede estar químicamente modificada, por ejemplo, para mejorar su actividad, su resistencia, su especificidad, su purificación, o para inmovilizarla sobre un soporte. La invención se caracteriza por el uso de una mevalonato difosfato descarboxilasa, en particular de una MDP descarboxilasa natural o modificada, para convertir los 3-hidroxi-alcanoatos como se han definido anteriormente en alcanos terminales. El sustrato natural de la MDP descarboxilasa es el mevalonato difosfato, que no está incluido en la definición de los 3-hidroxi-alcanoatos.
La reacción genérica realizada mediante la MDP descarboxilasa utilizando diferentes 3-hidroxi-alcanoatos se representa en la figura 2B. Se considera que estas reacciones conducen directamente, y en una sola etapa, a los alcanos terminales.
En una primera realización, se utiliza una enzima natural o recombinante, purificada o no, para transformar un 3hidroxi-alcanoato como se ha definido anteriormente en un alqueno terminal. Para ello, se incuba la preparación de la enzima en presencia del sustrato en condiciones físico-químicas tales que permiten que la enzima esté activa, y se deja que la incubación transcurra durante un tiempo suficiente. Al finalizar la incubación, se mide opcionalmente la presencia del alcano terminal utilizando cualquier sistema de detección conocido del experto en la materia, tal como la cromatografía en fase gaseosa o ensayos colorimétricos que permitan medir la aplicación del producto de alqueno, de fosfato libre, o que incluso permitan medir la desaparición del sustrato 3-hidroxi-alcanoato o del ATP.
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también en forma de bacterias no lisadas, para ahorrar los costes de purificación de la proteína. Sin embargo, los costes asociados a este procedimiento siguen siendo bastante altos debido a los costes de producción y purificación de los sustratos.
En otra realización de la invención, el procedimiento aplica un microorganismo vivo o una planta viva que produce la enzima que permite realizar la conversión. La invención también se caracteriza por la modificación mediante ingeniería genética de una cepa bacteriana productora de uno o varios 3-hidroxi-alcanoatos como se han definido anteriormente por ejemplo Alcaligenes eutrophus o Bacillus megaterium, o incluso una fuente de E. coli modificada en el laboratorio para producir dicho o dichos productos), de forma que dicha cepa bacteriana exprese en exceso la descarboxilasa, procediendo dicha enzima preferentemente de un organismo diferente al microorganismo hospedador, y que pueda generar directamente uno o varios alcanos terminales. La modificación genética puede consistir en una integración cromosómica del gen de la descarboxilasa, la expresión de la enzima mediante un plásmido que contiene un promotor antes de la secuencia que codifica la enzima, procediendo el promotor y la secuencia codificante, preferentemente, de organismos diferentes, o de cualquier otro medio conocido del experto en la técnica. Alternativamente, otras bacterias o levaduras pueden presentar ventajas concretas y conservarse. De este modo, una levadura como Saccharomyces cerevisiae, una bacteria extremófila como Thermus thermophilus, o bacterias anaerobias de la familia Clostridiae por ejemplo, microalgas, bacterias fotosintéticas, pueden ser de utilidad. Para producir de forma óptima el o los 3-hidroxi-alcanoato, que a continuación se convertirán en alcanos terminales, las cepas también se pueden haber modificado mediante ingeniería genética, es decir, por recombinación in vitro o por evolución dirigida in vivo.
De acuerdo con una realización posible, un procedimiento de la invención se caracteriza por la transformación de una fuente de carbono tal como glucosa, en 3-hidroxi-alcanoato, a continuación, la transformación de dicho producto primario en un producto secundario, es decir, en el alqueno terminal. Las diferentes etapas de dicho procedimiento se explicitan en la figura 6.
En una realización particular, la invención se caracteriza por la transformación de polihidroxialcanoatos en 3-hidroxialcanoato como se ha definido anteriormente, utilizando una enzima o un procedimiento físico-químico adaptado, a continuación, la transformación de dicho producto primario en un producto secundario, es decir, en el alqueno terminal. Opcionalmente, el polihidroxialcanoato se ha producido mediante una planta que se ha modificado en sus rutas metabólicas para producir elevados rendimientos de polihidroxialcanoato.
En una realización particular, la invención consiste en el procedimiento de producción integrada de los productos procedentes del CO2 atmosférico o artificialmente añadido al medio de cultivo. El procedimiento de la invención se lleva a cabo en un organismo capaz de realizar la fotosíntesis, tal como, por ejemplo, las microalgas.
En estas realizaciones, el procedimiento de la invención sigue caracterizado por el modo de recuperación de los productos, que se desprenden del cultivo en forma gaseosa. Los alcanos terminales cortos, y especialmente el etileno, propileno, los isómeros del buteno, se encuentran efectivamente en estado gaseoso a temperatura ambiente y presión atmosférica. Por tanto, el procedimiento de la invención no requiere extracción del producto a partir del medio líquido de cultivo, etapa que siempre constituye una fuente de costes importante desde el punto de vista industrial. La evacuación y el almacenamiento de los hidrocarburos gaseosos, y su eventual separación física y conversión química posterior, se pueden hacer funcionar según cualquier procedimiento conocido del experto en la materia.
En una realización particular, la invención también comprende la detección del alqueno (propileno, etileno e isobutileno, especialmente) presente en la fase gaseosa del procedimiento. La presencia de los compuestos diana en un entorno de aire o de otro gas, incluso en cantidades bajas, se puede llevar a cabo mediante el uso de diferentes tecnologías y, especialmente, utilizando los sistemas de cromatografía en fase gaseosa y la detección con infrarrojos, por ionización de llama, o por hifenación con un espectrómetro de masas.
En una realización particular, los alcanos terminales obtenidos se condensan, posteriormente se reducen opcionalmente, utilizando técnicas conocidas por una persona experta en la materia, para producir alquenos de cadena más larga, o alquenos de cadena más larga. En particular, el isobutileno puede utilizarse para sintetizar isoocteno: los procedimientos catalíticos para realizar correctamente esta reacción están ya bien descritos.
En una realización particular, el procedimiento implica el cultivo de los microorganismos en las condiciones de cultivo habituales (30 a 37°C bajo 1 atmósfera (101 kPa), en un fermentador que permita el crecimiento aerobio de bacterias) o no habituales (temperatura más alta para responder a las condiciones de cultivo de un organismo termófilo, por ejemplo).
En una realización particular, los microorganismos se cultivan en microaerofilia, estando limitada la cantidad de aire inyectado para minimizar la concentración de dioxígeno residual en los efluyentes gaseosos cargados de hidrocarburos alquénicos.
Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los ejemplos siguientes, que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.
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previsto de la proteína, sin que esta banda existiera en la hilera correspondiente a las bacterias sin transformar.
Ejemplo 2: medida de la actividad de los extractos proteicos para el 3-hidroxi-3-metil-butirato.
3-Hidroxi-3-metil-butirato (proporcionado por Sigma, referencia 55453 con el nombre de ácido β-hidroxiisovalérico), y suspendido a la concentración de 10 g/l. Se sintetizó el mevalonato-difosfato a partir de mevalonolactona y otros reactivos (Sigma), según la técnica convencional, y se resuspendió a la concentración de 10 g/l.
Se prepararon seis viales para cromatografía. En todos los viales, se introdujeron 50 µl de tampón que contenía Bistris/HCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM, MgCl2 10 mM, ATP 5 mM.
En los viales 1 y 4, se introdujeron 5 µl de agua (sin ningún sustrato).
En los viales 2 y 5, se añadieron 5 µl de la preparación de mevalonato difosfato (control positivo)
En los viales 3 y 6, se añadieron 5 µl de la preparación de 3-hidroxi-3-metil-butirato (HIV)
En los viales 1, 2, y 3, se añadieron a continuación 5 µl de agua (sin ninguna enzima)
En los viales 4, 5, y 6, se añadieron 5 µl de la preparación enzimática descrita en el ejemplo 1.
Se precintaron los viales con un tapón provisto de septo y una pinza selladora. Todos los viales se incubaron a 37°C durante de 4 horas a 3 días.
Al finalizar esta incubación, se tomó una muestra del gas presente en cada vial usando una jeringa para gases, y se midió la concentración de CO2 en estas muestras usando cromatografía en fase gaseosa. Se observa que la concentración de CO2 es muy significativa en el vial 5, y que también se puede observar una concentración de CO2, aunque más baja, en el vial 6, lo que refleja una reacción significativa de la preparación enzimática sobre el 3hidroxi-3-metil-butirato.
A continuación se mide la presencia de isobutileno en la muestra de gas correspondiente al vial 6 usando un sistema de cromatografía de gases acoplado a un detector de infrarrojos o de ionización de llama.
Ejemplo 3: optimización de las condiciones de reacción usando un cofactor.
Se lleva a cabo la misma reacción que se ha descrito en el vial 6 del ejemplo anterior, pero usando, en una de las muestras, etil-difosfato como cofactor, sintentizado a propósito.
En este ejemplo, se dispone de tres viales. El primero contiene los tampones, el ATP, el extracto enzimático en las condiciones descritas en el ejemplo anterior. El segundo contiene los mismos elementos, pero además 3-hidroxi-3metil-butirato en las condiciones descritas en el ejemplo anterior. El tercer vial contiene, además del 3-hidroxi-3metil-butirato, 10 µl de etil-difosfato a 10 mg/l.
Se mide, como en el ejemplo anterior, la formación de isobutileno utilizando un equipo de cromatografía de gases acoplado con un detector de infrarrojos o de ionización de llama. Se observa que, cuando el etil-difosfato está presente, la cantidad de isobutileno producida por unidad de tiempo es claramente superior.
Ejemplo 4. Cribado de una colección de enzimas
Una colección de sesenta y tres genes que codificaban enzimas de la familia de la MDP descarboxilasa se obtuvieron y se sometieron a ensayo para determinar su actividad sobre el sustrato HIV.
Clonación, cultivos bacterianos y expresión de las proteínas.
Los genes correspondientes a la familia difosfato mevalonato (MDP) descarboxilasas EC 4.1.1.33 se clonaron en el vector pET 25b (Novagen) para los genes de origen eucariota y pET 22b (Novagen) para los genes de origen procariota con 6 restos His añadidos al extremo N, inmediatamente después del codón metionina iniciador. Células E.coli BL21(DE3) competentes (Novagen) se transformaron con los vectores mediante choque térmico. Las células se cultivaron en medio TB que contenía sorbitol 0,5 M, betaína 5 mM, 100 µg/ml de ampicilina a 30°C, con agitación (160 rpm) hasta una DO (600 nm) comprendida entre 0,8 y 1. A continuación se añadió isopropil-B-Dtiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final 1 mM, y se siguió la expresión de las proteínas a 20°C durante la noche (aproximadamente 16 h). Las células se recogieron mediante centrifugación a 4°C, 10.000 rpm, 20 minutos y los aglomerados se congelaron a -80°C.
Lisis de las células
1,6 g de células se descongelaron sobre hielo; las células se resuspendieron en 5 ml de Na2HPO4 50 mM que contenía NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM pH 8. Se añadieron 20 µl de lisonasa (Novagen), a continuación se realizó una incubación de 10 min a temperatura ambiente, y seguida de reposo durante 20 min sobre hielo. La lisis de las células bacterianas se completó por sonicación en un baño de agua caliente de ultrasonidos de 3 a 5 minutos a 0°C con homogeneización de las muestras entre los pulsos. A continuación, los extractos bacterianos se
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Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q1WU41 Microorganismos: Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (cepa UCC118)
Candidato 4: SEQ ID NO: 10
Número de registro Genebank: ABJ57000.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q04EX2 Microorganismos: Oenococcus oeni (cepa BAA-331 / PSU-1)
Candidato 5: SEQ ID NO: 11
Número de registro Genebank: ABJ67984.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q03FN8 Microorganismos: Pediococcus pentosaceus ATCC 25745
Candidato 6: SEQ ID NO: 12
Número de registro Genebank: ABV09606.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: A8AUU9 Microorganismos: Streptococcus gordonii (cepa Challis / ATCC 35105 / CH1 / DL1 / V288)
Candidato 7: SEQ ID NO: 13
Número de registro Genebank: ABQ14154.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: A5EVP2 Microorganismos: Dichelobacter nodosus VCS1703A
Candidato 8: SEQ ID NO: 14
Número de registro Genebank: EDT95457.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: B2DRT0 Microorganismos: Streptococcus pneumoniae CDC0288-04
Candidato 9: SEQ ID NO: 15
Número de registro Genebank: AAT86835 Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q5XCM8 Microorganismos: Streptococcus pyogenes serotipo M6 (ATCC BAA-946 / MGAS10394)
Candidato 10: SEQ ID NO: 6
Número de registro Genebank: AAT43941 Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q6KZB1 Microorganismos: Picrophilus torridus DSM 9790
Candidato 11: SEQ ID NO: 16
Número de registro Genebank: AAV43007.1 Número de registro Swissprot/TrEMBL: Q5FJW7 Microorganismos: Lactobacillus acidophilus NCFM
La producción más elevada de IBN se observó para el candidato 10, es decir, con la enzima descarboxilasa purificada de la SEQ ID NO: 6 procedente de Picrophilus torridus. Esta enzima se guardó para su caracterización detallada.
Ejemplo 5: Caracterización de la enzima con la SEQ ID NO: 6
La enzima recombinante se purificó como se describe en el ejemplo 4. Los resultados, presentados en la Figura 8, muestran que la pureza de la enzima en la muestra proteica final se estima en un 90%.
Se informó la actividad de la enzima aislada. La reacción se llevó a cabo en las condiciones siguientes: Tris-HCl 100 mM pH 7,0 MgCl2 10 mM ATP 10 mM KCl 20 mM HIV 250 mM el pH final se ajustó a 6,0 3 mg/ml de enzima
Tras una incubación a 30°C durante 72 h, se mide la señal por CPG/EM. Los resultados se presentan en la Figura 9. En presencia de la enzima, la producción de IBN aumentó en este punto en un factor de aproximadamente 2,3 en
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Actividad en función del pH
Condiciones de los ensayos
tampón 100 mM
KCl 50 mM
5 ATP 10 mM HIV 200 mM (a precisar) 1 mg/ml de enzima purificada Incubación a 30°C durante 72 h
Las condiciones óptimas se han obtenidos a un pH de 5,5, en citrato 100 mM.
10 Parámetros enzimáticos
Se realizó una gama de sustrato realizada en las condiciones anteriormente descritas, con una incubación a 50°C. Se estima que el Km de la enzima es de HIV 40 mM.
Optimización de las condiciones de reacción
Se han investigado las condiciones de reacción óptimas. Se han considerado las condiciones siguientes:
15 citrato 100 mM KCl 50 mM ATP 40 mM HIV 200 mM 1 mg/ml de enzima
20 Incubación a 50°C durante 48 h
Como se muestra en la figura 14, al relación señal a ruido de fondo es de aproximadamente 100.
Ejemplo 6. Optimización del nivel de expresión de la MDP descarboxilasa de P. torridus en E. coli
El nivel de expresión inicial en E. coli BL21 era bajo, puesto que la banda era difícilmente visible en SDS-PAGE antes de la purificación. El índice de optimización por codón (CAI) de la secuencia natural para la expresión en E.
25 coli se midió usando el programa informático "Optimizer" disponible de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/, e inspirándose en el procedimiento de Sharp y Li (1987). El valor obtenido era solamente de 0,23, que refleja el nivel de expresión limitado de la proteína estudiada en E coli.
Se generó una secuencia codificante de una proteína idéntica, pero con codones mejor adaptados a la expresión en
E. coli. El CAI de esta secuencia, 0,77 estaba más cercano del óptimo de 1.
30 La secuencia natural y la secuencia optimizada se presentan en la SEQ ID NO: 17 (secuencia optimizada de la MDP descarboxilasa de P. torridus (AAT43941) que incluye la His Tag) y la SEQ ID NO: 19 (secuencia natural de la MDP descarboxilasa de P. torridus (AAT43941) que incluye la His Tag).
La secuencia optimizada se sintetizó mediante concatenación de oligonucleótidos, y se clonó en un vector de expresión pET25. Después de la transformación del vector en la cepa E.coli BL21(DE3) y de la inducción usando el
35 protocolo anteriormente descrito, las proteínas se produjeron, se purificaron y se analizaron en gel de una forma similar a la descrita anteriormente. Se realizó el mismo protocolo con la secuencia natural como comparación.
La comparación entre los niveles de expresión del candidato 224 mediante el uso tanto de la secuencia nucleotídica natural como de la secuencia optimizada para la expresión en E.coli.
Los resultados presentados en la Figura 15 muestran que la proteína correspondiente al gen optimizado es
40 claramente visible en el gen en el lisado celular no purificado (hilera 4), lo que se traduce en un aumento muy significativo en la expresión. La pureza de la proteína tras la etapa de purificación también es más importante en el caso del gen optimizado.
La actividad se midió sobre el lisado bruto. En efecto, ya que esta actividad era indetectable sobre el lisado en bruto obtenido con la secuencia nucleotídica natural. La expresión de la proteína se mejoró de tal manera que el lisado en
45 bruto obtenido a partir de la secuencia nucleotídica mejorada (clon 224 optimizado) presenta actualmente esta actividad.
El medio de reacción utilizado en este ensayo fue el siguiente:
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35
Medio de reacción
Productos
Concentración final
Tampón de reacción Tampón acetato (500 mM, pH = 5,5)
50 mM
MgCl2 (1M)
10 mM
KCl (1 M)
20 mM
HIV (3M)
50 mM
ATP (100 mM)
40 mM
Inhibidor de proteasas (100X)
1X
H20
Enzima
89 ug de proteínas totales (lisado en bruto)
Incubación 2 días a 50°C. Resultados Condición n.º 1: Lisado del clon 224 optimizado Condición n.º 2: Lisado del clon GB6 (plásmido pET vacío)
Condiciones
Área de la señal Relación
1
1083 22
2
49
Ejemplo 7: procedimiento de síntesis de isobutileno a partir de 3-hidroxi-3-metil-butirato y conversión en isooctano.
Se llevó a cabo una reacción idéntica a la del vial 3 del ejemplo 3 en un volumen de 1 litro, introducido en un fermentador que dispone un sistema de extracción de gases. La presencia de la enzima recombinante indujo la conversión del 3-hidroxi-3-metil-butirato en iso-butileno, que se desprende naturalmente en forma de gases y se recupera mediante un sistema de extracción de gases situado en la parte superior del fermentador. El isobutileno se utilizó para generar isoocteno mediante adición catalizada por la resina Amberlyst 35wet o 36wet (Rohm y Haas). Finalmente, el isoocteno se recuperó por hidrogenación catalítica en isooctano.
Ejemplo 8: ingeniería de la enzima para mejorar su eficacia para los sustratos.
Se utiliza la tecnología de mutagénesis aleatoria para generar un banco que contiene miles de mutantes a partir del gen descrito en el ejemplo 1. A continuación, este banco de mutantes se integró en el plásmido de expresión, y se transformó el banco en bacterias competentes de la cepa BL21. A continuación se aislaron un millar de bacterias, que se resiembran en tubos eppendorf que contienen 500 µl de medio LB suplementado con ampicilina. Las muestras se incubaron en un agitador durante 15 horas. Al día siguiente, se midió la cantidad de isobutileno producida usando uno u otro de los protocolos experimentales presentados en los ejemplos anteriores.
Los clones que presentaban una cantidad de isobutileno significativamente aumentada se validaron posteriormente de nuevo usando el mismo protocolo experimental. Una vez validada su mejora, el plásmido se extrajo de cada cepa mejorada, y se secuenció. Las mutaciones en el origen de la mejora de la actividad se identificaron, y se combinaron, en el mismo plásmido. El plásmido que contenía las diferentes mutaciones mejorantes se transformó a su vez en bacterias competentes, y se utilizó el mismo sistema de análisis.
El clon que combinaba las diferentes mutaciones, que presentaba una actividad significativamente superior a la del que contenía solamente una mutación mejorante, se utilizó después como bases para una nueva ronda de mutación/cribado, a la búsqueda de mutantes que mostraran una actividad todavía más mejorada.
Al finalizar este protocolo, se seleccionó el clon que contenía varias mutaciones y que tenía la mejor actividad.
Ejemplo 9: procedimiento de síntesis del etileno a partir de 3-hidroxi-propionato.
El gen que codifica la enzima descrita en el ejemplo 1 se insertó en un plásmido que permitía la expresión de proteínas recombinantes en una cepa de E. coli. El plásmido se transformó en bacterias de dicha cepa. Las bacterias transformantes se incubaron a continuación en un fermentador en presencia de propil-difosfato (10 mg/l) y de 3-hidroxi-propionato (1 g/l). La presencia de la enzima recombinante indujo la conversión del 3-hidroxipropionato en etileno, que se desprende espontáneamente en forma de gases y se recupera mediante un sistema de extracción de gases situado en la parte superior del fermentador. A continuación se mide la presencia de etileno en la muestra de gas correspondiente usando un sistema de cromatografía de gases acoplado a un detector de infrarrojos, zona

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