ES2773766T3 - Inhibidores de TFPI y métodos de uso - Google Patents

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Ulf Reimer
Ulrich Reineke
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Abstract

Un péptido que se une e inhibe la actividad del Inhibidor de la Vía del Factor Tisular-1α (TFPI-1α), que comprende la siguiente estructura de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en donde X1001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhf, C, F, H, I, K, L, M, N, Nmf, Q, R, T, V, W e Y; en donde X1002 es Q; en donde X1003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhs, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhk, C, E, F, G, H, I, K, k, M, N, Nmk, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, Aib, Bal, C, D, d, E, F, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Btq, C, D, E, G, H, I, K, M, N, Q, R, ST, V, W e Y; en donde X1007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, I, L, Nmv, P, Q, S, V, W e Y; en donde X1008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H, W e Y; en donde X1009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, f, I, S y V; en donde X1010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, C, K, G y Nmg; en donde X1012 es Y; en donde X1013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, E, F, H, L, M, Q, R, W e Y; en donde X1014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhe, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1015 es R; en donde X1016 es L; en donde X1017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, Dab, Dap, E, Eag, Eew, G, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Bal, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X1019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhk, K y R; y en donde X1020 está presente o ausente, por lo que en caso de que X1020 esté presente es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, Bhl, C, F, H, I, K, L, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y; y en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 70% de identidad con: Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 178).

Description

DESCRIPCI N
Inhibidores de TFPI y métodos de uso
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere de manera general a péptidos que se unen al Inhibidor de la Vía del Factor Tisular (TFPI) y a usos de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La hemostasia se basa en la cascada de coagulación compleja, en la que una serie de eventos mediados por factores de coagulación sanguínea llevan a la conversión de protrombina en trombina. La activación del Factor X (FX) es el evento central de las vías tanto intrínseca como extrínseca de la cascada de coagulación. La vía extrínseca se ha propuesto como el activador primario de la cascada de coagulación (Mackman et al., Arterioscler. Thromb. Casc. Biol., 27, 1687-1693 (2007)). El factor tisular circulante (TF) y el factor VII activado (FVIIa) interactúan para formar el "complejo extrínseco", que media la activación de FX. La cascada de coagulación se amplifica por la vía intrínseca, durante la cual la activación sucesiva de los factores XII, XI, IX y VIII da como resultado la formación del complejo FIXa-FVIIIa "intrínseco" que también media la activación de FX. El FX activado promueve la formación de trombina, que se requiere para que el cuerpo cree fibrina y frene eficazmente el sangrado.
Los trastornos hemorrágicos graves, como la hemofilia, son el resultado de la alteración de la cascada de coagulación sanguínea. La hemofilia A, el tipo más común de hemofilia, proviene de una deficiencia en el factor VIII, mientras que la hemofilia B está asociada con deficiencias en el factor IX (FIX). La hemofilia C está provocada por una deficiencia en el Factor XI (FXI) (Cawthern et al., Blood, 91(12), 4581-4592 (1998)). Actualmente no hay una cura para la hemofilia y otras enfermedades de coagulación. La terapia de reemplazo de factores es el tratamiento más común para los trastornos de la coagulación sanguínea. Sin embargo, los factores de coagulación sanguínea típicamente se eliminan del torrente sanguíneo poco después de la administración. Para ser eficaces, un paciente debe recibir infusiones intravenosas frecuentes de concentrados de factor recombinante o derivados del plasma, lo cual es incómodo, requiere entornos clínicos, es costoso y lleva mucho tiempo. Además, la eficacia terapéutica de la terapia de reemplazo de factores puede disminuir drásticamente tras la formación de anticuerpos inhibidores. Aproximadamente el 30% de los pacientes con hemofilia A grave desarrollan anticuerpos inhibidores que neutralizan el Factor VIII (FVIII) (Peerlinck y Hermans, Haemophilia, 12, 579-590 (2006)). Existen pocas opciones terapéuticas para pacientes con anticuerpos anti-Factores.
Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de composiciones y métodos para tratar trastornos de la coagulación sanguínea. La invención proporciona tales composiciones y métodos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un péptido que se une e inhibe la actividad del inhibidor de la vía del factor tisular-1a (TFPI-1a), que comprende la siguiente estructura de fórmula (I):
X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020 (I) (SEQ ID NO: 3116):
en donde X1001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhf, C, F, H, I, K, L, M, N, Nmf, Q, R, T, V, W e Y;
en donde X1002 es Q;
en donde X1003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhs, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhk, C, E, F, G, H, I, K, k, M, N, Nmk, P, Q, R, S, T, V,WeY;
en donde X1005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, Aib, Bal, C, D, d, E, F, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Btq, C, D, E, G, H, I, K, M, N, Q, R, ST, V, W e Y;
en donde X1007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, I, L, Nmv, P, Q, S, V, W e Y; en donde X1008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H, W e Y;
en donde X1009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, f, I, S y V;
en donde X1010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, C, K, G y Nmg;
en donde X1012 es Y;
en donde X1013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, E, F, H, L, M, Q, R, W e Y;
en donde X1014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhe, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1015 es R;
en donde X1016 es L;
en donde X1017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, Dab, Dap, E, Eag, Eew, G, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Bal, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
en donde X1019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhk, K y R; y
en donde X1020 está presente o ausente, por lo que en caso de que X1020 esté presente es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, Bhl, C, F, H, I, K, L, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y; y
en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 70% de identidad con: Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 178).
La presente invención también proporciona un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SeQ ID NO: 8-82, 84-127, 129-178, 183-188, 190-195, 197-200, 202­ 242, 244-252, 256-270, 273-275, 277, 279-289, 291-292, 294-295, 297-302, 305-312, 314-340, 342-394, 396-404, 407-409, 412, 414, 415, 417-422, 424-425, 428, 431-432, 434, 440-442, 445-450, 452, 455-458, 471, 472, 474­ 475,480, 482, 484, 488, 490, 491,494-496, 498, 500-502, 505-507, 509, 511-513, 517-519, 523-524, 527, 530, 532, 533, 536, 538-540, 545, 548-550, 553-559, 563-565, 568-572, 576-577, 579-581, 584-603, 605-616, 618-624, 626­ 627, 630, 632, 633, 635-643, 645-648, 650-656, 658, 660, 662-671, 690, 692, 693, 698, 701-709, 720, 724, 725, 731, 736-740, 747, 765, 795, 811, 817, 938 y 953.
La presente invención también proporciona un péptido de la invención como se ha definido anteriormente, para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención como se ha definido anteriormente, y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un péptido de la invención como se ha definido anteriormente para su uso en el diagnóstico in vivo de un sujeto que padece una enfermedad o está en riesgo de padecer una enfermedad, en donde el péptido se conjuga con una fracción detectable y se administra al sujeto, y la detección de la fracción detectable indica que el sujeto padece una enfermedad o corre el riesgo de padecer una enfermedad.
La presente invención también proporciona un método para purificar TFPI, en donde el método comprende:
a) poner en contacto una muestra que contiene TFPI con un péptido de la invención como se ha definido anteriormente bajo condiciones apropiadas para formar un complejo entre TFPI y el péptido;
b) eliminar el complejo de la muestra; y, opcionalmente,
c) disociar el complejo para liberar TFPI
La divulgación proporciona péptidos que se unen al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), incluyendo los péptidos antagonistas de TFPI que tienen la capacidad de modular la cascada de coagulación sanguínea. Por ejemplo, la divulgación proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21 (SEQ ID NO: 3109), en donde
X7 se selecciona del grupo que consiste de L, P, K, S, W, V, N y Q;
X8 se selecciona del grupo que consiste de L, R, N, F e I;
X9 se selecciona del grupo que consiste de Y, V, P y C;
X10 se selecciona de grupo que consiste de F, L y G;
X11 se selecciona de grupo que consiste de L, W, V, A, M, T y S;
X12 se selecciona de grupo que consiste de T, F, V, R, A, D, L, E, S e Y;
X13 se selecciona de grupo que consiste de I, M, G, Q, D y R;
X14 se selecciona de grupo que consiste de G, W, Y, L, M y H;
X15 se selecciona de grupo que consiste de N, P, F, H, K e Y;
X16 se selecciona de grupo que consiste de M, D, E, V, G y K;
X17 se selecciona de grupo que consiste de G, I, R, S, T y L;
X18 se selecciona de grupo que consiste de M, K, L e I;
X19 se selecciona de grupo que consiste de Y, G, R y S;
X20 se selecciona de grupo que consiste de A, E, S, C e Y; y
X21 se selecciona de grupo que consiste de A, V, K y E.
En un aspecto, el péptido de la divulgación comprende uno o más aminoácidos N-terminales directamente
enlazados a X7, en donde los aminoácidos N-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste de
Xa ,
X5 X6 ,
X4X5X6 ,
X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3110),
X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3111) y
X1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3112), en donde
X1 se selecciona del grupo que consiste de T y G; X2 se selecciona del grupo que consiste de F y V; X3 se
selecciona del grupo que consiste de V, W, Y y F; X4 se selecciona del grupo que consiste de D, Q y S; X5 se
selecciona del grupo que consiste de E, T, N y S; y X6 se selecciona del grupo que consiste de R, H, K y A.
Alternativa o adicionalmente, el péptido de la divulgación comprende uno o más aminoácidos C-terminales
directamente enlazados a X21, en donde los aminoácidos C-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste de
X22,
X22X23,
X22X23X24,
X22X23X24X25 (SEQ ID NO: 3113),
X22X23X24X25X26 (SEQ ID NO: 3114) y
X22X23X24X25X26X27 (SEQ ID NO: 3115), en donde
X22 se selecciona del grupo que consiste de Q, I, E, W, R, L y N; X23 se selecciona del grupo que consiste de L, V, M
y R; X24 se selecciona del grupo que consiste de K, L, A e Y; X25 es F; X26 es G; y X27 es T.
En un aspecto, la divulgación proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos
expuesta en las SEQ ID NO: 1-7, como un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en
cualquiera de JBT0132, JBT0303, JBT0193, JBT0178, JBT0120, y JBT0224, que inhibe la actividad de TFPI dentro
de la cascada de coagulación sanguínea. La divulgación también proporciona un péptido que se une a TFPI que
comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 60% de identidad con la secuencia con Phe-Gln-Ser-Lys-Gly-Asn-Val-Phe-Val-Asp-Gly-Tyr-Phe-Glu-Arg-Leu-Arg-Ala-Lys-Leu (FQSKGNVFVDGYFERLRAKL) (SEQ
ID NO: 32).
En un aspecto, el péptido que se une e inhibe la actividad de TFPI comprende la estructura de fórmula (III):
X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-GYC/F- X1014-RL-X1017-X1018-KK/L (III) (SEQ ID NO:
3117). En la fórmula (III), X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1008, X1010, X1014, X1017 y X1018 son como se
han definido anteriormente de acuerdo con la invención.
La divulgación proporciona además un péptido de unión a TFPI que comprende la estructura de fórmula
(V): X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011 -X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023 (V) (SEQ ID NO: 3118). En la fórmula (V), X2001, X2002
y X2023 están independientemente presentes o ausentes. Cuando está presente, X2001 es un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W; y X2002 es un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V y W. Adicionalmente,
X2003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;
X2004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W;
X2005 es W;
X2006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H, I, K, L, RV y W;
X2007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, Hcy, Dap y K, preferiblemente
seleccionado del grupo que consiste de C y Hcy;
X2008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, R, S y T;
X2009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, I, K, L, M, m, Nle, p, R y V;
X2010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, P, R, S, T y V;
X2011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, E, G, S y T;
X2012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, 1, M, m,
Nle, nle, P, p, R, r, S, s, T, t, V, v, W y w;
, T, V y R, S, T, S, T, V,
Figure imgf000004_0001
, V, W e X2021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, L y V; y
X2022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W.
Cuando X2023 está presente en el péptido, X2023 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D,
E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y. El péptido comprende una estructura cíclica generada por un enlace entre X2007 y X2018, indicado en Fórmula (V) entre paréntesis.
La divulgación también proporciona un péptido que se une a TFPI, en donde el péptido comprende la estructura de fórmula (VI): X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023 (VI) (SEQ ID NO: 3119). En la fórmula (VI), X2001, X2002 y X2023 están cada uno independientemente presentes o ausentes. X2008, X2010, X2012, X2013, X2016 y X2022, así como X2001, X2002 y X2023 cuando están presentes, se seleccionan cada uno independientemente de cualquier aminoácido. El péptido comprende una estructura cíclica generada por un enlace entre X2007 y X2018, indicado entre paréntesis en la Fórmula (VI).
En un aspecto, la divulgación proporciona un péptido que se une a TFPI, en donde el péptido comprende la estructura de fórmula (VIII X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021 (VIII) (SEQ ID NO: 3120). En la fórmula (VIII), X3001 y X3002 están cada uno independientemente presentes o ausentes. Cuando está presente, X3001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y; y X3002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, H, K, M, N, P, R, S, T, W, Y, G, I y L. Con respecto al resto de fórmula (VIII),
X3003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S,
T, W e Y;
X3004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T,
V, W, Y y P;
X3005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W
e Y;
X3006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, W, C, K, P, R y H;
X3007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q, A, C, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, W e Y;
X3008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,
W, Y e I;
X3009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, R, S, T, V, W, Y y K;
X3010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,
W e Y;
X3011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, C, F y H;
X3012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L y R;
X3013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, R, S, V, W, Y e I;
X3014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y yK;
X3015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K y R;
X3016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, K y R;
X3017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, I, K, L, N,
Figure imgf000005_0001
Q, R, S, T, V, W, Y, A y M;
X3018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, I, K, L, M, Q, R, V, W e Y; X3019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, K, L,
Figure imgf000005_0002
N, P, Q, R, V, W, Y e I;
X3020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, I y
P; y
X3021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, F yG.
Adicionalmente, la divulgación proporciona un péptido de unión a TFPI que comprende la estructura de fórmula (IX): X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021 (IX) (SEQ ID NO: 3121), en donde X3001, X3002, X3003, X3004, X3005, X3006, X3007, X3008, X3009, X3010, X3011, X3013, X3014, X3017, X3018, X3019, X3020 y X3021 se seleccionan cada uno independientemente de cualquier aminoácido. Además, la divulgación incluye un péptido que se une a
TFPI, en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 60% de identidad con la secuencia de fórmula (X): Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2 (SEQ ID NO: 2023).
El péptido de la invención se une e inhibe la actividad de TFPI-1a y, opcionalmente, mejora la generación de trombina regulada por TFPI en ausencia de FVIII, FIX y/o FXI. También se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el péptido.
Además, la invención proporciona métodos para usar el péptido de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método in vitro de inhibición de un TFPI que comprende poner en contacto el TFPI con un péptido como se describe en la presente. La invención también proporciona un péptido de la invención, para su uso en un método para mejorar la formación de trombina en un sujeto deficiente en factor de coagulación, un método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos en un sujeto, y un método para tratar un trastorno de coagulación de la sangre en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto un péptido como se proporciona en la presente en una cantidad eficaz para mejorar la formación de trombina, una cantidad eficaz para mejorar la formación de coágulos sanguíneos, o una cantidad eficaz para tratar el trastorno de coagulación sanguíneo en el sujeto. A menos que se indique explícitamente lo contrario, la descripción proporcionada en la presente con respecto a un péptido de la invención o método de la invención se aplica a cada péptido de la invención y método de la invención, respectivamente. Aspectos adicionales de la invención incluyen el uso del péptido de la invención para la fabricación de un medicamento; un péptido de la invención, para su uso en un método de terapia o diagnóstico in vivo de una enfermedad, el método comprendiendo dirigir una célula que muestra TFPI; un péptido de la invención para su uso en un método para tratar o diagnosticar in vivo a un sujeto que padece una enfermedad o está en riesgo de padecer una enfermedad, y un método para purificar TFPI.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una ilustración de la cascada de coagulación sanguínea.
La Figura 2 es una ilustración de la estructura secundaria del Inhibidor de la Vía del Factor Tisular-1.
La Figura 3 es una ilustración de la formación de un complejo cuaternario que comprende factor tisular, factor Xa (FXa), factor VIIa (FVIIa) y TFPI.
La Figura 4 es una lista de secuencias de aminoácidos de varios péptidos inhibidores de TFPI que denotan sustituciones de aminoácidos (en negrita y subrayadas) en referencia al péptido JBT0293.
La Figura 5 es una ilustración de la selección de muestra de ARNm de péptidos inhibidores de TFPI.
La Figura 6Aes una ilustración del EC50 del ELISA de unión y la Figura 6B es una ilustración del IC50 del ELISA descrito en el Ejemplo 1.
La Figura 7 es una curva ELISA de unión que compara el % de OD (eje y) y la concentración [nM] (eje x) para el péptido biotinilado JBT0132.
Las Figuras 8A-8D son curvas ELISA de competición que comparan el % de OD (eje y) y la concentración [nM] (eje x) para péptidos ejemplares de la invención.
Las Figuras 9A y 9B son sensorgramas que trazan RU (eje y) frente al tiempo en segundos (eje x) para los péptidos JBT0120 y JBT0132.
Las Figuras 10A y 10B son sensorgramas que trazan RU (eje y) frente al tiempo en segundos (eje x) para la interacción del péptido JBT0120 con el inhibidor de la vía del factor tisular-1 y el inhibidor de la vía del factor tisular-2.
Las Figuras 11A y 11B son gráficos que comparan la cantidad de trombina generada (nM) (eje y) y el tiempo en minutos (eje x) para el péptido JBT0120 y el péptido JBT0132 en un ensayo basado en plasma.
Las Figuras 12-18 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos de varios péptidos inhibidores de TFPI; EC50 y porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de FXa; EC50 y porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca; y FEIBA, Factor VIII (FVIII) Immunate o actividades equivalentes del Factor IX (FIX) (mU/ml) en ensayos basados en plasma. "*" denota controles negativos.
Las Figuras 19-21son tablas que enumeran los resultados del análisis BIAcore de varios péptidos de unión a TFPI. "*" denota controles negativos.
Las Figuras 22-30 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de unión a TFPI; EC50 y porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de FXa; EC50 y porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca; y actividades equivalentes de FEIBA, FVIII Immunate o FIX (mU/ml) en ensayos basados en plasma. "*" denota controles negativos.
La Figura 31es un gráfico que compara una característica farmacocinética (concentración de péptido (eje y) frente al tiempo después de la administración (eje x)) de un péptido de unión a TFPI PEGilado con la característica farmacocinética del mismo péptido que carece de PEG. Los péptidos se administraron por vía intravenosa a ratones C57B16 a una dosis de 10 mg/kg. Se analizaron tres muestras biológicas para determinar la presencia de péptido en cada punto temporal.
Las Figuras 32-39 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos y los valores de IC50 o EC50 de varios péptidos de la invención. "*" denota controles negativos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona péptidos que bloquean la actividad inhibidora del inhibidor de la vía del factor tisular-1 (referido en la presente TFPI) dentro de la cascada de coagulación sanguínea. Tras una lesión vascular, el Factor de tejido (TF) forma complejos con el Factor V11a para formar el "complejo extrínseco" o el "complejo de tenasa extrínseca", que activa los factores IX y X (Figura 1). El TFPI es el principal regulador natural de la actividad del complejo extrínseco TF/FVIIa y, por extensión, desempeña un papel en el control de la generación de trombina (Panteleev et al., Eur. J. Biochem., 249, 2016-2031 (2002)). El TFPI es un inhibidor de la serina proteasa de 43 kDa que comprende tres dominios inhibidores de tipo Kunitz (Figura 2). El dominio 1 de Kunitz de TFPI se une a FVIIa y el dominio 2 de Kunitz se une a FXa, permitiendo que el inhibidor forme un complejo cuaternario FXa-TFPI-FVIIa-TF que bloquea la actividad del complejo extrínseco TF/FVIIa (Figura 3) La unión de TFPI de FXa también regula por disminución la vía común de la cascada de coagulación, durante la cual FXa convierte la protrombina en trombina (Audu et al., Anesth. Analg., 103(4), 841-845 (2006)). La invención proporciona péptidos inhibidores de TFPI que bloquean la acción inhibitoria de TFPI sobre la cascada de coagulación sanguínea, mejorando de este modo la formación de trombina.
En la presente se proporcionan las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de unión a TFPI. Los aminoácidos convencionales se identifican de acuerdo con sus códigos estándar de una o tres letras, como se expone en la Tabla 1.
TABLA 1
Código de 3 Código de 1 Aminoácidos Código de 3 Código de 1 Aminoácidos letras letra letras letra
Ala A Alanina Met M Metionina
Cys C Cisteína Asn N Asparagina Asp D Ácido aspártico Pro P Prolina Glu E Ácido glutámico Gln Q Glutamina Phe F Fenilalanina Arg R Arginina Gly G Glicina Ser S Serina His H Histidina Thr T Treonina Ile I Isoleucina Val V Valina Lys K Lisina Trp W Triptófano
Leu L Leucina Tyr Y Tirosina
Los aminoácidos no convencionales y los bloques de construcción de péptidos adicionales se identifican de acuerdo con un código de tres letras (con la excepción de Ttds, que es una abreviatura de cuatro letras común) que encontrado en la Tabla 2.
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Las secuencias de aminoácidos de los péptidos proporcionados en la presente se representan en un formato de secuencia de péptidos típico, como entenderían los expertos en la técnica. Por ejemplo, el código de tres letras o el código de una letra de un aminoácido convencional, o el código de tres letras o la abreviatura para un aminoácido no convencional, indica la presencia del aminoácido en una posición especificada dentro de la secuencia de péptidos. El código para cada aminoácido no convencional está conectado al código para el aminoácido siguiente y/o anterior en la secuencia mediante un guion. Los aminoácidos adyacentes están conectados por un enlace químico (típicamente un enlace amida). La formación del enlace químico elimina un grupo hidroxilo del grupo 1-carboxilo del aminoácido cuando está localizado a la izquierda del aminoácido adyacente (por ejemplo, el aminoácido adyacente Hle), y elimina un hidrógeno del grupo amino del aminoácido cuando está localizado a la derecha del aminoácido adyacente (por ejemplo, el aminoácido adyacente Hle). Se entiende que ambas modificaciones pueden aplicarse al mismo aminoácido y a aminoácidos convencionales adyacentes presentes en secuencias de aminoácidos sin guiones ilustrados explícitamente. Cuando un aminoácido contiene más de un grupo amino y/o carboxi en la cadena lateral de aminoácidos, el grupo 2- o 3-amino y/o el grupo 1-carboxi generalmente se usan para la formación de enlaces peptídicos. Para los aminoácidos no convencionales, se usó un código de 3 letras donde la primera letra indica la estereoquímica del átomo C-a. Por ejemplo, una primera letra mayúscula indica que la forma L del aminoácido está presente en la secuencia peptídica, mientras que una primera letra minúscula indica que la forma D del aminoácido correspondiente está presente en la secuencia peptídica. Cuando se usa el código de una letra, una letra minúscula representa un D-aminoácido, mientras que una letra mayúscula representa un L-aminoácido. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se presentan en la presente en la dirección del extremo de N- a C-terminal.
Los extremos terminales C de varias secuencias peptídicas de unión a TFPI descritas en la presente se ilustran explícitamente mediante la inclusión de un OH, NH2, o una abreviatura para una amina de terminación específica enlazada con el código de aminoácidos C-terminal a través de un guion. Los extremos N terminales de varios péptidos descritos en la presente se ilustran explícitamente mediante la inclusión de un hidrógeno (para un extremo N-terminal libre), o una abreviatura para un ácido carboxílico de terminación específico u otro grupo químico enlazado con el código de aminoácidos N-terminal a través de un guion.
La divulgación proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21 (SEQ ID NO: 3109), en donde (usando códigos de una letra para aminoácidos)
X7 se selecciona del grupo que consiste de L, P,
X8 se selecciona del grupo que consiste de L, R,
X9 se selecciona del grupo que consiste de Y, V,
X10 se selecciona del grupo que consiste
X11 se selecciona del grupo que consiste S;
X12 se selecciona del grupo que consiste E, S e Y;
X13 se selecciona del grupo que consiste
X14 se selecciona del grupo que consiste
X15 se selecciona del grupo que consiste
X16 se selecciona del grupo que consiste
X17 se selecciona del grupo que consiste L;
X18 se selecciona del grupo que consiste
X19 se selecciona del grupo que consiste
X20 se selecciona del grupo que consiste ; y
X21 se selecciona del grupo que consiste de A, V,
Figure imgf000018_0001
Además de la estructura central expuesta anteriormente, X7-X21, otras estructuras que se contemplan específicamente son aquellas en las que uno o más aminoácidos adicionales están unidos a la estructura central (por ejemplo, enlazados al extremo N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos X7-X21). Por lo tanto, la divulgación incluye péptidos que comprenden la estructura central y que además comprenden uno o más aminoácidos N-terminales que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:
Xa ,
X5X6 ,
X4X5X6,
X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3110),
X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3111), y
X1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 3112);
en donde X6 está directamente enlazado a X7 de la secuencia de aminoácidos de la estructura central, y
X1 se selecciona del grupo que consiste de T y G;
X2 se selecciona del grupo que consiste de F y V;
X3 se selecciona del grupo que consiste de V, W, Y y F;
X4 se selecciona del grupo que consiste de D, Q y S;
X5 se selecciona del grupo que consiste de E, T, N y S; y
X6 se selecciona del grupo que consiste de R, H, K y A.
El péptido de la divulgación en un aspecto comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos QSKKNVFVFGYFERLRAK (SEQ ID NO: 1).
En otra realización, el péptido de la divulgación que comprende la estructura central comprende uno o más aminoácidos C-terminales que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:
X22,
X22X23,
X22X23X24,
X22X23X24X25 (SEQ ID NO: 3113),
X22X23X24X25X26 (SEQ ID NO: 3114), y
X22X23X24X25X26X27 (SEQ ID NO: 3115),
en donde X22 está directamente enlazado a X21 de la secuencia de aminoácidos de la estructura central, y
X22 se selecciona del grupo que consiste de Q, I, E, W, R, L y N;
X23 se selecciona del grupo que consiste de L, V, M y R;
X24 se selecciona del grupo que consiste de K, L, A e Y;
X25 es F;
X26 es G; y
X27 es T.
En un aspecto, el péptido de la divulgación comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos VIVFTFRHNKLIGYERRY (s Eq ID NO: 4). También se contempla que el péptido de la divulgación comprende aminoácidos adicionales tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal de la estructura central. En este aspecto, el péptido comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF (SEQ ID NO: 3), GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT (SEQ ID NO: 5), KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF (SEQ ID NO: 6), o ASFPLAVQLHVSKRSKEMA (SEQ ID NO: 7).
La divulgación incluye además péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos X3X4X5-F-X7-NVF-X11X12-GY-X15X16-RLRAK-X22 (SEQ ID NO: 2), en donde X3 es Y o F; X4 es Q o S; X5 es N o S; X7 es K, N o Q; X11 es V, A, S o T; X12 es F, A, D, L, Q, S o Y; X15 es F, K o Y; X16 es E o D; y X22 es L o N.
La invención proporciona un péptido que se une e inhibe la actividad de TFPI, en donde el péptido comprende la estructura de fórmula (I): X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020 (SEQ ID NO: 3116), como se ha definido anteriormente de acuerdo con la invención.
En un aspecto, el péptido de la invención comprende la estructura de fórmula (I) como se ha definido anteriormente de acuerdo con la invención, en donde X1001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, L, Y y M; X1002 es Q; X1003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, Q, R, S, T y C; X1004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, K, , P, R, E, G, I, Y, M y W; X1005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Nmg, p, Q, R, A, E, C y M; X1006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, H, K, N, Q, R, S y M; X1007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I y V; X1008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H e Y; X1009 es V; X1010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, K, M, N, Q, R, F, H, P, S, V, W e Y; X1011 es G; X1012 es Y; X1013 es C o F; X1014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V y Aib; X1015 es R; X1016 es L; X1017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S y M; X1018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, L, N, M y R; X1019 es K; y X1020 es K o L.
Cuando el aminoácido X1020 está ausente de la fórmula (I), el péptido de la invención en un aspecto comprende además el aminoácido X1000 en el extremo N terminal de la fórmula (I), de tal manera que el péptido comprende o consiste de la estructura de la fórmula (II): X1000-X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019 (II) (SEQ ID NO: 3122). Cuando X1000 está presente en el péptido, X1000 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, E y P, mientras que los aminoácidos de X1001-X1019 son como se han definido anteriormente de acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional, el péptido inhibidor y de unión a TFPI de la invención comprende la estructura de fórmula (III): X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L (III) (SEQ ID NO: 3117). X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1008, X1010, X1014, X1017 y X1018 en la fórmula (III) son como se ha definido anteriormente de acuerdo con la invención.
M);
En algunas realizaciones, el péptido de la invención comprende uno o más residuos de aminoácidos adicionales unidos al extremo N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el péptido que comprende la estructura de una cualquiera de las fórmulas (I)-(III) de acuerdo con la invención, en algunas realizaciones, comprende además uno o más aminoácidos N-terminales directamente enlazados a X1001, en donde los aminoácidos N-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de X1000,
X999-X1000,
X998-X999-X1000,
X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3123),
X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3124),
X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3125),
X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3126),
X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3127),
X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3128),
X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3129), y
X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3130).
Cuando el péptido comprende uno o más aminoácidos N-terminales, X1000 es A o K; X999 es V o K; X998 es Q o K; X997 es L o K; X996 es R o K; X995 es G o K; X994 es V o K; X993 es G o K; X992 es S o K; X991 es K; y X990 es K.
Además de las estructuras centrales expuestas en las fórmulas (I)-(III) de acuerdo con la invención, otras estructuras que se contemplan específicamente son aquellas en las que uno o más aminoácidos adicionales están unidos al extremo C-terminal de la estructura central. enlazada directamente a X1020. Por ejemplo, la adición C-terminal opcionalmente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de X1021, X1021-X1022, X1021-X1022-X1023 y X1021-X1022-X1023-X1024 (SEQ ID NO: 3131), en donde X1021 es T o K; X1022 es S o K; y X1023 y X1024 son K.
La invención incluye además un péptido inhibidor y de unión a TFPI que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 60% de identidad (por ejemplo, por lo menos un 65%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% de identidad) con la secuencia de aminoácidos Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (fórmula IV) (SEQ ID NO: 164). En algunos casos, el péptido comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas (I)-(III), como se describe en la presente de acuerdo con la invención. La divulgación también incluye un péptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8-978 (por ejemplo, un péptido que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8-741 y 962-972 (como las SEQ ID NO: 8-741, 962-968, 971, o 972) y/o seleccionada del grupo que consiste de 742-961 (como las SEQ ID NO: 744-961) y/o seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID No : 973-978).
Los péptidos de la invención, en algunos casos, comprenden enlaces disulfuro intramoleculares. A este respecto, el péptido que comprende la estructura de fórmulas (I)-(III) como se ha definido anteriormente de acuerdo con la invención contiene por lo menos dos residuos de cisteína (por ejemplo, el péptido contiene dos residuos de cisteína) que están separados por al menos tres residuos de aminoácidos de tal manera que las cisteínas forman un enlace disulfuro intramolecular. En algunos casos, las cisteínas están separadas por más de tres residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en el péptido que comprende la estructura de fórmulas (I), (II) o (III), dos cualquiera de X1000, X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1010, X1011, X1013, X1014, X1017, X1018, X1020 y X1021 son opcionalmente cisteínas capaces de formar un puente disulfuro. Por consiguiente, en algunos aspectos, el péptido contiene dos residuos de cisteína: uno de X1000, X1005, X1010 y X1014 es cisteína, y uno de X1006, X1010, X1017 y X1021 es una cisteína. La invención contempla todas las combinaciones posibles de pares de cisteína, por ejemplo, X1000 y X1006 son C; X1000 y X1010 son C; X1000 y X1017 son C; X1005 y X1017 son C; X1010 y X1017 son C; X1010 y X1021 son C; o X1014 y X1021 son C.
La divulgación proporciona además un péptido que se une a TFPI, el péptido que comprende la estructura de fórmula (V): X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023 (V) (SEQ ID NO: 3118), en donde el péptido forma una estructura cíclica generada por un enlace, por ejemplo, un enlace disulfuro, entre X2007 y X2018 (indicado entre paréntesis dentro de la fórmula (V)). En la fórmula (V), X2001, X2002 y X2023 están independientemente presentes o ausentes. Cuando está presente, X2001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W; X2002 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V y W; y X2023 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y.
X2003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;
X2004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W;
X2005 es W;
X2006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
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de F, H, I, K, L, R, V y W;
X2007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, Hcy, Dap y K (por ejemplo, C o Hcy); X2008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, R, S y T;
X2009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, I, K, L, M, m, Nle, p, R, Sem y V; X2010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, P, R, S, T y V;
X2011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, E, G, S y T;
X2012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, 1, M, m, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w;
X2013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, d, E, e, F, G, I, K, L, R, S, s, T, V y W; X2014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W; X2015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W; X2016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, I, K, L, M, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y;
V, W e Y; C);
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T, V y W.
En algunos casos, en el péptido de la divulgación que comprende la estructura de fórmula (V),
X2001 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L, P y S, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L y S (cuando X2001 está presente);
X2002 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L, P, R y S, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, H, K, L, M, R y S (por ejemplo, H, F, M o R) (cuando X2002 está presente);
X2003 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, K, L, S e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, S e Y (por ejemplo, F o Y);
X2004 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L y S (por ejemplo, K);
X2005 es opcionalmente W;
X2006 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H, K y L (por ejemplo, F o H);
X2007 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C y HcY (por ejemplo, X2007 es C);
X2008 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G y S;
X2009 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, K, L, V, M, m, Nle, Sem y p, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, Nle, p y V (por ejemplo, M, Sem o V);
X2010 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, K, L, P, R y S, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K, L, P, R y S (por ejemplo, K, P o R);
X2011 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, G y S (por ejemplo, D o S) ;
X2012 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, a, D, d, F, f, G, K, k, L, 1, M, m, Nle, P, S y s, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de D, d, F, f, G, K, k, L, 1, M, Nle, P, S y Sem (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, L, 1, Sem y M);
X2013 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, d, F, G, K, L, S y s, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L y S (por ejemplo, D, G, K o S);
X2014 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, F, G, K, L y S (por ejemplo, D o G);
X2015 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, I, K, L, M, Nle, S y T (por ejemplo, I o T);
X2016 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, F, K, L, M, Nle, S e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, F, K, L, M, Nle, S, Sem e Y (por ejemplo, D, F, M, Sem o Y);
X2017 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L, S, T e Y (por ejemplo, S o T);
X2018 es opcionalmente C;
X2019 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, L, S y V (por ejemplo, A o V);
X2020 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F y W (por ejemplo, W); X2021 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de L y V (por ejemplo, V); X2022 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L, P, R, S y W, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, G, K, L, P, R, S y W (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, L, K, R, P y W); y
X2023 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L, M, S e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, LM, S e Y (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de A, D, F, M, S e Y) (cuando X2023 está presente).
La divulgación incluye además un péptido que se une a TFPI, en donde el péptido comprende la estructura de fórmula (VI): X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023 (VI) (SEQ ID NO: 3119). En el péptido que comprende la estructura de fórmula (VI), X2001, X2002 y X2023 están cada uno independientemente presentes o ausentes. Si X2001, X2002 y/o X2023 están presentes, cualquiera de X2001, X2002 y X2023 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido. Además, X2008, X2010, X2012, X2013, X2016 y X2022 se seleccionan cada uno independientemente de cualquier aminoácido.
En algunos aspectos de la divulgación, en el péptido de fórmula (VI),
X2001 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W, como un aminoácido seleccionado de grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L, P y S (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L y S) (cuando X2001 está presente);
X2002 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V y W, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, H, K, L, M, P, R y S (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, H, K, L, M, R y S, como H, F, M o R) (cuando X2002 está presente);
X2008 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, R, S y T, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G y S;
X2010 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, P, R, S, T y V, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, K, L, P, R y S (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K, L, P, R y S, como K, P o R);
X2012 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, I, K, k, L, 1, M, m, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, a, D, d, F, f, G, K, k, L, 1, M, m, Nle, P, S, s y Sem (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, d, F, f, G, K, k, L, 1, M, Nle, P, S y Sem, como F, L, 1, Sem o M); X2013 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, d, E, e, F, G, I, K, L, R, S, s, T, V y W, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, d, F, G, K, L, S y s (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L y S, como D, G, K o S); X2016 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, I, K, L, M, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, F, K, L, M, Nle, S Sem e Y (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D, F, K, L, M, Nle, S, Sem, como F, Sem o M);
X2022 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, K, L, P, R, S y W (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, G, K, L, P, R, S y W, como F, L, K, R, P o W); y/o
X2023 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, F, G, I, K, L, R, M, S, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado de grupo que consiste de A, D, F, G, K, L, M, S e Y (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, F, G, LM, S e Y, como A, D, F, M, S o Y) (cuando X2023 está presente).
El péptido de unión a TFPI de la divulgación, en un aspecto, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 60% de identidad (por ejemplo, por lo menos un 60%, por lo menos un 65%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% de identidad) con la secuencia de fórmula VII: Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2 (VII) (SEQ ID NO: 1040). Opcionalmente, el péptido comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de fórmula (V)-(VII) como se define en la presente. La divulgación también incluye un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las s Eq ID NO: 1001-1293 (por ejemplo, un péptido que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1001-1212 y 1290-1291 (como SEQ ID NO: 1001-120, 1290 o 1291) y/o seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1213-1289 y/o seleccionada del grupo que consiste de 1292 y 1293).
La divulgación proporciona además un péptido de unión a TFPI que comprende la estructura de fórmula (VIII): X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021 (VIII) (SEQ ID NO: 3120).. En la fórmula (VIII), X3001 y X3002 están independientemente presentes o ausentes en el péptido. Si está presente, X3001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y; y X3002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, H, K, M, N, P, R, S, T, W, Y, G, I y L. Además,
X3003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W e Y;
X3004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y y P;
X3005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W e Y;
X3006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, W, C, K, P, R y H;
X3007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q, A, C, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, W e Y;
X3008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y e I;
X3009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, R, S, T, V, W, Y y K;
X3010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
X3011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, C, F y H;
X3012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L y R;
X3013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, R, S, V, W, Y e I;
X3014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y yK;
X3015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K y R;
X3016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, K y R;
X3017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
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F, G, I, K, L, N, Q, A y M;
X3018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
Figure imgf000023_0002
F, I, K, L, M, Q, R, X3019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste
Figure imgf000023_0003
D,
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E, F, G, H, K, L, N, e I;
X3020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, I y P; y
X3021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, F yG.
En algunos aspectos de la divulgación, el péptido comprende la secuencia de fórmula (VIII), en donde
X3001 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, K, L, M, N, P, R, S, T, E, H e Y (cuando X3001 está presente);
X3002 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, K, R, S, W, Y, G, I y L, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, K, R, W, Y, G, I y L (cuando X3002 está presente);
X3003 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y W, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, R, S, T y W;
X3004 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V y P, como un aminoácido seleccionado de grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T y P;
X3005 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, I, K, M, R, T, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, K, R y W;
X3006 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de P, H y A;
X3007 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, G, R, W, A y L, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de L, C, R y W;
X3008 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y e I, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, H, K, R, V, W, Y e I;
X3009 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, I, R, V y K, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, R, V y K;
X3010 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, Q, R, S y T, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, K, L, Q, R y S;
X3011 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, I, K, L, M, R, S, V, W, C, F y H, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, K, L, M, R, V, W, C, F y H;
X3012 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de H y R (por ejemplo, H);
X3013 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, K, L, M, R, V e I, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, K, R, V e I;
X3014 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, M, C, F, H, I, L, N, R, S, V, W y K, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, S, C, F, H, I, R y K;
X3015 es opcionalmente K o R;
X3016 es opcionalmente K o R;
X3017 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, H, A y M, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de C, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, H, A y M;
X3018 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K, C, I, L, R y W (por ejemplo, K, C, I, R o W);
X3019 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, E, H, K, N, Q, R e I, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, E, H, K, R e I;
X3020 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, H, L, M, R, V, I y P (por ejemplo, C, M, I o P); y
X3021 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, F y G, como un aminoácido seleccionado de grupo formado por A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, F y G.
La divulgación proporciona además un péptido que se une a TFPI y comprende la estructura de fórmula (IX): X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021 (IX) (SEQ ID NO: 3121). En la fórmula (IX), X3001 y X3002 están independientemente presentes o ausentes en el péptido. Si están presentes, X3001 y/o X3002 se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido. De igual manera, X3003, X3004, X3005, X3006, X3007, X3008, X3009, X3010, X3011, X3013, X3014, X3017, X3018, X3019, X3020 y X3021 se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido. Cuando está presente, X3001 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, K, L, M, N, P, R, S, T, E, H e Y). De igual manera, cuando está presente, X3002 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, H, K, M, N, P, R, S, T, W, Y, G, I y L, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, K, R, S, W, Y, G, I y L (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, K, R, W, Y, G, I y L). También con respecto a la fórmula (IX),
X3003 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y W (por ejemplo, un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, R, S, T y W);
X3004 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y y P, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V y P (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T y P);
X3005 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W e Y, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, I, K, M, R, T, W e Y (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, H, K, R y W);
X3006 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, W, C, K, P, R y H, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de P, H y A;
X3007 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q, A, C, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, W e Y, como un aminoácido seleccionado de grupo que consiste de C, G, R, W, A y L (por ejemplo, L, C, R o W);
X3008 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y e I, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y e I (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, H, K, R, V, W, Y e I);
X3009 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, R, S, T, V, W, Y y K, como un aminoácido seleccionado de grupo que consiste de C, I, R, V y K (por ejemplo, C, R, V o K);
X3010 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, H, I, K, L, M, Q, R, S y T (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, K, L, Q, R y S);
X3011 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, C, F y H, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, I, K, L, M, R, S, V, W, C, F y H (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, K, L, M, R, V, W, C, F y H); X3013 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, R, S, V, W, Y e I, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, F, K, L, M, R, V e I (por ejemplo, C, K, R, Vo I);
X3014 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y y K, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, M, C, F, H, I, L, N, R, S, V, W y K (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, S, C, F, H, I, R y K);
X3017 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, Y, H, A y M, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, H, A y M (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, H, A y M);
X3018 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, I, K, L, M, Q, R, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, K, C, I, L, R y W (por ejemplo, K, C, I, R o W);
X3019 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, F, G, H, K, L, N, P, Q, R, V, W, Y e I, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, E, H, K, N, Q, R e I (por ejemplo, C, E, H, K, R o I);
X3020 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, I y P, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C, H, L, M, R, V, I y P (por ejemplo, C, M, I o P); y/o
X3021 es opcionalmente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, F y G, como un amino ácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, F y G (por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, F y G).
El péptido de unión a TFPI de la divulgación comprende, en algunos aspectos, una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 60% de identidad (por ejemplo, por lo menos un 65%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% de identidad) con la secuencia de fórmula (X): Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2 (X) (SEQ ID NO: 2023). Opcionalmente, el péptido comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de fórmula (VIII)-(IX) como se define en la presente. Como se usa en la presente, "por lo menos un 60% de identidad" y términos similares abarcan cualquier número entero, por ejemplo, del 60% al 100%, como el 60%, 61%, 62% y similares. Además, el término "por lo menos [porcentaje] de identidad" abarca cualquier porcentaje que sea mayor que o igual que el número de aminoácidos idénticos dividido por el número total de aminoácidos del péptido de la invención ([por lo menos porcentaje de identidad] > [número de aminoácidos idénticos] / [número total de aminoácidos del péptido de la invención]).
La divulgación también incluye un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2001-2498 (por ejemplo, un péptido que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2001-2296 y 2498 (como SEQ ID NO: 2001-2126, 2128-2296 o 2498) y/o seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2297-2497 (como las SEQ ID NO: 2298-2497)) La divulgación proporciona además un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3001-3108 (por ejemplo, un péptido que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3001-3064 (como las SEQ ID NO: 3001-3048, 3051-3053, 3055 o 3057-3064) y/o seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3065-3084 (como las SEQ ID NO: 3066-3084) y/o seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3085-3108).
El péptido de las SEQ ID NO: 1-7 también, en algunos aspectos, comprende uno o más aminoácidos unidos en el extremo N- o C-terminal de las SEQ ID NO: 1-7. Por ejemplo, la divulgación incluye un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0047, JBT0051, JBT0055, JBT0131, JBT0132, JBT0133, JBT0155, JBT0158, JBT0162, JBT0163, JBT0164, JBT0166, JBT0169, JBT0170, JBT0171, JBT0174, JBT0175, o JBT0293, todos los cuales comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Los péptidos ejemplares que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 incluyen péptidos que comprenden o consisten de la secuencia de aminoácidos de JBT0294, JBT0295, JBT0296, JBT0297, JBT0298, JBT0299, JBT0300, JBT0301, JBT0302, JBT0303, JBT0304, JBT0305, JBT0306, JBT0307, JBT0308, JBT0309, JBT0310, o JBT0311. Los péptidos ejemplares que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 comprenden o consisten de la secuencia de aminoácidos de JBT0049, JBT0053, JBT0057, JBT0190, JBT0193 o JBT0197. La divulgación incluye además un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0050, JBT0054, JBT0058, JBT0129, JBT0130, JBT0205, JBT0208, JBT0211, JBT0212, JBT0217, JBT0218, o JBT0219, todos los cuales incluyen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Los péptidos ejemplares que comprenden la SEQ ID NO: 5 incluyen aquellos que comprenden o consisten de la secuencia de aminoácidos de JBT0101, JBT0052, JBT0103, JBT0178 o JBT0182. La divulgación incluye adicionalmente un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0120, JBT0124, JBT0247, JBT0248, JBT0251 o JBT0252, cada uno de los cuales incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. También se proporciona en la divulgación un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0122, JBT0126. JBT0221, JBT0224, JBT0225, JBT0226, JBT0228, JBT0232 o JBT0233. Los péptidos descritos en la presente se exponen en la Tabla 5 del Ejemplo 1 y en las Figuras 12-18.
En ciertas realizaciones, el péptido de la divulgación comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0047, JBT0049, JBT0101, j Bt 0120 o JBT0122 o cualquiera de los péptidos descritos en la presente (por ejemplo, un péptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3108, como un péptido que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 8-741, 744-968, 971-978, 1001-1210, 1213-1289, 1290-1293, 2001-2126, 2128-2296, 2298-2498, 3001­ 3048, 3051-3053, 3055, 3057-3064 y 3067-3108), o una variante de cualquiera de los anteriores. Por "variante" se entiende un péptido que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos o adiciones de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos original. Las variantes incluyen, pero no están limitadas a, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente a la vez que conserva la capacidad para unirse a TFPI y/o inhibir la actividad de TFPI. En una realización, el péptido comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de JBT0132, JBT0303, JBT0193, JBT0178, JBT0120o JBT0224.
En un aspecto, el péptido de la invención consiste de 40 aminoácidos o menos, como 35 aminoácidos o menos. Opcionalmente, el péptido de la invención consiste de 25 aminoácidos o menos, o, de acuerdo con la divulgación, 10 aminoácidos o menos. En varias realizaciones, el péptido de la divulgación comprende 15-35 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 residuos de aminoácidos). Sin embargo, también se contempla que un péptido descrito en la presente que comprende una o más deleciones es adecuado en el contexto de la invención siempre que el péptido bloquee la inhibición de TFPI de la cascada de coagulación que se une a TFPI. En un aspecto el péptido que comprende una o más deleciones es adecuado en el contexto de la invención siempre que el péptido se una a TFPI y bloquee la inhibición de TFPI de la cascada de coagulación. En algunos aspectos, los aminoácidos se eliminan del interior de la secuencia de aminoácidos, en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. Tales fragmentos peptídicos de la divulgación pueden comprender 3-14 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de aminoácidos).
Opcionalmente, el péptido de la divulgación comprende una o más sustituciones de aminoácidos (con referencia a cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente) que no destruyen la capacidad del péptido para unirse y/o inhibir TFPI. Por ejemplo, los péptidos que comprenden o que consisten de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de JBT0294, JBT0295, JBT0296, JBT0297, JBT0298, JBT0299, JBT0300, JBT0301, JBT0302, JBT0303, JBT0304, JBT0305, JBT0306, JBT0307, JBT0308, JBT0309, JBT0310, o JBT0311 son mutantes sustitucionales de la secuencia de aminoácidos de JBT0293 (la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 directamente enlazada a un residuo de fenilalanina en el extremo N-terminal y un residuo de lisina en el extremo C-terminal) (ver Figura 4). Las sustituciones de aminoácidos incluyen, pero no están limitadas a, aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en un péptido. En un aspecto, la sustitución es una sustitución conservadora, en donde un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido dentro de la técnica, e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Se apreciará, sin embargo, que un profesional no está limitado a crear sustituciones conservadoras siempre que el péptido resultante conserve la capacidad de regular por disminución, en su totalidad o en parte, la actividad de TFPI. La invención también abarca péptidos inhibidores de TFPI que comprenden aminoácidos atípicos de origen no natural, que son bien conocidos en la técnica. Los aminoácidos no naturales ejemplares incluyen ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido y-amino butírico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, un fluoro-aminoácido, un aminoácido 3-metilo, aminoácido a-C-metil, un aminoácido N-metilo, ácido 2-amino-isobutírico, ácido p-homoglutámico, p-homofenilalanina, p-homolisina, p-homoleucina, phomoasparagina, p-homoglutamina, p-homoarginina, p-homoserina, p-homotirosina, ácido p-homoaspártico, phomovalina, p-homoasparagina, (S)-ciclohexilalanina , (S)-citrulina, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)-diaminopropiónico, (S)-2-propargilglicina, (S)-N(omega)-nitro-arginina, L-homofenilalanina, S)-homoarginina, (S) -homo-citrulina, (S)-homo-cisteína, ácido (S)-2-amino-5-metil-hexanoico, (S)-homo-lisina, (S)-norleucina, (S)-N-metilalanina, ácido (S)-N-metil-aspártico, ácido (S)-N-metilglutamático, (S)-N-metil-fenilalanina, N-metil-glicina, (S)-N-metil-lisina, (S)-N-metil-leucina, (S)-N-metil-arginina, (S)-N-metil-serina, (S)-N-metil-valina, (S)-N-metil-tirosina, ácido (S)-2-amino-pentanoico, (S)-2-piridil-alanina, (S)-ornitina, L-fenilglicina, ácido 4-fenil-butírico y selenometionina. Los aminoácidos individuales pueden tener estereoquímica L o D cuando sea apropiado, aunque típicamente se emplea la estereoquímica L para todos los aminoácidos en el péptido.
La invención incluye además variantes de péptidos inhibidores de TFPI que comprenden uno o más aminoácidos insertados dentro de una secuencia de aminoácidos proporcionada en la presente y/o unida al extremo N-terminal o C-terminal. En un aspecto, el péptido comprende además uno o más aminoácidos que facilitan la síntesis, el manejo o el uso del péptido incluyendo, pero no limitado a, una o dos lisinas en el extremo N-terminal y/o C-terminal para aumentar la solubilidad del péptido. Las proteínas de fusión adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, proteínas que comprenden un péptido inhibidor de TFPI enlazado con uno o más polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o aminoácidos que generalmente no se reconocen como parte de la secuencia de la proteína. En un aspecto, un péptido de fusión comprende las secuencias de aminoácidos completas de dos o más péptidos o, alternativamente, comprende porciones (fragmentos) de dos o más péptidos. Además de todos o parte de los péptidos inhibidores de TFPI descritos en la presente, una proteína de fusión incluye opcionalmente todo o parte de cualquier péptido adecuado que comprende una actividad/función biológica deseada. De hecho, en algunos aspectos, un péptido inhibidor de TFPI está operativamente enlazado con, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un péptido con una vida media circulante larga, una proteína marcadora, un péptido que facilita la purificación del péptido inhibidor de TFPI, una secuencia peptídica que promueve la formación de proteínas multiméricas, o un fragmento de cualquiera de los anteriores. En una realización, dos o más péptidos inhibidores de TFPI se fusionan entre sí, se enlazan mediante un dominio de multimerización, o se unen mediante un enlace químico para generar un complejo peptídico inhibidor de TFPI. Los péptidos inhibidores de TFPI pueden ser iguales o diferentes.
Los "derivados" se incluyen en la invención e incluyen péptidos inhibidores de TFPI que se han modificado químicamente de alguna manera distinta de la adición, deleción o sustitución de aminoácidos. A este respecto, un péptido de la invención proporcionado en la presente está unido químicamente con polímeros, lípidos, otras fracciones orgánicas y/o fracciones inorgánicas. Se dan ejemplos de modificaciones de péptidos y proteínas en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). En algunas situaciones los derivados se preparan para aumentar la solubilidad, la estabilidad, la absorción o la vida media circulante. Varias modificaciones químicas eliminan o atenúan cualquier efecto secundario indeseable del agente. A este respecto, la invención incluye péptidos inhibidores de TFPI modificados covalentemente para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua. Los polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG de aproximadamente 40 kD o 1 kD de tamaño), polioxietilenglicol, polipropilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de cualquiera de los anteriores. En un aspecto, el péptido de la invención es un péptido PEGilado. Para una exposición adicional sobre uniones de polímeros solubles en agua, ver las Patentes de Estados Unidos N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; y 4.179.337. En otro aspecto, un derivado peptídico incluye una fracción dirigida específica para un tipo de célula, tejido y/u órgano particular. Alternativamente, el péptido está enlazado a una o más fracciones químicas que facilitan la purificación, detección, multimerización y caracterización de la actividad peptídica. Una fracción química ejemplar es la biotina. Además, en un aspecto, los péptidos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido. En otro aspecto, los péptidos de la invención están amidados en el aminoácido C-terminal del péptido. En un aspecto adicional más, los péptidos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido y se amidan en el aminoácido C-terminal del péptido.
Los derivados también incluyen péptidos que comprenden aminoácidos modificados o no proteinógenos o un grupo conector modificado (ver, por ejemplo, Grant, Synthetic Peptides: A User's Guide, Oxford University Press (1992)). Los aminoácidos modificados incluyen, por ejemplo, aminoácidos en los que el grupo amino y/o carboxilo está reemplazado por otro grupo. Ejemplos no limitativos incluyen aminoácidos modificados que incorporan tioamidas, ureas, tioureas, acilhidrazidas, ésteres, olefinas, sulfonamidas, amidas de ácido fosfórico, cetonas, alcoholes, amidas de ácido borónico, benzodiacepinas y otros heterociclos aromáticos o no aromáticos (ver Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6a edición, Volumen 1, Parte 4, John Wiley & Sons, Nueva York (2002)). Los aminoácidos modificados a menudo están conectados al péptido con por lo menos uno de los grupos funcionales mencionados anteriormente en lugar de un enlace amida. Los aminoácidos no proteinógenos incluyen, pero no están limitados a, p-alanina (Bal), norvalina (Nva), norleucina (Nle), ácido 4-aminobutírico (Y-Abu), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 6-aminohexanoico (£-Ahx), ornitina (Orn), hidroxiprolina (Hyp), taurina, sarcosina, citrulina (Cit), ácido cisteico (Coh), ciclohexilalanina (Cha), metioninesulfóxido (Meo), metioninesulfona (Moo), homoserinametiléster Hsm), propargilglicina (Eag), 5-fluorotriptófano (5Fw), 6-fluorotriptófano (6Fw), 3',4'-dimetoxifenil-alanina (Ear), 3',4'-difluorofenilalanina (Dff), 4'-fluorofenil-alanina (Pff), 1-naftil-alanina (1Ni), 1-metiltriptófano (1Mw), penicilamina (Pen), homoserina (Hse), t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina (Phg), benzotienilalanina (Bta), L-homo-cisteína (Hcy), N-metil-fenilalanina (Nmf), 2-tienilalanina (Thi), 3,3-difenilalanina (Ebw), homofenilalanina (Hfe) y S-bencil-L-cisteína (Ece). Estos y otros aminoácidos no proteinógenos pueden existir como isómeros D- o L-. Los ejemplos de conectores modificados incluyen, pero no están limitados a, el conector flexible 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (Ttds), glicina, ácido 6-aminohexanoico, beta-alanina (Bal) y combinaciones de Ttds, glicina, ácido 6-aminohexanoico y Bal.
Los homólogos de los aminoácidos que constituyen los péptidos de la invención pueden ser como se expone en la Tabla 3.
TABLA 3
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En algunas realizaciones, los enlaces peptídicos (CO-NH) que unen aminoácidos dentro del péptido de la invención se invierten para crear un péptido "retro-modificado", es decir, un péptido que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la dirección opuesta (enlaces NH-CO) en comparación con el péptido de referencia. El péptido retro-modificado comprende la misma quiralidad de aminoácidos que el péptido de referencia. Un péptido "inverso-modificado" es un péptido de la invención que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la misma dirección que un péptido de referencia, pero la quiralidad de los aminoácidos está invertida. Por tanto, cuando el péptido de referencia comprende L-aminoácidos, el péptido "inverso-modificado" comprende D-aminoácidos, y viceversa. Los péptidos inverso-modificados comprenden enlaces peptídicos CO-NH. Un péptido "retro-inverso modificado" se refiere a un péptido que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la dirección opuesta y que tienen quiralidad invertida. Un análogo retro-inverso tiene extremos terminales invertidos y dirección invertida de los enlaces peptídicos (es decir, NH-CO), mientras que mantiene aproximadamente la topología de la cadena lateral encontrada en el péptido de referencia. Los peptidomiméticos retro-inversos se elaboran usando métodos estándar, incluyendo los métodos descritos en Meziere et al., J. Immunol., 159, 3230­ 3237 (1997). Los péptidos retro-inversos parciales son péptidos en los que solo una parte de la secuencia de aminoácidos se invierte y se reemplaza con residuos de aminoácidos enantioméricos.
Los péptidos de unión a TFPI e inhibidores de la invención se preparan de varias maneras. En un aspecto, los péptidos se sintetizan mediante técnicas de síntesis en fase sólida incluyendo las descritas en Merrifield, J. Am. Chem Soc., 85, 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl., 10, 394-414 (1985); Larsen et al., J. Am. Chem Soc., 115, 6247 (1993); Smith et al., J. Peptide Protein Res., 44, 183 (1994); O'Donnell et al., J. Am. Chem Soc., 118, 6070 (1996); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins,, 3a ed., Vol. 2, págs. 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., Vol. 2, págs. 257-527 (1976). Alternativamente, el péptido inhibidor y de unión a TFPI se expresa recombinantemente mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica un péptido inhibidor y de unión a TFPI en las células huésped, que se cultivan para expresar el péptido. Tales péptidos se purifican a partir del cultivo celular usando técnicas estándar de purificación de proteínas.
La divulgación también abarca un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido inhibidor de TFPI de la invención. Los métodos para preparar moléculas de ADN y/o ARN son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, una molécula de ADN/ARN que codifica un péptido proporcionado en la presente se genera usando técnicas de síntesis química y/o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si se desea, se incorpora una secuencia que codifica un péptido inhibidor de TFPI en un vector de expresión. Un experto en la técnica apreciará que cualquiera de una serie de vectores de expresión conocidos en la técnica son adecuados en el contexto de la invención como, pero no limitados a, plásmidos, complejos plásmido-liposoma y vectores virales. Cualquiera de estos vectores de expresión se prepara usando técnicas estándar de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994). Opcionalmente, el ácido nucleico está enlazado operativamente a una o más secuencias reguladoras, como un promotor, activador, potenciador, señal de caperuza, señal de poliadenilación u otra señal implicada con el control de la transcripción o traducción.
Cualquiera de los péptidos inhibidores de TFPI de la invención o ácidos nucleicos que codifican los péptidos también se proporciona en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica). A este respecto, el péptido se formula con un portador, tampón, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable (es decir, farmacológicamente aceptable), como se describe más adelante en la presente. Opcionalmente, el péptido está en forma de una sal fisiológicamente aceptable, que está abarcada por la invención. "Sales fisiológicamente aceptables" significa cualquier sal que sea farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de sales apropiadas incluyen acetato, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y oxalato. Si se desea, la composición comprende uno o más agentes farmacéuticamente eficaces adicionales.
El péptido proporcionado en la presente inhibe por lo menos una actividad de TFPI-1a como, pero no limitado a, una actividad que regula por disminución la cascada de coagulación sanguínea. Sin estar sujeto a ningún mecanismo de acción específico, un mecanismo de inhibición propuesto puede implicar prevenir la formación del complejo cuaternario TF-FVIIA-FXA-TFPI. El péptido puede inhibir la unión de TFPI a FXa (por ejemplo, inhibir la unión del dominio 2 de Kunitz de TFPI al Factor Xa), el complejo TF/FVIIa (por ejemplo, inhibir la unión del dominio 1 de Kunitz de TFPI al complejo TF/FVIIa), TF solo, y/o FVIIa solo. Con la actividad de TFPI disminuida, TF y FVIIa son libres de activar FX que, a su vez, mejora la conversión de protrombina en trombina.
En un aspecto, el péptido de la invención muestra actividad antagonista de TFPI en sistemas de modelos y/o plasmáticos. Un sistema de modelo ejemplar para determinar la actividad inhibidora de TFPI es el ensayo de tenasa extrínseca, que prueba la capacidad de los péptidos candidatos para restaurar la activación de FX mediada por el complejo extrínseco en presencia de TFPI (que es un inhibidor natural de la reacción de activación de FX) (ver por ejemplo, Lindhout et al., Thromb. Haemost., 74, 910-915 (1995)). Otro sistema de modelo para caracterizar la actividad inhibidora de TFPI es el ensayo de inhibición de FXa, en el que la actividad de FXa se mide en presencia de TFPI (ver Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). El ensayo de la tenasa extrínseca y el ensayo de inhibición de FXa se describen adicionalmente en el Ejemplo 3. Opcionalmente, el péptido de la invención mejora la activación de FX en presencia de TFPI con una concentración eficaz media máxima (EC50) menor o igual a 1 x 104 M, menor o igual a 1 x 10'5 M, menor o igual a 1 x 10'6 M, o menor o igual a 1 x 10'7 M.
En un aspecto, la actividad antagonista de TFPI se caracteriza en un ensayo basado en plasma. La formación de trombina se desencadena en el plasma que carece sustancialmente de actividad de FVIII o FIX (por ejemplo, la actividad del factor de coagulación residual es inferior al 1%) en presencia de un péptido candidato. La formación de trombina puede detectarse usando un sustrato fluorogénico o cromogénico, como se describe en el Ejemplo 4. Un sistema para medir la actividad de la trombina se proporciona por Thrombinoscope BV (Maastricht, Países Bajos). La conversión de protrombina se mide usando, por ejemplo, un Thrombograph™ (Thermo Scientific, Waltham, MA), y los datos resultantes se compilan en un trombograma automático calibrado generado por el software del Thrombinoscope™ disponible de Thrombinoscope BV. En ciertas realizaciones, el péptido inhibidor de TFPI aumenta la cantidad de trombina máxima generada durante el ensayo y/o disminuye el tiempo requerido para lograr la formación de trombina máxima. Por ejemplo, el péptido mejora la generación de trombina regulada por TFPI en ausencia de FVIII (por ejemplo, en plasma desprovisto de FVIII) a por lo menos un 1% del nivel de generación de trombina dependiente de TFPi en plasma normal. En general, el plasma normal (no afectado) contiene de aproximadamente 0,5 U/ml a aproximadamente 2 U/ml de Factor VIII. Por consiguiente, en algunos casos, un péptido inhibidor de TFPI mejorará la formación de trombina en ausencia de FVIII a por lo menos aproximadamente un 1% de la observada en presencia de 0,5 U/ml a 2 U/ml de FVIII. En realizaciones adicionales, el péptido mejora la formación de trombina en ausencia de Factor VIII a por lo menos aproximadamente el 2%, por lo menos aproximadamente el 3%, por lo menos aproximadamente el 5%, por lo menos aproximadamente el 7%, o por lo menos aproximadamente el 10% del nivel de formación de trombina en plasma normal, es decir, en presencia de niveles fisiológicos de Factor VIII. En varios aspectos, el péptido se administra a un modelo animal de deficiencia de trombina o hemofilia para caracterizar la actividad inhibidora de TFPI in vivo. Tales modelos in vivo son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-FVIII administrados a ratones para inducir hemofilia A (Tranholm et al., Blood, 102, 3615-3620 (2003)); modelos de exclusión del factor de coagulación como, pero no limitados a, ratones excluidos de FVIII (Bi et al., Nat. Genet., 70(1), 119-121 (1995)) y ratones excluidos de FIX (Wang et al., PNAS, 94(21), 11563-66 (1997)); hemofilia-A inducida en conejos (Shen et al., Blood, 42(4), 509-521 (1973)); y perros Chapel Hill HA (Lozier et al., PNAS, 99, 12991-12996 (2002)).
Aunque no está vinculado a ninguna teoría o mecanismo particular, el péptido de la invención proporcionado en la presente puede inhibir la actividad de TFPI bloqueando (competitiva o alostéricamente) la unión de TFPI y FXa. Alternativa o adicionalmente, el péptido puede inhibir la unión de TFPI con un complejo de Factor Tisular (TF)/Factor VIIa. Por tanto, en ciertos aspectos, el péptido se une específicamente a TFPI. Varios péptidos se unen a TFPI de cualquier fuente incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, cobayas y primates. En una realización, el péptido se une a TFPI humano. Opcionalmente, el péptido inhibidor de TFPI se une a TFPI de más de una especie (es decir, el péptido es reactivo cruzado entre múltiples especies). En ciertos aspectos, el péptido se une a TFPI con una constante de disociación (Kd) menor o igual a 1 x 10' 4 M, menor o igual a 1 x 10' 5 M, menor o igual a 1 x 10' 6 M, o menor o igual a 1 x 10' 7 M La afinidad puede determinarse usando, por ejemplo y sin limitación, cualquiera, dos, o más de una variedad de técnicas como el ensayo ELISA de afinidad, un ensayo ELISA competitivo y/o un ensayo de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore™). Cuando se caracteriza usando un ensayo ELISA competitivo (IC50), el péptido de la invención demuestra opcionalmente una IC50 de menos de o igual a aproximadamente 50.000 nM. Por ejemplo, el péptido demuestra una IC50 de menos de o igual a aproximadamente 10.000 nM, como una IC50 menor o igual a aproximadamente 5.000 nM, menor o igual a aproximadamente 1.000 nM, o menor o igual a aproximadamente 500 nM. En un aspecto, el péptido demuestra una IC50 menor o igual a aproximadamente 250 nM, menor o igual a aproximadamente 100 nM, o menor o igual a aproximadamente 50 nM. Los péptidos ejemplares y sus valores de IC50 se proporcionan en las Figuras 32-39; en algunos casos, los péptidos se clasifican en grupos A, B, C, D, E, F y G (ver la Tabla 4 en el Ejemplo 1) en base a sus valores de IC50. En varios aspectos, la invención proporciona péptidos que caen dentro de los Grupos A, B, C, D, E, F y/o G como se define en la Tabla 4. La afinidad también puede determinarse mediante un método cinético o un método de equilibrio/solución. Tales métodos se describen con más detalle en la presente o se conocen en la técnica.
Al igual que con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la técnica reconoce que las varias fracciones a los que un agente de unión no debe unirse detectablemente para ser biológicamente (por ejemplo, terapéuticamente) eficaz serían exhaustivos y poco prácticos para enumerar. Por lo tanto, el término "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un péptido de unirse a TFPI con mayor afinidad que con la que se une a una proteína de control no relacionada que no es TFPI. Por ejemplo, el péptido puede unirse a TFPI con una afinidad que es por lo menos 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad para una proteína de control. En algunas realizaciones, el péptido se une a TFPI con mayor afinidad que a un "anti-objetivo" una proteína u otra sustancia de origen natural en humanos a la que la unión del péptido podría llevar a efectos adversos. Varias clases de péptidos o proteínas son anti-objetivos potenciales. Debido a que los péptidos inhibidores de TFPI ejercen su actividad en el torrente sanguíneo y/o en el endotelio, las proteínas plasmáticas representan anti­ objetivos potenciales. Las proteínas que contienen dominios de Kunitz (KD) son anti-objetivos potenciales ya que los k D de diferentes proteínas comparten una similitud significativa. El inhibidor de la vía del factor tisular-2 (TFPI-2) es muy similar al TFPI-1a y, como TFPI-1a, contiene KD (Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). Por tanto, en un aspecto, el péptido de la invención se une a TFPI con una afinidad que es por lo menos 5, 10, 15, 25 o 50 veces mayor que la afinidad para un anti-objetivo, como TFPI-2.
La invención incluye además un método para inhibir el inhibidor de la vía del factor tisular-1 (TFPI) in vitro.
El método comprende poner en contacto TFPI con un péptido de unión a TFPI como se describe en la presente. Se contempla cualquier grado de inhibición de la actividad de TFPI. Por ejemplo, un péptido inhibidor de TFPI reduce la inhibición de TFPI de la vía extrínseca por lo menos aproximadamente un 5% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 25% o por lo menos aproximadamente un 30%). En algunas realizaciones, el péptido inhibidor de TFPI reduce la actividad de TFPI dentro de la vía extrínseca por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 75% o por lo menos aproximadamente un 90% en comparación con la actividad de TFPI en ausencia del péptido.
La invención incluye además un péptido de la invención, para su uso en un método de terapia o diagnóstico in vivo de enfermedad, en donde el método comprende dirigirse a estructuras biológicas (incluyendo, pero no limitadas a, las superficies celulares y el revestimiento endotelial) donde está localizado el TFPI. El método comprende poner en contacto la estructura biológica (por ejemplo, incluyendo, sin limitación, una célula que muestra TFPI en la superficie celular) con un péptido de unión a TFPI descrito en la presente, opcionalmente conjugado a una fracción que añade funcionalidad adicional al péptido. La fracción puede ser un colorante (como un colorante de fluorescencia), un radionúclido o un complejo que contiene radionúclido, una proteína (por ejemplo, una enzima, una toxina o un anticuerpo) o un agente citotóxico. Por ejemplo, el péptido está enlazado o conjugado a una fracción efectora que facilita la detección y/o purificación de péptidos y/o comprende propiedades terapéuticas. En un aspecto, el péptido de unión a TFPi o el conjugado de péptido se administra a un mamífero para dirigirse a una célula que muestra TFPI dentro del mamífero. Opcionalmente, el método comprende además detectar la unión del péptido de unión a TFPI a TFPI. El método es útil para la terapia y el diagnóstico de enfermedades en las que TFPI es un marcador de diagnóstico adecuado o las células que expresan TFPI son un objetivo para un enfoque terapéutico.
En algunos aspectos, la unión péptido-TFPI se detecta indirectamente. A este respecto, el péptido se pone en contacto con un compañero de interacción que se une al péptido de la invención sin interferir significativamente con la unión péptido-TFPI, y se detecta el compañero de interacción. Los compañeros de interacción ejemplares incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, anticalinas y miméticos de anticuerpos, aptámeros y spiegelmers. Opcionalmente, el compañero de interacción comprende una fracción de detección para facilitar la detección de un complejo de compañero de interacción-péptido. Los métodos para detectar, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son bien conocidos en la técnica. De manera similar, las fracciones de detección se usan ampliamente en la técnica para identificar sustancias biológicas e incluyen, por ejemplo, colorante (por ejemplo, colorante fluorescente), radionúclidos y complejos que contienen radionúclidos, y enzimas.
Por tanto, la invención proporciona un péptido para su uso en un método para diagnosticar in vivo a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, o que está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno está asociado o provocado por una actividad aberrante de TFPI. El método comprende administrar al sujeto el péptido de unión a TFPI de la invención y detectar el complejo TFPI-péptido. En algunos casos, el péptido de la invención se conjuga con una fracción detectable, y el método comprende detectar la fracción detectable. En otros casos, el método comprende administrar al sujeto un compañero de interacción de péptido de unión a TFPI que se une al péptido de unión de TFPI, y detectar el compañero de interacción. Si se desea, el compañero de interacción comprende o se conjuga con una fracción detectable, y se detecta la fracción detectable. La presencia de la fracción detectable indica la presencia de TFPI, permitiendo de este modo el diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con TFPI (por ejemplo, una enfermedad o trastorno que (i) puede tratarse inhibiendo TFPI o (ii) comprende síntomas que pueden mejorarse o prevenirse inhibiendo TFPI). Si no se desea la administración del péptido al sujeto, se obtiene una muestra biológica del sujeto, se pone en contacto con el péptido de unión a TFPI como se describe en la presente, y se detectan complejos TFPI-péptido.
Los péptidos de la invención se unen a TFPI y, por lo tanto, son útiles para purificar TFPI o TFPI recombinante de una muestra biológica (por ejemplo, un fluido biológico como suero), extracto de fermentación, preparaciones de tejidos, medio de cultivo y similares. La invención incluye métodos para usar la unión a TFPI en la producción comercial de TFPI o en un método para caracterizar moléculas de TFPI. Por ejemplo, la invención incluye un método para purificar TFPI. El método comprende poner en contacto una muestra que contiene TFPI con un péptido como se define en la presente bajo condiciones apropiadas para formar un complejo entre TFPI y el péptido; eliminar el complejo de la muestra; y, opcionalmente, disociando el complejo para liberar TFPI. Las condiciones ejemplares apropiadas para formar un complejo entre TFPI y el péptido se divulgan en los Ejemplos, y tales condiciones pueden modificarse fácilmente para disociar el complejo TFPI-péptido. En algunas realizaciones, el péptido se inmoviliza en un soporte, por ejemplo, un soporte sólido, para facilitar la recuperación de TFPI. Por ejemplo, en una realización, el péptido se inmoviliza a la fase estacionaria de cromatografía (por ejemplo, sílice, perlas de cromatografía de afinidad, o resinas de cromatografía), se aplica una muestra que comprende TFPI a la fase estacionaria de modo que se formen complejos TFPI-péptido, el resto de la muestra se elimina de la fase estacionaria, y el TFPI se eluye de la fase estacionaria. A este respecto, los péptidos de la invención son, en un aspecto, adecuados para su uso en técnicas de cromatografía de afinidad.
También se proporciona un péptido de la invención, para su uso en un método para mejorar la formación de trombina en un sujeto deficiente en factor de coagulación. El método comprende administrar al sujeto un péptido proporcionado en la presente bajo condiciones eficaces para inhibir TFPI. A este respecto, el péptido inhibidor de TFPI se administra en una cantidad y en condiciones eficaces para mejorar la formación de trombina en el sujeto. Por "factor de coagulación deficiente" se entiende que el sujeto padece una deficiencia en uno o más factores sanguíneos requeridos para la formación de trombina, como FVIII, FIX o FXI. De hecho, en una realización, el sujeto es deficiente en FVIII. Alternativa o adicionalmente, el sujeto es deficiente en Factor IX. Las deficiencias del factor de coagulación se identifican examinando la cantidad de factor en una muestra clínica. Los profesionales clasifican la hemofilia de acuerdo con la magnitud de la deficiencia del factor de coagulación. Los sujetos que padecen hemofilia leve tienen aproximadamente del 5% al 30% de la cantidad normal (1 U/ml) de Factor VIII o Factor IX. La hemofilia moderada se caracteriza por aproximadamente del 1% al 5% de los niveles normales de Factor VIII, Factor IX o Factor XI, mientras que los sujetos que padecen hemofilia grave tienen menos del 1% de la cantidad normal de Factor VIII, Factor IX o Factor Xi. Las deficiencias pueden identificarse indirectamente mediante pruebas de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). La prueba APTT mide el tiempo requerido para que se forme un coágulo de sangre, que es más largo para pacientes con deficiencia de Factor VIII (hemofilia A), deficiencia de Factor IX (hemofilia B) y deficiencia de Factor XI (hemofilia C) en comparación con pacientes con niveles de factores de coagulación normales. Casi el 100% de los pacientes con deficiencia grave y moderada de Factor VIII pueden ser diagnosticados con una APTT. La invención incluye además mejorar la formación de trombina en un sujeto que no padece una deficiencia de factores de coagulación. El método comprende administrar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que comprende niveles fisiológicos normales de factor de coagulación) un péptido proporcionado en la presente bajo condiciones eficaces para mejorar la formación de trombina.
En un aspecto, se proporciona el péptido inhibidor de TFPI de la invención para su uso en un método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos en un sujeto. El método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos comprende administrar al sujeto un péptido descrito en la presente en una cantidad y bajo condiciones eficaces para aumentar la formación de coágulos sanguíneos. Se apreciará que el método no necesita restaurar completamente la cascada de coagulación para lograr un efecto beneficioso (por ejemplo, terapéutico). Se contempla cualquier mejora o aumento en la formación de trombina o de coágulos sanguíneos que reduzca la aparición o la gravedad de los síntomas asociados con las deficiencias de factores de coagulación. Los métodos para determinar la eficacia del método para promover la formación de trombina y la coagulación de la sangre son conocidos en la técnica y se describen en la presente.
La invención incluye además un péptido de la invención, para su uso en el método de tratar un trastorno de coagulación de la sangre en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto uno o más péptidos inhibidores de TFPI, como uno cualquiera o más de los péptidos descritos en la presente., en una cantidad y bajo condiciones eficaces para tratar el trastorno de coagulación de la sangre en el sujeto. En un aspecto, el péptido no es un péptido de origen natural que inhibe la actividad de TFPI. Los "trastornos de la coagulación" incluyen trastornos hemorrágicos provocados por una actividad deficiente de factores de coagulación sanguínea y una actividad plaquetaria deficiente. Los factores de coagulación sanguínea incluyen, pero no están limitados a, Factor V (FV), FVII, FVlII, FIX, FX, FXI, FXIII, FII (responsable de la hipoprotrombinemia) y el factor de von Willebrand. Las deficiencias de factores están provocadas, por ejemplo, por una vida media in vivo acortada del factor, propiedades de unión alteradas del factor, defectos genéticos del factor y una concentración en plasma del factor reducida. Los trastornos de la coagulación pueden ser congénitos o adquiridos. Los defectos genéticos potenciales incluyen deleciones, adiciones y/o sustitución dentro de una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de coagulación cuya ausencia, presencia y/o sustitución, respectivamente, tiene un impacto negativo sobre la actividad del factor de coagulación. Los trastornos de la coagulación también se derivan del desarrollo de inhibidores o autoinmunidad (por ejemplo, anticuerpos) contra factores de coagulación. En un ejemplo, el trastorno de la coagulación es la hemofilia A. Alternativamente, el trastorno de la coagulación es la hemofilia B o la hemofilia C.
Los trastornos plaquetarios están provocados por una función plaquetaria deficiente o un número de plaquetas en circulación anormalmente bajo. El recuento bajo de plaquetas puede deberse, por ejemplo, a la producción insuficiente, el secuestro de plaquetas o la destrucción incontrolada de plaquetas. La trombocitopenia (deficiencias de plaquetas) puede estar presente por varias razones, incluyendo quimioterapia y otras terapias con fármacos, radioterapia, cirugía, pérdida accidental de sangre y otros estados de enfermedad. Las condiciones de enfermedad ejemplares que implican trombocitopenia son: anemia aplásica; trombocitopenia idiopática o inmune (ITP), incluyendo púrpura trombocitopénica idiopática asociada con cáncer de mama; ITP asociada al VIH y púrpura trombocitopénica trombótica relacionada con el VIH; tumores metastásicos que resultan en trombocitopenia; lupus eritematoso sistémico, incluyendo el síndrome de lupus neonatal esplenomegalia; síndrome de Fanconi; deficiencia de vitamina B12; deficiencia de ácido fólico; anomalía de May-Hegglin; síndrome de Wiskott-Aldrich; enfermedad hepática crónica; síndrome mielodisplásico asociado con trombocitopenia; hemoglobinuria paroxística nocturna; trombocitopenia profunda aguda después de terapia con C7E3 Fab (Abciximab); trombocitopenia aloinmune, incluyendo la trombocitopenia aloinmune materna; trombocitopenia asociada con anticuerpos antifosfolípidos y trombosis; trombocitopenia autoinmune; trombocitopenia inmune inducida por fármacos, incluyendo la trombocitopenia inducida por carboplatino y la trombocitopenia inducida por heparina; trombocitopenia fetal; trombocitopenia gestacional; síndrome de Hughes; trombocitopenia lupoidea; pérdida de sangre accidental y/o masiva; trastornos mieloproliferativos; trombocitopenia en pacientes con neoplasias malignas; púrpura trombocitopénica trombótica, incluyendo microangiopatía trombótica que se manifiesta como púrpura trombocitopénica trombótica/síndrome urémico hemolítico en pacientes con cáncer; púrpura posterior a la transfusión (PTP); anemia hemolítica autoinmune; perforación oculta del divertículo yeyunal; aplasia pura de glóbulos rojos; trombocitopenia autoinmune; nefropatía epidémica; insuficiencia renal aguda asociada con la rifampicina; trombocitopenia de Paris-Trousseau; trombocitopenia aloinmune neonatal; hemoglobinuria paroxística nocturna; cambios hematológicos en el cáncer de estómago; síndromes urémicos hemolíticos (por ejemplo, afecciones urémicas en la infancia); y manifestaciones hematológicas relacionadas con la infección viral incluyendo el virus de la hepatitis A y la trombocitopenia asociada al CMV. Los trastornos plaquetarios también incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Von Willebrand, disfunción plaquetaria paraneoplásica, trombastenia de Glanzman, y enfermedad de Bernard-Soulier. Los trastornos hemorrágicos adicionales susceptibles de tratamiento con un péptido inhibidor de TFPI incluyen, pero no están limitados a, afecciones hemorrágicas inducidas por trauma; una deficiencia en uno o más factores de contacto, como FXI, FXII, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular (HMWK); deficiencia de vitamina K; un trastorno de fibrinógeno, incluyendo la afibrinogenemia, la hipofibrinogenemia y la disfibrinogenemia; y deficiencia de alfa2-antiplasmina. En una realización, el péptido inhibidor de TFPI se usa para tratar la hemorragia excesiva, como la hemorragia excesiva provocada por cirugía, trauma, hemorragia intracerebral, enfermedad hepática, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, hipotermia, menstruación, embarazo y fiebre hemorrágica del dengue. Todo lo anterior se considera "trastornos de la coagulación sanguínea” en el contexto de la divulgación.
En un aspecto, el péptido inhibidor de TFPI de la invención es para su uso en un método para revertir los efectos (en su totalidad o en parte) de uno o más anticoagulantes en un sujeto. Se conocen numerosos anticoagulantes en la técnica e incluyen, por ejemplo, heparina; derivados de cumarina, como warfarina o dicumarol; TFPI; AT III; lupus anticoagulante; péptido anticoagulante nematodo (NAPc2); Inhibidores de FVIIa; FVIIa bloqueado en el sitio activo (FVIIai); FIXa bloqueado en el sitio activo (FIXai); inhibidores de FIXa; Inhibidores de FXa, incluyendo fondaparinux, idraparinux, DX-9065a y razaxaban (DPC906); FXa bloqueado en el sitio activo (FXai); inhibidores de FVa o FVIIIa, incluyendo proteína C activada (APC) y trombomodulina soluble; inhibidores de trombina incluyendo hirudina, bivalirudina, argatrobán y ximelagatran; y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a un factor de coagulación (por ejemplo, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXIII, FII, FXI, FXII, factor de von Willebrand, precalicreina, o cininógeno de alto peso molecular (HMWK)).
Como se usan en la presente, "tratar" y "tratamiento" se refieren a cualquier reducción en la gravedad y/o aparición de los síntomas asociados con un trastorno de la coagulación de la sangre. Por consiguiente, "tratar" y "tratamiento" incluyen medidas terapéuticas y profilácticas. Un experto en la técnica apreciará que cualquier grado de protección de, o mejora de, un trastorno de coagulación de la sangre o síntoma asociado con el mismo es beneficioso para un sujeto, como un paciente humano. La calidad de vida de un paciente mejora al reducir en cualquier grado la gravedad de los síntomas en un sujeto y/o al retrasar la aparición de los síntomas. Por consiguiente, un péptido de la invención es para su uso en un método, que, en un aspecto se realiza lo antes posible después de que se haya determinado que un sujeto está en riesgo de desarrollar un trastorno de la coagulación de la sangre (por ejemplo, se detecta una deficiencia en un factor de coagulación (por ejemplo, FVIII, FIX o FXI)) o lo antes posible después de que se haya detectado un trastorno de la coagulación de la sangre (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C). En un aspecto adicional, el péptido se administra para proteger, total o parcialmente, contra la pérdida excesiva de sangre durante una lesión o cirugía.
A la vista de lo anterior, la invención proporciona un péptido para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto, como un método para el tratamiento de una enfermedad en donde la inhibición de TFPI es beneficiosa. En un aspecto, la enfermedad o trastorno es un trastorno de la coagulación sanguínea. El sujeto padece de una enfermedad o trastorno o está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno (o evento biológico adverso, como una pérdida excesiva de sangre). El método comprende administrar al sujeto el péptido de la invención en una cantidad y bajo condiciones eficaces para tratar o prevenir, total o parcialmente, la enfermedad o trastorno. La invención proporciona además un péptido para su uso en la fabricación de un medicamento. Por ejemplo, el péptido puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, como se describe con detalle en la presente.
En algunas realizaciones, es ventajoso administrar a un sujeto un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido inhibidor y de unión a TFPI de la invención. Dicho ácido nucleico, en un aspecto, se proporciona en lugar de, o además de, un péptido inhibidor de TFPI. Los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ácidos nucleicos, los métodos de administración y similares, se describen adicionalmente en la presente y en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20030045498.
Un régimen de administración particular para un sujeto particular dependerá, en parte, del péptido inhibidor de TFPI de la invención usado, la cantidad de péptido inhibidor y de unión a TFPI administrado, la vía de administración, la dolencia particular a tratar, consideraciones relevantes para el receptor, y la causa y el alcance de cualquier efecto secundario. La cantidad de péptido administrada a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, como un humano) y las condiciones de administración (por ejemplo, periodicidad de administración, vía de administración, régimen de dosificación) son suficientes para efectuar la respuesta biológica deseada durante un marco temporal razonable. La dosis depende típicamente de una variedad de factores, incluyendo el péptido inhibidor de TFPI particular empleado, la edad y el peso corporal del sujeto, así como la existencia y gravedad de cualquier enfermedad o trastorno en el sujeto. El tamaño de la dosis también estará determinado por la vía, la periodicidad y la frecuencia de administración. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo, y los expertos en la técnica conocen técnicas convencionales de búsqueda de rango. Simplemente a modo de ilustración, en un aspecto, el método comprende administrar, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosificación puede variar de 1 pg/kg hasta aproximadamente 75 mg/kg; o 5 pg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg; o 10 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis comprende de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2. 5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg) de péptido. Dada la naturaleza crónica de muchos trastornos de la coagulación sanguínea, se prevé que un sujeto recibirá el péptido inhibidor de TFPI durante un curso de tratamiento que dura semanas, meses o años, y puede requerir una o más dosis diarias o semanales. En otras realizaciones, el péptido inhibidor de TFPI se administra para tratar una afección aguda (por ejemplo, hemorragia provocada por cirugía o trauma, o episodios inhibidores de factores/autoinmunes en sujetos que reciben terapia de reemplazo de coagulación) durante un período de tratamiento relativamente corto, por ejemplo, de uno a 14 días.
Los métodos adecuados para administrar una composición fisiológicamente aceptable, como una composición farmacéutica que comprende un péptido descrito en la presente, son bien conocidos en la técnica. Aunque puede usarse más de una vía para administrar un péptido, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Dependiendo de las circunstancias, se aplica o instila en las cavidades corporales una composición farmacéutica, se absorbe a través de la piel o las membranas mucosas, se ingiere, inhala y/o se introduce en la circulación. En un aspecto, una composición que comprende un péptido inhibidor de TFPI se administra por vía intravenosa, intraarterial o intraperitoneal para introducir el péptido de la invención en circulación. La administración no intravenosa también es apropiada, particularmente con respecto a agentes terapéuticos de bajo peso molecular. En ciertas circunstancias, es deseable administrar una composición farmacéutica que comprenda el péptido inhibidor de TFPI por vía oral, tópica, sublingual, vaginal, rectal; mediante inyección por medio intracerebral (intraparenquimatoso), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmico, subcutáneo, intranasal, uretral o enteral; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación. Si se desea, el péptido inhibidor de TFPI se administra regionalmente mediante administración intraarterial o intravenosa que alimenta una región de interés, por ejemplo, a través de la arteria femoral para la administración a la pierna. En una realización, el péptido se incorpora en una micropartícula como se describe en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5.439.686 y 5.498.421 y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos 2003/0059474, 2003/0064033, 2004/0043077, 2005/0048127, 2005/0170005, 2005/0142205, 2005/142201, 2005/0233945, 2005/0147689. 2005/0142206, 2006/0024379, 2006/0260777, 2007/0207210, 2007/0092452, 2007/0281031, y 2008/0026068. Alternativamente, la composición se administra mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo en un aspecto se implanta en cualquier tejido adecuado, y la administración de la molécula deseada se realiza en varios aspectos mediante difusión, bolo de liberación programada, o administración continua. En otros aspectos, el péptido inhibidor de TFPI se administra directamente al tejido expuesto durante los procedimientos quirúrgicos o el tratamiento de una lesión, o se administra a través de transfusión de procedimientos sanguíneos. Los enfoques de administración terapéutica son bien conocidos por los expertos en la técnica, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.399.363.
Para facilitar la administración, el péptido inhibidor y de unión a TFPI en una realización se formula en una composición fisiológicamente aceptable que comprende un portador (es decir, vehículo, adyuvante, tampón o diluyente). El portador particular empleado está limitado solo por consideraciones químico-físicas, como la solubilidad y la falta de reactividad con el péptido, y por la vía de administración. Los portadores fisiológicamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen, sin limitación, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.466.468). Las formulaciones inyectables se describen adicionalmente en, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Filadelfia. Pa., Banquero y Chalmers. eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Una composición farmacéutica que comprende un péptido proporcionado en la presente se coloca opcionalmente dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones con respecto al uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como, en ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
Cuando sea apropiado, el péptido inhibidor y de unión a TFPI de la invención se administra en combinación con otras sustancias y/u otras modalidades terapéuticas para lograr un efecto biológico adicional o aumentado. Los co-tratamientos incluyen, pero no están limitados a, factores de coagulación derivados de plasma o recombinantes, tratamientos de profilaxis de hemofilia, inmunosupresores, antagonistas de anticuerpos inhibidores del factor plasmático (es decir, antiinhibidores), antifibrinolíticos, antibióticos, terapia hormonal, agentes antiinflamatorios. (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o sustancias antiinflamatorias esteroides), procoagulantes y analgésicos. En un aspecto, el péptido de la invención es para su uso en un método que es una terapia complementaria a los regímenes de tratamiento de factor de reemplazo tradicionales que implican la administración de, por ejemplo, FXIII, FXII, FXI (por ejemplo, HEMOLEVEN® (Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, Francia), y concentrado de FXI (BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FX, FIX (por ejemplo, BENEFIX® Factor IX de coagulación (Wyeth, Madison, NJ); ALPHANINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); MONONINE® (CSL Behring, King of Prussia, PA); BEBULIN VH™ (Baxter, Deerfield, IL); PROFILNINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); o PROPLEX T™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIII (e.g., ADVATE™ (Baxter, Deerfield, IL); HELIXATE® FS (CSL Behring, King of Prussia, PA); REFACTO® (Wyeth, Madison, NJ), XYNTHA™ (Wyeth, Madison, NJ), KOGENATE® y KOGENATE® FS (Bayer, Pittsburgh, PA); ALPHANATE® (Grifols, Los Angeles, CA); HEMOPHIL M™ (Baxter, Deerfield, IL); KOATE®-DVI (Talecris Biotherapeutics-USA, Research Triangle Park, NC); o MONARC-M™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIIa (por ejemplo, NOVOSEVEN ® FVIIa (Novo Nordisk, Princeton, NJ), y concentrado de FVII (Baxter Bioscience, Viena, Austria, o BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FV, FVa, FII, y/o FIII, a un sujeto. En algunos casos, el sujeto también recibe FEIBA VH Immuno™ (Baxter BioScience, Viena, Austria), que es una fracción de plasma humano estéril liofilizado con actividad de derivación del inhibidor del Factor VIII. FEIBA VH Immuno™ contiene unidades aproximadamente iguales de actividad de derivación del inhibidor del Factor VIII y factores del complejo de protrombina (Factores II, VII, IX y X y proteína C). Otros co-tratamientos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, precalicreína, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), factor de von Willebrand, factor tisular y trombina. Alternativa o adicionalmente, el péptido inhibidor de TFPI se co-formula con uno o más péptidos inhibiodres de TFPI diferentes.
Por lo tanto, la invención incluye un péptido inhibidor y de unión a TFPI de la invención (o múltiples péptidos inhibidores de TFPI), para su uso en combinación con una o más sustancias adicionalmente adecuadas, cada una de las cuales se administra a un sujeto de acuerdo con un régimen adecuado para ese medicamento Las estrategias de administración incluyen la administración concurrente (es decir, la administración sustancialmente simultánea) y la administración no concurrente (es decir, la administración en diferentes momentos, en cualquier orden, solapando o no) del péptido inhibidor de TFPI y uno o más agentes adicionales adecuados. Se apreciará que los diferentes componentes se administran opcionalmente en la misma composición o en composiciones separadas, y por la misma vía o diferentes vías de administración.
En algunas realizaciones, el péptido de la invención se conjuga con una fracción, por ejemplo, una fracción terapéutica o de diagnóstico, como las fracciones de detección y co-tratamientos descritos anteriormente. Alternativa o adicionalmente, el péptido se administra en combinación con un compañero de interacción (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticalina, aptámero o spiegelmer) que (a) se une al péptido y (b) es terapéuticamente activo y/o está vinculado a una fracción que proporciona funcionalidad adicional al compañero de interacción (por ejemplo, un agente terapéutico, de diagnóstico o de detección). Las fracciones adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, colorantes, radionúclidos, complejos que contienen radionúclidos, enzimas, toxinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y agentes citotóxicos, y, en algunos casos, la fracción posee actividad terapéutica (es decir, logra un efecto biológico ventajoso o deseado). La pareja de conjugados peptídicos o compañero de interacción paptídico es adecuado para su uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente, como los métodos de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno.
Además, se pretende que todo el documento se entienda como una divulgación unificada, y debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones de características descritas en la presente, incluso si la combinación de características no se encuentran juntas en la misma frase, o párrafo, o sección de este documento. Por ejemplo, cuando se describe la terapia con proteínas, se contemplan específicamente realizaciones que implican terapia con polinucleótidos (usando polinucleótidos/vectores que codifican la proteína), y lo contrario también es cierto. La invención incluye, por ejemplo, todas las realizaciones de la invención de un alcance más reducido en cualquier manera que las variaciones mencionadas específicamente con anterioridad. Con respecto a los aspectos de la invención descritos como un género, todas las especies individuales se consideran individualmente como aspectos separados de la invención. Con respecto a los aspectos de la invención descritos o reivindicados con "un" o "uno", debe entenderse que estos términos significan "uno o más" a menos que el contexto requiera inequívocamente un significado más restringido. Con respecto a los elementos descritos como uno o más dentro de un conjunto, debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones dentro del conjunto.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
El siguiente ejemplo describe la producción, identificación y selección de péptidos para la unión a TFPI.
Los péptidos candidatos se obtuvieron de proveedores comerciales (por ejemplo, PolyPeptide Laboratories SAS (Estrasburgo, Francia) y JPT Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania)). Los métodos para sintetizar péptidos candidatos se han proporcionado anteriormente. Los péptidos candidatos se sintetizaron como sales de trifluoroacetato (TFA) con una pureza >90% o >60%. Todos los péptidos se resolvieron en DMSO a una concentración madre de 10 mM. Las secuencias de péptidos de unión a TFPI se identificaron usando una biblioteca de visualización de ARNm. La tecnología de visualización de ARNm es superior a otras técnicas de selección de bibliotecas por permitir una diversidad de 1014 secuencias diferentes dentro de un grupo inicial y evitar, por ejemplo, los pasos in vivo requeridos para la visualización de fagos. En resumen, la tecnología implica enlazar directamente el ARNm a su péptido candidato codificado a través de una molécula de puromicina (Figura 5) El método de visualización de ARNm se describe adicionalmente en la Publicación de Patente Internacional N° WO 2005/051985 y Liu et al., Methods in Enzymology, 318, 268-293 (2000). El TFPI se inmovilizó en un soporte sólido a través de biotina y se expuso a complejos de péptido-ARN candidatos. Se aislaron los complejos de péptido-ARN candidatos unidos a TFPI, y el ARN se transcribió inversamente para obtener ADN codificante. Los aglutinantes de alta afinidad se obtuvieron después de seis a diez rondas de selección usando una estrategia de elusión competitiva. Muchos de los péptidos candidatos tenían 31 aminoácidos de longitud (27 aminoácidos aleatorizados y 2 aminoácidos que flanquean ambos extremos terminales).
Los péptidos seleccionados se sintetizaron y se sometieron a optimización de péptidos usando un análisis de barrido basado en micromatrices para identificar fragmentos de péptidos que retienen la afinidad de unión a TFPI. Por ejemplo, se realizó un barrido basado en micromatrices de JBT0047 usando una serie de 20 fragmentos de aminoácidos del péptido, cuyas secuencias se superponen con 19 aminoácidos. El análisis de truncamiento de extremos N- y C-terminales csupolementó el análisis de barrido. Los resultados del barrido de micromatrices demostraron que ese péptido JBT0293 se unía a TFPI con la mayor afinidad. Se generó una serie de mutantes de sustitución en base a la secuencia de aminoácidos de JBT0293 y se probaron para determinar las propiedades de unión de TFPI.
La afinidad de un subconjunto de péptidos para TFPI se demostró mediante un ensayo similar a un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (ELISA de unión (EC50)) realizado con péptidos biotinilados. Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos MaxiSorp (Nunc) con 3 pg/ml de TFPI en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,6) durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado (HNaT: NaCl 175 mM, HEPeS 25 mM, CaCh 5 mM, Tween 80 al 0,1%, pH 7.35), y posteriormente se bloquearon con 200 pl de extracto de levadura al 2% en HNaT durante 2 horas. Las placas se lavaron luego tres veces con 350 pl de HNaT. Los péptidos candidatos biotinilados se diluyeron de un stock de DMSO 1/200 en HNaT. La concentración de péptido inicial fue de 50 pM si no aparecía precipitado durante la dilución 1/200 de la solución madre de péptido 10 mM. Se realizaron diluciones previas del stock de péptidos en DMSO si se formaron precipitados. Los péptidos diluidos se aplicaron a las placas Maxisorp, se generaron diluciones en serie (1/3) y las diluciones se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La incubación fue seguida por tres pasos de lavado (350 pl de HNaT). El péptido unido se detectó por incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (1 hora), seguido de tres pasos de lavado con HNaT y una conversión cromogénica posterior de TMB añadido (3,3'5,5'-tetrametilbencidina). El ensayo se ilustra en la Figura 6A.
En general, la unión de péptidos a TFPI inmovilizado fue significativamente superior al fondo. Los valores de EC50 para péptidos biotinilados se proporcionan en las Figuras 32-39. La curva de unión de un péptido de unión a TFPI, JBT0132, se representa en la Figura 7. Se calculó que la EC50 de JBT0132 era de aproximadamente 2,2 nM.
Además, se realizó un ELISA de competición (IC50) usando péptidos de unión a TFPI biotinilados como "trazadores" para competir por la unión de TFPI con péptidos candidatos no biotinilados. El principio del ensayo se representa en la Figura 6B. Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos MaxiSorp (Nunc) con 3 pg/ml de TFPI en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,6) durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado (HNaT: NaCl 175 mM, HEPES 25 mM, CaCh5 mM, Tween 80 al 0,1%, pH 7,35), y se bloquearon con 200 pl de extracto de levadura al 2% en HNaT durante 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. Los péptidos trazadores biotinilados se aplicaron a una concentración correspondiente a sus valores de EC90 respectivos determinados en el ELISA de unión (mediana si n >2). Se diluyó una solución madre competitiva de péptido (10 mM) 1/33,3 en HNaT sin HSA, y se preparó una dilución 1/3 en serie con HNaT con DMSO al 3%. La dilución se diluyó adicionalmente con el péptido trazador biotinilado a una proporción de 1:6 (20 pl de dilución competidora y 100 pl de péptido trazador). La mezcla de péptido competidor y trazador se aplicó a la placa de microtitulación recubierta con TFPI y se incubó durante 1,5 horas. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. La unión péptido-TFPI se detectó aplicando estreptavidina conjugada con HRP a la placa de microtitulación, incubando la mezcla durante una hora, lavando la placa tres veces con 350 pl de HNaT, aplicando TMB (3,3'5,5'-tetrametilbencidina), y detectar la posterior conversión cromogénica de TMB por HRP. Los gráficos de IC50 para péptidos representativos no biotinilados se proporcionan en las Figuras 8A-8D. Las mediciones de IC50 de los péptidos JBT0303, JBT0120, y JBT0224 se describen en la Tabla 3.
TABLA 3
Figure imgf000037_0002
Además del ensayo ELISA (IC50) de competición, se empleó un ensayo de detección para medir números más altos de péptidos en paralelo. El ELISA de detección es similar al ELISA IC50 de competición, con la excepción de que solo se emplearon tres concentraciones diferentes del competidor (300 nM, 100 nM y 33,3 nM para la clase JBT0047, y 50000 nM, 16667 nM y 5556 nM para la clase JBT0122). En algunos casos, los resultados de la detección se expresaron como porcentaje de inhibición de la señal del trazador con respecto a un péptido competitivo (péptido competitivo JBT0477 para la familia JBT0047, y péptido competitivo JBT1697 para la familia JBT0122). Los resultados del ensayo de IC50 de competición y los resultados del ensayo de detección de los péptidos preparados y seleccionados de acuerdo con los métodos expuestos en la presente se proporcionan en las Figuras 32-39. Los valores medios de IC50 presentados en las Figuras 32-39 se basan en un mayor número de ensayos que los valores presentados en la Tabla 3 y, por lo tanto, los valores pueden diferir ligeramente. Los resultados del ELISA de detección se presentan como porcentaje de inhibición de la unión del péptido trazador JBT0131. Varios péptidos que se analizaron usando el ELISA de IC50 se clasifican en las Figuras 32-39 de acuerdo con su afinidad de unión como se describe en la Tabla 4.
TABLA 4
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Los péptidos de unión a TFPI ejemplares identificados usando los métodos descritos en la presente memoria se presentan en la Tabla 5. Algunos péptidos se biotinilaron, y muchos comprenden lisinas N- y C-terminales para promover la solubilidad. Varios péptidos mostraron actividad inhibidora de TFPI en modelos y/o sistemas de ensayos plasmáticos, como se describe a continuación.
TABLA 5
Figure imgf000037_0001
continuación
Figure imgf000038_0001
continuación
Figure imgf000039_0001
Este ejemplo proporciona métodos ejemplares de generación y caracterización de péptidos inhibidores de TFPI. Se descubrió que todos los péptidos en la Tabla 5 se unían a TFPI-1a humano. El análisis de mutaciones demostró que por lo menos un aminoácido en un péptido de unión a TFPI puede ser sustituido mientras mantiene la afinidad por TFPI. Los péptidos de la Tabla 5 probados en ensayos ELISA se unieron a TFPI-1a con una EC50 de menos de 10 pM (1 x10-5 M) y una IC50 de menos de 50 pM.
Ejemplo 2
Los péptidos de unión a TFPI seleccionados se caracterizaron adicionalmente en términos de unión "anti­ objetivo". Este ejemplo demuestra que los péptidos inhibidores de TFPI muestran una afinidad reducida para las proteínas que no son TFPI-1.
El TFPI-2 fue seleccionado como un anti-objetivo debido a su similitud con TFPI-1. La cinética de unión de los péptidos de unión a TFPI a TFPI-1 humano (residuos 29-282 fusionados en el extremo C-terminal a un marcador 10 His; MW41 kDa (R&D Systems, Minneapolis, MN; número de catálogo 2974-PI)) TFPI-1 murino (residuos 29-289 fusionados en el extremo C-terminal a un marcador 10 His; MW 41kDa (R&D Systems; número de catálogo 2975-PI)) y TFPI-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) se estudiaron usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie BIAcore 3000™ (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido). Las proteínas TFPI se inmovilizaron en un chip C1 (GE Healthcare, Código de pedido: BR-1005-40) mediante una química de acoplamiento de amina que apunta a 500 RU. Se emplearon varios péptidos de unión a TFPI como analitos para interactuar con las proteínas de TFPI inmovilizadas. Se usó un caudal de 30 pl/min. Después de 180 segundos, se inyectaron 180 pl de solución de pépptido a seis concentraciones diferentes que oscilaban entre 3,84 nM y 656,25 nM, seguido de un tiempo de disociación de 480 segundos. El chip se regeneró con 45 pl de NaOH 10 mM. Cada experimento de unión fue precedido y seguido de cuatro mediciones con tampón HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, P20 al 0,005%) más DMSO al 1% y P80 al 0,8%. Se usó el software BIAevaluation® Versión 4.1 (GE Healthcare) para analizar los datos. Los sensorgramas se ajustaron a una curva de unión de Langmuir 1:1 para determinar kon y koff y calcular Kd.
Ciertos péptidos probados, por ejemplo, JBT0050, JBT0121, JBT0205 y JBT0211, unidos a la célula en blanco y las constantes de unión de esos sensorgramas no pudieron determinarse. JBT0133 mostró una unión débil a TFPI-1. Los sensorgramas de otros péptidos dieron constantes de unión fiables. Los resultados del análisis BIAcore de varios péptidos inhibidores de TFPI se proporcionan en la Tabla 6 y las Figuras 19-21. Cada uno de los péptidos enumerados en la Tabla 6 presentó una Kd de menos de 10 pM. Los sensorgramas de dos de los péptidos se proporcionan como las Figuras 9A y 9B.
TABLA 6
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También se examinó la interacción con el anti-objetivo de TFPI-2. La señal máxima generada a partir de la interacción del péptido candidato con TFPI-2 humano fue mucho menor que las señales obtenidas con TFPI-1 como un compañero de interacción. El análisis cinético de las señales de unión a TFPI-2 bajas era propenso a errores; por lo tanto, se usó la comparación visual de sensorgramas para estimar la afinidad de unión. Se proporciona un sensorgrama que ilustra la unión de JBT0120 a TFPI-1 y TFPI-2 como las Figuras 10A y 10B. JBT0120 se une a TFPI-2 con una afinidad 10 veces menor en comparación con su afinidad de unión para TFPI-1. También se descubrió que JBT0132 mostraba por lo menos una afinidad 10 veces mayor para TFPI-1 que para TFPI-2.
Los datos proporcionados por este ejemplo confirman que los péptidos inhibidores de TFPI se unen específicamente a TFPI-1.
Ejemplo 3
El siguiente ejemplo describe la caracterización de la actividad inhibidora de TFPI de péptidos seleccionados identificados en el Ejemplo 1 usando un ensayo de inhibición de FXa e inhibición de la tenasa extrínseca. Ambos ensayos son predictivos de la actividad en sistemas plasmáticos. El ensayo de tenasa extrínseca da una idea de la influencia de los péptidos en (a) la interacción de FXa y TFPI y (b) la interacción del complejo FXa-TFPI con el complejo TF-FVIIa. El ensayo de inhibición de FXa mide la influencia de un péptido sobre la interacción de FXa y TFPI solamente.
El complejo de la tenasa extrínseca es responsable de la activación de FX y FIX al inicio del proceso de coagulación. El complejo extrínseco se compone de FVIIa, Factor Tisular (TF) y sustrato de FX. Para determinar la influencia de los péptidos sobre la inhibición mediada por TFPI del complejo de tenasa extrínseco, se estableció un ensayo enzimático acoplado. Los péptidos se diluyeron 1/6,25 a partir de stocks 10 mM (en DMSO) y se diluyeron adicionalmente por diluciones 1/4 en serie en DMSO para evitar la precipitación no deseada. El TFPI se diluyó en HNaCa-HSA (HEPES 25 mM; NaCl 175 mM; CaCh 5 mM; HSA al 0,1%; pH 7,35). FVIIa, TF lipidada, vesículas de fosfolípidos (DOPC/POPS 80/20) y sustrato cromogénico específico para FXa (S-2222 (disponible de DiaPharma, West Chester, OH)), se diluyeron todos en HNaCa-HSA, se añadieron a placas de 96 pocillos. Después de un período de incubación, se añadieron las diluciones de TFPI y de péptidos, dando como resultado una concentración final de DMSO al 2,5%. La activación de FX se inició añadiendo FX a los pocillos. La conversión del sustrato cromogénico mediado por FXa se determinó observando un aumento en la absorbancia usando un lector de microplacas. La cantidad de FXa generada en ciertos puntos temporales se calculó a partir de las lecturas de OD. El FXa generado a los 20 minutos después del inicio de la reacción se consideró para el cálculo de la EC50 a partir de gráficos de concentración de péptidos frente a la inhibición de TFPI (%).
La inhibición funcional de TFPI también se examinó usando un ensayo de inhibición de FXa. Se añadieron a placas de 96 pocillos un sustrato cromogénico específico de FXa (S-2222) y TFPI, ambos diluidos en HNaCa-HSA. Los péptidos se diluyeron a 1/6,25 a partir de stocks 10 mM (en DMSO) y se diluyeron adicionalmente por diluciones 1/4 en serie en DMSO para evitar la precipitación no deseada. Las diluciones de péptidos (2,5 pl) se añadieron a las placas de 96 pocillos, dando como resultado una concentración final del 2,5% de DMSO. La conversión del sustrato cromogénico se desencadenó mediante la adición de FXa, y la cinética de la conversión se midió en un lector de microplacas. Debido a que TFPI inhibe FXa lentamente, se consideraron las lecturas de OD después de 115 minutos para el cálculo de la EC50 a partir de gráficos de concentración de péptidos frente a la inhibición de TFPI (%).
Los resultados del ensayo de tenasa extrínseca y el ensayo de inhibición de FXa se proporcionan en la Tabla 7 y las Figuras 22-27.
TABLA 7
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En referencia a la Tabla 7, JBT0120, JBT0132 y JBT0224 restauraron la activación de FX mediada por el complejo extrínseco en presencia de TFPI-1 con una EC50 de <2 pM, lo que resultó en una inhibición de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 60% de la actividad de TFPI. jBt0047 (EC50 = 1,4 pM), JBT0131 (EC50 = 2,2 pM) y JBT0293 (EC50 = 2,9 pM) también restauraron la actividad del complejo extrínseco en presencia de TFPI-1. Además, JBT0120, JBT0132, JBT0224 y JBT0303 restauraron la actividad de FXa en presencia de TFPI-1 con una EC50 de <5 pM, lo que resultó en una inhibición de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50% de la actividad de TFPI, en el ensayo de inhibición de FXa. JBT0047 (EC50 = 0,7 pM), JBT0131 (EC50 = 8,2 pM), JBT0293 (EC50= 1,3 pM), JBT0297 (EC50 = 0,6 pM) y JBT0305 (EC50 = 2,3 pM) también restauraron la actividad de FXa en presencia de TFPI-1 en el ensayo de inhibición de FXa. Este ejemplo confirma que los péptidos de la invención son antagonistas de TFPI.
Ejemplo 4
En este ejemplo, se establece la actividad inhibidora de TFPI de los péptidos usando un ensayo basado en plasma.
Se midió por duplicado la influencia de los péptidos sobre la generación de trombina mediante trombografía automatizada calibrada en un lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia; filtros de excitación de 390 nm y emisión de 460 nm) después de la escisión lenta del sustrato fluorogénico específico de trombina Z-Gly-Gly-Arg-AMC (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). Se obtuvo plasma de pacientes con deficiencia de FVIII o FIX (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) para las pruebas. La actividad del factor de coagulación residual para cada uno de los plasmas fue inferior al 1%. Como modelo para la deficiencia de FVIII mediada por anticuerpos, se incubó plasma normal agrupado congelado (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) con plasma de FVIII antihumano de alto título, inactivado por calor y criado en cabra (4490 BU/ml; Baxter BioScience, Viena, Austria) dando lugar a 50 BU/ml. Los plasmas se mezclaron con inhibidor de tripsina de maíz (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) para inhibir la contaminación del Factor XIIa, resultando en una concentración final de 40 pg/ml.
Se añadió plasma precalentado (37° C) (80 pl) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (Immulon 2HB, fondo en U transparente; Thermo Electron, Waltham, MA). Para desencadenar la generación de trombina por el Factor Tisular, se añadieron 10 pl de reactivo bajo de PPP que contenía cantidades bajas (12 pM) de Factor Tisular humano recombinante y vesículas de fosfolípidos compuestas de fosfatidilserina, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina (48 pM) (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos). Los péptidos se diluyeron a 1/7,5 a partir de stocks 10 mM con DMSO, y se diluyeron adicionalmente a 1/8,33 con Aqua-Dest dando como resultado una concentración de DMSO del 12%, proporcionando una concentración de DMSO al 0,5% en la mezcla de ensayo final. Justo antes de colocar la placa en el lector precalentado (37° C), se añadieron 5 pl de solución salina tamponada con HEPES con 5 mg/ml de albúmina de suero humano (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA) o DMSO al 12% en Aqua-Dest, seguido de la adición de las diluciones de péptidos o proteínas de referencia (estándar de referencia FVIII Inmunate (Baxter BioScience, Viena, Austria); estándar de referencia de actividad de derivación del inhibidor del factor VIII (FEIBA) (Baxter BioScience, Viena, Austria); NovoSeven (Novo Nordisk, Dinamarca); y FIX de plasma humano purificado (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IL)). La generación de trombina se inició dispensando en cada pocillo 20 pl de reactivo FluCa (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) que contenía un sustrato fluorogénico y CaCh tamponado con HEPES (100 mM). La intensidad de fluorescencia se registró a 37° C.
Los parámetros de las curvas de generación de trombina resultantes se calcularon usando el software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) y el calibrador de trombina para corregir los efectos de filtro interno y consumo de sustrato (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). Para calcular la actividad generadora de trombina de ciertas concentraciones de péptidos equivalentes a las proteínas de referencia (por ejemplo, el estándar de referencia FVIII Immunate®, el estándar de referencia FEIBA), se trazaron las cantidades de trombina en el pico de cada curva de generación de trombina (pico de trombina, nM) frente a las concentraciones estándar, y se ajustaron mediante un algoritmo no lineal. En base a esta calibración, se calcularon las actividades equivalentes de FVIII Immunate, FIX, FEIBA o NovoSeven. Los resultados para varios péptidos se proporcionan en las Figuras 12-18 y 28-30. En la Tabla 8 se proporcionan resultados representativos (* denota que se obtuvo plasma deficiente en FVIII de un donante diferente).
TABLA 8
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Con referencia a la Tabla 8, JBT0120, JBT0132, JBT0224 y JBT0303 mejoraron la generación de trombina dependiente de TFPI en plasma desprovisto de FVIII a niveles que excedían el 1% del nivel de generación de trombina en plasma que contenía FVIII (% de actividad equivalente de FVIII). Los péptidos probados mostraron aproximadamente un 5%-40% de actividad equivalente en plasma deficiente en FVIII. JBT0120 y JBT0132 mejoraron la trombina máxima y el tiempo máximo, dependiendo de la dosis, como se ilustra en las Figuras 11A y 11B.
Ejemplo 5
El siguiente ejemplo demuestra que los péptidos de la invención pueden modificarse mediante la adición de fracciones que mejoran las propiedades fisicoquímicas o farmacocinéticas de los péptidos. Como se ilustra a continuación, la adición de PEG de 40 kDa a los péptidos descritos en la presente memoria mejoró dramáticamente el comportamiento farmacocinético de los péptidos.
En la técnica se conocen métodos para conjugar fracciones químicas o biológicas con péptidos. Para añadir PEG (polietilenglicol) a los péptidos descritos en la presente, se añadió un grupo funcional (AOA = acetato de aminooxi) al extremo N-terminal de los péptidos para el acoplamiento a aldehídos y cetonas. Alternativamente, se añadió una cisteína a la parte C-terminal del péptido para el acoplamiento con maleimida (Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). Los péptidos (JBT1586) AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 166) y (JBT1587) Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167) se usaron para la modificación N-terminal y C-terminal con PEG, respectivamente. AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 166) y Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167) se incubaron con un exceso de mPEG-Propionaldehido de 40 kDa (SUNBRIGHT ME-400, SUNBRIGHT ME-400 Japón) y mPEG-maleimida de 40 kDa (SUNBRIGHT ME-400MA, nOf , Japón), respectivamente. Los péptidos PEGilados resultantes, JBT1853 y JBT1855, muestran afinidades similares en comparación con la estructura de partida Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (JBT0740) (SEQ ID NO: 66).
Los péptidos PEGilados resultantes demostraron una estabilidad en plasma significativamente aumentada y una vida media en plasma prolongada en ratones. La Figura 31 ilustra los resultados de un análisis farmacocinético del péptido libre JBT0740 (Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 66) en comparación con el péptido PEGilado C-terminal JBT1855 ((Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG(40kD))-NH2) (SEQ ID NO: 252). Al contrario que el péptido no PEGilado, el péptido PEGilado está presente a altas concentraciones en plasma de ratón a los 100 minutos después de la administración. El péptido no PEGilado se depura rápidamente del plasma.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un péptido que se une e inhibe la actividad del Inhibidor de la Vía del Factor Tisular-1a (TFPI-1a), que comprende la siguiente estructura de fórmula (I):
    X1001 -X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X10 10-X1011-
    X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020 (I)
    (SEQ ID NO: 3116):
    en donde X1001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhf, C, F, H, I, K, L, M, N, Nmf, Q, R, T, V, W e Y;
    en donde X1002 es Q;
    en donde X1003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhs, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhk, C, E, F, G, H, I, K, k, M, N, Nmk, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, A, Aib, Bal, C, D, d, E, F, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Btq, C, D, E, G, H, I, K, M, N, Q, R, ST, V, W e Y;
    en donde X1007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, F, I, L, Nmv, P, Q, S, V, W e Y; en donde X1008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H, W e Y;
    en donde X1009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, f, I, S y V;
    en donde X1010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, C, K, G y Nmg;
    en donde X1012 es Y;
    en donde X1013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, E, F, H, L, M, Q, R, W e Y;
    en donde X1014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhe, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1015 es R;
    en donde X1016 es L;
    en donde X1017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, Dab, Dap, E, Eag, Eew, G, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Bal, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
    en donde X1019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Bhk, K y R; y
    en donde X1020 está presente o ausente, por lo que en caso de que X1020 esté presente es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, Bhl, C, F, H, I, K, L, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y; y
    en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 70% de identidad con:
    Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 178).
    2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
    en donde X1001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, L, Y y M;
    en donde X1002 es Q;
    en donde X1003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, Q, R, S, T y C;
    en donde X1004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Aib, K, P, R, E, G, I, Y, M y W; en donde X1005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Nmg, p, Q, R, A, E, C y M;
    en donde X1006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, G, H, K, N, Q, R, S y M;
    en donde X1007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I y V;
    en donde X1008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de F, H e Y; en donde X1009 es V; en donde X1010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, D, E, K, M, N, Q, R, F, H, P, S, V, W e Y;
    en donde X1011 es G;
    en donde X1012 es Y;
    en donde X1013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de C y F;
    en donde X1014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, C, D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V y Aib; en donde X1015 es R;
    en donde X1016 es L;
    en donde X1017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, Aib, C, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S y M;
    en donde X1018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A, L, N, M y R;
    en donde X1019 es K; y
    en donde X1020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K y L.
    3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad, preferiblemente por lo menos un 90% de identidad, más preferiblemente un 100% de identidad, con la secuencia de aminoácidos:
    Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 178).
    4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende la siguiente estructura de fórmula (II):
    X1000-X1001 -X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-
    X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019 (II) (SEQ ID NO:
    3122)
    en donde X1000 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de A, E y P y en donde cada uno de X1001 a X1019 es como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
    5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende la siguiente estructura de fórmula (III):
    X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-IA/-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-
    X1017-X1018-K-K/L (III)
    (SEQ ID NO: 3117);
    en donde cada uno de X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1008, X1010, X1014, X1017 y X1018 es como se define en la reivindicación 1 o 2.
    6. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 que comprende además uno o más aminoácidos N-terminales directamente enlazados a X1001, en donde los aminoácidos N-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de
    X1000,
    X999-X1000,
    X998-X999-X1000,
    X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3123),
    X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3124),
    X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3125),
    X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3126),
    X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3127),
    X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3128),
    X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3129), y
    X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3130),
    en donde X1000 es A o K, X999 es V o K, X998 es Q o K, X997 es L o K, X996 es R o K, X995 es G o K, X994 es V o K, X993 es G o K, X992 es S o K, X991 es K y X990 es K.
    7. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 que comprende además uno o más aminoácidos C-terminales directamente enlazados a X1020, en donde los aminoácidos C-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de
    X1021,
    X1021-X1022,
    X1021-X1022-X1023, y
    X1021-X1022-X1023-X1024 (SEQ ID NO: 3131),
    en donde X1021 es T o K, X1022 es S o K, X1023 es K, y X1024 es K.
    8. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4-7, en donde el péptido contiene por lo menos dos residuos de cisteína, en donde los por lo menos dos residuos de cisteína están separados por al menos tres residuos de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas (I) a (III) y en donde los por lo menos dos residuos de cisteína forman juntos un enlace disulfuro intramolecular.
    9. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 60% de identidad con la secuencia de fórmula IV:
    Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (IV) (SEQ ID NO: 164).
    10. El péptido de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la identidad de la secuencia de aminoácidos es por lo menos de un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.
    11. el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la IC50 del péptido es menor que 1000 nM.
    12. Un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8-56, 58-82, 84-127, 130-178, 183-188, 190-195, 197-200, 202-242, 244-252, 256-270, 273-275, 277, 279-289, 291-292, 294-295, 297-302, 305-312, 314-340, 342-394, 396-404, 407-409, 412, 414, 415, 417-422, 424-425, 428, 431-432, 434, 440-442, 445-450, 452, 455-458, 471, 472, 474-475,480, 482, 484, 488, 490, 491, 494-496, 498, 500­ 502, 505-507, 509, 511-513, 517-519, 523-524, 527, 530, 532, 533, 536, 538-540, 545, 548-550, 553-559, 563-565, 568-572, 576-577, 579-581, 584-603, 605-616, 618-624, 626-627, 630, 632, 633, 635-643, 645-648, 650-656, 658, 660, 662-671,690, 692, 693, 698, 701-709, 720, 724, 725, 731, 736-740, 747, 765, 795, 811, 817, 938 y 953.
    13. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el péptido se conjuga con un polímero soluble en agua.
    14. El péptido de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG).
    15. El péptido de acuerdo con la reivindicación 12 fusionado, enlazado por un dominio de multimerización, o unido mediante enlace químico a uno o más segundos péptidos de acuerdo con la reivindicación 13.
    16. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto.
    17. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el método es para el tratamiento de un trastorno hemorrágico provocado por una actividad de coagulación sanguínea deficiente o una actividad plaquetaria deficiente.
    18. Una composición farmacéutica que comprende un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un portador farmacéuticamente aceptable.
    19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la composición farmacéutica es para su uso en un método como se define en la reivindicación 16 o 17.
    20. El péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el diagnóstico in vivo de un sujeto que padece una enfermedad o que está en riesgo de padecer una enfermedad, en donde el péptido se conjuga con una fracción detectable y se administra al sujeto, y la detección de la fracción detectable indica que el sujeto padece una enfermedad o está en riesgo de padecer una enfermedad.
    21. Un método para purificar TFPI, en donde el método comprende
    a) poner en contacto una muestra que contiene TFPI con un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 bajo condiciones apropiadas para formar un complejo entre el TFPI y el péptido; b) eliminar el complejo de la muestra; y, opcionalmente,
    c) disociar el complejo para liberar TFPI.
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