ES2648492T3 - Fusiones de receptores TGF tipo II y tipo III - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión heterotrimérica que comprende: (a) un segmento amino terminal que comprende un primer dominio de unión a TGFß de un receptor de TGFß tipo II, (b) un segmento central que comprende un dominio de endoglina del receptor de TGFß tipo III, y (c) un segmento carboxilo terminal que comprende un segundo dominio de unión a TGFß del receptor de TGFß tipo I

Description

DESCRIPCIÓN

Fusiones de receptores tgf tipo ii y tipo iii

DECLARACIÓN RELATIVA A LA INVESTIGACIÓN FINANCIADA POR EL GOBIERNO FEDERAL 5

La presente invención se realizó con ayuda del gobierno con las becas CA079683 y GM58670 otorgadas por el Instituto Nacional del Cáncer y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, respectivamente. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

10

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS

Se ha presentado electrónicamente un listado de secuencias con esta solicitud. El listado de secuencias se incorpora en esta invención como referencia.

15

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las isoformas (β1, β2, y β3) del factor del crecimiento transformante beta (TGFβ) son polipéptidos homodiméricos de 25 kDa. Se secretan en una forma latente y solo un pequeño porcentaje de los TGFβ totales secretados se activan bajo condiciones fisiológicas. El TGFβ se une a tres receptores de superficie celular llamados receptores tipo 20 I (RI), tipo II (RII), y tipo III (RIII). RI y RII son receptores de serina/treonina quinasa. RIII (también llamado betaglicano) tiene dos sitios de unión de TGFβ en su dominio extracelular, que se llaman dominios E y U (BGE y BGU, respectivamente). TGFβ1 y TGFβ3 se unen a RII con una afinidad que es 200-300 veces mayor que la de TGF-β2 (Baardsnes y cols., Biochemistry, 48, 2146-55, 2009); en consecuencia, las células deficientes en RIII son de 200 a 300 veces menos sensibles a las concentraciones de TGF-β2 equivalentes en comparación con TGF-β1 y 25 TGFβ-3 (Chiefetz, y cols. (1990) J. Bio. Chem, 265, 20533-20538). Sin embargo, en presencia de los RIII, las células responden casi por igual a las tres isoformas de TGF-β, de acuerdo con los informes que muestran que los RIII pueden unirse al ligando y presentarlo a los RII para aumentar la actividad de TGFβ cuando está unido a la membrana (Chen y cols., J. Biol. Chem. 272, 12862-12867, 1997; Lopez-Casillas y cols., Cell 73, 1435-1444, 1993; Wang y cols., Cell 67, 797-805, 1991; Fukushima y cols., J. Biol. Chem. 268, 22710-22715, 1993; Lopez-Casillas y 30 cols., J. Cell Biol. 124, 557-568, 1994). La unión de TGFβ a los RII incorpora y activa los RI a través de la fosforilación (Wrana y cols., Nature 370, 341-347, 1994). El RI activado fosforila a los Smad2 y Smad3 intracelulares, que a su vez interactúan con Smad4 para regular la expresión génica en el núcleo. (Piek y cols., FASEB J. 13, 2105-2124, 1999; Massague and Chen, Genes & Development 14, 627-644, 2000). A través de su regulación de la expresión génica, el TGFβ ha demostrado afectar a muchas funciones celulares como por ejemplo la proliferación 35 celular, la diferenciación celular, la adhesión celular y de las células con la matriz, la motilidad celular, y la activación de los linfocitos (Massague, Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597-641, 1990; Roberts and Sporn, The transforming growth factor-betas. In Peptide growth factors and their receptors I, Sporn and Roberts, eds. (Heidelberg: Springer-Verlag), pp. 419-472, 1991). El TGFβ también ha demostrado estar, o está implicado, en la inducción o mediación de la progresión de muchas enfermedades como por ejemplo la osteoporosis, la hipertensión, la ateroesclerosis, la cirrosis 40 hepática y enfermedades fibróticas del riñón, hígado y pulmón (Blobe y cols., N. Engl. J. Med. 342, 1350-1358, 2000). Tal vez, la función más ampliamente estudiada de TGFβ es su papel en la progresión tumoral.

Los TGFβ han demostrado ser unos potentes inhibidores del crecimiento en varios tipos de células incluyendo las células epiteliales (Lyons and Moses, Eur. J. Biochem. 187, 467-473, 1990). El mecanismo de la inhibición de 45 crecimiento de TGFβ se debe principalmente a la regulación de las proteínas relacionadas con el ciclo celular (Derynck, Trends. Biochem. Sci. 19, 548-553, 1994; Miyazono y cols., Semin. Cell Biol. 5, 389-398, 1994). Por lo tanto, la regulación aberrante de la maquinaria del ciclo celular como por ejemplo la pérdida del producto génico del retinoblastoma durante la tumorigénesis puede provocar una pérdida de la inhibición del crecimiento de TGFβ. Además, se ha informado de la inactivación mutacional de los receptores de TGFβ, Smad2 y Smad4 en varios 50 carcinomas (Massague y cols., Cell 103, 295-309, 2000). Por ejemplo, a menudo se observa la pérdida de expresión de los RI y/o RII en algunos cánceres gastrointestinales humanos (Markowitz and Roberts, Cytokine, Growth Factor, Rev. 7, 93-102, 1996).

Mientras que muchas células de carcinoma pierden la respuesta a la inhibición del crecimiento de TGFβ, al 55 compararlas con sus homólogos normales, a menudo sobreproducen isoformas de TGFβ activas (Reiss, Microbes and Infection 1, 1327-1347, 1999). Es probable que esto provoque la selección de células cancerosas que sean resistentes a la actividad inhibitoria del crecimiento de TGFβ. De hecho un aumento en los niveles de TGFβ1 está fuertemente asociado con la progresión de muchos tipos de procedimientos cancerosos y malos resultados clínicos (Reiss, Microbes and Infection 1, 1327-1347, 1999). Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles séricos de 60 TGFβ1 están correlacionados con la carga tumoral, la metástasis, y el antígeno específico de próstata sérico (PSA) en pacientes con cáncer de próstata (Adler y cols., J. Urol. 161, 182-187, 1999; Shariat y cols., J. Clin. Oncol. 19, 2856-2864, 2001). De acuerdo con estas observaciones, se observó un notable aumento de la expresión de TGFβ1 y TGFβ2 en una línea celular agresiva de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos al compararla con la línea celular parental menos agresiva dependiente de andrógenos, LNCap (Patel y cols., J. Urol. 164, 1420-5 1425, 2000).

Se cree que varios mecanismos median en la actividad que favorece los tumores de TGFβ (Arteaga y cols., Breast Cancer Res. Treat. 38, 49-56, 1996; Reiss, Microbes and Infection 1, 1327-1347, 1999). El TGFβ es un potente inmunosupresor (Sosroseno and Herminajeng, Br. J. Biomed. Sci. 52, 142-148, 1995). La sobreexpresión de TGFβ1 10 en las células cancerosas de próstata en ratas se asoció con una reducción de la respuesta inmunológica durante la formación de tumores, lo que sugiere que el TGFβ puede suprimir la respuesta inmunitaria del huésped al crecimiento tumoral (Lee y cols, Prostrate 39, 285-290, 1999). El TGFβ también ha demostrado ser angiogénico in vivo (Fajardo y cols., Lab. Invest. 74, 600-608, 1996; Yang and Moses, J. Cell Biol. 111, 731-741, 1990; Wang y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 8483-8488, 1999). La sobreexpresión de TGFβ durante la progresión del 15 cáncer se asocia a menudo con el aumento de la angiogénesis y la metástasis sugiriendo que el TGFβ puede favorecer la metástasis estimulando la formación de vasos sanguíneos tumorales (Roberts and Wakefield, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 8621-8623, 2003). El TGFβ también juega un importante papel a la hora de favorecer de la metástasis ósea de los cánceres de próstata y de mama humanos (Koeneman y cols., Prostrate 39, 246-261, 1999; Yin y cols., J. Clin. Invest 103, 197-206, 1999). El tejido óseo, que es la mayor fuente de TGFβ en el cuerpo, 20 produce tanto el TGFβ1 como el TGFβ2 (Bonewald and Mundy, Clin. Orthop. 261-276, 1990). El TGFβ latente puede activarse mediante proteasas como la PSA y el activador del plasminógeno uroquinasa, que son secretadas abundantemente por las células cancerosas (Koeneman y cols., Prostrate 39, 246-261, 1999). Tomados conjuntamente, los TGFβ pueden actuar en el microambiente tumoral para favorecer el crecimiento del carcinoma, la angiogénesis y la metástasis. 25

Debido a su implicación en la progresión de diversas enfermedades, el TGFβ se ha destinado para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Una manera de antagonizar la actividad de TGFβ es utilizar el ectodominio del receptor tipo II de TGFβ o el receptor tipo III (betaglicano [BG]). Se ha demostrado previamente que la expresión ectópica de un RIII soluble (sBG) en líneas celulares de carcinoma humano pueden inhibir significativamente el 30 crecimiento tumoral, la angiogénesis, y la metástasis cuando se inocula ratones sin pelaje (nude) atímicos (Bandyopadhyay y cols., Cancer Res. 59, 5041-5046, 1999; Bandyopadhyay y cols., Oncogene 21, 3541-3551, 2002b). Más recientemente, se ha demostrado que la administración sistémica de sRIII recombinante puede inhibir el crecimiento, la angiogénesis, y la metástasis de xenoinjertos de las células MDA-MB-231 del carcinoma mamario humano en ratones sin pelaje (Bandyopadhyay y cols., Cancer Res. 62, 4690-4695, 2002a). Sin embargo, la 35 inhibición fue solo parcial. Esto podría ser debido, en parte, al hecho de que las células producen TGFβ1 activo y TGFβ2 activo y la potencia anti-TGFβ de sRIII es 10 veces menor para TGFβ1 que para TGFβ2 (Vilchis-Landeros y cols., Biochem. J. 355, 215-222, 2001). Curiosamente, mientras que el dominio extracelular de RII (sRII) tiene una afinidad muy baja para TGFβ2, su afinidad por TGFβ1 y TGFβ3 es más de diez veces mayor que la de sRIII (Lin y cols., J. Biol. Chem. 270, 2747-2754, 1995; Vilchis-Landeros y cols, Biochem. J. 355, 215-222, 2001). 40

Mientras que se han preparado y probado numerosos antagonistas de TGFβ, todos tienen propiedades inhibidoras incompletas de la isoforma TGFβ. Por lo tanto, existe la necesidad de antagonistas o inhibidores de TGFβ adicionales.

45

RESUMEN

Ciertas formas de realización están dirigidas a los novedosos polipéptidos heterotriméricos en los que el ectodominio del receptor tipo II de TGF-β (TβRII) se acopla a los extremos N o C terminales del dominio de endoglina (dominio E) del receptor tipo III de TGF-β (TβRIII). Este receptor trimérico, conocido como RER, puede unirse a las tres 50 isoformas de TGF-β con afinidad subnanomolar y es eficaz para neutralizar la señalización inducida por las tres isoformas de TGF-β, pero no a otros ligandos de la superfamilia de TGF-β, como por ejemplo las activinas, los factores de crecimiento y diferenciación (GDF), y las proteínas morfogenéticas óseas (BMP). La afinidad subnanomolar de la fusión, que surge de su capacidad para ponerse en contacto con el dímero de TGF-β en tres sitios distintos, le permite competir eficazmente con los receptores endógenos para la unión de TGF-β. Las proteínas 55 de fusión descritas en esta invención ofrecen un importante potencial como agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades provocadas por la sobreexpresión de las isoformas de TGF-β, como por ejemplo el cáncer y la fibrosis.

Ciertos aspectos están dirigidos a una proteína de fusión heterotrimérica que comprende (a) un segmento amino 60 terminal que comprende un primer dominio de unión a TGFβ de un receptor de TGFβ tipo II, (b) un segmento central que comprende un dominio de endoglina del receptor de TGFβ tipo III, y (c) un segmento carboxilo terminal que comprende un segundo dominio de unión a TGFβ del receptor de TGFβ tipo II.

Se proporciona un ejemplo de un receptor de TGFβ tipo II como la SEQ ID NO:6. Los aminoácidos 1 a 567 de la 5 SEQ ID NO:6 son un precursor del receptor de TGFβ tipo II (número CE=2.7.11.30). El péptido señal está compuesto por los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO:6. El péptido maduro incluye los aminoácidos 23 a 567 de la SEQ ID NO:6. El ectodominio se define por los aminoácidos 24 a 160 de la SEQ ID NO:6 (dominio RII). El ectodominio es seguido por una región transmembrana que abarca los aminoácidos 161 a 187 de la SEQ ID NO:6. El segmento amino terminal del segmento carboxilo terminal de una nueva proteína de fusión heterotrimérica 10 descrito en esta invención puede comprender, independientemente, un segmento aminoácido que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntico, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, a los aminoácidos 35, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, o 75 a 145, 150, 155, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, o 170 de la SEQ ID NO:6, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos. La capacidad del segmento polipéptido para unirse a TGFβ puede determinarse usando los ensayos de unión de ligando estándares conocidos por los 15 expertos en la técnica. En ciertos aspectos el dominio RII comprende mutaciones puntuales que alteran la afinidad de unión del dominio RII o de la afinidad de unión de un polipéptido que comprende un dominio RII. En ciertos aspectos los residuos de los aminoácidos 27, 30, 32, 50, 51, 52, 53, 55, 118, y 119 se pueden alterar individualmente o en varias combinaciones.

20

Se proporciona un ejemplo de un receptor TGFβ de tipo III receptor como la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:8. Los aminoácidos 1 a 23 de la SEQ ID NO:7 o 1 a 21 de la SEQ ID NO:8 definen el péptido señal. Los aminoácidos 24-409 de la SEQ ID NO:7 o 21-406 de la SEQ ID NO:8 definen el dominio tipo endoglina (dominio o región E), los aminoácidos 410 a 783 de la SEQ ID NO:7 o 407-780 de la SEQ ID NO:8 definen el dominio tipo zona pelúcida o el dominio tipo uromodulina (dominio o región U), y los aminoácidos 789 a 811 de la SEQ ID NO:7 o 786 a 808 de la 25 SEQ ID NO:8 definen la región transmembrana. El segmento central de la proteína de fusión trimérica puede comprender un segmento aminoácido que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntico, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, a los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, o 60 a 350, 355, 360, 361, 362, 364, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 o 409 de la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:8, incluyendo todos los valores e intervalos que existen entre ellos. En ciertos aspectos el dominio E 30 comprende mutaciones puntuales que alteran la afinidad de unión del dominio E o de la afinidad de unión de un polipéptido que comprende un dominio E. En otra forma de realización, el segmento central de la proteína de fusión trimérica puede comprender un segmento aminoácido que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntico, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, a los aminoácidos 405, 410, 415, 420, 425, 430, 440, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, o 550 a 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 35 650, 660, 670, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, o 780 de la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:8, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos. La capacidad del segmento polipéptido para unirse a TGFβ puede determinarse usando los ensayos de unión de ligando estándares conocidos por los expertos en la técnica. En ciertos aspectos los aminoácidos 69, 71, 72, 90, 93, 99, 108, 115, 120, 144, 163, 192, 206, 237, 252, 274, 283, y 336 de la SEQ ID NO:7 se pueden alterar individualmente o en varias combinaciones, o los correspondientes 40 aminoácidos de la SEQ ID NO:8.

En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además un conector entre el segmento amino terminal y el segmento central, y/o un conector entre el segmento central y el segmento terminal carboxílico. En otro aspecto, los conectores pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más 45 aminoácidos. En ciertos aspectos, los aminoácidos del conector son secuencias de aminoácidos adicionales del receptor de TGFβ tipo II o tipo III. En otros aspectos, los conectores no son secuencias de aminoácidos del receptor de TGFβ tipo II o tipo III, es decir, conectores heterólogos.

En ciertos aspectos, el segmento amino terminal comprende una secuencia de aminoácidos que es el 85, 90, 95, 98, 50 o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:3, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos.

En otro aspecto, el segmento central comprende una secuencia de aminoácidos que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:4, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos.

55

En otro aspecto adicional, el segmento carboxilo terminal comprende una secuencia de aminoácidos que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:5, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos.

En ciertos aspectos, la proteína de fusión tienen una secuencia de aminoácidos que es el 85, 90, 95, 98, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:2, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos. 60

En otro aspecto, la proteína de fusión puede comprender además una secuencia señal en el extremo amino terminal. En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además una etiqueta en el extremo amino terminal o carboxilo terminal. En ciertos aspectos la etiqueta es hexa-histidina.

5

Una etiqueta peptídica como se usa en esta invención se refiere a una secuencia de péptidos que está unida (por ejemplo mediante ingeniería genética) a otro péptido o una proteína, para proporcionar una función a la fusión resultante. Las etiquetas peptídica suelen ser relativamente cortas en comparación a una proteína a la que se fusionan, a modo de ejemplo, las etiquetas peptídicas son cuatro o más aminoácidos de longitud, como por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 25 o más aminoácidos. Normalmente una etiqueta peptídica no será de más de 10 aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, y puede no ser más de aproximadamente 75, no más que aproximadamente 50, no más que aproximadamente 40, o no más que aproximadamente 30.

Las etiquetas peptídicas confieren una o más funciones diferentes a una proteína de fusión (por lo tanto "funcionalizan" esa proteína), y dichas funciones pueden incluir (pero no se limitan a) uniones de anticuerpos (una 15 etiqueta de epítopo), purificación, translocación, dianas dirigidas y diferenciación (p. ej. a partir de una proteína nativa). Además, se puede usar como una etiqueta de epítopo específicamente escindible, un sitio de reconocimiento para una proteasa, para la que se conoce un anticuerpo de unión. El uso de dicha etiqueta escindible puede proporcionar escisiones y activaciones selectivas de una proteína. Alternativamente el sistema que se desarrolló en el laboratorio Dowdy (Vocero-Akbani y cols., Nat Med. 5:29-33, 1999) se puede usar para 20 proporcionar la especificidad de dicha escisión y activación.

Se puede lograr la detección de la molécula etiquetada usando distintas técnicas. Entre estas se incluyen: inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia ("western"), cromatografía de afinidad. 25

Las etiquetas de epítopo añaden un epítopo conocido (sitio de unión del anticuerpo) en la proteína sujeto, para proporcionar uniones de un anticuerpo conocido y a menudo de alta afinidad, y por lo tanto permitiendo que uno identifique y localice específicamente la proteína etiquetada que se ha añadido a un organismo vivo o la las células cultivadas. Entre los ejemplos de las etiquetas de epítopo se incluyen las etiquetas myc, T7, GST, GFP, HA 30 (hemaglutinina) y FLAG. Los primeros cuatro ejemplo son epítopos derivados de moléculas existentes. En contraste, FLAG es una etiqueta de epítopo sintética diseñada la alta antigenicidad (véase, p. ej., la patente de los EE.UU. N.º 4.703.004y 4.851.341).

La etiquetas de purificación se usan para permitir una fácil purificación de la proteína etiquetada, como por ejemplo 35 por cromatografía de afinidad. Una etiqueta de purificación muy conocida es la etiqueta hexa-histidina (6x-His), que es literalmente una secuencia de seis residuos de histidina. El sistema de purificación de la proteína 6x-His está comercialmente disponible por QIAGEN (Valencia, Calif.), bajo el nombre de QIAexpress®.

Ciertas formas de realización están dirigidas al uso terapéutico de las proteínas de fusión descritas en esta 40 invención. Ciertos aspectos están dirigidos a un procedimiento para tratar una afección relacionada con el TGFβ que comprende la administración de una cantidad eficaz de una proteína de fusión descrito en esta invención. La proteína de fusión se puede administrar a un sujeto, como por ejemplo un mamífero. El mamífero que recibe tratamiento puede tener o puede estar en riesgo de tener una o más afecciones asociadas con un exceso de TGF-β para la que se recomienda una reducción en los niveles de TGF-β. Dichas afecciones incluyen, pero no se limitan a, 45 enfermedades fibróticas (como por ejemplo glomerulonefritis, fibrosis neuronal, fibrosis dérmica, fibrosis pulmonar (p. ej. fibrosis pulmonar idiopática), fibrosis de pulmón, fibrosis inducida por radiación, fibrosis hepática, mielofibrosis), adherencias pleurales, enfermedades hiperproliferativas (p.ej. cáncer), quemaduras, enfermedades inmunológicas, enfermedades inflamatorias (incluyendo artritis reumatoide), rechazo al trasplante, contractura de Dupuytren, y úlceras gástricas. En ciertos aspectos la proteína de fusión se administra intravascularmente. 50

Entre otros términos relacionados con la descripción proporcionada en esta invención se incluyen:

El término "receptor" denota una proteína asociada a la célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y mitiga el efecto del ligando en la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una 55 estructura de dominio múltiple que comprende un dominio de unión de ligando extracelular y un dominio efector intracelular que está típicamente implicado en la transducción de la señal.

Por "multimérico" o "heteromultimérico" se entiende que comprende dos o más subunidades diferentes. Un receptor "heterodimérico" contiene dos subunidades distintas, donde una molécula "heterotrimérica" comprende tres 60 subunidades.

Por receptor multimérico "soluble" se entiende en esta invención un receptor multimérico, comprendiendo cada una de sus subunidades parcial o totalmente el dominio extracelular de un receptor, pero careciendo parcial o totalmente de cualquier dominio transmembrana, y careciendo parcial o totalmente de cualquier dominio intracelular. En 5 general, un receptor soluble de la invención es soluble en una solución acuosa.

Una proteína de "fusión" es una proteína que comprende dos segmentos de polipéptido unidos por una unión de péptidos, p. ej., por procesos recombinantes.

10

Como se usa en esta invención, un polipéptido "variante" de un polipéptido parental o de tipo salvaje, contiene una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos en comparación con uno parental o de tipo salvaje. Típicamente, dichas variantes tienen una identidad de secuencia para la secuencia parental o de tipo salvaje de al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, y tiene propiedades conservadas o 15 mejoradas en comparación con el polipéptido parental o de tipo salvaje. Algunos cambios pueden no afectar significativamente el plegamiento o actividad de la proteína o polipéptido, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, como son bien conocidas en la técnica, cambiando un aminoácido a otro que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares (aminoácidos básicos: arginina, lisina e histidina; aminoácidos ácidos: ácido glutámico, y ácido aspártico; aminoácidos polares: glutamina y asparagina; aminoácidos hidrófobos: leucina, 20 isoleucina y valina; aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptófano, tirosina; aminoácidos pequeños: glicina, alanina, serina, treonina, metionina), pequeñas supresiones, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos, y extensiones terminales amino o carboxilo pequeñas, como por ejemplo un residuo de metionina amino terminal, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad), como por ejemplo un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson y cols., EMBO 25 1985;14:1075 y ss; Nilsson y cols., Methods Enzymol. 1991; 198:3 y ss), glutathione S-transferase (Smith and Johnson, Gene 1988;67:31 y ss), u otro antígeno:epítopo o dominio de unión. Véase, en general Ford y cols., Protein Expression and Purification 1991;2:95-107. Las etiquetas de afinidad de la codificación del ADN están disponibles en los proveedores comerciales.

30

Las diferencias de secuencia o "identidad", en el contexto de las secuencias de aminoácidos, se pueden determinar mediante cualquier técnica adecuada, como por ejemplo (y como una selección adecuada en el contexto de esta invención) empleando un análisis de alineamiento Needleman-Wunsch (véase Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443453), como se proporciona mediante el análisis con ALIGN 2.0 usando la matriz de puntuación BLOSUM50 con una penalización por espacio en blanco de -12 y una penalización por extensión de -2 (véase Myers 35 and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 para la discusión sobre técnicas de alineamiento global incorporadas en el programa ALIGN). Hay disponible una copia del programa ALIGN 2.0, p. ej. a través del San Diego Supercomputer (SDSC) Biology Workbench. Debido a que el alineamiento Needleman-Wunsch proporciona una medición de identidad general o global entre dos secuencias, se debe reconocer que las secuencias diana que pueden ser parte o subsecuencias de las secuencias peptídicas grandes se pueden usar de forma análoga para completar secuencias 40 o, alternativamente, se pueden usar valores de alineación locales para evaluar las relaciones entre las subsecuencias, tal como determina, p. ej., el alineamiento Smith-Waterman (J. Mol. Biol. (1981) 147:195-197), que pueden obtenerse a través de programas disponibles (otros procedimientos de alineamiento locales que pueden ser adecuados para analizar la identidad incluyen programas que aplican algoritmos de alineamiento locales heurísticos como por ejemplo los programas FastA y BLAST). 45

El término "aislado" puede referirse a un ácido nucleico o polipéptido que carece sustancialmente de material celular, material bacteriano, material viral o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otros químicos (cuando se sintetizan químicamente). Además, un compuesto aislado se refiere a uno que se puede administrar a un sujeto como un compuesto aislado, en otras 50 palabras, el compuesto puede no considerarse simplemente "aislado" si está adherido a una columna o incrustado en un gel de agarosa. Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" o "péptido aislado" es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no se produce naturalmente como un fragmento y/o no está típicamente en el estado funcional.

55

Los restos de la invención, como por ejemplo polipéptidos o péptidos pueden conjugarse o unirse covalentemente o no covalentemente a otros restos como por ejemplo polipéptidos, proteínas, péptidos, soportes, restos de fluorescencia, o etiquetas. El término "conjugado" se usa ampliamente para definir la asociación funcional de un resto con otro agente y no pretende referirse únicamente a cualquier tipo de asociación funcional, y no está particularmente limitada a la conjugación "química". Se contemplan particularmente las proteínas de fusión 60 recombinantes.

El término "proporcionar" se usa de acuerdo con este significado ordinario para indicar "suministrar o facilitar para su uso". En algunas formas de realización, se proporciona la proteína directamente administrando la proteína, mientras que en otras formas de realización, la proteína se proporciona eficazmente administrando un ácido nucleico que 5 codifica la proteína. En ciertos aspectos la invención contempla composiciones que comprenden varias combinaciones de ácido nucleico, antígenos, péptidos, y/o epítopos.

Una cantidad eficaz se refiere a una cantidad de ingredientes activos necesarios para tratar, mejorar, o mitigar una enfermedad o una afección relacionada con una enfermedad. En aspectos más específicos, una cantidad eficaz 10 impide, alivia, o mejora los síntomas de la enfermedad, o prolonga la supervivencia del sujeto tratado, o mejora la calidad de vida de un individuo. La determinación de una cantidad eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en esta invención. Para cualquier preparación usada en los procedimientos de la invención, se puede estimar inicialmente una cantidad eficaz o dosis de los estudios in vitro, cultivos celulares, y/o ensayos con modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una 15 dosis en modelos animales para lograr una respuesta deseada o concentración de la proteína de fusión circulante. Dicha información se puede usar para determinar con precisión las dosis útiles en humanos.

A lo largo de esta solicitud se describen otras formas de realización de la invención. Una forma de realización descrita con respecto a un aspecto de la invención se aplica a otros aspectos de la invención y viceversa. Se 20 entiende que cada forma de realización descrita en esta invención es una forma de realización de la invención que se aplica a todos los aspectos de la invención. Se contempla que cualquier forma de realización descrita en esta invención se puede implementar con respecto a cualquier procedimiento o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones y kits de la invención se pueden usar para lograr procedimientos de la invención.

25

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno/a", pero también puede tener el significado de "uno/a o más", "al menos uno/a" y "uno/a o más que uno/a"

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación 30 estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para designar "y/o" a menos que se indique expresamente para referirse solo a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación admita una definición que se refiera solo a alternativas y a "y/o". 35

Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicación(ones), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, como por ejemplo "comprender" y "comprendiendo"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, como por ejemplo "tener" y "tiene"), "incluyendo" (y cualquier forma de incluir, como por ejemplo "incluye" e "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, como por ejemplo "contiene" y "contienen") son incluyentes o abiertas y no 40 excluyen elementos no indicados o etapas procedimentales adicionales.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indican formas de realización específicas de la invención, se dan solo a modo de ilustración, ya que 45 varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

50

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar aún más ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede comprender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las formas de realización de la memoria descriptiva que se presenta en esta invención.

55

FIG. 1. Sensogramas de SPR en los que se inyectaron concentraciones crecientes de TβRII y TβRIIIE sobre una superficie del sensor de SPR con TGF-β2 K25R I92V K94R inmovilizado. En los paneles a y b se muestran los sensogramas normalizados de masas, en el panel c se muestran los gráficos de la respuesta en equilibrio normalizada de masas (Req) en función de la concentración del receptor ([Receptor]), junto a los ajustes de Req = (Rmax x [Receptor])/(Kd + [Receptor]). 60

FIG. 2. Sensogramas de SPR en los que se inyectaron concentraciones crecientes de ectodominio del receptor tipo II de TGF-β sobre TGF-β2 K25R I92V K94R inmovilizado en ausencia (panel a) o presencia (panel b) de una concentración saturante (800 nM) del dominio de endoglina del receptor tipo III de TGF-β. En el panel c se muestran los gráficos de la respuesta en equilibrio normalizada de masas (Req) en función de la concentración del receptor 5 ([Receptor]), junto a los ajustes de Req = (Rmax x [Receptor])/(Kd + [Receptor]).

FIG. 3. Diagrama esquemático del complejo TGFβ:TβRII con el dominio de endoglina del receptor tipo III de TGFβ colocado de forma que no se solapa estéricamente con ninguna de las dos moléculas TβRII unidas. Se muestran las localizaciones en el TβRII de los extremos N y C terminales. 10

FIG. 4. Sensogramas de SPR en los que se inyectaron concentraciones crecientes de ER y RER sobre las superficies de la SPR con TGF-β1, -β2, y -β3 inmovilizados. Las concentraciones del receptor inyectado oscilan de 10 nM hacia abajo (en incrementos de dos veces).

15

FIG. 5. Datos de la unión competitiva en SPR en los que se preincubaron concentraciones crecientes de TβRII (R), TβRIIIE-TβRII (ER), y TβRII-TβRIIIE-TβRII (RER) con TGF-β3 0,8 nM durante 16 h y después se inyectaron sobre una superficie de SPR (20000 RU) de alta densidad con el anticuerpo monoclonal 1D11 anti TGF-β. Los datos se presentan en términos de pendiente inicial (que es directamente proporcional a la concentración de TGF-β libre en función de la concentración del competidor (R, ER, o RER). Se realizaron dos mediciones independientes para cada 20 construcción del receptor estudiada (indicado por -a y -b es suficiente en la leyenda).

FIG. 6. CI50 media usando células con Mv1Lu PAI1 luciferasa como indicador placas de 96 pocillos. Los ensayos se realizaron utilizando una dilución 4:1 de la fusión del receptor y 1D11 en serie (anticuerpo neutralizante) y el TGF-beta 20 pM 1, 2, o 3, a 37° durante la noche. 25

FIG. 7A-7C. Curvas de neutralización que comparan varias retenciones (RR (RII-RII), RER (RII-BGE-RII), ER (BGE-RII), REU (RII-BGE-BGU, o alternativamente RII-RIII), o EU (BGE-BGU, o alternativamente RIII) y 1D11 para (A) TGF-β1, (B) TGF-β2, o TGF-β3.

30

FIG. 8A-8C. Curvas de neutralización para varias preparaciones RER relacionadas con (A) de TGF-β1, (B) TGF-β2, o (c) TGF-β3

DESCRIPCIÓN

35

Como se analiza anteriormente, las isoformas (β1, β2, y β3) del factor del crecimiento transformante beta (TGFβ) son polipéptidos homodiméricos de 25 kDa. TGF-β tiene nueve residuos de cisteína que se conservan entre su familia; ocho cisteínas forman cuatro uniones disulfuro en la molécula, tres de las cuales forman una estructura de nudo de cisteína característica de la superfamilia de TGF-β, mientras que la novena cisteína forma una unión disulfuro con la novena cisteína de otra molécula TGF-β para producir el dímero. 40

Aunque se ha informado de varios inhibidores de TGF-β, no se ha aprobado ninguno para uso clínico. El nuevo inhibidor de TGF-β descrito en esta invención, RER, se puede producir fusionando artificialmente los dominios de unión del receptor de TGFβ tipo II y el dominio de endoglina del receptor tipo III. El diseño de RER, una fusión heterotrimérica en la que el ectodominio del receptor tipo II de TGF-β (R) se ha fusionado artificialmente en los 45 extremos N y C terminales del dominio tipo endoglina del receptor tipo III de TGF-β (E), se concibió basándose en las estructuras de la unión de los TGF-β a sus receptores de señalización, TβRI y TβRII,y los resultados de los estudios de unión la resonancia de plasmón superficial (SPR) que mostraron que:

1. El dominio de endoglina del receptor tipo III de TGF-β se une a los dímeros de TGF-β con una estequiometría de 50 1:1. Esto se demostró comparando la respuesta de la SPR normalizada de masas máxima ya que las concentraciones crecientes del ectodominio del receptor tipo II de TGF-β (TβRII o R) el dominio tipo endoglina del receptor tipo III de TGF-β (TβRIIIE o E) se inyectaron sobre el TGF-β2 K25R I92V K94R inmovilizado, una variante de TGF-β2 que une TβRII con afinidad alta (FIG. 1A y 1B) (De Crescenzo y cols. J Mol Biol. 355, 47-62, 2006; Baardsnes y cols. Biochemistry 48, 2146-55, 2009). La respuesta normalizada de masas máxima para TβRIIIE fue 55 de aproximadamente la mitad de esto para TβRII, permitiendo a los autores de la invención inferir que TβRIIIE debe unirse al dímero de TGF-β con estequiometría de 1:1 dado que es un hecho bien caracterizado a través de los estudios estructurales que TβRII se une a los dímeros de TGF-β con estequiometría 2:1 (FIG. 1C) (Hart y cols., Nat Struct Biol. 9, 203-8, 2002; Groppe y cols., Mol Cell 29, 157-68, 2008; Radaev y cols., Journal of Biological Chemistry 285, 14806-14, 2010). 60

2. TβRIIIE se une a los dímeros de TGF-β sin desplazar ninguno de los dos TβRII unidos. Esto se demostró realizando un experimento con la SPR en el que se inyectaron concentraciones aumentadas de TβRII sobre TGF-β2 K25R I92V K94R inmovilizado en ausencia o presencia de una concentración saturante de TβRIIIE (800 nM) (FIG. 2A y 2B). Los datos mostraron que la respuesta de unión normalizada de masas máxima para TβRII aumentó 5 ligeramente en presencia de TβRIIIE 800 nM (FIG. 2C), mostrando que los dos receptores no compiten el uno con el otro para unir el TGF-β (es imposible para más de dos TβRII unir el dímero de TGF-β y, por lo tanto, el aumento en la amplitud máxima está probablemente causado por un artefacto experimental, como por ejemplo una discrepancia en las concentraciones de TβRIIIE en la muestras de TβRII que se inyectaron y en el tampón).

10

En conjunto, estas observaciones sugieren que los dímeros de TGF-β son capaces de formar un complejo heterotrimérico en el que cada dímero de TGF-β se une a dos moléculas de TβRII y a una molécula de TβRIIIE. Se ha informado de que la estructura de TGF-β se une a TβRII (Hart y cols., Nat Struct Biol. 9, 203-8, 2002; Groppe y cols., Mol Cell 29, 157-68, 2008; Radaev y cols., Journal of Biological Chemistry 285, 14806-14, 2010), pero la estructura de TβRIIIE, sola o unida a TGF-β, no. Esto a llevado a la estructura híbrida a donde la estructura precisa 15 de TβRIIIE no es conocida, pero se conoce su posición global entre los dos TβRII unidos en el extremo distal del dímero de TGF-β (FIG. 3).

Este modelo híbrido para unir TβRII y TβRIIIE llevó a la construcción de la fusión RER (TβRII-TβRIIIE-TβRII) heterotrimérica como un nuevo inhibidor para unir y capturar TGF-β. La inclusión de dominio de unión adicional 20 mejora la afinidad de la fusión de TGF-β, especialmente de TGF-β1 y TGF-β3, que se unen a TβRII con afinidad alta (Kd ∼ 120 nM) (Baardsnes y cols. Biochemistry 48, 2146-55, 2009; Radaev y cols., Journal of Biological Chemistry 285, 14806-14, 2010).

En comparación con el RER descrito actualmente, el anticuerpo monoclonal GC1008 de Genzyme (la versión 25 humanizada del anticuerpo monoclonal 1D11 de ratones) ha demostrado unir las tres isoformas de TGF-β con un Kd de aproximadamente 5 - 10 nM (Grütter, y cols., PNAS U.S.A. 105(51): 20251-56, 2008), pero no ha demostrado ser muy eficaz en los ensayos clínicos del melanoma maligno y del carcinoma de células renales. La razón de la falta de eficacia podría ser que GC1008 no se une fuertemente a los TGF-β para competir con los receptores de TGF-β de la superficie celular, que une los TGF-β a concentraciones de picomolares a sub-picomolares. 30

Los polipéptidos descritos en esta invención incluyen inhibidores de TGF-β heterotriméricos, como por ejemplo RER. Como se describe anteriormente RER ha demostrado unirse a las tres isoformas de TGF-β con baja afinidad nanomolar a afinidad sub-nanomolar. RER es más potente que el anticuerpo monoclonal 1D11. Por lo tanto, debido a su afinidad mejorada para unir TGF-β, RER compite más eficazmente con los receptores de superficie celular para 35 unir TGF-β, y a la vez bloquear sus propiedades de empeoramiento de enfermedades en, por ejemplo, el cáncer y la fibrosis.

Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos RER (por ejemplo véase la SEQ ID NO:2) tiene uno o más de las siguientes características: 40

1. En ciertos aspectos la secuencia de TβRII es humana (SEQ ID NO:6), mientras que la secuencia de TβRIIIE puede ser de rata (SEQ ID NO:7). En ciertos aspectos la secuencia de TβRIIIE puede ser humana (SEQ ID NO:8).

2. En ciertas formas de realización la secuencia de TβRII del extremo N terminal de RER se extiende desde el residuo 42-160 de la SEQ ID NO:6, mientras que la secuencia TβRII del extremo C terminal de RER de extiende 45 desde el residuo 48 - 160 de la SEQ ID NO:6.

3. En ciertas formas de realización la secuencia TβRIIIE se extiende desde el residuo 24 - 383 de la SEQ ID NO:7. En ciertos aspectos, la secuencia TβRIIIEincluye 1, 2, 3, y/o 4 sustituciones simples de aminoácidos relativas a la secuencia de tipo salvaje de ratas (SEQ ID NO:7), R58H, H116R, C278S, y N337A.

4. En ciertas formas de realización no hay conector entre TβRIIIE y el dominio TβRII del extremo C terminal. En otros 50 aspectos el dipéptido Lys-Leu codificado por el sitio de restricción HindIII usado para unir los correspondientes fragmentos de ADN forman juntos un conector. Se contempla que se puede usar cualquier dipéptido.

5. En ciertas formas de realización hay un conector de 18 aminoácidos con la secuencia Gly-Leu-Gly-Pro-Val-Glu-Ser-Ser-Pro-Gly-His-Gly-Leu-Asp-Thr-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO:9) que une el extremo C terminal de TβRII del extremo N terminal al TβRIIIE del extremo N terminal. 55

6. En ciertas formas de realización hay una etiqueta hexa-histidina del extremo C terminal (para propósitos de purificación).

En un ejemplo, se insertó un casete de expresión RER en dirección amino del péptido señal de albúmina y un sitio de clonación Notl con la secuencia: Met-Lys-Trp-Val-Thr-Phe-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Ile-Ser-Gly-Ser-Ala-Phe-Ser-60 Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO:10). Como se describió anteriormente, todo el péptido señal de albuminase se situó dirección amino del promotor CMV en una forma modificada de pcDNA3.1 (Invitrogen) (Zou and Sun, Cell 134, 215-30, 2004).

Se transfectó un plásmido que expresa la construcción RER en células CHO Lec 3.2.8.1 (Rosenwald y cols., Mol 5 Cell Biol. 9(3):914-24, 1989) y se seleccionaron los transfectantes estables usando MSX (Zou and Sun, Cell 134, 215-30, 2004). A su vez, los transfectantes estables se analizaron para la expresión de la fusión RER examinando el medio acondicionado usando un anticuerpo policlonal expuesto a ectodominio betaglicano de ratas. Se creció el clon que expresa RER al máximo nivel y finalmente transfirió a un medio sin suero para la producción de medio acondicionado. Después, se purificó el RER para el medio acondicionado pasándolo a través de una columna 10 NiNTA, lavándolo con Tris de 25 mM, NaCl 100 mM, e imidazol 10 mM, pH 8 y finalmente se eluyó con el mismo tampón, pero con imidazol 300 mM.

A su vez, la proteína de fusión de RER aislada se caracterizó mediante un experimento de SPR en el que, junto con el ER preparado de forma similar (es decir la fusión de TβRIIIE-TβRII descrita previamente (Verona y cols., Protein 15 Eng Des Sel. 21, 463-73, 2008), excepto que se produjo en células CHO, no en bacterias), se inyectó sobre un chip del sensor de la SPR con TGF-β1, -β2, y -β3 inmovilizado. Estos datos mostraron velocidades de asociación comparables, pero velocidades de disociación significativamente menores, especialmente para TGF-β1 y TGF-β3 (FIG. 4). Esto muestra cualitativamente que RER une los TGF-β con mayor afinidad que ER; sin embargo, la magnitud de este aumento resultó ser difícil de cuantificar ya que la lenta asociación impide medir con precisión la 20 respuesta de la SPR del equilibrio, especialmente a bajas concentraciones del receptor inyectado.

Para evaluar más la afinidad, se realizó un experimento de SPR, en el que el anticuerpo monoclonal 1D11 anti TGF-β disponible comercialmente (R&D Systems) se acopló a un chip del sensor de la SPR a alta densidad (20000 RU) y a su vez se inyectó una concentración creciente de R (TβRII), ER (BGE-RII), o RER (RII-BGE-RII) en presencia de 25 una concentración fija baja (0,8 nM) de TGF-β3. La pendiente inicial de estos sensogramas (que es una función lineal de la concentración de TGF-β3 libre) se representa gráficamente en función de la concentración de la fusión del receptor (FIG. 5). Esto mostró que RER es realmente un competidor más potente que ER, de acuerdo con la menor tasa de disociación para RER en comparación con ER.

30

Los polipéptidos de RER demuestran una actividad más potente respecto a las proteínas de fusión similares. Por ejemplo la CI50 media [nM] usando células con Mv1Lu PAI1 luciferasa como indicador placas de 96 pocillos es muy inferior a los polipéptidos de RER (FIG. 6). Las curvas de neutralización que comparan varias fusiones de receptores (RR (RII-RII, también conocidos como T22d35), RER (RII-BGE-RII), ER (BGE-RII), REU (RII-BGE-BGU o alternativamente RII-RIII), o EU (BGE-BGUor alternativamente RIII) y 1D11 para (A) TGF-β1, (B) TGF-β2, o TGF-β3 35 también muestran una mayor actividad de los polipéptidos de RER (FIG. 7 y FIG. 8).

I. Conectores

En algunas formas de realización, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende tres dominios de 40 unión de TGF-β unidos entre ellos directamente o mediante un conector, como p. ej. un péptido conector corto. En algunas formas de realización, el extremo C terminal del segmento de unión a TGF-β amino terminal está unido a través de un péptido conector al extremo N terminal del segmento de unión a TGF-β central, y el extremo C terminal del segmento de unión a TGFβ central puede unirse al extremo N terminal del segmento de unión a TGF-β del extremo carboxilo mediante un segundo conector. Un conector se considera corto si contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 45 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 hasta 50 o menos aminoácidos.

Más típicamente el conector es un péptido conector que contiene 50 o menos aminoácidos, p. ej., 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 3, 4, 2, o 1 aminoácido(s). En ciertos aspectos, la secuencia del péptido conector es una secuencia aminoacídica de un receptor diferente a los TGF-β tipo II o tipo III. En otros aspectos, la secuencia del 50 péptido conector es una secuencia de aminoácidos del receptor tipo II o tipo III de TGF-β adicional, p. ej. los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, hasta 50 o menos aminoácidos flanquean los extremos terminales amino de los dominios de unión. El término adicional en este contexto se refiere a los aminoácidos además de aquellos que definen los segmentos del polipéptido heterotrimérico como se define anteriormente. En varias formas de realización, el conector no contiene más de 50, 40, 20, 10, o 5 aminoácidos contiguos de las 55 secuencias del receptor nativo. Típicamente, el conector será flexible y permitirá el correcto plegamiento de los dominios unidos. Normalmente se prefieren los aminoácidos que no tienen cadenas laterales voluminosas y grupos cargados (p. ej. glicina, serina, alanina y treonina). Opcionalmente, el conector puede contener adicionalmente uno o más aminoácidos adaptadores, como por ejemplo, aquellos producidos como resultado de la inserción de sitios de restricción. Generalmente, no habrá más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 aminoácidos adaptadores en un conector. 60

En algunas formas de realización, el conector comprende una o más glicinas, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, o más glicinas. Por ejemplo, el conector puede consistir en (GGG)n, donde n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc. y aminoácidos adaptadores opcionales. En ciertos aspectos, el conector es un conector de glicina-serina que comprende (GGGS)n, donde n = 1, 2, 3, 4, 5, etc. En vista de los resultados desvelados en esta invención, los 5 expertos en la materia reconocerán que para las proteínas de fusión de la invención se puede usar cualquier otro péptido conector adecuado, por ejemplo, los descritos en Alfthan y cols., Protein Eng. 8:725-31, 1995; Argos, J. MoI. Biol. 211:943-58, 1990; Crasto y cols., Protein Eng., 13:309-12, 2000; Robinson y cols., PNAS USA, 95:5929-34, 1998.

10

II. Ácidos nucleicos, vectores y célula huésped

La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas de fusión de la invención, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y célula huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos. Por ejemplo, en una forma de realización ilustrativa, el ácido nucleico de la invención comprende la 15 secuencia como se expone en SEQ ID NO:1.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector, p. ej. un vector de expresión, usando técnicas estándar. Después, el vector de expresión puede introducirse en las células huésped usando una variedad de técnicas estándar como por ejemplo la transfección liposómica, la precipitación con fosfato de calcio, o 20 electroporación. De acuerdo con la presente invención, las células huésped pueden ser células de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster chino, célula de riñón embrionario humano (p.ej., HEK 293), células HeLa S3, células derivadas de embriones murinos, o células NSO. Sin embargo, también se pueden usar células no derivadas de mamíferos, incluyendo, p.ej. bacterias, levaduras, insectos, y células vegetales. Las célula huésped adecuadas también pueden residir in vivo, en cuyo caso se pueden usar los ácidos nucleicos en el contexto de terapia génica in 25 vivo o ex vivo.

III. Procedimientos de realización

La invención proporciona ademas procedimientos para producir (a) proteínas de fusión, (b) ácidos nucleicos que 30 codifican las mismas, y (c) célula huésped y composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión o los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un procedimiento para producir la proteína de fusión de acuerdo a la invención comprende cultivar una célula huésped, que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención bajo condiciones que resultan en la expresión de la proteína de fusión y la subsiguiente recuperación de la proteína de fusión. En otro aspecto, la proteína de fusión se expresa en células CHO o HEK 293 y se purifica a partir 35 del medio usando procedimientos conocidos en la técnica. En algunas formas de realización, la proteína de fusión se eluye a partir de una columna con un pH neutro o superior, p. ej., pH 7,5 o superior, pH 8,0 o superior, pH 8,5 o superior, o pH 9,0 o superior.

Las proteínas de fusión, incluyendo las variantes, así como ácidos nucleicos que codifican las mismas, pueden 40 fabricarse usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo técnicas de biología molecular estándares y procedimientos sintéticos, por ejemplo, los descritos en las siguientes referencias: Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, y Bodansky y cols. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany). Las composiciones farmacéuticas además pueden fabricarse usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo por ejemplo, los 45 descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado y cols., 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005).

IV. Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

50

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención o los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión.

La proteína de fusión podrá entregarse a una célula u organismo por medio de terapia génica, donde una secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se inserta en un vector de expresión que se administra in vivo o 55 a células ex vivo, que después se administran in vivo, y la proteína de fusión se expresa posteriormente. Los procedimientos de terapia génica para entregar antagonistas de TGF-β son conocidos (véase, p. ej., Fakhrai y cols., PNAS USA, 93:2909-14, 1996 y la patente de EE. UU. 5,824,655).

La proteína de fusión puede administrarse a una célula u organismo en una composición farmacéutica que 60 comprende la proteína de fusión como un principio activo. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular dependiendo del tratamiento a efectuar y de la ruta de administración. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por instilación intranasal, instilación intravesical o intracavitaria, intraocular, intraarterial, intralesional, o por aplicación de las membranas mucosas, como por ejemplo, las de la nariz, garganta, 5 y bronquios. La composición farmacéutica comprenderá típicamente componentes biológicamente inactivos, como por ejemplo diluyentes, excipientes, sales, tampones, conservantes, etc. las técnicas de formulación farmacéutica estándares y los excipientes son bien conocidos por los experto en la materia (véase, p.ej., Physicians' Desk Reference (PDR) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004; y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado y cols. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005). 10

Generalmente, la proteína de fusión de la invención puede administrarse como una dosis de aproximadamente de 1 µg/kg hasta 25 mg/kg, dependiendo de la gravedad de los síntomas y de la progresión de la enfermedad. Un médico tratante selecciona la dosis terapéuticamente eficaz de un antagonista y puede oscilar aproximadamente desde 1 µg/kg hasta 20 mg/kg, desde 1 µg/kg hasta 10 mg/kg, desde 1 µg/kg hasta 1 mg/kg, desde 10 µg/kg hasta 1 mg/kg, 15 desde 10 µg/kg hasta 100 µg/kg, desde 100 µg hasta 1 mg/kg, y desde 500 µg/kg hasta 5 mg/kg. Las dosis obtenidas en un animal pueden adaptarse para usarse en otro animal, incluyendo humanos, usando factores de conversión conocidos en la técnica (véase, p. ej., Freireich y cols., Cancer Chemother. Reports, 50(4):219-244 (1996)).

20

V. Usos Terapéuticos y no terapéuticos

Las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para capturar o neutralizar TGF-β, por lo tanto reducir o impedir la unión de TGF-β que se produce de forma espontánea en los receptores de TGF-β.

25

La invención incluye un procedimiento para tratar a un sujeto (p. ej. mamífero) administrando al mamífero una proteína de fusión descrita en esta invención o un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o células que contienen un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. El mamífero puede ser, por ejemplo, primate (p. ej. humano), roedor (p. ej. ratón, cobaya, rata), u otros (como p. ej.pero, cerdo, conejo).

30

El mamífero que recibe tratamiento puede tener o puede estar en riesgo de tener una o más afecciones asociadas con un exceso de TGF-β para la que se recomienda una reducción en los niveles de TGF-β. Dichas afecciones incluyen, pero no se limitan a, enfermedades fibróticas (como por ejemplo glomerulonefritis, fibrosis neuronal, fibrosis dérmica, fibrosis pulmonar (p. ej. fibrosis pulmonar idiopática), fibrosis de pulmón, fibrosis inducida por radiación, fibrosis hepática, mielofibrosis), adherencias pleurales, enfermedades hiperproliferativas (p.ej. cáncer), quemaduras, 35 enfermedades inmunológicas, enfermedades inflamatorias (incluyendo artritis reumatoide), rechazo al trasplante, contractura de Dupuytren, y úlceras gástricas.

En ciertas formas de realización, las proteínas de fusión, los ácidos nucleicos, y las células de la invención se usan para tratar enfermedades y afecciones asociadas con la deposición de la matriz extracelular (ECM). Dichas 40 enfermedades y afecciones incluyen, pero no se limitan a, esclerosis sistémica, adherencias postoperatorias, cicatrización hipertrófica o queloide, vitreorretinopatía proliferativa, cirugía de drenaje del glaucoma, lesión corneal, cataratas, enfermedad de Peyronie, síndrome de dificultad respiratoria en adultos, cirrosis biliar, cicatrización posterior al infarto de miocardio, restenosis (p. ej. restenosis posterior a la angioplastia), cicatrización después de hemorragia subaracnoidea, esclerosis múltiple, fibrosis después de laminectomía, fibrosis después de reparaciones 45 de tendón y otras, cicatrización debido a eliminación de tatuaje, cirrosis biliar (incluyendo colangitis esclerosante), pericarditis, pleuresía, traqueostomía, lesión penetrante del CNS, síndrome miálgico eosinofilico, restenosis vascular, enfermedad veno-oclusiva, pancreatitis y artropatía psoriásica. En particular, las proteínas de fusión, y los aspectos relacionados de la invención son particularmente útiles para el tratamiento de fibrosis peritoneal y adherencias. Es bien conocido que los anticuerpos se transfieren fácilmente desde la cavidad peritoneal a la circulación. Por lo tanto, 50 la administración intraperitoneal de la proteína de fusión puede proporcionar una forma altamente localizada de tratamiento de los trastornos peritoneales como la fibrosis peritoneal y las adherencias debido a la concentración ventajosa de la proteína de fusión dentro del peritoneo afectado.

Las proteínas de fusión, los ácidos nucleicos, y las células de la invención son además útiles para tratar afecciones 55 donde el favorecimiento de la reepitelización es beneficiosa. Dichas afecciones incluyen, pero no se limitan a: enfermedades de la piel, como úlceras venosas, úlceras isquémicas (llagas por presión), úlceras diabéticas, zonas de injertos, zonas de injertos en donantes, abrasiones y quemaduras; enfermedades del epitelio bronquial, como por ejemplo asma y ARDS, enfermedades del epitelio intestinal, como por ejemplo mucositis asociada con el tratamiento citotóxico, úlceras estomacales, y lesiones del intestino delgado y grueso (enfermedad inflamatoria intestinal). 60

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de fusión heterotrimérica que comprende:

   (a) un segmento amino terminal que comprende un primer dominio de unión a TGFβ de un receptor de TGFβ tipo II, 5

   (b) un segmento central que comprende un dominio de endoglina del receptor de TGFβ tipo III, y

   (c) un segmento carboxilo terminal que comprende un segundo dominio de unión a TGFβ del receptor de TGFβ tipo II.
2. 2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, comprende además uno o más aminoácidos del conector 10 entre el segmento amino terminal y el segmento central, y/o uno o más aminoácidos del conector entre el segmento central y el segmento carboxilo terminal.
3. 3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el segmento amino terminal comprende una secuencia de aminoácidos que es el 90 % idéntica a la SEQ ID NO:3. 15
4. 4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el segmento central comprende una secuencia de aminoácidos que es el 90 % idéntica a la SEQ ID NO:4 o a los aminoácidos 21-406 de la SEQ ID NO:8.
5. 5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el segmento carboxilo terminal comprende una 20 secuencia de aminoácidos que es el 90 % idéntica a la SEQ ID NO:5.
6. 6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos que es el 90 % idéntica a la SEQ ID NO:2.

   25
7. 7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.
8. 8. La proteína de fusión de la reivindicación 1 comprende además una secuencia señal en el extremo amino terminal. 30
9. 9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, comprende además una etiqueta en el extremo amino terminal o carboxilo terminal.
10. 10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, donde la etiqueta es una hexa-histidina en el extremo 35 carboxilo terminal.
11. 11. Una proteína de fusión de la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de una afección relacionada con el aumento de la expresión de TGFβ que comprende la administración de una cantidad eficaz de la proteína de fusión a un sujeto que la necesite. 40
12. 12. La proteína de fusión para el uso de la reivindicación 11, donde la afección es un trastorno hiperproliferativo.
13. 13. La proteína de fusión para el uso de la reivindicación 12, donde el trastorno hiperproliferativo es 45 cáncer.
14. 14. La proteína de fusión para el uso de la reivindicación 11, donde la afección es fibrosis.