ES2648865T3 - Cepas de levadura manipuladas para producir etanol a partir de ácido acético y glicerol - Google Patents

Abstract

Un proceso de producción de etanol, por el que el proceso comprende la etapa de fermentar un medio con una célula de levadura, por el que el medio contiene o se alimenta con: a) una fuente de al menos una de una hexosa y una pentosa; b) una fuente de ácido acético; y, c) una fuente de glicerol, por el que la célula de levadura fermenta ácido acético, glicerol y al menos una de la hexosa y pentosa en etanol, y opcionalmente, recuperación del etanol, por el que la célula de levadura comprende un gen exógeno que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de convertir el ácido acético en etanol, y por el que la célula de levadura comprende un gen bacteriano que codifica una enzima con actividad de glicerol deshidrogenasa unida a NAD+, y en el que la célula de levadura comprende una modificación genética que aumenta la actividad específica de dihidroxiacetona cinasa, en el que la célula de levadura no es una célula de levadura que comprende una modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula, en el que el aumento o reducción de una actividad específica de una enzima particular es un aumento o disminución en comparación con la actividad específica de esa enzima en una célula de levadura no mutada por lo demás idéntica.

Description

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Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Polaromonas sp. JS666

68 %

Burkholderia phytofirmans PsJN

70 %

Rhodococcus opacus B4

64 %

Preferentemente, la célula hospedadora comprende un gen exógeno que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad para convertir el ácido acético en etanol. La ventaja de uso de una enzima bifuncional con actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa en lugar de separar enzimas para cada una de las actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, es que permite que la directa canalización del producto intermedio entre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en una vía ofrezca la posibilidad de un medio eficiente, exclusivo y protegido de administración de metabolitos. La canalización de sustratos disminuye así el tiempo de tránsito de los productos intermedios, previene la pérdida de productos intermedios por difusión, protege los productos intermedios lábiles del disolvente, y anticipa la entrada de productos intermedios en las vías metabólicas de competición. La enzima bifuncional, por tanto, permite una conversión más eficiente de ácido acético en etanol en comparación con las enzimas acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa separadas. Una ventaja adicional de uso de la enzima bifuncional es que también puede usarse en células hospedadoras que tienen poca o ninguna actividad de alcohol deshidrogenasa en la condición usada, tal como, por ejemplo, condiciones anaerobias y/o condiciones de represión de catabolitos.

Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son procariotas y protozoarios conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, las enzimas bifuncionales codificadas por los genes adhE de Escherichia coli y ADH2 de Entamoeba histolytica (véase, por ejemplo, Bruchaus and Tannich, 1994, J. Biochem. 303: 743-748; Burdette and Zeikus, 1994, J. Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett. 27: 505-510; Yong et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6464-6469). Las enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son proteínas más grandes que consisten en aproximadamente 900 aminoácidos y son bifuncionales por que presentan tanto actividad de acetaldehído deshidrogenasa (ACDH; EC 1.2.1.10) como de alcohol deshidrogenasa (ADH; EC 1.1.1.1). adhE de E. coli y ADH2 de Entamoeba histolytica muestran el 45 % de identidad de aminoácidos. Por tanto, en una realización de la invención, un gen exógeno adecuado que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 3 y 5. Ejemplos adecuados de procariotas que comprenden enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa se proporcionan en las Tablas 2 y 3. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas bifuncionales están disponibles en bases de datos públicas y pueden ser usadas por el experto para diseñar secuencias de nucleótidos de codón optimizado que codifican la enzima bifuncional correspondiente (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o 6).

Tabla 2: Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa relacionadas con adhE de E. coli 5

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Escherichia coli O157:H7 str. Sakai

100 %

Shigella sonnei

100 %

Shigella dysenteriae 1012

99 %

Klebsiella pneumoniae 342

97 %

Enterobacter sp. 638

94 %

Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001

90 %

Serratia proteamaculans 568

90 %

Pectobacterium carotovorum WPP14

90 %

Sodalis glossinidius str. 'morsitans'

87 %

Erwinia tasmaniensis Et1/99

86 %

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Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Aeromonas hydrophila ATCC 7966

81 %

Vibrio vulnificus YJ016]

76 %

Tabla 3: Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa relacionadas con ADH2 de Entamoeba histolytica

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Entamoeba histolytica HM-1:IMSS

99 %

Entamoeba dispar SAW760

98 %

Mollicutes bacterium D7

65 %

Fusobacterium mortiferum ATCC 9817

64 %

Actinobacillus succinogenes 130Z

63 %

Pasteurella multocida Pm70

62 %

Mannheimia succiniciproducens MBEL55E

61 %

Streptococcus sp. 2_1_36FAA]

61 %

El gen exógeno que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, una enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa, preferentemente es una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima operativamente unida a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para garantizar la expresión de la enzima tras la transformación de la construcción de expresión en la célula hospedadora de levadura de la invención. Así, el gen

o construcción de expresión comprenderá al menos un promotor que es funcional en la célula hospedadora operativamente unido a la secuencia codificante. El gen o construcción puede comprender además una secuencia conductora de 5' en la dirección 5' de la región codificante y una secuencia no traducida de 3' (extremo 3') que comprende un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción en la dirección 3' de la secuencia codificante. Métodos de preparación o construcción de las células de levadura de la invención se desvelan además en el presente documento. Para este fin, se usan técnicas de biología genética y molecular estándar que son generalmente conocidas en la técnica y han sido descritas, por ejemplo, por Sambrook y Russell (2001, "Molecular cloning: A laboratory manual" (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al. (1987, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York). Además, la construcción de cepas de levadura hospedadoras mutadas se lleva a cabo por cruces genéticos, esporulación de los diploides resultantes, disección de tétradas de las esporas haploides que contienen los marcadores auxotróficos deseados, y purificación de colonias de tales levaduras hospedadoras haploides en el medio de selección apropiado. Todos estos métodos son métodos genéticos de levadura estándar conocidos para aquellos en la materia. Véase, por ejemplo, Sherman et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1978) y Guthrie et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991).

Promotores adecuados para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tienen actividad de acetaldehído deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa (además de otras enzimas, véase más adelante) incluyen promotores que son preferentemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferentemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Los promotores que tienen estas características están ampliamente disponibles y son conocidos para el experto. Ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, por ejemplo, promotores de genes glucolíticos tales como los promotores de fosfofructocinasa (PPK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GDP, TDH3 o GAPDH), piruvato cinasa (PYK), de fosfoglicerato cinasa (PGK), del promotor de glucosa-6-fosfato isomerasa (PGI1) de levaduras. Más detalles sobre tales promotores de levadura pueden encontrarse en (documento WO 93/03159). Otros promotores útiles son promotores del gen que codifica proteína ribosómica (TEF1), el promotor del gen de lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y similares), el promotor de enolasa (ENO) y el promotor del transportador de hexosa (glucosa) (HXT7). Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa se expresa en exceso en condiciones anaerobias usando un promotor anóxico tal como, por ejemplo, el promotor ANB1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 19). Otros promotores, tanto

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constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias activadoras en la dirección 5', serán conocidos para aquellos expertos en la materia. Preferentemente, el promotor que está operativamente unido a la secuencia de nucleótidos como se ha definido anteriormente es homólogo a la célula hospedadora. Secuencias terminadoras adecuadas son obtenibles, por ejemplo, del gen de citocromo c1 (CYC1) o un gen de alcohol deshidrogenasa (por ejemplo, ADH1).

Para aumentar la probabilidad de que la enzima que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa se exprese a niveles suficientes y en forma activa en las células hospedadoras de levadura transformadas de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica estas enzimas, además de otras enzimas (véase más adelante), se adapta preferentemente para optimizar su uso de codones al de la célula hospedadora en cuestión. La capacidad de adaptación de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima al uso de codones de una célula hospedadora puede expresarse como el índice de adaptación de codones (IAC). El índice de adaptación de codones se define en el presente documento como una medición de la capacidad de adaptación relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes altamente expresados en una célula hospedadora u organismo particular. La capacidad de adaptación relativa (w) de cada codón es la relación del uso de cada codón, con la del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice IAC se define como la media geométrica de estos valores de capacidad de adaptación relativa. Se excluyen codones y codones de terminación no sinónimos (dependientes del código genético). Los valores de IAC oscilan de 0 a 1, indicando valores más altos una proporción más alta de los codones más abundantes (véanse Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; véase también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada preferentemente tiene un IAC de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9. Las preferidas son las secuencias que han sido optimizadas en codones para la expresión en la célula hospedadora fúngica en cuestión tal como, por ejemplo, células de S. cerevisiae.

La secuencia de nucleótidos codifica una enzima que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa que se expresa preferentemente en forma activa en la célula hospedadora transformada. Así, la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula hospedadora produce una acetaldehído deshidrogenasa con una actividad específica de al menos 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 o 0,10 µmol min-1 (mg de proteína)-1, determinada como la velocidad dependiente de acetil-CoA de la reducción de NADH en extractos de células de la célula hospedadora transformada a 30 ºC como se describe en los ejemplos en el presente documento.

La célula hospedadora que va a transformarse con una construcción de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con acetaldehído deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa es una célula hospedadora de levadura. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula cultivada. La célula hospedadora de levadura de la invención, preferentemente es hospedador capaz de transporte activo o pasivo de pentosa (xilosa y preferentemente también arabinosa) en la célula. La célula hospedadora contiene preferentemente glicólisis activa. La célula hospedadora puede contener además preferentemente una vía de pentosa fosfato endógena y puede contener actividad de xilulosa cinasa endógena de manera que la xilulosa isomerizada a partir de xilosa puede ser metabolizada a piruvato. El hospedador contiene además preferentemente enzimas para la conversión de una pentosa (preferentemente mediante piruvato) en un producto de fermentación deseado tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propano-diol, butanoles (1butanol, 2-butanol, isobutanol) y productos derivados de isoprenoide. Una célula hospedadora particularmente preferida es una célula de levadura que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaerobia. La célula hospedadora de levadura adicional preferentemente tiene una alta tolerancia al etanol, una alta tolerancia a pH bajo (es decir, capaz de crecimiento a un pH inferior a 5, 4, o 3) y hacia ácidos orgánicos como ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico y productos de degradación de azúcar tales como furfural e hidroxi-metilfurfural, y una alta tolerancia a temperaturas elevadas. Cualquiera de estas características o actividades de la célula hospedadora de levadura pueden estar naturalmente presentes en la célula hospedadora o pueden introducirse o modificarse por modificación genética, preferentemente por auto-clonación o por los métodos descritos a continuación.

Levaduras se definen en el presente documento como microorganismos eucariotas e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Yeasts: characteristics and identification, J.A. Barnett, R.W. Payne, D. Yarrow, 2000, 3ª ed., Cambridge University Press, Cambridge RU; y, The yeasts, a taxonomic study, C.P. Kurtzman and J.W. Fell (eds) 1998, 4ª ed., Elsevier Science Publ. B.V., Ámsterdam, Los Países Bajos) que crecen predominantemente en forma unicelular. Las levaduras pueden o bien crecer por gemación de un talo unicelular o bien crecer por fisión del organismo. Células de levadura preferidas para su uso en la presente invención pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia. Preferentemente, la levadura es capaz de fermentación anaerobia, más preferentemente fermentación alcohólica anaerobia. A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de producción de bioetanol importantes han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productor de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para procesos industriales, es decir, una alta tolerancia a ácidos, etanol y osmotolerancia, capacidad de crecimiento anaerobio, y, por supuesto, su alta capacidad fermentativa alcohólica. Especies de levadura preferidas como células hospedadoras incluyen S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombe. La célula hospedadora de levadura de la invención comprende además una modificación genética que 9 10

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introduce actividad de glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ en la célula. La glicerol deshidrogenasa codificada por el gen GCY1 de levadura endógeno parece ser específica para el cofactor NADP+ (EC 1.1.1.72), a diferencia de NAD+ (EC 1.1.1.6). Levaduras tales como S. cerevisiae parecen carecer de actividad de glicerol deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.1.1.6) (véase, por ejemplo, la vía de KEGG 00561). Una glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción química (EC 1.1.1.6):

glicerol + NAD+ ↔ glicerona + NADH + H+

Otros nombres en uso común incluyen glicerina deshidrogenasa y glicerol:NAD+ 2-oxidoreductasa. La modificación genética que introduce actividad de glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ en la célula hospedadora es la expresión de una glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ que es heteróloga a la célula hospedadora de levadura. La secuencia de nucleótidos para la expresión de una glicerol deshidrogenasa heteróloga en las células de levadura de la invención es una secuencia que codifica una glicerol deshidrogenasa bacteriana que usa NAD+ como cofactor (EC 1.1.1.6). Un ejemplo adecuado de una glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ bacteriana para la expresión en una célula hospedadora de levadura de la invención es, por ejemplo, el gen gldA de E. coli descrito por Truniger y Boos (1994, J Bacteriol. 176(6):1796-1800), cuya expresión en levadura ya se ha informado (Lee y Dasilva, 2006, Metab Eng. 8(1):58-65). Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una glicerol deshidrogenasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 7 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tienen una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 7. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase anteriormente) que codifica la glicerol deshidrogenasa heteróloga se expresa en exceso, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicerol deshidrogenasa de SEQ ID NO: 7. Una secuencia de nucleótidos optimizada en codones tal se proporciona, por ejemplo, en SEQ ID NO: 21 (posiciones 10 -1113; IAC = 0,976).

Para la expresión en exceso de la secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa, la secuencia de nucleótidos (que va a expresarse en exceso) se pone en una construcción de expresión en la que está operativamente unida a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para garantizar la expresión en exceso de la enzima glicerol deshidrogenasa tras la transformación de la construcción de expresión en la célula hospedadora de levadura de la invención (véase anteriormente). Promotores adecuados para la expresión (en exceso) de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de glicerol deshidrogenasa incluyen promotores que son preferentemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferentemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan anteriormente. La expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula hospedadora produce una actividad de glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ específica de al menos 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, o 5,0 U min-1 (mg de proteína)-1, determinada en extractos de células de las células hospedadoras transformadas a 30 ºC como se describe en los ejemplos en el presente documento. La célula hospedadora de levadura de la invención comprende además una modificación genética que aumenta la actividad específica de dihidroxiacetona cinasa en la célula. Datos de transcriptomas han mostrado que la dihidroxiacetona cinasa DAK1 endógena ya se expresa a altos niveles en S. cerevisiae. Sin embargo, para velocidades de conversión óptimas, la célula hospedadora de levadura de la invención comprende así una modificación genética que aumenta la actividad específica de dihidroxiacetona cinasa en la célula. Una dihidroxiacetona cinasa se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción química (EC 2.7.1.29):

ATP + glicerona ↔ ADP + glicerona fosfato

Otros nombres en uso común incluyen glicerona cinasa, ATP:glicerona fosfotransferasa y acetol cinasa (fosforilante). Se entiende que la glicerona y dihidroxiacetona son la misma molécula. Preferentemente, la modificación genética produce la expresión en exceso de una dihidroxiacetona cinasa, por ejemplo por expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona cinasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona cinasa puede ser endógena a la célula o puede ser una dihidroxiacetona cinasa que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que pueden usarse para la expresión en exceso de dihidroxiacetona cinasa en las células de la invención son, por ejemplo, los genes de dihidroxiacetona cinasa de S. cerevisiae (DAK1) y (DAK2) como se describe, por ejemplo, por Molin et al. (2003, J. Biol. Chem. 278:1415-1423). Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona cinasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 8 y 9. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase anteriormente) que codifica la dihidroxiacetona cinasa se expresa en exceso, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la dihidroxiacetona cinasa de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la dihidroxiacetona cinasa de SEQ ID NO: 9. Una secuencia de nucleótidos preferida para la expresión en exceso de una dihidroxiacetona cinasa es una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona cinasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 8

(S. cerevisiae (DAK1) o que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 8.

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Secuencias de nucleótidos que pueden usarse para la expresión en exceso de una dihidroxiacetona cinasa heteróloga en las células de la invención son, por ejemplo, secuencias que codifican dihidroxiacetona cinasas bacterianas tales como el gen dhaK de Citrobacter freundii descrito, por ejemplo, por Daniel et al. (1995, J. Bacteriol. 177:4392-4401). Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona cinasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 25 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tienen una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 25. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase anteriormente) que codifica la dihidroxiacetona cinasa heteróloga se expresa en exceso, tal como por ejemplo una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la secuencia de aminoácidos de la dihidroxiacetona cinasa de SEQ ID NO: 25. Una secuencia de nucleótidos optimizada en codones tal se proporciona, por ejemplo, en SEQ ID NO: 26 (posiciones 10 -1668).

Para la expresión en exceso de la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona cinasa, la secuencia de nucleótidos (que va a expresarse en exceso) se pone en una construcción de expresión en la que está operativamente unida a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para garantizar la expresión en exceso de la enzima dihidroxiacetona cinasa tras la transformación de la construcción de expresión en la célula hospedadora de la invención (véase anteriormente). Promotores adecuados para la expresión (en exceso) de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de dihidroxiacetona cinasa incluyen promotores que son preferentemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferentemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan anteriormente. En las células de la invención, una dihidroxiacetona cinasa que va a expresarse en exceso se expresa preferentemente en exceso al menos un factor 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Preferentemente, la dihidroxiacetona cinasa se expresa en exceso en condiciones anaerobias por al menos un factor 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel en estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica en la célula), el nivel en estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel en estado estacionario del transcrito que codifica la enzima en la célula. La expresión en exceso de la secuencia de nucleótidos en la célula hospedadora produce una actividad de dihidroxiacetona cinasa específica de al menos 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 o 0,05 U min-1 (mg de proteína)1, determinada en extractos de células de las células hospedadoras transformadas a 30 ºC como se describe en los ejemplos en el presente documento.

En una realización adicional, la célula hospedadora de levadura de la invención comprende además una modificación genética que aumenta el transporte de glicerol en la célula. Preferentemente, la modificación genética que aumenta el transporte de glicerol en la célula preferentemente es una modificación genética que produce la expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de una proteína de captación de glicerol y un canal de glicerol.

Una proteína de captación de glicerol se entiende en el presente documento como una proteína que atraviesa múltiples membranas que pertenece a la incluida en la superfamilia de O-aciltransferasas unidas a membrana (MBOAT) que incluye, por ejemplo, las proteínas de captación de glicerol de S. cerevisiae codificadas por los genes GUP1 y GUP2. Preferentemente, la modificación genética produce la expresión en exceso de una proteína de captación de glicerol, por ejemplo por expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de captación de glicerol. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol puede ser endógena a la célula o puede ser una proteína de captación de glicerol que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que pueden usarse para la expresión en exceso de proteína de captación de glicerol en las células de la invención son, por ejemplo, los genes de la proteína de captación de glicerol de S. cerevisiae (GUP1) y (GUP2) y ortólogos de los mismos como se describe, por ejemplo, por Neves et al. (2004, FEMS Yeast Res. 5:51-62). Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 10 (Gup1p) y 11 (Gup2p). En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase anteriormente) que codifica la proteína de captación de glicerol se expresa en exceso, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de captación de glicerol SEQ ID NO: 10 o una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de captación de glicerol de SEQ ID NO: 11. Aunque la naturaleza exacta de la influencia de GUP1 sobre el transporte de glicerol todavía no está clara, Yu et al. (2010, arriba) han mostrado que la expresión en exceso de GUP1 en S. cerevisiae mejora la producción de etanol en células cultivadas en glicerol. Una secuencia de nucleótidos preferida para la expresión en exceso de una proteína de captación de glicerol es, por tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de captación de glicerol que es capaz de rescatar el fenotipo asociado al estrés por sales de un mutante gup1Δ de S. cerevisiae por complementación como se describe por Neves et al. (2004, arriba). Tales ortólogos de complementación de GUP1 de S. cerevisiae incluyen secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 60, 68, 72, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y pueden obtenerse a partir de especies de levadura que pertenecen a los géneros

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de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia.

Un canal de glicerol se entiende en el presente documento como un miembro de la familia MIP de proteínas de canales revisado por Reizer et al. (1993, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28: 235-257), cuyas proteínas de canales comprenden un dominio transmembranario de 250 -280 aminoácidos que consiste en seis dominios que atraviesan la membrana y tienen al menos el 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de aminoácidos, o al menos el 55, 60, 65, 70, 80, 90, 95, 98 o 99 % de similitud de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de SEQ ID NO: 12, la acuagliceroporina de FPS1 de S. cerevisiae. Secuencias de nucleótidos que pueden usarse para la expresión en exceso de un canal de glicerol en las células de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que codifican el gen FPS1 de acuagliceroporina de levadura de, por ejemplo, S. cerevisiae (Van Aelst et al., 1991, EMBO J. 10:2095-2104) y ortólogos del mismo de otras levaduras que incluyen Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus y Zygosaccharomyces rouxii como se describe, por ejemplo, por Neves et al. (2004, arriba). Sin embargo, el uso de canales de glicerol bacteriano o de planta no se excluye, por ejemplo, Luyten et al. (1995, EMBO J. 14:1360-1371) han mostrado que el facilitador de glicerol de

E. coli, que tiene solo el 30 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de la acuagliceroporina de FPS1 de S. cerevisiae, puede complementar la captación de glicerol en un mutante fps1Δ de S. cerevisiae. La secuencia de nucleótidos que codifica el canal de glicerol puede ser endógena a la célula

o puede ser un canal de glicerol que es heterólogo a la célula. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase anteriormente) que codifica el canal de glicerol se expresa en exceso, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la acuagliceroporina de SEQ ID NO: 12.

Para la expresión en exceso de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol y/o la proteína de canales de glicerol, la secuencia de nucleótidos (que va a expresarse en exceso) se pone en una construcción de expresión en la que está operativamente unida a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para garantizar la expresión en exceso de la proteína de captación de glicerol y/o la proteína de canales de glicerol tras la transformación de la construcción de expresión en la célula hospedadora de la invención (véase anteriormente). Promotores adecuados para la expresión (en exceso) de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol y/o la proteína de canales de glicerol incluyen promotores que son preferentemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferentemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan anteriormente. En las células de la invención, una proteína de captación de glicerol y/o una proteína de canales de glicerol que va a expresarse en exceso se expresan preferentemente en exceso al menos un factor 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Preferentemente, la proteína de captación de glicerol y/o la proteína de canales de glicerol se expresan en exceso en condiciones anaerobias al menos un factor 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel en estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica en la célula), el nivel en estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel en estado estacionario del transcrito que codifica la enzima en la célula.

En una realización preferida de la célula hospedadora de la invención, la expresión de la proteína de canales de glicerol como se ha definido anteriormente se reduce o inactiva. Una modificación genética que reduce o que inactiva la expresión de la proteína de canales de glicerol puede ser útil para reducir o prevenir el transporte de glicerol fuera de la célula. Preferentemente, la reducción o inactivación de la expresión de la proteína de canales de glicerol se combina con la expresión en exceso de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol como se ha definido anteriormente.

En una realización adicional, la célula hospedadora de la invención comprende además una modificación genética que aumenta la actividad de acetil-CoA sintetasa específica en la célula, preferentemente en condiciones anaerobias ya que esta actividad es limitante de la velocidad en estas condiciones. Acetil-CoA sintetasa o acetato-CoA ligasa (EC 6.2.1.1) se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza la formación de un nuevo enlace químico entre el acetato y la coenzima A (CoA). Preferentemente, la modificación genética produce la expresión en exceso de una acetil-CoA sintetasa, por ejemplo, por expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa puede ser endógena a la célula o puede ser una acetil-CoA sintetasa que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que pueden usarse para la expresión en exceso de acetil-CoA sintetasa en las células de la invención son, por ejemplo, los genes de acetil-CoA sintetasa de S. cerevisiae (ACS1 y ACS2) como se describen, por ejemplo, por de Jong-Gubbels et al. (1998, FEMS Microbiol Lett. 165: 15-20). Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 13 y 14.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que se expresa en exceso codifica una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad por acetato. El uso de una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad por acetato se prefiere para condiciones en las que hay una concentración relativamente baja de ácido acético en el medio de cultivo, por ejemplo, no más de 2 g de ácido acético/l de medio de cultivo. Una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad por

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1593); los genes MIG1 o MIG2 de S. cerevisiae; genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de glicerol tales como los genes glicerol-fosfato deshidrogenasa 1 y/o 2 de S. cerevisiae; u ortólogos (de hibridación) de estos genes en otras species. Otras modificaciones adicionalmente preferidas de células hospedadoras para la fermentación de xilosa se describen en van Maris et al. (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418), documentos WO2006/009434, WO2005/023998, WO2005/111214 y WO2005/091733. Cualquiera de las modificaciones genéticas de las células como se describen en el presente documento se introducen o modifican preferentemente, en la medida de lo posible, por modificación genética de auto-clonación.

Una célula hospedadora preferida según la invención tiene la capacidad de crecer sobre al menos una de xilosa y arabinosa como fuente de carbono/energía, preferentemente como única fuente de carbono/energía, y preferentemente en condiciones anaerobias, es decir, condiciones como se definen en el presente documento más adelante para el proceso de fermentación anaerobia. Preferentemente, cuando crece sobre xilosa como fuente de carbono/energía, la célula hospedadora esencialmente no produce xilitol, por ejemplo, el xilitol producido está por debajo del límite de detección o, por ejemplo, es inferior al 5, 2, 1, 0,5, o 0,3 % del carbono consumido en una base molar. Preferentemente, cuando crece sobre arabinosa como fuente de carbono/energía, la célula esencialmente no produce arabinitol, por ejemplo, el arabinitol producido está por debajo del límite de detección o, por ejemplo, es inferior al 5, 2, 1, 0,5 o 0,3 % del carbono consumido en una base molar.

Una célula hospedadora preferida de la invención tiene la capacidad de crecer sobre una combinación de: a) al menos uno de una hexosa y una pentosa; b) ácido acético; y c) glicerol a una velocidad de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 o 0,3 h-1 en condiciones aerobias, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 o 0,2 h-1 en condiciones anaerobias. Por tanto, preferentemente, la célula hospedadora tiene la capacidad de crecer sobre al menos una de xilosa y arabinosa como única fuente de carbono/energía a una velocidad de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 o 0,3 h-1 en condiciones aerobias, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 o 0,2 h-1 en condiciones anaerobias. Más preferentemente, la célula hospedadora tiene la capacidad de crecer sobre una mezcla de una hexosa (por ejemplo glucosa) y al menos una de xilosa y arabinosa (en una relación de peso 1:1) como única fuente de carbono/energía a una velocidad de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 o 0,3 h-1 en condiciones aerobias, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 o 0,2 h-1 en condiciones anaerobias.

En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso de producción de etanol. El proceso comprende preferentemente la etapa de: a) fermentar un medio con una célula de levadura, por lo que el medio contiene o se alimenta con: a) una fuente de al menos una de una hexosa y una pentosa; b) una fuente de ácido acético; y, c) una fuente de glicerol y por lo que la célula de levadura fermenta ácido acético, glicerol y al menos una de la hexosa y pentosa en etanol. La célula de levadura es una célula (hospedadora) como se ha definido anteriormente en el presente documento. El proceso comprende preferentemente una etapa adicional en la que se recupera el producto de fermentación, es decir, el etanol. El proceso pueden ser un proceso discontinuo, un proceso de lotes alimentados

o un proceso continuo como son muy conocidos en la técnica. En el proceso de la invención, la fuente de glicerol puede ser cualquier fuente de carbono que tenga un estado más reducido que la glucosa. Una fuente de carbono que tiene un estado más reducido que la glucosa se entiende como una fuente de carbono de la que el estado de reducción promedio por moles de C (de los compuestos en su interior) es superior al estado de reducción por moles de C de glucosa. Ejemplos de fuentes de carbono que tienen un estado más reducido que la glucosa incluyen, por ejemplo, alcanoles tales como propanol y butanol; polioles tales como 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, manitol y xilitol.

En un proceso preferido, la fuente de hexosa comprende o consiste en glucosa. Preferentemente, la fuente de pentosa comprende o consiste en al menos una de xilosa y arabinosa. Preferentemente, el medio fermentado por las células de la invención comprende o se alimenta con (fracciones de) biomasa hidrolizada que comprende al menos una al menos una de una hexosa y una pentosa tal como glucosa, xilosa y/o arabinosa. (Fracciones de) Biomasa hidrolizada que comprende las hexosas y pentosa normalmente también comprenderán ácido acético (o una sal del mismo). Un ejemplo de biomasa hidrolizada para ser fermentada en los procesos de la invención es, por ejemplo, biomasa lignocelulósica hidrolizada. Biomasa lignocelulósica se entiende en el presente documento como biomasa de plantas que está compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina. Los polímeros de hidrato de carbono (celulosa y hemicelulosas) están fuertemente unidos a la lignina. Ejemplos de biomasa lignocelulósica que va a hidrolizarse para su uso en la presente invención incluyen residuos agrícolas (incluyendo hojas y tallos de maíz y bagazo de caña de azúcar), residuos de madera (incluyendo desechos de aserradero y de fábricas de papel) y residuos (municipales) de papel. Se conocen en sí en la técnica métodos de hidrólisis de biomasa tales como lignocelulosas e incluyen, por ejemplo, ácidos, tales como ácido sulfúrico y enzimas tales como celulasas y hemicelulasas.

En el proceso de la invención, las fuentes de xilosa, glucosa y arabinosa pueden ser xilosa, glucosa y arabinosa como tales (es decir, como azúcares monoméricos) o pueden estar en forma de cualquier oligo-o polímero de hidrato de carbono que comprende unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa, tales como, por ejemplo, lignocelulosa, arabinanos, xilanos, celulosa, almidón y similares. Para la liberación de las unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa de tales hidratos de carbono, pueden añadirse carbohidrasas apropiadas (tales como arabinasas, xilanasas, glucanasas, amilasas, celulasas, glucanasas y similares) al medio de fermentación o pueden ser producidas por la célula hospedadora modificada. En el último caso, la célula hospedadora modificada puede ser

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la posibilidad de que más de uno del elemento esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Así, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno".

Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos solo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.

Descripción de las figuras

Figura 1. Se muestra la evolución de los niveles netos de glicerol (g/l) (es decir, producción menos consumo) con el tiempo (horas) para las cepas de S. cerevisiae RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189.

Figura 2. Se muestra la evolución de los niveles netos de ácido acético (g/l) (es decir, producción menos consumo) con el tiempo (horas) para las cepas de S. cerevisiae RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189.

Ejemplos

1. Ensayos de actividad enzimática

Se prepararon extractos de células para ensayos de actividad a partir de cultivos discontinuos aerobios o anaerobios de crecimiento exponencial y se analizaron para el contenido de proteína como se describe por Abbot et al., (2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2320-2325).

Se midió la actividad de acetaldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10) a 30 ºC monitorizando la oxidación de NADH a 340 nm. La mezcla de reacción (volumen total 1 ml) contuvo tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), NADH 0,15 mM y extracto de células. La reacción empezó mediante la adición de acetil-Coenzima A 0,5 mM.

Para la determinación de la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8), se prepararon extractos de células como se ha descrito anteriormente, excepto que el tampón fosfato se sustituyó por tampón trietanolamina (10 mM, pH 5). Se ensayaron las actividades de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa en extractos de células a 30 ºC como se ha descrito previamente (Blomberg y Adler, 1989, J. Bacteriol. 171: 1087-1092,9). Las velocidades de reacción fueron proporcionales a las cantidades de extracto de células añadidas.

Se midió la actividad de acetil-CoA sintasa (EC 6.2.1.1) como se describe por Frenkel y Kitchens (1977, J. Biol. Chem. 252: 504-507) que es una modificación del método de Webster (Webster, 1969, Methods Enzymol. 13: 375381). La formación de NADH se mide espectrofotométricamente cuando la acetil-CoA producida se acopla con reacciones de citrato sintasa y malato deshidrogenasa. El sistema de ensayo contuvo Tris-Cl 100 mM (pH 7,6), MgCl2 10 mM, ATP 6 mM, malato 5 mM, NAD+ 1 mM, NADH 0,1 mM, ditiotreitol o 2-mercaptoetanol 2,5 mM, coenzima A 0,2 mM, 25 µg de citrato sintasa (80 unidades/mg), 20 µg de malato deshidrogenasa (1000 unidades/mg) y acetato 10 mM y se midió la velocidad de reacción a 340 nm y se calculó a partir del coeficiente de extinción de NADH (6,22 x 106 cm2/mol).

Se mide la actividad de glicerol deshidrogenasa y dihidroxiacetona cinasa a 30 ºC en extractos de células, esencialmente como se describe previamente (Gonzalez et al., 2008, Metab. Eng. 10, 234-245). Las actividades enzimáticas de glicerol deshidrogenasa y dihidroxiacetona cinasa se informan como µmoles de sustrato/min/mg de proteína de célula.

2. Construcción de cepas

Todas las modificaciones empiezan con la cepa fermentadora de xilosa y arabinosa RN1008 his-. RN1008 his-, también denominada en el presente documento RN1041, es una cepa fermentadora de arabinosa y xilosa basada en CEN.PK) con el genotipo:

Mat a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-Ptpi::TAL1, loxP-Ptpi::RKI1, loxP-Ptpi-TKL1, loxP-Ptpi-RPE1, delta:: -LEU2, delta:: Padh1XKS1Tcyc1-URA3-Ptpi-xylA-Tcyc1, delta:: LEU2-AAAaraABD.

Mat a = tipo de apareamiento a

Mutaciones ura3-52, leu2-112, his3::loxP en los genes ura3, leu2 y his3, ura3 está complementado por la construcción de expresión en exceso de xylA-XKS, leu2 está complementado por la construcción de expresión en exceso de AraABD. his3 podrían usarse para la selección de plásmidos adicionales, RN1041 necesita histidina en el medio para el crecimiento.

gre3::loxP = deleción del gen gre3 que codifica xilosa reductasa, queda el sitio loxP después de la eliminación del marcador.

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acs1f: TTAAGCTTAAAATGTCGCCCTCTGCCGT (SEQ ID NO: 47)

acs1r: AAGCGCGCTACAACTTGACCGAATCAATTAGATGTCTAACAATGCCAGGG (SEQ ID NO: 48)

Este fragmento de PCR se corta con las enzimas de restricción HindIII y BssHII y se liga al fragmento del promotor TEF1 cortado con SalI y HindIII (colección C5YeastCompany) y el fragmento del terminador ADH1 cortado con BssHII y BsiWI (colección C5YeastCompany). Este fragmento combinado se somete a PCR con cebadores específicos de promotor y terminador y se clona en el vector topo Blunt (InVitrogen) dando pACS1.

Se amplifica por PCR el marco de lectura abierto de ACS2 con los cebadores acs2f y acs2r.

acs2f: AACTGCAGAAAATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTTATGAAGCTCA (SEQ ID NO: 49)

acs2r: ACGTCGACTATTTCTTTTTTTGAGAGAAAAATTGGTTCTCTACAGCAGA (SEQ ID NO: 50)

Este fragmento de PCR se corta con las enzimas de restricción PstI y SalI y se liga al fragmento del promotor PGK1 cortado con SpeI y PstI (collección C5YeastCompany) y el fragmento del terminador PGI1 cortado con XhoI y BsiWI (collección C5YeastCompany). Este fragmento combinado se somete a PCR con cebadores específicos de promotor y terminador y se clona en el vector topo Blunt (InVitrogen) dando el plásmido pACS2.

La construcción de expresión en exceso de ACS1 se corta de pACSI con las enzimas de restricción SalI y BsiWI, la construcción de expresión en exceso de ACS2 se corta de pACS2 con las enzimas de restricción SpeI y BsiWI, el marcador KanMX se corta con BspEI y XbaI (collección de plásmidos C5YeastCompany). Estos fragmentos se ligan al plásmido pRS306 + 2mu ORI (collección de plásmidos C5Yeast company) cortado con BspEI y XhoI dando el plásmido final pRN753 (SEQ ID NO: 51). Este plásmido se usa para transformar cepas de levadura como se indica en la Tabla 4 y los transformantes se seleccionan con resistencia a G418. La expresión en exceso se verifica por qPCR. Un plásmido alternativo que puede usarse para la expresión en exceso de ACS1 y ACS 2 es pRN500 (SEQ ID NO: 20).

Expresión de adhE de E. coli, ADH2 de E. histolytica o mphF de E. coli

Se añaden el promotor PGK1 (SpeI-PstI) y la secuencia terminadora ADH1 (AflII-NotI) a los fragmentos sintéticos optimizados en codones y se clonan en pRS303 con 2µ ori cortado con SpeI y NotI y la construcción de expresión se clona en este vector. La expresión se verifica por qPRC. Secuencias optimizadas en codones para mphF de E. coli (SEQ ID NO: 2), adhE de E. coli (SEQ ID NO: 4) y ADH2 de E. histolytica (SEQ ID NO: 6) son como se indican en el listado de secuencias.

Para la expresión del gen mhpF de E. coli, se ligaron un fragmento de promotor PGK1 de levadura (SpeI-PstI) y un fragmento de terminador ADH1 (AflII-NotI) (ambos de la colección de plásmidos de Nedalco) sobre el fragmento sintético optimizado en codones que codifica mhpF de E. coli (SEQ ID NO: 2). Se cortó pRS 303 con 2µ ori (= pRN347, colección de plásmidos de Royal Nedalco) con SpeI y NotI y la construcción de expresión de mhpF se clonó en este vector para producir pRN558 (SEQ ID NO: 29).

Para la expresión del gen adhE de E. coli, un fragmento sintético optimizado en codones que codifica adhE de E. coli (SEQ ID NO: 4) se corta con XbaI y AflII y se liga en pRN558 cortado con XbaI y AflII (que sustituye al gen mhpF de

E. coli en pRN558) para producir pRN595 (SEQ ID NO: 30).

Para la expresión de adh2 de Entamoeba histolytica, un fragmento sintético optimizado en codones que codifica adh2 de E. histolytica (SEQ ID NO: 6) se corta con XbaI y AflII y se liga en pRN558 cortado con XbaI y AflII (que sustituye el gen mhpF de E. coli en pRN558) para producir pRN596 (SEQ ID NO: 31).

pRN595 se usa para la construcción adicional de pRN957 y pRN977 (véase más adelante). Es evidente que pRN558 y pRN596 pueden usarse de la misma forma, sustituyendo así la expresión de adhE de E. coli con mhpF de E. coli o adh2 de E. histolytica, respectivamente.

Expresión de gldA de E. coli

La construcción para la expresión en levadura de gldA de E. coli se hizo ligando una fragmento de promotor ACT1 de levadura (cortado con las enzimas de restricción SpeI y PstI), un ORF sintético (SEQ ID NO: 21), que codifica gldA de E. coli (cortado con PstI en BssHII) y un fragmento de terminador CYC1 de levadura (cortado con BssHII y BsiWI) juntos en pCRII blunt (Invitrogen) para dar pRNgldA (SEQ ID NO: 28).

Expresión en exceso de DAK1

Se realiza PCR en ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores que introducen un sitio XbaI 5' de ATG y un sitio SalI 3' de TAA para producir el fragmento de SEQ ID NO: 22. Un fragmento de ADN que comprende el promotor TPI1 de S. cerevisiae se liga en la dirección 5' de ORF de DAK1 y el fragmento de ADN que comprende el fragmento de terminador PGI1 de S. cerevisiae se liga en la dirección 3' de ORF de DAK1 para producir pRNDAK (SEQ ID NO: 38).

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Tablas 4A y B: Visión general de cepas construidas

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RN1201

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3. Fermentaciones anóxicas en medio de extracto de levadura-peptona estéril con cepas construidas en presencia y ausencia de glicerol y o ácido acético

Se obtuvo la prueba del principio de reducción simultánea de ácido acético y oxidación de glicerol usando un medio que contenía 1 % de extracto de levadura y 1 % de peptona. Los experimentos se realizaron en cultivo de quimiostato (1 litro de volumen de trabajo) a D = 0,05 h-1 y el pH se mantuvo a 5,5 por adición automática de o bien KOH o bien H2SO4. Se añadieron glucosa (50 g/l) y xilosa (50 g/l) como fuente de carbono y de energía al medio de extracto de levadura-peptona. Para estos experimentos que demuestran la prueba del principio, no se incluyó arabinosa. Donde fuera relevante, se añadió ácido acético al medio de extracto de levadura-peptona a 4 g/l y glicerol a 10 g/l. La temperatura se mantuvo a 32 ºC.

Se preparan precultivos de cepas inoculando un cultivo de reserva de glicerol congelado de la levadura en un medio YP (extracto de levadura al 1 % en p/v y peptona al 1 % en p/v) con adición de cada uno de los azúcares glucosa y xilosa (cada uno al 1 % p/v) a 32 ºC y pH 5,5. Después de 24 h de incubación en condiciones óxicas en matraces oscilantes, se usan 50 ml de este cultivo para inocular los cultivos de quimiostato.

En el estado estacionario de las fermentaciones (cambios de 5 volúmenes), se tomó una muestra para el análisis del consumo de azúcar (glucosa y xilosa), consumo de ácido acético y metabolito (etanol y glicerol). Se monitorizan las concentraciones de etanol, glicerol y ácido acético por análisis de HPLC. Para determinar el consumo de azúcar, se determinan glucosa y xilosa por análisis de HPAEC (Dionex).

La cepa RN1151 no es capaz de alcanzar una situación de estado estacionario en el medio que contiene 4 g/l de ácido acético ni en presencia ni en ausencia de glicerol. Si no se añade ácido acético al medio, el organismo en el estado estacionario consumió toda la glucosa y xilosa (quedando menos de 1 g/l). No se consumió glicerol, sino que en su lugar se produjo.

Las cepas RN1200 y RN1201 se prueban similarmente en medios con ácido acético y ya sea con o sin glicerol añadido. Estas cepas rinden de forma claramente diferente de la cepa RN1151. En el medio que contiene glicerol, los azúcares glucosa y xilosa se consumen casi hasta la finalización (quedando menos de 1 g/l). Los niveles de ácido acético disminuyen a 0,5 g/l y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación es 3 g/l en los tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1200 y RN1201 oscilaron entre 43 y 47 g/l en diversos experimentos. En el medio que no contiene glicerol, pero que contiene 4 g/l de ácido acético, no se obtuvo estado estacionario estable. Las cepas no pueden crecer bajo estas condiciones. A partir de estos resultados, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la expresión de los genes gldA y adhE de E. coli en combinación con la regulación por incremento de DAK1 o expresión de dhaK de C. freundii tiene un profundo efecto sobre el rendimiento de las cepas. En presencia de glicerol, son capaces de consumir glicerol y ácido acético,

Las cepas RN1202 a RN1207 son similares a las cepas RN1200 y RN1201, excepto por el hecho de que los genes GPD1 y/o GPD2 han sido delecionados. En el medio que contiene 4 g/l de ácido acético, los azúcares glucosa y xilosa son consumidos casi hasta la finalización (quedando menos de 1 g/l) si se añade glicerol al medio como es el caso para las cepas RN1200 y RN1201. Si no se añade glicerol, no se obtiene el estado estacionario.

4. Fermentaciones anóxicas con las cepas construidas en ácido acético que comprenden hidrolizados lignocelulósicos en presencia o ausencia de glicerol

El hidrolizado de fibra de maíz contiene: glucosa (38 g/l), xilosa (28 g/l), arabinosa (12 g/l) y ácido acético (4 g/l). Ha sido preparado tratando fibras de maíz a 160 ºC y a pH 3,0 durante 20 minutos, seguido de hidrólisis enzimática por celulasas y hemicelulasas. Se añadió ácido acético a este hidrolizado produciendo una concentración total de ácido acético en el hidrolizado de 10 g/l. El pH de este hidrolizado enriquecido en ácido acético se restauró a pH = 4,5 por la adición de KOH. Se añadió extracto de levadura a este hidrolizado para alcanzar una concentración final de 5 g/l. En todos los experimentos posteriores, se empleó este hidrolizado enriquecido. El pH durante las fermentaciones se mantuvo a 6,5 por adición automática de cualquiera de KOH o H2SO4.

Se preparan precultivos de cepas inoculando un cultivo de reserva de glicerol congelado de la levadura en un medio YP (extracto de levadura al 1 % en p/v y peptona al 1 % en p/v) con adición de cada uno de los azúcares glucosa, xilosa y arabinosa (cada uno al 1 % p/v) a 32 ºC y pH 5,5. Después de 24 h de incubación en condiciones óxicas en matraces oscilantes, se usan 50 ml de este cultivo para inocular los cultivos de fermentador. Las fermentaciones se realizan en una configuración de fermentación de lotes alimentados. El hidrolizado (ya sea con o sin glicerol añadido a 50 g/l) se bombea en el fermentador. Si no se añadió glicerol, entonces se añadieron 40 ml de agua. Durante las primeras 6 horas, el caudal para el hidrolizado se establece a una velocidad de 5 ml por hora. Durante las siguientes 6 horas, el caudal se establece a 10 ml por hora. Posteriormente, durante otras 43 horas, el caudal se establece a 20 ml por hora. El volumen total al final de la fermentación alcanza 1000 ml. Estas fermentaciones anóxicas de lotes alimentados se realizan a aproximadamente pH = 4,5 con agitación suave a 100 rpm. La temperatura durante las fermentaciones se establece a 32 ºC. Para minimizar la infección, los hidrolizados se calientan durante 10 min a 105 ºC antes de que se añadan las fermentaciones y el antibiótico kanamicina con una concentración final de 50 µg/ml.

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Al final de las fermentaciones después de 55 h, se tomó una muestra para el análisis del consumo de azúcar (glucosa, xilosa y arabinosa), consumo de ácido acético y metabolito (etanol y glicerol). Se monitorizan las concentraciones de etanol, glicerol y ácido acético con el tiempo por análisis de HPLC. Para determinar el consumo de azúcar, se determinan glucosa, xilosa, y arabinosa por análisis de HPAEC (Dionex).

La cepa RN1151 (= RN1041 complementada con HIS3) se prueba en el hidrolizado ya sea con o sin glicerol añadido. En ambos casos, la concentración de glucosa al final de la serie de fermentación (55 h) es 35 g/l, mientras que la xilosa y arabinosa siguen a sus concentraciones iniciales de 28 y 12 g/l, respectivamente. Las cantidades de etanol producidas son 2 g/l y el ácido acético está presente a 9,5 g/l. No se detecta consumo de glicerol en el hidrolizado que contiene glicerol. La fermentación de los azúcares se detiene durante el transcurso de la operación de lotes alimentados debido a los niveles crecientes de ácido acético. Inicialmente, no está presente ácido acético en el fermentado, pero mientras que se bombea el hidrolizado que contiene niveles tóxicos de ácido acético, la concentración alcanza rápidamente niveles tóxicos.

Las cepas RN1200 y RN1201 se prueban similarmente en hidrolizado ya sea con o sin glicerol añadido. Estas cepas rinden de forma claramente diferente a la cepa RN1151. En el hidrolizado que contiene glicerol, los azúcares glucosa, xilosa y arabinosa se consumen hasta la finalización. Los niveles de ácido acético disminuyen a 2 g/l y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación son 29,5 g/l en los tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1200 y RN1201 son 51,7 y 52,2 g/l, respectivamente. En el hidrolizado que no contuvo glicerol, se consume considerablemente menos azúcar. Los niveles de xilosa y arabinosa son invariables a 28 y 12 g/l, respectivamente. La glucosa se consume, pero a un grado limitado solo. Al final de la fermentación, la concentración restante es 32 g/l en los tres casos, alcanzando el etanol una concentración de 3 g/l. La concentración de ácido acético disminuye a 9,1 g/l al final de la fermentación, mientras que se produce algo de glicerol (menos de 0,5 g/l). A partir de estos resultados, los presentes inventores llegan a la conclusión de que la expresión de los genes gldA y adhE de E. coli en combinación con la regulación por incremento de DAK1 o la expresión de dhaK de

C. freundii tiene un profundo efecto sobre el rendimiento de las cepas. En presencia de glicerol, son capaces de consumir glicerol y ácido acético, y producir etanol adicional (en comparación con la cepa RN1151). En ausencia de glicerol, las cepas consumen algo de ácido acético. Pero durante la fermentación, el nivel de ácido acético aumenta a niveles tóxicos.

Las cepas RN1202 a RN1207 son similares a las cepas RN1200 y RN1201, excepto por el hecho de que los genes GPD1 y/o GPD2 han sido delecionados. En el hidrolizado que contiene glicerol, los azúcares glucosa, xilosa y arabinosa se consumen hasta la finalización como era el caso para la cepa RN1200. Los niveles de ácido acético disminuyen similarmente a aproximadamente 2 g/l y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación es 28 g/l en estos tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 y RN1207 son 51,6, 52,9, 52,1, 52,5, 53,1 y 52,3 g/l, respectivamente. En el hidrolizado que no contiene glicerol, se consume considerablemente menos azúcar. Los niveles de xilosa y arabinosa son invariables a 28 y 12 g/l, respectivamente. La glucosa se consume pero a un grado limitado solo. Al final de la fermentación, la concentración restante en el hidrolizado no de glicerol para glucosa es 31 g/l en los tres casos, alcanzando el etanol una concentración de 3 g/l. La concentración de ácido acético disminuye a 9,1 g/l al final de la fermentación, mientras que se produce algo de glicerol (inferior a 0,5 g/l). A partir de estos resultados los presentes inventores llegan a la conclusión de que la deleción de los genes GPD1 y/o GPD2 junto con las otras modificaciones en RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 y RN1207 produce cepas que pueden realizar las reacciones deseadas.

Materiales y métodos para los Ejemplos 5-8

Técnicas generales de biología molecular

A menos que se indique lo contrario, los métodos usados son técnicas bioquímicas estándar. Ejemplos de libros de texto de metodología general adecuados incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Medios

Los medios usados en los experimentos fueron o bien medio YEP (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona)

o bien medio YNB sólido (6,7 g/l de base de nitrógeno de levadura, 15 g/l de agar), complementados con azúcares como se indica en los ejemplos. Para el medio YEP sólido, se añadió 15 g/l de agar al medio líquido antes de la esterilización.

En los experimentos de AFM, se usó medio mineral. La composición del medio mineral se ha descrito por Verduyn et al. (Yeast (1992), Volumen 8, 501-517) y se complementó con 2,325 g/l de urea y azúcares como se indica en los ejemplos.

Transformación de células de levadura

La transformación de levadura se hizo según el método descrito por Schiestl y Gietz (Current Genetics (1989), Volumen 16, 339-346).

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PCR de colonias

Se extrajo ADN genómico de colonias de levadura individuales para PCR según el método descrito por Looke et al. (BioTechniques (2011), Volumen 50, 325-328).

Procedimiento de AFM

El monitor de fermentación de alcohol (AFM; Halotec, Veenendaal, Los Países Bajos) es un birreactor en paralelo de laboratorio robusto y fácil de usar que permite comparaciones precisas de velocidades de conversión de carbono y rendimientos para seis fermentaciones anaerobias simultáneas.

El cultivo de partida del experimento de AFM contuvo 50 mg de levadura (peso seco). Para determinar esto, se hizo una curva de calibración de la cepa RN1041 de biomasa frente a DO700. Esta curva de calibración se usó en el experimento para determinar el volumen de cultivo celular necesario para 50 mg de levadura (peso seco).

Antes del inicio del experimento de AFM, se cultivaron precultivos como se indica en los ejemplos. Para cada cepa se midió la DO700 y se inocularon 50 mg de levadura (peso seco) en 400 ml de medio mineral (Verduyn et al. (Yeast (1992), Volumen 8, 501-517), complementado con 2,325 g/l de urea y azúcares como se indica en los ejemplos.

Ensayo de actividad de glicerol deshidrogenasa

El método para la determinación del ensayo de actividad de glicerol deshidrogenasa fue adoptado de Lin y Magasanik (1960) J Biol Chem, 235:1820-1823.

Tabla 5: Condiciones de ensayo

Tampón carbonato/bicarbonato 1,0 M a pH 10

800 µl

Sulfato de amonio 1,0 M

33 µl

NAD+ 0,1 M

33 µl

Extracto libre de células

5 µl

Se preparó extracto libre de células recogiendo células por centrifugación. Las células se recogieron en la fase exponencial. El sedimento de células se lavó una vez con tampón carbonato/bicarbonato 1 M (pH 10) y se preparó un extracto libre de células en el mismo mediante la adición de perlas de vidrio y agitando con vórtex a velocidad máxima durante intervalos de 1 minuto hasta que las células se rompieron. Lo último se comprobó microscópicamente.

Experimentos en matraz oscilante

Se realizaron experimentos anaerobios en matraz oscilante como se indica en los ejemplos. Los experimentos típicos usan matraces Erlenmeyer de 100 ml con 25 ml de medio. Con el fin de garantizar las condiciones anaerobias, el matraz se cerró con un cierre hidráulico. Para cada momento de tiempo, se inoculó un matraz oscilante separado, omitiendo así la aireación durante el muestreo.

Cepas

La cepa parental usada en los experimentos descritos en los Ejemplos 5 a 8 es RN1041.

RN1041 se ha descrito en el documento WO 2012067510. Esta cepa tiene el siguiente genotipo:

MAT a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-pTPI1::TAL1, loxP-pTPI1::RKI1, loxP-pTPI1-TKL1, loxPpTPI1-RPE1, delta::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2, delta:: URA3-pTPI1-xylA-tCYC1

MATa = tipo de apareamiento a

Mutaciones ura3-52, leu2-112, HIS3::loxP en los genes URA3, LEU2 y HIS3, respectivamente. La mutación ura3-52 está complementada por el gen URA3 en la construcción de expresión en exceso de xylA; la mutación leu2-112 está complementada por el gen LEU2 en la construcción de expresión en exceso de XKS1. La deleción del gen HIS3-produce una auxotrofía a la histidina. Por este motivo, RN1041 necesita histidina en el medio para el crecimiento.

gre3::loxP es una deleción del gen GRE3, que codifica aldosa reductasa. El sitio loxP se deja atrás en el genoma loxP después de la eliminación del marcador.

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Ejemplo 7 Experimentos de AFM Se repitió el experimento descrito en el Ejemplo 6 en una configuración ligeramente diferente, es decir, el AFM

(monitor de fermentación alcohólica), que permite la determinación de dióxido de carbono en línea, durante el

experimento. Las cepas probadas fueron RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189. La cepa RN1041 se transformó con el plásmido pRS323, un vector de clonación estándar que contiene el gen HIS3 y un origen de replicación 2µ, complementando así la autotrofía a la histidina.

Las cepas se precultivaron durante la noche en medio mineral con 2 % de glucosa como fuente de carbono, en un agitador rotatorio a 280 rpm y 30 ºC. Las células se recogieron y se empezó un experimento de AFM como se ha descrito anteriormente. Se tomaron muestras a intervalos regulares y se determinaron azúcares, etanol, glicerol y HAc por HPLC. Los resultados se muestran en la tabla a continuación. Tabla 9: Consumo de glicerol y HAc, y valores de producción de etanol por cepa en el tiempo = 112 horas.

Cepa

Aumento neto (-) o disminución (+) de glicerol (gramos por litro) Consumo de HAc (gramos por litro) Producción de etanol (gramos por litro)

RN1041

+ 1,4 0,1 24,0

RN1041+pRN595

+ 1,1 0,4 24,1

RN1186

-0,3 0,7 25,5

RN1187

-1,2 1,0 25,5

RN1188

-0,3 0,7 25,2

RN1189

-1,1 1,0 25,6

La evolución de los niveles de glicerol y HAc en el tiempo se muestran en las Figuras 1 y 2.

Las cepas RN1041 y RN1041+pRN595 están mostrando una producción neta de glicerol. Las cepas RN1186 y RN1188 están mostrando inicialmente producción de glicerol; sin embargo, después de aproximadamente 24 a 32 horas, comenzó el consumo de glicerol y continuó hasta que al final se observó consumo neto de glicerol.

Las cepas RN1187 y RN1189 no presentan la producción de glicerol inicial, como se observa con RN1186 y RN1188. Después de 24 horas, comienza el consumo de glicerol. El consumo de glicerol es significativamente más alto en estas cepas en comparación con RN1186 y RN1188. Estos resultados indican que la deleción del gen GPD1 produce mayor consumo de glicerol que la deleción del gen GPD2.

La cepa RN1041+pRN595 está mostrando un mayor consumo de HAc que la cepa de referencia RN1041. RN1186 y RN1188 están presentando un mayor consumo de HAc que RN1041+pRN595. Este resultado indicó que el consumo de glicerol potenció el consumo de HAc. Este efecto es incluso más fuerte en las cepas RN1187 y RN1189.

Ejemplo 8

Ensayo de actividad de glicerol deshidrogenasa

Se prepararon extractos libres de células (CFE) de la cepa RN1041 y RN1190 como se ha descrito anteriormente. Se realizó el ensayo de actividad de glicerol deshidrogenasa, adoptado del protocolo de Lin y Magasanik (1960) J Biol Chem, 235:1820-1823. Los resultados se muestran en la tabla a continuación.

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2