ES2649091T3

ES2649091T3 - Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita

Info

Publication number: ES2649091T3
Application number: ES12178368.2T
Authority: ES
Inventors: Fergal O'brien; John Gleeson; Niamh Plunkett
Original assignee: Royal College Surgeons Ireland; Royal College of Surgeons in Ireland
Current assignee: Royal College Surgeons Ireland; Royal College of Surgeons in Ireland
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-11
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2028-02-11
Also published as: DK2117617T3; AU2008212526B2; JP5527760B2; PT2117617E; PL2117617T3; JP2014076387A; DK2517738T3; ES2435192T3; EP1964583A1; US20130177648A1; IL200295A; CA2677992C; PL2517738T3; EP2117617A2; US20100158976A1; WO2008096334A3; JP2010517659A; EP2117617B1; EP2517738B1; JP5881669B2

Abstract

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) que comprende una distribución homogénea de hidroxiapatita dentro de una matriz de colágeno porosa, en el que la relación de HA a colágeno es al menos de 1:10 (p/p), en el que el andamio de material compuesto tiene una porosidad de al menos 98% (v/v) y una rigidez en compresión de al menos 0,4 kPa, y en el que el andamio de material compuesto comprende células.

Description

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DESCRIPCION

Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita Campo tecnico

La invencion se refiere a un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA). Tales andamios se pueden usar en la regeneracion osea y en aplicaciones de ingenieria tisular.

Tecnica anterior

Los injertos oseos son, despues de las trasfusiones de sangre, los segundos en la lista de materiales trasplantados en todo el mundo. Ademas, el mercado mundial estimado anual para los materiales de injertos oseos es de aproximadamente 650 millones de dolares en todo el mundo. Cada ano, se realizan en todo el mundo mas de 4 millones de procedimientos de sustitucion osea que requieren el uso de un injerto oseo o andamio. El tratamiento clinico mas habitual es un autoinjerto, mediante el cual se toma hueso de cuerpo del propio paciente y se vuelve a implantar. Sin embargo, existe una cantidad limitada de hueso que pueda ser retirado de un sitio de un donante particular y se requiere cirugia invasiva para su reimplantacion. Otra opcion es el uso de un haloinjerto, mediante el cual se extrae hueso de un donante de organo. Los problemas con esta tecnica se derivan del origen del hueso de un donante distinto. Asociado con dicho material hay un mayor riesgo de transmision de enfermedades infecciosas. Ademas, en el hueso de dicho donante estan presentes menores factores de crecimiento debido a que no contiene celulas vivas. Estos factores de crecimiento ayudan al crecimiento de nuevo hueso. Un andamio implantable ideal que promoveria la formacion de hueso que al mismo tiempo facilite el soporte de carga reduciria la necesidad de haloinjertos y autoinjertos. Sin embargo, en la actualidad estas tecnicas tradicionales constituyen mas del 90% de todos los procedimientos de injerto oseo. La razon de este deficit, aparte de los problemas descritos antes, es que todavia no se ha desarrollado un andamio vascularizado, mecanicamente competente y osteoconductor que se podria usar para producir hueso in vitro o provocar una osteogenesis in vivo. Dicho producto tendria un potencial comercial significativo.

Se han realizado diversos intentos usando numerosos materiales sinteticos para producir andamios viables para injertos oseos. Ejemplos incluyen poliestireno, titanio, poli(acido lactico) (PLLA), poli(acido glicolico) (PGA) y poli(acido lactico glicolico) (PLGA). Sin embargo, todos estos materiales conllevan problemas asociados e inconvenientes que incluyen el riesgo de infeccion y dificultan el permitir una adecuada resorcion que promueva la vascularizacion y el crecimiento de nuevo hueso. Tambien se han usado materiales biologicos tales como sustratos basados en colageno, gelatina, quitosan, agarosa y glucosaminoglucano (GAG). Sin embargo, estos materiales no tienen propiedades mecanicas suficientes que permitan soportar la carga despues del implante. El documento WO 2006/095154 describe un procedimiento para la preparacion de materiales compuestos que comprende un material inorganico que puede ser hidroxiapatita y un material organico que puede ser colageno. El documento WO 2006/03119 describe un biomaterial poroso que comprende fibras de colageno e hidroxiapatita. El documento EP 1566186 describe un material poroso reticulado de apatita/colageno que tiene una estructura uniforme. El documento EP 1500405 describe un material compuesto poroso que comprende una mezcla homogenea de colageno e hidroxiapatita. El documento WO 2005/0049 describe esponjas de colageno de material particulado porosas preparadas mediante un mezclado de colageno e hidroxiapatita en acido acetico glacial, seguido por una etapa de liofilizacion.

Declaraciones de la invencion

La invencion se refiere a un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10. La invencion tambien proporciona un implante oseo osteoconductor, un implante elaborado por ingenieria tisular, un sustituto de injerto oseo maxilofacial, un sustituto de injerto oseo dental, un implante de reparacion de defectos del cartilago, o un implante de reparacion de defectos osteocondrales, que comprenden un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

En general, la HA empleada en la presente invencion esta en forma de polvo. De forma adecuada, el polvo de HA se selecciona del grupo que consiste en polvo de HA sinterizado; y polvo de HA no sinterizado. Ejemplos de polvos de HA sinterizados y no sinterizados, adecuados para la presente invencion seran conocidos por los expertos en la tecnica y se proporcionan mas adelante.

De forma tipica, el polvo de HA tiene un tamano de particulas de 10 nm a 100 pm.

De forma adecuada, el colageno empleado en la presente invencion comprende fibras de colageno. Preferiblemente, las fibras de colageno comprenden colageno microfibrilar, preferiblemente colageno de tendon bovino microfibrilar.

En una realizacion de la invencion, el andamio de material compuesto se reticula. De forma tipica, el andamio de material compuesto se reticula por un medio seleccionado del grupo que comprende: reticulacion deshidrotermica y reticulacion quimica. Agentes de reticulacion quimica y procedimientos adecuados seran bien conocidos por los

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expertos en la tecnica e incluyen clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAC). Cuando se emplea reticulacion deshidrotermica, la temperatura de reticulacion varia de 105 0C a 180 °C. De forma adecuada, el proceso de reticulacion se lleva a cabo durante al menos 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas o 120 horas. Cuando se emplea reticulacion con EDAC, la molaridad de la solucion de EDAC es 6 mmol por gramo de material compuesto de colageno/HA.

Preferiblemente, el andamio de material compuesto de la invencion tiene una porosidad de al menos 99% (v/v), 99,1% (v/v), 99,2% (v/v), 99,3% (v/v). De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invencion tiene una porosidad de 98 a 99,5% (v/v), y mas preferiblemente de 98,5 a 99,5% (v/v). El procedimiento para determinar el % de porosidad de describe mas adelante.

De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invencion tiene una rigidez en compresion de al menos 0,5 kPa, 0,6 kPa. De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invencion tiene una rigidez en compresion de 1 a 5 kPa, preferiblemente de 1 a 4 kPa. Los andamios de material compuesto de EDAC reticulados tienen una rigidez en compresion de al menos 1 kPa, 1,5 kPa, 2 kPa, 2,5 kPa, 3 kPa, 3,5 kPa, 4 kPa. El procedimiento para determinar la rigidez en compresion se describe mas adelante.

De forma tipica, la relacion de HA a colageno en el andamio de material compuesto varia de 1:10 a 50:10 (p/p), y preferiblemente al menos 2:10 (p/p), 3:10 (p/p), 4:10 (p/p), 5:10 (p/p), 6: 10 (p/p), 7:10 (p/p), 8:10 (p/p), 9:10 (p/p) o 1:1 (p/p). En una realizacion particularmente preferida de la invencion, la relacion de HA a colageno en el andamio de material compuesto varia de 5:10 a 30:10 (p/p).

La bioactividad in vitro del andamio de material compuesto de la invencion se puede caracterizar controlando la actividad de osteoblastos MC3T3 en el andamio despues de incubacion durante 1 dia (para controlar el grado de union celular inicial), 7 dias, 21 dias y 28 dias (para controlar la proliferacion celular). En una realizacion de la invencion, el andamio de material compuesto de la invencion se caracteriza por un nivel de proliferacion de osteoblastos MC3T3 en el andamio, despues de 7 dias de incubacion, mayor que el numero inicial de celulas sembradas en el andamio. De forma tipica, esto es al menos 1 x 106 celulas por 500 mm3 de volumen del andamio. En una realizacion preferida de la invencion, el andamio de material compuesto se caracteriza por un nivel de proliferacion de osteoblastos MC3T3 en el andamio a los 28 dias de incubacion menos el nivel a los 7 dias de al menos 0,5 x 106 celulas, y adecuadamente de 0,5 x 106 a 1,5 x 106 celulas. Un procedimiento para determinar el nivel de proliferacion de osteoblastos MC3T3 es como sigue: Se siembra una muestra cilindrica de andamio de material compuesto de 12,7 mm de diametro con 2 x 106 celulas MC3T3. Despues de 7 dias de incubacion, se determina el numero de celulas presentes por andamio usando el ensayo de ADN con Hoechst 33258. Esto da una valoracion de la union inicial de las celulas. Despues de 14, 21 y 28 dias de incubacion, se determina el numero de celulas presentes por andamio usando el ensayo de ADN con Hoechst 33258. El cambio en el numero de celulas presentes por andamio en el tiempo (numero de celulas en el dia 28 menos numero de celulas en el dia 7) se usa para determinar la proliferacion celular.

En una realizacion, el andamio de material compuesto de la invencion se caracteriza por tener una conductividad del bajo presion a traves del andamio de al menos 1 x 10-10 m4/Ns, de forma adecuada de 6 x 10-10 m4/Ns a 1,4 x 10-9 irr/Ns, preferiblemente de 8 x 10-10 m4/Ns a 1,2 x 10-9 m4/Ns. De forma tipica, una conductividad del flujo bajo presion a traves del andamio es de al menos 10 x 10-10 m4/Ns.

Lo ideal es que el andamio de material compuesto de la invencion tenga un alto grado de interconectividad de poros. Preferiblemente, el andamio tiene una distribucion de poros homogenea. De forma tipica, el andamio tiene un tamano de poros homogeneo. En una realizacion, el andamio se produce en forma de hoja. De forma tipica, la hoja tiene un grosor promedio de al menos 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o 10 mm.

El andamio de material compuesto de la invencion comprende celulas. De forma tipica, las celulas son citoblastos que no estan diferenciados, estan parcialmente diferenciados o estan totalmente diferenciados. En una realizacion, las celulas se seleccionan del grupo que consiste en: osteoblastos; y citoblastos mesenquimatosos.

La invencion tambien se refiere a un implante oseo osteoconductor que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

La invencion se refiere tambien a un implante elaborado por ingenieria tisular que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion. Asi, el andamio de la invencion puede formar una base sobre la cual se puede obtener tejido por ingenieria tisular. Se preven diversas formas de tejido para esta invencion, incluyendo, aunque sin quedar limitadas a las mismas, cartilago, ligamentos, musculo y organos.

La invencion se refiere tambien a un sustituto de injerto oseo maxilofacial que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

La invencion se refiere tambien a un sustituto de injerto oseo dental que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

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La invencion se refiere tambien a un implante de reparacion de defectos del cartilago que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

La invencion se refiere tambien a un implante de reparacion de defectos osteocondrales que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

La invencion propuesta se produce a partir de dos constituyentes principales del hueso, a saber, la fase mineral, hidroxiapatita (HA) y la fase organica, colageno. Como tal, este es un sustrato mucho mas natural que cualquiera de los materiales descritos con anterioridad que promueven la formacion de hueso. Ademas, combinando la elevada rigidez mecanica de la HA con la biocompatibilidad, biodegradabilidad y arquitectura de poros de un andamio de colageno elaborado usando el procedimiento especifico de la invencion, se ha desarrollado un producto que cumple todos los criterios requeridos para su uso como un andamio osteoconductor, incluyendo una excelente rigidez en compresion (para facilitar la manipulacion y carga in vivo) y un alto grado de porosidad, interconectividad de poros y permeabilidad.

La hidroxiapatita es un material ceramico. Las ceramicas son compuestos inorganicos, no metalicos que forman enlaces ionicos y covalentes. Estas se caracterizan por una elevada rigidez mecanica, muy baja elasticidad y una superficie quebradiza y dura. En el tejido vivo, la HA se combina con colageno para formar los constituyentes primarios del hueso. Como material, esta presenta un parecido tanto quimico como cristalino con el mineral del hueso. Sin embargo, las construcciones de HA pura no son atractivas por una serie de razones, lo mas notable, la rigidez, la naturaleza quebradiza y la baja capacidad de reabsorcion del material [1]. Por consiguiente, la estabilidad y el control de la velocidad de degradacion de la construccion es problematica [2], inhibiendo gravemente la reabsorcion optima, el posterior recrecimiento del tejido y la restauracion de la integridad mecanica del sitio del defecto, los cuales son todos determinantes significativos para una implantacion con exito.

Al contrario que la HA, el segundo constituyente de la presente invencion, el colageno, ya cumple todos los determinantes biologicos requeridos para una implantacion con exito. Es un polimero natural presente en numerosos tejidos en el cuerpo humano, presentando de este modo una excelente biocompatibilidad. Como resultado, el colageno promueve la adhesion celular, la proliferacion y la formacion de matriz extracelular (ECM). Su velocidad de degradacion puede controlarse in vivo variando la densidad de reticulacion. Las reticulaciones son enlaces quimicos entre las moleculas de colageno. Estas proporcionan la resistencia mecanica del colageno y estabilizan las fibras de colageno evitando que las moleculas largas de colageno con forma de bastones resbalen entre si bajo el esfuerzo [3]. La reticulacion tambien es un medio eficaz para controlar la velocidad de degradacion de los andamios de colageno, puesto que las reticulaciones deben romperse antes de que se degrade el andamio. Existen diversos procedimientos para aumentar el nivel de reticulacion en andamios de colageno. Otro atributo significativo es la reciente aprobacion por parte de la FDA y el exito clinico de los andamios basados en colageno usados para regeneracion cutanea y nerviosa [4]. El principal inconveniente asociado con el colageno como andamio es su inherente falta de resistencia mecanica. Por consiguiente, esta invencion combina colageno y HA para formar una construccion tridimensional de material compuesto con las ventajas de ambos constituyentes y ninguna de las desventajas.

Ademas de los actuales materiales constituyentes por si mismos, el procedimiento de elaboracion del andamio y posterior morfologia de la construccion es vital en la determinacion del exito in vivo del implante del andamio. La elaboracion de la presente invencion implica el uso de una tecnica de elaboracion de un andamio de colageno especializada que, de forma tipica, incluye liofilizacion/secado por congelacion. Tradicionalmente, la elaboracion de andamios porosos usando liofilizacion implica la congelacion rapida o inactivacion de los materiales constituyentes del andamio mezclados entre si en una suspension. Esto da como resultado una distribucion de poros extremadamente irregular y un elevado grado de variacion en el tamano de poros. Adicionalmente, la inactivacion altera la relacion de aspecto de los poros creados, conduciendo a formas de poro con diferentes magnitudes en las tres dimensiones. El procedimiento de elaboracion mediante secado por congelacion de la presente invencion facilita el control exhaustivo de todos los determinantes morfologicos principales de la viabilidad del andamio. Lo hace controlando de forma precisa la temperatura y presion en la camara de secado por congelacion durante las etapas de congelacion y secado del proceso. Se ha demostrado que una congelacion o secado no controlado en cualquier punto durante el procedimiento de elaboracion conduce a distribuciones de poro, formas y tamanos heterogeneos, los cuales son todos determinantes clave en la viabilidad de las celulas sembradas. Usando un procedimiento de secado por congelacion, se pueden elaborar andamios basados en colageno porosos, reproducibles y homogeneos de forma repetida con elevadas interconectividad de poros, porosidad y area de la superficie, las cuales son todas clave para el exito en el transporte masivo de celulas en el andamio y tejido del huesped circundante y proporciona un espacio para la vascularizacion y recrecimiento de nuevo tejido. Ademas, el procedimiento de la invencion permite el control extensivo del tamano de poros de la construccion, facilitando una funcionalidad especifica de las celulas. La presente divulgacion describe la elaboracion de un andamio de material compuesto, mediante el uso del procedimiento de la invencion que da como resultado un andamio poroso, tridimensional que tiene una alta porosidad, alta interconectividad de poros y una distribucion homogenea de HA en la matriz de colageno.

Breve descripcion de las figuras

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Figura 1: Rigidez en compresion del andamio no reticulado con EDAC como funcion del tipo de andamio. (Colageno = andamio control de colageno mezclado en acido acetico 0,05M, 10% en peso de HA = colageno + 10% en peso de HA peso mezclado en acido acetico 0,05M, 50% e peso de HA(L) = colageno + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,1 M, 50% en peso de HA = colageno + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 2: Rigidez en compresion de andamio reticulado con EDAC como funcion del tipo de andamio. (Colageno = andamio control de colageno reticulado con EDAC mezclado en acido acetico 0,5M, 50 HA = colageno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 100 HA = colageno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 200 HA = colageno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 3: Porosidad del andamio en funcion del tipo de andamio.

(Colageno = Andamio control de colageno no reticulado con EDAC mezclado en acido acetico 0,5M, 50 HA = Colageno del andamio no reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 100 HA = Colageno del andamio no reticulado con EDAC + HA al 100% en peso mezclado en acido acetico 0,5M, 200 HA = Colageno del andamio no reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 4: Bioactividad in vitro en funcion del tipo de andamio (t = 7, 14, 21,28 dias)

Densidad de siembra inicial de 2 millones de celulas usadas en todos los andamios. (Colageno = andamio control de colageno reticulado con EDAC mezclado en acido acetico 0,5M, 50 HA = colageno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 100 HA = colageno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 200 HA = colageno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 5: Bioactividad in vitro en funcion del tipo de andamio (t = 28 dias - 7 dias)

Nueva bioactividad de andamios entre el dia 7 y el dia 28 (colageno = andamio control de colageno reticulado con EDAC mezclado en acido acetico 0,5M, 50 HA = colageno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 100 HA = colageno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 200 HA = colageno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 6: Imagen de escaner de MicroTC del andamio de material compuesto de acuerdo con la invencion.

Figura 7: Seccion del andamio de la Figura 6.

Figura 8: Imagen SEM del andamio con 50% en peso de HA que destaca la estructura de poros homogeneos e interconectados.

Figura 9: Distribucion de particulas minerales de la region de interes definida en la Figura 8.

Figuras 10 y 11: Imagenes SEM de un andamio de material compuesto con 50% en peso de HA no reticulado con EDAC conforme a un aumento de 10 veces y 100 veces, respectivamente.

Figura 12: Permeabilidad del andamio en funcion del tipo de andamio.

(Colageno = andamio control de colageno reticulado con EDAC mezclado en acido acetico 0,5M, 50 HA = colageno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 100 HA = colageno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M, 200 HA = colageno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en acido acetico 0,5M).

Figura 13: Rayos X de un hueso de la boveda craneal de rata y dibujo esquematico adjunto que muestra la posicion del defecto y las posiciones de las secciones tomadas de las imagenes del escaner de Tc.

Figura 14: Imagenes de escaner de MicroTC de un hueso de la boveda craneal de rata que tiene un defecto vacio.

Figuras 15 y 16: Imagenes de escaner de MicroTC de un hueso de la boveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 50% en peso de HA reticulado con EDAC de la invencion sembrado con celulas MSC de rata.

Figuras 17 y 18: Imagenes de escaner de MicroTC de un hueso de la boveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 200% en peso de HA reticulado con EDAC de la invencion sembrado con celulas MSC de rata.

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Figuras 19 y 20: Imageries de escaner de MicroTC de un hueso de la boveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 50% en peso de HA reticulado con EDAC de la invencion (sin sembrar).

Figuras 21 y 22: Imagenes de escaner de MicroTC de un hueso de la boveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 200% en peso de HA reticulado con EDAC de la invencion (sin sembrar).

Descripcion detallada de la invencion

Elaboracion de la invencion. Se elaboraron andamios control de colageno y andamios con 10% en peso de HA usando el protocolo descrito en la Realizacion 1, de forma especifica, usando una concentracion inicial de acido acetico de 0,05M. A medida que aumentaba la relacion de HA hasta un 50% en peso de HA, la mezcla homogenea de los dos constituyentes principales (colageno y HA) se hacia mas problematica. Se encontro que un aumento en la concentracion inicial de acido acetico aliviaba este problema. El efecto de este aumento en la concentracion de acido acetico se investigo usando dos aumentos diferentes en la concentracion de acido acetico, especificamente 0,1M y 0,5M. Estas realizaciones se describen en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente. La elaboracion de andamios control de colageno reticulados con EDAC y andamios de material compuesto que tienen 50% en peso, 100% en peso y 200% en peso de HA, se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 1

Se prepararon 400 ml de una solucion de acido acetico 0,05M (pH 3,05) usando agua destilada, desionizada (se anadieron 1,16 ml de acido acetico glacial a 398,84 ml de agua destilada, desionizada). Se uso un sistema de enfriamiento de agua WK1250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reaccion de vidrio hasta una temperatura constante de 4 0C durante una hora. Este recipiente de reaccion se uso para mezclar los constituyentes del andamio mientras se mantenia la suspension a una temperatura constante de 4 0C. Esto evitaba la desnaturalizacion de las fibras de colageno como resultado de la generacion de calor durante el proceso de mezcla. Se anadieron 1,8 g de colageno de tendon bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solucion de acido acetico 0,05 M. Se mezclo esta suspension usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4 0C. Se mezclaron 40 ml de la solucion de acido acetico con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), especificamente 10% en peso de colageno (0,18 g de HA). Se anadio una alicuota de 10 ml de esta solucion de acido acetico/HA a la suspension de colageno/acido acetico en el recipiente de reaccion enfriado a los 90 minutos. El procedimiento de suministro de la suspension de HA implicaba una agitacion vigorosa de la suspension inmediatamente antes de la inyeccion (garantizando una suspension homogenea de las particulas minerales) en el centro del vortice del mezclador mediante una jeringa. Se conecto un tubo de caucho a la boquilla de la jeringa para facilitar la inyeccion directamente en el centro del vortice del mezclador. Se anadieron a continuacion alicuotas de 10 ml (tres en total) a la suspension cada hora. Despues de anadir la alicuota final de solucion de HA en acido acetico, la suspension se mezclo durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media).

Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirio la suspension a un matraz conico limpio y se desgasifico a vacio a una presion de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos. Esta etapa elimino todas las burbujas de aire no deseadas en la suspension ya que estas tendrian un efecto perjudicial sobre el posterior proceso de secado por congelacion. El andamio se produjo usando un proceso de liofilizacion (secado por congelacion). Se coloco una alicuota de 67,5 ml de la suspension de colageno/HA en una bandeja de muestras de una camara liofilizadora suministrada por el fabricante del liofilizador (VirTis Co., Gardiner, NY, EEUU) y realizada en acero inoxidable calidad 304. Las dimensiones internas de la bandeja de muestras eran 127 mm de anchura x 127 mm de longitud x 38 mm de altura. El grosor de la placa base de la bandeja es de 3 mm. La bandeja de muestras se coloco en la camara de liofilizacion y se coloco en el estante de enfriamiento del liofilizador a una temperatura de 20 0C.

El proceso de secado por congelacion implico el enfriamiento de la camara de liofilizacion y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 0C/min), basandose en un estudio previo, hasta la temperatura de congelacion final (40 0C). La variable principal de la morfologia del cristal de hielo durante el proceso de secado por congelacion es la temperatura de congelacion final. La temperatura del estante y de la camara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelacion final durante 60 minutos hasta completar el proceso de congelacion. La temperatura del estante se incremento entonces hasta 0 0C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimo entonces a un vacio de aproximadamente 200 mTorr a 0 0C durante 17 horas para producir el andamio poroso de colageno/HA.

La construccion porosa de colageno/HA se coloco entonces en un horno de vacio (Fisher IsoTemp 201, Fisher Scientific, Boston, MA) para reticular el colageno mediante un proceso de reticulacion deshidrotermico. Los andamios se colocaron en el horno de vacio a una temperatura de 120 0C bajo un vacio de 50 mTorr durante 24 horas.

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Ejemplo 2

Se prepararon 400 ml de una solucion de acido acetico 0,1M (pH 2,9) usando agua destilada, desionizada (se anadieron 2,32 ml de acido acetico glacial a 397,68 ml de agua destilada, desionizada). Se uso un sistema de enfriamiento de agua WK1250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reaccion de vidrio hasta una temperatura constante de 4 0C durante una hora. Se anadieron 1,8 g de colageno de tendon bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solucion de acido acetico 0,1 M. Se mezclo esta suspension usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4 0C.

Se mezclaron 40 ml de la solucion de acido acetico con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), especificamente 50% en peso de colageno (0,9 g de HA). Se anadio una alicuota de 10 ml de esta solucion de acido acetico/HA a la suspension de colageno/acido acetico en el recipiente de reaccion enfriado a los 90 minutos. Se anadieron a continuacion alicuotas de 10 ml (tres en total) a la suspension cada hora. Despues de anadir la alicuota final de solucion de HA en acido acetico, la suspension se mezclo durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media). Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirio la suspension a un matraz conico limpio y se desgasifico a vacio a una presion de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos.

El andamio se produjo usando un proceso de liofilizacion (secado por congelacion). Se coloco una alicuota de 67,5 ml de la suspension de colageno/HA en una bandeja de muestras de una camara liofilizadora suministrada por el fabricante del liofilizador (VirTis Co., Gardiner, NY, EEUU) y realizada en acero inoxidable calidad 304. Las dimensiones internas de la bandeja de muestras eran 127 mm de anchura x 127 mm de longitud x 38 mm de altura. El grosor de la placa base de la bandeja es de 3 mm. La bandeja de muestras se coloco en la camara de liofilizacion y se coloco en el estante de enfriamiento del liofilizador a una temperatura de 20 0C.

El proceso de secado por congelacion implico el enfriamiento de la camara de liofilizacion y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 0C/min), hasta la temperatura de congelacion final (40 0C). La temperatura del estante y de la camara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelacion final durante 60 minutos. La temperatura del estante se incremento entonces hasta 0 0C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimo entonces a un vacio de aproximadamente 200 mTorr a 0 0C durante 17 horas.

Ejemplo 3

Se prepararon 400 ml de una solucion de acido acetico 0,5M (pH 2,55) usando agua destilada, desionizada (se anadieron 11,6 ml de acido acetico glacial a 388,4 ml de agua destilada, desionizada). Se uso un sistema de enfriamiento de agua WK1250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reaccion de vidrio hasta una temperatura constante de 4 0C durante una hora. Se anadieron 1,8 g de colageno de tendon bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solucion de acido acetico 0,5 M. Se mezclo esta suspension usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4 0C.

Se mezclaron 40 ml de la solucion de acido acetico con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), especificamente 50%, 100% y 200% en peso de colageno (0,9, 1,8 y 3,6 g de HA).

Se anadio una alicuota de 10 ml de esta solucion de acido acetico/HA a la suspension de colageno/acido acetico en el recipiente de reaccion enfriado a los 90 minutos. Se anadieron a continuacion alicuotas de 10 ml (tres en total) a la suspension cada hora. Despues de anadir la alicuota final de solucion de HA en acido acetico, la suspension se mezclo durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media). Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirio la suspension a un matraz conico limpio y se desgasifico a vacio a una presion de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos.

El proceso de secado por congelacion implico el enfriamiento de la camara de liofilizacion y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 0C/min), hasta la temperatura de congelacion final (40

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0C). La temperatura del estante y de la camara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelacion final durante 60 minutos. La temperatura del estante se incremento entonces hasta 0 0C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimo entonces a un vacio de aproximadamente 200 mTorr a 0 0C durante 17 horas para producir el andamio poroso de colageno/HA.

Ejemplo 4

Se mezclaron 40 ml de la solucion de acido acetico con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), especificamente 50%, 100% y 200% en peso de colageno (0,9, 1,8 y 3,6 g de HA). Se anadio una alicuota de 10 ml de esta solucion de acido acetico/HA a la suspension de colageno/acido acetico en el recipiente de reaccion enfriado a los 90 minutos. Se anadieron a continuacion alicuotas de 10 ml (tres en total) a la suspension cada hora. Despues de anadir la alicuota final de solucion de HA en acido acetico, la suspension se mezclo durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media). Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirio la suspension a un matraz conico limpio y se desgasifico a vacio a una presion de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos.

El proceso de secado por congelacion implico el enfriamiento de la camara de liofilizacion y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 0C/min), hasta la temperatura de congelacion final (40 0C). La temperatura del estante y de la camara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelacion final durante 60 minutos. La temperatura del estante se incremento entonces hasta 0 0C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimo entonces a un vacio de aproximadamente 200 mTorr a 0 0C durante 17 horas para producir el andamio poroso de colageno/HA.

Despues del procedimiento de reticulacion DHT, se reticularon los andamios quimicamente usando clorhidrato de etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAC) como agente reticulante. Se mezclo EDAC a una concentracion de 6 mmol de EDAC por gramo de andamio en una relacion molar de 5:2 con N-hidroxisuccinimida (EDAC:NHS = 5:2). Los andamios se sumergieron en esta solucion de EDAC/NHS y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuacion, se aclararon los andamios dos veces usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubo en PBS durante dos horas usando un agitador orbital para agitar el PBS.

Caracterizacion de los andamios de material compuesto

Para los propositos de este estudio, todos los andamios de colageno/HA elaborados se compararon con un andamio control realizado en colageno, elaborado usando el protocolo convencional usado en este laboratorio de investigacion, de forma especifica, en solucion de acido acetico 0,5M y se liofilizaron a una velocidad de enfriamiento constante hasta una temperatura de congelacion final de 40 0C.

1. Rigidez mecanica

Para garantizar la supervivencia una vez implantado en un defecto oseo, un sustituto de injerto oseo debe poseer suficiente resistencia intrinseca para soportar las fuerzas a las que se ve sometido al soportar cargas en el sitio del

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defecto afectado. La capacidad para elaborar de forma personalizada un sustituto de injerto oseo osteoconductor con suficiente resistencia intrfnseca para permitir su implantacion en un defecto que soporta carga fue el objetivo principal de este estudio. Mediante el uso de tecnologfa de materiales compuestos, se combina una construccion a base de colageno extremadamente biocompatible con la hidroxiapatita ceramica mas resistente para desarrollar un sustituto de injerto oseo con todas las ventajas de ambos materiales y ninguna de sus desventajas. Todos los ensayos se llevaron a cabo en andamios hidratados con solucion salina tamponada con fosfato (PBS). El ensayo de compresion en muestras de andamios se llevo a cabo usando una maquina de ensayos mecanicos Zwick provista de una celula de carga de 5-N. Se cortaron muestras de 8 mm de diametro (4 mm de altura) de las hojas usando un punzon de cuero afilado con una lima metalica redondeada. Las muestras se hidrataron entonces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) una hora antes del ensayo en una placa de cultivo de 24 pocillos. El protocolo de ensayo consistfa en dos ciclos: un ciclo de preacondicionamiento y un ciclo de ensayo. Para ambos ciclos se aplico una carga previa de 0,15 nM y se mantuvo la posicion durante un minuto. Esta fuerza se selecciono puesto que es suficientemente baja (0,5% de la carga a una deformacion del 10%) para garantizar el contacto con la muestra sin compresion suficiente de la muestra antes del ensayo. La posicion de la platina superior en esta carga previa se uso para medir la altura del andamio. Se colocaron andamios hidratados en una platina seca que se habfa sumergido antes de bajar la platina superior. Se puso cuidado en garantizar que no quedaban burbujas atrapadas entre la platina superior y el andamio. Para el preacondicionamiento, se cargaron las muestras hasta un 5%. Para el ensayo, se cargaron las muestras hasta un 10% y se descargaron. Se uso una velocidad de deformacion del 10% por minuto. Despues del ensayo se midio el diametro de las muestras en tres posiciones separadas usando un calibre Vernier. Se definio el modulo como la pendiente de un ajuste lineal a la curva de tension-deformacion a una deformacion de 2-5%.

La Figura 1 muestra el efecto de anadir HA al andamio reticulado sin EDAC sobre la rigidez en compresion. Se encontro que la adicion de un 50% en peso de HA aumento significativamente la rigidez en compresion medida por ensayo mecanico en compresion no confinada. Se aprecio un aumento en la rigidez en compresion de casi un 300% relativo a productos control de andamios de colageno. De particular interes fue el efecto de la concentracion de acido acetico sobre la eficacia de incorporacion de HA en la construccion. Se cree que explica el aumento relativamente grande de la rigidez incorporando un 10% en peso de HA en la suspension de colageno convencional sin aumentar correspondientemente la concentracion de acido acetico. En conclusion, con una adicion de tan solo un 50% en peso de HA, se consigue un aumento mayor de la rigidez de mas del triple y mediante ligeros ajustes en la concentracion de acido acetico, se pueden conseguir maximos aumentos en la rigidez de la construccion con la adicion de cantidades relativamente pequenas de HA. Por consiguiente, esto permitira aumentos significativos en la relacion de HA anadido alterando correspondientemente la concentracion inicial de acido acetico en futuros estudios.

La Figura 2 muestra el efecto de anadir HA al andamio reticulado con EDAC sobre la rigidez en compresion. El andamio de partida, colageno, aumenta su rigidez de 0,2 kPa en la Figura 1 a aproximadamente 1,5 kPa en la Figura

2. La adicion de HA aumenta aun la rigidez de los andamios como se pretende, pero en menores cantidades de HA, tales como 50% en peso de HA, el efecto de la reticulacion con EDAC eclipsa esto. Sin embargo, a un 200% en peso de HA, se aprecia un aumento significativo en la rigidez como antes. La adicion de pequenas cantidades de HA mostro que aumentaba significativamente aspectos de biocompatibilidad de los andamios reticulados y esto se describe mas adelante en las secciones 5 y 7.

2. Porosidad de la invencion

La porosidad de un andamio poroso es una medida de la proporcion del volumen de andamio compuesto de espacio poroso, abierto, expresado como porcentaje. En terminos mas sencillos, es el porcentaje de volumen de poros de una construccion porosa. Se requiere una elevada porosidad del andamio para la difusion de nutrientes/materiales de desecho hacia/desde las celulas tanto in vitro como in vivo. Una de las limitaciones principales en el desarrollo de andamios de tejido preparados por ingenierfa tisular ha sido el problema de la degradacion del nucleo, que se produce por la falta de suministro de nutrientes y de eliminacion de materiales de desecho desde el centro de la construccion. Como resultado, las construcciones fallan con frecuencia una vez implantadas debido a necrosis avascular en el centro del andamio. Una de las grandes ventajas de los andamios basados en colageno de la presente invencion en su alta porosidad. La porosidad del andamio se determino por la medicion precisa de una muestra de andamio seca de 8 mm, 4 mm de profundidad usando un balance de masas. Usando la formula para el volumen de un cilindro, nr2h, se calculo la densidad de cada muestra dividiendo la masa por el volumen. La porosidad se calculo usando la formula 100 - [100(pandamio / Pmaterial)] donde Pandamio es la densidad de una muestra dada y pmaterial es la densidad determinada de los constituyentes del andamio (es decir, pandamio con 10% en peso de ha =

[mcolageno + m10% en peso de Ha]/ [mcolageno/pcolageno + m10% en peso de HA/p10% en peso de Ha]).

La adicion de HA a las construcciones dio como resultado una disminucion en la porosidad del andamio pero esta fue despreciable en terminos absolutos como puede apreciarse en la Figura 3. Por tanto, los andamios de la invencion incorporan HA en la construccion pero reteniendo una porosidad muy alta para mejorar la migracion celular en el centro del andamio para estimular la proliferacion celular. Se demuestra que esto se cumple en los datos del estudio en animales in vivo mostrado mas adelante.

De forma especffica, nuestro intervalo de porosidades en andamios producidos realmente vario de un 99,5% para

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colageno puro hasta un 99% para andamios con un 200% en peso de HA.

3. Estructura mineral

La distribucion de particulas de mineral a lo largo de los andamios es un parametro/atributo dificil de cuantificar. Es un atributo mucho mas facil de visualizar y, por tanto, es dificil definir un intervalo de valores a proteger. Esta se visualizo usando dos procedimientos diferentes. El primero fue microTC que se muestra en la Figura 6 mas adelante. El escaner de microTC usado en este analisis usa rayos X para detectar tejido mineralizado. Por consiguiente, la Figura 6 muestra solo las particulas minerales en un andamio con 100% de HA. Sabiendo que el colageno no es visible, se puede observar que las particulas minerales estan distribuidas de forma completa y uniforme en todo el andamio. Dado que el andamio esta vacio en un 99%, esta imagen muestra la evidente conclusion de que el HA esta intimamente asociado con las fibras de colageno. La Figura 7 muestra una loncha en dos dimensiones del mismo andamio que ilustra la distribucion desde otro punto de vista.

Las Figuras 8 y 9 ilustran la distribucion de las particulas minerales en todo el andamio con 50% en peso de HA usando una herramienta de visualizacion diferente, Microscopia Electronica de Barrido (SEM). Ambas imagenes muestran la misma region de interes en un andamio con 50% en peso de HA. La Figura 8 muestra ambas fases de colageno y HA. Las particulas minerales no pueden distinguirse a simple vista. Sin embargo, usando el Analisis de rayos X con dispersion de energia, se pueden detectar las particulas minerales para la region identica de interes (ROI). Esto se muestra en la Figura 9 como pixeles blancos que representan particulas minerales. Junto con los datos de microTC, estas imagenes demuestran de forma concluyente que las particulas minerales estan distribuidas de forma uniforme y homogenea en todo el andamio y que estan intimamente asociadas con los soportes de colageno.

4. Interconectividad de poros

La interconectividad de poros es otro atributo importante de los andamios que es muy dificil definir de forma cuantitativa en andamios compuestos principalmente de material biologico. Sin embargo, la interconectividad de poros esta fuertemente relacionada con la permeabilidad del andamio. La permeabilidad se define mas adelante pero la conductividad del flujo depende conjuntamente de la porosidad, el tamano de poros y la interconectividad de poros. Por consiguiente, la permeabilidad aporta una indicacion de la interconectividad de poros cuando se definen el tamano de poros y la porosidad.

Se proporcionan imagenes SEM de andamios de la invencion para ilustrar los niveles extremadamente elevados de interconectividad de poros que se pueden apreciar facilmente. La Figura 10 muestra un andamio con un 50% en peso de HA a 10 aumentos y la estructura obviamente interconectada en la superficie. Se puede apreciar que es identica usando secciones delgadas tomadas de tales muestras. La Figura 11 muestra el mismo andamio con un 50% en peso de HA a 100 aumentos. Esta imagen ilustra la interconectividad de poros. A este aumento, se concluye que la estructura de poros esta interconectada.

5. Bioactividad In-Vitro

El efecto de la adicion de HA al andamio de colageno se determino cuantificando la proliferacion de osteoblastos MC3T3E1 en los andamios despues de 7, 14, 21 y 28 dias de incubacion. Se encontro que la adicion de HA a los andamios no tenia efectos perjudiciales sobre la actividad celular. De hecho, se encontro lo contrario a los 28 dias despues de la siembra. Se encontro que aumentar la proporcion de HA hasta 200% en peso de HA estimulaba la proliferacion celular incluso mas que el andamio de colageno puro control. La Figura 4 muestra los valores absolutos de celulas retenidas en los andamios.

Como se puede apreciar, los andamios con 50% en peso de HA retuvieron un numero significativamente menor de celulas debido a restricciones empiricas. Por consiguiente, la Figura 4 no da la mejor indicacion de la bioactividad. Por consiguiente, la Figura 5 ilustra el numero medio de celulas neto que quedan en los tipos de andamios a los 28 dias. Se aprecia una disminucion neta de 0,5 millones en la proliferacion celular en las construcciones de colageno puro (aproximadamente un 20% de disminucion), que no es sorprendente puesto que la construccion de colageno puro es favorable pero no esta optimizada para celulas osteoblastos. Sin embargo, la adicion de 50% en peso, 100% en peso y 200% en peso de HA da como resultado una mayor proliferacion celular de aproximadamente 500%, 50% y 30%, respectivamente (Figura 4).

6. Permeabilidad de la invencion

La permeabilidad de un andamio poroso es esencialmente la conductividad del flujo a presion a traves de dicho medio poroso. Una elevada permeabilidad del andamio es fundamental para la viabilidad a largo plazo del andamio in vivo puesto que permite la migracion de las celulas al centro del andamio y facilita la vascularizacion in vivo. Los andamios con 50% en peso, 100 % en peso y 200% en peso de HA presentaron una permeabilidad del tejido media significativamente aumentada con respecto a los andamios de colageno control. Esto fue un hallazgo sorprendente pero positivo de este estudio y muestra que la adicion de HA realmente ayuda al flujo de fluido por todo el andamio.

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Se cree que este aumento en la conductividad del flujo por el andamio se debe a la mayor rigidez del andamio. El protocolo empirico usado para cuantificar la permeabilidad del andamio se describe con detalle en la referencia [5] (O’Brien et al, 2007, Seccion 2,2, paginas 7-10).

7. Ensayo en animales in vivo

Se llevo a cabo un pequeno ensayo clinico en animales para determinar el potencial de esta invencion para estimular la osteogenesis y mineralizacion de un defecto de un tamano de gravedad en el hueso. Durante el ensayo se usaron nueve ratas Wistar. Se creo un defecto de un tamano de gravedad en la boveda del craneo de la rata. Se dejo un animal con un defecto vacio como control. Los otros ocho animales se dividieron en grupos. Concretamente, se llenaron cuatro de los defectos con andamios con 50% en peso de HA, dos de los cuales se sembraron con citoblastos mesenquimatosos (MSC) de rata y dos de los cuales se dejaron sin sembrar. Esto fue asi para investigar el potencial del tejido creado por ingenieria tisular frente a los tipos de andamios comerciales. Los defectos de las cuatro muestras restantes se llenaron con andamios con 200% en peso de HA y, de nuevo, estos se dividieron homogeneamente entre andamios sembrados y no sembrados. Despues de 28 dias en las bovedas del craneo de las ratas, los animales se sacrificaron y se extirparon las bovedas del craneo. Estas se procesaron y analizaron usando microTC para investigar la presencia de andamio en el defecto y observar el efecto de los tipos de andamio sobre el proceso de cicatrizacion, osteogenesis y produccion de matriz mineral. Las figuras en las siguientes secciones muestran lonchas en dos dimensiones tomadas de la rata con defecto vacio. Las lonchas eran secciones de corona del hueso de la boveda del craneo. Los defectos tenian 5 mm de diametro y eran perfectamente circulares. Las secciones mostradas en los datos de microTC se representan en forma esquematica mas adelante en la Figura 13.

Defecto vacio (Fig. 14)

Los datos de animales con defecto vacio mostraron que el defecto se relleno con tejido fibroso blanco como parte del proceso de cicatrizacion. Esto era de esperar y se habia apreciado en ensayos en animales llevados a cabo con anterioridad en el grupo de ingenieria tisular de los autores. En algunos puntos del defecto despues del ensayo de 28 dias, se observaron pequenas particulas de material denso en el defecto vacio pero estos se observaban pocas veces y no fueron suficientemente densos para indicar una cicatrizacion significativa en la muestra con defecto vacio. Mas adelante se muestran ejemplos de estos en las imagenes de rayos X de microTC.

Siembra 1 con 50 % en peso (Fig. 15)

Los andamios sembrados con celulas con 50% en peso de HA mostraron resultados mas prometedores. Estos andamios se sembraron con citoblastos mesenquimatosos de rata antes de implantarlos. Como se puede apreciar de las siguientes imagenes de rayos X de microTC representativas, se apreciaron pequenas bolsas heterogeneas de material mediadamente mineralizado no solo en la periferia de la interfase defecto-hueso, sino tambien en el centro de los andamios. Hubo un numero significativamente mayor de casos de estas bolsas de mineralizacion con respecto a los datos del defecto vacio y aparecian con intensidad mas brillante con respecto a los casos observados en el defecto vacio.

Siembra 2 con 50 % en peso (Fig. 16)

El segundo andamio sembrado con celulas con 50% en peso de HA de la invencion mostraron resultados mucho mas mejorados con respecto al primer andamio sembrado con celulas al 50% en peso de HA y, por consiguiente, respecto al defecto vacio. Se apreciaron casos significativos de tejido fuertemente mineralizado en puntos en todo el defecto relleno con andamio. Esto era especialmente evidente en la periferia de la interfase andamio-hueso. El nivel de mineralizacion no fue tan alto como el observado en el hueso circundante pero era muy similar. Esto puede apreciarse como niveles de intensidad casi identica del tejido mineralizado observado en el defecto relleno con andamio y del hueso circundante.

Siembra 1 con 200 % en peso (Fig. 17)

El primer andamio sembrado con celulas con 200% en peso de HA mostro resultados significativamente mejorados al comparar con los andamios con 50% en peso de HA. Casi en todos los puntos examinados por todo el defecto se observaron niveles significativos de mineralizacion desde la periferia del defecto en todas direcciones hacia el centro del defecto relleno con andamio. En esta muestra, el nivel de mineralizacion no fue tan alto como el del tejido oseo circundante indicado por la diferencia relativa en la intensidad de la imagen de las particulas mineralizadas en el defecto relleno de andamio.

Siembra 2 con 200 % en peso (Fig. 18)

El segundo andamio sembrado con celulas con 200% en peso de HA mostro resultados significativamente mejorados al comparar con todos los andamios anteriores. En un numero significativo de areas examinadas en todo el defecto se observaron niveles significativos de mineralizacion desde la periferia del defecto en todas direcciones

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hacia el centro del defecto relleno con andamio. A diferencia de los primeros andamios sembrados con celulas con 200% en peso de HA, el tejido mineralizado formado no era de una naturaleza en partfculas sino continua en todo el defecto relleno con andamio. Lo mas interesante es que esta mineralizacion continua se observo en la parte mas ancha del defecto. En esta muestra, el nivel de mineralizacion fue casi identico al del tejido oseo circundante indicado por la intensidad de imagen similar del material mineralizado en el defecto relleno con andamio.

No sembrado 1 con 50% en peso (Fig. 19)

Los resultados del defecto relleno de andamio exento de celulas para andamios con 50% en peso de HA fueron muy similares a los de andamios sembrados con celulas con 50% en peso de HA. Se observo en todo el defecto relleno con andamio tejido significativamente mineralizado pero no de naturaleza continua. Sin embargo, la intensidad del tejido mineralizado fue marginalmente mayor que la observada en muestras sembradas con celulas. Esto se observo en toda las muestras no sembradas que siguen e indico que una construccion exenta de celulas puede comportarse mejor in vivo.

No sembrado 2 con 50% en peso (Fig. 20)

Esta muestra no sembrada con 50% en peso de HA mostro resultados similares a las otras muestras con 50% en peso de HA. Despues del ensayo de 28 dfas, se observo evidencia de comienzo de mineralizacion del andamio tanto en la periferia como en el centro del defecto relleno con andamio pero el tejido mineralizado no fue continuo. Sin embargo, la intensidad de las partfculas mineralizadas indico una mineralizacion similar a la del hueso circundante.

No sembrado 1 con 200% en peso (Fig. 21)

Como se observo en las muestras sembradas con celulas con 200% en peso de HA, la muestra no sembrada con 200% en peso de HA mostro niveles significativos de mineralizacion en la periferia y en el centro del defecto relleno con andamio en un numero significativo de areas por todo el defecto. Este tejido mineralizado era de naturaleza continua, a diferencia del observado en las muestras con 50% en peso de HA.

No sembrado 2 con 200% en peso 2 (Fig. 22)

Como se observo en la muestra no sembrada con 200% en peso de HA anterior, esta muestra no sembrada con 200% en peso de HA mostro niveles significativos de mineralizacion en la periferia y en el centro del defecto relleno con andamio en un numero significativo de areas por todo el defecto. Este tejido mineralizado era de naturaleza continua, a diferencia del observado en las muestras con 50% en peso de HA.

La invencion no queda limitada a las realizaciones descritas en el presente documento. Como tales, las tres realizaciones de la invencion descritas en el presente documento representan una pequena proporcion del numero total de variantes de andamios posibles usando el mismo protocolo de elaboracion principal. Cualquiera de los constituyentes en sf mismos o etapas de realizacion o etapas de proceso especfficas se pueden modificar para producir una gama de construcciones variada, optimizada para usos especfficos de aplicacion. Las posibles variaciones incluyen.

Concentracion de acido acetico: La concentracion de acido acetico en la suspension inicial de colageno se puede alterar para adecuarse a aplicaciones especfficas. Aumentar la concentracion estimula una integracion mas rapida y homogenea de las partfculas de HA en la suspension de mezcla. Ademas, esta concentracion tiene tambien un efecto significativo tanto sobre las propiedades mecanicas como sobre la biocompatibilidad del andamio. Estos efectos se describen con detalle en la seccion anterior de "Caracterizacion de la invencion". De forma adecuada, la concentracion de acido acetico se puede variar de 0,05M a 5M.

Cantidad de colageno: La cantidad de colageno se puede variar en la suspension inicial de colageno. Aumentar la cantidad de colageno da como resultado un aumento en la rigidez mecanica del andamio resultante. Esto tambien tiene un efecto significativo sobre la biocompatibilidad del andamio. De forma adecuada, la cantidad de colageno puede variar de 0,5 g/l hasta 50 g/l de la solucion de acido acetico (1/10 y 10 veces la concentracion de colageno convencional, respectivamente).

Cantidad de hidroxiapatita: La cantidad de HA se puede variar en un intervalo especificado con respecto a la proporcion de colageno en la suspension de andamio antes de la elaboracion. De forma especffica, la cantidad de HA puede variar de forma adecuada de 10 a 1000 por ciento en peso de la cantidad de colageno usada. Se encontro que aumentar el contenido de HA aumentaba significativamente la rigidez mecanica del andamio elaborado.

Tipo de hidroxiapatita: La presente invencion se puede elaborar usando las formas sinterizada, no sinterizada y otras formas de polvo de HA.

Adicion de hidroxiapatita: Tanto el volumen de la alfcuota de HA como el intervalo de inyeccion pueden variarse para facilitar la mezcla de los dos constituyentes principales de la suspension. En general, el intervalo de inyeccion se

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puede variar de 30 minutos hasta 240 minutos. Ademas, el volumen de alicuota se puede variar adecuadamente de 1 ml hasta 100 ml. Esta libertad facilita la optimizacion de cualquier realizacion particular de la invencion.

Tamano de particulas de hidroxiapatita: De forma tipica, el tamano de particulas de la HA se puede variar de 10 nm hasta 100 pm para adaptarse a aplicaciones especificas.

Temperatura de congelacion final: La temperatura de congelacion final alcanzada durante el proceso de secado por congelacion determina el tamano medio de poro en los andamios elaborados. Esta temperatura de congelacion final se puede variar para producir andamios con diversos tamanos de poro especificos para una aplicacion o tipo de celula especifica. De forma adecuada, la temperatura de congelacion final se puede variar de -10 0C hasta -70 0C.

Interfase de congelacion: La interfase de congelacion colocada entre la suspension de la realizacion y el estante de enfriamiento del secador por congelacion se puede variar. El tipo de interfase de congelacion afecta a la transmision de energia termica hacia/desde la suspension/andamio y puede alterar la estructura de poro del andamio final. Estan disponibles cuatro opciones principales, en especial un recipiente con paredes de interfase definida realizado en metal (1), plastico (2), una membrana polimerica (3) o sin interfase (4).

Velocidad de congelacion: La velocidad de congelacion determina la velocidad de nucleacion de cristales de hielo en la suspension colageno/HA durante el proceso de secado por congelacion y controla la homogeneidad del proceso de formacion de poros. La velocidad de enfriamiento se varia para optimizar el proceso de congelacion para diversos tipos de interfases disponibles entre la suspension y el estante de enfriamiento del secador por congelacion (por ejemplo, metal, plastico, ninguna). De forma tipica, la velocidad de congelacion se puede variar de 0,01 0C/min hasta 10 0C/min.

Recocido: Se puede emplear una etapa de recocido durante el proceso de secado por congelacion y permite la creacion de poros con un diametro medio significativamente mayor que los tamanos de poros que pueden obtenerse variando unicamente la temperatura de congelacion final. El tiempo de recocido se puede variar de 15 minutos a 36 horas. A mayor tiempo de recocido, mayor es el tamano medio de poro final.

Procedimiento de reticulacion del andamio: El procedimiento de reticulacion puede ser uno de una serie posible de tecnicas, de naturaleza bien deshidrotermica o quimica. Ademas, ambas tecnicas se pueden emplear de forma consecutiva. Opciones de reticulacion especificas incluyen glutaraldehido, carbodiimidas (EDAC), transglutaminasa microbiana (mTgasa), reticulacion deshidrotermica (DHT) y radiacion ultravioleta (UV).

Temperatura/concentracion de reticulacion del andamio: El colageno del andamio secado por congelacion se puede reticular por medios deshidrotermicos para aumentar la rigidez mecanica del andamio. La temperatura de reticulacion se puede variar de 105 0C hasta 180 0C con un aumento correspondiente en la rigidez de la realizacion. Ademas, cuando se usan procedimientos de reticulacion quimica, la concentracion de la solucion de reticulacion se puede variar para alterar el grado de reticulacion quimica.

Duracion de la reticulacion del andamio: El tiempo de exposicion a la reticulacion se puede variar para alterar el grado del proceso de reticulacion en el andamio. Este se puede variar de 24 a 120 horas para alterar las especificaciones mecanicas finales del andamio.

Referencias

[1] Tancred D.C., Carr A.J. y McCormack B.A. Development of a new synthetic bone graft. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 9(12): 819-823, 1998.

[2] Dong J.K., Luthy H., Wohlwend A. y Scharer P. Heatpressed ceramics: technology and strength. International Journal of Prosthodontics, 5(1 ):9-16, 1992.

[3] Bailey A.J., Light N.D. y Atkins E.D.T. Chemical crosslinking restrictions on models for the molecular organisation of the collagen fibre. Nature, 288:408-410, 1980.

[4] Yannas LV. Tissue and Organ Regeneration in Adults. New York: Springer, 2001.

[5] O’Brien F.J., Harley B.A., Yannas I.V. y Gibson L.J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen gag scaffolds. Biomaterials, 26:433-441,2005.

[6] O’Brien, F.J.; Harley, B.A.; Waller, M.A.; Yannas, I.V; Gibson, L.J y Prendergast, P.J. (2007) The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Healthcare Invited Article (15):3-17.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) que comprende una distribucion homogenea de hidroxiapatita dentro de una matriz de colageno porosa, en el que la relacion de HA a colageno es al menos de 1:10 (p/p), en el que el andamio de material compuesto tiene una porosidad de al menos 98% (v/v) y una rigidez en compresion de al menos 0,4 kPa, y en el que el andamio de material compuesto comprende celulas.
2. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun la reivindicacion 1, que tiene una relacion de HA a colageno de al menos 10:10 o al menos 10:20 (p/p).
3. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o

2, que tiene una porosidad de al menos 99% (v/v).
4. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3, que se reticula por medios deshidrotermicos y con EDAC, que tiene una rigidez en compresion de al menos 1,0 kPa, 2,0 kPa o 3 kPa.
5. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

4, en el que la relacion de HA a colageno en el andamio de material compuesto es de 1:10 (p/p) a 50:10 (p/p) o de 5:10 (p/p) a 30:10 (p/p).
6. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

5, en el que el andamio de material compuesto esta caracterizado por un nivel de proliferacion de osteoblastos MC3T3 en el andamio a los 28 dias de incubacion menos el nivel a los 7 dias de al menos 0,5 x 106 celulas .
7. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

6, en el que el andamio de material compuesto esta caracterizado por tener una conductividad del flujo a presion a traves del andamio de al menos 1 x 10-10 m4/Ns.
8. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

7, en el que el andamio se produce en forma de una hoja.
9. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

8, en el que el andamio de material compuesto se siembra con al menos 1 x 106 celulas por 500 mm3 de volumen de andamio.
10. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita (HA) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a

9, que se reticula.
11. Un implante oseo osteoconductor que comprende un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Un implante elaborado por ingenieria tisular que comprende un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Un sustituto de injerto oseo maxilofacial que comprende un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
14. Un sustituto de injerto oseo dental, o un implante de reparacion de defectos del cartilago, o un implante de reparacion de defectos osteocondrales, que comprende un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Un andamio de material compuesto de colageno/hidroxiapatita segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las celulas son osteoblastos.