ES2655688T3 - Composiciones terapéuticas para polineuropatía simétrica diabética - Google Patents
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Abstract
Una composición para su uso en un método para tratar neuropatía diabética simétrica por administración tópica o transdérmica, la composición comprendiendo: una cantidad efectiva de pirenzepina, una sal de la misma, o hidrato de la misma; uno o más agentes potenciadores de la penetración; y un portador o excipiente farmacológicamente aceptable o combinaciones de los mismos.
Description
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Composiciones terapéuticas para polineuropatía simétrica diabética Descripción
CAMPO DE LA INVENCION
Esta invención se refiere a terapias para la polineuropatía simétrica diabética. Más particularmente, esta invención se refiere a composiciones terapéuticas para la polineuropatía distal simétrica, en donde las composiciones comprenden una cantidad efectiva de la pirenzepina antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos.
ANTECEDENTES
La polineuropatía simétrica es un problema clínico en aproximadamente el 50% de las personas afectadas de diabetes. Los síntomas clínicos pueden incluir el desarrollo de dolor en la parte superior de la espalda y/o abdominal (es decir neuropatía toracoabdominal diabética), pérdida de control de movimientos de los ojos (es decir, parálisis del tercer nervio), y pérdida progresiva de la función de los nervios que comprenden el sistema nervioso periférico (por ejemplo, polineuropatía, mononeuropatía, mononeuritis simple, neuropatía autonómica).
La forma dominante de neuropatía diabética se presenta como una polineuropatía distal simétrica que afecta inicialmente a los pies, piernas y manos del sujeto. Los síntomas principales incluyen pérdida de sensaciones de tacto y/o palpación y la pérdida de la capacidad de detectar estímulos que provocan dolor. Un sub-grupo de pacientes con neuropatía diabética temprana también desarrollan síntomas positivos de dolor neuropático como sensaciones de hormigueo, ardor, punzadas o dolor que pueden coexistir con otros síntomas negativas de pérdida sensorial. Tal dolor neuropático es referido comúnmente como alodinia táctil o mecano-hiperalgesia.
La neuropatía sensorial distal puede medirse usando biopsias de piel para determinar la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF). La pérdida de IENF representa la retracción de las finalizaciones nerviosas de las neuronas sensoriales de la epidermis con la pérdida sensorial posterior que finalmente contribuye a altas incidencias de ulceración, gangrena y amputación en sujetos que padecen diabetes avanzada. Actualmente, no hay terapias reguladoras probadas en Norte América para esta polineuropatía simétrica degenerativa. Los costes actuales para los sistemas de salud para proporcionar alivio a estos síntomas son enormes. R. Van der Ploeg et al. divulgaron pirenzepina y un ensayo in vitro para evaluar el crecimiento de los axones (resumen N° A-C1108, 2a Annual Canadian Neuroscience Meeting organizada conjuntamente por CAN e INMHA 25-28 Mayo 2008). La US 2008/0255062 divulga un método para seleccionar moléculas pequeñas para identificar moléculas pequeñas que estimulan la regeneración de axones y el crecimiento desde neuronas sensoriales adultas. El método comprende generalmente preparar una suspensión de células de ganglios de la raíz dorsal (DRG), recubrir bien las superficies de una microplaca multi-pocillo adecuadamente preparada con el DRG, luego dispensar dosificaciones de las moléculas pequeñas seleccionadas en los pocillos seleccionados. Las microplacas se incuban bajo condiciones estériles a aproximadamente 37° C durante por lo menos 24 horas. La suspensión de DRG en cada pocillo se evalúa luego morfométricamente para evaluar la extensión de la regeneración de los axones y el crecimiento que tuvo lugar, y los efectos de las moléculas pequeñas seleccionadas se determinan por comparación con los tratamientos de control.
SUMARIO DE LA INVENCION:
Las realizaciones ejemplares de la presente invención pertenecen a composiciones adecuadas para terapia de polineuropatía simétrica diabética. Las composiciones terapéuticas comprenden el antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos, pirenzepina, una sal del mismo o hidrato del mismo. Las composiciones son adecuadas para tratar tanto los síntomas negativos de la polineuropatía simétrica diabética ejemplificados por la ralentización de la conducción nerviosa y por la pérdida sensorial, y los síntomas positivos de la polineuropatía simétrica diabética ejemplificados por la alodinia táctil y por la mecano-hiperalgesia.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, las composiciones del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos son inyectables. Las inyecciones pueden ser inyecciones subcutáneas en un cuerpo del sujeto. Alternativamente, las inyecciones pueden ser inyecciones sub-epidérmicas. Los sitios de inyección objetivo adecuados incluyen, entre otros, dedos de los pies, pies, tobillos, rodillas y piernas. Otros sitios de inyección objetivo adecuados incluyen, entre otros, dedos, manos, muñecas, brazos y hombros. Otros sitios de inyección objetivo adecuados más incluyen la espalda superior e inferior, el pecho y el área abdominal.
De acuerdo con la presente invención, las composiciones del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos son adecuadas para administraciones tópicas sobre los sitios objetivo seleccionados en un cuerpo del sujeto. Los sitios de aplicación tópica objetivo adecuados incluyen, entro otros, dedos de los pies, pies, tobillos, rodillas y piernas. Otros sitios de aplicación tópica objetivo adecuados incluyen, entre otros, dedos, manos, muñecas, brazos y hombros. Otros sitios de aplicación tópica objetivo adecuados incluyen la espalda superior e
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inferior, el pecho y el área abdominal. Alternativamente, las composiciones del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos podrían administrarse a los sitios objetivo seleccionados en un cuerpo del sujeto por parches transdérmicos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, las composiciones del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos son adecuadas para la administración oral en un cuerpo del sujeto.
Si se desea, las composiciones inyectables de la presente divulgación pueden usarse en combinación con, concurrentemente con, o secuencialmente con las composiciones tópicas de la presente invención y/o en combinación con, concurrentemente con, o secuencialmente con las composiciones orales de la presente invención.
Otras realizaciones ejemplares pertenecen al uso de las composiciones de la presente invención para terapia de polineuropatía simétrica diabética. El uso incluye aplicaciones tópicas y/o aplicaciones de parches transdérmicos de las composiciones del antagonista de los receptores de la acetilcolina muscarínicos sobre los sitios objetivo seleccionados en un cuerpo del paciente.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La presente invención se describirá en conjunción con referencia a los siguientes dibujos en los que:
La Fig. 1 es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina, un antagonista del receptor tipo 1 (M1R) de acetilcolina muscarínico, en neuronas cultivadas en ratas grasas diabéticas de Zucker (ZDF) (modelo de diabetes tipo 2);
Las Figs. 2(A)-(C) son gráficos que muestran los efectos de antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos en el crecimiento de neuritas de neuronas cultivadas a partir de ratas normales 2(A) pirenzepina, 2(B) telenzepina y 2(C) atropina;
La Fig. 3 es un gráfico que muestra los efectos de dosis bajas de antagonistas del receptor tipo 1 (M1R) de acetilcolina muscarínicos en el crecimiento de neuritas de neuronas cultivadas de ratas normales;
Las Figs. 4(A) y 4(B) muestran los efectos de la pirenzepina en el crecimiento de neuritas de cultivos de neuronas sensoriales aisladas de: 4(A) ratones del tipo salvaje, y 4(B) ratones knockout M1R;
La Fig. 5 es un gráfico que compara la producción de acetilcolina en cultivos de ratones del tipo salvaje y en cultivos de ratones knockout M1R;
La Fig. 6(A) es un análisis de inmunotransferencia Western que muestra los efectos de la pirenzepina en la fosforilación de la proteína quinasa regulada extracelular (ERK) en neuronas sensoriales cultivadas, mientras que la 6(B) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en la proporción P-ERK/T-ERK;
La FIG. 7(A) es un análisis de inmunotransferencia Western que muestra los efectos de VU255035 en la fosforilación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en neuronas sensoriales cultivadas, mientras que la 7(B) es un gráfico que muestra los efectos de VU255035 en la proporción P-ERK/T-ERK;
Las Fig. 8(A) y 8(B) son gráficos que muestran los efectos profilácticos de inyecciones subcutáneas de pirenzepina en 8(A) hipoalgesia térmica, y 8(B) pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF), en ratones diabéticos C57Bl6J con estreptozotocina (STZ) (modelo de diabetes tipo 1);
Las Figs. 9(A-B) son gráficos que muestran los efectos del antagonista de M1R específico VU255035 en la reversión de 9(A) hipoalgesia térmica, y 9(B) pérdida de IENF en ratones Swiss Webster diabéticos inducidos con STZ;
Las Figs. 10(A)-10(C) son gráficos que muestran los efectos profilácticos de aplicaciones tópicas de pirenzepina en: 10(A) hipoalgesia térmica, 10(B) pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF) y 10(C) plexos nerviosos subepidérmicos (SNP) en ratones diabéticos C57Bl6J STZ;
Las Figs. 11(A) y 11(B) son gráficos que muestran los efectos de inyecciones subcutáneas a largo plazo de pirenzepina en la reversión de: 11(A) hipoalgesia térmica, y 11(B) pérdida de IENF en ratones diabéticos Swiss-Webster no consanguíneos;
La Fig. 12 es un diagrama que muestra los efectos de la retirada de tratamientos con pirenzepina en la reaparición de neuropatía;
La Fig. 13 es un gráfico que muestra los efectos de inyecciones de pirenzepina en la reversión de hipoalgesia
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La Fig. 14(A) es un gráfico que muestra que la administración subcutánea diaria de pirenzepina evita la alodinia táctil de las patas en ratas Sprague-Dawley diabéticas STZ tras 5 ó 9 semanas de tratamiento y previene por lo tanto el comienzo de neuropatía diabética dolorosa, y 14(B) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en el desarrollo de la velocidad de conducción de nervios sensoriales en los mismos animales, medida tras 8 semanas de diabetes;
Las Figs. 15 (A-B) son gráficos que muestran los efectos de dosificación de pirenzepina oral en la reversión de: (A) hipoalgesia térmica de las patas, y (B) pérdida de IENF en ratones Swiss-Webster diabéticos STZ;
La Fig. 16(A) es un análisis de inmunotransferencia Western que muestra los efectos de la pirenzepina en la conservación de la expresión de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y receptor/coactivador-1a activado por el proliferador de peroxisoma (PGC-1a), 16(B) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en la expresión de P-AMPK, 16(C) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en los niveles de T-AMPK, y 16(D) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en la expresión de PGC- 1a en ratone diabéticos STZ;
La Fig. 17(A) es un análisis de inmunotransferencia Western que muestra los efectos de la pirenzepina en la reversión de los déficits de expresión de las proteínas mitocondriales NDUFS3 y COX IV (T-ERK se mide como un control de carga), 17(B) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en la expresión de la proteína NDUFS3, y 17(C) es un gráfico que muestra los efectos de la pirenzepina en la expresión de la proteína COX IV en ratones diabéticos STZ;
Las Fig. 18(A), 18(B) y 18 (C) son gráficos que muestran los efectos de la pirenzepina en la reversión de déficits en las actividades del complejo respiratorio mitocondrial I (A), el complejo respiratorio mitocondrial IV (B), y el citrato sintasa mitocondrial (C) en ratones diabéticos STZ; y
La Fig. 19 es un gráfico que muestra los efectos de inyecciones de pirenzepina subcutáneas diarias en la restauración de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en ganglios de la raíz dorsal lumbar recién homogeneizados de ratas diabéticas STZ.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona sólo con propósitos de información. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los significados que se entenderían comúnmente por un experto en la técnica en el contexto de la presente especificación. Aunque también podrían usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente en la puesta en práctica o pruebas de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con las que se citan las publicaciones.
Debe tenerse en cuenta que como se usan en la presente y en las reivindicaciones añadidas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos" incluye una pluralidad de tales antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos y la referencia "al agente" incluye referencia a uno o más agentes y equivalentes del mismo conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
"Opcional" u "opcionalmente" o "alternativamente" significa que el evento, circunstancia o material descritos posteriormente pueden o no tener lugar o estar presentes, y que la descripción incluye situaciones en las que el evento, circunstancia o material tiene lugar o está presente y situaciones en las que no tiene lugar o no está presente.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviniente, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o interviniente en ese intervalo indicado, está abarcado dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y están también, abarcados dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Donde el intervalo indicado incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en la invención.
"Inhibir", "inhibiendo" e "inhibición" significan disminuir una actividad, respuesta, condición, enfermedad, u otro parámetro biológico. Esto puede incluir pero no está limitado a la ablación completa de la actividad, respuesta,
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condición, o enfermedad. Esto puede incluir también, por ejemplo, una reducción del 10% en la actividad, respuesta, condición, o enfermedad en comparación con el nivel nativo o de control. Así una reducción puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90; 100%, o cualquier cantidad de reducción entre los porcentajes específicamente enumerados, en comparación con los niveles nativos o de control.
"Promover", "promoción" y "promoviendo" se refieren a un aumento en una actividad, respuesta, condición, enfermedad, u otro parámetro biológico. Esto puede incluir pero no está limitado al inicio de la actividad, respuesta, condición, o enfermedad. Esto puede incluir también, por ejemplo, un aumento del 10% en la actividad, respuesta, condición, o enfermedad en comparación con el nivel nativo o de control. Así el aumento en una actividad, respuesta, condición, enfermedad u otro parámetro biológico puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, o más, incluyendo cualquier cantidad de aumento entre los porcentajes específicamente enumerados, en comparación con los niveles nativos o de control.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" significa cualquier objetivo de administración. El sujeto puede ser un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Por lo tanto, el sujeto puede ser un humano. El término no indica una edad o sexo particulares. Por lo tanto, se pretende que estén cubiertos sujetos adultos, juveniles y neonatos, ya sean masculinos o femeninos. Un paciente se refiere a un sujeto afligido con una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios.
El término "receptores de acetilcolina muscarínicos" significa receptores finales principales acoplados a proteínas G que se estimulan por la acetilcolina liberada de varios tipos de células incluyendo neuronas sensoriales, queratinocitos y fibras posganglionares en el sistema nervioso parasimpático, y funcionan como moléculas de señalización que inician las cascadas de señales dentro de las células en sus regiones inmediatas.
El término "antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos" como se usa en la presente, significa uno o más agentes de origen natural extraídos, agentes de origen natural purificados, agentes sintetizado químicamente, sus sales, sus derivados y sus homólogos, que reducen las actividades y/o función de los receptores de acetilcolina muscarínicos encontrados en las neuronas y otras células.
Como se usan en la presente, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto ad verso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente", cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un humano, e incluye: (a) prevenir que tenga lugar la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pro que todavía no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.
El término "terapéuticamente efectivo" significa que la cantidad de la composición usada es de suficiente cantidad para mejorar una o más causas o síntomas de una enfermedad o trastorno. Dicha mejora sólo requiere una reducción o alteración, no necesariamente la eliminación. La "cantidad terapéuticamente efectiva" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su severidad y la edad, peso, etc., del sujeto a ser tratado.
Como se usa en la presente, "composición farmacéutica" incluye cualquier composición para: (i) administración tópica, o (ii) administración transdérmica o (iii) administración parenteral, o (iv) administración oral de un antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos a un sujeto con necesidad de terapia para polineuropatía distal simétrica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes activos de superficie y similares además del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también uno o más ingredientes activos como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y similares.
El término "forma de dosificación unitaria" como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "portador" significa un compuesto, composición, sustancia o estructura que, cuando se combina con un antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos o composición, ayuda o facilita la preparación, almacenamiento, administración, entrega, eficacia, selectividad o cualquier otra característica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos o composición para su uso o propósito pretendido. Por ejemplo, un portador puede seleccionarse para minimizar cualquier degradación de los antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos y para minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen esencialmente composiciones farmacéuticas
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químicamente inertes y no tóxicas que no interfieren con la efectividad de la actividad biológica de la composición farmacéutica. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para volver la formulación isotónica. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, soluciones salinas, soluciones de glicerol, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetil-amonio (DOTMA), diolesilfosfotidiletanolamina (DOPE), y liposomas. Tales composiciones farmacéuticas deberían contener una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, junto con una cantidad adecuada del portador para proporcionar la forma para la administración apropiada al sujeto. La formulación debería adecuarse al modo de administración. Por ejemplo, la administración oral requiere recubrimientos entéricos para proteger a los antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos de la degradación dentro del tracto gastrointestinal. En otro ejemplo, los antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos pueden administrarse en una formulación liposómica para facilitar el transporte a través del sistema vascular del sujeto y efectuar la administración a través de las membranas celulares a los sitios intracelulares.
El término "excipiente" significa en la presente cualquier sustancia, no ella misma un agente terapéutico, que puede usarse en una composición para la administración del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos a un sujeto o combinarse alternativamente con un antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos (para crear una composición farmacéutica) para mejorar sus propiedades de manejo o almacenamiento o para permitir o facilitar la formación de una dosis unitaria de la composición (por ejemplo, la formación de un hidrogel tópico que puede luego ser opcionalmente incorporado en un parche transdérmico). Los excipientes incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, agentes aglutinantes, disgregantes, potenciadores de sabor, solventes, espesantes o gelificantes (y cualquier agente neutralizante, si es necesario), potenciadores de la penetración, agentes solubilizantes, agentes humectantes, antioxidantes, lubricantes, emolientes, sustancias añadidas para enmascarar o contrarrestar olor, fragancias o sabor desagradables, sustancias añadidas para mejorar la apariencia o textura de la composición y sustancias usadas para formar las composiciones farmacéuticas. Cualquiera de tales excipientes puede usarse en cualquier forma de dosificación de acuerdo con la presente divulgación. Las clases precedentes de excipientes no se pretende que sean exhaustivas si no meramente ilustrativas como una persona experta en la técnica reconocerá que se pueden usar tipos y combinaciones adicionales de excipientes para alcanzar los objetivos deseados para la administración del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos.
La pirenzepina es un medicamento bien conocido que se usa para tratar úlceras duodenales, úlceras estomacales y problemas intestinales, ya sea sola o en combinación con antiácidos u otros medicamentos como ranitidina. La pirenzepina se ha usado para aliviar calambres y/o espasmos en el estomago, intestino y vejiga. Adicionalmente, la pirenzepina puede usarse como un profiláctico para prevenir nauseas, vómitos y cinetosis. La pirenzepina pertenece a las siguientes categorías de fármacos: (a) agentes antiulcerosos, (b) antimuscarínicos, (c) antiespasmódicos y (d) antagonistas muscarínicos.
Los efectos principales de la pirenzepina son consecuencia de su enlace con y modulación del receptor de acetilcolina muscarínico. El receptor de acetilcolina muscarínico media varias respuestas celulares, incluyendo la inhibición de la adenilato ciclasa, degradación de fosfoinosítidos y modulación de los canales de potasio mediante la acción de proteínas G. Los usos terapéuticos actuales de la pirenzepina se basan en composiciones administradas oralmente. La pirenzepina se absorbe del tracto gastro-digestivo y tras la asimilación, modula la secreción de ácidos gástricos, secreciones salivares, el sistema nervioso central, funciones cardiovasculares, oculares y urinarias. Las dosificaciones efectivas en composiciones de pirenzepina administradas oralmente para estas indicaciones estén en el intervalo de aproximadamente 50 a 300 mg/día, aproximadamente de 75 a 225 mg/día, aproximadamente de 100 a 150 mg/día.
La fórmula molecular de la pirenzepina es C19H21N5O2 con un peso molecular de 351,402. En nombre IUPAC de la pirenzepina es 1-[2-(4-metilpiperazin-1-il)acetil]-5H-pirido[2,3-b][1,4]benzodiazepin-6-1. LA pirenzepina está disponible como una sal o hidrato de HCL.
Hemos descubierto sorprendentemente que cultivar neuronas adultas y juveniles extirpadas de ratas diabéticas, en medio de cultivo que comprende pirenzepina estimula el crecimiento de neuritas a partir de las neuronas extirpadas. Adicionalmente, hemos descubierto que todas las aplicaciones tópicas, inyecciones subcutáneas, inyecciones de pirenzepina a y en varios objetivos de la piel en ratones diabéticos: (i) previno déficits en la velocidad de conducción de nervios motores; (ii) previno e invirtió la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas, (ii) previno la pérdida de plexos nerviosos sub-epidérmicos, (iv) previno alodinia táctil, y (v) previno e invirtió el desarrollo de hipoalgesia térmica. Además, hemos descubierto que la administración oral de pirenzepina invirtió la neuropatía sensorial.
En vista de estos resultados destacables, evaluamos otros antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos para su potencial para invertir perdida asociada con la diabetes de fibras nerviosas intraepidérmicas e hipoalgesia térmica. Los antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos son agentes que reducen las
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actividades y/o función de los receptores de acetilcolina muscarínicos que se encuentran en las membranas plasmáticas de neuronas y otras células. Los receptores de acetilcolina muscarínicos son receptores finales principales acoplados a proteína G que se estimulan por la acetilcolina liberada de varios tipos de células incluyendo neuronas sensoriales, queratinocitos y fibras postganglionares en el sistema nervioso parasimpático, y funcionan como moléculas de señalización que inician las cascadas de señales dentro de las células en sus regiones inmediatas. Antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos bien conocidos útiles para el tratamiento de enfermedades como mal funcionamiento del sistema nervioso central, enfermedades pulmonares y dolencias gástricas se ejemplifican por la atropina, escopolamina, telenzepina, hioscina, ipratropio tropicamida, ciclopentolato, glicopirrolato, 4-difenilacetoxi-1,1-dimetilpiperidinio, quinidina, orfenadrina, oxifenonio, emepronio, prociclidina, propantelina, 4-fluorhexahidrosiladifenidol, octilonium" quinuclidinil benzilato, tolterodina, benctimazina, bipreiden, diciclomina, benztropina, dexetimida, hexahidrosiladifenidol, entre otros.
Además, adicionalmente a la pirenzepina, hay una variedad de antagonistas selectivos del receptor muscarínico tipo 1 (M1R) y otros subtipos de receptores muscarínicos que se anticipan muestran actividades beneficiosas similares a las demostradas por la pirenzepina en el crecimiento de neuritas neuronales. Algunos de estos compuestos tienen actividad selectiva de M1R muy superior. Por ejemplo, la telenzepina, un análogo de la pirenzepina con una estructura tricíclica alterada pero una cadena lateral de piperazina no modificada, es de 4 a 10 veces más potente que la pirenzepina. El VU0255035, un derivado de tiadiazol es 75 veces más selectivo para M1R en relación a los receptores M2, M3, M4 y M5. Entre la nueva generación de antagonistas de M1R, hay tres antagonistas de M1R activos centralmente prometedores, PD150714, y 77-LH-28-1 y espirotramina. Listados de antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos adecuados para la incorporación en composiciones terapéuticas para polineuropatía distal simétrica y/o alodinia táctil se muestran en las Tablas 1-4.
Tabla 1: Clasificación química de antagonistas de M1R y sus estructuras representativas.
- S. IM° Estructura
- Nombre
- rojfífia Muscarínica
- D
- MT7(veneno)
- '-----DFTFtGCAA TCPK AE YRD VINCCGTDKC NK
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Tabla 2: antagonistas de M1R mixtos, es decir compuestos que muestran efectos antagonistas en más de un subtipo
de receptor muscarínico, incluyendo M1.
Tabla 3: antagonistas no M1 muscarínicos selectivos (es decir, selectivos para M2, M3, M4 o M5)
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Tabla 4: Antagonistas muscarínicos no selectivos (estructuras basadas en escopolamina)
- S.N°
- Estructura Nombre Indicación Clínica Via de adminsitración
- a“ CHICHI ‘H--
- 1
- y‘-° Bromuro de ipratropio Asma agudo COPD Inhalación
- HO'1 i N Cinetosis
- 2
- o O .S\ •v- . > V'' Escopolamina Calambres intestianles Oral, IV, transdermlca
- HO"
Las descripciones anteriores de las estructuras químicas en las Tablas 1 a 4 indican que los compuestos que muestran actividad selectiva para M1R requieren características definidas y cambios a las estructuras que podrían hacer a un antagonista selectivo para M1R selectivos para M3R o selectivo para M2R, y viceversa. Por ejemplo, el compuesto 1 en la Tabla 2 y el compuesto 1 en la Tabla 3 pertenecen a la misma clase de fármacos, pero el cambio en el patrón de sustitución en la cadena lateral de piperazina determina la selectividad de M1 frente a M1/M3. Por lo tanto, los compuestos químicos que pertenecen a las estructuras químicas generales anteriores, pero con variaciones estructurales, podrían poseer todavía actividad antagonista selectiva de M1 permitiendo así su uso en polineuropatía simétrica diabética. Por consiguiente, pueden diseñarse fórmulas genéricas que abarquen las características estructurales para los antagonistas, incluyendo aquellas que son compuestos selectivos para M1R y no selectivos para M1R. Las fórmulas adecuadas se ejemplifican por la Fórmula I y la Fórmula II.
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contiene heteroátomos;
R2 puede ser uno de un anillo insaturado de 5 miembros, un anillo insaturado de 6 miembros, o un anillo que contiene heteroátomos;
R3 puede ser uno de un grupo H-piperidinilo, un grupo 2-piperidinilo, un 3-piperdinilo, un grupo 4-piperidinilo, un grupo 2-piperazinilo, o un grupo 3-piperazinilo, ligado mediante un grupo metilo o un grupo etilo o un grupo propilo o grupo butilo. Los grupos piperidinilo o grupos piperazinilo pueden estar ligados adicionalmente a fracciones de metilo, trifluorometilo o etilo.
R4 puede ser un ion de hidrógeno o un ion de cloruro.
R5 puede ser un ion de hidrógeno o un ion de cloruro.
R6 puede ser un ion de hidrógeno o un ion de cloruro.
R7 puede ser un ion de hidrógeno o un ion de cloruro.
X puede ser un grupo metilo o un grupo "NR", es decir un grupo amino primario, un grupo amino secundario, o un grupo amino terciario.
R1 puede ser o
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en donde " -fX‘" " indica el punto de conexión de R1 con la estructura superior en la Fórmula II.
R2 puede ser un ion de hidroxilo o un ion de hidrógeno o una cetona.
R3 puede ser un ion de hidroxilo o un ion de hidrógeno o una cetona.
En una realización, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente comprenden un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos, en una cantidad total por peso de la composición de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 95%. Por ejemplo la cantidad de antagonista de los receptores de
acetilcolina muscarínicos, por peso de la composición farmacéutica puede ser
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente e aproximadamente e aproximadamente e aproximadamente e aproximadamente e aproximadamente e
0,2%, aproximadamente el 0,3%, 0,6%, aproximadamente el 0,7%, 1%, aproximadamente el 1,1%, 1,4%, aproximadamente el 1,5%, 1,8%, aproximadamente el 1,9%, 2,2%, aproximadamente el 2,3%, 2,6%, aproximadamente el 2,7%, 3%, aproximadamente el 3,1%, 3,4%, aproximadamente el 3,5%, 3,8%, aproximadamente el 3,9% 4,2%, aproximadamente el 4,3%, 4,6%, aproximadamente el 4,7%,
aproximadamente el 0,4% aproximadamente el 0,8% aproximadamente el 1,2%, aproximadamente el 1,6%. aproximadamente el 2%, aproximadamente el 2,4%, aproximadamente el 2,8%, aproximadamente el 3,2%, aproximadamente el 3,6%, , aproximadamente el 4%, aproximadamente el 4,4%, aproximadamente el 4,8%,
aproximadamente el 0,1%, aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 0,9%, aproximadamente el 1,3%, aproximadamente el 1,7%, aproximadamente el 2,1 %,
5%, aproximadamente el 5,1%, aproximadamente el 5,2%, 5,4%, aproximadamente el 5,5%, aproximadamente el 5,6%, 5,8%, aproximadamente el 5,9%, aproximadamente el 6%, 6,2%, aproximadamente el 6,3%, aproximadamente el 6,4%,
6,6%, aproximadamente el 6,7%, aproximadamente el 6,8%,
7%, aproximadamente el 7,1%, aproximadamente el 7,2%, 7,4%, aproximadamente el 7,5%, aproximadamente el 7,6%, 7,8%, aproximadamente el 7,9%, aproximadamente el 8%, 8,2%, aproximadamente el 8,3%, aproximadamente el 8,4%,
8,6%, aproximadamente el 8,7%,
9%, aproximadamente el 9,1%,
9,4%, aproximadamente el 9,5%, 9,8%, aproximadamente el 9,9% 12%, aproximadamente el 13%, 16%, aproximadamente el 17%, 20%, aproximadamente el 25%, 40%, aproximadamente el 45%, 60%, aproximadamente el 65%,
aproximadamente el 8,8%, aproximadamente el 9,2%, aproximadamente el 9,6%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 70%,
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
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aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90% o aproximadamente el 95%,
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden el antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos pirenzepina se formulan para administración tópica o alternativamente, para administración transdérmica.
Una composición farmacéutica para la administración tópica puede proporcionarse como, por ejemplo, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, hidrogeles, espráis, aerosoles o aceites. Cuando se formula en una pomada, el ingrediente activo puede emplearse con una base de pomada o parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de aceite en agua o una base de agua en aceite.
Una composición farmacéutica para la administración transdérmica puede proporcionarse como, por ejemplo, un hidrogel que comprende un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos incorporado en una composición de parche adhesivo pretendida para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del sujeto durante un periodo de tiempo prolongado. Una composición de parche adhesivo ejemplar puede comprender una capa monolítica producida mezclando un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos con un adhesivo tipo silicona o alternativamente un adhesivo de acrilato-acetato de vinilo en un solvente ejemplificado por cloruro de metileno, acetato de etilo, miristato de isopropilo y propilenglicol. La mezcla se extrudiría luego sobre una película con respaldo de poliéster a un grosor uniforme de aproximadamente 100 micras o más con un aplicador de películas húmedas de precisión. Se permite que el solvente evapore en un horno de secado y el "parche" resultante se recorta al tamaño apropiado.
El farmacéutico para la administración tópica o alternativamente para la administración transdérmica de un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede incorporar adicionalmente un potenciador de la
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penetración y/o un agente espesante o agente gelificante y/o un emoliente y/o un antioxidante y/o un conservante antimicrobiano y/o un agente emulsionante y/o un solvente miscible en agua y/o un alcohol y/o agua.
De acuerdo con la presente invención, la composición farmacéutica para la administración tópica o la administración transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos comprende uno o más agentes potenciadores de la penetración o co-solventes para la administración transdérmica o tópica. Un potenciador de la penetración es un excipiente que ayuda en la difusión del activo a través del estrato córneo. Muchos potenciadores de la penetración también funcionan como co-solventes que se piensa que aumentan la actividad termodinámica o solubilidad del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos en la composición. Los potenciadores de la penetración también son conocidos como aceleradores, adyuvantes o promotores de la sorción. Un potenciador de la penetración adecuado para su uso en las composiciones farmacéuticas y métodos descritos en la presente debe: (i) ser altamente potente, con un mecanismo específico de acción; (ii) mostrar un inicio de la actividad rápido tras la administración; (iii) tener una duración de acción predecible; (iv) tener solamente efectos no permanentes o reversibles en la piel; (v) ser químicamente estable; (vi) no tener o tener efectos farmacológicos mínimos; (vii) ser física y químicamente compatible con otros componentes de la composición; (viii) ser inodoro; (ix) ser incoloro; (x) ser hipoalergénico; (xi) ser no irritante; (xii) ser no fototóxico; (xiii) ser no comedogénico; (xic) tener un parámetro de solubilidad que se aproxime al de la piel (10,5 cal/cm3); (xv) estar fácilmente disponible; (xvi) ser económico; y (xvii) ser capaz de ser formulado en composiciones farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica de un agente farmacéutico activo.
Pueden usarse varias clases de compuestos químicos, con varios mecanismos de acción, como potenciadores de la penetración. A continuación se exponen ejemplos no limitativos de agentes potenciadores de la penetración, muchos de los cuales son también co-solventes adecuados. Los sulfóxidos, como el dimetilsulfóxido y el decilmetilsulfóxido pueden usarse como agentes potenciadores de la penetración. El dimetilsulfóxido potencia la penetración en parte aumentando la fluidez de lípidos y promoviendo la partición del fármaco. Por el contrario, el decilmetilsulfóxido potencia la penetración reaccionando con proteínas en la piel que cambian la conformación de las proteínas lo que da lugar a la creación de canales acuosos.
Otra clase de potenciadores de la penetración son las alcanonas, como N-heptano, N-octano, N-nonano, N- decano, N-undecano, N-dodecano, N-tridecano, N-tetradecano y N-hexadecano. Se piensa que las alcanonas potencian la penetración de un agente activo alterando el estrato córneo. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los alcoholes alcanólicos, como etanol, propanol, butanol, 2-butanol, pentanol, 2-pentanol, hexanol, octanol, nonanol, decanol y alcohol bencílico. Los alcoholes alcanólicos de bajo peso molecular, es decir, aquellos con 6 o menos carbonos, pueden potenciar la penetración en parte actuando como agentes solubilizantes, mientras que alcoholes más hidrófobos pueden aumentar la difusión extrayendo lípidos del estrato córneo. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los alcoholes grasos, como alcohol oleílico, alcohol caprílico, alcohol decílico, alcohol laurílico, alcohol 2-laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, alcohol estearílico, alcohol oleílico, alcohol linoleílico y alcohol linoleílico. Los polioles, incluyendo propilenglicol, polietilenglicol, etilenglicol, dietilenglicol, trietilenglicol, dipropilenglicol, glicerol, propanodiol, butanodiol, pentanodiol, hexanotriol, monolaurato de propilenglicol y monometiléter de dietilenglicol (transcutol), también pueden potenciar la penetración. Algunso polioles, como el propilenglicol, pueden funcionar como un potenciador de la penetración solvantando alfa-queratina y ocupando los sitios de enlace de hidrógeno, reduciendo de este modo la cantidad de enlace de tejido activo.
Otra clase de potenciadores de la penetración son las amidas, incluyendo urea, dimetilacetamida, dietiltoluamida, dimetilformamida, dimetiloctamida, dimetildecamida y urea cíclica biodegradable (por ejemplo, 1- alquil-4-imidazolin-2-ona). Las amidas tienen varios mecanismos de potenciar la penetración. Por ejemplo, algunas amidas, como la urea aumentan la hidratación del estrato córneo, actúan como queratolíticos y crean canales de difusión hidrófilos. Por el contrario, otras amidas, como la dimetilacetamida y dimetilformamida, aumentan la partición de queratina a concentraciones bajas, a la vez que aumentan la fluidez de lípidos e interrumpen el empaquetado de lípidos a concentraciones más altas. Otra clase de agentes potenciadores de la penetración son derivados de pirrolidona, como 1 -metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, 1 -lauril-2-pirrolidona, 1-metil-4-carboxi-2-pirrolidona, 1 -hexil-4- carboxi-2-pirrolidona, 1 -lauril-4- carboxi-2-pirrolidona, 1-metil-4-metoxicarbonil-2-pirrolidona, 1-hexil-4-metoxicarbonil- 2-pirrolidona, 1-lauril-4-metoxicarbonil-2-pirrolidona, N-metil-pirrolidona, N-ciclohexilpirrolidona, N-dimetilaminopropil- pirrolidona, N-cocoalpirrolidona y N-seboalquilpirrolidona, así como derivados de pirrolidona biodegradables, incluyendo ésteres de ácidos grasos de N-(2-hidroxietil)-2-pirrolidona. En parte, los derivados de pirrolidona potencian la penetración mediante interacciones con la queratina en el estrato córneo y lípidos en la estructura de la piel. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son las amidas cíclicas, incluyendo 1- dodecilazacicloheptano-2-ona también conocido como Azone® (Azone es una marca registrada de Echo Therapuetics Inc., Franklin, MA, USA), 1-geranilazocicloheptan-2-ona, 1-farnesilazacicloheptan-2-ona, 1- geranilgeranilazacicloheptan-2-ona, 1-(3,7-dimetiloctil)-azacicloheptan-2-ona, 1-(3,7,11 -trimetildodecil)
azaciclohaptan-2-ona, 1-geranilazaciclohexano-2-ona, 1-geranilazaciclopentan- 2,5-diona y 1-farnesilazaciclopentan- 2-ona. Las amidas cíclicas, como la Azone®, potencian la penetración de los ingredientes activos en parte afectando a la estructura de lípidos del estrato córneo, aumentado la partición y aumentando la fluidez de la membrana. Clases adicionales de potenciadores de la penetración incluyen dietanolamina, trietanolamina y hexametilenurauramida y sus derivados.
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Potenciadores de la penetración adicionales incluyen ácidos grasos lineales, como ácido octanoico, ácido linoleico, ácido valérico, ácido heptanoico, ácido pelagónico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido caprílico. Los ácidos grasos lineales potencian la penetración en parte mediante la perturbación selectiva de las bicapas lipídicas intercelulares. Adicionalmente, algunos ácidos grasos lineales, como el ácido oleico, potencian la penetración disminuyendo las temperaturas de transición de fase del lípido, aumentando de este modo la libertad de movimiento o fluidez de los lípidos. Los ácidos grasos ramificados, incluyendo el ácido isovalérico, ácido neopentanoico, ácido neoheptanoico, ácido nonanoico, ácido trimetilhexónico, ácido neodecanoico y ácido isosteárico, son una clase adicional de potenciadores de la penetración. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los ésteres de ácidos grasos alifáticos, como oleato de etilo, n- butirato de isopropilo, n-hexanoato de isopropilo, n-decanoato de isopropilo, miristato de isopropilo ("IPM"), palmitato de isopropilo y miristato de octildodecilo. Los ésteres de ácidos grasos alifáticos potencian la penetración aumentando la difusividad en el estrato córneo y/o el coeficiente de partición. Adicionalmente, ciertos ésteres de ácidos grasos alifáticos, como el IPM, potencian la penetración actuando directamente en el estrato córneo e impregnando las bicapas de liposoma aumentando de este modo la fluidez. Los ésteres de ácidos grasos de alquilo, como acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de metilo, valerato de metilo, propionato de metilo, sebacato de dietilo, oleato de etilo, estearato de butilo y laurato de metilo, pueden actuar como potenciadores de la penetración. Los ésteres de ácidos grasos de alquilo potencian la penetración en parte aumentando la fluidez de los lípidos.
Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los surfactantes aniónicos, incluyendo laurato de sodio, lauril sulfato de sodio y octil sulfato de sodio. Los surfactantes aniónicos potencian la penetración de los agentes activos alterando la función de barreara del estrato córneo y permitiendo la eliminación de los agentes solubles en agua que actúan normalmente como plastificantes. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los surfactantes catiónicos, como bromuro de cetiltrimetilamonio, tetradeciltrimetilamonio, bromuro de octiltrimetilamonio, cloruro de benzalconio, cloruro de octadeciltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de dodeciltrimetilamonio y cloruro de hexadeciltrimetilamonio. Los surfactantes catiónicos potencian la penetración adsorbiendo en, interactuando con, interfaces de las membranas biológicas, dando resultado a daño den la piel. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los surfactantes zwitteriónicos, como hexadecil trimetil amoniopropano sulfonato, oleil betaína, cocamidopropil hidroxisultaína y cocamidopropil betaína. Los surfactantes no iónicos ejemplificados por Polyxamer 231, Polyxamer 182, Polyxamer 184, Polysorbate 20, Polysorbate 60, Brij® 30, Brij® 93, Brij® 96, Brij® 99 (Brij es una marca registrada de Uniqema Americas LLC, Wilmington, DE, USA), Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 80, Span® 85 (Span es una marca registrada de Uniqema Americas LLC, Wilmington, DE, USA), Tween® 20, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 80 (Tween es una marca registrada de Uniqema Americas LLC, Wilmington, DE, USA), Myrj 45, Myrj 51, Myrj 52, and Miglyol® 840 (Miglyol es una marca registrada de Sasol Germany GMBH Corp, Hamburg, Rep. Fed. de Alemania), y similares. Los surfactantes no iónicos potencian la penetración en parte emulsionando el sebo y potenciando la actividad termodinámica o solubilidad del activo.
Otra clase de potenciadores de la penetración aumentan la actividad termodinámica o solubilidad del activo, que incluyen, pero no están limitados a, n-octanol, oleato de sodio, D-limoneno, monooleína, cineol, oleil oleato y miristato de isoproprilo.
Otros potenciadores de la penetración son las sales biliares, como colato de sodio, sales de sodio de ácido taurocólico, ácidos glicólicos y ácidos desoxicólicos. También se ha descubierto que la lecitina tiene características potenciadoras de la penetración. Una clase adicional de potenciadores de la penetración son los terpenos, que incluyen hidrocarburos como d-limoneno, alfa-pineno y betacareno; alcoholes, como alfa-terpineol, terpinen-4-ol y carvol; cetonas, como ascarvona, pulegona, piperitona y mentona; oxidos, como óxido de ciclohexeno, óxido de limoneno, óxido de alfa-pineno, óxido de ciclopenteno y 1,8-cineol; y aceites como ylang ylang, anís, chenopodium y eucalipto. Los terpenos potencian la penetración en parte interrumpiendo la bicapa lipídica intercelular para aumentar la difusividad del activo y abriendo las vías polares dentro y a través del estrato córneo. Los ácidos orgánicos como el ácido salicílico y salicilatos (incluyendo sus derivados de metilo, etilo y propilglicol), ácido cítrico y ácido succínico, son potenciadores de la penetración. Otra clase de potenciadores de la penetración con las ciclodextrinas incluyendo 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina y 2,6-dimetil-beta-ciclodextrina. Las ciclodextrinas potencian la penetración de los agentes activos formando complejos de inclusión con activos lipófilos y aumentando su solubilidad en soluciones acuosas.
El agente(s) potenciador(es) de la penetración y/o co-solvente(s) está(n) presentes en la composición farmacéutica para la administración tópica o la administración transdérmica de un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos en una cantidad suficiente para proporcionar el nivel deseado de transporte del fármaco a través del estrato córneo y la epidermis o para aumentar la actividad termodinámica o solubilidad del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina. El uno o más potenciadores de la penetración y/o co-solventes farmacéuticamente aceptables pueden estar presentes en una cantidad total por peso de aproximadamente el 0,1%, aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,3%, aproximadamente el 0,4%, aproximadamente el 0,5%,
aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 0,7%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 0,9%,
aproximadamente el 1,0%, aproximadamente el 1,1%, aproximadamente el 1,2%, aproximadamente el 1,3%,
aproximadamente el 1,4%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el 1,6%, aproximadamente el 1,7%,
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- aproximadamente
- el 1,8%, aproximadamente el 1,9%, aproximadamente el 2,0%, aproximadamente el 2,1%
- aproximadamente
- el 2,2%, aproximadamente el 2,3%, aproximadamente el 2,4%, aproximadamente el 2,5%
- aproximadamente
- el 2,6%, aproximadamente el 2,7%, aproximadamente el 2,8%, aproximadamente el 2,9%
- aproximadamente
- el 3,0%, aproximadamente el 3,1%, aproximadamente el 3,2%, aproximadamente el 3,3%
- aproximadamente
- el 3,4%, aproximadamente el 3,5%, aproximadamente el 3,6%, aproximadamente el 3,7%
- aproximadamente
- el 3,8%, aproximadamente el 3,9%, aproximadamente el 4,0%, aproximadamente el 4,1%
- aproximadamente
- el 4,2%, aproximadamente el 4,3%, aproximadamente el 4,4%, aproximadamente el 4,5%
- aproximadamente
- el 4,6%, aproximadamente el 4,7%, aproximadamente el 4,8%, aproximadamente el 4,9%
- aproximadamente
- el 5,0%, aproximadamente el 5,1%, aproximadamente el 5,2%, aproximadamente el 5,3%
- aproximadamente
- el 5,4%, aproximadamente el 5,5%, aproximadamente el 5,6%, aproximadamente el 5,7%
- aproximadamente
- el 5,8%, aproximadamente el 5,9%, aproximadamente el 6,0%, aproximadamente el 6,1%
- aproximadamente
- el 6,2%, aproximadamente el 6,3%, aproximadamente el 6,4%, aproximadamente el 6,5%
- aproximadamente
- el 6,6%, aproximadamente el 6,7%, aproximadamente el 6,8%, aproximadamente el 6,9%
- aproximadamente
- el 7,0%, aproximadamente el 7,1%, aproximadamente el 7,2%, aproximadamente el 7,3%
- aproximadamente
- el 7,4%, aproximadamente el 7,5%, aproximadamente el 7,6%, aproximadamente el 7,7%
- aproximadamente
- el 7,8%, aproximadamente el 7,9%, aproximadamente el 8,0%, aproximadamente e sl 8,1 %
- aproximadamente
- el 8,2%, aproximadamente el 8,3%, aproximadamente el 8,4%, aproximadamente el 8,5%
- aproximadamente
- el 8,6%, aproximadamente el 8,7%, aproximadamente el 8,8%, aproximadamente el 8,9%
- aproximadamente
- el 9,0%, aproximadamente el 9,1%, aproximadamente el 9,2%, aproximadamente el 9,3%
- aproximadamente
- el 9,4%, aproximadamente el 9,5%, aproximadamente el 9,6%, aproximadamente el 9,7%
aproximadamente e
9,8%
aproximadamente el 9,9% o aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%,
- aproximadamente
- el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%
- aproximadamente
- el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%
- aproximadamente
- el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%
- aproximadamente
- el 24%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 27%
- aproximadamente
- el 28%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 31%
- aproximadamente
- el 32%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 34%, aproximadamente el 35%
- aproximadamente
- el 36%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 38%, aproximadamente el 39%
- aproximadamente
- el 40%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 42%, aproximadamente el 43%
- aproximadamente
- el 44%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 46%, aproximadamente el 47%
- aproximadamente
- el 48%, aproximadamente el 49%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 51%
- aproximadamente
- el 52%, aproximadamente el 53%, aproximadamente el 54%, aproximadamente el 55%
- aproximadamente
- el 56%, aproximadamente el 57%, aproximadamente el 58%, aproximadamente el 59%
- aproximadamente
- el 60%, aproximadamente el 61%, aproximadamente el 62%, aproximadamente el 63%
- aproximadamente
- el 64%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 66%, aproximadamente el 67%
- aproximadamente
- el 68%, aproximadamente el 69%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 71%
- aproximadamente
- el 72%, aproximadamente el 73%, aproximadamente el 74%, aproximadamente el 75%
- aproximadamente
- el 76%, aproximadamente el 77%, aproximadamente el 78%, aproximadamente el 79%
- aproximadamente
- el 80%, aproximadamente el 81%, aproximadamente el 82%, aproximadamente el 83%
- aproximadamente
- el 84%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 86%, aproximadamente el 87%
- aproximadamente
- el 88%, aproximadamente el 89%, aproximadamente el 90%, aproximadamente e l 91 %
aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, o aproximadamente el 95%,
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un agente espesante o gelificante adecuado para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente para aumentar la viscosidad de la composición. Los agentes adecuados (también conocidos como agentes gelificantes) se ejemplifican por polímeros aniónicos neutralizados o carbómeros neutralizados, como ácido poliacrílico, carboxipolimetileno, carboximetilcelulosa y similares, incluidos los derivados de Ultrez 10, polímeros de Carbopol® como Carbopol® Carbopol® 940, Carbopol® 941, Carbopol® 954, Carbopol® 980, Carbopol® 981, Carbopol® ETD 2001, Carbopol® EZ-2 y Carbopol® EZ-3.(Carbopol es una marca registrada de Lubrizol Advanced Materials Inc., Cleveland, OH, USA). Como se usa en la presente, un "carbómero neutralizado" es un polímero de alto peso molecular, sintético, compuesto principalmente de un ácido poliacrílico neutralizado. Además, cuando se añade una base para neutralizar una solución de carbómero, aumenta la viscosidad de la solución. También son adecuados otros agentes espesantes poliméricos, como los emulsionantes poliméricos Pemulen®, policarbofilos Noveon® (Pemulen y Noveon son marcas registradas de Hercules Inc., Wilmington, DE, USA). Agentes espesantes, potenciadores y adyuvantes adicionales pueden encontrarse generalmente en Remington's The Science and Practice of Pharmacy así como en Handbook of Pharmaceutical Excipients, Arthur H. Kibbe ed. 2000. Alternativamente, la composición farmacéutica para la administración tópica o la aplicación transdérmica de del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un precursor de agente espesante de polímero aniónico, como un carbómero, que se ha combinado con un neutralizante en una cantidad suficiente para formar una composición de gel o tipo gel con una viscosidad mayor de 1000 cps como se mide por un Viscómetro Brookfield RV DVII+ con un agitador CPE-52, torsión mayor del 10% y la temperatura mantenida a 25 °C. Alternativamente, el precursor del agente espesante de polímero aniónico puede combinarse con un neutralizante seleccionado del grupo que consiste de: hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico, arginina,
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aminometil propanol, tetrahidroxipropil etilendiamina, trietanolamina ("TEA"), trometamina, PEG-15-cocamina, diisopropanolamina y triisopropanolamina, o combinaciones de los mismos en una cantidad suficiente para neutralizar el precursor del agente espesante de polímero aniónico para formar una composición de gel o tipo gel en el curso de la formación de la composición. Los agentes espesantes o agentes gelificantes están presentes en una cantidad suficiente para proporcionar las propiedades reológicas deseadas de la composición, que incluyen tener una viscosidad suficiente para formar una composición de gel o tipo gel que pueda aplicarse a la piel de un mamífero. El agente espesante o agente gelificante está presente en una cantidad total por peso de
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
0,1%, aproximadamente el 0,25%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 1,25%, aproximadamente el
2,0%, aproximadamente el 2,25%, 3,0%, aproximadamente el 3,25%, 4,0%, aproximadamente el 4,25%, 5,0%, aproximadamente el 5,25%, 6,0%, aproximadamente el 6,25%, 7,0%, aproximadamente el 7,25%, 8,0%, aproximadamente el 8,25%, 9,0%, aproximadamente el 9,25%, 10%, aproximadamente el 11%, 12,5%, aproximadamente el 13%,
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
0,5%, aproximadamente el 0,75%,
I, 5%, aproximadamente el 1,75%, 2,5%, aproximadamente el 2,75%, 3,5%, aproximadamente el 3,75%, 4,5%, aproximadamente el 4,75%, 5,5%, aproximadamente el 5,75%, 6,5%, aproximadamente el 6,75%, 7,5%, aproximadamente el 7,75%, 8,5%, aproximadamente el 8,75%, 9,5%, aproximadamente el 9,75%,
II, 5%, aproximadamente el 12%, 13,5%, aproximadamente el 14%,
aproximadamente el 14,5% o aproximadamente el 15%.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un emoliente. Los emolientes adecuados se ejemplifican por aceite mineral, mezclas de aceite mineral y alcoholes de lanolina, alcohol cetílico, alcohol cetoestearílico, vaselina, vaselina y alcoholes de lanolina, cera de ésteres de cetilo, colesterol, glicerina, monoestearato de glicerilo, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, lecitina, caproato de alilo, extracto de althea officinalis, alcohol araquidílico, argobase EUC, butilenglicol, dicaprilato/dicaprato, acacia, alantoína, carragenano, cetildimeticona, ciclometicona, succinato de dietilo, behenato de dihidroabietilo, adipato de dioctilo, laurato de etilo, palmitato de etilo, estearato de etilo, laurato de isoamilo, octanoato, PEG-75, lanolina, laurato de sorbitán, aceite de nuez, aceite de germen de trigo, almendra súper refinada, sésamo súper refinado, soja súper refinada, palmitato de octilo, triglicéridos caprílicos/cápricos y cocoato de glicerilo. Un emoliente, si lo hay, está presente en las composiciones descritas en la presente en una cantidad por peso de la composición de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 25%, o de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15%. A modo de ilustración, uno o más emolientes están presentes en una cantidad total de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%,
aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%,
aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%,
aproximadamente el 24%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 27%,
aproximadamente el 28%, aproximadamente el 29%, o aproximadamente el 30%, por peso.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un antioxidantes. Los antioxidantes adecuados están ejemplificados por ácido cítrico, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido ascórbico, glutatión, retinol, a-tocoferol, p-caroteno, a-caroteno, ubiquinona, hidroxianisol butilado, ácido etilendiaminotetraacético, selenio, zinc, lignano, ácido úrico, ácido lipoico y N -acetilcisteína. Un antioxidantes, si lo hay, está presente en las composiciones descritas en la presente en una cantidad total seleccionada del intervalo de aproximadamente el 0,025% a aproximadamente el 1,0% por peso.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un conservante antimicrobiano. Los conservantes antimicrobianos ilustrativos incluyen ácidos, incluyendo pero no limitado a, ácido benzoico, ácido fenólico, ácidos sórbicos, alcoholes, cloruro de bencetonio, bronopol, butilparabeno, cetrimida, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cresol, etilparabeno, imidaurea, metilparabeno, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, acetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, sorbato de potasio, propilparabeno, propionato de sodio o timerosal. El conservante antimicrobiano, si lo hay, está presente en una cantidad por peso de la composición de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 3%, o de aproximadamente el 0,3% a aproximadamente el 2%, por ejemplo aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,4%, aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 1,2%, aproximadamente el 1,4%, aproximadamente el 1,6%, aproximadamente el 1,8%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 2,2%, aproximadamente el 2,4%, aproximadamente el 2,6%, aproximadamente el 2,8%, aproximadamente el 3,0%, aproximadamente el 3,2%, aproximadamente el 3,4%, aproximadamente el 3,6%, aproximadamente el 3,8%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 4,2%,
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aproximadamente el 4,4%, aproximadamente el 4,6%, aproximadamente el 4,8%, o aproximadamente el 5%.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender uno o más agentes emulsionantes. El término "agente emulsionante" se refiere a un agente capaz de disminuir la tensión superficial entre una fase no polar y una polar e incluye agentes auto emulsionantes. Los agentes emulsionantes adecuados puede venir en cualquier clase de agente emulsionante farmacéuticamente aceptable ejemplificados por carbohidratos, proteínas, alcoholes de alto peso molecular, agentes humectantes, ceras y sólidos finamente divididos. El agente emulsionante opcional, si lo hay, está presente en una composición en una cantidad total de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 25%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 20%, o de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% por peso de la composición. Ilustrativamente, uno o más agentes emulsionantes están presentes en una cantidad total por peso de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%,
aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%,
aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%,
aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%,
aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%,
aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 24%, o aproximadamente el 25%.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender un solvente miscible en agua ejemplificado por propilenglicol. Un solvente miscible en agua adecuado se refiere a cualquier solvente que es aceptable para su uso en una composición farmacéutica y es miscible con agua. Si lo hay, el solvente miscible en agua está presente en una composición en una cantidad total de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 40%, o de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 25% por peso de la composición.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender uno o más alcoholes. En una realización adicional, el alcohol es un alcohol inferior. Como se usa en la presente, el término "alcohol inferior", solo o en combinación, significa una fracción de alcohol de cadena lineal o cadena ramificada que contiene de uno a aproximadamente seis átomos de carbono. En una realización el alcohol inferior contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, y en otra realización el alcohol inferior contiene dos o tres átomos de carbono. Ejemplos de tales fracciones de alcoholes incluyen metanol, etanol, etanol USP (es decir, 95% v/v), n- propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol y terc-butanol. Como se usa en la presente, el término "etanol- se refiere a C2H5OH. Puede usarse como alcohol deshidratado USP, alcohol USP o en cualquier forma común incluyendo en combinación con varias cantidades de agua. Si lo hay, el alcohol está presente en una cantidad suficiente para formar una composición que es adecuada para el contacto con un mamífero. Por ejemplo, en una cantidad total por peso de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%,
aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%,
aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%,
aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%,
aproximadamente el 24%, aproximadamente el 25%.
De acuerdo con otro aspecto, la composición farmacéutica para administración tópica o para aplicación transdérmica del antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede comprender agua separadamente en una cantidad suficiente para lograr el peso deseado de la composición farmacéutica.
El antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos comprende
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
0,2%, aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 1,4%, aproximadamente el 1,8%, aproximadamente el 2,2%, aproximadamente el 2,6%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 3,4%, aproximadamente el 3,8%, aproximadamente el 4,2%, aproximadamente el 4,6%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el
0,3%, aproximadamente el 0,4%, 0,7%, aproximadamente el 0,8%, 1,1%, aproximadamente el 1,2%, 1,5%, aproximadamente el 1,6%, 1,9%, aproximadamente el 2%, 2,3%, aproximadamente el 2,4%, 2,7%, aproximadamente el 2,8%, 3,1%, aproximadamente el 3,2%, 3,5%, aproximadamente el 3,6%, 3,9%, aproximadamente el 4%, 4,3%, aproximadamente el 4,4%, 4,7%, aproximadamente el 4,8%, 5,1%, aproximadamente el 5,2%,
aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
0,1%,
0,5%,
0,9%,
1,3%,
1,7%,
2,1%,
2,5%,
2,9%,
3,3%,
3,7%,
4,1%,
4,5%,
4,9%,
5,3%,
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aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el
5,4%, aproximadamente el 5,8%, aproximadamente el 6,2%, aproximadamente el 6,6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 7,4%, aproximadamente el 7,8%, aproximadamente el 8,2%, aproximadamente el 8,6%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 9,4%, aproximadamente el 9,8%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 24%, aproximadamente el 28%, aproximadamente el 32%, aproximadamente el 36%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 44%, aproximadamente el 48%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el
5,5%, aproximadamente el 5,6% 5,9%, aproximadamente el 6%, 6,3%, aproximadamente el 6,4% 6,7%, aproximadamente el 6,8% 7,1%, aproximadamente el 7,2%, 7,5%, aproximadamente el 7,6% 7,9%, aproximadamente el 8%, 8,3%, aproximadamente el 8,7%, aproximadamente el 9,1%, aproximadamente el 9,5%, aproximadamente el 9,9%, aproximadamente el
13%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 49%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el
8,4%,
8,8%,
9,2%,
9,6%,
10%,
14%,
18%,
22%,
26%,
30%,
34%,
38%,
42%,
46%,
50%,
70%,
, aproximadamente el aproximadamente el , aproximadamente el , aproximadamente el aproximadamente el , aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente
5,7%, 6,1%, 6,5%, 6,9%, 7,3%, 7,7%, 8,1 %, 8,5%, 8,9%, 9,3%, 9,7%, 11%, 15%, 19%, 23%, 27%, 31%, 35%, 39%, 43%, 47%, 55%, 75%,
80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90% o aproximadamente el 95% por
peso de la composición farmacéutica para aplicación tópica o aplicación transdérmica.
Otro aspecto de la presente divulgación pertenece a composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos formulado para la administración parenteral por inyección. Las composiciones farmacéuticas inyectables de la presente invención comprenden una solución portadora adecuada ejemplificada por agua estéril, solución salina, y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las soluciones tamponadas adecuadas se ejemplifican por solución de dextrosa de Ringer y solución lactada de de Ringer. La solución portadora puede comprender en una cantidad total por peso de aproximadamente el 0,1%,
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
- el
- 0,2%, aproximadamente el 0,3%, aproximadamente el 0,4%, aproximadamente el 0,5%
- el
- 0,6%, aproximadamente el 0,7%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 0,9%
- el
- 1,0%, aproximadamente el 1,1%, aproximadamente el 1,2%, aproximadamente el 1,3%
- el
- 1,4%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el 1,6%, aproximadamente el 1,7%
- el
- 1,8%, aproximadamente el 1,9%, aproximadamente el 2,0%, aproximadamente el 2,1%
- el
- 2,2%, aproximadamente el 2,3%, aproximadamente el 2,4%, aproximadamente el 2,5%
- el
- 2,6%, aproximadamente el 2,7%, aproximadamente el 2,8%, aproximadamente el 2,9%
- el
- 3,0%, aproximadamente el 3,1%, aproximadamente el 3,2%, aproximadamente el 3,3%
- el
- 3,4%, aproximadamente el 3,5%, aproximadamente el 3,6%, aproximadamente el 3,7%
- el
- 3,8%, aproximadamente el 3,9%, aproximadamente el 4,0%, aproximadamente el 4,1%
- el
- 4,2%, aproximadamente el 4,3%, aproximadamente el 4,4%, aproximadamente el 4,5%
- el
- 4,6%, aproximadamente el 4,7%, aproximadamente el 4,8%, aproximadamente el 4,9%
- el
- 5,0%, aproximadamente el 5,1%, aproximadamente el 5,2%, aproximadamente el 5,3%
- el
- 5,4%, aproximadamente el 5,5%, aproximadamente el 5,6%, aproximadamente el 5,7%
- el
- 5,8%, aproximadamente el 5,9%, aproximadamente el 6,0%, aproximadamente el 6,1%
- el
- 6,2%, aproximadamente el 6,3%, aproximadamente el 6,4%, aproximadamente el 6,5%
- el
- 6,6%, aproximadamente el 6,7%, aproximadamente el 6,8%, aproximadamente el 6,9%
- el
- 7,0%, aproximadamente el 7,1%, aproximadamente el 7,2%, aproximadamente el 7,3%
- el
- 7,4%, aproximadamente el 7,5%, aproximadamente el 7,6%, aproximadamente el 7,7%
- el
- 7,8%, aproximadamente el 7,9%, aproximadamente el 8,0%, aproximadamente el 8,1%
- el
- 8,2%, aproximadamente el 8,3%, aproximadamente el 8,4%, aproximadamente el 8,5%
- el
- 8,6%, aproximadamente el 8,7%, aproximadamente el 8,8%, aproximadamente el 8,9%
- el
- 9,0%, aproximadamente el 9,1%, aproximadamente el 9,2%, aproximadamente el 9,3%
- el
- 9,4%, aproximadamente el 9,5%, aproximadamente el 9,6%, aproximadamente el 9,7%
- el
- 9,8%, aproximadamente el 9,9% o aproximadamente el 10% aproximadamente el 11%
- el
- 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%
- el
- 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%
- el
- 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%
- el
- 24%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 27%
- el
- 28%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 31%
- el
- 32%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 34%, aproximadamente el 35%
- el
- 36%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 38%, aproximadamente el 39%
- el
- 40%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 42%, aproximadamente el 43%
5
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40
45
50
55
60
65
- aproximadamente
- el 44%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 46%, aproximadamente el 47%
- aproximadamente
- el 48%, aproximadamente el 49%, aproximadamente el 50%, aproximadamente e l 51 %
- aproximadamente
- el 52%, aproximadamente el 53%, aproximadamente el 54%, aproximadamente el 55%
- aproximadamente
- el 56%, aproximadamente el 57%, aproximadamente el 58%, aproximadamente el 59%
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- el 60%, aproximadamente el 61%, aproximadamente el 62%, aproximadamente el 63%
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- el 64%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 66%, aproximadamente el 67%
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- el 68%, aproximadamente el 69%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 71%.
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- el 76%, aproximadamente el 77%, aproximadamente el 78%, aproximadamente el 79%
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- el 88%, aproximadamente el 89%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%
aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, o aproximadamente el 95%.
De acuerdo con un aspecto, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden incorporar adicionalmente uno o más solventes no acuosos ejemplificados por propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables ejemplificados por oleato de etilo.
De acuerdo con otro aspecto, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden incorporar adicionalmente uno o más de agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y similares.
Las composiciones farmacéuticas inyectables pueden presentarse en contenedores de dosis unitarias o multidosis ejemplificadas por ampollas y viales sellados. Las composiciones farmacéuticas inyectables pueden almacenarse en una condición congelada en seco (liofilizada) que requiere la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, solución salina estéril para inyecciones, inmediatamente antes del uso.
Otro aspecto de la presente divulgación pertenece a composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos formulado para la administración oral. Las composiciones farmacéuticas orales pueden proporcionarse como cápsulas o comprimidos; como polvos o gránulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos). Los comprimidos o cápsulas de gelatina dura pueden comprender, por ejemplo, lactosa, almidón o derivados de los mismos, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico y sales de los mismos. Las cápsulas de gelatina blanda pueden comprender, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, semisólidos, o polioles líquidos, etc. Las soluciones y jarabes pueden comprender, por ejemplo, agua, polioles y azúcares. El antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos puede estar recubierto con o mezclado con un material (por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo) que retrasa la disgregación o afecta a la absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal. Así, por ejemplo, la liberación sostenida de un agente activo puede lograrse durante muchas horas y, si es necesario, el agente activo puede protegerse de ser degradado dentro del tracto gastrointestinal. Tomando ventaja de varios pH y condiciones enzimáticas a lo largo del tracto gastrointestinal, las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse para facilitar la liberación de un agente activo en una localización gastrointestinal particular.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se usan en una "cantidad farmacológicamente efectiva". Una "cantidad farmacológicamente efectiva" es la cantidad de antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos en la composición que es suficiente para administrar una cantidad terapéutica del agente activo durante el intervalo de dosificación en el que se administra la composición farmacéutica. Por consiguiente, la cantidad de composición farmacéutica administrada para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista(s) de los receptores de acetilcolina muscarínicos es de aproximadamente el 0,01 g, aproximadamente el 0,05 g, aproximadamente el 0,1 g, aproximadamente el 0,2 g, aproximadamente el 0,3 g, aproximadamente el 0,4 g, aproximadamente el 0,5 g, aproximadamente el 0,6 g, aproximadamente el 0,7 g, aproximadamente el 0,8 g,
aproximadamente el 0,9 g, aproximadamente el 1 g, aproximadamente el 1,1 g, aproximadamente el 1,2 g,
aproximadamente el 1,3 g, aproximadamente el 1,4 g, aproximadamente el 1,5 g, aproximadamente el 1,6 g,
aproximadamente el 1,7 g, aproximadamente el 1,8 g, aproximadamente el 1,9 g, aproximadamente el 2 g, aproximadamente el 2,1 g, aproximadamente el 2,2 g, aproximadamente el 2,3 g, aproximadamente el 2,4 g,
aproximadamente el 2,5 g, aproximadamente el 2,6 g, aproximadamente el 2,7 g, aproximadamente el 2,8 g,
aproximadamente el 2,9 g, aproximadamente el 3 g, aproximadamente el 3,1 g, aproximadamente el 3,2 g,
aproximadamente el 3,3 g, aproximadamente el 3,4 g, aproximadamente el 3,5 g, aproximadamente el 3,6 g,
aproximadamente el 3,7 g, aproximadamente el 3,8 g, aproximadamente el 3,9 g, aproximadamente el 4 g, aproximadamente el 4,1 g, aproximadamente el 4,2 g, aproximadamente el 4,3 g, aproximadamente el 4,4 g,
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aproximadamente el 5,3 g, aproximadamente el 5,4 g, aproximadamente el 5,5 g, aproximadamente el 5,6 g,
aproximadamente el 5,7 g, aproximadamente el 5,8 g, aproximadamente el 5,9 g, aproximadamente el 6 g, aproximadamente el 6,1 g, aproximadamente el 6,2 g, aproximadamente el 6,3 g, aproximadamente el 6,4 g,
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aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el iroximadamente el 9,8
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7.4 g, aproximadamente el 7,5 g, aproximadamente el 7,6 7,8 g, aproximadamente el 7,9 g, aproximadamente el 8 8,2 g, aproximadamente el 8,3 g, aproximadamente el 8,4 8,6 g, aproximadamente el 8,7 g, aproximadamente el 8,8 9 g, aproximadamente el 9,1 g, aproximadamente el 9,2
9.4 g, aproximadamente el 9,5 g, aproximadamente el 9,6 g, aproximadamente el 9,9 g o aproximadamente el 10 g.
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Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir más completamente la invención y se presentan para propósitos ilustrativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Efectos de la pirenzepina en el crecimiento de las neuritas de neuronas extirpadas en un modelo de ratas con diabetes tipo 2
Se aislaron neuronas sensoriales de DRG cervicales, torácicos y lumbares de una rata diabética ZDF macho adulta de 3-4 meses de edad (modelo de diabetes tipo 2) y se disociaron usando un método basado en las enseñanzas de Fernyhough et al. (1993, Brain Res. 607:117-124), Gardiner et al. (2005, Mol. Cell Neurosci. 28:229- 240), y Huang et al. (2003, Diabetes 52:2129-2136). Brevemente, se retiraron los DRG de todos los niveles espinales, se recortaron sus raíces, y luego las células se disociaron químicamente en 0,125% de colagenasa (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ,, USA) en medio nutriente F12 (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Canadá) durante 1,5 horas a 37° C. Los ganglios se disociaron luego mecánicamente por tratamiento con 0,05% de tripsina (Worthington Biochemical Corp.) en medio nutriente F12, seguido por trituración con una pipeta de vidrio. La suspensión celular resultante se centrifugó luego a 600 rpm durante 5 min a través de un amortiguador de 15% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON, Canadá); este procedimiento eliminó mucho del desecho celular y dio lugar a un pellet neuronalmente enriquecido de neuronas disociadas. Las células neuronales se colocaron en placas sobre platos de plástico de 48 o 96 pocillos NUNC recubiertos de poli-L- ornitina-laminina con fondos de vidrio ópticamente claros en medio F12 libre de suero y libre de insulina en presencia de aditivos de N2 modificados (que no contenían insulina) a 37° C en una incubadora humidificada con 95% de aire/5% de CO2. Todos los cultivos se expusieron las siguientes condiciones adicionales: 10mM de D-glucosa, 0,1 nM de insulina, 0,3 ng/ml de NGF, 1 ng/ml de NT-3 y 5ng/ml de GDNF (todos obtenidos de Sigma-Aldrich Canada Ltd.). Tras colocarlas en placas, las neuronas se trataron inmediatamente con dosificaciones de pirenzepina-HCl que variaban de 0 a 10 pM. Se evaluó luego el crecimiento de neuritas al de 24 horas como se ha descrito anteriormente por Fernyhough et al. (1993) y Gardiner et al. (2005). Los datos en la Figura 1 muestran que las dosificaciones crecientes de 0,1, ,5, 1,0 y 10,0 pM de pirenzepina-HCl aumentaron progresivamente el crecimiento de neuritas de las neuronas extirpadas de un modelo de diabetes tipo 2.
Ejemplo 2: Efectos de antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos seleccionados en el crecimiento de neuritas de neuronas extirpadas de una rata normal
Se aislaron neuronas sensoriales de DRG cervicales, torácicos y lumbares de una rata Sprague Dawley macho adulta no diabética de 3-4 meses de edad y se disociaron usando el método descrito en el Ejemplo 1. Las células neuronales se colocaron en placas sobre platos de plástico de 48 o 96 pocillos NUNC recubiertos de poli-L- ornitina-laminina con fondos de vidrio ópticamente claros en medio F12 libre de suero y libre de insulina en presencia de aditivos de N2 modificados (que no contenían insulina) a 37° C en una incubadora humidificada con 95% de aire/5% de CO2. Todos los cultivos se expusieron a las siguientes condiciones adicionales: 10mM de D-glucosa, 0,1 nM de insulina, 0,3 ng/ml de NGF, 1 ng/ml de NT-3 y 5 ng/ml de GDNF (todos obtenidos de Sigma-Aldrich Canada Ltd.). Tras colocarlas en placas, las neuronas se expusieron a estas condiciones y se trataron inmediatamente con uno de los tres siguientes antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos: (A) dosificaciones de pirenzepina-HCl que varían de 0 a 10 pM, (B) dosificaciones de telenzepina-2HCl que varían de de 0 a 10 pM, y (C) dosificaciones de atropina que varían de 0 a 1,0 pM. Se evaluó luego el crecimiento de neuritas al de 24 horas. Los datos en la Fig. 2(A) muestran que la dosificación de pirenzepina más baja de 0,01 pM más que triplicó el crecimiento de neuritas de neuronas extirpadas de un modelo no diabético, y que las dosificaciones de pirenzepina crecientes de 0,1, 1,0 y 10,0 pM no aumentaron adicionalmente las tasas de crecimiento de neuritas. Los datos en la Fig. 2(B) muestran que la dosificación de telenzepina más baja de 0,01 pM más que doblo el crecimiento de neuritas de las neuronas extirpadas de un modelo diabético, y que las dosificaciones de 0,1 pM y la de 10,0 pM triplicaron las tasas de crecimiento de neuritas. Los datos en la Fig. 2(C) muestran que la dosificación de atropina más baja de 0,01 pM más que triplicó el crecimiento de neuritas de las neuronas extirpadas de un modelo no diabético, y que las dosificaciones de 0,1 pM y la de 10,0 pM no aumentaron adicionalmente las tasas de crecimiento de neuritas.
Ejemplo 3: Efectos de concentraciones bajas de dos antagonistas de M1R selectivos en el crecimiento de neuritas de neuronas extirpadas en una rata normal
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Se aislaron neuronas sensoriales de DRG cervicales, torácicos y lumbares de una rata Sprague Dawley macho adulta de 3-4 meses de edad y se disociaron usando el método descrito en el Ejemplo 1, y luego se cultivaron durante 24 horas en medio F12 libre de suero y libre de insulina en presencia de aditivos de N2 modificados. Después de colocarse en placas, las neuronas se trataron inmediatamente con o: (A) dosificaciones de pirenzepina-HCl que variaban de 0 a 0,1 pM (diamantes sólidos) o (B) un agente antimuscarínico nuevo con nombre en código "VU255035" (cuadrados sólidos). El VU0255035 [N-(3-oxo-3-(4-(piridina-4-il)piperazin-1-il)propil)-benzo[ c][1,2,5]tiadiazol-4 sulfonamida] es un antagonista específico de M1R nuevo (Sheffler et al., 2009, Molecular Pharmacology 76: 356-368). El enlace de radioligando de equilibrio y estudios funcionales demostraron una selectividad mayor de 75 veces del VU0255035 para M1R en relación a M(2)-M(5). Los estudios de farmacología molecular y mutagénesis indican que el VU0255035 es un antagonista ortoestérico competitivo de M1R. El VU0255035 tiene penetración de la barreara del cerebro sanguínea excelente in vivo en ratones. El crecimiento de neuritas se evaluó luego tras un periodo de cultivo de 24 horas.
Las longitudes de neuritas totales (Es decir, la suma de la longitud de todas las neuritas producidas por una neurona individual) se evaluaron usando un método de inmunotinción. Una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos Greiner Bio-One pClear (Greiner Bio-One North America Inc., Munroe, NC, US) con una superficie de crecimiento de plástico ópticamente clara delgada para optimizar las condiciones de crecimiento de neuritas. Se capturaron cuatro imágenes por pocillo y la frecuencia de replicado del pocillo se estableció a n=6. Se aplicó el marcador neuronal p- tubulin III (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) a células fijadas con formalina. El marcador se etiquetó con el conjugado fluorescente Alexa Fluor 488 (Invitrogen Canada Ltd.). Las imágenes fluorescentes se recolectaron usando un microscopio invertido Olympus IX71 con un objetivo 20X / 0.45 PH1 LUCPLANFLN que era adecuado para resolver imágenes en superficies de plástico. Este sistema se equipó con una lámpara de arco corto Xenon y un monocromador Delta Ram X Photon Technology International, Birmingham, NJ, US) para proporcionar una longitud de onda de excitación fiable. La fluorescencia de la imagen capturada se convirtió posteriormente a una imagen de 8-bit en escala de grises para cuantificar el volumen de píxeles total. Específicamente, la imagen TIFF bruta se abrió usando software de procesamiento de imágenes patrocinado por NIH de dominio público Image J. La imagen se invirtió primero para crear una imagen objetivo negra frente a un fondo blanco y luego se minimizó el volumen de los píxeles del fondo por ajuste del umbral. Las imágenes posteriores se estandarizaron frente al valor umbral ajustado por continuidad. Se cuantificó el volumen de píxeles total de los cuerpos celulares específicos de neuronas y neuritas. El volumen de píxeles de los cuerpos celulares se eliminó para producir un volumen de píxeles neto atribuido a neuritas. El volumen de píxeles neto se normalizó frente al número de células neuronales por campo cuantificado. Los datos en la Figura 3 muestran que: (A) las concentraciones de pirenzepina de 0,003 pM y mayores aumentaron significativamente el crecimiento de neuritas total en neuronas aisladas de una rata diabética, y (B) las concentraciones de VU255035 de de 0,03 pM y mayores aumentaron significativamente el crecimiento de neuritas total en neuronas aisladas de una rata diabética.
Ejemplo 4: Respuestas de cultivos de neuronas sensoriales derivadas de ratones knockout M1R, a tratamientos de pirenzepina
Se aislaron neuronas sensoriales de DRG cervicales, torácicos y lumbares de (A) ratones del tipo salvaje (en un fondo 129S6 x CF1), y de (B) ratones knockout M1R (de Taconic, Hudson, NY y mediados mediante una colaboración con el Laboratory of Bioorganic Chemistry, NIH-NIDDK, Bethesda, MD) seguido generalmente por el método esbozado en el Ejemplo 1. El receptor de acetilcolina muscarínico Mi (M1R), también conocido como el receptor colinérgico, se había inactivado en ratones knockout M1R y por lo tanto, la administración de los antagonistas de los receptores de acetilcolina muscarínicos que inactivan específicamente el receptor de acetilcolina muscarínico Mi no será fisiológicamente efectiva en ratones knockout MÍR. Las neuronas sensoriales de DRG aisladas de los ratones de tipo salvaje y de los ratones knockout M1R se cultivaron separadamente durante 24 horas en un intervalo de concentraciones de factor de crecimiento neurotrófico (NTs) más 1 pM de pirenzepina. El cóctel de dosis baja (LD) de los factores de crecimiento indujo un nivel significativamente más alto de crecimiento de neuritas en cultivos de ratones knockout M1R (Fig., 4(B)) en comparación con el observado en cultivos de ratones del tipo salvaje (Fig. 4(A)). Los niveles máximos de crecimiento de neuritas generados por los factores de crecimiento de dosis alta (HD) fueron los mismos entre cultivos de ratones del tipo salvaje (Fig. 4(A)) y ratones knockout (Fig. 4(B)). Los tratamientos con pirenzepina aumentaron el crecimiento de neuritas 2 veces en comparación con el control de LD en cultivos de ratones del tipo salvaje (Fig. 4(A)). Sin embargo, los tratamientos con pirenzepina no potenciaron el crecimiento de neuritas en cultivos de ratones knockout M1R (Fig. 4(B)). También se midieron las cantidades de acetilcolina producidas por los cultivos de neuronas sensoriales de DRG. La Fig. 5 muestra que los cultivos de neuronas sensoriales de ratones knockout M1R produjeron significativamente menos acetilcolina en comparación con los cultivos del tipo salvaje. Estos datos sugieren que, por lo menos en condiciones de cultivos celulares agudos, las neuronas sensoriales auto-limitan su crecimiento axonal mediante una vía colinérgica autocrina (presumiblemente mediante una vía dependiente de aceitlcolina/M1R). La sorprendente capacidad de los antagonistas de M1R o eliminación genética del M1R para acelerar el crecimiento axonal ha dado lugar a la hipótesis de que las neuronas periféricas adultas están bajo constante "restricción colinérgica" que previene el crecimiento excesivo una vez que han logrado el contacto con su objetivo. Respecto a la inervación de la epidermis por queratinocitos de fibras sensoriales secretan acetilcolina y se comunican mediante una red no neuronal de receptores colinérgicos que tiene importancia durante la reparación de heridas. La presencia de M1Rs
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en neuronas sensoriales ofrece la posibilidad intrigante de que las mismas neuronas y/o los queratinocitos usan la acetilcolina como la señal de "parada" para evitar crecimiento de fibras descontrolado.
Ejemplo 5: Efectos de la pirenzepina en la fosforilación de la proteína quinasa regulada extracelular (ERK) en neuronas sensoriales cultivadas
Se aislaron DRG lumbares de ratas Sprague Dawley no consanguíneas macho siguiendo generalmente el método indicado en el Ejemplo 1, y luego se cultivaron durante 24 horas en medio F12 libre de suero y libre de insulina en presencia de aditivos de N2 modificados más 10 pM de pirenzepina. Las muestras se tomaron inmediatamente (momento 0) y luego después de 15 min, 30 min, 6 horas, y 24 horas de la incubación. Se realizó transferencia Western cuantitativa como se enseña por Chowdhury et al (2010) y Fernyhough et al. (1999, Diabetes 48: 881-889). Los homogeneizados de DRG de 5-10 pg de proteína se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 10% y se electrotransfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon luego en 5% de leche no grasa que contenía 0,05% de Tween-20, se enjuagaron en PBS (pH 7,4) y se incubaron con un reactivo de anticuerpos específico para quinasa fosforilada (Thr-202/Tyr-204) o regulada por señal extracelular (P-ERK o T-ERK; 1:4000 y 1:2000, respectivamente; Covance, Princeton, NJ, US). Las transferencias se enjuagaron, se incubaron en Reactivo Luminol de transferencia Western (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, US) y se formaron imágenes usando un analizador de imágenes BioRad Fluor-S (BioRad, Hercules, CA, US). Los datos en las Figs. 6(A) y 6(B) muestran que la pirenzepina elevó la fosforilación de ERK (P-ERK) aproximadamente 2 veces tras 15 min con un retorno al valor de referencia a las 24 horas (en relación a los niveles de ERK totales).
Ejemplo 6: (Ejemplo de referencia) Efectos de un VU255035 antagonista muscarínico de M1R en la actividad de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en neuronas sensoriales cultivadas
Se aislaron DRG lumbares de ratas Sprague Dawley no consanguíneas macho siguiendo generalmente el método indicado en el Ejemplo 1, y luego se cultivaron durante 6 horas en medio F12 libre de suero y libre de insulina en presencia de aditivos de N2 modificados más 10 pM de VU255035. Las muestras se tomaron inmediatamente (momento 0) y luego después de 15 min, 30 min, 6 horas, y 24 horas de la incubación. Se realizó transferencia Western cuantitativa siguiendo el procedimiento enseñado en el Ejemplo 5. Los homogeneizados de DRG de 5-10 pg de proteína se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 10% y se electrotransfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon luego en 5% de leche no grasa que contenía 0,05% de Tween-20, se enjuagaron en PBS (pH 7,4) y se incubaron con los siguientes anticuerpos: (i) AMPK policlonal anti- fosfo (en Thr-172, 1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, US), y (ii) quinasa regulada por señal extracelular (T-ERK; 1:2000, Covance, Princeton, NJ, US). Las transferencias se enjuagaron, se incubaron en Reactivo Luminol de transferencia Western (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, US) y se formaron imágenes usando un analizador de imágenes BioRad Fluor-S (BioRad, Hercules, CA, US). Los datos en las Figs. 7(A) y 7(B) muestran que el VU255035 aumentó significativamente la fosforilación de AMPK (P-AMPK) al de 15 min y mantuvo la fosforilación al de 30-60 min con un retorno al valor de referencia al de 6 horas (en relación a los niveles de ERK totales; los niveles de AMPK totales no se vieron afectados).
Ejemplo 7: (Ejemplo de referencia) Efectos profilácticos de inyecciones subcutáneas de pirenzepina en el desarrollo de polineuropatía simétrica en un modelo de ratón de ratón con diabetes tipo 1
Se hicieron diabéticos a ratones C57Bl6J macho con 2 inyecciones de 90 mg/kg de STZ en días consecutivos, y luego se separaron en cuatro grupos. Un quinto grupo era el grupo de control (no diabético) y comprendía ratones que no recibieron las inyecciones de STZ. El primer grupo de ratones diabéticos no recibió ningún tratamiento de pirenzepina durante el curso del estudio de dos meses y sirve para ilustrar la neuropatía inducida por la diabetes. El primer grupo de ratones diabéticos STZ desarrolló signos de neuropatía, incluyendo ralentización de la conducción de los nervios, hipoalgesia térmica y pérdida de IENF en el plazo de 2 meses de los tratamientos con STZ. El segundo, tercer y cuarto grupos de ratones diabéticos STZ recibieron tratamientos de pirenzepina diarios administrados por inyección subcutánea en la nuca del cuello, comenzando una semana después de la segunda inyección de STZ. El segundo grupo de ratones diabéticos STZ recibió una dosis diaria de 0,1 mg de pirenzepina/kg de peso corporal. El tercer grupo de ratones diabéticos STZ recibió una dosis diaria de 1,0 mg de pirenzepina/kg de peso corporal. El cuarto grupo de ratones diabéticos STZ recibió una dosis diaria de 10,0 mg de pirenzepina/kg de peso corporal.
Dos meses después de la segunda inyección de STZ, la función de las neuronas sensoriales pequeñas en los cinco grupos de ratones se determinó midiendo la latencia de respuesta térmica de la pata trasera usando un aparato Hargreaves modificado UARD, San Diego, CA, US) con una velocidad de calentamiento de aproximadamente 1° C/segundo desde un valor de referencia de 30° C y con un corte al de 20 segundos como se enseña por Calcutt et al. (2004, Diabetologia 47: 718-724). Los datos en la Fig. 8(!) muestran que el grupo de ratones diabéticos STZ que por lo demás no fue tratado demostró un aumento significativo en la latencia térmica en comparación con los ratones de control (no diabéticos). El grupo de ratones diabéticos que recibían inyecciones subcutáneas de pirenzepina diarias a 10 mg/kg demostró una latencia de respuesta térmica que no era significativamente diferente de la de los ratones no diabéticos de control (Fig. 8(B)). El análisis estadístico se hizo
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usando el ANOVA de una dirección con comparación post-hoc usando la prueba de Tukey.
Se evaluó la integridad estructural de las neuronas sensoriales midiendo los perfiles de fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF) en la piel de la planta de la pata trasera que se fijo por inmersión en 4% de paraformaldehido y se procesó a bloques de parafina. Se tiñeron secciones (6 |jm) con el marcador pan-neuronal PGP9.5 (1:1000, Biogenesis Ltd., Poole, UK) y se vieron bajo un microscopio de luz para permitir el recuento de IENF y perfiles nervioso sub-epidérmicos (SNP) por unidad de longitud del borde dérmico: epidérmico usando la técnica enseñada por Beiswenger et al. (2008, Neurosci Lett. 442, 267-272). Los datos en la Fig. 8 muestran que los ratones diabéticos STZ que por lo demás no se trataron demostraron una disminución significativa en los niveles de pata de IENF en comparación con el control (ratones no diabéticos). El grupo de ratones diabéticos que recibían inyecciones subcutáneas diarias de 10 mg/kg de pirenzepina no demostraron cambios significativos en los niveles de pata de IENF en comparación con los ratones de controla (no diabéticos). Los análisis estadísticos se hicieron usando ANOVA de una dirección seguido por prueba de Tukey.
Se midió la velocidad de conducción nerviosa motora bajo anestesia con isoflurano y la temperatura del núcleo y el nervio se mantuvieron a 37° C usando una almohadilla de calentamiento y lámparas siguiendo las enseñanzas de Jolivalt et al, (2011, Diabetes Obesity and Metabolism, 2 de Junio Epub antes de la impresión). Se estimuló el nervio ciático (5V, 0.05 ms pulso, onda cuadrada) con electrodos de aguja en la escotadura ciática o el tobillo. Las respuestas tempranas evocadas (ondas M) se registraron en los músculos interóseos del pie con electrodos de aguja fina, se amplificaron y se visualizaron en un osciloscopio. La diferencia en las latencias de respuesta de la onda M tras la estimulación en la escotadura ciática y el tobillo se registró como el tiempo requerido para la conducción nerviosa motora entre los sitios de estimulación. La distancia entre los sitios de estimulación se midió en la superficie de la extremidad trasera completamente extendida y se dividió por la diferencia en las latencias de onda M para calcular la velocidad de conducción nerviosa motora (MNCV). Las mediciones se hicieron por triplicado y se usó el valor mediano para representar el MNCV para cada animal.
Ejemplo 8: (Ejemplo de referencia) Inversión de la hipoalgesia térmica y pérdida de IENF en ratones diabéticos inducidos por STZ con VU255035
Se volvieron diabéticos ratones Swiss Webster (no consanguíneos) con 2 inyecciones de 90 mg/kg de STZ en días consecutivos. Un grupo de control de ratones Swiss Webster de la misma edad no recibió las inyecciones de STZ. Los ratones se mantuvieron hasta 8 semanas tras las inyecciones de STZ. La neuropatía diabética estaba bien establecida en los ratones que recibieron las inyecciones de STZ como se evidenció por signos de neuropatía (hipoalgesia térmica). Un cohorte recibió luego 10 mg/kg de VU255035 por inyección i.p. diariamente durante 4 semanas. Los datos en la Fig. 9(A) muestran que la hipoalgesia térmica (pérdida sensorial) se había desarrollado al de 8 semanas y el tratamiento con VU255035 provocó una reversión significativa de vuelta a los niveles de control de sensibilidad térmica. La Fig. 9B) muestra que el VU255035 también revertió significativamente la pérdida de IENF y SNP.
Ejemplo 9: Efectos profilácticos de la aplicación tópica de pirenzepina en el desarrollo de neuropatía sensorial en un modelo de ratón de diabetes tipo 1
Se volvieron diabéticos ratones C57Bl6J machos con 2 inyecciones de 90 mg/kg de STZ en días consecutivos, y luego se separaron en tres grupos. Había también dos grupos de ratones de control (no diabéticos) . El primer grupo de ratones de control (no diabéticos) recibió tratamiento tópico diario con 50 jl de hidrogel Intrasite® (el Intrasite es una marca registrada de T.J. Smith and Nephew, Hull, Inglaterra) a ambas patas traseras, con una exposición controlada de tiempo de 20 minutos. El segundo grupo de ratones de control (no diabéticos) recibió una aplicación tópica diaria de 50 jl de una composición de gel que comprendía 10% de piperizina en hidrogel en una pata trasera y 50 jl de hidrogel solamente a la otra pata, comenzando cuando los ratones diabéticos recibieron sus tratamientos tópicos. El tercer grupo de ratones eran ratones diabéticos que recibieron tratamiento tópico diario con 50 jl de hidrogel en ambas patas traseras. El cuarto grupo comprendía ratones diabéticos que recibieron una aplicación tópica diaria de 50 jl de hidrogel que comprendía 2% de pirenzepina en una pata trasera y 50 jg de hidrogel solo en la otra pata trasera, el tratamiento comenzando 7 días después de la segunda inyección de STZ. El quinto grupo comprendía ratones diabéticos que recibieron una aplicación tópica diaria de 50 jl de hidrogel que comprendía 10% de pirenzepina a una pata trasera y 50 jl de hidrogel solo a la otra pata trasera, el tratamiento comenzando 7 días después de la segunda inyección de STZ. El grupo de ratones diabéticos STZ tratado con hidrogel solo a ambas patas traseras desarrollo signos de neuropatía, incluyendo ralentización de conducción nerviosa, hipoalgesia térmica y pérdida de IENF en el plazo de 2 meses de los tratamientos con STZ.
Dos meses después de la segunda inyección de STZ, la función de las neuronas sensoriales pequeñas en los cinco grupos de ratones se determinó midiendo la latencia de respuesta térmica de la pata trasera usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 7. Los datos en la Fig. 10(A) muestran que la latencia de respuesta térmica en ratones de control (no diabéticos) no se vio afectada por una aplicación tópica del hidrogel que comprendía 10% de pirenzepina. Los ratones diabéticos tratados con hidrogel solo a ambas patas demostraron un aumento significativo en la latencia de respuesta térmica en comparación con ambos grupos de ratones de control (no diabéticos). Los dos
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grupos de ratones diabéticos que recibieron aplicaciones tópicas diarias de hidrogel de pirenzepina a una para trasera no demostraron ningún cambio significativo en la latencia de respuesta térmica en esa pata en comparación con los ratones de control (no diabéticos) (el análisis estadístico se hizo usando el ANOVA de una dirección con comparación post-hoc usando la prueba de Tukey).
Se evaluó la integridad estructura de las neuronas sensoriales pequeñas midiendo los perfiles de IENF en la piel de la planta de la pata trasera como se describe en el Ejemplo 7. Los datos en la Fig. 10(B) y 10(C) muestran que la aplicación de hidrogel que comprende 10% de pirenzepina a una pata trasera de ratones de control (no diabéticos) resulto en aumentos numéricamente, pero estadísticamente insignificantes en IENF y SNP por mm de piel tomada de la pata trasera tratada con pirenzepina. Los ratones diabéticos STZ tratados con hidrogel sólo en ambas patas traseras demostraron una disminución significativa en los niveles de las patas de IENF y SNP por mm de piel en comparación con los ratones de control (no diabéticos) que se trataron con hidrogel sólo en ambas patas traseras. Los dos grupos de ratones diabéticos que recibieron aplicaciones tópicas diarias de 50 pl de hidrogel que comprendía 2% o 10& de pirenzepina no demostraron cambios significativos en los niveles de IENF y SNP en la pata tratada con pirenzepina cuando se comparó con los ratones de control (no diabéticos) que se trataron con hidrogel sólo en ambas patas traseras (el análisis estadístico se hizo usando el ANOVA de una dirección con comparación post-hoc usando la prueba de Tukey).
Ejemplo 10: (Ejemplo de referencia) Efectos restauradores de las inyecciones subcutáneas de pirenzepina en hipoalgesia térmica y pérdida de IENF en ratones diabéticos
Se hicieron diabéticos ratones Swiss Webster no consanguíneos macho con dos inyecciones de 90 mg/kg de STZ en días consecutivos. Un grupo de control de ratones Swiss Webster de la misma edad no recibió las inyecciones de STZ. Los ratones se mantuvieron durante 14 semanas tras las inyecciones de STZ. La neuropatía diabética estaba bien establecida en los ratones que recibieron las inyecciones de STZ como se evidenció por signos de neuropatía, hipoalgesia térmica y pérdida de IENF. Al de 14 semanas, los ratones diabéticos se separaron en dos grupos. El primero era el grupo sin tratar de ratones diabéticos, El otro grupo de ratones diabéticos recibió inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina a una dosis de 10 mg/kg durante 2 meses.
Se avaluó la función de las neuronas sensoriales pequeñas en los grupos diabéticos y no diabéticos al de 5 semanas, 7 semanas, 11 semanas, 14 semanas tras las inyecciones de STZ. Hubo un aumento significativo en la latencia térmica en los ratones diabéticos en comparación con los ratones no diabéticos, siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 7. La hipoalgesia se observó 11 semanas después de las inyecciones de STZ y se volvió incluso más pronunciada al de 14 semanas (Fig. 11(A)). El examen microscópico de las muestras de tejido de la piel recolectadas de los ratones diabéticos al de 14 semanas mostraron aproximadamente un 40% de pérdida en IENF. Sin embargo, las administraciones de pirenzepina diarias a ratones diabéticos redujeron significativamente la latencia térmica en el plazo de 4 semanas de comenzar el tratamiento con pirenzepina, es decir, al de 18 semanas (Fig. 11(A)) y por la semana 21, es decir 7 semanas después de comenzar los tratamientos con pirenzepina, la latencia térmica en los ratones diabéticos era idéntica a la de los controles no diabéticos (Fig. 11(A)). La determinación de los perfiles de IENF en los tres grupos de ratones al de 21 semanas demostró que la aplicación de los tratamientos de pirenzepina a ratones diabéticos restauró los perfiles de IENF a aproximadamente el de los ratones de control no diabéticos (Fig. 11(B)).
Ejemplo 11: Reaparición de neuropatía tras la retirada de tratamientos de pirenzepina
Ratones C57B16J se hicieron diabéticos con STZ como se ha descrito anteriormente y luego recibieron 10 mg/kg de pirenzepina (inyecciones subcutáneas diarias). Después de 8 semanas, se previno la hipoalgesia por los tratamientos de pirenzepina (Fig. 12). En esta coyuntura, los tratamientos de pirenzepina se detuvieron y se midieron las latencias térmicas cada dos semanas posteriormente (Fig. 12). Sólo 9 semanas después (el punto temporal de la semana 17) no hubo reaparición significativa de hipoalgesia en los ratones diabéticos inducidos con STZ tratados previamente (Fig., 12).
Ejemplo 12: (Ejemplo de referencia) Efectos de reversión de inyecciones subcutáneas de pirenzepina en hipoalgesia térmica en ratas diabéticas
Se hizo diabético un grupo de ratas Sprague Dawley macho adultas con una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de STZ, mientras que un segundo grupo de ratas macho adultas se mantuvo como control no diabético. Los dos grupos de ratas se monitorizaron para la aparición de diabetes tipo 1 evaluando la latencia térmica a intervalos de 4 semanas. A la semana 12, la neuropatía estaba bien establecida en las ratas tratadas con STZ (Fig. 13). Las ratas diabéticas se separaron luego en dos grupos, con un grupo de ratas cada uno recibiendo una inyección subcutánea de 10 mg/kg de pirenzepina. Las evaluaciones de la latencia térmica continuaron a intervalos de 4 semanas, y a la semana 20 del estudio, es decir 8 semanas después de que comenzaran las inyecciones de pirenzepina diarias, la latencia térmica en las ratas diabéticas que habían recibido las inyecciones había caído a aproximadamente los niveles en las ratas de control no diabéticas (Fig. 13).
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Ejemplo 13 Efectos de pirenzepina en la prevención del desarrollo del dolor, indicado por alodinia táctil, y ralentización de la conducción nerviosa sensorial en ratas diabéticas
Se hicieron diabéticos dos grupos de ratas Sprague Dawley hembra adultas con una inyección intraperitoneal de 55 mg/kg de STZ. Uno de los dos grupos de ratas inyectadas con STZ recibió tratamientos diarios de 10 mg/kg de pirenzepina mediante inyección subcutánea, mientras que el segundo grupo recibió inyecciones de sólo vehículo. Un tercer grupo de ratas macho adultas se mantuvo como controles no diabéticos. Los tres grupos de ratas se monitorizaron para la aparición de neuropatía dolorosa diabética midiendo los umbrales de respuesta táctil de las patas en las semanas 5 y 9 de diabetes, como se enseña por Calcutt (1996, Pain: 68:293-299). La neuropatía dolorosa, como se indica por alodinia táctil (50% de umbral de respuesta por debajo de 5 g) estaba bien establecida por la semana 5 en las ratas tratadas con STZ que no recibieron los tratamientos de pirenzepina y persistió hasta 9 semanas de diabetes. Las ratas diabéticas tratadas con pirenzepina tenían umbrales de respuesta táctil en las patas que eran significativamente más altos que las ratas tratadas con vehículo después de 5 semanas de diabetes (Fig. 14A) y no diferente de las ratas de control por la semana 9 de diabetes (Fig. 14A). La velocidad de conducción nerviosa sensorial (SNCV) se midió en las mismas cohortes de ratas tras 8 semanas de diabetes midiendo bajo anestesia con isoflurano, la latencia de las ondas H en el electromiograma de los músculos interóseos siguiendo la estimulación eléctrica del nervio ciático en la escotadura ciática y el tendón de Aquiles y midiendo luego la distancia entre los dos puntos de estimulación nerviosa , como se enseña por Calcutt (J. Clin. Invest. 111:507-514, 2003). La SNCV se redujo significativamente en ratas diabéticas y la pirenzepina previno parcialmente este déficit (Fig. 14B).
Ejemplo 14: (Ejemplo de referencia) Reversión de neuropatía sensorial diabética con dosificación oral de pirenzepina
Se hicieron diabéticos ratones Swiss Webster no consanguíneos macho con 2 inyecciones de 90 mg/kg de STZ en días consecutivos. Un grupo de control de ratones Swiss Webster de la misma edad no recibió las inyecciones de STZ. Los ratones se mantuvieron durante 8 semanas tras las inyecciones de STZ. La neuropatía diabética estaba bien establecida en los ratones que recibieron las inyecciones de STZ como se evidencia por los signos de hipoalgesia térmica. Al de 8 semanas, se administraron tratamientos de pirenzepina diarios a un subgrupo de los ratones diabéticos STZ por sonda oral durante un periodo adicional de 8 semanas. Los datos en la Fig. 15(A) muestran que los tratamientos que administran pirenzepina oralmente revirtieron la hipoalgesia térmica. Adicionalmente, la dosificación oral con pirenzepina también revirtió la pérdida de IENF y SNP (Fig. 15(B)).
Ejemplo 15: Evaluación de los efectos de pirenzepina en la expresión génica de AMPK y PGCLa en ganglios de la raíz dorsal (DRG) en ratones diabéticos STZ
Algunos de los ratones en cada uno de los tres grupos de ratones (grupo de control no diabético; grupo diabético no tratado; grupo diabético que recibía inyecciones de pirenzepina diarias desde la semana 14 en adelante) del estudio descrito en el Ejemplo 10 se mantuvieron hasta 22 semanas después de las inyecciones de STZ. Los DRG lumbares se aislaron y enjuagaron en solución enfriada con hielo que contenía tampón STE (250 mmol/l de sacarosa, 10 mmol/l de Tris-HCl, 1 mmol/l de EDTA, pH 7,4), y luego se homogenizaron con un homogeneizador polytron (KINEMATICA GmbH, Suiza) usando 3 x 7,5 s pulsos de molienda a intervalos de 30 segundos de acuerdo con el método enseñado por Chowdhury et al. (2010, Diabetes 59: 1082-1091).
Se realizó una transferencia Western cuantitativa como se ha divulgado anteriormente por Chowdhury et al (2010) y Fernyhough et al. (1999, Diabetes 48: 881-889). Los homogeneizados de DRG de 5-10 |jg de proteína se resolvieron en un gel de SDS-PAGE al 10% y se electrotransfirieron sobre una membrana de celulosa. Las transferencias se bloquearon luego en 5% de leche no grasa que contenía 0,05% de Tween-20, se enjuagaron en PBS (pH 7,4) y se incubaron con los siguientes anticuerpos: AMPK policlonal anti-fosfo (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, US), anti-PGC-1a policlonal (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA) y subunidad de p sintasa anti-ATP monoclonal (1:2000 dilución, Mitosciences, Eugene, OR). La quinasa regulada por señal extracelular (T-ERK; 1:2000, Covance, Princeton, NJ, US) se sondeó como un control de carga (estudios previos muestras que esta proteína no cambia el nivel de expresión en DRG en diabetes). Las transferencias se enjuagaron, se incubaron en Reactivo Luminol de transferencia Western (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, US) y se formaron imágenes usando un analizador de imágenes BioRad Fluor-S (BioRad, Hercules, CA, US).
Los datos en las Figs. 16(A) - 16(D) muestran que la expresión génica de P-AMPK, T-AMPK, y PGC-1a se redujo en ratones diabéticos en comparación con los controles no diabéticos, y que las inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina durante 8 semanas restauraron la expresión de estos genes.
Ejemplo 16: Evaluación de los efectos de pirenzepina en la expresión de proteínas del complejo respiratorio mitocondrial en ganglios de la raíz dorsal en ratones diabéticos STZ
Las muestras de DRG se evaluaron para la expresión de proteínas mitocondriales específicas en ratas diabéticas que recibieron inyecciones diarias de pirenzepina durante 8 semanas. Se realizó transferencia Western cuantitativa como se describe en el Ejemplo 15. La transferencia Western cuantitativa se realizó como se ha
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divulgado anteriormente por Chowdhury et al (2010) y Fernyhough et al. (1999). Los homogeneizados de DRG de 510 pg de proteína se resolvieron en un gel SDS-PAGE al l0% y se electrotransfirieron sobre membrana de celulosa. Las transferencias se bloquearon luego en 5% de leche no grasa que contenía 0,05% de Tween-20, se enjuagaron en PBS (pH 7,4) y se incubaron con los siguientes anticuerpos: subunidad 4 monoclonal anti-citocromo c oxidasa (COX IV; 1:1000, Mitosciences, Eugene, OR, US), proteína 3 de hierro-azufre monoclonal anti-NADH deshidrogenasa (ubiquinona) (NDUFS3, 1:1000, Mitosciences, Eugene, OR, US). La quinasa regulada por señal extracelular (T-ERK; 1:2000, Covance, Princeton, NJ, US) se sondeó como un control de carga. Las transferencias se enjuagaron, se incubaron en Reactivo Luminol de transferencia Western (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, US) y se formaron imágenes usando un analizador de imágenes BioRad Fluor-S (BioRad, Hercules, CA, US).
Los datos en las Figs. 17(A)-17(C) demuestran que los tratamientos de pirenzepina restauraron la expresión de proteínas mitocondriales NDUFS3 y COX IV.
Ejemplo 17: Evaluación de los efectos de pirenzepina en la actividad de complejos respiratorios mitocondriales en ganglios de la raíz dorsal en ratones diabéticos STZ
Se evaluaron las muestras de DRG lumbar de los ratones descritos en el Ejemplo 10 para la restauración de la actividad de los complejos mitocondriales en ratones diabéticos que habían recibido inyecciones diarias de pirenzepina durante 8 semanas.
Todas las mediciones de las actividades enzimáticas en las preparaciones de DRG lumbar se realizaron espectrofotométricamente usando un espectrómetro de UV visible Ultrospec 2100 controlado por temperatura (Biopharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) usando los métodos enseñados por Chowdhury et al. (2010). Se midió la actividad del complejo I como actividad de NADH sensible a rotenona: citocromo c reductasa. Se añadieron el tampón de ensayo recién preparado (50 mmol/l K-fosfato pH 7.4, 1 mmol/l KCN, 100 pmol/l NADH) y 10 pg de proteína de preparación de homogeneizado de DRG a la cubeta y se preincubó durante 3 min a 25° C. Tras la adición de 100 pmol/l de citocromo c oxidado, la reacción se continuó durante 2 minutos a 550 nm y luego durante 2 minutos más tras la adición de 25 pmol/l de rotenona para permitir el cálculo de la actividad de Complejo I sensible a la rotenona. Se midió la actividad del Complejo IV a 25° C monitorizando la disminución de absorbancia de citocromo c reducido a 550 nm como se divulga por Chowdhury et al. (2000, Clin. Chim. Acta 298: 157-173). La reacción se comenzó por la adición de 40 pmol/l de citocromo c reducido en 50 mmol/l de tapón de fosfato que contiene 5 pg de proteína solubilizada con 0,02% de laurilmaltosida. Se determinó la actividad de la enzima del ciclo de Krebs, citrato sintasa a 25° C en medio que contenía 150 mmol/l de Tris-HCl (pH 8.2), 0,02% de laurilmaltosida, 0,1 mmol/l de ácido ditionitrobenzoico y 5 pg de proteína de acuerdo con el método de Chowdhury et al (2007, Free Radic. Res. 41: 1116-1124). La reacción se inició por la adición de 100 pmol/l de acetil-CoA y se midieron los cambios en la absorbancia a 412 nm durante 1 minuto. Este valor se sustrajo de la velocidad obtenida tras la adición de 0,05 mmol/l de ácido oxaloacético.
Los datos en las Figs. 18(A)-18(C) demuestran que los tratamientos de pirenzepina restauraron los déficits en los complejos respiratorios mitocondriales I y IV y en la citrato sintasa.
Ejemplo 18: Evaluación de efectos de la pirenzepina en la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en ganglios de la raíz dorsal lumbar recién homogeneizados en ratas diabéticas STZ.
Algunas de las ratas en cada uno de los tres grupos de ratas (grupo de control no diabético; grupo diabético no tratado; grupo diabético que recibía inyecciones de pirenzepina diarias desde la semana 14 en adelante) del estudio descrito en el Ejemplo 12 se mantuvieron durante 20 semanas después de las inyecciones de STZ. Las ratas fueron luego sacrificadas y posteriormente el DRG lumbar se aisló y enjuagó en solución enfriada con hielo que contenía tampón STE (250 mmol/l de sacarosa, 10 mmol/l de Tris-HCl, 1 mmol/l de EDTA, pH 7,4), y luego se homogeneizó con un homogeneizador polytron (KINEMATICA GmbH, Suiza( usando 3 x 7,5 s pulsos de molienda a intervalos de 30 segundos de acuerdo con el método enseñado por Chowdhury et al. (2010).
La actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en mitocondrias recién aisladas de DRG lumbar de ratas de la misma edad, de control, diabéticas, y diabéticas tratadas con pirenzepina se determinó usando un electrodo tipo Clarke (Oroboros Oxygraph-2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) siguiendo el método enseñado por Chowdhury et al. (2005, Biochem Biophys Res Commun. 333: 1139-1145), en presencia de sustratos e inhibidores específicos de la cadena respiratoria mitocondrial (Fig. 19). La respiración basal en las mitocondrias DRG lumbares se establece como respiración en estado 4 con sustratos energéticos, piruvato y malato (P+M). La respiración acoplada en el estado 3 se indujo por la adición de ADP. Luego, se determinó la velocidad desacoplada añadiendo el agente de desacoplamiento, carbonilcianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Se añadieron Ascorbato (asc) y N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenediamina (TMPD) para determinar la capacidad de la citocromo c oxidasa (complejo IV). El TMPD es un mediador redox artificial que ayuda a la transferencia de electrones del ascorbato al citocromo c,
Las velocidades de respiración basal con piruvato y malato (P+M) fueron similares para las ratas de control
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no diabéticas, ratas diabéticas, y en las ratas diabéticas que habían recibido inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina diariamente durante las últimas ocho semanas del estudio (Fig. 19). La respiración acoplada en ratas diabéticas tras 20 semanas había disminuido aproximadamente el 30% de la de las ratas de control no diabéticas (P+M+ADP). Sin embargo, la respiración acoplada en ratas diabéticas que habían recibido inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina, no era significativamente diferente de los controles no diabéticos. Aunque la respiración desacoplada en ratas diabéticas tras 20 semanas disminuyó aproximadamente el 40% de la de las ratas no diabéticas de control (FCCP), la respiración desacoplada en ratas diabéticas que habían recibido inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina, no era significativamente diferente de la de los controles no diabéticos. La capacidad de la citocromo c oxidasa (complejo IV) en ratas diabéticas tras 20 semanas había disminuido aproximadamente el 25% de la de las ratas de control no diabéticas (Asc + TMPD). Sin embargo, la capacidad de la citocromo c oxidasa en ratas diabéticas que habían recibido inyecciones subcutáneas diarias de pirenzepina , no era significativamente diferente de la de los controles no diabéticos.
Ejemplo 19: Preparación de una composición de pirenzepina para aplicación tópica
Se preparó una composición de pirenzepina para aplicación tópica mezclando 10 mg de polvo de pirenzepina en 0,5 ml de un gel adecuado para un 2% (20 mg/ml) de gel. Un gel adecuado se ejemplifica por el hidrogel estéril Intrasite® N° de producto 66027313 (Smith & Nephew Inc, St. Laurent, PQ, CA). Alternativamente, pueden mezclarse 100 mg de polvo de pirenzepina en 1,0 ml de gel para preparar un 10% (100 mg/ml) de gel.
Ejemplo 20: (Ejemplo de referencia) Preparación de formulación oral de pirenzepina
La pirenzepina (ya sea en su forma de clorhidrato o en su forma de hidrato u otras formas de sales similares) puede ser o disuelta en solución salina, agua destilada, o en una formulación de comprimido adecuada para la administración oral. Tales formulaciones pueden prepararse usando el conocimiento general disponible para la pirenzepina o sus varias formas de sales en la bibliografía y por alguien razonablemente experto en la técnica. Una formulación de clorhidrato de pirenzepina disuelta en agua y administrada oralmente a ratones mostro eficacia (Fig. 15).
Claims (15)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Una composición para su uso en un método para tratar neuropatía diabética simétrica por administración tópica o transdérmica, la composición comprendiendo:una cantidad efectiva de pirenzepina, una sal de la misma, o hidrato de la misma; uno o más agentes potenciadores de la penetración; yun portador o excipiente farmacológicamente aceptable o combinaciones de los mismos.
- 2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición es una loción, una crema, un gel, un fluido viscoso, o un parche transdérmico.
- 3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la pirenzepina comprende una sal de pirenzepina, o un hidrato de pirenzepina.
- 4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la polineuropatía diabética simétrica es una neuropatía diabética sensorial.
- 5. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende por lo menos un agente espesante, un emoliente, un antioxidante, un conservante antimicrobiano, un agente emulsionante, un solvente miscible en agua, y un alcohol.
- 6. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente potenciador de la penetración es un agente potenciador de la penetración transdérmico.
- 7. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente potenciador de la penetración comprende un sulfóxido, una alcanona o un ácido graso lineal.
- 8. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el ácido grado lineal es un ácido linoleico.
- 9. Un proceso para la fabricación de una composición tópica para la terapia de polineuropatía diabética simétrica, el proceso comprendiendo:mezclar una cantidad seleccionada de pirenzepina o una sal de la misma, o hidrato de la misma, con una cantidad seleccionada de un portador o excipiente farmacológicamente aceptable o combinaciones de los mismos, el portador o excipiente comprendiendo uno o más agentes potenciadores de la penetración, produciendo de este modo una mezcla de pirenzepina; ydispensar la mezcla de pirenzepina en un recipiente de dispensación para la administración tópica.
- 10. El proceso de la reivindicación 9, en donde la pirenzepina comprende una sal de pirenzepina, o un hidrato de pirenzepina.
- 11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde la mezcla es una de una loción, una crema, un gel, un fluido viscoso, y un liquido.
- 12. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la pirenzepina comprende aproximadamente el 2% por peso de la composición farmacéutica.
- 13. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la pirenzepina comprende aproximadamente el 10% por peso de la composición farmacéutica.
- 14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el potenciador de la penetración comprende un sulfóxido, una alcanona o un ácido graso lineal.
- 15. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el ácido graso lineal es un ácido linoleico.
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