ES2653253T3

ES2653253T3 - Solución de polipéptido, método de producción de fibra de polipéptido artificial que usa la misma, y método de purificación de polipéptido

Info

Publication number: ES2653253T3
Application number: ES12844908.9T
Authority: ES
Inventors: Junichi Sugahara; Kaori Sekiyama; Ryota Sato; Mizuki Ishikawa; Shinya Murata; Kazuhide Sekiyama; Kazuko Otomo
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: EP3281950B1; WO2013065650A1; EP2774934B1; US9051453B2; CN103827139A; EP2774934A1; EP3281950A1; JP5427322B2; EP2774934A4; CN103827139B; JPWO2013065650A1; US20140245923A1

Abstract

Una solución de polipéptido en la que un polipéptido obtenido a partir de proteínas de seda de araña natural se disuelve en un disolvente, en la que el polipéptido es una proteína de seda de araña natural o una proteína de seda de araña recombinante y el disolvente contiene al menos uno seleccionado entre los siguientes (i)-(iii): (i) Dimetil sulfóxido; (ii) Dimetil sulfóxido con una sal inorgánica; y (iii) N,N-dimetilformamida con una sal inorgánica; y en la que, cuando la solución de polipéptido es de un 100 % en masa, el porcentaje del polipéptido está en un intervalo de un 3 a un 45 % en masa.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

[Tabla 1]

Disolvente polar: Sal inorgánica (% en masa) Solubilidad Solubilidad en caso de usar aditivo (% en masa)

EtOH*1: MeOH*1 Agua ultrapura

DMSO: Sin sal A 23 A 14 A 90 A

LiCl 10: A 60 A 52 A 90 A

DMSO: LiBr 10 A 33 A 30 A 90 A

Ca(NO3)2 95,5: A 74 A 78 A 90 A

CaCl2 13,6: A 57 A 39 A 90 A

NaSCN 13,6: A 33 A 25 A 90 A

DMF: Sin sal (~150 ºC) C -*4 - -

LiCl 14,4: A 62 A 45 A 90 A

LiBr 10: A 27 A 21 A 90 A

Ca(NO3)2 77,7: A 72 A 67 A 90 A

CaCl2 7,1: A 25 A 14 A 90 A

NaSCN 27,8: A 36 A 35 A 90 A

HFIP*2: Sin sal A 47 A 38 A 40 A

DMA: Sin sal C - - -

LiCl 11,1: C - - -

NMP: Sin sal C - - -

LiCl 10: C - - -

DMI: Sin sal C - - -

LiCl 14,2: C - - -

Carbonato de butileno: Sin sal C - - -

LiCl 8,7: C - - -

Carbonato de propileno: Sin sal C - - -

LiCl 8,3: C - - -

Carbonato de etileno: Sin sal C - - -

LiCl 7,7: C - - -

γ-butirolactona: Sin sal C - - -

LiCl 8,9: C - - -

Fosforamida de hexametilo: Sin sal C - - -

LiCl 9,7: C - - -

Ácido fórmico*3: Sin sal Se descompone - - -

LiCl 29,1: Se descompone - - -

13

imagen12

< Experimento 3 >

A continuación, la proteína se disolvió a 100 ºC usando DMSO, y la temperatura se mantuvo a 100 ºC o la temperatura de la solución de polipéptido se redujo a temperaturas bajas y se mantuvo durante tres horas para observarla estabilidad. La Tabla 3 muestra los resultados.

[Tabla 3]

Concentración de LiCl (% en masa): Concentración de proteína (% en masa) Temperatura (ºC)

25: 50 80 100

0: 20 Gel Gel A A

25: Gel Gel A A

0,9: 20 Gel B A A

2,7: 20 Gel A A A

3,6: 20 A A A A

30: Gel B B A

45: Gel B B A

4,5: 20 A A A A

5,4: 20 A A A A

10: 20 A A A A

30: A A A A

40: A A A A

A partir de la Tabla 3, se confirmó que, si la concentración de LiCl es un 10 % en masa, la solubilidad es estable en

10 temperaturas prácticas que varían de 25 a 100 ºC cuando la concentración de proteína es un 40 % en masa o inferior.

(Ejemplo 2)

15 (1) Solución de Hilado (Solución de Fluido de Hilado)

La proteína usada en el Ejemplo 1 se usó para producir una solución de hilado (solución de fluido de hilado). En primer lugar, un polvo liofilizado (proteína) se añadió a DMSO (100 ºC) que contenía un 10 % en masa de LiCl de modo que la concentración del polvo liofilizado se convirtió en un 20 % en masa. Después de 6 horas de disolución

20 usando un aparato de rotación, los polvos y las burbujas se eliminaron. La viscosidad de la solución de proteína era de 1 Pa.s (Pascales por segundo). Por lo tanto, la solución de hilado (solución de fluido de hilado) se preparó.

(2) Procesos de Hilado -Estiramiento

25 El método que se muestra en la FIG. 2A se adoptó como los procesos de hilado y estiramiento. La solución de hilado se cargó en un cilindro y se extruyó desde una boquilla 0,3 mm de diámetro a una velocidad de 2,0 ml/h usando una bomba de jeringa, y a partir de ese momento el disolvente se extrajo en un 100 % en masa de líquido de coagulación de metanol, para producir un hilo no estirado. La longitud del baño de líquido de coagulación era 250 mm, y la velocidad de entrada era 2,1 m/min. A continuación, como estiramiento, el hilo no estirado se estiró hasta 4,5 veces

30 en agua caliente a 50 ºC. La velocidad de entrada era 9,35 m/min.

(3) Medición de Propiedades Físicas

El diámetro de la fibra se midió usando un microscopio óptico. 35

(a) Ensayo de tracción

La resistencia, el módulo elástico inicial (obtenido basándose en la medición de inclinaciones de 20 puntos: las inclinaciones se midieron a 20 puntos con un intervalo de 50 mseg y la inclinación máxima se definió como el módulo

15

elástico inicial), y la elongación de la fibra se midió usando un probador de tracción (probador de tablero pequeño EZ-S fabricado por Shimadzu Corporation) a una temperatura ambiente de 25 ºC y una humedad relativa de un 60 %, y se calculó la dureza. La muestra se unió a un molde de cartón, la distancia entre las pinzas era de 20 mm, y la velocidad de tracción era de 10 mm/min. La capacidad de la celda de carga era 1 N, y la pieza era de tipo clip. El valor de medido fue un promedio de cinco muestras (n = 5). La fórmula para calcular la dureza fue la que sigue a continuación:

imagen13

10 en la que

E Energía de fractura (unidad: J) r Radio de la fibra (unidad: mm) π Pi

15 L Distancia entre pinzas en la medición del ensayo de tracción.

La Tabla 4 resume diversas propiedades físicas de las fibras. Además, la FIG. 5 muestra la curva de tensióndesplazamiento (deformación) de la fibra obtenida.

20 (Ejemplo 3)

La solución de hilado idéntica a la del Ejemplo 2 se cargó en un cilindro y se extruyó desde una boquilla 0,3 mm de diámetro a una velocidad de 1,4 ml/h usando una bomba de jeringa, y a partir de ese momento el disolvente se extrajo en un 100 % en masa de líquido de coagulación de metanol, para producir un hilo no estirado. La longitud del

25 baño de líquido de coagulación era 250 mm, y la velocidad de entrada era 2,2 m/min. A continuación, como estiramiento, el hilo no estirado se estiró hasta 3,5 veces en agua caliente a 50 ºC. La velocidad de entrada era 7,7 m/min. A partir de ese momento, el hilo se estiró hasta a 1,25 veces mediante estiramiento con calor seco a 160 ºC. El método que se muestra en las FIGS. 2A y 2B se adoptó como los procesos de hilado y estiramiento.

30 Se midieron diversas propiedades físicas de la fibra obtenida como se ha descrito anteriormente, y la Tabla 4 resume los resultados. La FIG. 6 muestra la curva de tensión-desplazamiento (deformación) de la fibra obtenida.

[Tabla 4]

Fuerza máxima del ensayo puntual (mN): Tensión puntual máxima (MPa) Módulo elástico inicial (GPa) Desplazamiento en el punto de ruptura (%) Diámetro (mm) Rugosidad (MJ/m3)

Ej. 2: 70,5 213,7 6,2 35,2 0,0205 59,1

Ej. 3: 119,1 313,3 9,4 19,9 0,0220 52,6

35 (Ejemplo 4)

La solución de hilado se produjo de la misma manera que en el Ejemplo 2 excepto porque la concentración de proteína era de un 7 % en masa y solamente se usó DMSO como disolvente. Se usó el dispositivo de hilado que se muestra en las FIGS. 2A-2B. Las siguientes son condiciones respectivas del hilado en estado húmedo.

40

(1) Procesos de Extrusión -Coagulación

Diámetro de la boquilla de extrusión: 0,3 mm Velocidad de extrusión: 3,0 ml/h 45 Temperatura del líquido de coagulación en el baño: 10 ºC

(2) Primera etapa del estiramiento

La primera etapa del estiramiento se realizó en agua caliente a 50 ºC, a una proporción de estiramiento de 2,5 50 veces y una velocidad de entrada de 5,5 m/min (55 rpm) durante 3,5 minutos.

16

imagen14

imagen15

5

15

25

35

45

55

65

(IV) El precipitado, a partir del que se había eliminado el sobrenadante, se disolvió con DMSO (que contiene LiCl 2 M) a 80 ºC, se agitó con un agitador, se centrifugó (11.000 x g, 10 minutos, temperatura ambiente) con la centrifugadora descrita anteriormente fabricada por TOMY SEIKO Co., Ltd., y el sobrenadante obtenido se dializó con agua usando un tubo de diálisis (tubo de celulosa 36/32 fabricado por Sanko Junyaku Co., Ltd.). La proteína agregada (color blanco) obtenida después de la diálisis se recogió por centrifugación, y el agua se eliminó con un aparato de liofilización, para recoger el polvo liofilizado. El grado de purificación de la proteína diana MaSp2_N (aproximadamente 31,7 kDa) en el polvo liofilizado obtenido se comprobó analizando imágenes de los resultados de electroforesis en gel de poliacrilamida (tinción con Oriole) de dicho polvo de proteína usando ImageLab (Bio-RAD Laboratories, Inc.). Como resultado, el grado de purificación de MaSp2_N era aproximadamente un 68,1 %.

(2): Solución de Hilado (Solución de fluido de Hilado)

La solución de hilado se produjo usando la proteína MaSp2_N obtenida anteriormente. El polvo liofilizado se añadió dio a DMSO que se había calentado a 40 ºC de modo que la concentración del polvo liofilizado se convirtió en un 18 % en masa. Después de 6 horas de disolución usando un aparato de rotación, los polvos y las burbujas se eliminaron. La viscosidad de la solución de proteína fue 1 Pa.s (Pascales por segundo). Esta se usó como la solución de hilado.

(3): Procesos de Hilado -Estiramiento

El hilado en estado húmedo se realizó usando la solución de hilado obtenida anteriormente. El dispositivo de hilado que se muestra en la FIG. 4A se usó para los procesos de extrusión -coagulación. Las siguientes son condiciones respectivas del hilado en estado húmedo.

(I): Procesos de Extrusión -Coagulación Diámetro de la boquilla de extrusión: 0,2 mm Velocidad de extrusión: 2,0 ml/h Temperatura del líquido de coagulación en el baño: 10 ºC Velocidad de entrada: 2,5 m/min

(II): Primera etapa del estiramiento La primera etapa del estiramiento se realizó en agua caliente a 50 ºC, a una proporción de estiramiento de 2,5 veces.

(III) Segunda etapa del estiramiento La segunda etapa del estiramiento se realizó en un horno de calor seco a 80 ºC, a una proporción de estiramiento de 1,85 veces.

(IV) Propiedades físicas del hilo estirado obtenido Las propiedades físicas del hilo estirado obtenido se midieron como se ha descrito anteriormente. Como resultado, el diámetro medio de la fibra individual fue 35 µm, la tensión puntual máxima fue 236,7 MPa, el módulo elástico inicial fue 5,7 GPa, el desplazamiento en el punto de ruptura (elongación) fue un 14,9 %, y la dureza fue 26,5 MJ/m3. La FIG. 10 muestra la curva de tensión-desplazamiento (deformación) de la fibra individual de las fibras obtenidas.

(Ejemplo 8)

(1) Proteína Usada

(I): Aproximadamente 4,5 g de células bacterianas de la Escherichia coli que expresa la proteína Flag_92_short2 protein y 30 ml de una solución tampón AI (Tris-HCI 20 mM, pH 7,4) se añadieron a un tubo de centrifugadora (50 ml). Después de dispersar las células bacterianas con una mezcladora ("SI-0286" fabricada por GE, nivel 10), la dispersión se centrifugó (10.000 rpm, 10 minutos, temperatura ambiente) con una centrifugadora ("MX-305" fabricada por TOMY SEIKO Co., Ltd.), y un sobrenadante se descartó.

(II): A un precipitado (células bacterianas) obtenido por la centrifugación, se añadieron 30 ml de la solución tampón AI y 0,3 ml de PMSF 0,1 M (disuelto con isopropanol). Después de dispersar el precipitado durante 3 minutos con la mezcladora descrita anteriormente (nivel 10) fabricada por GE, las células bacterianas se interrumpieron usando un aparato de interrupción con ultrasonidos ("VCX500" fabricado por Sonics & Materials, Inc.). La interrupción con ultrasonidos se realizó repitiendo un procesamiento de 20 segundos y una pausa de 5 segundos durante 8 minutos en total.

(III) Las células bacterianas después de la interrupción con ultrasonidos se centrifugaron (11.000 x g, 30 minutos, temperatura ambiente) con una centrifugadora ("MX-305" fabricada por TOMY SEIKO Co., Ltd.).

(IV) A un sobrenadante (fracción de proteína soluble) obtenido con la centrifugación, se añadió Ni sepharose (suspensión de un 50 %, fabricada por GE Healthcare Japan Corporation, número de producto "17-5318-02"). Después de dispersar la mezcla durante 3 minutos con una mezcladora ("T18 basic ULTRA TURRAX" fabricada por IKA, nivel 2), la dispersión se agitó durante 60 minutos con un agitador. A partir de ese momento, la dispersión agitada se centrifugó (500 x g, 5 minutos, temperatura ambiente) con la centrifugadora descrita anteriormente fabricada por TOMY SEIKO Co., Ltd., y un sobrenadante se retiró. El Ni sepharose se cargó en una columna vacía (fabricada por GE Healthcare Japan Corporation, número de producto "17-0435-01") y se lavó

19

imagen16

imagen17

Claims

imagen1