ES2648978T3 - Recuento de glóbulos blancos - Google Patents

Abstract

Dispositivo (10) de adquisición de muestras para la enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra de sangre, comprendiendo dicho dispositivo (10) de adquisición de muestras: una cavidad (20) de medición para alojar una muestra de sangre en el que la muestra de sangre es sangre completa sin diluir que se ha adquirido directamente dentro de la cavidad de medición, teniendo dicha cavidad (20) de medición un grosor fijo predeterminado, medido de manera que dicho grosor, cuando el dispositivo está en uso, en combinación con un área de la muestra de la que están obteniéndose imágenes, define un volumen de muestra analizada; en el que el dispositivo (10) de adquisición de muestras comprende además: un reactivo (22), que se dispone en forma seca sobre una superficie que define la cavidad (20) de medición, comprendiendo dicho reactivo (22) un agente hemolizante para lisar glóbulos rojos en la muestra de sangre, y un agente de tinción para teñir selectivamente glóbulos blancos en la muestra de sangre; una entrada (18) de muestras, que está definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo (10) de adquisición de muestras, estando dispuestas dichas paredes tan cerca entre sí que puede crearse una fuerza capilar en la entrada (18) de muestras; estando dispuesta dicha cavidad (20) de medición en comunicación con dicha entrada (18) de muestras; y un elemento (12) de cuerpo que tiene dos superficies planas para definir dicha cavidad (20) de medición, en el que las superficies planas están dispuestas a una distancia predeterminada entre sí para determinar un grosor de muestra para una medición óptica, y en el que las superficies planas de dicha cavidad (20) de medición están dispuestas más cerca entre sí que dichas paredes de la entrada (18) de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada (18) de muestras en la cavidad (20) de medición.

Description

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DESCRIPCION

Recuento de globulos blancos Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un dispositivo de adquisicion de muestras, a un metodo y a un sistema para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre.

Antecedentes de la invencion

La determinacion del recuento de globulos blancos a menudo es importante en relacion con el tratamiento de un paciente. Este analisis puede ser necesario para diagnosticar por ejemplo leucemia, o enfermedades infecciosas o inflamatorias o para monitorizar tratamientos. Es deseable permitir que los resultados del analisis se obtengan lo mas rapidamente posible con el fin de minimizar los tiempos de espera para los pacientes y permitir que un medico tome una decision de tratamiento y diagnostico directamente cuando esta realizando un primer examen del paciente. Por tanto, seria preferible proporcionar un metodo de analisis que el medico o una enfermera pueda realizar rapidamente sin necesidad de enviar la prueba a un laboratorio.

Actualmente, el recuento de globulos blancos se obtiene normalmente a traves de un procedimiento manual mediante la tincion de una muestra de sangre y la observacion microscopica de la muestra en una camara de recuento especial, por ejemplo una camara de Burker. La camara de recuento esta dotada de una reticula que divide la camara en volumenes pequenos bien definidos. Se permite que los globulos blancos sedimenten en el fondo de la camara de recuento con el fin de permitir que el microscopio enfoque todas las celulas en la camara y, por tanto, de facilitar el recuento. Por tanto, es necesario que la muestra sedimente durante varios minutos antes de realizar el recuento. Entonces puede determinarse el recuento de globulos blancos contando el numero de globulos sanguineos por recuadro en la reticula. El recuento de globulos blancos lo obtiene manualmente un analista, que es necesario que tenga experiencia en la realizacion del analisis con el fin de poder realizar un analisis fiable.

Este analisis requiere mucho tiempo. Ademas, puesto que se realiza manualmente, los resultados del analisis pueden variar dependiendo de la persona que realiza el analisis.

Hay un numero limitado de metodos de analisis automatizados existentes para determinar el recuento de globulos blancos. El recuento de globulos blancos puede determinarse por medio del principio de Coulter, que se basa en determinar el tamano celular y de ese modo el tipo celular detectando una impedancia. Un metodo para contar globulos blancos mediante el principio de Coulter se describe en el documento US 5.262.302.

El principio de Coulter es el metodo de analisis automatizado, predominante, que esta usandose actualmente. Sin embargo, se han descrito algunos otros metodos. Uno de tales metodos para determinar el recuento de globulos blancos se da a conocer en el documento US 5.585.246. En este caso, tiene que prepararse una muestra de sangre mediante mezclado con un tinte fluorescente y un complejo de ligando que marca los globulos blancos. La muestra se introduce en un capilar y se irradia por una fuente de laser que explora la muestra en el capilar. Se mide la fluorescencia con el fin de determinar el numero de globulos blancos. Se da a conocer un metodo similar en el documento WO 97/02482, usando un tinte fluorescente y una fuente de laser que explora un capilar. Este metodo esta adaptado para la enumeracion de globulos blancos en productos de aferesis que contienen un numero limitado de globulos blancos. En este caso, el capilar es bastante grueso y es necesario esperar hasta que los globulos blancos han sedimentado en el fondo del capilar antes de que pueda explorarse el capilar.

En el documento WO 99/45384, se muestra una muestra que contiene una camara que tiene un grosor variable. El grosor variable separa diferentes compuestos de la sangre. La muestra de sangre se tine con un colorante para destacar de manera diferencial al menos tres tipos diferentes de globulos blancos en la muestra de sangre. Los globulos blancos pueden enumerarse usando un instrumento de exploracion optico para visualizar una parte de la camara.

En el documento EP 1 161 994 A2, se da a conocer una cubeta para insertar hemoderivados y reactivos en la misma. La cubeta tiene un cuerpo principal hueco que contiene el hemoderivado y el reactivo de tincion fluorescente en hemolisis. La cubeta esta compuesta por un plastico incoloro y transparente y tiene una tapa compuesta por caucho. El reactivo de tincion fluorescente en hemolisis se anade a la cubeta cuando esta realizandose el recuento de leucocitos. Despues se anade el hemoderivado a la cubeta y se mezclan el reactivo y el hemoderivado y se hace reaccionar el reactivo con el hemoderivado. Se centrifuga la cubeta y tras exponerse a la fuerza centrifuga, se ajusta sobre un micro-leucocitometro para contar el numero de los leucocitos en el hemoderivado.

La patente estadounidense 5.948.686 da a conocer una camara de muestras que incluye una primera pared y una segunda pared transparente. Las paredes estan separadas entre si por un grosor a traves del plano. El grosor a traves del plano puede variar dependiendo del hematocrito y de los constituyentes objetivo. Se mezcla una muestra de sangre completa con una cantidad de un colorante sensible que puede estar en forma liquida o seca. Tras

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mezclar la muestra, se introduce en la camara de muestras donde la muestra se mantiene de manera quiescente durante un breve periodo de tiempo para permitir la formacion de cilindros y lagunas. Las lagunas son areas abiertas que quedan entre los cilindros formados, que son agrupaciones de globulos rojos. Los globulos blancos se encuentran en las lagunas junto con las plaquetas. Los globulos blancos se detectan mediante un microscopio en las lagunas transparentes.

Existe todavia la necesidad de acelerar y simplificar los metodos automatizados existentes para determinar el recuento de globulos blancos de manera que pueda proporcionarse el analisis en el punto de atencion. Ademas, puesto que el recuento de globulos blancos es un analisis realizado con frecuencia de este tipo, cualquier mejora en el metodo de analisis tendria un gran impacto sobre la atencion del paciente. Un metodo de analisis que proporcione la posibilidad de obtener resultados en el punto de atencion seria particularmente ventajoso.

Sumario de la invencion

Un objeto de la invencion es proporcionar un analisis sencillo para determinar la enumeracion volumetrica de globulos blancos. Un objeto adicional de la invencion es proporcionar un analisis rapido sin necesidad de aparatos complicados o grandes preparaciones de muestras.

Estos objetos se logran parcial o completamente mediante un dispositivo de adquisicion de muestras, un metodo y un sistema segun las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes.

Por tanto, se proporciona un dispositivo de adquisicion de muestras para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre. El dispositivo de adquisicion de muestras comprende una cavidad de medicion para alojar una muestra de sangre, en el que la muestra de sangre es sangre completa sin diluir que se ha adquirido directamente dentro de la cavidad de medicion. La cavidad de medicion tiene un grosor fijo predeterminado medido de manera que dicho grosor, cuando el dispositivo esta en uso, en combinacion con un area de la muestra de la que estan obteniendose imagenes, define un volumen de muestra analizada. El dispositivo de adquisicion de muestras comprende ademas un reactivo, que se dispone en forma seca sobre una superficie que define la cavidad de medicion, comprendiendo dicho reactivo un agente hemolizante para lisar globulos rojos en la muestra de sangre, y un agente de tincion para tenir selectivamente globulos blancos en la muestra de sangre. El dispositivo de adquisicion de muestras comprende ademas una entrada de muestras, que esta definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisicion de muestras, estando dispuestas dichas paredes tan cerca entre si que puede crearse una fuerza capilar en la entrada de muestras. La cavidad de medicion en el dispositivo de adquisicion de muestras esta dispuesta en comunicacion con la entrada de muestras, y la cavidad de medicion esta definida por dos superficies planas, en la que las superficies planas estan dispuestas a una distancia predeterminada entre si para determinar un grosor de muestra para una medicion optica, y en la que las superficies planas de dicha cavidad de medicion estan dispuestas mas cerca entre si que dichas paredes de la entrada de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada de muestras en la cavidad de medicion.

El dispositivo de adquisicion de muestras proporciona la posibilidad de obtener directamente una muestra de sangre completa dentro de la cavidad de medicion y proporcionarla para su analisis. No hay necesidad de preparacion de la muestra. De hecho, la muestra de sangre puede aspirarse dentro de la cavidad de medicion directamente de un dedo de un paciente en que se ha realizado una puncion. Dotar el dispositivo de adquisicion de muestras de un reactivo permite una reaccion dentro del dispositivo de adquisicion de muestras que hace que la muestra quede lista para el analisis. La reaccion se inicia cuando la muestra de sangre entra en contacto con el reactivo. Por tanto, no hay necesidad de preparar manualmente la muestra, lo que hace que el analisis sea especialmente adecuado para realizarse directamente en una sala de reconocimiento mientras que el paciente esta esperando.

Puesto que el reactivo se proporciona en forma seca, el dispositivo de adquisicion de muestras puede transportarse y almacenarse durante largo tiempo sin afectar a la capacidad de uso del dispositivo de adquisicion de muestras. Por tanto, el dispositivo de adquisicion de muestras con el reactivo puede fabricarse y prepararse mucho antes de realizar el analisis de una muestra de sangre.

Aunque muchos metodos existentes pueden contar diferentes globulos sanguineos e incluso subgrupos de globulos sanguineos, el dispositivo de adquisicion de muestras segun la invencion esta adaptado especificamente para realizar la enumeracion volumetrica de globulos blancos. El reactivo comprende un agente hemolizante que lisara los globulos rojos en la muestra de sangre. Esto destruye la posibilidad de enumerar los globulos rojos en la muestra. Por otra parte, el lisado de los globulos rojos simplifica la distincion e identificacion de los globulos blancos dentro de la muestra de sangre.

El agente de tincion proporciona el marcaje de los globulos blancos individuales. Esto permite que los globulos blancos se visualicen o se detecten individualmente. Por ejemplo, los globulos blancos pueden detectarse explorando la cavidad de medicion u obteniendo una imagen de la cavidad de medicion. El recuento de globulos blancos puede obtenerse por tanto sumando el numero de globulos blancos detectados individualmente en un volumen definido.

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La invencion tambien proporciona un metodo para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre. El metodo comprende adquirir una muestra de sangre dentro de una cavidad de medicion de un dispositivo de adquisicion de muestras, en el que la muestra de sangre es sangre completa sin diluir que se adquiere directamente dentro de la cavidad (20) de medicion, irradiar la muestra, adquirir una imagen digital de una ampliacion de la muestra irradiada en la cavidad de medicion y analizar digitalmente la imagen digital para identificar los globulos blancos y determinar el numero de globulos blancos en la muestra.

En el metodo segun la invencion, el dispositivo de adquisicion de muestras tiene una entrada de muestras, que esta definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisicion de muestras, en el que dichas paredes estan dispuestas tan cerca entre si que puede crearse una fuerza capilar en la entrada de muestras, y la cavidad de medicion esta dispuesta en comunicacion con dicha entrada de muestras. La cavidad de medicion esta definida por dos superficies planas, en la que dichas superficies planas estan dispuestas a una distancia predeterminada entre si para determinar un grosor de muestra para una medicion optica, y en la que las superficies planas de dicha cavidad de medicion estan dispuestas mas cerca entre si que dichas paredes de la entrada de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada de muestras en la cavidad de medicion. Ademas, la cavidad de medicion contiene un reactivo, que esta dispuesto en forma seca sobre una superficie que define la cavidad de medicion, que comprende un agente hemolizante para lisar globulos rojos y un agente de tincion para reaccionar con la muestra de manera que los globulos blancos se tinan, en la que los globulos blancos se distinguen mediante la tincion selectiva del agente de tincion.

La invencion proporciona ademas un sistema para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre. El sistema comprende un dispositivo de adquisicion de muestras tal como se describio anteriormente. El sistema comprende ademas un aparato de medicion que comprende un soporte de dispositivo de adquisicion de muestras dispuesto para alojar el dispositivo de adquisicion de muestras que contiene una muestra de sangre en la cavidad de medicion, y una fuente de luz dispuesta para irradiar la muestra de sangre. El aparato de medicion comprende ademas un sistema de obtencion de imagenes, que comprende un sistema de ampliacion y un medio de adquisicion de imagenes digitales para adquirir una imagen digital de una ampliacion de la muestra irradiada en la cavidad de medicion, en el que los globulos blancos se distinguen en la imagen digital mediante la tincion selectiva del agente de tincion. El aparato de medicion tambien comprende un analizador de imagenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para identificar los globulos blancos y determinar el numero de globulos blancos en la muestra de sangre.

El metodo y el sistema de la invencion proporcionan un analisis muy sencillo de una muestra de sangre para determinar el recuento de globulos blancos. El analisis no requiere un aparato de medicion complicado ni que un operario realice etapas avanzadas. Por tanto, puede realizarse en conexion directa con el examen de un paciente, sin necesidad de un tecnico cualificado. El aparato de medicion utiliza las propiedades del dispositivo de adquisicion de muestras para realizar un analisis en una muestra de sangre completa sin diluir que se ha adquirido directamente dentro de la cavidad de medicion. El aparato de medicion se dispone para obtener una imagen de un volumen de la muestra para realizar una enumeracion volumetrica de los globulos blancos a partir de la imagen.

Se permite que la muestra de sangre se mezcle con el reactivo en la cavidad de medicion. En el plazo de algunos minutos o menos, la reaccion de la muestra de sangre con el reactivo habra hemolizado los globulos rojos y tenido los globulos blancos de manera que la muestra este lista para presentarse para la medicion optica. La muestra de sangre puede mezclarse con el reactivo por ejemplo mediante dispersion o difusion del reactivo dentro de la muestra de sangre o haciendo vibrar o moviendo activamente el dispositivo de adquisicion de muestras de modo que se produzca una agitacion en la cavidad de medicion.

El dispositivo de adquisicion de muestras comprende un elemento de cuerpo que tiene dos superficies planas para definir dicha cavidad de medicion. Las superficies planas estan dispuestas a una distancia predeterminada entre si para determinar un grosor de muestra para una medicion optica. Esto implica que el dispositivo de adquisicion de muestras proporciona un grosor bien definido para la medicion optica, que puede usarse para determinar de manera precisa el recuento de globulos blancos por unidad volumetrica de la muestra de sangre. Un volumen de una muestra analizada estara bien definido por el grosor de la cavidad de medicion y un area de la muestra de la que estan obteniendose imagenes. Por tanto, el volumen bien definido podria usarse para asociar el numero de globulos blancos con el volumen de la muestra de sangre de manera que se determine el recuento volumetrico de globulos blancos.

La cavidad de medicion tiene preferiblemente un grosor uniforme de 50-170 micrometros. Un grosor de al menos 50 micrometros implica que la cavidad de medicion no fuerza a realizar un frotis de la muestra de sangre para dar lugar a una monocapa lo que permite que se analice un volumen mayor a lo largo de una area de seccion transversal pequena. Por tanto, puede analizarse un volumen suficientemente grande de la muestra de sangre con el fin de obtener valores fiables del recuento de globulos blancos usando una imagen relativamente pequena de la muestra de sangre. El grosor es mas preferiblemente de al menos 100 micrometros, lo que permite que se analice un area de seccion transversal incluso mas pequena o un volumen de muestra mas grande. Ademas, el grosor de al menos 50 micrometros y mas preferiblemente de 100 micrometros tambien simplifica la fabricacion de la cavidad de medicion

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que tiene un grosor bien definido entre dos superficies planas.

Para la mayorfa de las muestras dispuestas en una cavidad que tiene un grosor de no mas de 170 micrometros, el recuento de globulos blancos es tan bajo que solo habra desviaciones menores debidas a los globulos blancos que se disponen solapandose entre sf. Sin embargo, el efecto de tales desviaciones estara relacionado con el recuento de globulos blancos y por tanto, al menos en cierto grado, pueden manejarse por medio de la correccion estadfstica de los resultados al menos para los valores grandes del recuento de globulos blancos. Esta correccion estadfstica puede basarse en calibraciones del aparato de medicion. Las deviaciones seran incluso menores para una cavidad de medicion que tenga un grosor de no mas de 150 micrometros, por lo que puede usarse una calibracion mas sencilla. Este grosor puede incluso no requerir ninguna calibracion para los globulos sangufneos solapantes.

Ademas, el grosor de la cavidad de medicion es suficientemente pequeno como para permitir que el aparato de medicion obtenga una imagen digital de manera que pueda analizarse simultaneamente toda la profundidad de la cavidad de medicion. Puesto que va a usarse un sistema de ampliacion en el aparato de medicion, no es sencillo obtener una gran profundidad de campo. Por tanto, el grosor de la cavidad de medicion preferiblemente no superara los 150 micrometros con el fin de que se analice simultaneamente todo el grosor en una imagen digital. La profundidad de campo puede disponerse para manejar un grosor de la cavidad de medicion de 170 micrometros.

La imagen digital puede adquirirse con una profundidad de campo correspondiente al menos al grosor de la cavidad de medicion. Esto implica que se obtiene un enfoque suficiente de todo el grosor de la muestra de manera que puede analizarse simultaneamente todo el grosor de la cavidad de medicion en la imagen digital de la muestra. Por tanto, no hay necesidad de esperar a que los globulos blancos sedimenten en la cavidad de medicion, por lo que se reduce el tiempo para obtener el analisis. Al elegir no enfocar de manera muy pronunciada sobre una parte especffica de la muestra, se obtiene un enfoque suficiente de todo el grosor de la muestra para permitir identificar el numero de globulos blancos en la muestra. Esto implica que un globulo blanco puede estar algo borroso y todavfa considerarse que esta en enfoque en la profundidad de campo.

El dispositivo de adquisicion de muestras puede estar dotado de un reactivo que se ha aplicado a la superficie disuelto en un lfquido volatil que se ha evaporado para dejar el reactivo en forma seca.

Se ha conseguido que el reactivo se disuelva ventajosamente en un lfquido volatil antes de insertarse dentro de la cavidad de medicion. Esto implica que el lfquido puede evaporarse de manera eficaz del espacio estrecho de la cavidad de medicion durante la fabricacion y la preparacion del dispositivo de adquisicion de muestras.

El reactivo puede disolverse preferiblemente en un disolvente organico y mas preferiblemente puede disolverse en metanol. Tales disolventes son volatiles y pueden usarse de manera apropiada para secar el reactivo sobre una superficie de la cavidad de medicion.

El agente de tincion puede disponerse para tenir selectivamente el nucleo de los globulos blancos. Esto implica que los globulos blancos pueden identificarse como puntos de color y por tanto pueden contarse facilmente en una imagen digital.

El agente de tincion puede ser uno cualquiera del grupo de hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azur de metileno, acetato de violeta de cresilo, azul de toluidina, violeta de genciana, analogos de Sudan, galocianina y analogos de fucsina, o cualquier combinacion de los mismos. Sin embargo, debe apreciarse que el agente de tincion no se limita a este grupo, sino que pueden contemplarse muchas otras sustancias.

El agente hemolizante puede ser una sal de amonio cuaternario, una saponina, un acido biliar, tal como acido desoxicolico, una digitoxina, un veneno de serpiente, un glucopiranosido o un detergente no ionico de tipo Triton. Sin embargo, debe apreciarse que el agente hemolizante no se limita a este grupo, sino que pueden contemplarse muchas otras sustancias.

El dispositivo de adquisicion de muestras comprende ademas una entrada de muestras que comunica la cavidad de medicion con el exterior del dispositivo de adquisicion de muestras, estando dispuesta dicha entrada para adquirir una muestra de sangre. La entrada de muestras puede estar dispuesta para introducir una muestra de sangre mediante una fuerza capilar y la cavidad de medicion puede introducir ademas la sangre desde la entrada en la cavidad. Como resultado, la muestra de sangre puede adquirirse facilmente dentro de la cavidad de medicion moviendo simplemente la entrada de muestras en contacto con la sangre. Entonces, las fuerzas capilares de la entrada de muestras y la cavidad de medicion introduciran una cantidad bien definida de sangre dentro de la cavidad de medicion.

El dispositivo de adquisicion de muestras puede ser desechable, es decir esta dispuesto para usarse solo una vez. El dispositivo de adquisicion de muestras proporciona un kit para realizar un recuento de globulos blancos, puesto que el dispositivo de adquisicion de muestras puede alojar una muestra de sangre y contiene todos los reactivos necesarios con el fin de presentar la muestra para el recuento de celulas. Esto se permite particularmente puesto que el dispositivo de adquisicion de muestras esta adaptado para usarse solo una vez y puede formarse sin

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considerar las posibilidades de limpiar el dispositivo de adquisicion de muestras y volver a aplicar un reactivo. Ademas, el dispositivo de adquisicion de muestras puede moldearse en material de plastico y de ese modo fabricarse a un precio bajo. Por tanto, todavia puede ser rentable usar un dispositivo de adquisicion de muestras desechable.

La muestra puede irradiarse mediante luz de una longitud de onda correspondiente a un pico en la absorbancia del agente de tincion. Por consiguiente, los globulos blancos tenidos que contienen una acumulacion de agente de tincion se detectaran mediante una baja transmitancia de luz.

La irradiacion puede realizarse por medio de una fuente de laser. La fuente de laser puede proporcionar luz de una longitud de onda bien definida que ajusta la absorbancia del agente de tincion. Ademas, la fuente de laser proporciona luz colimada, lo que minimiza las alteraciones de la luz parasita, de manera que se distinguira claramente un punto de baja transmitancia de luz.

La irradiacion puede realizarse alternativamente por medio de un diodo emisor de luz. Esta fuente de luz todavia puede proporcionar condiciones de irradiacion suficientes para distinguir de manera apropiada los globulos blancos de otra materia en la muestra.

La imagen digital puede adquirirse usando un poder de ampliacion de 3-200x, mas preferiblemente de 3-10x. Dentro de estos intervalos de poder de ampliacion, los globulos blancos se amplian suficientemente con el fin de detectarse, mientras que la profundidad de campo puede disponerse para que cubra el grosor de muestra. Un poder de ampliacion bajo implica que puede obtenerse una gran profundidad de campo. Sin embargo, si se usa un poder de ampliacion bajo, los globulos blancos pueden ser dificiles de detectar. Puede usarse un poder de ampliacion menor aumentando el numero de pixeles en la imagen adquirida, es decir, mejorando la resolucion de la imagen digital. De este modo, se ha hecho posible usar un poder de ampliacion de 3-4x, mientras que todavia se permite que se detecten los globulos blancos.

El analisis comprende identificar areas de alta absorbancia de luz en la imagen digital. El analisis puede comprender ademas identificar puntos negros u oscuros en la imagen digital. Puesto que los agentes de tincion pueden acumularse en el nucleo de los globulos blancos, la absorbancia de la luz puede tener picos en puntos separados. Estos puntos formaran puntos negros en la imagen digital.

El analisis puede comprender ademas ampliar electronicamente la imagen digital adquirida. Mientras que la muestra esta ampliandose para adquirir una imagen digital ampliada de la muestra, la propia imagen digital adquirida puede ampliarse electronicamente para distinguir de manera simplificada entre objetos de los que estan obteniendose imagenes muy cerca entre si en la imagen digital adquirida.

Breve descripcion de los dibujos

Ahora se describira la invencion en detalle adicional a modo de ejemplo haciendo referencia a los dibujos adjuntos.

La figura 1 es una vista esquematica de un dispositivo de adquisicion de muestras segun una realizacion de la invencion.

La figura 2 es una vista esquematica de un dispositivo de adquisicion de muestras segun una realizacion que no forma parte de la invencion.

La figura 3 es una vista esquematica de un aparato de medicion segun una realizacion de la invencion.

La figura 4 es un diagrama de flujo de un metodo segun una realizacion de la invencion.

La figura 5 es una imagen digital de una muestra de sangre que va a usarse para la enumeracion volumetrica de globulos blancos.

Descripcion detallada de una realizacion preferida

En referencia ahora a la figura 1, se describira un dispositivo 10 de adquisicion de muestras segun una realizacion de la invencion. El dispositivo 10 de adquisicion de muestras es desechable y va a tirarse tras haberse usado para el analisis. Esto implica que el dispositivo 10 de adquisicion de muestras no requiere un manejo complicado. El dispositivo 10 de adquisicion de muestras esta formado preferiblemente de material de plastico y puede fabricarse mediante moldeo por inyeccion. Esto hace que la fabricacion del dispositivo 10 de adquisicion de muestras sea sencilla y economica, mientras que el coste del dispositivo 10 de adquisicion de muestras puede mantenerse bajo.

El dispositivo 10 de adquisicion de muestras comprende un elemento 12 de cuerpo, que tiene una base 14, que un operario puede tocar sin producir ninguna interferencia en los resultados del analisis. La base 14 tambien puede tener salientes 16 que pueden ajustar un soporte en el aparato de analisis. Los salientes 16 pueden disponerse de

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manera que el dispositivo 10 de adquisicion de muestras se coloque correctamente en el aparato de analisis.

El dispositivo 10 de adquisicion de muestras comprende ademas una entrada 18 de muestras. La entrada 18 de muestras esta definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo 10 de adquisicion de muestras, estando dispuestas las paredes tan cerca entre si que puede crearse una fuerza capilar en la entrada 18 de muestras. La entrada 18 de muestras se comunica con el exterior del dispositivo 10 de adquisicion de muestras para permitir que la sangre entre en el dispositivo 10 de adquisicion de muestras. El dispositivo 10 de adquisicion de muestras comprende ademas una camara para contar globulos blancos en forma de una cavidad 20 de medicion dispuesta entre paredes opuestas dentro del dispositivo 10 de adquisicion de muestras. La cavidad 20 de medicion esta dispuesta en comunicacion con la entrada 18 de muestras. Las paredes que definen la cavidad 20 de medicion estan dispuestas mas cerca entre si que las paredes de la entrada 18 de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada 18 de muestras en la cavidad 20 de medicion.

Las paredes de la cavidad 20 de medicion estan dispuestas a una distancia entre si de 50-170 micrometros. La cavidad 20 de medicion tiene mas preferiblemente al menos 100 micrometros de grosor. Ademas, la cavidad 20 de medicion tiene mas preferiblemente no mas de 150 micrometros de grosor. La distancia es uniforme a lo largo de toda la cavidad 20 de medicion. El grosor de la cavidad 20 de medicion define el volumen de sangre que esta examinandose. Puesto que el resultado del analisis va a compararse con el volumen de la muestra de sangre que esta examinandose, es necesario que el grosor de la cavidad 20 de medicion sea muy preciso, es decir solo se permiten variaciones muy pequenas en el grosor dentro de la cavidad 20 de medicion y entre las cavidades 20 de medicion de diferentes dispositivos 10 de adquisicion de muestras. El grosor permite que se analice un volumen de muestra relativamente grande en un area pequena de la cavidad. El grosor permite teoricamente que los globulos blancos se dispongan unos encima de otros dentro de la cavidad 20 de medicion. Sin embargo, la cantidad de globulos blancos dentro de la sangre es tan baja que la probabilidad de que esto ocurra es muy pequena.

El dispositivo 10 de adquisicion de muestras normalmente esta adaptado para medir recuentos de globulos blancos por encima de 0,5 x 109 celulas/litro de sangre. A recuentos de globulos blancos menores, el volumen de muestra sera demasiado pequeno como para permitir que se cuenten cantidades estadisticamente significativas de globulos blancos. Ademas, cuando el recuento de globulos blancos supera 12 x 109 celulas/litro de sangre, el efecto de los globulos sanguineos que se disponen solapandose entre si comenzara a ser significativo en el recuento de globulos blancos medido. A este recuento de globulos blancos, los globulos blancos cubriran aproximadamente el 8% de la seccion transversal de la muestra que esta irradiandose, si el grosor de la cavidad de medicion es de 140 micrometros. Por tanto, con el fin de obtener recuentos de globulos blancos corregidos, sera necesario tener en cuenta este efecto. Por tanto, puede usarse una correccion estadistica de valores del recuento de globulos blancos por encima de 12 x 109 celulas/litro de sangre. Esta correccion estadistica aumentara para recuentos de globulos blancos crecientes, puesto que el efecto de los globulos sanguineos solapantes sera mayor para recuentos de globulos blancos mayores. La correccion estadistica puede determinarse por medio de la calibracion de un aparato de medicion. Como alternativa, la correccion estadistica puede determinarse a nivel general para configurar los aparatos de medicion que van a usarse en relacion con el dispositivo 10 de adquisicion de muestras. Esta correccion estadistica es de magnitud similar a las correcciones estadisticas que se realizan actualmente en los aparatos de analisis que usan el principio de Coulter. Se contempla que el dispositivo 10 de adquisicion de muestras pueda usarse para analizar recuentos de globulos blancos de hasta 50 x 109 celulas/litro de sangre.

La superficie de una pared de la cavidad 20 de medicion se recubre al menos parcialmente con un reactivo 22. El reactivo 22 puede estar liofilizado, secado por calor o secado al vacio y puede aplicarse a la superficie de la cavidad 20 de medicion. Cuando se adquiere una muestra de sangre dentro de la cavidad 20 de medicion, la sangre entrara en contacto con el reactivo 22 seco e iniciara una reaccion entre el reactivo 22 y la sangre.

El reactivo 22 se aplica insertando el reactivo 22 dentro de la cavidad 20 de medicion usando una pipeta o dispensador. El reactivo 22 se disuelve en un liquido volatil, por ejemplo un disolvente organico tal como metanol, cuando se inserta dentro de la cavidad 20 de medicion. El disolvente con el reactivo 22 puede llenar la cavidad 20 de medicion. Entonces, se realiza el secado de manera que el disolvente se evaporara y el reactivo 22 se unira a las superficies de la cavidad 20 de medicion.

Puesto que el reactivo va a secarse sobre una superficie de un espacio estrecho, el liquido tendra una superficie muy pequena en contacto con la atmosfera ambiental, por lo que la evaporacion del liquido se hace mas dificil. Por tanto, resulta ventajoso usar un liquido volatil, tal como metanol, lo que permite que el liquido se evapore de manera eficaz del espacio estrecho de la cavidad de medicion.

Segun un metodo de fabricacion alternativo, el dispositivo 10 de adquisicion de muestras puede formarse uniendo dos piezas entre si, por lo que una pieza forma la pared inferior de la cavidad 20 de medicion y la otra pieza forma la pared superior de la cavidad 20 de medicion. Esto permite que un reactivo 22 se seque sobre una superficie abierta antes de que las dos piezas se unan entre si. Por tanto, el reactivo 22 puede disolverse en agua, puesto que no es necesario que el disolvente sea volatil.

El reactivo 22 comprende un agente hemolizante y un agente de tincion. El agente hemolizante puede ser una sal de

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amonio cuaternario, una saponina, un acido biliar, tal como acido desoxicolico, una digitoxina, un veneno de serpiente, un glucopiranosido o un detergente no ionico de tipo Triton. El agente de tincion puede ser hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azur de metileno, acetato de violeta de cresilo, azul de toluidina, violeta de genciana, un analogo de Sudan, galocianina o un analogo de fucsina, o cualquier combinacion de los mismos. Cuando una muestra de sangre entra en contacto con el reactivo 22, el agente hemolizante actuara para lisar los globulos rojos de manera que los globulos rojos lisados se mezclan con el plasma sanguineo. Ademas, el agente de tincion se acumulara en los nucleos de los globulos blancos. El reactivo 22 debe contener cantidades suficientes de agente de tincion para tenir claramente todos los nucleos de los globulos blancos. Por tanto, a menudo habra un exceso de agente de tincion, que se entremezclara en el plasma sanguineo. El exceso de agente de tincion dara un nivel de agente de tincion de fondo bajo, homogeneo en el plasma sanguineo. El agente de tincion acumulado en los globulos blancos podra distinguirse del nivel de fondo de agente de tincion.

El reactivo 22 tambien puede comprender otros constituyentes, que pueden ser activos, es decir, que toman parte en la reaccion quimica con la muestra de sangre, o no activos, es decir que no toman parte en la reaccion quimica con la muestra de sangre. Los constituyentes activos pueden disponerse por ejemplo para catalizar la accion de hemolisis o tincion. Los constituyentes no activos pueden disponerse por ejemplo para mejorar la union del reactivo 22 a la superficie de una pared de la cavidad 20 de medicion.

En el plazo de algunos minutos, la muestra de sangre habra reaccionado con el reactivo 22, de manera que los globulos rojos se habran lisado y el agente de tincion se habra acumulado en los nucleos de los globulos blancos.

En referencia a la figura 2, se describira una realizacion de un dispositivo de adquisicion de muestras que no forma parte de la presente invencion. El dispositivo 110 de adquisicion de muestras comprende una camara 120 que forma la cavidad de medicion. El dispositivo 110 de adquisicion de muestras tiene una entrada 118 hacia el interior de la camara 120 para transportar sangre dentro de la camara 120. La camara 120 esta conectada a una bomba (no mostrada) a traves de un tubo 121 de succion. La bomba puede aplicar una fuerza de succion en la camara 120 a traves del tubo 121 de succion de manera que puede succionarse sangre dentro de la camara 120 a traves de la entrada 118. El dispositivo 110 de adquisicion de muestras puede desconectarse de la bomba antes de que se realice la medicion. Al igual que la cavidad 20 de medicion del dispositivo 10 de adquisicion de muestras segun la primera realizacion, la camara 120 tiene un grosor bien definido que define el grosor de la muestra que va a examinarse. Ademas, se aplica un reactivo 122 a las paredes de la camara 120 para que reaccione con la muestra de sangre.

En referencia ahora a la figura 3, se describira un aparato 30 para la enumeracion volumetrica de globulos blancos. El aparato 30 comprende un soporte 32 de muestras para alojar un dispositivo 10 de adquisicion de muestras con una muestra de sangre. El soporte 32 de muestras esta dispuesto para alojar el dispositivo 10 de adquisicion de muestras de manera que la cavidad 20 de medicion del dispositivo 10 de adquisicion de muestras se coloque correctamente dentro del aparato 30. El aparato 30 comprende una fuente 34 de luz para iluminar la muestra de sangre dentro del dispositivo 10 de adquisicion de muestras. La fuente 34 de luz puede ser una lampara incandescente, que irradia luz en todo el espectro visible. El agente de tincion que se acumula en los nucleos de los globulos blancos absorbera luz de longitudes de onda especificas, de manera que los nucleos de los globulos blancos apareceran en una imagen digital de la muestra. Si se adquiere una imagen de color, los globulos blancos apareceran como puntos de color especificamente. Si se adquiere una imagen en blanco y negro, los globulos blancos apareceran como puntos negros contra un fondo mas claro.

La fuente 34 de luz puede ser alternativamente un laser o un diodo emisor de luz. Esto puede usarse para aumentar el contraste en la imagen de manera que los globulos blancos puedan detectarse mas facilmente. En este caso, la fuente 34 de luz se dispone para irradiar radiacion electromagnetica de una longitud de onda que corresponde a un pico de absorpcion del agente de tincion. La longitud de onda debe escogerse ademas de manera que la absorpcion de los compuestos sanguineos sea relativamente baja. Ademas, las paredes del dispositivo 10 de adquisicion de muestras deben ser esencialmente transparentes a la longitud de onda. Por ejemplo, cuando se usa azul de metileno como agente de tincion, la fuente 34 de luz puede disponerse para irradiar luz que tiene una longitud de onda de 667 nm.

El aparato 30 comprende ademas un sistema 36 de obtencion de imagenes, que esta dispuesto en el lado opuesto del soporte 32 de muestras en relacion con la fuente 34 de luz. Por tanto, el sistema 36 de obtencion de imagenes esta dispuesto para recibir la radiacion que se ha transmitido a traves de la muestra de sangre. El sistema 36 de obtencion de imagenes comprende un sistema 38 de ampliacion y un medio 40 de adquisicion de imagenes. El sistema 38 de ampliacion esta dispuesto para proporcionar un poder de ampliacion de 3-200x, mas preferiblemente de 3-100x, y lo mas preferiblemente de 3-4x. Dentro de estos intervalos de poder de ampliacion, es posible distinguir los globulos blancos. La imagen puede adquirirse con una resolucion mejorada con el fin de permitir que se use un poder de ampliacion menor. Ademas, la profundidad de campo del sistema 38 de ampliacion todavia se dispone para que corresponda al menos al grosor de la cavidad 20 de medicion.

El sistema 38 de ampliacion comprende una lente o sistema 42 de lentes de objetivo, que se dispone cerca del soporte 32 de muestras, y una lente o sistema 44 de lentes oculares, que se dispone a una distancia de la lente 42

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de objetivo. La lente 42 de objetivo proporciona una primera ampliacion de la muestra, que se amplia adicionalmente por la lente 44 ocular. El sistema 38 de ampliacion puede comprender lentes adicionales para lograr una ampliacion y obtencion de imagenes apropiada de la muestra. El sistema 38 de ampliacion se dispone de manera que la muestra en la cavidad 20 de medicion cuando se coloca en el soporte 32 de muestras se enfocara sobre un plano de imagen en el medio 40 de adquisicion de imagenes.

El medio 40 de adquisicion de imagenes se dispone para adquirir una imagen digital de la muestra. El medio 40 de adquisicion de imagenes puede ser cualquier tipo de camara digital, tal como una camara CCD. El tamano de pixel de la camara digital establece una restriccion en el sistema 36 de obtencion de imagenes de manera que el circulo de confusion en el plano de imagen puede no superar el tamano de pixel dentro de la profundidad de campo. Sin embargo, los globulos blancos todavia pueden detectarse aunque esten algo borrosos y, por tanto, puede permitirse que el circulo de confusion supere el tamano de pixel aunque se considera que esta dentro de la profundidad de campo. La camara 40 digital adquirira una imagen digital de la muestra en la cavidad 20 de medicion, en la que todo el grosor de la muestra esta enfocado suficientemente en la imagen digital para contar los globulos blancos. El sistema 36 de obtencion de imagenes definira un area de la cavidad 20 de medicion, de la que se obtendran imagenes en la imagen digital. El area de la que estan obteniendose imagenes junto con el grosor de la cavidad 20 de medicion definen el volumen de la muestra de la que estan obteniendose imagenes. El sistema 36 de obtencion de imagenes se configura para ajustar la obtencion de imagenes de muestras de sangre en los dispositivos 10 de adquisicion de muestras. No hay necesidad de cambiar la configuracion del sistema 36 de obtencion de imagenes. Preferiblemente, el sistema 36 de obtencion de imagenes se dispone dentro de un alojamiento de manera que la configuracion no se cambie accidentalmente.

El aparato 30 comprende ademas un analizador 46 de imagenes. El analizador 46 de imagenes esta conectado a la camara 40 digital para recibir imagenes digitales adquiridas por la camara 40 digital. El analizador 46 de imagenes se dispone para identificar patrones en la imagen digital que corresponden a un globulo blanco para el recuento del numero de globulos blancos que estan presentes en la imagen digital. Por tanto, el analizador 46 de imagenes puede disponerse para identificar puntos negros en un fondo mas claro. El analizador 46 de imagenes puede disponerse para ampliar electronicamente primero la imagen digital antes de analizar la imagen digital. Esto implica que el analizador 46 de imagenes puede distinguir mas facilmente globulos blancos de los que estan obteniendose imagenes que estan cerca entre si, aun cuando la ampliacion electronica de la imagen digital hara que la imagen digital sea algo borrosa.

El analizador 46 de imagenes puede calcular el numero de globulos blancos por volumen de sangre dividiendo el numero de globulos blancos que estan identificados en la imagen digital entre el volumen de la muestra de sangre, que esta bien definido tal como se describio anteriormente. El recuento volumetrico de globulos blancos puede presentarse en una pantalla del aparato 30.

El analizador 46 de imagenes puede realizarse como una unidad de procesamiento, que comprende codigos para realizar el analisis de la imagen.

En referencia a la figura 4, se describira un metodo para la enumeracion volumetrica de globulos blancos. El metodo comprende adquirir una muestra de sangre en un dispositivo de adquisicion de muestras, etapa 102. Se adquiere una muestra de sangre completa sin diluir en el dispositivo de adquisicion de muestras. La muestra puede adquirirse de sangre capilar o de sangre venosa. Puede introducirse una muestra de sangre capilar dentro de la cavidad de medicion directamente de un dedo de un paciente en que se ha realizado una puncion. La muestra de sangre entra en contacto con un reactivo en el dispositivo de adquisicion de muestras que inicia una reaccion. Los globulos rojos pueden lisarse y un agente de tincion se acumula en los nucleos de los globulos blancos. En el plazo de algunos minutos de la adquisicion de la muestra de sangre, la muestra esta lista para analizarse. El dispositivo de adquisicion de muestras se coloca en un aparato de analisis, etapa 104. Puede iniciarse un analisis apretando un boton del aparato de analisis. Alternativamente, el aparato inicia automaticamente el analisis detectando la presencia del dispositivo de adquisicion de muestras.

Se irradia la muestra, etapa 106, y se adquiere una imagen digital de una ampliacion de la muestra, etapa 108. La muestra esta irradiandose con radiacion electromagnetica de una longitud de onda correspondiente a un pico de absorpcion del agente de tincion. Esto implica que la imagen digital contendra puntos negros o mas oscuros en las posiciones de los nucleos de los globulos blancos.

La imagen digital adquirida se transfiere a un analizador de imagenes, que realiza el analisis de las imagenes, etapa 110, con el fin de contar el numero de puntos negros en la imagen digital.

En la figura 5, se muestra un ejemplo de una imagen digital para indicar la posibilidad de identificar globulos blancos en una muestra de sangre que se hemoliza y se tine. Esta imagen digital se obtuvo de un dispositivo de adquisicion de muestras que tenia un grosor de cavidad de 140 pm y usando una ampliacion de 50 veces. La fuente de luz irradia luz blanca, lo que indica que los globulos blancos pueden identificarse aun cuando la irradiacion no esta adaptada especificamente a un pico de absorpcion del agente de tincion. El agente de tincion usado fue azul de metileno. En la figura aparecen distintos puntos negros indicando globulos blancos. La imagen mostrada en la figura

5 es una version en blanco y negro de una imagen en color. El contraste entre los globulos blancos y el fondo aparece mas claro en la imagen de color que en la imagen en blanco y negro reproducida en este caso. Los puntos negros pueden contarse facilmente por un analizador de imagenes.

5 En los metodos manuales de recuento de globulos blancos, normalmente se cuentan aproximadamente 200 celulas para determinar el recuento de globulos blancos de la muestra de sangre. El metodo y el aparato presentados en este caso pueden disponerse por ejemplo para contar aproximadamente 2000 celulas, lo que da una mejor certeza estadistica de los resultados obtenidos. Un adulto sano normal tiene un recuento de globulos blancos de 4-5 x 109 celulas/litro de sangre. Esto implica que se encuentran 2000 celulas en muestras que tienen un volumen de 0,410 0,5 pl. Por ejemplo, si se obtiene una imagen de un area de 1,5 x 1,5 mm en la cavidad de medicion que tiene un

grosor de 140 mm, el volumen de la que estan obteniendose imagenes es 0,315 pl. Puede seleccionarse una parte de la imagen adquirida para su analisis. Por tanto, la imagen adquirida puede analizarse toscamente de manera que no se permitan anomalias en la parte que esta usandose para determinar el recuento de globulos blancos. Puede seleccionarse que la parte de la imagen adquirida seleccionada para el analisis tenga un tamano apropiado de modo 15 que se analice un volumen suficiente volumen de la muestra de sangre.

Debe hacerse hincapie en que las realizaciones preferidas descritas en el presente documento en modo alguno son limitativas y que son posibles muchas realizaciones alternativas dentro del alcance de proteccion definido por las reivindicaciones adjuntas.

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REIVINDICACIONES

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre, comprendiendo dicho dispositivo (10) de adquisicion de muestras:

una cavidad (20) de medicion para alojar una muestra de sangre en el que la muestra de sangre es sangre completa sin diluir que se ha adquirido directamente dentro de la cavidad de medicion, teniendo dicha cavidad (20) de medicion un grosor fijo predeterminado, medido de manera que dicho grosor, cuando el dispositivo esta en uso, en combinacion con un area de la muestra de la que estan obteniendose imagenes, define un volumen de muestra analizada; en el que el dispositivo (10) de adquisicion de muestras comprende ademas:

un reactivo (22), que se dispone en forma seca sobre una superficie que define la cavidad (20) de medicion, comprendiendo dicho reactivo (22) un agente hemolizante para lisar globulos rojos en la muestra de sangre, y un agente de tincion para tenir selectivamente globulos blancos en la muestra de sangre;

una entrada (18) de muestras, que esta definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo (10) de adquisicion de muestras, estando dispuestas dichas paredes tan cerca entre si que puede crearse una fuerza capilar en la entrada (18) de muestras; estando dispuesta dicha cavidad (20) de medicion en comunicacion con dicha entrada (18) de muestras; y

un elemento (12) de cuerpo que tiene dos superficies planas para definir dicha cavidad (20) de medicion, en el que las superficies planas estan dispuestas a una distancia predeterminada entre si para determinar un grosor de muestra para una medicion optica, y en el que las superficies planas de dicha cavidad (20) de medicion estan dispuestas mas cerca entre si que dichas paredes de la entrada (18) de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada (18) de muestras en la cavidad (20) de medicion.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun la reivindicacion 1, en el que las superficies planas estan dispuestas a una distancia entre si para determinar un grosor uniforme de 50-170 micrometros para una medicion optica.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun la reivindicacion 2, en el que las superficies planas estan dispuestas a una distancia entre si para determinar un grosor uniforme de al menos 100 micrometros para una medicion optica.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun la reivindicacion 2 o 3, en el que las superficies planas estan dispuestas a una distancia entre si para determinar un grosor uniforme de no mas de 150 micrometros para una medicion optica.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo (22) se ha aplicado a la superficie disuelto en un liquido volatil que se ha evaporado para dejar el reactivo (22) en forma seca.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de tincion se dispone para tenir selectivamente el nucleo de los globulos blancos.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de tincion es uno cualquiera del grupo de hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azur de metileno, acetato de violeta de cresilo, azul de toluidina, violeta de genciana, analogos de Sudan, galocianina y analogos de fucsina, o cualquier combinacion de los mismos.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente hemolizante es una sal de amonio cuaternario, una saponina, un acido biliar, una digitoxina, un veneno de serpiente, un glucopiranosido o un detergente no ionico de tipo Triton.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha entrada (18) de muestras esta dispuesta para adquirir una muestra de sangre.

Dispositivo (10) de adquisicion de muestras segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo (10) de adquisicion de muestras es desechable.

Metodo para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre, comprendiendo dicho metodo:

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adquirir una muestra de sangre dentro de una cavidad (20) de medicion de un dispositivo (10) de adquisicion de muestras,

en el que la muestra de sangre es sangre completa sin diluir que se adquiere directamente dentro de la cavidad (20) de medicion, irradiar la muestra,

adquirir una imagen digital de una ampliacion de la muestra irradiada en la cavidad (20) de medicion, y

analizar digitalmente la imagen digital para identificar los globulos blancos y determinar el numero de globulos blancos en la muestra;

teniendo dicho dispositivo de adquisicion de muestras una entrada (18) de muestras, que esta definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo (10) de adquisicion de muestras, en el que dichas paredes estan dispuestas tan cerca entre si que puede crearse una fuerza capilar en la entrada (18) de muestras;

estando dispuesta dicha cavidad (20) de medicion en comunicacion con dicha entrada (18) de muestras;

estando definida dicha cavidad (20) de medicion por dos superficies planas, en el que dichas superficies planas estan dispuestas a una distancia predeterminada entre si para determinar un grosor de muestra para una medicion optica, y en el que las superficies planas de dicha cavidad (20) de medicion estan dispuestas mas cerca entre si que dichas paredes de la entrada (18) de muestras, de manera que una fuerza capilar puede introducir sangre desde la entrada (18) de muestras en la cavidad (20) de medicion; y

dicha cavidad (20) de medicion contiene un reactivo (22), que esta dispuesto en forma seca sobre una superficie que define la cavidad (20) de medicion, que comprende un agente hemolizante para lisar globulos rojos y un agente de tincion para reaccionar con la muestra de manera que los globulos blancos se tinan, en el que los globulos blancos se distinguen mediante la tincion selectiva del agente de tincion.

12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que la muestra de sangre se mezcla con el reactivo (22) en la cavidad (20) de medicion.

13. Metodo segun la reivindicacion 11 o 12, en el que la cavidad (20) de medicion tiene un grosor de 50-170 micrometros, y dicha imagen digital se adquiere con una profundidad de campo correspondiente al menos al grosor de la cavidad (20) de medicion.

14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que un volumen de una muestra analizada esta bien definido por el grosor de la cavidad (20) de medicion y un area de la muestra de la que estan obteniendose imagenes.

15. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que la muestra se irradia por luz de una longitud de onda correspondiente a un pico en la absorbancia del agente de tincion.

16. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que dicha irradiacion se realiza por medio de una fuente de laser.

17. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que dicha irradiacion se realiza por medio de un diodo emisor de luz.

18. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en el que la imagen digital se adquiere usando un poder de ampliacion de 3-200x, mas preferiblemente de 3-10x.

19. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en el que dicho analisis comprende identificar areas de alta absorbancia de luz en la imagen digital.

20. Metodo segun la reivindicacion 19, en el que dicho analisis comprende identificar puntos negros en la imagen digital.

21. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-20, en el que dicho analisis comprende ampliar electronicamente la imagen digital adquirida.

22. Sistema para la enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra de sangre, comprendiendo dicho sistema:

un dispositivo (10) de adquisicion de muestras, y un aparato (30) de medicion que comprende:

un soporte (32) de dispositivo de adquisicion de muestras dispuesto para alojar el dispositivo (10) de adquisicion de muestras que contiene una muestra de sangre en una

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cavidad (20) de medicion,

una fuente (34) de luz dispuesta para irradiar la muestra de sangre, un sistema (36) de obtencion de imagenes, que comprende un sistema (38) de ampliacion y un medio (40) de adquisicion de imagenes digitales para adquirir una imagen digital de una ampliacion de la muestra irradiada en la cavidad (20) de medicion, en el que los globulos blancos se distinguen en la imagen digital mediante la tincion selectiva de un agente de tincion, y

un analizador (46) de imagenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para identificar los globulos blancos y determinar el numero de globulos blancos en la muestra de sangre;

en el que dicho dispositivo (10) de adquisicion de muestras es un dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

Sistema segun la reivindicacion 22, en el que el sistema de ampliacion se dispone con una profundidad de campo de al menos el grosor de la cavidad (20) de medicion del dispositivo (10) de adquisicion de muestras.

Sistema segun la reivindicacion 22 o 23, en el que un volumen de una muestra analizada esta bien definido por el grosor de la cavidad (20) de medicion y un area de la muestra de la que estan obteniendose imagenes.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en el que la fuente de luz esta dispuesta para irradiar luz de una longitud de onda correspondiente a un pico en la absorbancia del agente de tincion.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que dicha fuente de luz comprende una fuente de laser.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que dicha fuente de luz comprende un diodo emisor de luz.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-27, en el que el sistema de ampliacion tiene un poder de ampliacion de 3-200x, mas preferiblemente de 3-10x.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-28, en el que el analizador de imagenes esta dispuesto para identificar areas de alta absorbancia de luz en la imagen digital.

Sistema segun la reivindicacion 29, en el que el analizador de imagenes esta dispuesto para identificar puntos negros en la imagen digital.

Sistema segun una cualquiera de las reivindicaciones 22-30, en el que el analizador de imagenes esta dispuesto para ampliar electronicamente la imagen digital adquirida.