ES2648885T3 - Anticuerpos monoclonales humanizados y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanizados y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal G6 murino humanizado aislado que se une específicamente a la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana codificada por el gen VH1-69 de la línea germinal o un fragmento de este, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos:**Fórmula** una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos:**Fórmula** b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos:**Fórmula** una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos:**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos monoclonales humanizados y metodos de uso Campo de la invencion
Esta invencion se refiere generalmente a anticuerpos humanizados anti VH 1-69 humano asf como a los metodos de uso de los mismos para aumentar la respuesta inmune a la infeccion microbiana.
Antecedentes de la invencion
Una pandemia de gripe representa una de las mayores amenazas infecciosas agudas para la salud humana. La pandemia de gripe de 1918-1919 causo aproximadamente 500.000 muertes en los Estados Unidos, por lo que es el evento mas fatal en toda la historia de los Estados Unidos. La propagacion de la gripe aviar altamente patogena (HPAI) gripe H5N1 en Asia y ahora en Medio Oriente y el norte de Africa crea un riesgo sustancial para que surja una nueva pandemia.
La variacion natural asf como los mutantes de escape sugieren que la evolucion continua del virus debena afectar la decision sobre que cepa(s) debe(n) usarse para la inmunizacion pasiva y activa. Aunque se han reportado un numero importante de estudios de escape de neutralizacion y mapeo de epttopos, se necesitan nuevos anticuerpos neutralizantes y estudios estructurales relacionados para desarrollar estrategias de inmunizacion para desarrollar una "vacuna universal" contra una amplia variedad de virus de la gripe del Grupo 1. Los desafms para desarrollar una vacuna protectora contra la gripe del Grupo 1 son formidables y se necesitan nuevos enfoques para prevenir y tratar la infeccion humana por un enemigo en constante cambio. Existe una necesidad de desarrollar rapidamente estrategias terapeuticas para obtener la inmunidad protectora del huesped, tanto pasiva como activamente. El documento de patente num. WO 2007/035857 describe el tratamiento de enfermedades de celulas B que usan agentes de union anti anticuerpo de la lmea germinal. Corti, D. y otros, J Clin Invest.2010; 120(5):1663-73 describe anticuerpos neutralizantes heterosubtfpicos producidos por individuos inmunizados con una vacuna contra la gripe estacional.
Resumen de la invencion
La invencion se define de conformidad con las reivindicaciones adjuntas y se basa en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales que se unen al gen VH1-69 de la lmea germinal en la region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana. El anticuerpo monoclonal es completamente humano. En varios aspectos, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo bivalente, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo monocatenario o fragmento de este. Los anticuerpos monoclonales ilustrativos incluyen un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal murino G6.
Los anticuerpos monoclonales pueden tener una afinidad de union que es 1 nM o menos.
El anticuerpo monoclonal tiene una secuencia de aminoacidos variable de cadena pesada que contiene la sec. con. nums. de ident.:2 o 12, y/o una secuencia de aminoacidos variable de cadena ligera que contiene la sec. con num. de ident.:4. El anticuerpo monoclonal tiene una secuencia de acido nucleico variable de cadena pesada que contiene la sec. con. nums. de ident.:1 u 11, y/o una secuencia de acido nucleico variable de cadena ligera que contiene la sec. con num. de ident.:3.
Se describe ademas un anticuerpo monoclonal o fragmento de este con el gen VH1-69 de la lmea germinal en la region variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, donde el anticuerpo tiene un CDRH1:GYTFTSYW (sec. con num. de ident.: 5); CDRH2:VSPGNSDT (sec. con num. de ident.: 6); y CDRH3:TRSRYGNNALDY (sec. con num. de ident.: 7) y un CdRl1:QGISSNIVW (sec. con num. de ident.: 8); CDRL2:HGT (sec. con num. de ident.: 9); y CDRL3:VQYSQFPPT (sec. con num. de ident.: 10).
En algunos aspectos, el anticuerpo de conformidad con la invencion se une covalentemente a un antfgeno. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo monocatenario y el antfgeno es la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe.
Se describen ademas los metodos para aumentar la respuesta inmune de un sujeto a un antfgeno mediante la administracion al sujeto de un anticuerpo idiotipo anti gen de la lmea germinal en la region variable de inmunoglobulina y un inmunogeno capaz de inducir una reaccion inmune al antfgeno. En algunos aspectos, el anticuerpo se enlaza covalentemente al antfgeno. El gen de la lmea germinal codifica para un polipeptido de cadena ligera o un polipeptido de cadena pesada. Preferentemente, el gen de la lmea germinal de la region variable es VH1-69. El antfgeno es un virus, una bacteria o un hongo. Por ejemplo, el virus es un virus de la gripe. Preferentemente, el inmunogeno es la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe o fragmento de este. Con preferencia superlativa, el inmunogeno contiene la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe. El anticuerpo puede administrarse antes, al mismo tiempo o despues de la administracion del inmunogeno.
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A menos que se especifique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por el experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion pueden usarse en la practica o prueba de la presente invencion, los metodos y materiales adecuados se describen mas abajo. En caso de conflicto, prevalecera la presente descripcion, que incluye las definiciones. Ademas, los materiales, metodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra el modelo de homologfa de la cadena pesada (VH) del anticuerpo G6 de raton y la cadena ligera (VL) generada usando el modelado de anticuerpos Web (WAM).VH de color azul y VL de color verde con las CDR resaltadas en rojo.
La Figura 2 muestra la comparacion de la actividad de union a antigeno de los anticuerpos huG6.1 y mG6.
La Figura 3 muestra el modelo de homologfa de VH y VL del anticuerpo G6.1 humano. a), modelo de anticuerpo G6.1 humano, VH en azul y VL en verde con las CDR en rojo. b), el modelo de homologfa de G6.1 humano despues de la minimizacion de la energfa del campo de fuerza GROMOS, visualizado en el programa DeepView, se resaltan en diferentes colores, los residuos que exhiben geometna distorsionada o choques estericos.
La Figura 4 muestra los residuos con geometna distorsionada y choques estericos entre los residuos dentro de las regiones marco, asf como entre los residuos marco y CDR usando el programa Pymol.
La Figura 5 muestra la comparacion de la actividad de union a antfgeno de scFv-Fc de huG6.2 y de mG6.
La Figura 6 es un analisis de union de Interferometna Bio-Capa en tiempo real de HuG6.2 (Rojo) y G6 de raton (Azul) al scFv-Fc de D80 biotinilado.
La Figura 7 es un analisis de union en Interferometna Bio-Capa en tiempo real de HuG6.2 y HuG6.3 (mutante Thr73Lys) al scFv-Fc de D80 biotinilado.
La Figura 8 muestra la union de los anticuerpos anti-H5 endogeno a H5 mediante ELISA de competicion. Se mezclaron 3 ng de anticuerpos purificados F10 biotinilados (Bio-F10) con cada muestra de suero en diversas diluciones y se anadieron a placas revestidas con H5 (H5-VN04), se lavaron y se siguieron incubaciones con HRP-estreptavidina para detectar F10 biotinilado unido a H5. La mayona de las muestras de suero, excepto la num. 8, muestran la capacidad de inhibir la union de Bio-F10 a H5, lo que indica la presencia de anticuerpos anti-H5 endogenos en muestras de suero de individuos sanos.
La Figura 9 muestra la union de anticuerpos anti-H5 endogenos a H5 mediante ELISA de competicion. Se mezclaron los anticuerpos purificados biotinilados-F10 (Bio-F10) con muestras de suero obtenidas antes o despues de la vacunacion de individuos sanos con H5N1. La mezcla se anadio a placas revestidas con H5 (H5-VN04), se lavaron y se siguio por incubacion con HRP-estreptavidina para detectar F10 biotinilado unido a H5. La mayona de las muestras de suero prevacunadas muestran la capacidad de inhibir la union de Bio-F10 a H5, lo que indica la presencia de anticuerpos anti- H5 endogenos en los individuos sanos. La vacunacion con H5N1 refuerza la produccion de anticuerpos anti-H5 en todos los individuos. El efecto del refuerzo es mas fuerte en los individuos con menor cantidad de anticuerpos anti-H5 endogenos.
La Figura 10 muestra la union in vitro de fracciones anti-H5 eluidas con acido y eluidas con F10 biotinilado (Bio-F10) a partir de muestras de inmunoglobulina intravenosa (IVIG). Se evaluaron anticuerpos F10 purificados, fracciones anti-H5 eluidas con acido y eluidas con F10 biotinilado (Bio-F10) a varias concentraciones para determinar la union a varios HA revestidos en una placa de ELISA.(A) Tanto las fracciones eluidas con acido como las eluidas con Bio-F10 reconocen H1-NY18 como lo hacen los anticuerpos de control F10.(B) Tanto las fracciones eluidas con acido como las eluidas con Bio-F10 reconocen a H5-VN04 como lo hacen los anticuerpos de control F10.(C) Solo el control H3M3 y la fraccion eluida con acido reconocen H3-BR07, pero no la fraccion eluida con Bio-F10.(D) A diferencia del anticuerpo de control anti-H7, la fraccion eluida con acido solo se une a H7-NL219 a alta concentracion, y la fraccion eluida con Bio-F10 no reconoce H7-NL219.
La Figura 11 muestra el analisis FACS de varias fracciones de eluato anti-H5 que se unen a H1, H2, H5 (Grupo H1a); y H8 (Grupo H9). Se transfectaron transitoriamente celulas 293T con diferentes plasmidos que expresan HA, y se analizo la union del anticuerpo a las celulas mediante FACS. El anticuerpo 80R espedfico a H5 es el control negativo y el anticuerpo F10 con especificidad mas amplia es el control positivo. Tanto la fraccion eluida con acido como la fraccion
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anti-H5 de Bio-F10 pueden unirse a H1, H2 y H5.No muestran mucha diferencia en la union a H1, H2 y H5. Las designaciones de cepa viral completa son: H1-SC1918 (A/Carolina del Sur/1/1918 (H1N1)), H2-JP57 (A/Japon/305/57 (H2N2)), HS-TH04 (A/Tailandia/2-SP-33/2004 (HSN1)); H8-ON68 (A/Turqma/Ontario/6118/68).
La Figura 12 muestra la neutralizacion in vitro de varias fracciones de eluato anti-H5. Se evaluaron anticuerpos F10 purificados, fracciones anti-H5 eluidas con acido y eluidas con F10 biotinilado (Bio-F10) a varias concentraciones para neutralizar la actividad contra el virus de la gripe del individuo. El anticuerpo 80R espedfico a H5 es el control negativo y el anticuerpo F10 con especificidad mas amplia es el control positivo.(A) Tanto las fracciones eluidas con acido como las eluidas con Bio-F10 pueden neutralizar H1-SC1918.(B) Ni las fracciones eluidas con acido ni las eluidas con Bio-F10 pueden neutralizar h2-JP57.(C) Tanto las fracciones eluidas con acido como las eluidas con Bio-F10 pueden neutralizar H5-TH04.(D) Tanto las fracciones eluidas con acido como las eluidas con Bio-F10 pueden neutralizar H6-NY98 [H6- NY98 (A/Pollo/Nueva York/14677-13/1998 (H6N2))].
La Figura 13 muestra los principales codones de nucleotidos de la lmea germinal que distinguen las diferentes variantes del gen VH1-69. Entre 13 alelos, los alelos *01, *03, *05, *06, *12, y *13 se relacionan con 51p1.
La Figura 14 muestra la distribucion de los anticuerpos que se aislaron mediante el uso de G6 para formar un molde contra la biblioteca no inmune Mehta I/II.(A) 84% de los anticuerpos que se unieron a G6 fueron IGHV1-69 y se componen principalmente por los alelos *01 y *05 que codifican la Phe55 cntica (Figura 6) que se inserta en el bolsillo hidrofobico en el tallo HA (Sui, NSMB '09). Estos datos sugieren que este antiidiotipo solo reconoce los alelos 51p1 pero no los alelos hv1263.(B) El surtido aleatorio de cadenas VL indica que el idiotipo G6 solo se expresa en VH pero no en VL.
La Figura 15 muestra el numero de mutaciones somaticas de los anticuerpos codificados VH-69 que se unen a G6.
La Figura 16 muestra la grafica de frecuencia de los diferentes aminoacidos que se encontraron en cada una de las posiciones del Abs codificado VH1-69 que se une a G6. El marco con bordes solidos indica la region determinante de complementariedad 1 (CDR1) y el marco con bordes discontinuos indica el CDR2. Tenga en cuenta que existe mucha menos variabilidad de aminoacidos cnticos que son aminoacidos de contacto importantes para la union a HA, como la GGT en HCDR1 y Phe55 en CDR2.
La Figura 17 muestra motivos basados en WRCY Deaminasa inducida por activacion (AID) en VH1-69. El marco con bordes solidos indica la region determinante de complementariedad 1 (CDR1) y el marco con bordes discontinuos indica el CDR2. Los datos muestran que existe una escasez de motivos WRCY en las mismas regiones que se necesitan para mutar que permiten la rotacion de Phe55 que se inserta en el bolsillo hidrofobico (que se muestra en las figuras mas abajo).
La Figura 18 muestra la union in vitro de anticuerpos anti-H5. Seis BnAb anti-H5 se evaluaron para la union a mAb de raton antiidiotfpico G6. Solo D8 muestra union positiva a G6.
La Figura 19 muestra la union in vitro de VH1-69/F10 a G6. (A) El dibujo ilustra los dominios principales de F10 y los dominios de la construccion quimerica VH1-69/F10. (B) VH1-69/F10 puede unirse a G6, pero no puede a F10. Estos datos confirman que el idiotipo G6 se localiza en el segmento Vh.
La Figura 20 muestra esquemas de diferentes construcciones F10 quimericas y sus capacidades de union a H5. La sustitucion de Pro con Ala fuera del dominio de union aumenta la union a H5 (+++++). Sin embargo, la union se pierde completamente cuando el CDR2 se sustituye con su forma de la lmea germinal. La introduccion de Ser de nuevo a la secuencia recupera el 90% de la union. La sustitucion de las regiones marco (FR) con la forma de la lmea germinal ademas disminuye la union. La restauracion de algunos residuos de union clave en el fondo de la lmea germinal rescata su capacidad de union.
Descripcion detallada
La presente descripcion proporciona anticuerpos monoclonales humanizados espedficos contra el gen VH1-69 de la lmea germinal en la region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana. En particular, la descripcion proporciona un anticuerpo G6 humanizado anti-idiotipo VH1-69 humano (referido en la presente descripcion como huG6).Mas espedficamente, la descripcion proporciona un metodo para aumentar una respuesta inmune a un antfgeno al enfocar una respuesta inmune a un gen de la lmea germinal en la region variable humana en combinacion con la estimulacion antigenica.
Espedficamente, esta invencion se basa en un trabajo previo en el que se identificaron los mAb antihemaglutinina humana de alta afinidad, de subtipo cruzado, ampliamente neutralizante.(Ver, documento de patente num.,WO 2009/086514). Se uso una biblioteca de presentacion en fagos de anticuerpos humanos y ectodominio de hemaglutinina (HA) H5 para seleccionar diez mAb neutralizantes (nAb) con un intervalo notablemente amplio entre los virus de gripe de Grupo 1, que incluyen cepas de HSN1 "gripe aviar" y H1N1 "gripe espanola" y "gripe porcina". Estos nAb inhiben el
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proceso de fusion posterior a la union al reconocer un epftopo neutralizante novedoso y altamente conservado (denominado en la presente descripcion el epftopo F10) dentro de la region del tallo en un punto donde los elementos claves del cambio conformacional - el peptido de fusion y la superficie expuesta de la helice aA - se ponen en aposicion cercana.
Sorprendentemente, estos nAb aislados utilizan el mismo gen de la lmea germinal VH, IGHV1-69*01, y codifican un bucle CDR3 que contiene una tirosina en una posicion equivalente a Y102, de una biblioteca no inmune. Esto indico que preexiste una amplia inmunidad cruzada anti-HA en la poblacion virgen H5. El uso recurrente de este segmento VH de la lmea germinal, la comunidad de la tirosina de CDR3 introducida a traves de la insercion de N y/o el ensamblaje del gen D de la lmea germinal, y el uso promiscuo de los genes VL por los nAb descubiertos indican que la frecuencia precursora de los segmentos VH reorganizados que podna reconocer este epftopo es significativo. Esto indica que con una exposicion adecuada al epftopo F10, estos nAb de amplio espectro pueden inducirse facilmente in vivo.
La hemaglutinina del virus de la gripe tiene funciones esenciales para el inicio de la infeccion por el virus de la gripe e involucra dos regiones estructuralmente distintas, la cabeza globular y la region del tallo. La region de la cabeza globular contiene los principales determinantes antigenicos en los que surgen las mutaciones antigenicas. Sin embargo, se conserva la region del tallo. Asf, el hallazgo de estos mAb antihemaglutinina humana de neutralizacion amplia sugiere que con una estimulacion antigenica adecuada, los seres humanos son capaces de provocar una amplia respuesta neutralizante antigripe.
Los anticuerpos antiidiotipo (denominados Ab2) son anticuerpos dirigidos contra la region variable (sitio de union a antfgeno) de otro anticuerpo (Ab1), el idiotipo. A su vez, la inmunizacion con anticuerpos Ab2 puede inducir anticuerpos con especificidades similares a los anticuerpos originales. En la presente invencion, se propone inmunizar con un anticuerpo antiidiotfpico que es espedfico para el gen de la lmea germinal en la region variable de inmunoglobulina para estimular clonotfpicamente una respuesta inmune del gen de la lmea germinal. Esto, de hecho, preparara el sistema inmune activando las celulas B espedficas del gen de la lmea germinal.
Por consiguiente, se describe en la presente descripcion un metodo para aumentar una respuesta inmune en un sujeto a un antfgeno administrando al sujeto un anticuerpo antiidiotipo del gen de la lmea germinal en la region variable de inmunoglobulina y un inmunogeno capaz de inducir una reaccion inmune al antfgeno. Por ejemplo, el gen de la lmea germinal en la region variable es VH1-69.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado que se une espedficamente a la protema de la region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana codificada por el gen de la lmea germinal VH1-69. El anticuerpo huG6 es monovalente o bivalente y comprende una cadena simple o doble. Funcionalmente, la afinidad de union del anticuerpo huG6 es menor que 250 nM, menor que 1 00 nM, menor que 1 0 nM, menor que 1 nM o menor que 100 pM. Preferentemente, la afinidad de union esta dentro de un intervalo de 100 pM - 1nM. La secuencia del anticuerpo se modifica geneticamente y, asf, puede comprender una o mas regiones de union a antfgeno del anticuerpo murino G6. El anticuerpo huG6 se une al mismo epftopo que el Mab G6 murino. Ademas, el anticuerpo comprende un inmunogeno (es decir, antfgeno) que incluye, pero no se limita a, la protema de hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe o fragmento de esta. Por ejemplo, el inmunogeno comprende la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe.
El anticuerpo monocatenario G6 (muG6) murino (1567) se construyo a partir del clon de celulas de hibridoma G6. Tras la clonacion, se descubrio que el hibridoma G6 codifico tres genes diferentes de cadena ligera variable. Todas las cadenas ligeras fueron Vk. Las secuencias de aminoacido y acido nucleico de VH y VL de G6 murino son las siguientes:
Secuencia de nucleotido VH de muG6:(sec. con num. de ident.: 13)
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGTGCTCGCAAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT
GGCTACACCTTTACCAGTTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCT
GTTTCTCCTGGAAATAGTGATACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGTCACATCC
ACCAGCACTGCCTACATGGAGTTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAAGTCGA
TATGGTAACAATGCTTTGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Secuencia de aminoacido VH de muG6:(sec. con num. de ident.: 14)
QVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNQKFKGKATLTAVTS
TSTAYMEFSSLTNEDSAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTTVTVSS
Secuencia de nucleotido Vl de muG6 -19:(sec. con num. de ident.: 15)
GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCC
AGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTC
CTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC
ACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAagGGAGCTTACACG
TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
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Secuencia de nucleotido Vl de muG6 -30:(sec. con num. de ident.:16)
GACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCC
AGCGCAAGTGTTGATAATTATGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTC
CTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC
AGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAagGGAGCTTACACG
TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Secuencia de nucleotido Vl de muG6 -39:(sec. con num. de ident.: 17)
GACATCGAGCTCACTCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAACATCACTTGCCGTGCA
AGTCAGGGCATTAGCAGTAATATAGTGTGGTTGCAGCAGAAACCAGGGAAGTCATTTAAGGGCCTGATCTATCAT
GGGACCAATTTGGAAGATGGAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATC
AGCAGCCTGGAATCTGAGGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATTCTCAGTTTCCTCCCACGTTCGGCTCG
GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Secuencia de aminoacido Vl de muG6:(sec. con num. de ident.:18)
DIELTQSPSSMSVSLGDTVNITCRASQGISSNIVWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTI
SSLESEDFADYYCVQYSQFPPTFGSGTKLELK
Las CDR de cadena pesada del anticuerpo huG6 tienen las siguientes secuencias:CDRH1:GYTFTSYW (sec. con num. de ident.: 5); CDRH2:VSPGNSDT (sec. con num. de ident.: 6); y CDRH3:TRSRYGNNALDY (sec. con num. de ident.: 7). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo huG6 tienen las siguientes secuencias:CDR1:QGISSNIVW (sec. con num. de ident.: 8); CDRL2:HGT (sec. con num. de ident.: 9); y CDRL3:VQYSQFPPT (sec. con num. de ident.: 10). Las secuencias de nucleotidos VH y VL se optimizaron para el uso de codones de mairnferos.
Secuencia de nucleotido Vh de huG6.2:(sec. con num. de ident.:1)
CAGGTCCAGCTCGTCCAGTCCGGCGCTGAAGTGGTGAAACCCGGGGCATCCGTCAAAGTCTCTTGTAAGGCTAGT
GGCTACACCTTCACATCCTACTGGATGCATTGGGTGAAACAGGCACCTGGCCAGGGACTCGAATGGATCGGAGCC
GTGTCTCCTGGAAATTCCGACACCTCCTACAACGAAAAATTCAAGGGCAAGGCAACCCTCACTGTGGATACTAGT
GCTTCTACCGCCTACATGGAACTCTCATCTCTCCGCTCTGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTACTCGGTCACGA
TACGGGAACAACGCTCTCGATTACTGGGGACAGGGCACACTGGTCACTGTCTCT
Secuencia de aminoacido Vh de huG6.2:(sec. con num. de ident.:2)
Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsywmhwvkqapgqglewigavspgnsdtsynekfkgkatltvd|s
ASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVS
Secuencia de nucleotido VLdehuG6.2 y Vl huG6.3:(sec. con num. de ident.: 3)
GATATTCAGCTCACACAGAGCCCATCTTCTCTGTCTGCTTCTGTGGGCGATCGAGTGACAATCACTTGTCGGGCT
AGTCAGGGCATTTCTAGCAACATTGTGTGGCTCCAGCAGAAACCTGGCAAAGCCCCAAAAGGCCTCATCTACCAC
GGAACCAACCTGGAATCTGGCGTGCCATCTCGGTTTAGTGGATCTGGATCCGGGACCGATTACACACTCACCATC
TCTTCACTGGAACCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTGTCCAGTACTCCCAGTTTCCACCCACTTTTGGACAG
GGAACCAAACTCGAGATCAAA
Secuencia de aminoacido Vl de huG6.2 y Vl de huG6.3:(sec. con num. de ident.:4)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTI
SSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK
Secuencia de nucleotido Vh de huG6.3:(sec. con num. de ident.: 11)
CAGGTCCA.GCTCGTCCAGTCCGGCGCTGAAGTGGTGAAA.CCCGGGGCATCCGTCA.AAGTCTCTTGTAAGGCTA.GT
GGCTACACCTTCACATCCTACTGGATGCATTGGGTGAAACAGGCACCTGGCCAGGGACTCGAATGGATCGGAGCC
GTGTCTCCTGGAAATTCCGACACCTCCTACAACGAAAAATTCAAGGGCAAGGCAACCCTCACTGTGGACAAATCT
GCCTCTACCGCCTACATGGAACTCTCATCTCTCCGCTCTGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTACCCGGTCACGA
TACGGCAATAACGCCCTCGATTACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACTGTGTCT
Secuencia de aminoacido Vh de huG6.3:(sec. con num. de ident.: 12)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDgs
ASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVS
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Anticuerpos
Como se usa en la presente descripcion, el termino "anticuerpo" se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moleculas que contienen un sitio de union al antigeno que se unen (inmunoreacciona con) espedficamente a un antigeno. Por "se une espedficamente" o "inmunorreacciona con" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o mas determinates antigenicos del antigeno deseado y no reacciona con otros polipeptidos. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a policlonal, monoclonal, quimerico, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, fragmentos, Fab, Fab' y F(ab')2, los scFv, y bibliotecas de expresion Fab.
Una molecula de polipeptido Fv de cadena simple ("scFv") es un heterodfmero Vh ::Vl covalentemente enlazado, que puede expresarse a partir de una fusion genica que incluye genes que codifican Vh y Vl enlazados mediante un enlazador que codifica un peptido.(Ver Huston y otros (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883). Se han descrito un numero de metodos para discernir estructuras qmmicas para convertir las cadenas polipeptfdicas ligeras y pesadas, naturalmente agregadas, pero qmmicamente separadas, de una region V de anticuerpo en una molecula scFv, que se pliega en una estructura tridimensional esencialmente similar a la estructura de un sitio de union a antigeno. Ver, por ejemplo,Patente de los Estados Unidos nums. 5,091,513; 5,132,405; y 4,946,778.
Se han creado y pueden crearse bibliotecas de scFv humanas vfrgenes muy grandes para ofrecer una gran fuente de genes de anticuerpos reorganizados frente a una pletora de moleculas objetivo. Pueden construirse bibliotecas mas pequenas a partir de individuos con enfermedades infecciosas para aislar anticuerpos espedficos de la enfermedad. (Ver Barbas y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992); Zebedee y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)).
En general, las moleculas de anticuerpos obtenidas de seres humanos se relacionan con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sf por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molecula. Ciertas clases tambien tienen subclases, tales como IgG-i, IgG2, y otros. Ademas, en los humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. El termino "sitio de union a antigeno" o "porcion de union" se refiere a la parte de la molecula de inmunoglobulina que participa en la union al antfgeno. El sitio de union al antfgeno se forma por residuos de aminoacidos de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes mas conservados conocidos como "regiones marco" o "FR".Asf, el termino "FR" se refiere a secuencias de aminoacidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molecula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen una respecto de la otra en un espacio tridimensional para formar una superficie de union a antfgeno. La superficie de union a antfgeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antfgeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad," o "CDR". Espedficamente, las CDR de las cadenas pesadas de anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, respectivamente.De manera similar, las CDR de las cadenas ligeras de anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente.
Un idiotipo es la variacion geneticamente determinada de estructuras intramoleculares en las regiones variables de inmunoglobulinas. T. Sin embargo, la variacion del idiotipo implica la secuencia de aminoacidos y la estructura de la protema (los llamados determinantes) especialmente en el area del sitio de union al antfgeno, tambien denominado "idiotopo". El termino "idiotipo" designa el conjunto completo de determinantes de una region variable de una molecula de anticuerpo.
Puede generarse un anticuerpo antiidiotipo con un proceso que usa un anticuerpo monoclonal humano purificado o una lmea celular de hibridoma humano que expresa un anticuerpo monoclonal humano. Por ejemplo, un proceso para la generacion de un anticuerpo antiidiotipo puede implicar cultivar una lmea celular de hibridoma humano que segrega un anticuerpo monoclonal humano en su sobrenadante y purificar este anticuerpo, por ejemplo, por medio del uso de cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico, filtracion en gel o una de sus combinaciones. Este anticuerpo monoclonal humano purificado puede usarse despues para inmunizar un mairnfero no humano, tal como un raton o una rata, por medio de, por ejemplo, de una inyeccion intraperitoneal o in vitro directamente sobre linfocitos B aislados. Despues pueden aislarse linfocitos B del mamffero no humano sacrificado hasta cuatro dfas despues de la ultima inmunizacion, y los linfocitos B aislados pueden ponerse en contacto con celulas de mieloma de la misma especie (por ejemplo, raton o rata) en condiciones que conducen a la fusion de las celulas de mieloma con los linfocitos B para generar una celula de hibridoma no humana. Estas celulas de hibridoma no humanas pueden despues cultivarse y analizarse (por ejemplo, por medio de ELISA) para la expresion de anticuerpos Ig idiotipo, por ejemplo, anticuerpos IgM, IgA o IgG, despues de, por ejemplo, tres semanas de cultivo. Estos anticuerpos Ig pueden probarse para determinar la union espedfica a las celulas de hibridoma humano y a diversos anticuerpos, que incluyen el anticuerpo monoclonal humano usado para inmunizar al mamffero no humano.
Como se usa en la presente descripcion, el termino "epttopo" incluye cualquier determinante de protema capaz de la union espedfica a una inmunoglobulina, un scFv, o un receptor de celulas T. Los determinantes epitopicos por lo
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general consisten en agrupaciones de moleculas de superficie qmmicamente activa tales como los aminoacidos o cadenas laterales de azucares y por lo general tienen caractensticas espedficas de estructura tridimensional, asf como las caractensticas espedficas de carga. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos contra peptidos N-terminales o C- terminales de un polipeptido.
Como se usa en la presente descripcion, los terminos "union inmunologica" y "propiedades de union inmunologicas" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molecula de inmunoglobulina y un antigeno para el que la inmunoglobulina es espedfica. La fuerza o afinidad de las interacciones de union inmunologica puede expresarse en terminos de la constante de disociacion (Kd) de la interaccion, en donde una Kd mas pequena representa una afinidad mayor. Las propiedades de union inmunologica de los polipeptidos seleccionados pueden cuantificarse usando metodos bien conocidos en la tecnica. Uno de tales metodos implica medir las velocidades de formacion y disociacion del complejo de union a antfgeno/sitio antigeno, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de las parejas complejas, la afinidad de la interaccion y los parametros geometricos que igualmente influyen en la velocidad en ambas direcciones. Asf, tanto la "constante de velocidad de asociacion" (Kon) como la "constante de velocidad de disociacion" (Kof) pueden determinarse mediante el calculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociacion y disociacion. (Ver Nature 361:186-87 (1993)). La relacion de Koff/Kon permite la cancelacion de todos los parametros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociacion Kd. (Ver, en general, Davies y otros (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo se une espedficamente a un epftopo cuando la constante de union en equilibrio (Kd) es <1 jM, preferentemente <100 nM, con mayor preferencia <10 nM, y con preferencia superlativa <100 pM a aproximadamente de 1 pM, segun lo medido por ensayos tales como ensayos de union de radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la tecnica.
Los expertos en la tecnica reconoceran que es posible determinar, sin una experimentacion excesiva, si un anticuerpo monoclonal humano tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la invencion al determinar si el primero impide que este ultimo se una a un polipeptido de la region variable de inmunoglobulina humana. Si el anticuerpo monoclonal humano que se prueba compite con el anticuerpo monoclonal de la invencion, como se muestra por una disminucion en la union por el anticuerpo monoclonal de la invencion, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo, o a un epftopo mtimamente relacionado.
Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra una protema de la descripcion, o contra derivados, fragmentos, homologos analogos u ortologos de estos.(Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los anticuerpos pueden purificarse mediante tecnicas bien conocidas, tales como la cromatograffa de afinidad que usa la protema A o la protema G, que proporcionan principalmente la fraccion IgG del suero inmune. Posteriormente, o alternativamente, el antfgeno espedfico que es el objetivo de la inmunoglobulina buscada, o un epftopo de este, puede inmovilizarse en una columna para purificar el anticuerpo inmune espedfico mediante cromatograffa de inmunoafinidad. La purificacion de inmunoglobulinas se discute, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Filadelfia PA, Vol. 14, Num. 8 (abril 17, 2000), pags. 25-28).
El termino "anticuerpo monoclonal" o "MAb" o "composicion de anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripcion, se refiere a una poblacion de moleculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molecula de anticuerpo que consiste en un producto unico de gen de cadena ligera y un producto genico de cadena pesada unico. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son identicas en todas las moleculas de la poblacion. Los MAb contienen un sitio de union a antfgeno capaz de inmunorreaccionar con un epftopo particular del antfgeno caracterizado por una afinidad de union unica por el.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando los metodos del hibridoma tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un metodo de hibridoma, un raton, hamster, u otro animal huesped adecuado, tipicamente se inmuniza con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante tfpicamente incluira el antfgeno de protema, un fragmento de este o una protema de fusion de este. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periferica si se desean celulas de origen humano, o se usan celulas de bazo o celulas de nodulo linfatico si se desean fuentes de mairftferos no humanos. Los linfocitos se fusionan despues con una lmea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pags. 59-103). Las lmeas celulares inmortalizadas por lo general son celulas de mamfero transformadas, particularmente celulas de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Por lo general, se emplean lmeas celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de
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cultivo para los hibridomas tipicamente incluira hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
Las lmeas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan una expresion estable de alto nivel de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las lmeas celulares inmortalizadas mas preferidas son lmeas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Centro de Distribucion de Celulas del Instituto Salk, San Diego, California y la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. Se han descrito ademas lmeas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano raton para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos. ((Ver Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pags. 51-63)).
El medio de cultivo en el que se cultivan las celulas de hibridoma puede analizarse despues para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferentemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina por inmunoprecipitacion o por un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales tecnicas y ensayos se conocen en la tecnica. La afinidad de union de un anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el analisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal.Biochem., 107:220 (1980).Ademas, en aplicaciones terapeuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de union por el antigeno objetivo.
Despues de que se identifican las celulas de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitante y crecer mediante metodos estandar. (VerGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pags. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.Alternativamente, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un marnffero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, protema A-Sefarosa, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse ademas por metodos de ADN recombinante, tales como se describen en la patente de los Estados Unidos num. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion pueden aislarse y secuenciarse facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma de la invencion sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, los cuales se transfectan despues en las celulas huesped tales como celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que de cualquier otra forma no producen protema de inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. El ADN puede modificarse ademas, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Ver la Patente de los Estados Unidos num. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipeptido no inmunoglobulmico.Un polipeptido no inmunoglobulmico de ese tipo puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinacion de antfgeno de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo bivalente quimerico.
Los anticuerpos completamente humanos son moleculas de anticuerpos en las que la secuencia completa tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las CDR, surge de genes humanos. Tales anticuerpos se denominan "anticuerpos humanizados", "anticuerpos humanos", o "anticuerpos completamente humanos" en la presente descripcion. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos usando la tecnica de trioma; la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Ver Kozbor, y otros, 1983 Immunol Today 4: 72); y la tecnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Ver Cole, y otros, 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CAnCeR THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96). Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales humanos y pueden producirse usando hibridomas humanos (Ver Cote, y otros, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando celulas B humanas con Virus de Epstein Barr in vitro (Ver Cole, y otros, 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96).
Ademas, los anticuerpos humanos pueden producirse ademas usando tecnicas adicionales, que incluyen bibliotecas de presentacion en fagos.(VerHoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581
(1991)).De manera similar, los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente inactivados. Tras el desaffo, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se parece mucho a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluido el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos nums.
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5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en Marks y otros, Bio/Technology 10, 779-783
(1992) ; Lonberg y otros, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern.Rev. Immunol.13 65-93 (1995).
Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente usando animales transgenicos no humanos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endogenos del animal en respuesta a la exposicion por un antigeno. (Ver publicacion PCT de documento de patente num. WO94/02602). Los genes endogenos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en el huesped no humano han sido incapacitados, y los loci activos que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humana se insertan en el genoma del huesped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano requeridos. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se obtiene despues como progenie cruzando animales intermedios transgenicos que contienen menos que el complemento completo de las modificaciones. El animal no humano preferido de este tipo es un raton, y se denomina Xenomouse™ como se describe en publicaciones PCT de documento de patente num. WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce celulas B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal despues de la inmunizacion con un inmunogeno de interes, como, por ejemplo, una preparacion de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de celulas B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Ademas, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener analogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moleculas Fv de cadena simple (scFv).
Un ejemplo de un metodo para producir un huesped no humano, ejemplificado como un raton, que carece de expresion de una cadena pesada de inmunoglobulina endogena se describe en la Patente de los Estados Unidos num. 5.939.598. Puede obtenerse mediante un metodo, que incluye eliminar los genes del segmento J de al menos un locus de cadena pesada endogeno en una celula madre embrionaria para prevenir la reordenacion del locus y evitar la formacion de una transcripcion de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada, la eliminacion se efectua mediante un vector de direccionamiento que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y que produce a partir de la celula madre embrionaria un raton transgenico cuyas celulas somaticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.
Un metodo para producir un anticuerpo de interes, tal como un anticuerpo humano, se describe en la Patente de los Estados Unidos num. 5.916.771. Este metodo incluye introducir un vector de expresion que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una cadena pesada en una celula huesped de mamfero en cultivo, introducir un vector de expresion que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una cadena ligera en otra celula huesped de mamffero y fusionar las dos celulas para formar una celula hfbrida. La celula hfbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.
En una mejora adicional de este procedimiento, un metodo para identificar un epftopo clrnicamente relevante en un inmunogeno, y un metodo correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespedficamente al epftopo relevante con alta afinidad, se describen en publicacion PCT documento de patente num. WO 99/53049.
El anticuerpo puede expresarse mediante un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.
Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola de genes, cateteres, etc. Los vectores incluyen conjugados qmmicos tales como los descritos en documento de patente num. WO 93/64701, que tiene una porcion de direccionamiento (por ejemplo un ligando a un receptor de superficie celular) y una porcion de union a acido nucleico (por ejemplo polilisina), vector viral (por ejemplo un vector viral de ADN o ARN), protemas de fusion tales como las descritas en documento de patente num. PCT/US 95/02140 (documento de patente WO 95/22618) que es una protema de fusion que contiene una porcion objetivo (por ejemplo un anticuerpo espedfico para una celula objetivo) y una porcion de union a acido nucleico (por ejemplo una protamina), plasmidos, fago, etc. Los vectores pueden ser cromosomicos, no cromosomicos o sinteticos.
Los vectores preferidos incluyen vectores virales, protemas de fusion y conjugados qmmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina moloney. Se prefieren los vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores pox tales como vectores ortopox o avipox, vectores herpesvirus tales como un vector del virus del herpes simple (Ver Geller, A. I. y otros, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., y otros, en DNA Cloning:Mammalian Systems, D. Glover, Ed.(Oxford Univ. Press, Oxford Inglaterra) (1995); Geller, A. I. y otros, Proc Natl. Acad. Sci. U. S.A. 90:7603
(1993) ; Geller, A. I., y otros, Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), Vectores de Adenovirus (Ver LeGal LaSalle y otros, Science, 259:988 (1993); Davidson, y otros, Nat.Genet 3:219 (1993); Yang, y otros, J. Virol.69:2004 (1995) y vectores de virus adenoasociados (Ver Kaplitt, M. G. y otros, Nat.Genet.8:148 (1994).
Los vectores virales Pox introducen el gen en el citoplasma de las celulas. Los vectores del virus Avipox resultan solo una expresion a corto plazo del acido nucleico. Se prefieren los vectores adenovirus, vectores de virus adenoasociados
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y vectores de virus del herpes simple (HSV) para introducir el acido nucleico en las celulas neuronales. El vector de adenovirus resulta en una expresion de termino mas corto (aproximadamente 2 meses) que el virus adenoasociado (aproximadamente 4 meses), que a su vez es mas corta que los vectores de HSV. El vector particular elegido dependera de la celula objetivo y la afeccion que se trate. La introduccion puede ser mediante tecnicas estandar, por ejemplo infeccion, transfeccion, transduccion o transformacion. Ejemplos de modos de transferencia genica incluyen por ejemplo, ADN desnudo, precipitacion con CaPO4 DEAE dextrano, electroporacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, microinyeccion celular y vectores virales.
El vector puede emplearse para atacar esencialmente cualquier celula objetivo deseada. Por ejemplo, la inyeccion estereotaxica puede usarse para dirigir los vectores (por ejemplo adenovirus, HSV) a una ubicacion deseada. Ademas, las partmulas pueden suministrarse mediante infusion intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusion de minibomba, como un sistema de infusion SynchroMed.,Un metodo basado en el flujo a granel, denominado conveccion, ha demostrado ademas la eficacia en el suministro de moleculas grandes a areas extendidas del cerebro y puede ser util para suministrar el vector a la celula objetivo.(Ver Bobo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080
(1994); Morrison y otros, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)).otros metodos que pueden usarse incluyen cateteres, inyeccion intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutanea, y vfas de administracion oral u otras conocidas.
Las tecnicas pueden adaptarse para la produccion de anticuerpos monocatenarios espedficos para una protema antigenica de la descripcion (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos num. 4,946,778).Ademas, los metodos pueden adaptarse para la construccion de bibliotecas de expresion Fab (ver por ejemplo, Huse, y otros, 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificacion rapida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una protema o derivados, fragmentos, analogos u homologos de esta. Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos para un antfgeno de protema pueden producirse por tecnicas conocidas en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a:(i) un fragmento F(ab')2 producido por digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado al reducir los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papama y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.
Los anticuerpos heteroconjugados estan ademas dentro del alcance de la presente descripcion. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las celulas del sistema inmune a las celulas no deseadas (ver Patente de los Estados Unidos num. 4,676,980), y para el tratamiento de la infeccion por HIV (verdocumento de patente num. WO 91/00360; documento de patente num. WO 92/200373; documento de patente num. EP 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro mediante metodos conocidos en la qrnmica de protemas sinteticas, que incluyen aquellos que involucran los agentes de reticulacion. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse mediante una reaccion de intercambio de disulfuro o por la formacion de un enlace tioeter. Ejemplos de reactivos adecuados para este proposito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos num. 4,676,980.
Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invencion con respecto a la funcion efectora, para mejorar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cancer. Por ejemplo el(los) residuo(s) de cistema(s) puede(n) introducirse en la region Fc, permitiendo de ese modo la formacion de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region. El anticuerpo homodimerico asf generado puede haber mejorado la capacidad de internalizacion y/o aumentado la muerte celular mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Ver Caron y otros, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, puede modificarse geneticamente un anticuerpo que tenga dos regiones de Fc y puede tener de ese modo las capacidades de lisis de complemento y de la ADCC mejoradas. (Ver Stevenson y otros, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
La descripcion se refiere ademas a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de esta), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de estas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas de diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP S-), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionuclidos estan disponibles para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de protema bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tal como dimetilo adipimidato HCL), esteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehfdos (tal como glutaraldehfdo), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina
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puede prepararse como se describe en Vitetta y otros, Science 238:1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3- metildietileno triaminapentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para la conjugacion del radionucleotido al anticuerpo. (Ver documento de patente num. WO94/11026).
Los expertos en la tecnica reconoceran que puede acoplarse una gran variedad de porciones posibles a los anticuerpos resultantes o a otras moleculas de la invencion.(Ver, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nueva York, (1989)).
El acoplamiento puede lograrse mediante cualquier reaccion qmmica que unira a las dos moleculas siempre que el anticuerpo y la otra porcion retengan sus respectivas actividades. Este enlace puede incluir muchos mecanismos qmmicos, por ejemplo union covalente, union por afinidad, intercalacion, union coordinada y formacion de complejos. La union preferida es, sin embargo, union covalente. La union covalente puede lograrse ya sea mediante condensacion directa de cadenas laterales existentes o mediante la incorporacion de moleculas de puente externas. Muchos agentes de enlaces bivalentes o polivalentes son utiles en el acoplamiento de moleculas de protema, tales como los anticuerpos de la presente invencion, a otras moleculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos organicos tales como tioesteres, carbodiimidas, esteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehudo, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la tecnica, sino mas bien, es ilustrativa de los agentes de acoplamiento mas comunes. (VerKillen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y otros, Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y otros, Science 238:1098 (1987)). Los enlazadores preferidos se describen en la literatura. (Ver, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y otros, Cancer Res. 44:201-208 (1984) que describen el uso de MBS (ester de M- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Verademas, la Patente de los Estados Unidos num. 5.030.719, que describe el uso del derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptido. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen:(i) clorhidrato de EDC (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida, (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem.Co., Cat. (21558G); (iii) SpDp (succinimidil-6[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., num. de cat. 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. num. de cat. 2165-G), y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., num. de cat. 24510) conjugado con EDC.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, lo que conduce asf a conjugados con diferentes propiedades fisicoqmmicas. Por ejemplo, los esteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son mas estables que los esteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromaticos. Los enlazadores que contienen esteres de NHS son menos solubles que los esteres de sulfo-NHS. Ademas, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estericamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces debido a que el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que resulta en un menor conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tal como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman esteres que son mas resistentes a la hidrolisis que la reaccion de acoplamiento de carbodimida sola.
Los anticuerpos descritos en la presente descripcion pueden formularse ademas como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por metodos conocidos en la tecnica, tales como los descritos en Epstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82:3688 (1985); Hwang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77:4030 (1980); y Patente de los Estados Unidos nums. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un tiempo de circulacion mejorado se describen en la Patente de los Estados Unidos num. 5,013,556.
Particularmente, los liposomas utiles pueden generarse por el metodo de evaporacion de fase inversa con una composicion de lfpidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidil etanolamina derivatizada con PEG (PEG- PE). Los liposomas son extrudidos a traves de filtros de tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invencion pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin y otros, J. Biol.Chem., 257:286-288 (1982) a traves de una reaccion de intercambio de disulfuro.
Metodos de tratamiento
Los anticuerpos pueden usarse para prevenir, diagnosticar o tratar trastornos medicos en un sujeto, especialmente en humanos. La descripcion proporciona metodos tanto profilacticos como terapeuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) o que tiene una infeccion. La infeccion es viral, bacteriana, fungica o parasitaria.
La presente descripcion proporciona metodos para aumentar la respuesta inmune de un sujeto a un antfgeno que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o fragmento de este que reconoce un gen VH1-69 de la lmea germinal en la region variable de la cadena pesada humana y un inmunogeno capaz de inducir una inmunidad reaccion a dicho antfgeno. En algunos aspectos, el anticuerpo es huG6.2. En otro aspecto, el anticuerpo es huG6.3. En algun aspecto, el anticuerpo incluye una region variable de cadena pesada (sec. con. nums. de ident.: 2 o 12), codificada por la secuencia de acido nucleico sec. con. nums. de ident.:1 u 11, y una region variable de cadena ligera (sec. con num. de ident.: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico sec. con num. de ident.:3. Las CDR de cadena pesada del
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anticuerpo tienen las siguientes secuencias: sec. con nums. de ident.:5, 6 y 7. Las CDR de cadena ligera del anticuerpo tienen las siguientes secuencias:sec. con nums. de ident.:8, 9 y 10. Preferentemente, las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoacidos de al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, o mas identica a la secuencia de aminoacidos de la sec. con. nums. de ident.:5, 6 y 7 y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoacidos de al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, o mas, identica a la secuencia de aminoacidos de sec. con. nums. de ident.:8, 9 y 10.
En algunos aspectos, el inmunogeno se enlaza covalentemente al anticuerpo. El antigeno podna ser un virus, una bacteria, un hongo o un parasito. El inmunogeno es de origen viral (por ejemplo, gripe, HIV), bacteriano y fungico. Por ejemplo, el inmunogeno es la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe o fragmento de esta. Preferentemente, el inmunogeno comprende la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe. El anticuerpo de esta invencion puede administrarse antes, a la vez o despues de la administracion del inmunogeno.
En la descripcion se incluyen metodos para aumentar o potenciar una respuesta inmune a un antfgeno. Una respuesta inmune se aumenta o potencia mediante la administracion al sujeto un anticuerpo anti idiotipo del gen de la lmea germinal de la region variable de la inmunoglobulina y un inmunogeno. En una modalidad preferida, el anticuerpo incluye una region variable de cadena pesada (sec. con. nums. de ident.: 2 o 12), codificada por la secuencia de acido nucleico sec. con. nums. de ident.:1 u 11, y una region variable de cadena ligera (sec. con num. de ident.: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico sec. con num. de ident.:3. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo tienen las siguientes secuencias: sec. con nums. de ident.:5, 6 y 7. Las CDR de cadena ligera del anticuerpo tienen las siguientes secuencias: sec. con nums. de ident.:8, 9 y 10. Preferentemente, las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoacidos de al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, o mas identica a la secuencia de aminoacidos de la sec. con. nums. de ident.:5, 6 y 7 y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoacidos de al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, o mas, identica a la secuencia de aminoacidos de sec. con. nums. de ident.:8, 9 y 10.
En algunos aspectos, el gen de la lmea germinal es VH1-69. En algunos aspectos, el anticuerpo es huG6.2. En otro aspecto, el anticuerpo es huG6.3. El antfgeno podna ser un virus, una bacteria, un hongo o un parasito. El inmunogeno es de origen viral (por ejemplo, gripe, HIV), bacteriano y fungico. Por ejemplo, el inmunogeno es la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe o fragmento de esta. Preferentemente, el inmunogeno comprende la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe. El anticuerpo de esta invencion puede administrarse antes, a la vez o despues de la administracion del inmunogeno.
Composiciones farmaceuticas
Los anticuerpos o agentes descritos en la presente descripcion (ademas denominados en la presente descripcion "compuestos activos"), y los derivados, fragmentos, analogos y homologos de estos, pueden incorporarse en composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion. Tales composiciones tfpicamente comprenden el anticuerpo o agente y un portador farmaceuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripcion, el termino "portador farmaceuticamente aceptable" se pretende que incluya cualquiera y todos los solventes, medio de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicoticos, agentes isotonico y de retardo de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Los portadores adecuados se describen en la edicion mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estandar en el campo. Los ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solucion salina, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa, y albumina de suero humano al 5%. Pueden usarse liposomas y vehmulos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Compuestos activos suplementarios tambien se pueden incorporaren las composiciones.
Una composicion farmaceutica de la invencion se formula para ser compatible con su via de administracion prevista. Los ejemplos de vfas de administracion incluyen administracion parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (por ejemplo, inhalacion), transdermica (es decir, topica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones que se usan para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tal como acido etilendiaminotetraacetico (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clortudrico o hidroxido sodico. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiples hechos de vidrio o plastico.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir dispersiones o soluciones acuosas esteriles (solubles en agua) y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de dispersiones o soluciones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los portadores adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor TM EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solucion salina regulada con fosfato (PBS). En
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todos los casos, la composicion debe ser esteril y debena ser fluida hasta el punto que sea facilmente inyectable. Debena ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debena preservarse contra la accion de contaminacion de los microorganismos tales como bacteria y hongos. El portador puede ser un medio de dispersion o solvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede lograrse porvarios agentes antibacterianos y antimicoticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir en la composicion, agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composicion un agente que retarda la absorcion, por ejemplo, monoestearato alummico y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse mediante la incorporacion del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por la esterilizacion con filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un portador esteril que contiene un medio de dispersion basico y otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion son el secado al vacfo y liofilizacion que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solucion esteril de este previamente filtrada.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en capsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el proposito de la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, trociscos, o capsulas. Las composiciones orales pueden prepararse ademas usando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica por via oral. Los agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composicion. Las tabletas, pfldoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tales como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tales como almidon o lactosa, un agente desintegrante tales como acido algmico, Primogel o almidon de mafz; un lubricante tales como estearato de magnesio o esterotes; un agente de deslizamiento tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tales como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tales como yerbabuena, salicilato de metilo, o sabor de naranja.
Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en la forma de una atomizacion de aerosol a partir de un dispersador o contenedor presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dioxido de carbono, o un nebulizador.
La administracion sistemica puede ser ademas por medios transmucosales o transdermicos. Para la administracion transmucosal o transdermica, se usan en la formulacion, penetrantes adecuados para la barrera que se penetra. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, para administracion transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion transmucosal puede lograrse a traves del uso de atomizadores nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, unguentos, geles, o cremas que se conocen generalmente en la tecnica.
Los compuestos pueden prepararse ademas en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para el suministro rectal.
En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegeran el compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluyen sistemas de suministro microencapsulados e implantes. Pueden usarse polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno y acetato de vinilo, polianhndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales pueden obtenerse ademas comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomicas (que incluyen liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales para antfgenos virales) pueden usarse ademas como portadores farmaceuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de conformidad con los metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos num. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administracion y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente descripcion se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de dosis unitarias de la invencion se dictan por, y dependen directamente de, las caractensticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que se desea, y las limitaciones inherentes en la tecnica de la composicion tal como un compuesto activo para el tratamiento de los individuos.
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Las composiciones farmaceuticas se pueden incluir en un contenedor, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administracion.
Esta descripcion se refiere ademas a nuevos agentes identificados por cualquiera de los ensayos de tamizaje mencionados anteriormente y sus usos para tratamientos como se describen en la presente descripcion.
Ejemplos
Ejemplo 1.Humanizacion del anticuerpo G6 de raton.
1. Modelo de homologfa del anticuerpo G6 de raton usando el Modelado de Anticuerpo Web (WAM).
La secuencia de aminoacidos de la cadena pesada variable (VH) y ligera variable (VL) de G6 de raton se enviaron al programa de modelado de anticuerpos basado en la Web (WAM)1 para generar el modelo de homologfa del anticuerpo G6 de raton. El programa W AM tiene en cuenta varios parametros que rigen diferentes conformaciones de los anticuerpos. En los anticuerpos, por lo general los residuos en la region marco se conservan en su mayor parte, mientras que los residuos que forman las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las mas variables. Como tal enfoque basado en la homologfa se usa, cinco de las seis CD R (excepto la cadena pesada CDR3) pueden categorizarse en clases de estructura canonica clasica. Ademas, los miembros de las mismas clases canonicas tienen una conformacion de bucle muy similar. Esto se determina por la longitud del bucle, la presencia de ciertos residuos clave conservados no solo en las regiones marco sino ademas en las CDR.
Brevemente WAM llevo a cabo diferentes parametros computacionales en su algoritmo para crear un modelo de homologfa de formato de anticuerpo G6 de raton a partir de su secuencia de aminoacidos usando los siguientes criterios:
a) Los residuos del marco de un anticuerpo G6 de raton que no solo incluyen los residuos de la cadena principal sino ademas residuos de cadena lateral junto con residuos de cadena principal de bucle canonico se construyeron usando las estructuras de homologfa mas conocidas (rayos X y RMN).
b) Usando un muestreo conformacional uniforme con el algoritmo iterativo CONGEN, se predijo la conformacion de las cadenas laterales en los bucles para obtener la conformacion mas minimizada energeticamente 2
c) Las regiones de bucle no canonicas se modelaron a traves de una serie de conformaciones obtenidas a partir de la busqueda de bases de datos de bancos de datos de protemas (PDB) o usando una busqueda de base de datos conformacional/estructura diferente para una conformacion de bucle.
d) Fue minimizada ademas la energfa de las diferentes conformaciones generadas usando la etapa anterior usando Eureka, que es una version del campo de fuerza de valencia (VFF)3) modificada con solvente.Ademas, se uso tambien el tamizaje de la desviacion de la media cuadratica (R.M. S.D) que compara la similitud en r.m. S.d con las estructuras conocidas de CDR3 (H3) de cadena pesada que contienen la misma longitud que el candidato de modelado.
El modelo final del anticuerpo G6 de raton se selecciono de las primeras cinco conformaciones de energfa mas bajas. El algoritmo comparo los angulos de torsion entre el modelo candidato y el conjunto original de bucles de una estructura conocida en el banco de datos de protemas. El modelo final con la conformacion mas cercana al conjunto de angulos de torsion se selecciono y se mostro en la Figura 1.
2. Humanizacion de G6 de raton y generacion de la 1ra version de G6 humanizado (huG6.1) segun la secuencia de la lmea germinal humana mas cercana de G6 y accesibilidad superficial de residuos en los marcos de modelo de homologfa G6 de raton
El modelo de homologfa G6 de raton generado a partir de WAM se uso como molde para identificar los residuos que son accesibles en la superficie (expuestos al disolvente) tal como se visualiza a traves del programa DeepView, usando un lfmite umbral del 30% 4-5 Posteriormente se buscaron residuos de cadenas pesadas variables (VH) y cadenas ligeras (VL) de raton G6 usando IGBLAST (
www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) contra la base de datos de la lmea germinal de IgG humana. Para humanizar el G6 de raton, intercambiamos los residuos accesibles de la superficie en marcos tanto de VH como VL manualmente a los encontrados en la secuencia de la lmea germinal humana seleccionada, generando asf la version 1 humanizada de G6 (hG6.1). La alineacion de la secuencia se muestra mas abajo (Cambios totales de 14 aminoacidos en VH y 15 en VL).
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VH
sec. con num de ident. 19) Humano-G6.1-VH sec. con num de ident. 20) Raton-G6-VH
OVQLVCSCALVVKTOASv'KVSCKitSGYTrrsm-'HWVKOAPGC'GLEMIGAVSPGNSDT-Sy
OVOI§QSGYjHB|PGASVI^|SCKASSmTSYm5KWVKC§PGaGl£WIGAVSPGHSOTSY
H+ + + • . «■ » V »r *«*«-»*-* rt ** r •*«*» •* •* •*»**■%*»■%**>•* •»»«•*♦**
sec. con num. de ident. 19) Humano-G6.1-VH sec. con num. de ident. 20) Raton-GG-VH
HEKntGKATLTVDKSAST.AYKELSSLRSED7AVYYCTASRYGHJlALDYKGQGTI.VTVS «■* FKGKAT t.:J^(?|STAYKEFSS^HEI]§A\^'YCTRSRYGNNAt.DYWGQ<nj|VTVS
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sec. con num de ident. 21) sec. con num. de ident. 18)
sec. con num de ident. 21) sec. con num. de ident. 18)
VL
Humano-GG 1-VL Raton-G6-VL
Humano-G6.1-VL
Raton-GG-VL
DICM'iCSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSH'VWYQOKE'GKAPKGLIYHGTNLESC-VP.SRF
Sl|t.rOSM.!J.'|.c^|3!^|,.,ilICRASWISSMIV»LQCKPGt®K€I.IYK«rMLE|GVP3RF
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SGSGSGTDYTLTISSLCPEDFATYYCVOYSOrPPTFGOGtKLEIK
SCSGSC^FYfLTISSLijEDF/fYYCVOYSQFPPTFGjGTKlEgK
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A continuacion, la region variable monocatenaria G6.1 humana (scFv) se sintetizo de nuevo por Genewiz y el gen se optimizo con codones para la expresion en celulas de mairnferos. El fragmento scFv-Fc de huG6.1 se construyo mediante el subclonaje del scFv sintetizado en un vector de expresion de Fc pcDNA3.1-Bisagra que contiene los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana pero carece de dominio CH1. Se expreso el scFv-Fc de G6.1 humano en celulas 293T (ATCC) mediante transfeccion transitoria (Lipofectamina, Invitrogen) y se purifico mediante cromatograffa de afinidad de protema A sefarosa. Para probar la actividad de union del antigeno (en la presente descripcion es D80-IgG1 que usa la forma 51pa1 de VH1-69) de scFv-Fc de huG6.1 y compararlo con G6 de raton, biotinilamos huG6.1 y G6 de raton con un kit de biotinilacion comercial (Pierce) y se hizo el analisis ELISA. En resumen, se revistio D80-IgG en una placa Maxisorp de 96 pocillos a 2 |jg/ml, durante toda la noche a 4°C. La protema no unida se separo por lavado con pBs y la placa se bloqueo con leche al 2%/PBS durante 1 hora a 25°C. Se anadio scFv-Fc de HuG6.1 y scFv-Fc de G6 de raton biotinilados diluidos a los pocillos y se incubaron a 25°C durante 1 hora. Las placas se lavaron con PBST (0,05%Tween/PBS). Se anadio estreptavidina-HRP, se incubo a 25°C durante 30 minutos. Las placas se lavaron de nuevo y se revelaron con solucion de TMB y 5 minutos despues la reaccion se detuvo con la adicion de un reactivo de parada. La placa se leyo a OD450.Como se muestra en la Figura 2, huG6.1 perdio la actividad de union al antigeno significativamente en comparacion con el G6 de raton (Figura 2)
3. Minimizacion de la energfa de huG6.1 para mejorar la humanizacion.
A continuacion, aplicamos el parametro de minimizacion de energfa de campo de fuerza de GROMOS al modelo de homologfa huG6.1 usando el programa6DeepView. El modelo final se visualizo con los programas DeepView y PyMOL como se muestra en la Figura 3a. El examen de este modelo de homologfa minimizada de energfa del G6.1 humano resulto en la identificacion de ciertos residuos que teman geometna distorsionada o choques estericos entre diferentes residuos en el marco asf como residuos de regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se muestra en la Figura 3b.
4. Generar anticuerpos huG6.2 y G6.3 para mejorar la geometna distorsionada y los choques estericos usando el programa PyMOL.
Un examen mas detallado en el programa DeepView mostro ciertos residuos con alta entropfa en sus rotameros de cadena lateral. Estas anomalfas revelaron residuos con geometna distorsionada y choques estericos entre los residuos dentro de las regiones marco, asf como entre los residuos del marco y CDR. Una inspeccion adicional en PyMOL condujo a las siguientes observaciones:
i) Lisina73 (Lys73) (siguiendo completamente la numeracion kabat) en el VH esterico choco con Glicina53 (Gly53) en CDR2 de VH (Figura 4a).Debido a que los residuos de CDR no debenan cambiarse, la Lys73 (en huG6.3) se cambio de nuevo a Thr de G6 de raton para resolver el choque esterico.
ii) Metionina4 (Met4) tuvo un choque esterico con el residuo conservado de cistema 88 (Cys88) que se coloca justo antes de CDR3 de la region variable de la cadena ligera como se muestra en el panel izquierdo en la Figura 4b. La alineacion de secuencia revelo que Cys88 es un residuo altamente conservado y Met4 no lo es, por lo tanto Met4 puede mutarse de nuevo al residuo Leucina como se encuentra en el G6 de raton. Esta mutacion de nuevo resolvio el choque esterico entre los residuos como se muestra en el panel derecho de la Figura 4b.
iii) Tirosina 36 (Tyr36) en el marco 2 de cadena ligera tuvo ademas choque esterico con Leucina 100B (Leu100B) en el CDR3 de cadena pesada, el panel izquierdo, Figura 4c.Como tal Tyr36 puede mutarse de nuevo a Leu36 (residuo de raton) que resuelve el choque esterico entre los residuos como se muestra en el panel derecho en la Figura 4c.
iv) El residuo de Glutamina79 (Gln79) en la region del marco 3 (cadena ligera) tuvo choque esterico con Arginina61 (Arg61) del mismo panel izquierdo del marco en la Figura 4d. La alineacion de secuencias indico que Arg61 se conserva en su mayona entre diferentes secuencias homologas mientras que Glen79 no se conserva. Como tal Gln79 puede mutarse de
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nuevo a Glutamate79 en la cadena ligera que fija el choque esterico como se muestra en el panel derecho de la Figura 4d.
En resumen, identificamos cuatro residuos que pueden cambiar de nuevo a los residuos de raton: un residuo en VH (Thr73) y tres residuos en VL (Leu4, Leu36, Glu79). En base a este resultado del analisis estructural, fabricamos la version 2 (huG6.2) y la version 3 (huG6.3) de G6 humanizado. En huG6.2, los cuatro residuos se cambiaron de nuevo a residuos de raton. En huG6.3, solo los 3 aminoacidos en VL se cambiaron de nuevo a residuos de raton, en otras palabras, solo existe una diferencia de aminoacidos entre huG6.2 y huG6.3, que es el residuo de raton Thr73 en VH de huG6.2, mientras que la Lys73 humana en VH de huG6.3. Las diferencias en la secuencia de aminoacidos entre los genes huG6.1, huG6.2, huG6.3 y G6 de raton se muestran mas abajo, resaltados en rosa son los cuatro residuos.
Alineacion de secuencia multiple de huG6.1, huG6.2 y G6 de raton.
VH
(sec. con num. de ident.: 19) Humano-G6.1-VH (sec con num de ident : 2) Humano-G6 2-VH (sec con num de ident : 12) Humano-G6 3-VH (sec. con num. de ident.: 20) Raton-G6-VH
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSOTSY QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKGAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSY QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSY QVQLfQSGTmPGASVhfsCKASGYTFTSYWMHWVKCjPGQGLEWIGAVSPGNSDTSY **** ***. . . * ****** ****************** * ********************
(sec. con num. de ident.: 19) Humano-G6.1-VH (sec. con num. de ident.: 2) Humano-G6.2-VH (sec. con num. de ident.: 12) Humano-G6.3-VH (sec. con num. de ident.: 20) Raton-G6-VH
NEKFKGKATLTVtJSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVS NEKFKGKATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVS NEKFKGKATLTVtgSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVS N§KFKGKATLTj||?§STAYMEFSSI^NEE|AVYYCTRSRYGNNALDYWGQG'lJVTVS *.********* #•******•*** ************************* ****
VL
(sec. con num. de ident.: 21) (sec con num de ident : 4) (sec con num de ident : 4) (sec con num de ident : 18)
Humano-G6.1-VL
Humano-G6.2-VL
Humano-G6.3-VL
Raton-G6-VL
dicJtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissniw^oqkpgkapkgliyhgtnlesgvpsrf
DXQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRF DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQG1SSNIVWLQQK PGKAPKGL1Y HGTN LESGV PSRF Dl|LTQSPSSfSf£4|3L|-.^ITCRASQGISSNIVWLQQKPGK§|KGLIYHGTNLHjGVPSRF **.*******.* *♦** * **********************. *********** ******
(sec. con num. de ident.: 21) (sec. con niim. de ident.: 4) (sec. con num. de ident.: 4) (sec. con num. de ident.: 18)
Humano-G6 1-VL SGSGSGTDYTLTISSlflPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK
Humano-G6.2-VL sgsgsgtdytltisslepedfatyycvqysqfpptfgqgtkleik
Humano-G6 3-VL SGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVOYSQFPPTFGQGTKLEIK Raton-G6-VL SGSGSG§DY§LTISSLEJeDFP^YYCVQYSQFPPTFO§GTKLE§K ******.**.******* •*** ************** *******
5. Comparacion de la actividad de union a antfgeno de huG6.2 y G6 de raton.
El scFv-Fc de G6.2 humano se sintetizo, expreso, purifico y biotinilo usando el mismo metodo que el descrito anteriormente para huG6.1. El ELISA se realizo para comparar huG6.2 y G6 de raton. Como se muestra en la Figura 5, huG6.2 tiene una actividad de union similar a D80 que el G6 de raton. Ademas es consistente con los datos mostrados en la Figura 2, huG6.1 solo se une muy debilmente a D80. Esto demostro que los cuatro residuos cambian de huG6.1 de nuevo a los residuos de raton huG6.2 claramente juegan un papel importante en la restauracion de la actividad de union de G6 humanizado.
Ademas comparamos scFv-Fc de huG6.2 y scFv-Fc de mG6 usando el instrumento Octet Red (ForteBio, Menlo Park, CA, Estados Unidos) que utiliza la Interferometna Bio-Capa (BLI), una tecnologfa sin etiquetas para medir la interaccion protema a protema. Para este ensayo, el anrfgeno de G6, D80-scFv-Fc, se biotinilo y se revistio con puntas de biosensor de estreptavidina (SA) (ForteBio, Menlo Park, CA, Estados Unidos). El ensayo se realizo a 30°C en 1x tampon de ensayo cinetico (0,1 mg/ml de BSA, 0,002% de Tween-20, PBS). Las muestras se agitaron a 1000 rpm. Antes de la ejecucion experimental, los sensores SA se humidificaron en PBS durante 15 minutos. Se cargaron puntas de sensor de SA con 20 |jg/ml de scFv-Fc de D80 biotinilado durante 900 segundos, lo que rfpicamente resulto en niveles de captura de 3,0-3,5 nM. Se prepararon anticuerpos G6 en una concentracion de 100 nM. Las velocidades de asociacion y disociacion se monitorearon durante 300 segundos. Los datos se procesaron y analizaron usando el software de analisis de datos Octet (ForteBio).Como se muestra en la Figura 6.HuG6.2 (rojo) tiene una velocidad de asociacion y disociacion mas lenta que G6 de raton (azul). La afinidad para ambos esta dentro de un intervalo de 100 pM -1 nM.
6. Analisis cinetico de la actividad de union de scFv-Fc de HuG6.2 y scFv-Fc de HuG6.3 (mutante Thr73Lys) con D80 biotinilado.
La Interferometna Bio-Capa se realizo como se describio anteriormente. Brevemente, el unico cambio fue cuatro concentraciones diferentes de los scFv-Fc de G6.2 humano y de G6.3 humano (100nM, 10 nM, 1 nM y 0nM). Las velocidades de asociacion y disociacion se monitorearon durante 300 segundos y 4000 segundos, respectivamente. Los resultados mostraron que HuG6.3 tuvo velocidades de asociacion (on) mas rapidas y velocidades de disociacion mas lentas (off) en comparacion con G6.2 humano como se muestra en la Figura 7. Esto sugirio que el residuo Lys73 en la region marco 3 de la VH de Hu6.3 es importante en la union a D80.
En resumen, hemos preparado G6.2 y G6.3 humanizado que tienen una actividad/cinetica de union similar o mejor en comparacion con G6 de raton. La afinidad estimada para ellos esta dentro del intervalo de 100 pM-1 nM.
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Claims (9)

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    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo monoclonal G6 murino humanizado aislado que se une espedficamente a la region variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana codificada por el gen VH1-69 de la lmea germinal o un fragmento de este, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento comprende:
    a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos:
    QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVS PGNSDTSYNEKFKGKATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNAL DYWGQGTLVTVS (sec. con num. de ident.: 2); y
    una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos:
    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLES GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK (sec con num. de ident: 4); o
    b) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos: QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVS PGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNAL DYWGQGTLVTVS (sec. con num. de ident.: 12); y
    una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos: DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLES
    GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK (sec con num de ident.: 4)
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo es
    a. monovalente o bivalente, o
    b. un anticuerpo monocatenario.
  3. 3. Una composicion que comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  4. 4. La composicion de conformidad con la reivindicacion 3 que comprende ademas un antigeno, opcionalmente en donde dicho antfgeno
    a. se enlaza covalentemente a dicho anticuerpo y preferentemente en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monocatenario, o
    b. comprende la region del tallo de la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe.
  5. 5. La composicion de la reivindicacion 4, en donde dicho antfgeno es un virus, una bacteria o un hongo, opcionalmente en donde dicho virus es un virus de la gripe.
  6. 6. La composicion de la reivindicacion 4, en donde dicho antfgeno es la protema hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe o fragmento de este.
  7. 7. Una celula aislada que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  8. 8. Un anticuerpo o fragmento de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en la terapia.
  9. 9. Un anticuerpo o fragmento de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y un inmunogeno capaz de inducir una reaccion inmune a un antfgeno para su uso en la terapia.
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