ES2648231T3

ES2648231T3 - Composición inmunogénica de múltiples componentes para la prevención de la enfermedad por estreptococos beta hemolíticos (EBH)

Info

Publication number: ES2648231T3
Application number: ES09752598.4T
Authority: ES
Inventors: Ingrid Lea Dodge; Annaliesa Sybil Anderson; Michael Hagen; Stephen Bruce Olmsted; Patrick P. Cleary
Original assignee: Wyeth LLC; University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Current assignee: Wyeth LLC; University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Priority date: 2008-11-05
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2029-11-04
Also published as: BRPI0921286B8; AU2009313615A1; RU2011116286A; AU2009313615B2; TW201022442A; PE20120116A1; AR074273A1; US9127050B2; US20140037669A1; NO2356135T3; EP2356135A1; CN107050442B; RU2478396C2; EP2356135B1; CN102203122A; BRPI0921286A8; CA2741691A1; JP2012508174A; MX2011004755A; US20100119534A1

Abstract

Una composición inmunogénica, comprendiendo dicha composición una mezcla de: (a) un polipéptido de PCE que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEQ ID NO: 4); y (c) un supuesto polipéptido de adhesión que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 8 (SEQ ID NO: 8).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

Un experto en la materia entiende bien que son útiles muchos niveles de identidad de secuencia en la identificación de secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos relacionadas. Los alineamientos de secuencia y los cálculos del porcentaje de identidad se pueden realizar utilizando el programa MEGALIGN™ del paquete de programas de computación bioinformático LASERGENE™ (DNASTAR Inc., Madison, WI). Utilizando el método de alineamiento Clustal pueden realizarse alineamientos de múltiples secuencias (Higgins y Sharp, Gene, 73 (1): 237-44, 1988) con los parámetros predeterminados, por ejemplo, PENALIZACIÓN de HUECO = 10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 10. Los parámetros predeterminados para los alineamientos en pares utilizando el método Clustal pueden ser, por ejemplo, KTUPLA 1, PENALIZACIÓN DE HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5.

Una secuencia de polipéptido de uso en la invención puede ser idéntica a la secuencia recitada, es decir, el 100 % idéntica o, en la medida en que se describe en las reivindicaciones, puede incluir hasta un determinado número entero de modificaciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de forma que el % de identidad es menor que el 100 %. Tales alteraciones incluyen al menos una deleción, sustitución, incluyendo una sustitución conservativa o no conservativa, o inserción de aminoácido. Las modificaciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminal de la secuencia de polipéptido de referencia, o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea de forma individual entre los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia o en uno o más grupos continuos dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia.

Por lo tanto, en la medida en que se define en las reivindicaciones, la invención también proporciona el uso de polipéptidos aislados que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias recitadas. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es preferentemente mayor que el 90 % (por ejemplo, el 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más). Estas proteínas homólogas incluyen mutantes y variantes alélicas.

“Identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, según pueda ser el caso, determinado por la coincidencia entre las hebras de tales secuencias. La “identidad” y la “similitud” pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero sin limitación los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferentes para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas de computación disponibles de forma pública. Los métodos de programa de computación preferentes para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al. 1984, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, SF, et al., 1990. El programa BLASTX está disponible de forma pública en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., 1990). Para determinar la identidad también puede utilizarse el bien conocido algoritmo de Smith Waterman.

Por ejemplo, el número de modificaciones de aminoácidos para una dada identidad % puede determinarse multiplicando el número total de aminoácidos de una de las figuras 2-10 numeradas par (las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10) por el porcentaje numérico de la respectiva identidad porcentual (dividido por 100) y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la una de las Figuras 2-10 numeradas par (las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10), o:

na ≤xa -(xa •y),

en la que na es el número de modificaciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en la una de las figuras 2-10 numeradas par (las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10) e y es, por ejemplo, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 %, 0,97 para 97 % etc., y en la que cualquier producto de xa e y que no sea un número entero se redondea al número entero inferior más cercano antes de restarlo de xa.

En la medida en que se definen en las reivindicaciones, la presente invención también contempla el uso de polipéptidos aislados que están sustancialmente conservados entre las cepas de estreptococos β hemolíticos.

Además, también se contempla en la presente invención el uso de polipéptidos aislados que están sustancialmente conservados entre las cepas de estreptococos β hemolíticos y que son eficaces en la prevención y la mejora de la colonización o infección por estreptococos β hemolíticos en un sujeto susceptible. Como se usa en el presente documento, el término “conservado” se refiere a, por ejemplo, el número de aminoácidos que no experimenta inserciones, sustitución y/o deleciones como un porcentaje del número total de aminoácidos en una proteína. Por ejemplo, si una proteína está al 90 % conservada y tiene, por ejemplo, 263 aminoácidos, entonces existen 237

posiciones de aminoácido en la proteína en las que los aminoácidos no experimentan sustitución. Así mismo, si una proteína está al 95 % conservada y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280 aminoácidos, entonces hay 14 posiciones de aminoácido en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución y 266 (es decir, 280 menos 14) posiciones de aminoácido en las que los aminoácidos no experimentan sustitución. De acuerdo con una realización de la presente invención, un polipéptido aislado utilizado en ella está preferentemente al menos aproximadamente el 90 % conservado entre las cepas de estreptococos β hemolíticos, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % conservado entre las cepas, aún más preferentemente al menos aproximadamente el 97 % conservado entre las cepas y muy preferentemente al menos aproximadamente el 99 % conservado entre las cepas, sin limitación.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos y aún obtener polipéptidos que tengan actividad y/o antigenicidad de estreptococos β hemolíticos y/o de Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una secuencia sin una pérdida apreciable de actividad y/o antigenicidad. Debido a que es esta capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad biológica funcional del polipéptido, pueden realizarse en una secuencia de polipéptido determinadas sustituciones en la secuencia de aminoácidos (o, por supuesto, su secuencia de ADN codificante subyacente) y, no obstante, obtener un polipéptido con propiedades similares.

En la medida en que se define en las reivindicaciones, la invención incluye el uso de cualquiera de los polipéptidos aislados que son equivalentes biológicos de los polipéptidos indicados de forma concreta, que proporcionan la reactividad deseada según se describe en el presente documento. La expresión “reactividad deseada” se refiere a la reactividad que reconocería un experto en la materia como un resultado útil para los fines de la invención. Se describen en el presente documento ejemplos de reactividad deseada, incluyendo, pero sin limitación, los niveles deseados de protección, los títulos de anticuerpos deseados, la actividad opsonofagocítica deseada y/o la reactividad cruzada deseada, tal como reconocería un experto en la materia como útil para los fines de la presente invención. La actividad opsonofagocítica deseada está indicada por un porcentaje de destrucción de bacterias según se mide por la disminución de unidades formadoras de colonias (UFC) en un EOF (ensayo opsonofagocítico) frente a un control negativo. Sin limitarse a ello, la actividad opsonofagocítica deseada es preferentemente al menos aproximadamente del 15 %, más preferentemente al menos aproximadamente del 20 %, aún más preferentemente al menos aproximadamente del 40 %, aún más preferentemente al menos aproximadamente del 50 % y muy preferentemente al menos aproximadamente del 60 %.

En la medida en que se define en las reivindicaciones, la invención incluye el uso de polipéptidos que son variantes de los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de las figuras 2-10 numeradas par (las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10). “Variante”, como el término que se usa en el presente documento, incluye un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia pero conserva propiedades esenciales. En general, las diferencias están limitadas de forma que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares de forma general y, en muchas regiones, idénticas (es decir, biológicamente equivalentes). Un polipéptidos variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones o deleciones, en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe si es de origen natural. Las variantes de los polipéptidos que no son de origen natural pueden fabricarse por síntesis directa o por técnicas de mutagénesis.

En la realización de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en el otorgamiento de una función biológica interactiva a un polipéptido se entiende de forma general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar y aún dar como resultado un polipéptido con una actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático a base de su hidrofobicidad y características de carga. Los índices se enumeran en paréntesis detrás de cada aminoácido como sigue: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparragina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del resto de aminoácido determina las estructuras secundaria y terciaria del péptido resultante, lo que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tal como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y aún obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, es preferente la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están entre +/-2, los que están entre +/-1 son particularmente preferentes y los que están entre +/-0,5 son aún más particularmente preferentes.

La sustitución de aminoácidos similares también puede realizarse a base de la hidrofilicidad, en particular cuando el polipéptido o péptido equivalente biológico funcional creado de ese modo está destinado a su uso en realizaciones inmunológicas. La Patente de Estados Unidos número 4.554.101, incorporada en el presente documento como referencia, indica que una mayor hidrofilicidad promedio local de un polipéptido, regida por la hidrofilicidad de sus

imagen8

imagen9

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o de una dispersión inyectable estéril.

Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N. J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe estar estéril y debería ser fluida hasta el punto que exista una jeringabilidad fácil.

Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y deben conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilénglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y similares. En muchos casos, los agentes isotónicos están incluidos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y/o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede efectuarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los polipéptidos en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con una o más combinaciones de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son secado por vacío y liofilización, lo que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento también comprenden, en determinadas realizaciones, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmunitaria cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha observado que varias citocinas o linfocinas tienen actividad inmunomoduladora y que, por lo tanto, son útiles como adyuvantes, incluyendo, pero sin limitación, las interleucinas 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8 y 10, 12 (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones α, β y γ; el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º 5.078.996 y el Número de Registro de la ATCC 39900); el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y los factores de necrosis tumoral α y β. Aún otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento incluyen quimiocinas, que incluyen pero sin limitación, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β y RANTES; moléculas de adhesión, tales como selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas similares a mucina, por ejemplo, CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1; un miembro de la familia de las integrinas tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas tales como PECAM, las ICAM, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tales como CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluyen el factor de crecimiento vascular, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y el factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas receptoras que incluyen Fas, el receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6; y Caspasa (ICE)

Los adyuvantes adecuados utilizados para potenciar una respuesta inmunitaria incluyen además, pero sin limitación, MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacetilado, Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la Patente de Estados Unidos n.º 4.912.094. También son adecuados para su uso como adyuvantes los análogos sintéticos de lípido A o los compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (FAG), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente de Estados Unidos n.º 6.113.918. Uno de tales AFG es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que también es conocido como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (FA) o como una emulsión estable (EE).

Aún otros adyuvantes incluyen muramil péptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), Nacetil-normuramil-L-alanina-2-(1’-2’ dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite en agua, tales como MF59 (Patente de Estados Unidos n.º 6.299.884) (que contienen escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (opcionalmente que contengan diversas cantidades de MTP-PE) formuladas en partículas submicrométricas utilizando un microfluidificador tal como el microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)), y SAF (que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero L121 bloqueado con pluronic al 5 % y thr-MDP, ya sea microfluidificado en una emulsión submicrométrica o sometido a agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande); sales de aluminio (alumbre), tal como

hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amfigen; Avridina; L121/escualeno; D-lactidapolilactida/glucósido; polioles de pluronic; Bordetella destruida; saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA), descrito en la Patente de Estados Unidos n.º 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito en la Patente de Estados Unidos n.º 5.254.339 y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.º 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descrito en las Patentes Europeas n.º 1.296.713 y 1.326.634; una toxina pertussis (TP) o un mutante de la misma, una toxina colérica o un mutante de la misma (por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 7.285.281, 7.332.174, 7.361.355 y 7.384.640); o una toxina termolábil (TL) de E. coli o un mutante de la misma, en particular LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 6.149.919, 7.115.730 y 7.291.588).

Los polipéptidos de uso en la invención también pueden conjugarse o unirse a un péptido, polipéptido o proteína, o a un polisacárido. También se prevé que las composiciones inmunogénicas puedan contener otros componentes, tales como polisacáridos, solos o conjugados con proteínas que pueden suscitar una respuesta inmunitaria.

Se utilizan diversas pruebas para evaluar la inmunogenicidad in vitro de los polipéptidos de las composiciones inmunogénicas de la invención. Por ejemplo, se realiza un ensayo de opsonización in vitro incubando juntos una mezcla de células de Streptococcus sp., suero inactivado con calor que contiene anticuerpos específicos frente al polipéptido en cuestión y una fuente exógena de complemento. Durante la incubación de los linfocitos polimorfonucleares (los PMN) aislados recientemente con la mezcla de anticuerpo/complemento/células de Streptococcus sp. tiene lugar la opsonofagocitosis. Las células bacterianas que están recubiertas con anticuerpo y complemento se destruyen durante la opsonofagocitosis. Se determinan mediante plaqueo de la mezcla de ensayo las unidades formadoras de colonias (ufc) de las bacterias supervivientes que escapan de la opsonofagocitosis. Los títulos se informan como el inverso de la dilución más alta que proporciona ≥ 50 % de destrucción bacteriana, según se determina mediante la comparación con los controles del ensayo. Se notifica que las muestras de ensayo que muestran menos del 50 % de destrucción a la dilución de suero más baja analizada (1:8), tienen un título de anticuerpo de opsonofagocitosis (AOF) de 4. El método descrito anteriormente es una modificación del método de Gray (Gray, Conjugate Vaccines Supplement, pág. 694-697, 1990).

Se incluye para cada suero individual un control del suero de prueba, el cual contiene suero de prueba más células bacterianas y complemento inactivado por calor. Este control se utiliza para evaluar si la presencia de antibióticos o de otros componentes del suero tienen la capacidad de destruir la cepa bacteriana de forma directa (es decir, en ausencia de complemento o de los PMN). Se utiliza un suero humano con título de opsonización conocido como un control positivo de suero humano. El título de anticuerpos opsónicos de cada suero desconocido se calcula como el inverso de la dilución inicial de suero que proporciona el 50 % de reducción de ufc en comparación con el control sin suero.

Para evaluar la inmunogenicidad in vitro y la exposición en superficie del antígeno polipeptídico también puede utilizarse un ensayo de ELISA de células enteras, en el que la cepa bacteriana de interés se recubre en la placa, tal como una placa de 96 pocillos, y se hace reaccionar con las células bacterianas un suero de prueba de un animal inmunizado. Puede detectarse mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia si algún anticuerpo específico para el antígeno polipeptídico de prueba es reactivo con un epítopo expuesto en la superficie del antígeno polipeptídico. Una estrategia similar es controlar el antígeno en la superficie celular utilizando citometría de flujo y anticuerpos específicos para el antígeno.

Después puede analizarse en un modelo animal de exposición in vivo cualquier polipéptido que demuestre la actividad deseada in vitro. En algunas realizaciones las composiciones inmunogénicas se utilizan en la inmunización de un animal (por ejemplo, un ratón) mediante métodos y vías de inmunización conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, intranasal, parenteral, intramuscular, oral, rectal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, etc.). Después de la inmunización del animal con una composición inmunogénica estreptocócica, el animal se expone a una o más especies estreptocócicas y se ensaya la resistencia a la infección por Streptococcus spp.

La composición inmunogénica de la invención puede combinarse con uno o más polipéptidos conocidos de Streptococcus pyogenes incluyendo, pero sin limitación, las proteínas M, adhesinas y similares.

Una vez formuladas, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse de forma directa al sujeto, suministrarse ex vivo a las células obtenidas del sujeto o in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Para el suministro directo al sujeto, la administración puede ser mediante cualquier forma convencional, tal como por vía intranasal, vía parenteral, vía oral, vía intraperitoneal, vía intravenosa, vía subcutánea

o vía tópica, aplicada a cualquier superficie mucosa, tal como intranasal, oral, del ojo, del pulmón, vaginal o la superficie del recto, tal como mediante una pulverización en aerosol.

Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma de dosificación unitaria, para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a

imagen10

PCE (Peptidasa C5a)

peptidilpropil isomerasa (codificada por la ORF 554)

supuesta proteína de adhesión (codificada por la ORF 1358)

lipoproteína de superficie (codificada por la ORF 2459)

proteína hipotética (codificada por la ORF 1218)

Las combinaciones de dos o más de estos antígenos en una única composición inmunogénica de múltiples componentes proporcionan protección potenciada frente a uno o más grupos de EBH y producen una respuesta inmunitaria potenciada frente a los mismos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no se pretende que la presente invención se limite a ellos.

EJEMPLO 1-UNIÓN DE ANTICUERPOS

La unión de anticuerpos a las bacterias, un proceso conocido como opsonización, puede conducir a la captación y destrucción de las bacterias por las células fagocíticas. La exploración de tales anticuerpos se utiliza para determinar la eficacia de los anticuerpos producidos frente a serotipos particulares en la destrucción de bacterias que expresan

o no expresan el serotipo en la superficie.

Para cada serotipo explorado se produjeron en ratones anticuerpos frente a los anticuerpos que codifica la ORF indicada. Después, los anticuerpos se exploraron frente a diversas cepas de EBH. La exploración de los anticuerpos se realizó mediante separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Brevemente, se incubaron estreptococos destruidos con calor con un anticuerpo indicado, en hielo durante 45 minutos, seguido de dos lavados. Después, los estreptococos se incubaron durante 30 minutos en hielo con un anticuerpo de cabra anti Alexa 488 de ratón (Molecular Probes, Eugene, OR), seguido de dos lavados. Las células así tratadas se procesaron en una máquina de FACS (por ejemplo, véase DeMaster et al., Infect. Immun., 70 (1): 350-359, 2002). Los resultados se resumen en la Tabla 2.

En el transcurso de la exploración de los antisueros anti estreptococo beta hemolítico y los anticuerpos monoclonales frente a diversas cepas de estreptococos beta hemolíticos (EBH), se observó que algunos antisueros y anticuerpos tenían reactividad cruzada frente a muchas cepas de EBH, incluyendo los miembros de Streptococcus pyogenes (estreptococos del Grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) y estreptococos del grupo C y el grupo G (que incluyen las especies estreptocócicas Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, Streptococcus dysgalactiae sub. Equisimilis y Streptococcus dysgalactiae sub. Dysgalactiae). Esta reactividad cruzada también significa que los polipéptidos indicados o que codifica la ORF de interés, pueden utilizarse en una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmunitaria eficaz para proteger frente a la infección por Streptococcus del Grupo A o Grupo B, así como por Streptococcus del Grupo C o Grupo G.

En la Tabla 2, el símbolo “+” significa que los anticuerpos reaccionan con el antígeno al menos tres veces por encima del fondo, el símbolo “+/-” significa que los anticuerpos reaccionan con el antígeno entre dos y tres veces por encima del fondo, y el símbolo “-” significa que la detección de la señal del anticuerpo está en o por debajo del fondo.

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

Claims

imagen1