ES2654909T3 - Método para detectar ARNm del virus del papiloma humano - Google Patents

Abstract

Un método in vitro de cribado de sujetos humanos para evaluar su riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino, método que comprende el cribado del sujeto para determinar la expresión de transcritos de ARNm de longitud completa del gen E6 de VPH y la clasificación del sujeto en una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino sobre la base de la expresión de dicho ARNm de E6, en el que los individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 se califican como portadores de VPH integrado o de un genoma de VPH episómico modificado y, por tanto, se clasifican como de alto riesgo para el desarrollo de carcinoma de cuello uterino, mientras que los individuos negativos para la expresión de ARNm de E6 se califican como no portadores de VPH integrado un genoma de VPH episómico modificado y, por tanto, se clasifican como sin riesgo detectable para el desarrollo de carcinoma de cuello uterino.

Description

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que los individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 se identifican como portadores de cambios celulares anormales en el cuello uterino.

La expresión "cambios celulares anormales en el cuello uterino", incluye cambios celulares que son característicos de una enfermedad más grave que las lesiones de cuello uterino de grado bajo o que las lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo; incluye cambios celulares que son característicos de enfermedades de igual o mayor gravedad que la CIN de alto grado (definida como una expansión neoplásica de células transformadas), CIN (neoplasia intraepitelial de cuello uterino, por sus siglas en inglés) III o neoplasia intraepitelial escamosa de alto grado (HSIL, por sus siglas en inglés), incluyendo lesiones con un perfil de ADN multiploide y lesiones CIN "malignas" con valores incrementados del índice medio de ADN, un elevado porcentaje de aneuploidia de ADN y tasas que exceden 2,5c (Hanselaar y col., 1992, Anal. Cell. Pathol., 4: 315-324; Rihet y col., 1996, J. Clin. Pathol.,

49: 892-896; y McDermott y col., 1997, Br. J. Obstet. Gynaecol., 104: 623-625).

La Neoplasia Intraepitelial de cuello uterino (abreviada "CIN" por sus siglas en inglés), denominada también Displasia de cuello uterino, es una afección del de cuello uterino causada por el Virus del Papiloma Humano. La CIN es clasificada como I, II o III dependiendo de su gravedad. Se considera una anormalidad precancerosa, pero no un cáncer real. La forma más leve, CIN I, remite normalmente por sí misma, aunque raramente puede progresar a cáncer. Las formas más graves, CIN II y CIN III, muy a menudo permanecen igual o empeoran con el tiempo. Pueden convertirse en cáncer, pero casi nunca lo hacen si se tratan adecuadamente.

Se ha identificado al VPH como un agente causante del desarrollo de cambios celulares en el cuello uterino, que pueden dar lugar al desarrollo de cáncer de cuello uterino. Estos cambios celulares se asocian a la expresión constitutiva o persistente de las proteínas E6/E7 del genoma vírico de VPH. Por tanto, es posible concluir que aquellos sujetos en los que puede detectarse la expresión de ARNm de E6, particularmente aquellos sujetos que presentan una expresión de E6 persistente cuando se determina a lo largo de un periodo de tiempo, manifiestan ya cambios celulares en el cuello uterino. Estos cambios celulares pueden tener lugar solamente en unas pocas células del cuello uterino y pueden no ser detectables mediante citología convencional. No obstante, con la utilización de métodos sensibles, específicos y precisos para la detección de ARNm de E6, es posible identificar a aquellos sujetos que presentan ya cambios celulares en el cuello uterino en un estado mucho más temprano del que sería posible utilizando el cribado citológico convencional. Esto permitirá una intervención más temprana con tratamientos encaminados a prevenir el desarrollo de carcinoma de cuello uterino.

Como resultado de la integración de VPH en el genoma o como resultado de la "modificación" en un genoma de VPH episómico modificado, se pierde el control normal de la transcripción de los oncogenes E6/E7 víricos (Durst y col., 1985, J. Gen. Virol., 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater y Pater, 1985, Virology, 145: 313-318; Schwarz y col., 1985, Nature, 314: 111-114; Park y col., 1997, ídem). Por el contrario, en lesiones premalignas y en epitelio normal infectado con VPH, los virus del papiloma predominan en formas episómicas "sin modificar" y por tanto la transcripción del oncogén puede estar ausente o estar regulada negativamente eficazmente (Johnson y col., 1990, J. Gen. Virol., 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli y col., 1993, J. Med. Virol., 40: 261-265). Se ha observado que la integración de ADN del virus del papiloma humano de tipo 16 en el genoma humano da lugar a una actividad celular/genoma más inestable, y a una estabilidad incrementada de los ARNm de E6 y E7 (Jeon y Lambert, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1654-1658). Por tanto, la integración del VPH, encontrada normalmente en cánceres de cuello uterino pero encontrada solamente de manera poco frecuente en lesiones CIN (Carmody y col., 1996, Mol. Cell. Probes, 10: 107-116), parece ser un acontecimiento importante en la carcinogénesis de cuello uterino.

El presente método detecta la expresión de ARNm vírico de E6/E7 en el cuello uterino en lugar de ADN. La expresión vírica de E6/E7 en células de cuello uterino es una determinación del riesgo de desarrollar cáncer mucho más precisa que demostrar simplemente que el virus VPH está presente. Además, la detección de transcritos de oncogenes del VPH puede ser un indicador más sensible de la implicación directa de oncogenes víricos en la carcinogénesis (Rose y col., 1994, Gynecol. Oncol., 52: 212-217; Rose y col., 1995, Gynecol. Oncol., 56: 239-244). La detección de transcritos de E6/E7 por amplificación y detección es una herramienta de diagnóstico útil para las evaluaciones del riesgo relacionado con el desarrollo de CIN y su progresión a cáncer de cuello uterino, especialmente en las pacientes infectadas por tipos de VPH de alto riesgo con ASCUS y CIN I (Sotlar y col., 1998, Gynecol. Oncol., 69: 114-121; Selinka y col., 1998, Lab. Invest., 78: 9-18).

La expresión de transcritos de E6/E7 de VPH 16/18 está correlacionada uniformemente con el estatus físico de los ADNs del VPH (Park y col., 1997, Gynecol. Oncol., Vol. 65(1), 121-9). En la mayoría de las células de carcinoma de cuello uterino, los genes E6 y E7 de virus del papiloma humano específicos son transcritos a partir de secuencias víricas integradas en los cromosomas de las células hospedadoras (von Kleben Doeberitz y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88(4), 1411-5). La carga y la integración víricas se han evaluado en una serie grande de lesiones CIN (Pietsaro y col., 2002, J. Clin. Microbiol., Vol. 40(3), 886-91). Solamente una muestra contenía exclusivamente ADN de VPH 16 episómico, y esta lesión experimentó un retroceso espontáneamente. Se identificaron previamente 17 de 37 muestras de carcinoma de cuello uterino invasivo como contenedoras del genoma de VPH 16 completamente integrado mediante la utilización de una PCR que cubría el gen E1/E2 completo, y esto se confrmó mediante rliPCR en 16 casos. Un caso, sin embargo, mostró un bajo nivel de ácido desoxirribonucleico episómico además de la forma integrada predominante. De las 20 muestras de carcinoma

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de más de 50 copias del ARNm relevante (por ml de muestra o por volumen total de muestra), mientras que una determinación de la "expresión negativa" puede requerir la presencia de menos de 1 copia del ARNm relevante (por ml de muestra o por volumen total de muestra).

Los métodos de la invención preferentemente implicarán la selección por ARNm de E6 utilizando una técnica que sea capaz de detectar específicamente ARNm de E6 de tipos de VPH asociados al cáncer, más preferentemente de tipos de VPH asociados al cáncer de "alto riesgo". En la realización más preferida los métodos implican la selección por ARNm de E6 utilizando una técnica que sea capaz de detectar ARNm de E6 de los tipos de VPH 16, 18, 31 y 33, y preferentemente también 45. Más preferentemente, el método detectará específicamente la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, y preferentemente también el 45, y mucho más preferentemente los cinco tipos. Sin embargo, las mujeres positivas para la expresión de E6 de otros tipos distintos de 16, 18, 31, 33 y 45, por ejemplo, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 y 68 pueden tener aún "riesgo" de desarrollar carcinoma de cuello uterino. Por tanto, el método puede abarcar la selección de la expresión de ARNm de E6 de uno

o más de estos tipos de VPH, muy preferentemente además de la selección por ARNm de E6 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33 y 45. Ciertos tipos de VPH presentan una notable distribución geográfica/poblacional. Por tanto, puede ser apropiado incluir cebadores específicos para un tipo de VPH conocido como prevalente en el área poblacional/geográfica sometida a ensayo, por ejemplo, además de la selección de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33 y

45.

Para evitar dudas, a menos que se indique de otro modo, la expresión "ARNm de E6", según se utiliza en el presente documento, incluye todos los transcritos de ARNm existentes de manera natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo las variantes por corte y empalme que tienen lugar de forma natural, e incluye por tanto transcritos que contienen adicionalmente todo o parte del marco de lectura abierto de E7 (y además marcos de lectura abiertos adicionales). Las expresiones "ARNm de E6/E7", "transcritos de E6/E7", etc., se utilizan indistintamente con las expresiones "ARNm de E6", "transcritos de E6" e incluyen también los transcritos de ARNm existentes de manera natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo las variantes por corte y empalme existentes de forma natural, y transcritos que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7. La expresión "expresión de oncogenes", a menos que se indique de otro modo, se refiere también a transcritos de ARNm existentes de forma natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo variantes de corte y empalme que tienen lugar de forma natural, y transcritos que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7.

Se han descrito hasta ahora cuatro especies de ARNm de E6/E7 en células infectadas con VPH 16, a saber, un transcrito de E6 no cortado y empalmado y tres transcritos cortados y empalmados denominados E6*I, E6*II y E6*III (Smotkin, D. y col., J. Virol., Marzo 1989, 63(3): 1441-7; Smotkin, D., Wettstein, F.O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Julio 1986, 83(13): 4680-4; Doorbar, J. y col., Virology, Septiembre 1990, 178(1): 254-62; Cornelissen, M.T. y col., J. Gen. Virology, Mayo 1990, 71 (Pt 5): 1243-6; Johnson, M.A. y col., J. Gen. Virol., Julio 1990, 71 (Pt 7): 1473-9; Schneider-Maunoury, S. y col., J. Virol., Octubre 1987, 61(10): 3295-8; Sherman, L. y col., Int. J. Cancer, Febrero 1992, 50(3): 356-64). Los cuatro transcritos se transcriben a partir de un único promotor (p97) situado justo corriente arriba del segundo ATG del ORF de E6.

En una realización, los métodos pueden comprender la selección por transcritos de E6 que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7. Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando cebadores o sondas específicos para la región codificadora de E7.

En una realización adicional, los métodos pueden comprender la selección por la presencia de transcritos de E6 de "longitud completa". En el caso de VPH 16, la expresión "transcritos de E6 de longitud completa" se refiere a transcritos que contienen toda la región desde el nucleótido (nt) 97 al nt 880 del ORF de E6, los nt 97 y 880 inclusive. Las posiciones de los nucleótidos están numeradas de acuerdo con la nomenclatura convencional del VPH (véase Human Papillomavirus Compendium OnLine, disponible en internet o en forma impresa en la base de datos de HV, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545, EE.UU.). La detección específica de transcritos de longitud completa puede realizarse, por ejemplo, utilizando cebadores o sondas que sean específicos para la región que está presente únicamente en los transcritos de E6 de longitud completa, y no en las variantes por corte y empalme. Tipos diferentes de VPH presentan patrones diferentes de expresión del ARNm de E6/E7. Los mapas de transcritos para varios tipos de VPH, incluyendo los tipos de VPH 16 y 31, que pueden utilizarse para facilitar el diseño de sondas o cebadores para la detección de transcritos de E6/E7, están disponibles públicamente a través del Human Papillomavirus Compendium (igual que anteriormente).

En el presente documento se describen cebadores oligonucleotídicos de E6 que son adecuados para su uso en la amplificación de regiones del ARNm de E6 de varios tipos de VPH mediante NASBA o PCR.

Los métodos que implican la selección por la expresión de ARNm de L1 pueden comprender la selección por la expresión del ARNm de L1 utilizando una técnica que sea capaz de detectar ARNm de L1 de sustancialmente todos los tipos conocidos de VPH o de al menos los tipos de VPH asociados al cáncer principales (por ejemplo, preferentemente todos los tipos de VPH 16, 18, 31 y 33). En el presente documento se describen cebadores y sondas de L1 que son capaces de detectar ARNm de L1 de los tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 y 51 en

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Los cebadores y las sondas incluidos en el kit son preferentemente moléculas de ADN de cadena sencilla. Pueden utilizarse también polinucleótidos sintéticos no naturales que conserven la capacidad de apareamiento de bases con una molécula de ácido nucleico complementaria, incluyendo oligonucleótidos sintéticos que incorporen bases modificadas y oligonucleótidos sintéticos en los que los enlaces entre los nucleósidos individuales incluyan enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster. Los cebadores y las sondas pueden producirse de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica, tal como mediante síntesis química utilizando aparatos y protocolos convencionales para la síntesis de oligonucleótidos.

Los cebadores y las sondas serán normalmente polinucleótidos monocatenarios aislados de no más de 100 bases de longitud, más normalmente de menos de 55 bases de longitud. Para evitar dudas, se manifiesta en el presente documento que los términos "cebador" y "sonda" excluyen genomas de VPH de longitud completa existentes de forma natural.

Pueden incluirse en el kit varios tipos generales de cebadores y sondas oligonucleotídicos que incorporen secuencias específicas del VPH. Normalmente, dichos cebadores y sondas pueden contener secuencias adicionales que no sean del VPH, por ejemplo, secuencias que se requieran para una reacción de amplificación o que faciliten la detección de los productos de la reacción de amplificación.

El primer tipo de cebadores son los oligonucleótidos cebadores 1 (denominados también en el presente documento cebadores P1 del NASBA), que son oligonucleótidos de generalmente 50 bases de longitud aproximadamente, que contienen una media de 20 bases aproximadamente en el extremo 3' y que son complementarios a una región del ARNm diana. Los oligonucleótidos adecuados para su uso como cebadores P1 del NASBA se denominan "P1/PCR" en la Tabla 1. Los oligonucleótidos cebadores P1 tienen la estructura general X1-SEQ, en la cual SEQ representa una secuencia específica para VPH y X1 es una secuencia que contiene un promotor que es reconocido por una ARN polimerasa específica. Se prefiere la utilización en los oligonucleótidos de promotores de bacteriófagos, por ejemplo, los promotores de T7, T3 y SP6, ya que proporcionan las ventajas de un elevado nivel de transcripción que depende únicamente de la unión de la ARN polimerasa apropiada. La secuencia "X1" puede comprender la secuencia AATTCTAATACGACTCACTATAGGG o la secuencia AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG. Estas secuencias contienen un promotor de T7, que incluye el sitio de inicio de la transcripción para la ARN polimerasa de T7. Las secuencias específicas para VPH en los cebadores denominados en la Tabla 1 como "P1/PCR" también pueden adaptarse para su uso en cebadores convencionales de PCR. Cuando estas secuencias se utilizan como la base de los cebadores P1 del NASBA, tienen la estructura general X1-SEQ, según se ha definido anteriormente. La secuencia del promotor X1 es esencial en un cebador P1 del NASBA. Sin embargo, cuando se utilizan las mismas secuencias como la base de cebadores de PCR convencionales, no es necesario incluir X1.

Un segundo tipo de cebadores son los oligonucleótidos cebadores 2 del NASBA (denominados también en el presente documento cebadores P2 del NASBA) que contienen generalmente una secuencia de 20 bases aproximadamente sustancialmente idéntica a una región del ARNm diana. Las secuencias oligonucleotídicas denominadas en la Tabla 1 "P2/PCR" son adecuadas para su uso en cebadores P2 del NASBA y en cebadores convencionales para PCR.

Los oligonucleótidos destinados para su uso como cebadores P2 del NASBA pueden contener, además, una secuencia de nucleótidos en el extremo 5' que no esté relacionada con el ARNm diana pero que sea capaz de hibridarse con una sonda de detección genérica. La sonda de detección estará preferentemente marcada con, por ejemplo, un marcador fluorescente, luminiscente o enzimático. La sonda de detección puede marcarse con un marcador que permita la detección utilizando la tecnología ECL™, aunque se apreciará que la invención no se limita de ninguna manera a este método de detección particular. El extremo 5' de los oligonucleótidos cebadores 2 puede contener la secuencia GATGCAAGGTCGCATATGAG. Esta secuencia es capaz de hibridar con una sonda genérica ECL™ disponible en el mercado en Organon Teknika que tiene la estructura siguiente:

Ru(bpy)32+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3'

En un ejemplo diferente, el oligonucleótido cebador 2 puede incorporar la tecnología de "sondas moleculares fluorescentes" ("balizas"), que es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en el documento WO 95/13399 por Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology, 14: 303-308, 1996, para permitir el control en tiempo real de la reacción del NASBA.

También pueden incluirse en el kit oligonucleótidos sonda específicos de la diana. Los oligonucleótidos sonda contienen generalmente una secuencia de 20-25 bases aproximadamente sustancialmente idéntica a una región del ARNm diana, o al complemento de la misma. Ejemplos de secuencias oligonucleotídicas específicas para el VPH que son adecuadas para su uso como sondas se designan como "PO" en la Tabla 1. Los oligonucleótidos sonda pueden utilizarse como sondas de hibridación específicas de la diana para la detección de los productos de una reacción de NASBA o PCR. A este respecto, los oligonucleótidos sonda pueden acoplarse a un soporte sólido, tal como esferas paramagnéticas, para formar una sonda de captura (véase más adelante). El extremo 5' del oligonucleótido sonda puede estar marcado con biotina. La adición de una marca de biotina facilita la unión de la sonda a un soporte sólido a través de un enlace biotina/estreptavidina o biotina/avidina.

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Las sondas específicas de la diana que permiten la detección en tiempo real de los productos de amplificación pueden incorporar la tecnología de las "sondas moleculares fluorescentes" ("balizas") que es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, por Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology, 14: 303-308, 1996 y en el documento WO 95/13399. Ejemplos de secuencias oligonucleotídicas específicas para el VPH adecuadas para su uso como sondas moleculares fluorescentes se denotan "MB" en la Tabla 1.

La expresión "sondas moleculares fluorescentes" ("balizas"), como se utiliza en el presente documento, quiere indicar moléculas que tienen la estructura:

X2-brazo1-diana-brazo2-X3

en la que "diana" representa una secuencia de nucleótidos específica de la diana, "X2" y "X3" representan un resto fluorescente y un resto inactivador capaz de inactivar sustancialmente o completamente la fluorescencia procedente del resto fluorescente cuando los dos se mantienen juntos en una estrecha proximidad y "brazo1" y "brazo2" representan secuencias complementarias capaces de formar un dúplex troncal.

Las combinaciones preferidas de las secuencias "brazo1" y "brazo2" son como se indica a continuación, aunque éstas tienen la intención de ser ilustrativas más que limitantes de la invención:

cgcatg-SEQ-catgcg ccagct-SEQ-agctgg cacgc-SEQ-gcgtg cgatcg-SEQ-cgatcg ccgtcg-SEQ-cgacgg cggacc-SEQ-ggtccg ccgaagg-SEQ-ccttcgg cacgtcg-SEQ-cgacgtg cgcagc-SEQ-gctgcg ccaagc-SEQ-gcttgg ccaagcg-SEQ-cgcttgg cccagc-SEQ-gctggg ccaaagc-SEQ-gctttgg cctgc-SEQ-gcagg ccaccc-SEQ-gggtgg ccaagcc-SEQ-ggcttgg ccagcg-SEQ-cgctgg cgcatg-SEQ-catgcg

La utilización de la tecnología de sondas moleculares fluorescentes ("balizas") permite el control en tiempo real de las reacciones de amplificación, por ejemplo, la amplificación mediante NASBA (véase Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, págs. 2150-2155). Las sondas moleculares fluorescentes ("balizas") incluyen generalmente secuencias complementarias que flanquean a la secuencia específica para el VPH, representadas en el presente documento por la notación brazo1 y brazo2, que son capaces de hibridarse entre sí para formar una estructura de dúplex troncal. Las secuencias exactas del brazo1 y el brazo2 no son material de la invención, excepto por el requisito de que estas secuencias deben ser capaces de formar un dúplex troncal cuando la sonda no está unida a una secuencia del VPH diana.

Las sondas moleculares fluorescentes ("balizas") incluyen también un resto fluorescente y un resto inactivador, estando representados en el presente documento los restos fluorescente e inactivador por la notación X2 y X3. Como apreciará el lector experto, los restos fluorescente e inactivador se seleccionan de manera que el resto inactivador sea capaz de inactivar sustancialmente o completamente la fluorescencia procedente del resto fluorescente cuando los dos restos estén muy próximos, por ejemplo, cuando la sonda esté en la conformación "cerrada" de horquilla en ausencia de la secuencia diana. Después de la unión a la secuencia diana, los restos fluorescente e inactivador se mantienen separados, de manera que la fluorescencia procedente del resto fluorescente ya no resulta inactivada.

Muchos ejemplos de pares de restos inactivador/fluorescente adecuados que pueden utilizarse de acuerdo con la invención son conocidos en la técnica (véase el documento WO 95/13399, Tyagi y Kramer, ídem). Puede utilizarse una amplia gama de fluoróforos de muchos colores diferentes, incluyendo por ejemplo, el ácido 5-(2'aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), fluoresceína, FAM y Rojo Texas (véase Tyagi, Bratu y Kramer, 1998, Nature Biotechnology, 16, 49-53). La utilización de sondas marcadas con diferentes fluoróforos coloreados permite la detección "simultánea" de dos o más sondas diferentes en un único recipiente de reacción. Un inactivador preferido es el ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), un cromóforo no fluorescente, que sirve como inactivador "universal" para una amplia gama de fluoróforos. Los restos fluorescente e inactivador pueden estar unidos covalentemente a la sonda en cualquier orientación, ya sea con el fluorescente en o cerca del extremo 5' y el inactivador en o cerca del extremo 3', o viceversa. Se conocen en la técnica protocolos para la síntesis de sondas moleculares fluorescentes ("balizas"). Un protocolo detallado para la síntesis se proporciona en una publicación

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SEC ID

Tipo de cebador/sonda Secuencia Tipo de VPH nt

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PO ACAGTTATGCACAGAGCT 16 142

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PO ATATTAGAATGTGTGTAC 16 182

16

PO TTAGAATGTGTGTACTGC 16 185

17

PO GAATGTGTGTACTGCAAG 16 188

18

PO CTTTGCTTTTCGGGATTTATGC 16 235

19

PO TATGACTTTGCTTTTCGGGA 16 230

20

MB X2-brazo1-TATGACTTTGCTTTTCGGGA-brazo2-X3 16 230

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P2/PCR CAGAGGAGGAGGATGAAATAGTA 16 656

22

P1/PCR X1-GCACAACCGAAGCGTAGAGTCACAC 16 741

23

PO TGGACAAGCAGAACCGGACAGAGC 16 687

24

P2/PCR CAGAGGAGGAGGATGAAATAGA 16 656

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P1/PCR X1-GCACAACCGAAGCGTAGAGTCA 16 741

26

PO AGCAGAACCGGACAGAGCCCATTA 16 693

27

P2/PCR ACGATGAAATAGATGGAGTT 18 702

28

P1/PCR X1-CACGGACACACAAAGGACAG 18 869

29

PO AGCCGAACCACAACGTCACA 18 748

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P2/PCR GAAAACGATGAAATAGATGGAG 18 698

31

P1/PCR X1-ACACCACGGACACACAAAGGACAG 18 869

32

PO GAACCACAACGTCACACAATG 18 752

33

MB X2-brazo1-GAACCACAACGTCACACAATG-brazo2-X3 18 752

34

P2/PCR TTCCGGTTGACCTTCTATGT 18 651

35

P1/PCR X1-GGTCGTCTGCTGAGCTTTCT 18 817

36

P2/PCR GCAAGACATAGAAATAACCTG 18 179

37

P1/PCR X1-ACCCAGTGTTAGTTAGTT 18 379

38

PO TGCAAGACAGTATTGGAACT 18 207

39

P2/PCR GGAAATACCCTACGATGAAC 31 164

40

P1/PCR X1-GGACACAACGGTCTTTGACA 31 423

41

PO ATAGGGACGACACACCACACGGAG 31 268

42

P2/PCR GGAAATACCCTACGATGAACTA 31 164

43

P1/PCR X1-CTGGACACAACGGTCTTTGACA 31 423

44

PO TAGGGACGACACACCACACGGA 31 269

45

P2/PCR ACTGACCTCCACTGTTATGA 31 617

46

P1/PCR X1-TATCTACTTGTGTGCTCTGT 31 766

47

PO GACAAGCAGAACCGGACACATC 31 687

48

P2/PCR TGACCTCCACTGTTATGAGCAATT 31 619

49

P1/PCR X1-TGCGAATATCTACTTGTGTGCTCT GT 31 766

50

PO GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA 31 686

51

MB X2-brazo1-GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAbrazo2-X3 31 686

52

P2/PCR ACTGACCTCCACTGTTAT 31 617

53

P1/PCR X1-CACGATTCCAAATGAGCCCAT 31 809

54

P2/PCR TATCCTGAACCAACTGACCTAT 33 618

55

P1/PCR X1-TTGACACATAAACGAACTG 33 763

56

PO CAGATGGACAAGCACAACC 33 694

57

P2/PCR TCCTGAACCAACTGACCTAT 33 620

58

P1/PCR X1-CCCATAAGTAGTTGCTGTAT 33 807

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PO GGACAAGCACAACCAGCCACAGC 33 699

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MB X2-brazo1-GGACAAGCACAACCAGCCACAGCbrazo2-X3 33 699

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P2/PCR GACCTTTGTGTCCTCAAGAA 33 431

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P1/PCR X1-AGGTCAGTTGGTTCAGGATA 33 618

63

PO AGAAACTGCACTGTGACGTGT 33 543

64

P2/PCR ATTACAGCGGAGTGAGGTAT 35 217

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P1/PCR X1-GTCTTTGCTTTTCAACTGGA 35 442

66

PO ATAGAGAAGGCCAGCCATAT 35 270

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P2/PCR TCAGAGGAGGAGGAAGATACTA 35 655

68

P1/PCR X1-GATTATGCTCTCTGTGAACA 35 844

69

P2/PCR CCCGAGGCAACTGACCTATA 35 610

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P1/PCR X1-GTCAATGTGTGTGCTCTGTA 35 770

71

PO GACAAGCAAAACCAGACACCTCCAA 35 692

72

PO GACAAGCAAAACCAGACACC 35 692

SEC ID

Tipo de cebador/sonda Secuencia Tipo de VPH nt

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P2/PCR TTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT 52 144

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P1/PCR X1-CCCTCTCTTCTAATGTTT 52 358

75

PO GTGCCTACGCTTTTTATCTA 52 296

76

P2/PCR GTGCCTACGCTTTTTATCTA 52 296

77

P1/PCR X1-GGGGTCTCCAACACTCTGAACA 52 507

78

PO TGCAAACAAGCGATTTCA 52 461

79

P2/PCR TCAGGCGTTGGAGACATC 58 157

80

P1/PCR X1-AGCAATCGTAAGCACACT 58 301

81

P2/PCR TCTGTGCATGAAATCGAA 58 173

82

P1/PCR X1-AGCACACTTTACATACTG 58 291

83

PO TGAAATGCGTTGAATGCA 58 192

84

PO TTGCAGCGATCTGAGGTATATG 58 218

85

P2/PCR TACACTGCTGGACAACAT B (11) 514

86

P1/PCR X1-TCATCTTCTGAGCTGTCT B (11) 619

87

P2/PCR TACACTGCTGGACAACATGCA B (11) 514

88

P1/PCR X1-GTCACATCCACAGCAACAGGTCA B (11) 693

89

PO GTAGGGTTACATTGCTATGA B (11) 590

90

PO GTAGGGTTACATTGCTATGAGC B (11) 590

91

P2/PCR TGACCTGTTGCTGTGGATGTGA B (11) 693

92

P1/PCR X1-TACCTGAATCGTCCGCCAT B (11) 832

93

PO ATWGTGTGTCCCATCTGC B (11) 794

94

P2/PCR CATGCCATAAATGTATAGA C (18 39 45) 295

95

P1/PCR X1-CACCGCAGGCACCTTATTAA C (18 39 45) 408

96

PO AGAATTAGAGAATTAAGA C (18 39 45) 324

97

P2/PCR GCAGACGACCACTACAGCAAA 39 210

98

P1/PCR X1-ACACCGAGTCCGAGTAATA 39 344

99

PO ATAGGGACGGGGAACCACT 39 273

100

P2/PCR TATTACTCGGACTCGGTGT 39 344

101

P1/PCR X1-CTTGGGTTTCTCTTCGTGTTA 39 558

102

PO GGACCACAAAACGGGAGGAC 39 531

103

P2/PCR GAAATAGATGAACCCGACCA 39 703

104

P1/PCR X1-GCACACCACGGACACACAAA 39 886

105

PO TAGCCAGACGGGATGAACCACAGC 39 749

106

P2/PCR AACCATTGAACCCAGCAGAAA 45 430

107

P1/PCR X1-TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA 45 527

108

P2/PCR GTACCGAGGGCAGTGTAATA 45 500

109

P2/PCR AACCATTGAACCCAGCAGAAA 45 430

110

P1/PCR X1-TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA 45 527

111

P2/PCR GAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA 45 428

112

P1/PCR X1-TTGCTATACTTGTGTTTCCCTACG 45 558

113

PO GTACCGAGGGCAGTGTAATA 45 500

114

PO GGACAAACGAAGATTTCACA 45 467

115

P2/PCR GTTGACCTGTTGTGTTACCAGCAAT 45 656

116

P1/PCR X1-CACCACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

117

P2/PCR CTGTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 654

118

P1/PCR X1-CCACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

119

P2/PCR GTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 656

120

P1/PCR X1-ACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

121

PO GAGTCAGAGGAGGAAAACGATG 45 686

122

PO AGGAAAACGATGAAGCAGATGGAGT 45 696

123

PO ACAACTACCAGCCCGACGAGCCGAA 45 730

124

P2/PCR GGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 658

125

P1/PCR X1-GCCCATTAACATCTGCTGTA 51 807

126

P2/PCR AGAGGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 655

127

P1/PCR X1-ACGGGCAAACCAGGCTTAGT 51 829

128

PO GCAGGTGTTCAAGTGTAGTA 51 747

129

PO TGGCAGTGGAAAGCAGTGGAGACA 51 771

130

P2/PCR TTGGGGTGCTGGAGACAAACATCT 56 519

SEC ID

Tipo de cebador/sonda Secuencia Tipo de VPH nt

131

P1/PCR X1-TTCATCCTCATCCTCATCCTCTGA 56 665

132

P2/PCR TGGGGTGCTGGAGACAAACATC 56 520

133

P1/PCR X1-CATCCTCATCCTCATCCTCTGA 56 665

134

P2/PCR TTGGGGTGCTGGAGACAAACAT 56 519

135

P1/PCR X1-CCACAAACTTACACTCACAACA 56 764

136

PO AAAGTACCAACGCTGCAAGACGT 56 581

137

PO AGAACTAACACCTCAAACAGAAAT 56 610

138

PO AGTACCAACGCTGCAAGACGTT 56 583

139

P1/PCR X1-TTGGACAGCTCAGAGGATGAGG 56 656

140

P2/PCR GATTTTCCTTATGCAGTGTG 56 279

141

P1/PCR X1-GACATCTGTAGCACCTTATT 56 410

142

PO GACTATTCAGTGTATGGAGC 56 348

143

PO CAACTGAYCTMYACTGTTATGA A (16 31 35)

144

MB X2-brazo1-CAACTGAYCTMYACTGTTATGA-brazo2-X3 A (16 31 35)

145

PO GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTAT A (33 52 58)

146

MB X2-brazo1-GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATbrazo2-X3 A (33 52 58)

147

PO AAGACATTATTCAGACTC C (18 45 39

148

MB X2-brazo1-AAGACATTATTCAGACTC-brazo2-X3 C (18 45 39)

Tabla 2: Secuencias específicas de L1 para ser incluidas en los cebadores y sondas de NASBA/PCR

SEC ID

Tipo de cebador/sonda Secuencia

149

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGGGTAA

150

P1/PCR X1-TCATATTCCTCCCCATGTC

151

PO TTGTTACTGTTGTTGATACTAC

152

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGSRHAA

153

P1/PCR X1-TCATATTCCTCMMCATGDC

154

PO TTGTTACTGTTGTTGATACYAC

155

PO TTGTTACTGTTGTTGATACCAC

156

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGSIIAA

157

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGIIHAA

158

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGIRIAA

159

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGGGTAA

160

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGGGAAA

161

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGCATAA

162

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGGGCAA

163

P2/PCR AATGGCATTTGTTGGCACAA

164

P1/PCR X1-TCATATTCCTCMICATGIC

165

P1/PCR X1-TCATATTCCTCAACATGIC

166

P1/PCR X1-TCATATTCCTCIICATGTC

167

P1/PCR X1-TCATATTCCTCIICATGGC

168

P1/PCR X1-TCATATTCCTCIICATGAC 3'

169

P1/PCR X1-TCATATTCCTCIICATGCC 3'

Los cebadores preferidos adecuados para su uso en la detección del ARNm de L1 y E6 del VPH mediante NASBA 5 se enumeran en las tablas siguientes. Sin embargo, éstos son meramente ilustrativos y no se desea que el ámbito de la invención se limite a estas moléculas específicas.

En las tablas siguientes, los cebadores P2 del NASBA (p2) incluyen la secuencia GATGCAAGGTCGCATATGAG en el extremo 5'; los cebadores P1 del NASBA (p1) incluyen la secuencia

10 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG en el extremo 5'. Los oligonucleótidos adecuados para su uso como sondas se identifican por "po". Los cebadores P2 contienen generalmente secuencias del VPH procedentes de la cadena positiva, mientras que los cebadores p1 contienen generalmente secuencias del VPH procedentes de la cadena negativa. nt se refiere a la posición de los nucleótidos en la secuencia genómica del VPH relevante.

15

Tabla 3: Cebadores y sondas preferidos para el NASBA de E6

Nombre del cebador

Secuencia Tipo de VPH nt

HAe6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTA 16 116

HAe6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGGTTTGTTGTAT TGCTGTTC 16 368

HAe6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA 16 116

HAe6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTTTGTTGTATTG CTGTTC 16 368

HPV16p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGATTCCCATCTCTAT ATACTA 16 258

HAe6702Ap1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCACGTCGCAGTAA CTGT 16 208

HAe6702Bp1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGCTTGCAGTACA CACA 16 191

HAe6702Cp1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTGCAGTACACACAT TCTA 16 186

HAe6702Dp1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCAGTACACACATT CTAA 16 185

H16e6702Ap2

GATGCAAGGTCGCATATGAGACAGTTATGCACAGAGCT 16 142

H16e6702Bp2

GATGCAAGGTCGCATATGAGATATTAGAATGTGTGTAC 16 182

H16e6702Cp2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTTAGAATGTGTGTACTGC 16 185

H16e6702Dp2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGAATGTGTGTACTGCAAG 16 188

H16e6702Apo

ACAGTTATGCACAGAGCT 16 142

H16e6702Bpo

ATATTAGAATGTGTGTAC 16 182

H16e6702Cpo

TTAGAATGTGTGTACTGC 16 185

H16e6702Dpo

GAATGTGTGTACTGCAAG 16 188

HAe6701po

CTTTGCTTTTCGGGATTTATGC 16 235

HAe6702po

TATGACTTTGCTTTTCGGGA 16 230

HAe6701mb1

X2-cgcatgTATGACTTTGCTTTTCGGGAcatgcg-X3 16 230

HAe6701mb2

X2-ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg-X3 16 230

HAe6701mb3

X2-cacgcTATGACTTTGCTTTTCGGGAgcgtg-X3 16 230

HAe6701mb4

X2-cgatcgTATGACTTTGCTTTTCGGGAcgatcg-X3 16 230

HAe6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGAGGAGGAGGATGAAATAGTA 16 656

HAe6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACAACCGAAGC GTAGAGTCACAC 16 741

HAe6703po

TGGACAAGCAGAACCGGACAGAGC 16 687

HAe6704p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA 16 656

HAe6704p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACAACCGAAGC GTAGAGTCA 16 741

HAe6704po

AGCAGAACCGGACAGACCCCATTA 16 693

H18e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGACGATGAAATAGATGGAGTT 18 702

H18e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACGGACACACAAA GGACAG 18 869

H18e6701po

AGCCGAACCACAACGTCACA 18 748

H18e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAG 18 698

H18e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACACCACGGACAC ACAAAGGACAG 18 869

H18e6702po

GAACCACAACGTCACACAATG 18 752

H18e6702mb1

X2-cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcg-X3 18 752

H18e6702mb2

X2-ccgtcgGAACCACAACGTCACACAATGcgacgg-X3 18 752

H18e6702mb3

X2-cggaccGAACCACAACGTCACACAATGggtccg-X3 18 752

H18e6702mb4

X2-cgatcgGAACCACAACGTCACACAATGcgatcg-X3 18 752

H18e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTTCCGGTTGACCTTCTATGT 18 651

H18e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGA GCTTTCT 18 817

H18e6704p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGCAAGACATAGAAATAACCTG 18 179

H18e6704p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACCCAGTGTTAGTT AGTT 18 379

H18e6704po

TGCAAGACAGTATTGGAACT 18 207

H31e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGGAAATACCCTACGATGAAC 31 164

H31e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGACACAACGGTC TTTGACA 31 423

Nombre del cebador

Secuencia Tipo de VPH nt

H31e6701po

ATAGGGACGACACACCACACGGAG 31 268

H31e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGGAAATACCCTACGATGAACTA 31 164

H31e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTGGACACAACGG TCTTTGACA 31 423

H31e6702po

TAGGGACGACACACCACACGGA 31 269

H31e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTATGA 31 617

H31e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTG CTCTGT 31 766

H31e6703po

GACAAGCAGAACCGGACACATC 31 687

H31e6704p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTGACCTCCACTGTTATGAGCAATT 31 619

H31e6704p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTGCGAATATCTACT TGTGTGCTCT GT 31 766

H31e6704po

GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA 31 686

H31e6704mb1

X2-ccgaaggGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAccttcgg-X3 31 686

H31e6704mb2

X2-ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacgg-X3 31 686

H31e6704mb3

X2-cacgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacgtg-X3 31 686

H31e6704mb4

X2-cgcagcGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAgctgcg-X3 31 686

H31e6704mb5

X2-cgatcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgatcg-X3 31 686

H31e6705p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTAT 31 617

H31e6705p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACGATTCCAAATG AGCCCCAT 31 809

H33e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTAT 33 618

H33e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACG AACTG 33 763

H33e6701po

CAGATGGACAAGCACAACC 33 694

H33e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTCCTGAACCAACTGACCTAT 33 620

H33e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCATAAGTAGTTG CTGTAT 33 807

H33e6703po

GGACAAGCACAACCAGCCACAGC 33 699

H33e6703mb1

X2-ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg-X3 33 699

H33e6703mb2

X2-ccaagcgGGACAAGCACAACCAGCCACAGCcgcttgg-X3 33 699

H33e6703mb3

X2-cccagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgctggg-X3 33 699

H33e6703mb4

X2-ccaaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgctttgg-X3 33 699

H33e6703mb5

X2-cctgcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcagg-X3 33 699

H33e6703mb6

X2-cgatcgGGACAAGCACAACCAGCCACAGCcgatcg-X3 33 699

H33e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGACCTTTGTGTCCTCAAGAA 33 431

H33e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGGTCAGTTGGTTC AGGATA 33 618

H33e6702po

AGAAACTGCACTGTGACGTGT 33 543

H35e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGATTACAGCGGAGTGAGGTAT 35 217

H35e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCTTTGCTTTTCA ACTGGA 35 442

H35e5601po

ATAGAGAAGGCCAGCCATAT 35 270

H35e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTCAGAGGAGGAGGAAGATACTA 35 655

H35e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGATTATGCTCTCTG TGAACA 35 844

H35e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCCCGAGGCAACTGACCTATA 35 610

H35e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCAATGTGTGTGC TCTGTA 35 770

H35e6702po

GACAAGCAAAACCAGACACCTCCAA 35 692

H35e6703po

GACAAGCAAAACCAGACACC 35 692

H52e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT 52 144

H52e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCTCTCTTCTAAT GTTT 52 358

H52e6701po

GTGCCTACGCTTTTTATCTA 52 296

H52e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGTGCCTACGCTTTTTATCTA 52 296

H52e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGGGTCTCCAACA CTCTGAACA 52 507

H52e6702po

TGCAAACAAGCGATTTCA 52 461

H58e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTCAGGCGTTGGAGACATC 58 157

Nombre del cebador

Secuencia Tipo de VPH nt

H58e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCAATCGTAAGCA CACT 58 301

H58e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTCTGTGCATGAAATCGAA 58 173

H58e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCACACTTTACAT ACTG 58 291

H58e6701po

TGAAATGCGTTGAATGCA 58 192

H58e6702po

TTGCAGCGATCTGAGGTATATG 58 218

HBe6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTACACTGCTGGACAACAT B (11) 514

HBe6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATCTTCTGAGCT GTCT B (11) 619

HBe6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTACACTGCTGGACAACATGCA B (11) 514

HBe6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCACATCCACAGC AACAGGTCA B (11) 693

HBe6701po

GTAGGGTTACATTGCTATGA B (11) 590

HBe6702po

GTAGGGTTACATTGCTATGAGC B (11) 590

HBe6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTGACCTGTTGCTGTGGATGTGA B (11) 693

HBe6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTACCTGAATCGTCC GCCAT B (11) 832

HBe6703po

ATWGTGTGTCCCATCTGC B (11) 794

HCe6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCATGCCATAAATGTATAGA C (18 39 45) 295

HCe6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACCGCAGGCACC TTATTAA C (18 39 45) 408

HCe6701po

AGAATTAGAGAATTAAGA C (18 39 45) 324

H39e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGCAGACGACCACTACAGCAAA 39 210

H39e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACACCGAGTCCGA GTAATA 39 344

H39e6701po

ATAGGGACGGGGAACCACT 39 273

H39e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTATTACTCGGACTCGGTGT 39 344

H39e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTGGGTTTCTCTT CGTGTTA 39 558

H39e6702po

GGACCACAAAACGGGAGGAC 39 531

H39e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAATAGATGAACCCGACCA 39 703

H39e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACACCACGGAC ACACAAA 39 886

H39e6703po

TAGCCAGACGGGATGAACCACAGC 39 749

HPV45p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA 45 430

HPV45p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTG CCTGGTCA 45 527

HPV45po

GTACCGAGGGCAGTGTAATA 45 500

H45e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA 45 430

H45e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTG CCTGGTCA 45 527

H45e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA 45 428

H45e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGCTATACTTGTG TTTCCCTACG 45 558

H45e6701po

GTACCGAGGGCAGTGTAATA 45 500

H45e6702po

GGACAAACGAAGATTTCACA 45 467

H45e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGTTGACCTGTTGTGTTACCAGCAAT 45 656

H45e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACCACGGACACA CAAAGGACAAG 45 868

H45e6704p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGCTGTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 654

H45e6704p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCACGGACACACA AAGGACAAG 45 868

H45e6705p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 656

H45e6705p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGGACACACAAA GGACAAG 45 868

H45e6703po

GAGTCAGAGGAGGAAAACGATG 45 686

H45e6704po

AGGAAAACGATGAAGCAGATGGAGT 45 696

H45e6705po

ACAACTACCAGCCCGACGAGCCGAA 45 730

H51e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 658

Nombre del cebador

Secuencia Tipo de VPH nt

H51e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCCCATTAACATCT GCTGTA 51 807

H51e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGAGAGGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 655

H51e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGGGCAAACCAG GCTTAGT 51 829

H51e6701po

GCAGGTGTTCAAGTGTAGTA 51 747

H51e6702po

TGGCAGTGGAAAGCAGTGGAGACA 51 771

H56e6701p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGGGGTGCTGGAGACAAACATCT 56 519

H56e6701p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTCATCCTCATCCT CATCCTCTGA 56 665

H56e6702p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTGGGGTGCTGGAGACAAACATC 56 520

H56e6702p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCATCCTCATCCTCA TCCTCTGA 56 665

H56e6703p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGGGGTGCTGGAGACAAACAT 56 519

H56e6703p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCACAAACTTACAC TCACAACA 56 764

H56e6701po

AAAGTACCAACGCTGCAAGACGT 56 581

H56e6702po

AGAACTAACACCTCAAACAGAAAT 56 610

H56e6703po

AGTACCAACGCTGCAAGACGTT 56 583

H56e6703po1

TTGGACAGCTCAGAGGATGAGG 56 656

H56e6704p2

GATGCAAGGTCGCATATGAGGATTTTCCTTATGCAGTGTG 56 279

H56e6704p1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGACATCTGTAGCAC CTTATT 56 410

H56e6704po

GACTATTCAGTGTATGGAGC 56 348

HPVAPO1A

CAACTGAYCTMYACTGTTATGA A (16 31 35)

HPVApo1Amb1

X2-cgcatgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcatgcg-X3 A (16 31 35)

HPVApo1Amb2

X2-ccgtcgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcgacgg-X3 A (16 31 35)

HPVApo1Amb3

X2-ccacccCAACTGAYCTMYACTGTTATGAgggtgg-X3 A (16 31 35)

HPVApo1Amb4

X2-cgatcgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcgatcg-X3 A (16 31 35)

HPVAPO4A

GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTAT A (33 52 58)

HPVAPO4Amb1

X2-ccaagcGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATgcttgg-X3 A (33 52 58)

HPVAPO4Amb2

X2-ccaagccGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATggcttgg-X3 A (33 52 58)

HPVAPO4Amb3

X2-ccaagcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgcttgg-X3 A (33 52 58)

HPVAPO4Amb4

X2-ccagcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgctgg-X3 A (33 52 58)

HPVAPO4Amb5

X2-cgatcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgatcg-X3 A (33 52 58)

HPVCPO4

AAGACATTATTCAGACTC C (18 45 39)

HPVCPO4Amb1

X2-ccaagcAAGACATTATTCAGACTCgcttgg-X3 C (18 45 39)

HPVCPO4Amb2

X2-cgcatgAAGACATTATTCAGACTCcatgcg-X3 C (18 45 39)

HPVCPO4Amb3

X2-cccagcAAGACATTATTCAGACTCgctggg-X3 C (18 45 39)

HPVCPO4Amb4

X2-cgatcgAAGACATTATTCAGACTCcgatcg-X3 C (18 45 39)

Los pares de cebadores P1 y P2 que tienen el mismo prefijo (por ejemplo, HAe6701p1 y HAe6701p2) tienen por objeto ser utilizados en combinación. Sin embargo, pueden utilizarse también otras combinaciones, según se resume a continuación, para los tipos de VPH 16, 18, 31, 33 y 45.

imagen11

Nombre del cebador

Secuencia Tipo de VPH nt

H31e6703PCR1

TATCTACTTGTGTGCTCTGT 31 766

H31e6704PCR2

TGACCTCCACTGTTATGAGCAATT 31 619

H31e6704PCR1

TGCGAATATCTACTTGTGTGCTCT GT 31 766

H31e6705PCR2

ACTGACCTCCACTGTTAT 31 617

H31e6705PCR1

CACGATTCCAAATGAGCCCAT 31 809

H33e6701PCR2

TATCCTGAACCAACTGACCTAT 33 618

H33e6701PCR1

TTGACACATAAACGAACTG 33 763

H33e6703PCR2

TCCTGAACCAACTGACCTAT 33 620

H33e6703PCR1

CCCATAAGTAGTTGCTGTAT 33 807

H33e6702PCR2

GACCTTTGTGTCCTCAAGAA 33 431

H33e6702PCR1

AGGTCAGTTGGTTCAGGATA 33 618

H35e6701PCR2

ATTACAGCGGAGTGAGGTAT 35 217

H35e6701PCR1

GTCTTTGCTTTTCAACTGGA 35 442

H35e6702PCR2

TCAGAGGAGGAGGAAGATACTA 35 655

H35e6702PCR1

GATTATGCTCTCTGTGAACA 35 844

H35e6703PCR2

CCCGAGGCAACTGACCTATA 35 610

H35e6703PCR1

GTCAATGTGTGTGCTCTGTA 35 770

H52e6701PCR2

TTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT 52 144

H52e6701PCR1

CCCTCTCTTCTAATGTTT 52 358

H52e6702PCR2

GTGCCTACGCTTTTTATCTA 52 296

H52e6702PCR1

GGGGTCTCCAACACTCTGAACA 52 507

H58e6701PCR2

TCAGGCGTTGGAGACATC 58 157

H58e6701PCR1

AGCAATCGTAAGCACACT 58 301

H58e6702PCR2

TCTGTGCATGAAATCGAA 58 173

H58e6702PCR1

AGCACACTTTACATACTG 58 291

HBe6701PCR2

TACACTGCTGGACAACAT B (11) 514

HBe6701PCR1

TCATCTTCTGAGCTGTCT B (11) 619

HBe6702PCR2

TACACTGCTGGACAACATGCA B (11) 514

HBe6702PCR1

GTCACATCCACAGCAACAGGTCA B (11) 693

HBe6703PCR2

TGACCTGTTGCTGTGGATGTGA B (11) 693

HBe6703PCR1

TACCTGAATCGTCCGCCAT B (11) 832

HCe6701PCR2

CATGCCATAAATGTATAGA C (18 39 45) 295

HCe6701PCR1

CACCGCAGGCACCTTATTAA C (18 39 45) 408

H39e6701PCR2

GCAGACGACCACTACAGCAAA 39 210

H39e6701PCR1

ACACCGAGTCCGAGTAATA 39 344

H39e6702PCR2

TATTACTCGGACTCGGTGT 39 344

H39e6702PCR1

CTTGGGTTTCTCTTCGTGTTA 39 558

H39e6703PCR2

GAAATAGATGAACCCGACCA 39 703

H39e6703PCR1

GCACACCACGGACACACAAA 39 886

H45e6701PCR2

AACCATTGAACCCAGCAGAAA 45 430

H45e6701PCR1

TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA 45 527

H45e6702PCR2

GAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA 45 428

H45e6702PCR1

TTGCTATACTTGTGTTTCCCTACG 45 558

H45e6703PCR2

GTTGACCTGTTGTGTTACCAGCAAT 45 656

H45e6703PCR1

CACCACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

H45e6704PCR2

CTGTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 654

H45e6704PCR1

CCACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

H45e6705PCR2

GTTGACCTGTTGTGTTACGA 45 656

H45e6705PCR1

ACGGACACACAAAGGACAAG 45 868

H51e6701PCR2

GGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 658

H51e6701PCR1

GCCCATTAACATCTGCTGTA 51 807

H51e6702PCR2

AGAGGAGGAGGATGAAGTAGATA 51 655

H51e6702PCR1

ACGGGCAAACCAGGCTTAGT 51 829

H56e6701PCR2

TTGGGGTGCTGGAGACAAACATCT 56 519

H56e6701PCR1

TTCATCCTCATCCTCATCCTCTGA 56 665

H56e6702PCR2

TGGGGTGCTGGAGACAAACATC 56 520

H56e6702PCR1

CATCCTCATCCTCATCCTCTGA 56 665

H56e6703PCR2

TTGGGGTGCTGGAGACAAACAT 56 519

H56e6703PCR1

CCACAAACTTACACTCACAACA 56 764

H56e6704PCR2

GATTTTCCTTATGCAGTGTG 56 279

H56e6704PCR1

GACATCTGTAGCACCTTATT 56 410

Los pares de cebadores para PCR preferidos para los tipos de VPH 16, 18, 31 y 33 son análogos a los pares de cebadores para el NASBA.

Tabla 5: Cebadores y sondas preferidos para el NASBA de L1

Nombre del cebador

Secuencia

Onc2A2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGTAA 3'

Onc2A1

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCCCCATGTC 3'

Onc2PoA

5' TTGTTACTGTTGTTGATACTAC 3'

Onc2B2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGSRHAA 3'

Onc2B1

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCMMCATGDC 3'

Onc2PoB

5' TTGTTACTGTTGTTGATACYAC 3'

Onc2PoC

5' TTGTTACTGTTGTTGATACCAC 3'

Onc2C2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'

Onc2D2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'

Onc2E2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'

Onc2F2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGTAA 3'

Onc2G2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGAAA 3'

Onc2H2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGCATAA 3'

Onc2I2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGCAA 3'

Onc2J2

5' GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGCACAA 3'

Onc2K2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCMICATGIC 3'

Onc2L2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCAACATGIC 3'

Onc2M2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGTC 3'

Onc2N2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGGC 3'

Onc2O2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGAC 3'

Onc2P2

5' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGCC 3'

Tabla 6: Cebadores preferidos para la PCR de L1

Nombre del cebador

Secuencia

Onc2A1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGGGTAA 3'

Onc2A2-PCR

5' TCATATTCCTCCCCATGCTC 3'

Onc2B1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGSRHAA 3'

Onc2B2-PCR

5' TCATATTCCTCMMCATGDC 3'

Onc2C1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'

Onc2D1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'

Onc2E1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'

Onc2F1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGGGTAA 3'

Onc2G1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGGGAAA 3'

Onc2H1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGCATAA 3'

Onc2I1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGGGCAA 3'

Onc2J1-PCR

5' AATGGCATTTGTTGGCACAA 3'

Onc2K2-PCR

5' TCATATTCCTCMICATGIC 3'

Onc2L2-PCR

5' TCATATTCCTCAACATGIC 3'

Onc2M2-PCR

5' TCATATTCCTCIICATGTC 3'

Onc2N2-PCR

5' TCATATTCCTCIICATGGC 3'

Onc2O2-PCR

5' TCATATTCCTCIICATGAC 3'

Onc2P2-PCR

5' TCATATTCCTCIICATGCC 3'

Las secuencias específicas del VPH en las SEQ ID NO: 149 y 150 (cebadores Onc2A2/Onc2A1-PCR y Onc2A1/Onc2A2-PCR) son idénticas a fragmentos de la secuencia genómica del VPH de tipo 16 desde la posición

10 6596 a la 6615 (SEQ ID NO: 149; Onc2A2/Onc2A1-PCR) y desde la posición 6729 a la 6747 (SEQ ID NO:150; Onc2A1/Onc2A2-PCR).

Las secuencias específicas del VPH SEQ ID NO: 152 y 153 (Onc2B2/Onc2B1-PCR y Onc2B1/Onc2B2-PCR) son variantes de las secuencias anteriores, respectivamente, que incluyen varias bases degeneradas. Las

15 representaciones de las secuencias de moléculas de oligonucleótidos degenerados proporcionados en el presente documento utilizan el código convencional IUB para los sitios de bases mixtos: N=G, A, T, C; V=G, A, C; B=G, T, C; H=A, T, C; D=G, A, T; K=G, T; S=G, C; W=A, T; M=A, C; Y=C, T; R=A, G.

Es también posible utilizar variantes de las secuencias específicas del VPH SEQ ID NO: 152 (Onc2B2/Onc2B1

20 PCR) y SEQ ID NO: 153 (Onc2B1/Onc2B2-PCR) en las que cualquiera de dos de los nucleótidos "SRH" hacia el extremo 3' de la secuencia estén reemplazados por inosina (I), como se indica a continuación:

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El ARN y el ADN se aislaron automáticamente de 5300 mujeres en el primer ciclo de extracción, utilizando 1 ml de la muestra total de 9 ml en tampón de lisis. El ARN y el ADN se extrajeron de acuerdo con el método de aislamiento "Boom" de Organon Teknika (Organon Teknika B.V., Boselind 15, P.O. Box 84, 5280 AB Baxtel, Países Bajos; actualmente Biomérieux, 69280 Marcy l'Etoile, Francia) utilizando el extractor Nuclisens™ siguiendo el protocolo para extracción automatizada.

Estirpes celulares

Se utilizaron ADN y ARN de las estirpes celulares HeLa (VPH 18), SiHa (VPH 16) y CaSki (VPH 16) como controles positivos para las reacciones de PCR y NASBA. Estas células se utilizaron también como material de muestra en el estudio de sensibilidad (Ejemplo 2). Las células SiHa tienen 1-2 copias de VPH 16 integradas por célula, mientras que las células CaSki tienen entre 60-600 copias de VPH 16, integradas y en estado episómico. Las células HeLa tienen 10-50 copias de VPH 18 por célula aproximadamente.

Detección y tipificación del VPH mediante PCR

Se sometió ADN aislado de raspados de cuello uterino a PCR utilizando los cebadores consenso GP5+/6+ (EP-B-0 517 704). La PCR se realizó en un volumen de reacción de 50 μl que contenía Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25 ºC), (NH4)2SO4 20 mM, Tween 20™ 0,01 %, 200 mM de cada dNTP, MgCl2 1,5 mM, 1 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 μl de muestra de ADN y 50 pmoles de cada uno de los cebadores GP5+ y GP6+. A una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94 ºC le siguieron 40 ciclos de amplificación con un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 1 minuto, una etapa de hibridación de los cebadores a 40 ºC durante 2 minutos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72 ºC durante 1,5 minutos. La última etapa de alargamiento se prolongó en 4 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado.

Las muestras positivas con GP5+/6+ se sometieron a protocolos de PCR para el VPH de tipo 16, 31 y 33 como se indica a continuación:

VPH 16, 31 y 33: La PCR se realizó en 50 μl que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25 ºC), 200 mM de cada dNTP, MgCl2 1,5 mM, 2,5 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 μl de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. A una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94 ºC le siguieron 35 ciclos de amplificación con un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 30 segundos, una etapa de hibridación de los cebadores a 57 ºC durante 30 segundos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72 ºC durante 1 minuto. La última etapa de alargamiento se prolongó en 10 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado. El protocolo para VPH 33 tenía una etapa de hibridación de los cebadores a 52 ºC. Protocolo para el VPH 18: Se diseñaron cebadores para identificar VPH de tipo 18. La PCR se realizó en 50 μl que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25 ºC), (NH4)2SO4 20 mM, Tween 20 0,01 %, 200 mM de cada dNTP, MgCl2 2,0 mM, 2,5 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 μl de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. A una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94 ºC le siguieron 35 ciclos de amplificación en un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 30 segundos, una etapa de hibridación de los cebadores a 57 ºC durante 30 segundos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72 ºC durante 1 minuto. La última etapa de alargamiento se prolongó en 10 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado.

Se utilizó un conjunto de cebadores dirigidos contra el gen de la β-globina humana como control de calidad del ADN (Procedimiento de trabajo, University Hospital Vrije Universiteit, Amsterdam, Países Bajos). La PCR se realizó en 50 μl que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25 ºC), 200 mM de cada dNTP, MgCl2 1,5 mM, 1 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 μl de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. A una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94 ºC le siguieron 35 ciclos de amplificación en un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, una etapa de hibridación de los cebadores a 55 ºC durante 1 ½ minutos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72 ºC durante 2 minutos. La última etapa de alargamiento se prolongó en 4 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado. Se utilizó HeLa como control positivo para VPH 18, mientras que se utilizaron SiHa o CaSki como control positivo para VPH 16. Se utilizó agua como control negativo. Cebadores utilizados para la PCR del VPH:

Tipo

Cebador Secuencia de los cebadores Posición Longitud (pb)

VPH 16

Pr1 Pr2 5' TCA AAA GCC ACT GTG TCC TGA 3' 5' CGT GTT CTT GAT GAT CTG CAA 3' 421 -440 521 -540 119

VPH 18

Pr1 Pr2 (5' TTC CGG TTG ACC TTC TAT GT 3') (5' GGT CGT CTG CTG AGC TTT CT 3') 651 -670 817 -836 186

VPH 31

Pr1 Pr2 5' CTA CAG TAA GCA TTG TGC TAT GC 3' 5' ACG TAA TGG AGA GGT TGC AAT AAC CC 3' 3835 -3875 3963 -3988 153

Tipo

Cebador Secuencia de los cebadores Posición Longitud (pb)

VPH 33

Pr1 Pr2 5' AAC GCC ATG AGA GGA CAC AAG 3' 5' ACA CAT AAA CGA ACT GTG TGT 3' 567 -587 758 -778 211

Gp+

Gp5+ Gp6+ 5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3' 5' GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C 6624 -6649 6719 -6746 150

BGPCO3 BGPCO5

Pr1 Pr2 5' ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC 5' GAA ACC CAA GAG TCT TCT CT

La visualización de los productos de la PCR se realizó en un chip de ADN 500 (Agilent Technologies, EE.UU.) según su manual. El chip de ADN utiliza electroforesis en gel a microescala con un límite de detección óptimo de 0,5-50 ng/ml. Los resultados se interpretaron utilizando el programa de ordenador Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies,

5 EE.UU.).

La tabla siguiente confirma los cebadores utilizados para la PCR del VPH en muestras de pacientes e indica cebadores de PCR adicionales útiles para VPH 35, 39, 45, 51, 52, 58 y VPH 6/11. Cebadores de PCR para la detección de VPH.

10

Tipo

Cebador Secuencia de los cebadores Posición Longitud (pb)

VPH 6/11

Pr1 Pr2 5' TAC ACT GCT GGA CAA CAT 3' 5' TCA TCT TCT GAG CTG TCT 3' 514 -531 619 -636 123

VPH 16

Pr1 Pr2 5' TCA AAA GCC ACT GTG TCC TGA 3' 5' CGT GTT CTT GAT GAT CTG CAA 3' 421 -441 520 -540 120

VPH 18

Pr1 Pr2 5' TTC CGG TTG ACC TTC TAT GT 3' 5' GGT CGT CTG CTG AGC TTT CT 3' 651 -670 817 -836 186

VPH 31

Pr1 Pr2 5' CTA CAG TAA GCA TTG TGC TAT GC 3' 5' ACG TAA TGG AGA GGT TGC AAT AAC CC 3' 3835 -3857 3964 -3989 155

VPH 33

Pr1 Pr2 5' AAC GCC ATG AGA GGA CAC AAG 3' 5' ACA CAT AAA CGA ACT GTG GTG 3' 567 -587 758 -778 212

VPH 35

Pr1 Pr2 5' CCC GAG GCA ACT GAC CTA TA 3' 5' GGG GCA CAC TAT TCC AA ATG 3' 610 -629 821 -840 231

VPH 39

Pr1 Pr2 5' GCA GAC GAC CAC TAC AGC AAA 3' 5' ACA CCG AGT CCG AGT AAT A 3' 210 -230 344 -362 153

VPH 45

Pr1 Pr2 5' GAA ACC ATT GAA CCC AGC AGA AAA 3' 5' TTG CTA TAC TTG TGT TTC CCT ACG 3' 428 -451 558 -581 154

VPH 51

Pr1 Pr2 5' GGA GGA GGA TGA AGT AGA TA 3' 5' GCC CAT TAA CAT CTG CTG TA 3' 658 -677 807 -826 169

VPH 52

Pr1 Pr2 5' GTG CCT ACG CTT TTT ATC TA 3' 5' GGG GTC TCC AAC ACT CTG AAC A 3' 296 -315 507 -528 233

VPH 58

Pr1 Pr2 5' TCA GGC GTT GGA GAC ATC 3' 5' AGC AAT CGT AAG CAC ACT 3' 157 -174 301 -318 162

Gp+

Gp5+ Gp6+ 5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3' 5' GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C 150

BGPCO3

Pr1 5' ACA CAA CTG TGT TCA CAT GC

BGPCO5

Pr2 5' GAA ACC CAA GAG TCT TCT CT

Amplificación de ARN mediante NASBA

Precauciones para evitar contaminación: 15

1.

Realizar la liberación, el aislamiento y la amplificación/detección de los ácidos nucleicos en áreas del laboratorio separadas.

2.

Almacenar y preparar los reactivos para la liberación, el aislamiento y la amplificación/detección de los ácidos

nucleicos en las áreas del laboratorio en las que vayan a realizarse la liberación, el aislamiento y la 20 amplificación/detección de los ácidos nucleicos, respectivamente.

3.

Mantener todos los tubos y viales cerrados cuando no se estén utilizando.

4.

Las pipetas y cualquier otro equipamiento que se hayan utilizado en un área del laboratorio no deben ser utilizados en las demás áreas.

5.

Utilizar una pipeta o una punta de pipeta nueva para cada pipeteo.

25 6. Utilizar pipetas con puntas resistentes a aerosoles para los fluidos que es posible que contengan ácido nucleico. El pipeteo de las soluciones debe realizarse siempre fuera o dentro de un tubo aislado que se abra y cierre exclusivamente para esta acción. Todos los demás tubos y viales deben mantenerse cerrados y separados del que se está manejando.

7. Utilizar guantes desechables cuando se trabaje con material clínico que es posible que contenga ARN diana o

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La biopsia 2 se dividió en dos cuando se congeló y la mitad se utilizó para la extracción de ADN/ARN. La otra mitad se fijó en formaldehído tamponado al 10 % y se procesó para el examen histopatológico. Algunas lesiones no estaban orientadas correctamente en el bloque de parafina y tuvieron que ser reorientadas o seccionadas en serie para mostrar el epitelio superficial relevante. En consecuencia, no pudo garantizarse que se hubiera utilizado exactamente el mismo tejido para la extracción y para la evaluación histopatológica. La muestra de ensayo cónica, finalmente, fue evaluada por el patólogo local que en todos los casos pudo confirmar la presencia de displasia. No era siempre el mismo grado que en la biopsia original y, en muchos casos, no era el mismo que en la biopsia 2.

Extracción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos se aislaron utilizando el Nuclisens Extractor automatizado según se describió previamente (Boom y col., 1990). Cada biopsia se cortó en dos fragmentos, uno destinado al examen histológico y la otra mitad para el análisis de ARN. El material destinado al análisis de ARN se dividió en fragmentos más pequeños mientras se mantenía en nieve carbónica (-80 ºC) y se puso en 1 ml de tampón de lisis (igual que anteriormente) seguido de 20 segundos de homogenización utilizando trituradores desechables. Se diluyeron cien mililitros de la muestra posteriormente 10 veces en tampón de lisis y después se extrajeron 100 ml para determinar ADN/ARN. El ADN/ARN extraído se diluyó con ~40 ml de tampón de elución (Organon Teknika) y se almacenó a -70 ºC.

Todas las sondas moleculares fluorescentes ("balizas") utilizadas en este estudio emplean el fluoróforo FAM (6carboxifluoresceína) en el extremo 5' de la estructura. Éste se unió a una secuencia variable del bucle troncal acoplada al inactivador universal ácido 4-(4'-diametilaminofenilazo)benzoico (DABCYL) en el extremo 3'. Las sondas fueron suministradas por Eurogentec, Bélgica. La concentración final de sondas moleculares fluorescentes utilizada en la reacción fue de 2,5 mM. Para el NASBA en tiempo real se utilizó el kit Nuclisens Basic Kit (Organon Teknika, Países Bajos), destinado al desarrollo de ensayos de amplificación de ARN definidos por el usuario. La amplificación mediante NASBA se realizó en un volumen de 20 μl. Los conjuntos de cebadores y las sondas se dirigieron contra el ARNm de E6/E7 de longitud completa de los VPH de alto riesgo 16, 18, 31 y 33. Como control de funcionamiento, para evitar resultados negativos falsos debido a la degradación del ácido nucleico, se utilizó un conjunto de cebadores y una sonda dirigidos contra la proteína A específica de la ribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP) U1 humana (ARNm de U1A) (Nelissen y col., 1991). Todas las muestras se procesaron por duplicado en máquinas separadas (lectores de microplacas para medir la fluorescencia y la absorbancia, Bio-tek FL-600 FA de MWG). El ARNm aislado de células CaSki/SiHa o HeLa sirvió como control positivo para los transcritos de VPH 16 y VPH 18, respectivamente. Los controles negativos, incluidos para cada reacción 7, consistían en una reacción que contenía todos los reactivos excepto ARNm.

Análisis del ADN del VPH; Reacción en Cadena de la Polimerasa

Se utilizaron para la PCR los mismos extractos y las mismas cantidades que las utilizadas en la reacción de NASBA. Se utilizaron los cebadores Gp5+/Gp6+ consenso para L1 con el fin de detectar todas las muestras que contenían ADN de VPH. La amplificación por PCR se realizó según se describió anteriormente. La primera desnaturalización del ADN se realizó durante 2 minutos a 94 ºC, posteriormente se realizaron 40 ciclos de PCR: desnaturalización durante 1 minuto a 94 ºC, hibridación durante 2 minutos a 40 ºC, extensión durante 1,5 minutos a 72 ºC, seguido por una extensión final durante 4 minutos a 72 ºC. La tipificación del VPH se realizó utilizando cebadores de PCR específicos de tipo frente a VPH 16, 18, 31 y 33 (6/11, 35, 45, 51, 52, 58), según se ha descrito anteriormente.

Resultados

Originalmente se sometieron a biopsia 190 pacientes después de haber sido diagnosticadas de CIN I, CIN II o CIN III mediante citología. Se confirmó una lesión de alto grado mediante examen histológico, se diagnosticaron 150 muestras como CIN III (78,9 %). La biopsia 2, tomada antes de la conización, se utilizó para el análisis de ARN. Sin embargo, el examen histológico de esta biopsia diagnosticó solamente 53 muestras de las 150 originales como CIN III [a 54 no se les dio ningún diagnóstico, 24 se diagnosticaron como CIN II, 18 como CIN I y 4 como VPH/condiloma]. El número de muestras con CIN II aumentó de 16 (8,4 %) a 30 (15,8 %) [por la Histología I, 24 fueron diagnosticadas como CIN III, 4 como CIN II, 1 como carcinoma y 1 como CIN I. A 12 casos de CIN II de la Histología I se les dio un diagnóstico inferior en la Histología II]. El grado de CIN I aumentó de 6 muestras (3,2 %) a 32 muestras (16,8 %). Los 2 carcinomas de células escamosas se diagnosticaron en la Histología II como CIN III, el adenocarcinoma como CIN II. En 71 muestras (38,4 %), no se detectaron lesiones de grado alto.

Se detectó ARN oncogénico de VPH en 69 (36 %) de las 190 pacientes. De las 53 muestras (28 %) diagnosticadas como CIN III en la Histología II, se encontraron 40 casos (76 %) que presentaban la expresión oncogénica de VPH 16, 18, 31 o 33. Además, se encontró expresión oncogénica en 9 de 30 casos (30 %) de CIN II, en 4 de 32 casos (13 %) de CIN I, en 14 de 71 casos (20 %) que no presentaban anormalidades celulares y en 2 de 4 muestras (50 %) diagnosticadas como VPH/condiloma.

Se encontró ARN de VPH 16 en 42 de las 190 pacientes, se encontró VPH 18 en 7 (3,7 %), VPH 31 en 15 (7,9 %) y VPH 33 en 8 (4,2 %). Una paciente tenía una infección mixta con VPH 16 y VPH 18, y una con VPH 16 y VPH 31.

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