RS66691B1 - Terapijske kompozicije za simetričnu dijabetesnu polineuropatiju - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju za upotrebu u postupku lečenja dijabetesne neuropatije topikalnom ili transdermalnom primenom, a kompozicija sadrži: efikasnu količinu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora selektivnog za podtip M1 receptora, ili njegovu so; jedno ili više sredstava za poboljšanje penetracije ili korastvarača; i farmakološki prihvatljiv nosač ili ekscipijens ili njihove kombinacije. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na jedinjenje antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora selektivno za podtip M1 receptora, ili njegovu so, za upotrebu u postupku lečenja dijabetesne neuropatije kod subjekta, gde je subjekt čovek, a postupak obuhvata davanje/administriranje kompozicije koja sadrži jedinjenje injekcijom.

STANJE TEHNIKE

[0002] Simetrična polineuropatija je klinički problem kod oko 50% osoba obolelih od dijabetesa. Klinički simptomi mogu da uključuju razvoj bolova u gornjem delu leđa i/ili bol u abdomenu (tj. dijabetesna torakoabdominalna neuropatija), gubitak kontrole pokreta oka (tj. paraliza trećeg nerva) i progresivni gubitak funkcije nerava koji čine periferni nervni sistem (npr. polineuropatija, mononeuropatija, mononeuritis simplex, autonomna neuropatija).

[0003] Dominantni oblik dijabetesne neuropatije se predstavlja kao distalna simetrična polineuropatija koja u početku pogađa stopala, noge i ruke ispitanika. Primarni simptomi uključuju gubitak senzacija dodira i/ili osećaja i gubitak sposobnosti da se oseti stimulans koji izaziva bol. Podgrupa pacijenata sa ranom dijabetesnom neuropatijom, takođe, razvija pozitivne simptome neuropatskog bola kao što su neprikladno peckanje, žarenje, puckanje ili osećaj bola koji mogu koegzistirati sa drugim negativnim simptomima senzornog gubitka. Takav neuropatski bol se obično naziva taktilna alodinija ili mehanohiperalgezija.

[0004] Distalna senzorna neuropatija može da se meri korišćenjem biopsija kože da bi se odredio gubitak intraepidermalnih nervnih vlakana (IENF). Gubitak IENF predstavlja povlačenje nervnih završetaka senzornih neurona iz epidermisa sa naknadnim senzornim gubitkom koji na kraju doprinosi visokoj incidenci ulceracije, gangrene i amputacije kod osoba koje pate od uznapredovalog dijabetesa. Trenutno, u Severnoj Americi ne postoje odobrene terapije za ovu simetričnu degenerativnu polineuropatiju. Trenutni troškovi zdravstvenih sistema za ublažavanje ovih simptoma su ogromni.

[0005] Upotreba jedinjenja aktivnih na sigma receptoru za proizvodnju leka za lečenje bola povezanog sa dijabetesom je razmtrana u WO 2007/025613 A2.

[0006] Studiju otvorenog tipa o topikalnom amitriptilinom i ketaminom u sindromu neuropatskog bola razmatrali su Lynch et al. u Journal of Pain, Saunders, Philadelphia, PA, US, vol.6, br.10, od 1. Oktobra 2005. (2005-10-01), str.644-649, ISSN: 1626-5900.

[0007] Učešće adenozina u anti-alodinskom efektu amitriptilina kod dijabetesnih pacova izazvanih streptozotocinom razmatrali su Ulugol Ahmet et al. u Neuroscience Letters, vol. 328, br. 2, 9. avgust 2002, (2002-08-09), strane 129-132, ISSN: 0304-3940.

[0008] Pirenzepin i in vitro test za procenu rasta aksona razmatrali su R. Van der Ploeg et al. na URL: http://www.can-acn.org/meeting2008/abstracts/257.htm.

[0009] Postupak za brzi skrining malih molekula za identifikaciju malih molekula koji stimulišu regeneraciju aksina i rast iz senzornih neurona je razmatran u US 2008/255062 A1.

[0010] Aktivnost agonista TrkA i TrkB receptora amitriptilina, pospešivanje heterodimerizacije TrkA/TrkB i moćnu neurotrofnu aktivnost razmatrali su Jang S W et al. u Chemistry and Biology, Current Biology, London, GB, vol.16, br.6, 26. jun 2009. (26.06.2009), strane 644-656.

KRATAK OPIS PRONALASKA:

[0011] Terapeutske kompozicije za upotrebu prema pronalasku sadrže jedan od antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora selektivnog za podtip M1 receptora, ili soli antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora selektivnog za podtip M1 receptora, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Kompozicije su za upotrebu prema patentnim zahtevima, i pogodne su za lečenje i negativnih simptoma simetrične dijabetesne polineuropatije čiji primer je usporavanje nervne provodljivosti i gubitak čula, i pozitivnih simptoma simetrične dijabetesne polineuropatije čiji primer su taktilna alodinija i mehano-hiperalgezija.

[0012] Prema jednom aspektu predmetnog pronalaska, kompozicije antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora za upotrebu prema zahtevima mogu se injektirati. Injekcije mogu biti supkutane injekcije u telo subjekta. Alternativno, injekcije mogu biti subepidermalne injekcije. Pogodna ciljna mesta za injekcije uključuju, između ostalog, nožne prste, stopala, skočne zglobove, kolena i noge. Druga pogodna ciljna mesta za injekcije uključuju, između ostalog, prste, šake, zglobove, ruke i ramena. Još pogodnih ciljanih mesta za injekcije uključuju gornji i donji deo leđa, grudni koš i abdominalni deo.

[0013] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, kompozicije antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora za upotrebu prema zahtevima su pogodne za lokalnu (topikalnu) primenu na odabranim ciljnim mestima na telu subjekta. Pogodna ciljana mesta za lokalnu primenu uključuju, između ostalog, nožne prste, stopala, skočne zglobove, kolena i noge. Ostala pogodna ciljna mesta za lokalnu primenu uključuju, između ostalog, prste, šake, zglobove, ruke i ramena. Ostala pogodna ciljna mesta za lokalnu primenu uključuju gornji i donji deo leđa, grudi i abdominalni deo. Alternativno, kompozicije antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora mogu se isporučiti na izabrana ciljna mesta na telu subjekta preko transdermalnih flastera.

[0014] Prema aspektu predmetnog pronalaska (za koji se zaštita ne traži), kompozicije antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora su pogodne za oralnu isporuku u telo subjekta.

[0015] Ako se tako želi, kompozicije za injektiranje predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa, istovremeno ili uzastopno sa topikalnim kompozicijama iz predmetnog pronalaska i/ili u kombinaciji sa, istovremeno ili uzastopno sa oralnim kompozicijama prema predmetnom pronalasku (za koje se zaštita ne traži).

[0016] Drugi primeri realizacija se odnose na kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u terapiji simetrične dijabetesne polineuropatije. Upotreba može da uključuje injektiranje doza koje sadrže efikasne količine muskarinskog antagonista u odabrana ciljna mesta na telu subjekta.

Alternativno, primena pronalaska može da uključuje topikalnu primenu i/ili transdermalne primene flasterom kompozicija antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora na odabrana ciljna mesta na telu subjekta. Alternativno, u aspektu pronalaska (za koji se zaštita ne traži), upotreba može da uključuje oralnu isporuku kompozicija antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora u telo subjekta.

[0017] Drugi primeri postupka prema pronalasku (za koje se zaštita ne traži) odnose se na postupke za proizvodnju kompozicija za injekcije prema predmetnom pronalasku.

[0018] Drugi primeri postupka prema pronalasku (za koje se zaštita ne traži) odnose se na postupke za proizvodnju topikalnih kompozicija predmetnog pronalaska.

[0019] Drugi primeri postupka prema pronalasku (za koje se zaštita ne traži) odnose se na postupke za proizvodnju oralnih kompozicija prema predmetnom pronalasku.

OPIS SLIKA

[0020] Predmetni pronalazak će biti opisan uz upućivanje na sledeće slike u kojima:

Slika 1 je grafikon koji prikazuje efekte pirenzepina, specifičnog antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora tipa 1 (M1R), na neurone kultivisane od Zucker diabetic fatty (ZDF) pacova (model dijabetesa tipa 2 );

Slike 2(A)-(C) su grafikoni koji pokazuju efekte antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora na izrastanje neurita iz neurona kultivisanih od normalnih pacova, 2(A) pirenzepina, 2(B) telenzepina i 2(C) atropina;

Slika 3 je dijagram koji pokazuje efekte niskih doza antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora tipa 1 (M1R) na izrastanje neurita iz neurona kultivisanih od normalnih pacova;

Slike 4(A) i 4(B) pokazuju efekte pirenzepina na izrastanje neurita iz kultura senzornih neurona izolovanih iz: 4(A) divljeg tipa miševa i 4(B) M1R nokaut miševa;

Slika 5 je grafikon koji upoređuje proizvodnju acetilholina u kulturama iz miševa divljeg tipa i u kulturama iz M1R nokaut miševa;

Slika 6(A) je Western imuno blot analiza koja pokazuje efekte pirenzepina na fosforilaciju ekstracelularno regulisane proteinske kinaze (ERK) u kultivisanim senzornim neuronima, dok je 6(B) grafikon koji prikazuje efekte pirenzepina na odnos P-ERK/T-ERK;

Slika 7(A) je Western imuno blot analiza koja pokazuje efekte VU255035 na fosforilaciju proteinske kinaze aktivirane AMP (AMPK) u kultivisanim senzornim neuronima, dok je 7(B) grafikon koji prikazuje efekte VU255035 na odnos P-AMPK/T-ERK;

Slike 8(A)-8(C) su grafikoni koji pokazuju profilaktičke efekte supkutanih injekcija pirenzepina na: 8(A) termičku hipoalgeziju, 8(B) gubitak intraepidermalnih nervnih vlakana (IENF) i 8(C) deficiti u brzini provodljivosti motornih nerava kod streptozotocinskih (STZ) dijabetičkih miševa C57Bl6J (model dijabetesa tipa 1);

Slika 9(A-B) su grafikoni koji pokazuju efekte specifičnog M1R antagonista VU255035 na reverziju 9(A) termalne hipoalgezije i gubitak 9(B) IENF kod STZ indukovanih dijabetesnih Swiss Webster miševa; Slike 10(A)-10(C) su grafikoni koji pokazuju profilaktičke efekte topikalne primene pirenzepina na: 10(A) termalnu hipoalgeziju, 10(B) gubitak intraepidermalnog nervnog vlakna (IENF) i 10(C) subepidermalni nervni splet (SNP) kod STZ dijabetesnih C57Bl6J miševa;

Slike 11(A) i 11(B) su grafikoni koji pokazuju efekte dugotrajnih supkutanih injekcija pirenzepina na reverziju: 11(A) termička hipoalgezije i 11(B) gubitak IENF kod Swiss Webster miševa sa dijabetesom (iz spoljnjeg uzgoja);

Slika 12 je grafikon koji pokazuje efekte povlačenja tretmana pirenzepinom na ponovnu pojavu neuropatije;

Slika 13 je grafikon koji pokazuje efekte injekcija pirenzepina na preokret termalne hipoalgezije kod STZ dijabetesnih Sprague-Dawley pacova;

Slika 14(A) je grafikon koji pokazuje da svakodnevno supkutano davanje pirenzepina sprečava taktilnu alodiniju šape kod STZ dijabetesnih Sprague-Dawley pacova nakon 5 ili 9 nedelja lečenja i na taj način sprečava pojavu bolne dijabetesne neuropatije, a 14(B) je dijagram ponašanja koji pokazuje uticaj pirenzepina na razvoj brzine provodljivosti senzornog nerva kod istih životinja, mereno nakon 8 nedelja dijabetesa;

Slike 15(A-B) su grafikoni koji pokazuju efekte oralnog doziranja pirenzepina na preokret: (A) termalne hipoalgezije šape i (B) gubitka IENF kod STZ dijabetesnih Sprague-Dawley miševa;

Slika 16(A) je Western imuno blot analiza koja pokazuje efekte pirenzepina na očuvanje ekspresije proteinske kinaze aktivirane AMP (AMPK) i receptora/koaktivatora-1α aktiviranog proliferatorom peroksizoma (PGC-1α), 16(B) je grafikon koji pokazuje efekte pirenzepina na ekspresiju P-AMPK, 16(C) je grafikon koji pokazuje efekte pirenzepina na nivoe T-AMPK, a 16(D) je grafikon koji pokazuje efekte pirenzepina na ekspresiju PGC-1α kod STZ dijabetesnih miševa;

Slika 17(A) je Western imuno blot analiza koja pokazuje efekte pirenzepina na poništavanje deficita u ekspresiji mitohondrijalnih proteina NDUFS3 i COX IV (T-ERK se meri kao kontrola opterećenja), 17(B) je dijagram koji pokazuje efekte pirenzepina na ekspresiju NDUFS3 proteina, a 17(C) je grafikon koji pokazuje efekte pirenzepina na ekspresiju COX IV proteina kod STZ dijabetesnih miševa;

Slike 18(A), 18(B) i 18(C) su grafikoni koji pokazuju efekte pirenzepina na poništavanje deficita u aktivnostima mitohondrijalnog respiratornog kompleksa I (A), mitohondrijalnog respiratornog kompleksa IV (B) i mitohondrijalne citratne sintaze (C) kod STZ dijabetesnih miševa; i

Slika 19 je grafikon koji prikazuje efekte dnevnih supkutanih injekcija pirenzepina na obnavljanje aktivnosti mitohondrijalnog respiratornog lanca u sveže homogenizovanim ganglijama lumbalnog dorzalnog korena STZ dijabetesnih pacova.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Pre nego što dalje opišemo predmetni pronalazak, treba razumeti da predmetni pronalazak nije ograničen na posebne opisane realizacije, jer one mogu, naravno, da variraju. Takođe, podrazumeva se da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih realizacija, i nije joj namera da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

[0022] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi ovde korišćeni imaju značenja koja bi stručnjak u tehnici podrazumevao u kontekstu ove specifikacije. Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, takođe, mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada su opisani postupci i materijali kojima se daje prednost.

[0023] Mora se napomenuti da kako se koristi ovde i u priloženim zahtevima, oblici jednine „a”, „an” i „the” (u engleskoj verziji) uključuju reference u množini osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, upućivanje na „antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora” uključuje veći broj takvih antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora, a upućivanje na „sredstvo” uključuje upućivanje na jedno ili više sredstava i njihovih ekvivalenata poznatih stručnjacima, i tako dalje.

[0024] „Opcion” ili „opciono” ili „alternativno” znači da se naknadno opisani događaj, okolnost ili materijal može ili ne mora pojaviti ili biti prisutan, i da opis uključuje slučajeve u kojima se događaj, okolnost ili materijal dešava ili je prisutan i slučajeve u kojima se ne dešava ili nije prisutan.

[0025] Kada je obezbeđen raspon vrednosti, podrazumeva se da je svaka intervenciona vrednost, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog raspona i bilo koje druge navedene ili intervenišuće vrednosti u tom navedenom rasponu, obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granice ovih manjih raspona mogu nezavisno biti uključene u manje raspone, a takođe su, obuhvaćene pronalaskom, predmet bilo koje posebno isključene granice u navedenom rasponu. Tamo gde navedeni raspon uključuje jednu ili obe granice, rasponi koji isključuju jednu ili obe uključene granice takođe su uključeni u pronalazak.

[0026] „Inhibirati”, „inhibiranje” i „inhibicija” znače smanjenje aktivnosti, odgovora, stanja, bolesti ili drugog biološkog parametra. Ovo može da uključuje, ali nije ograničeno na, potpunu ablaciju aktivnosti, odgovora, stanja ili bolesti. Ovo, takođe, može da uključuje, na primer, 10% smanjenje aktivnosti, odgovora, stanja ili kontrole, u poređenju sa prirodnim ili kontrolnim nivoom. Stoga, smanjenje može da bude 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ili bilo koja količina smanjenja između specifično navedenih procenata, u poređenju sa prirodnim ili kontrolnim nivoima.

[0027] „Pospešivati”, „pospešivanje” i „podsticanje” se odnose na povećanje aktivnosti, odgovora, stanja, bolesti ili drugog biološkog parametra. Ovo može da uključuje, ali nije ograničeno na početak aktivnosti, odgovor, stanje ili bolest. Ovo, takođe, može da uključuje, na primer, 10% povećanje aktivnosti, odgovora, stanja ili bolesti u poređenju sa prirodnim ili kontrolnim nivoom. Dakle, povećanje aktivnosti, odgovora, stanja, bolesti ili drugog biološkog parametra može da bude 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, ili više, uključujući bilo koju količinu povećanja između specifično navedenih procenata, u poređenju sa prirodnim ili kontrolnim nivoima.

[0028] Kako se ovde koristi, izraz „subjekt” označava bilo koju metu administracije. Subjekt može da bude kičmenjak, na primer, sisar. Dakle, subjekt može da bude čovek. Izraz ne označava određeni uzrast ili pol. Dakle, odrasli, maloletni i novorođeni subjekti, bilo da su muškarci ili žene, su pokriveni. Pacijent se odnosi na subjekta koji ima bolest ili poremećaj. Izraz „pacijent” uključuje humane i veterinarske subjekte.

[0029] Izraz „muskarinski acetilholinski receptori” označava glavne krajnje receptore kuplovane sa G proteinom koji su stimulisani acetilholinom koji se oslobađa iz nekoliko tipova ćelija uključujući senzorne neurone, keratinocite i postganglionska vlakna u parasimpatičkom nervnom sistemu, i funkcionišu kao signalni molekuli koji iniciraju signalne kaskade unutar ćelija u njihovim neposrednim regionima.

[0030] Izraz „antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora” kako se ovde koristi, označava jedno ili više ekstrahovanih prirodnih sredstava, prečišćenih sredstava koji se javljaju u prirodi, hemijski sintetizovanih sredstava, njihovih soli, njihovih derivata i njihovih homologa, koji smanjuju aktivnosti i/ili funkciju muskarinskih acetilholinskih receptora koji se nalaze u neuronima i drugim ćelijama.

[0031] Kako se ovde koriste, izrazi „tretman”, „lečenje” i slično se odnose na postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može da bude profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja bolesti ili njenih simptoma i/ili može da bude terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili štetnog uticaja koji se može pripisati bolesti. „Lečenje”, kako se ovde koristi, pokriva bilo koji tretman bolesti kod sisara, posebno kod čoveka, a uključuje: (a) sprečavanje pojave bolesti kod subjekta koji može da ima predispozicije za bolest, ali još uvek nije dijagnostikovano da je ima; (b) inhibiranje bolesti, tj. zaustavljanje njenog razvoja; i (c) ublažavanje bolesti, tj. izazivanje regresije bolesti.

[0032] Izraz „terapeutski efikasan” znači da je količina upotrebljene kompozicije dovoljna da ublaži jedan ili više uzroka ili simptoma bolesti ili poremećaja. Takvo poboljšanje zahteva samo smanjenje ili izmenu, a ne nužno i eliminaciju. „Terapeutski efikasna količina” će varirati u zavisnosti od jedinjenja, bolesti i njene težine i starosti, telesne mase, itd., subjekta koji se leči.

[0033] Kako se ovde koristi, „farmaceutska kompozicija” obuhvata bilo koju kompoziciju za: (i) lokalnu primenu (administriranje), ili (ii) transdermalnu primenu ili (iii) parenteralnu primenu, ili (iv) oralnu primenu, antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora subjektu kome je potrebna terapija za distalnu simetričnu polineuropatiju. Farmaceutske kompozicije mogu da uključuju nosače, zgušnjivače, razblaživače, pufere, konzervanse, površinski aktivna sredstva i slično pored antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora. Farmaceutske kompozicije mogu, takođe, da uključuju jedan ili više aktivnih sastojaka kao što su antimikrobna sredstva, antiinflamatorna sredstva, anestetici i slično.

[0034] Izraz „pojedinačni dozni oblik” kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao pojedinačne doze za ljude i životinje, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora izračunatu u količini koja je dovoljna da proizvede željeni efekat u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem ili vehikulumom.

[0035] Izraz „nosač” označava jedinjenje, kompoziciju, supstancu ili strukturu koja, kada je u kombinaciji sa antagonistom muskarinskog acetilholinskog receptora ili kompozicijom, pomaže ili olakšava pripremu, skladištenje, administriranje, isporuku, efikasnost, selektivnost ili bilo koju drugu karakteristiku antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora ili kompozicije za njegovu predviđenu upotrebu ili svrhu. Na primer, nosač se može izabrati tako da se minimizira bilo kakva degradacija antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora i da se minimiziraju bilo koje neželjene nuspojave kod subjekta.

[0036] Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju suštinski hemijski inertne i netoksične farmaceutske kompozicije koje ne ometaju efikasnost biološke aktivnosti farmaceutske kompozicije. Pogodni nosači i njihove formulacije opisani su u Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995. Obično, odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli se koristi u formulaciji da se formulacija učini izotoničnom. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, slane rastvore, rastvore glicerola, etanol, N-(1(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), diolesilfosfotidiletanolamin (DOPE) i lipozome. Takve farmaceutske kompozicije treba da sadrže terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača kako bi se obezbedio oblik za pravilno davanje subjektu. Formulacija treba da odgovara načinu administriranja. Na primer, oralno administriranje zahteva enterične obloge za zaštitu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora od degradacije u gastrointestinalnom traktu. U drugom primeru, antagonisti muskarinskih acetilholinskih receptora mogu se davati u lipozomalnoj formulaciji da bi se olakšao transport kroz vaskularni sistem subjekta i uticalo na isporuku preko ćelijskih membrana do intracelularnih mesta.

[0037] Izraz „ekscipijens” ovde označava bilo koju supstancu, koja sama po sebi nije terapeutsko sredstvo, koja se može koristiti u kompoziciji za isporuku antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora subjektu ili alternativno kombinovati sa antagonistom muskarinskih acetilholinskih receptora (npr. da bi se stvorila farmaceutska kompozicija) da bi se poboljšala svojstva rukovanja ili skladištenja ili da bi se omogućilo ili olakšalo formiranje pojedinačne doze kompozicije (npr. formiranje topikalnog hidrogela koji onda može opciono da se ugradi u transdermalni flaster). Ekscipijensi uključuju, u svrhu ilustracije a ne ograničenja, veziva, dezintegrante, pojačivače ukusa, rastvarače, sredstva za zgušnjavanje ili geliranje (i bilo koja sredstva za neutralizaciju, ukoliko je potrebno), pojačivače penetracije, sredstva za rastvaranje, sredstva za vlaženje, antioksidanse, maziva, emolijense, supstance koje se dodaju da maskiraju ili suzbijaju neprijatan smrad, mirise ili ukus, supstance koje se dodaju da poboljšaju izgled ili teksturu kompozicije i supstance koje se koriste za formiranje farmaceutskih kompozicija. Bilo koji takav ekscipijens može se koristiti u bilo kom doznom obliku prema predmetnom pronalasku. Prethodne klase ekscipijenasa nisu zamišljene da budu konačne, već samo ilustrativne jer prosečan stručnjak u tehnici prepoznaje da se dodatni tipovi i kombinacije ekscipijenasa mogu koristiti za postizanje željenih ciljeva za isporuku antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora.

[0038] Pirenzepin je dobro poznati lek koji se koristi za lečenje čira na dvanaestopalačnom crevu, čira na želucu i crevnih problema, bilo sam ili u kombinaciji sa antacidima ili drugim lekovima kao što je ranitidin. Pirenzepin se koristi za ublažavanje grčeva i/ili spazma u želucu, crevima i bešici. Pored toga, pirenzepin može da se koristi kao profilaktičko sredstvo za sprečavanje mučnine, povraćanja i morske bolesti. Pirenzepin pripada sledećim kategorijama lekova: (a) lekovi protiv čira, (b) antimuskarinici, (c) antispazmodici i (d) muskarinski antagonisti.

[0039] Primarni efekti pirenzepina su posledica njegovog vezivanja i modulacije muskarinskog acetilholinskog receptora. Muskarinski acetilholinski receptor posreduje u različitim ćelijskim odgovorima, uključujući inhibiciju adenil ciklaze, razgradnju fosfoinozitida i modulaciju kalijumovih kanala kroz delovanje G proteina. Trenutne terapeutske upotrebe pirenzepina su zasnovane na oralno primenjenim kompozicijama. Pirenzepin se apsorbuje iz gastro-digestivnog trakta i nakon asimilacije modulira sekreciju želudačne kiseline, sekreciju pljuvačke, centralni nervni sistem, kardiovaskularne, očne i urinarne funkcije. Efikasne doze u oralno administriranim kompozicijama pirenzepina za ove indikacije su u rasponu od oko 50 do 300 mg/dan, oko 75 do 225 mg/dan, oko 100 do 150 mg/dan.

[0040] Molekularna formula za pirenzepin C19H21N5O2sa molekulskom težinom od 351,402. IUPAC naziv pirenzepina je 11-[2-(4-metilpiperazin-1-il)acetil]-5H-pirido[2,3-b][1,4]benzodiazepin-6-1. Pirenzipin je dostupan kao so ili hidrat HCL.

[0041] Iznenađujuće smo otkrili da kultivisanje pobuđenih odraslih i juvenilnih neurona dijabetesnih pacova u medijumu za kulturu koji sadrži pirenzepin stimuliše rast neurita iz pobuđenih neurona. Pored toga, otkrili smo da sve lokalne primene, supkutane injekcije, injekcije pirenzepina na i u različite mete na koži kod dijabetesnih miševa: (i) sprečavaju deficite u brzini provodljivosti motornih nerava, (ii) sprečavaju i poništavaju gubitak intraepidermalnih nervnih vlakana, (iii) sprečavaju gubitak subepidermalnog nervnog spleta, (iv) sprečavaju taktilnu alodiniju i (v) sprečavaju i preokreću razvoj termalne hipoalgezije. Štaviše, otkrili smo da je oralna primena pirenzepina preokrenula senzornu neuropatiju.

[0042] Imajući u vidu ove izvanredne rezultate, procenili smo druge antagoniste muskarinskih acetilholinskih receptora zbog njihovog potencijala da preokrenu gubitak intraepidermalnih nervnih vlakana povezan sa dijabetesom i termalnu hipoalgeziju. Antagonisti muskarinskih acetilholinskih receptora su sredstva koji smanjuju aktivnosti i/ili funkciju muskarinskih acetilholinskih receptora koji se nalaze u plazma membranama neurona i drugih ćelija. Muskarinski acetilholinski receptori su glavni krajnji receptori kuplovani sa G proteinom koji su stimulisani acetilholinom koji se oslobađa iz nekoliko tipova ćelija, uključujući senzorne neurone, keratinocite i postganglionska vlakna u parasimpatičkom nervnom sistemu, i funkcionišu kao signalni molekuli koji iniciraju signalne kaskade unutar ćelija u njihovom neposrednom regionu. Dobro poznati antagonisti muskarinskih acetilholinskih receptora korisni za lečenje bolesti kao što su poremećaj centralnog nervnog sistema, plućne bolesti i želudačne bolesti su na primer atropin, skopolamin, telenzepin, hioscin, ipratropijum tropikamid, ciklopentolat, glikopirolatm 4-difenilacetoksi-1,1-dimetilpiperidinijum, kinidin, orfenadrin, oksifenonijum, emepronijum, prociklidin, propantelin, 4-fluorheksahidrosiladifenidol, oktilonijum, hinuklidinil benzilat, tolterodin, benaktizin, bipreiden, diciklomin, beztropin, deksetimid, heksahidrosiladifenidol, između ostalih.

[0043] Dalje, pored pirenzepina, postoji izvestan broj selektivnih antagonista muskarinskog receptora tipa 1 (MIR) i drugih podtipova muskarinskih receptora za koje se očekuje da ispoljavaju korisne aktivnosti slične onima koje pokazuje pirenzepin na rast neurita neurona. Neka od ovih jedinjenja imaju mnogo bolju M1R selektivnu aktivnost. Na primer, telenzepin, analog pirenzepina sa izmenjenom tricikličnom strukturom, ali nemodifikovanim bočnim lancem piperazina, je 4 do 10 puta potentniji od pirenzepina. VU0255035, derivat tiadiazola i 75 puta je selektivniji za M1R u odnosu na M2, M3, M4 i M5 receptore. Među novom generacijom M1R antagonista, postoje tri obećavajuća centralno aktivna M1R antagonista, PD150714 i 77-LH-28-1 i spirotramin. Liste pogodnih antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora pogodnih za inkorporaciju u terapeutske kompozicije pronalaska prikazane su u Tabeli 1. Dalja jedinjenja za distalnu simetričnu polineuropatiju i/ili taktilnu alodiniju su stavljena su na uvid javnosti u Tabelama 2-4 kao referenca.

Tabela 1: Hemijska klasifikacija M1R antagonista i njihovih reprezentativnih struktura.

1

Tabela 2 (referentna jedinjenja): M1R mešani antagonisti, odnosno, jedinjenja koja pokazuju antagonističke efekte na više od jednog podtipa muskarinskih receptora, uključujući M1.

1

Tabela 3 (referentna jedinjenja): Selektivni ne-M1 muskarinski antagonisti (tj. selektivni za M2, M3, M4 ili M5)

Tabela 4 (referentna jedinjenja): Neselektivni muskarinski antagonisti (strukture na bazi skopolamina)

[0044] Gornji opisi hemijskih struktura u Tabelama 1 do 4 ukazuju na to da jedinjenja koja pokazuju M1R selektivnu aktivnost zahtevaju definisane karakteristike i da promene u strukturama mogu da učine da M1R selektivni antagonist bude M3R selektivan ili M2R selektivan, i obrnuto. Na primer, jedinjenje 1 u Tabeli 2 i jedinjenje 1 u Tabeli 3 pripadaju istoj klasi lekova, ali promena u obrascu supstitucije na bočnom lancu piperazina određuje selektivnost M1 u odnosu na M1/M3. Dakle, hemijska jedinjenja koja pripadaju gornjim opštim hemijskim strukturama, ali sa strukturnim varijacijama, mogu da i dalje poseduju M1 selektivnu antagonističku aktivnost, što omogućava njihovu primenu kod simetrične dijabetesne polineuropatije. Shodno tome, mogu se dizajnirati generičke formule koje obuhvataju strukturne karakteristike za antagoniste, uključujući ona jedinjenja koja su

1

M1R selektivna (za upotrebu u skladu sa pronalaskom) i M1R neselektivna (za koje se zaštita ne traži). Primeri odgovarajućih formula su Formula I i Formula II.

R1 može da bude jedan od 5-članog nezasićenog prstena, 6-članog nezasićenog prstena ili prstena koji sadrži hetero atom;

R2 može da bude jedan od 5-članog nezasićenog prstena, 6-članog nezasićenog prstena ili prstena koji sadrži hetero atom;

R3 može da bude jedan od H-piperidinil grupe, 2-piperidinil grupe, 3-piperidinil, 4-piperidinil grupe, 2-piperazinil grupe ili 3-piperazinil grupe, povezan preko metil grupe ili etil grupe ili propil grupe ili butil grupe. Piperidinil grupe ili piperazinil grupe mogu dodatno da budu vezane za metilni, trifluorometilni ili etilni deo.

R4 može da bude jon vodonika ili hloridni jon.

R5 može da bude jon vodonika ili hloridni jon.

R6 može da bude jon vodonika ili hloridni jon.

R7 može da bude jon vodonika ili hloridni jon.

X može da bude metil grupa ili „NR” grupa, tj. primarna aminska grupa, sekundarna aminska grupa, ili tercijarna aminska grupa.

R1 može da bude ili

1

pri čemu „ “ označava tačku veze R1 sa gornjom strukturom u Formuli II.

R2 može da bude hidroksilni jon ili jon vodonika ili keton.

R3 može da bude hidroksilni jon ili jon vodonika ili keton.

[0045] U jednoj realizaciji, ovde stavljene na uvid javnosti farmaceutske kompozicije sadrže antagonist(e) muskarinskih acetilholinskih receptora, u ukupnoj težinskoj količini kompozicije od oko 0,1% do oko 95%. Na primer, količina antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora, prema težini farmaceutske kompozicije, može da bude oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, oko 2%, oko 2,1%, oko 2,2%, oko 2,3%, oko 2,4%, oko 2,5%, oko 2,6%, oko 2,7%, oko 2,8%, oko 2,9%, oko 3%, oko 3,1%, oko 3,2%, oko 3,3%, oko 3,4%, oko 3,5%, oko 3,6%, oko 3,7%, oko 3,8%, oko 3,9%, oko 4%, oko 4,1%, oko 4,2%, oko 4,3%, oko 4,4%, oko 4,5%, oko 4,6%, oko 4,7%, oko 4,8%, oko 4,9%, oko 5%, oko 5,1%, oko 5,2%, oko 5,3%, oko 5,4%, oko 5,5 %, oko 5,6 %, oko 5,7 %, oko 5,8 %, oko 5,9 %, oko 6 %, oko 6,1 %, oko 6,2 %, oko 6,3 %, oko 6,4 %, oko 6,5 %, oko 6,6 %, oko 6,7 %, oko 6,8 %, oko 6,9 %, oko 7 %, oko 7,1 %, oko 7,2%, oko.7,3%, oko 7,4%, oko 7,5%, oko 7,6%, oko 7,7%, oko 7,8%, oko 7,9%, oko 8%, oko 8,1%, oko 8,2%, oko 8,3%, oko 8,4%, oko 8,5%, oko 8,6%, oko 8,7%, oko 8,8%, oko 8,9%, oko 9%, oko 9,1%, oko 9,2%, oko 9,3%, oko 9,4%, oko 9,5%, 9,6%, oko 9,7%, oko 9,8%, oko 9,9%, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95%.

[0046] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema predmetnom pronalasku koje sadrže antagonist(e) muskarinskih acetilholinskih receptora mogu biti formulisane za topikalnu primenu ili alternativno, za transdermalnu primenu, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0047] Farmaceutska kompozicija za lokalnu primenu može da bude obezbeđena kao, na primer, masti, kreme, suspenzije, losioni, praškovi, rastvori, paste, gelovi, hidrogelovi, sprejevi, aerosoli ili ulja. Kada se formuliše u obliku masti, aktivni sastojak se može koristiti ili sa parafinskom ili sa osnovom masti koja se meša sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak može da bude formulisan u kremi na bazi ulja u vodi ili vode u ulju.

[0048] Farmaceutska kompozicija za transdermalnu primenu može da se obezbedi kao, na primer, hidrogel koji sadrži antagonist(e) muskarinskih acetilholinskih receptora koji je ugrađen u kompoziciju adhezivnog flastera namenjenog da ostane u intimnom kontaktu sa epidermom subjekta tokom produženog vremenskog perioda. Primer kompozicije adhezivnog flastera može da sadrži monolitni sloj proizveden mešanjem antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora sa adhezivom silikonskog tipa ili alternativno akrilat-vinil acetatnim adhezivom u rastvaraču čiji su primeri metilen hlorid, etil acetat, izopropilmiristat i propilen glikol. Smeša bi se zatim ekstrudirala na foliju sa poliesterskom podlogom do ujednačene debljine od oko 100 mikrona ili veće pomoću preciznog aplikatora za mokri film. Rastvarač se ostavi da ispari u sušnici i dobijeni „flaster” se seče na odgovarajuću veličinu.

1

[0049] Farmaceutik za topikalnu primenu ili alternativno za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora prema pronalasku dodatno uključuje jedan ili više pojačivača penetracije ili korastvarača i može opciono da sadrži sredstvo za zgušnjavanje ili sredstvo za geliranje i/ili emolijens i/ili antioksidans i/ili antimikrobni konzervans i/ili emulgator i/ili rastvarač koji se meša sa vodom i/ili alkohol i/ili vodu.

[0050] Prema pronalasku, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora kao što je definisano u priloženim patetnnim zahtevima sadrži jedno ili više sredstava za poboljšanje penetracije ili korastvarača za transdermalnu ili topikalnu primenu. Pojačivač penetracije je ekscipijens koji pomaže u difuziji aktivne supstance kroz stratum corneum. Mnogi pojačivači penetracije, takođe, funkcionišu kao korastvarači za koje se smatra da povećavaju termodinamičku aktivnost ili rastvorljivost antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora u kompoziciji. Pojačivači penetracije su, takođe, poznati kao akceleransi, adjuvansi ili pospešivači sorpcije. Pogodan pojačivač penetracije za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani treba da: (i) bude veoma potentan, sa specifičnim mehanizmom delovanja; (ii) pokazuje brz početak delovanja nakon primene; (iii) ima predvidljivo trajanje delovanja; (iv) ima samo netrajne ili reverzibilne efekte na kožu; (v) je hemijski stabilan; (vi) nema ili ima minimalne farmakološke efekte; (vii) bude fizički i hemijski kompatibilan sa drugim komponentama kompozicije; (viii) je bez mirisa; (ix) je bezbojan; (x) je hipoalergen; (xi) ne izaziva iritaciju; (xii) nije fototoksičan; (xiii) je nekomedogen; (xiv) ima parametar rastvorljivosti koji je približan parametru kože (10,5 cal/cm<3>); (xv) je lako dostupan; (xvi) je jeftin; i (xvii) je u stanju da se formuliše u farmaceutskim kompozicijama za topikalnu ili transdermalnu isporuku aktivnog farmaceutskog sredstva.

[0051] Nekoliko klasa hemijskih jedinjenja, sa različitim mehanizmima delovanja, mogu se koristiti kao pojačivači penetracije. U daljem tekstu su navedeni neograničavajući primeri sredstava za poboljšanje penetracije, od kojih su mnoga, takođe, pogodni korastvarači. Sulfoksidi, kao što su dimetilsulfoksid i decilmetilsulfoksid mogu se koristiti kao sredstva za poboljšanje penetracije. Dimetilsulfoksid delimično poboljšava penetraciju povećanjem fluidnosti lipida i pospešivanjem particionisanja lekova. Nasuprot tome, decilmetilsulfoksid pojačava penetraciju tako što reaguje sa proteinima u koži koji menjaju konformaciju proteina, što rezultira stvaranjem vodenih kanala.

[0052] Druga klasa pojačivača penetracije su alkanoni, kao što su N-heptan, N-oktan, N-nonan, N-dekan, N-undekan, N-dodekan, N-tridekan, N-tetradekan i N-heksadekan. Smatra se da alkanoni poboljšavaju prodiranje aktivnog sredstva menjajući stratum corneum. Sledeća klasa pojačivača penetracije su alkanol alkoholi, kao što su etanol, propanol, butanol, 2-butanol, pentanol, 2-pentanol, heksanol, oktanol, nonanol, dekanol i benzil alkohol. Alkanol alkoholi male molekularne težine, tj. oni sa 6 ili manje ugljenika, mogu delimično da pojačaju penetraciju delujući kao sredstva za rastvaranje, dok više hidrofobni alkoholi mogu da povećaju difuziju ekstrakcijom lipida iz stratum corneuma. Sledeća klasa pojačivača penetracije su masni alkoholi, kao što su oleil alkohol, kapril alkohol, decil alkohol, lauril alkohol, 2-lauril alkohol, miristil alkohol, cetil alkohol, stearil alkohol, oleil alkohol, linoleil alkohol i linolenil alkohol. Polioli, uključujući propilen glikol, polietilen glikol, etilen glikol, dietilen glikol, trietilen glikol, dipropilen glikol, glicerol, propandiol, butandiol, pentandiol, heksantriol, propilen glikol monolaurat i dietilen glikol monometil etar (transkutol) takođe poboljšavaju penetraciju. Neki polioli, kao što je propilen glikol, mogu da funkcionišu kao pojačivači penetracije solvatacijom alfa-kertina i zauzimanjem mesta vodonične veze, čime se smanjuje količina vezivanja aktivnog tkiva.

[0053] Druga klasa pojačivača penetracije su amidi, uključujući ureu, dimetilacetamid, dietiltoluamid, dimetilformamid, dimetiloktamid, dimetildekamid i biorazgradivu cikličnu ureu (npr. 1-alkil-4-imidazolin-2-on). Amidi imaju različite mehanizme poboljšanja penetracije. Na primer, neki amidi, kao što je urea, povećavaju hidrataciju stratum corneuma, deluju keratolitički i stvaraju hidrofilne difuzione

1

kanale. Nasuprot tome, drugi amidi, kao što su dimetilacetamid i dimetilformamid, povećavaju particionisanje na keratin pri niskim koncentracijama, dok povećavaju fluidnost lipida i ometaju pakovanje lipida pri većim koncentracijama. Druga klasa sredstava za poboljšanje penetracije su derivati pirolidona, kao što su 1-metil-2-pirolidon, 2-pirolidon, 1-lauril-2-pirolidon, 1-metil-4-karboksi-2-pirolidon, 1-lauril-4-karboksi-2-pirolidon, 1-metil-4-metoksikarbonil-2-pirolidon, 1-heksil-4-metoksikarbonil-2-pirolidon, 1-lauril-4-metoksikarbonil-2-pirolidon, N-metil-pirolidon, N-cikloheksilpirolidon, N-dimetilaminopropil-pirolidon, N-kokoalkipirolidon i N-talovalkipirolidon, kao i biorazgradivi derivati pirolidona, uključujući estre masnih kiselina N-(2-hidroksietil)-2-pirolidona. Derivati pirolidona delimično povećavaju penetraciju kroz interakcije sa keratinom u stratum corneum i lipidima u strukturi kože. Dodatna klasa pojačivača penetracije su ciklični amidi, uključujući 1-dodecilazacikloheptan-2-on, takođe poznat kao Azone® (Azone je registrovani žig Echo Therapuetics Inc., Franklin, MA, SAD), 1-geranilazacikloheptan-2-on, 1-farnezilazacikloheptan-2-on, 1-geranilgeranilazacikloheptan-2-on, 1-(3,7-dimetiloktil)-azacikloheptan-2-on, 1-(3,7,11-trimetildodecil)azaciklohaptan-2-on, 1-geranilazacikloheksan-2-on, 1-geranilazaciklopentan-2,5-dion i 1-farnezilazaciklopentan-2-on. Ciklični amidi, kao što je Azone®, pojačavaju prodiranje aktivnih sredstava delimično utičući na strukturu lipida u stratum corneumu, povećavajući particionisanje i povećavajući fluidnost membrane. Dodatne klase pojačivača penetracije uključuju dietanolamin, trietanolamin i heksametilenlauramid i njegove derivate.

[0054] Dodatni pojačivači penetracije uključuju linearne masne kiseline, kao što su oktanska kiselina, linolna kiselina, valerinska kiselina, heptanska kiselina, pelagonska kiselina, heksanska kiselina, kaprinska kiselina, laurinska kiselina, miristrinska kiselina, stearinska kiselina, oleinska kiselina i kaprilna kiselina. Linearne masne kiseline delimično povećavaju penetraciju putem selektivne perturbacije međućelijskih lipidnih dvoslojeva. Pored toga, neke linearne masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, poboljšavaju penetraciju smanjenjem temperature faznog prelaza lipida, čime se povećava sloboda kretanja ili fluidnost lipida. Razgranate masne kiseline, uključujući izovalerinsku kiselinu, neopentansku (pivalinsku) kiselinu, neoheptansku kiselinu, nonansku kiselinu, trimetil heksaonsku kiselinu, neodekansku kiselinu i izostearinsku kiselinu, još su jedna klasa pojačivača penetracije. Dodatna klasa pojačivača penetracije su estri alifatičnih masnih kiselina, kao što su etil oleat, izopropil n-butirat, izopropil n-heksanoat, izopropil n-dekanoat, izopropil miristat („IPM”), izopropil palmitat i oktildodecil miristat. Estri alifatičnih masnih kiselina povećavaju penetraciju povećanjem difuznosti u stratum corneum i/ili koeficijenta particionisanja. Pored toga, određeni estri alifatičnih masnih kiselina, kao što je IPM, poboljšavaju penetraciju direktnim delovanjem na stratum corneum i prožimanjem u dvosloje lipozoma i na taj način povećavaju fluidnost. Alkil estri masnih kiselina, kao što su etil acetat, butil acetat, metil acetat, metil valerat, metil propionat, dietil sebakat, etil oleat, butil stearat i metil laurat, mogu delovati kao pojačivači penetracije. Alkil estri masnih kiselina delimično povećavaju penetraciju povećanjem fluidnosti lipida.

[0055] Dodatna klasa pojačivača penetracije su anjonski surfaktanti, uključujući natrijum laurat, natrijum lauril sulfat i natrijum oktil sulfat. Anjonski surfaktanti poboljšavaju penetraciju aktivnih sredstava menjajući barijernu funkciju stratum corneuma i omogućavajući uklanjanje sredstava rastvorljivih u vodi koji normalno deluju kao plastifikatori. Dalja klasa pojačivača penetracije su katjonski surfaktanti, kao što su cetiltrimetilamonijum bromid, tetradeciltrimetilamonijum, oktiltrimetil amonijum bromid, benzalkonijum hlorid, oktadeciltrimetilamonijum hlorid, cetilpiridinijum hlorid, dodeciltrimetilamonijum hlorid i heksadeciltrimetilamonijum hlorid. Katjonski surfaktanti poboljšavaju penetraciju adsorbujući i stupajući u interakciju sa interfejsima bioloških membrana, što dovodi do oštećenja kože. Sledeća klasa pojačivača penetracije su cviterjonski surfaktanti, kao što su heksadecil trimetil amoniopropan sulfonat, oleil betain, kokamidopropil hidroksisultain i kokamidopropil betain. Nejonski surfaktanti su na primer poliksamer 231, poliksamer

1

182, poliksamer 184, polisorbat 20, polisorbat 60, Brij® 30, Brij® 93, Brij® 96, Brij® 99 (Brij je registrovani žig Uniqema Americas LLC, Vimington, DE, SAD), Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 80, Span® 85 (Span je registrovani žig kompanije Uniqema Americas LLC, Vilmington, DE, SAD), Tween® 20, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 80 (Tween je registrovani žig kompanije Uniqema Americas LLC, Vilmington, DE, SAD), Myrj 45, Myrj 51, Myrj 52 i Miglyol® 840 (Miglyol je registrovani žig kompanije Sasol Germany GMBH Corp, Hamburg, Fed. Rep. Nemačka) i slično. Nejonski surfaktanti delimično povećavaju penetraciju emulgujući sebum i povećavajući termodinamičku aktivnost ili rastvorljivost aktivne supstance.

[0056] Još jedna klasa pojačivača penetracije povećava termodinamičku aktivnost ili rastvorljivost aktivne supstance, što uključuje, ali nije ograničeno na, n-oktanol, natrijum oleat, D-limonen, monoolein, cineol, oleil oleat i izopropril miristat.

[0057] Drugi pojačivači penetracije su žučne soli, kao što su natrijum holat, natrijumove soli tauroholne kiseline, glikolne kiseline i dezoksiholne kiseline. Takođe je utvrđeno da lecitin ima karakteristike koje povećavaju penetraciju. Dodatna klasa pojačivača penetracije su terpeni, koji uključuju ugljovodonike, kao što su d-limonen, alfa-pinen i beta-karen; alkoholi, kao što su alfa-terpineol, terpinen-4-ol i karvol; ketoni, kao što su askarvon, pulegon, piperiton i menton; oksidi, kao što su cikloheksen oksid, limonen oksid, alfa-pinen oksid, ciklopenten oksid i 1,8-cineol; i ulja kao što su ilang-ilang, anis, chenopodium i eukaliptus. Terpeni delimično pojačavaju penetraciju tako što ometaju međućelijski lipidni dvosloj da bi povećali difuznost aktivnih i otvarajući polarne puteve unutar i preko stratum corneuma. Organske kiseline, kao što su salicilna kiselina i salicilati (uključujući njihove derivate metil, etil i propil glikola), limunska kiselina i jantarna kiselina, pojačivači su penetracije. Druga klasa pojačivača penetracije su ciklodekstrini, uključujući 2-hidroksipropil-beta-ciklodekstrin i 2,6-dimetil-beta-ciklodekstrin. Ciklodekstrini poboljšavaju propusnost aktivnih sredstava formiranjem inkluzijskih kompleksa sa lipofilnim aktivnim sastojcima i povećavanjem njihove rastvorljivosti u vodenim rastvorima.

[0058] Sredstvo(a) za poboljšanje penetracije i/ili korastvarač(i) su prisutni u farmaceutskoj kompoziciji za topikalnu ili transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora u količini koja je dovoljna da obezbedi željeni nivo transporta leka kroz stratum corneum i epidermis ili da poveća termodinamičku aktivnost receptora ili da se poveća rastvorljivost antagonista acetilholinskih receptora. Jedan ili više farmaceutski prihvatljivih pojačivača penetracije i/ili korastvarača mogu biti prisutni u ukupnoj težinskoj količini od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1,0%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4 %, oko 1,5 %, oko 1,6 %, oko 1,7 %, oko 1,8 %, oko 1,9 %, oko 2,0 %, oko 2,1 %, oko 2,2 %, oko 2,3 %, oko 2,4 %, oko 2,5 %, oko 2,6 %, oko 2,7 %, oko 2,8 %, oko 2,9 %, oko 3,0%, oko 3,1%, oko 3,2%, oko 3,3 %, oko 3,4 %, oko 3,5 %, oko 3,6 %, oko 3,7 %, oko 3,8 %, oko 3,9 %, oko 4,0 %, oko 4,1 %, oko 4,2 %, oko 4,3 %, oko 4,4 %, oko 4,5 %, oko 4,6 %, oko 4,7 %, oko 4,8 %, oko 4,9 %, oko 5,0 %, oko 5,1%, oko 5,2%, oko 5,3%, oko 5,4%, oko 5,5%, oko 5,6%, oko 5,7%, oko 5,8%, oko 5,9%, oko 6,0%, oko 6,1%, oko 6,2%, oko 6,3%, oko 6,4%, oko 6,5%, oko 6,6%, oko 6,7%, oko 6,8%, oko 6,9%, oko 7,0%, oko 7,1%, oko 7,2%, oko 7,3%, oko 7,4%, oko 7,5%, oko 7,6%, oko 7,7%, oko 7,8%, oko 7,9%, oko 8,0%, oko 8,1%, oko 8,2%, oko 8,3%, oko 8,4%, oko 8,5%, oko 8,6%, oko 8,7%, oko 8,8%, oko 8,9%, oko 9,0%, oko 9,1%, oko 9,2%, oko 9,3%, oko 9,4%, oko 9,5%, oko 9,6%, oko 9,7%, oko 9,8%, oko 9,9% ili oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20 %, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24%, oko 25%, oko 26%, oko 27%, oko 28%, oko 29%, oko 30%, oko 31%, oko 32%, oko 33%, oko 34%, oko 35%, oko 36%, oko 37%, oko 38%, oko 39%, oko 40%, oko 41%, oko 42%, oko 43%, oko 44%, oko 45%, oko 46%, oko 47%, oko 48%, oko 49%, oko 50%, oko 51%, oko 52%, oko 53%, oko 54%, oko 55%, oko 56%, oko 57%, oko 58%, oko 59%, oko 60%, oko 61%, oko 62%, oko 63%, oko 64%, oko 65%, oko 66%, 67%, oko 68%, oko 69%, oko 70%, oko 71%, oko 72%, oko 73%, oko 74%, oko 75%, oko 76%, oko 77%,

2

oko 78%, oko 79%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, ili oko 95%.

[0059] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora može da sadrži sredstvo za zgušnjavanje ili geliranje pogodno za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama i postupcima za povećanje viskoziteta kompozicije. Pogodna sredstva (takođe poznata kao sredstva za geliranje) su primeri neutralizovanih anjonskih polimera ili neutralizovanih karbomera, kao što su poliakrilna kiselina, karboksipolimetilen, karboksimetilceluloza i slično, uključujući derivate Ultrez 10, Carbopol® polimera, kao što su Carbopol® Carbopol® 940, Carbopol® 941, Carbopol® 954, Carbopol® 980, Carbopol® 981, Carbopol® ETD 2001, Carbopol® EZ-2 i Carbopol® EZ-3. (Carbopol je registrovani žig kompanije Lubrizol Advanced Materials Inc., Klivlend, Ohajo, SAD). Kako se ovde koristi, „neutralizovani karbomer” je sintetički polimer visoke molekulske težine, sastavljen prvenstveno od neutralizovane poliakrilne kiseline. Dalje, kada se doda baza da neutrališe rastvor karbomera, viskozitet rastvora se povećava. Pogodna su i druga poznata polimerna sredstva za zgušnjavanje, kao što su Pemulen® polimerni emulgatori, Noveon® polikarbofili (Pemulen i Noveon su registrovani žigovi Lubrizol Advanced Materials Inc.) i Klucel® (Klucel je registrovani žig Hercules Inc., Vilmington, DE, SAD). Dodatna sredstva za zgušnjavanje, pojačivači i adjuvansi se generalno mogu naći u Remingtonovoj The Science and Practice of Pharmacy, kao i u Handbook of Pharmaceutical Excipients, Arthur H. Kibbe ed. 2000. Farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora može da sadrži anjonski polimerni prekursor sredstva za zgušnjavanje, kao što je karbomer, koji je kombinovan sa neutralizatorom u količini koja je dovoljna da formira gel ili kompoziciju nalik gelu viskoznosti veće od 1000 cps mereno po Brookfiel RV DVII+ viskozimetaru sa vretenom CPE-52, sa obrtnim momentom većim od 10% i temperaturom održavanom na 25°C. Alternativno, prekursor anjonskog polimera za zgušnjavanje može da se kombinuje sa neutralizatorom izabranim iz grupe koju čine: natrijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid, arginin, aminometil propanol, tetrahidroksipropil etilendiamin, trietanolamin („TEA”), trometamin, PEG-15 kokamin, diizopropanolamin i triizopropanolamin, ili njihove kombinacije u količini dovoljnoj da neutrališe anjonski polimerni prekursor sredstva za zgušnjavanje da bi se formirao gel ili kompozicija nalik gelu u toku formiranja kompozicije. Sva sredstva za zgušnjavanje ili sredstva za geliranje su prisutna u količini koja je dovoljna da obezbedi željene reološke osobine kompozicije, koje uključuju dovoljan viskozitet za formiranje gela ili kompozicije slične gelu koja se može primeniti na kožu sisara. Sredstvo za zgušnjavanje ili sredstvo za geliranje je prisutno u ukupnoj težinskoj količini od oko 0,1%, oko 0,25%, oko 0,5%, oko 0,75%, oko 1%, oko 1,25%, oko 1,5%, oko 1,75%, oko 2,0%, oko 2,25%, oko 2,5%, oko 2,75%, oko 3,0%, oko 3,25%, oko 3,5%, oko 3,75%, oko 4,0%, oko 4,25%, oko 4,5%, oko 4,75%, oko 5,0%, oko 5,25%, oko 5,5%, oko 5,75%, oko 6,0%, oko 6,25%, oko 6,5%, oko 6,75%, oko 7,0%, oko 7,25%, oko 7,5%, oko 7,75%, oko 8,0%, oko 8,25%, oko 8,5%, oko 8,75%, oko 9,0%, oko 9,25%, oko 9,5%, oko 9,75%, oko 10%, oko 11%, oko 11,5%, oko 12%, oko 12,5%, oko 13%, oko 13,5%, oko 14%, oko 14,5% ili oko 15%.

[0060] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži emolijens. Primeri pogodnih emolijenasa su mineralno ulje, smeše mineralnog ulja i lanolinskih alkohola, cetil alkohol, cetostearil alkohol, petrolatum, petrolatum i lanolin alkoholi, vosak cetil estara, holesterol, glicerin, gliceril monostearat, izopropil miristat, izopropil palmitat, lecitin, alil kaproat, ekstrakt althea officinalis, arahidil alkohol, argobaza EUC, butilen glikol, dikaprilat/dikaprat, akacija, alantoin, karagenan, cetil dimetikon, ciklometikon, dietil sukcinat, dihidroabietil behenat, dioktil adipat, etil laurat, etil palmitat, etil stearat, izoamil laurat, oktanoat, PEG-75, lanolin, sorbitan laurat, ulje oraha, ulje pšeničnih klica, super rafinisani badem, super rafinisani susam, super rafinisana sojina zrna, oktil palmitat, kaprilni/kaprični triglicerid i gliceril kokoat. Emolijens, ukoliko je prisutan, prisutan je u ovde opisanim kompozicijama u težinskoj količini od oko 1% do oko 30%, oko 3% do oko 25%, ili oko 5% do oko 15%. Ilustrativno, jedan ili više emolijenasa su prisutni u ukupnoj količini od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9%, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24%, oko 25%, oko 26%, oko 27%, oko 28%, oko 29% ili oko 30 tež. %.

[0061] Prema sledećem aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži antioksidans. Primeri pogodnih antioksidanasa su limunska kiselina, butilovani hidroksitoluen (BHT), askorbinska kiselina, glutation, retinol, α-tokoferol, β-karoten, α-karoten, ubihinon, butilovani hidroksianizol, etilendiamintetrasirćetna kiselina, selen, cink, lignan, mokraćna kiselina, lipoinska kiselina i N-acetilcistein. Antioksidans, ukoliko je prisutan, prisutan je u ovde opisanim kompozicijama u ukupnoj količini izabranoj iz raspona od oko 0,025% do oko 1,0 tež. %.

[0062] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži antimikrobni konzervans. Ilustrativni antimikrobni konzervansi uključuju kiseline, uključujući, ali ne ograničavajući se na, benzojevu kiselinu, fenolnu kiselinu, sorbinske kiseline, alkohole, benzetonijum hlorid, bronopol, butilparaben, cetrimid, hlorheksidin, hlorbutanol, hlorkrezol, krezol, etilparaben, imidureu, metilparaben, fenol, fenoksietanol, feniletil alkohol, fenil-živa acetat, fenil-živa borat, fenil-živa nitrat, kalijum sorbat, propilparaben, natrijum propionat ili timerosal. Antimikrobni konzervans, ukoliko je prisutan, prisutan je u težinskoj količini kompozicije od oko 1%, oko 1,2%, oko 1,4%, oko 1,6%, oko 1,8%, oko 2%, oko 2,2%, oko 2,4%, oko 2,6%, oko 2,8%, oko 3,0%, oko 3,2%, oko 3,4%, oko 3,6%, oko 3,8%, oko 4%, oko 4,2%, oko 4,4%, oko 4,6%, oko 4,8% ili oko 5%.

[0063] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži jedan ili više emulgatora. Izraz „emulgator” odnosi se na sredstvo sposobno da smanji površinski napon između nepolarne i polarne faze i uključuje samoemulgatore. Pogodni emulgatori mogu da potiču iz bilo koje klase farmaceutski prihvatljivih emulgatora, kao primer ugljenih hidrata, proteina, alkohola visoke molekulske mase, sredstava za vlaženje, voskova i fino usitnjenih čvrstih materija. Opcioni emulgator, ukoliko je prisutan, prisutan je u kompoziciji u ukupnoj količini od oko 1 % do oko 25%, oko 1% do oko 20%, ili oko 1% do oko 15 tež. % kompozicije. Ilustrativno, jedan ili više emulgatora su prisutni u ukupnoj težini od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9%, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24% ili oko 25%.

[0064] Prema sledećem aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora, kako je ovde definisano, može dodatno da sadrži rastvarač koji se meša sa vodom, kao na primer propilen glikol. Pogodan rastvarač koji se meša sa vodom odnosi se na bilo koji rastvarač koji je prihvatljiv za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji i koji se meša sa vodom. Ukoliko je prisutan, rastvarač koji se meša sa vodom je prisutan u kompoziciji u ukupnoj količini od oko 1% do oko 95%, oko 2% do oko 75%, oko 3% do oko 50%, oko 4% do oko 40% ili oko 5% do oko 25 tež. % kompozicije.

[0065] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži jedan ili više alkohola. U daljoj realizaciji, alkohol je niži alkohol. Kako se ovde koristi, izraz „niži alkohol”, sam ili u kombinaciji, označava alkoholni deo ravnog ili razgranatog lanca koji sadrži jedan do oko šest atoma ugljenika. U jednoj realizaciji, niži alkohol sadrži jedan do oko četiri atoma ugljenika, a u drugoj realizaciji niži alkohol sadrži dva ili tri atoma ugljenika. Primeri takvih alkoholnih delova uključuju metanol, etanol, etanol USP (tj. 95% v/v), n-propanol, izopropanol, n-butanol, izobutanol, sek-butanol i terc-butanol. Kako se ovde koristi, izraz „etanol” se odnosi na C2H5OH . Može se koristiti kao dehidrirani alkohol USP, alkohol USP ili u bilo kom uobičajenom obliku, uključujući u kombinaciji sa različitim količinama vode. Ukoliko je prisutan, alkohol je prisutan u količini dovoljnoj da formira kompoziciju koja je pogodna za kontakt sa sisarom. Na primer, u ukupnoj težini od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9%, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24%, oko 25%.

[0066] Prema još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora kao što je ovde definisano može dodatno da sadrži vodu odvojeno u količini dovoljnoj da se postigne željena težina farmaceutske kompozicije.

[0067] Antagonist(i) muskarinskog acetilholinskog receptora sadrži oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, oko 2%, oko 2,1%, oko 2,2%, oko 2,3%, oko 2,4%, oko 2,5%, oko 2,6%, oko 2,7%, oko 2,8%, oko 2,9%, oko 3%, oko 3,1%, oko 3,2%, oko 3,3%, oko 3,4%, oko 3,5%, oko 3,6%, oko 3,7%, oko 3,8%, oko 3,9%, oko 4%, oko 4,1%, oko 4,2%, oko 4,3%, oko 4,4%, oko 4,5%, oko 4,6%, oko 4,7%, oko 4,8%, oko 4,9%, oko 5%, oko 5,1%, oko 5,2%, oko 5,3%, oko 5,4%, oko 5,5%, oko 5,6%, oko 5,7%, oko 5,8%, oko 5,9%, oko 6%, oko 6,1%, oko 6,2%, oko 6,3%, oko 6,4%, oko 6,5%, oko 6,6%, oko 6,7%, oko 6,8%, oko 6,9%, oko 7%, oko 7,1%, oko 7,2%, oko 7,3%, oko 7,4%, oko 7,5%, oko 7,6%, oko 7,7%, oko 7,8%, oko 7,9%, oko 8%, oko 8,1%, oko 8,2%, oko 8,3%, oko 8,4%, oko 8,5%, oko 8,6%, oko 8,7%, oko 8,8%, oko 8,9%, oko 9%, oko 9,1%, oko 9,2%, oko 9,3%, oko 9,4%, oko 9,5%, oko 9,6%, oko 9,7%, oko 9,8%, oko 9,9%, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24%, oko 25%, oko 26%, oko 27%, oko 28%, oko 29%, oko 30%, oko 31%, oko 32%, oko 33%, oko 34%, oko 35%, oko 36%, oko 37%, oko 38%, oko 39%, oko 40%, oko 41%, oko 42%, oko 43%, oko 44%, oko 45%, oko 46%, oko 47%, oko 48%, oko 49%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95 tež. % farmaceutske kompozicije za topikalnu primenu ili za transdermalnu primenu.

[0068] Druga realizacija se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže antagonist(e) muskarinskih acetilholinskih receptora formulisane za parenteralnu primenu injekcijom. Farmaceutske kompozicije koje se mogu injektirati prema predmetnom pronalasku sadrže pogodan rastvor nosača, na primer sterilnu vodu, fiziološki rastvor i puferovane rastvore na fiziološkom pH. Primeri odgovarajućih puferovanih rastvora su Ringerov rastvor dekstroze i Ringerov rastvor sa laktatima. Rastvor nosača može da sadrži u ukupnoj težinskoj količini od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1,0%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, oko 2,0%, oko 2,1%, oko 2,2%, oko 2,3%, oko 2,4%, oko 2,5%, oko 2,6%, oko 2,7%, oko 2,8%, oko 2,9%, oko 3,0%, oko 3,1%, oko 3,2%, oko 3,3%, oko 3,4%, oko 3,5%, oko 3,6%, oko 3,7%, oko 3,8%, oko 3,9%, oko 4,0%, oko 4,1%, oko 4,2%, oko 4,3%, oko 4,4%, oko 4,5%, oko 4,6%, oko 4,7%, oko 4,8%, oko 4,9%, oko 5,0%, oko 5,1%, oko 5,2%, oko 5,3%, oko 5,4%, oko 5,5%, oko 5,6%, oko 5,7%, oko 5,8%, oko 5,9%, oko 6,0%, oko 6,1%, oko 6,2%, oko 6,3%, oko 6,4%, oko 6,5%, oko 6,6%, oko 6,7%, oko 6,8%, oko 6,9%, oko 7,0%, oko 7,1%, oko 7,2%, oko 7,3%, oko 7,4%, oko 7,5%, oko 7,6%, oko 7,7%, oko 7,8%, oko 7,9%, oko 8,0%, oko 8,1%, oko 8,2%, oko 8,3%, oko 8,4%, oko 8,5%, oko 8,6%, oko 8,7%, oko 8,8%, oko 8,9%, oko 9,0%, oko 9,1%, oko 9,2%, oko 9,3%, oko 9,4%, oko 9,5%, oko 9,6%, oko 9,7%, oko 9,8%, oko 9,9% or oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko

2

16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, oko 20%, oko 21%, oko 22%, oko 23%, oko 24%, oko 25%, oko 26%, oko 27%, oko 28%, oko 29%, oko 30%, oko 31%, oko 32%, oko 33%, oko 34%, oko 35%, oko 36%, oko 37%, oko 38%, oko 39%, oko 40%, oko 41%, oko 42%, oko 43%, oko 44%, oko 45%, oko 46%, oko 47%, oko 48%, oko 49%, oko 50%, oko 51%, oko 52%, oko 53%, oko 54%, oko 55%, oko 56%, oko 57%, oko 58%, oko 59%, oko 60%, oko 61%, oko 62%, oko 63%, oko 64%, oko 65%, oko 66%, oko 67%, oko 68%, oko 69%, oko 70%, oko 71%, oko 72%, oko 73%, oko 74%, oko 75%, oko 76%, oko 77%, oko 78%, oko 79%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94% ili oko 95%.

[0069] Prema jednom aspektu, farmaceutske kompozicije za injekcije mogu dodatno da sadrže jedan ili više nevodenih rastvarača, na primer propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organske estre za injektiranje kao, na primer, etil oleat.

[0070] Prema drugom aspektu, farmaceutske kompozicije za injekcije mogu dodatno da sadrže jedno ili više antimikrobnih sredstava, antioksidanasa, helatnih sredstava i slično.

[0071] Farmaceutske kompozicije za injekcije mogu biti predstavljene u kontejnerima sa pojedinačnom dozom ili višedoznim kontejnerima, čiji su primeri zapečaćene ampule i bočice. Farmaceutske kompozicije koje se mogu injektirati mogu se čuvati u stanju osušenom zamrzavanjem (liofilizovanom) koje zahteva dodavanje sterilnog tečnog nosača, npr. sterilnog fiziološkog rastvora za injekcije, neposredno pre upotrebe.

[0072] Još jedan aspekt pronalaska (za koga se ne traži zaštita) odnosi se na farmaceutske kompozicije koje sadrže antagonist(e) muskarinskih acetilholinskih receptora formulisane za oralnu primenu. Oralne farmaceutske kompozicije mogu biti obezbeđene kao kapsule ili tablete; kao prah ili granule; kao rastvori, sirupi ili suspenzije (u vodenim ili nevodenim tečnostima). Tablete ili tvrde želatinske kapsule mogu da sadrže, na primer, laktozu, skrob ili njihove derivate, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat, stearinsku kiselinu ili njihove soli. Meke želatinske kapsule mogu da sadrže, na primer, biljna ulja, voskove, masti, polučvrste ili tečne poliole, itd. Rastvori i sirupi mogu da sadrže, na primer, vodu, poliole i šećere. Antagonisti muskarinskog acetilholinskog receptora mogu biti obloženi ili pomešani sa materijalom (npr. gliceril monostearat ili gliceril distearat) koji odlaže dezintegraciju ili utiče na apsorpciju aktivnog sredstva u gastrointestinalnom traktu. Tako, na primer, produženo oslobađanje aktivnog sredstva se može postići tokom mnogo sati i, ako je potrebno, aktivno sredstvo može da bude zaštićeno od razgradnje unutar gastrointestinalnog trakta. Korišćenjem prednosti različitih pH i enzimskih uslova duž gastrointestinalnog trakta, farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu se formulisati da olakšaju oslobađanje aktivnog sredstva na određenoj gastrointestinalnoj lokaciji.

[0073] Farmaceutske kompozicije opisane ovde se koriste u „farmakološki efikasnoj količini”. „Farmakološki efikasna količina” je količina antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora u kompoziciji koja je dovoljna da isporuči terapeutsku količinu aktivnog sredstva tokom intervala doziranja u kome se farmaceutska kompozicija primenjuje. Shodno tome, količina farmaceutske kompozicije koja se primenjuje za isporuku terapeutski efikasne količine antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora je oko 0,01 g, oko 0,05 g, oko 0,1 g, oko 0,2 g, oko 0,3 g, oko 0,4 g, oko 0,5 g, oko 0,6 g, oko 0,7 g, oko 0,8 g, oko 0,9 g, oko 1 g, oko 1,1 g, oko 1,2 g, oko 1,3 g, oko 1,4 g, oko 1,5 g, oko 1,6 g, oko 1,7 g, oko 1,8 g, oko 1,9 g, oko 2 g, oko 2,1 g, oko 2,2 g, oko 2,3 g, oko 2,4 g, oko 2,5 g, oko 2,6 g, oko 2,7 g, oko 2,8 g, oko 2,9 g, oko 3 g, oko 3,1 g, oko 3,2 g, oko 3,3 g, oko 3,4 g, oko 3,5 g, oko 3,6 g, oko 3,7 g, oko 3,8 g, oko 3,9 g, oko 4 g, oko 4,1 g, oko 4,2 g, oko 4,3 g, oko 4,4 g, oko 4,5 g, oko 4,6 g, oko 4,7 g, oko 4,8 g, oko 4,9 g, oko 5 g, oko 5,1 g, oko 5,2 g, oko 5,3 g, oko 5,4 g, oko 5,5 g, oko 5,6 g, oko 5,7 g, oko 5,8 g, oko 5,9 g, oko 6 g, oko 6,1 g, oko 6,2 g, oko 6,3 g, oko 6,4 g, oko 6,5 g, oko 6,6 g, oko 6,7 g, oko 6,8 g, oko 6,9 g, oko 7 g, oko 7,1 g, oko 7,2 g, oko 7,3 g, oko 7,4 g, oko 7,5 g, oko 7,6 g, oko 7,7 g, oko 7,8 g, oko 7,9 g, oko 8 g, oko 8,1 g, oko 8,2 g, oko 8,3 g, oko 8,4 g, oko 8,5 g, oko 8,6 g, oko 8,7 g, oko 8,8 g, oko 8,9 g, oko 9 g, oko 9,1 g, oko 9,2 g, oko 9,3 g, oko 9,4 g, oko 9,5 g, oko 9,6 g, oko 9,7 g, oko 9,8 g, oko 9,9 g ili oko 10 g.

[0074] Sledeći primeri su dati da potpunije opišu pronalazak i predstavljeni su u neograničajuće ilustrativne svrhe.

PRIMERI

Primer 1: Efekti pirenzepina na rast neurita iz pobuđenih neurona u modelu dijabetesa tipa 2 kod pacova

[0075] Senzorni neuroni iz cervikalnog, torakalnog i lumbalnog DRG odraslog mužjaka ZDF dijabetesnog pacova starog 3-4 meseca (model dijabetesa tipa 2) su izolovani i usitnjeni korišćenjem postupka zasnovanog na učenjima Fernyhough et al. (1993, Brain Res. 607:117-124), Gardiner et al. (2005, Mol. Cell Neurosci.28:229-240), i Huang et al. (2003, Diabetes 52:2129-2136). Ukratko, DRG su uklonjeni sa svih nivoa kičme, njihovi koreni su isečeni, a zatim su ćelije hemijski razdvojene u 0,125% kolagenaze (Worthington Biochemical Corp., Lejkvud, NJ, SAD) u F12 hranljivom medijumu (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Kanada) tokom 1,5č na 37°C. Ganglioni su potom mehanički usitnjeni tretmanom sa 0,05% tripsina (Worthington Biochemical Corp.) u F12 hranljivom medijumu, nakon čega je usledila trituracija staklenom pipetom. Dobijena ćelijska suspenzija je zatim centrifugirana na 600 rpm tokom 5 minuta kroz jastučić od 15% goveđeg serumskog albumina (BSA; Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oukvil, ON, Kanada); ova procedura je eliminisala veliki deo ćelijskih ostataka i rezultirala neuronalno obogaćenom peletom razdvojenih neurona. Neuronske ćelije su postavljene na poli-L-ornitin-laminin obložene plastične posude NUNC sa 48 ili 96 ležišta sa optički prozirnim staklenim dnom u F12 medijumu bez seruma i insulina u prisustvu modifikovanih aditiva N2 (koji ne sadrže insulin) na 37°C u 95% vazduh / 5% CO2vlažnom inkubatoru. Sve kulture su bile izložene sledećim dodatnim uslovima: 10 mM D-glukoze, 0,1 nM insulina, 0,3 ng/ml NGF, 1 ng/ml NT-3 i 5 ng/ml GDNF (sve dobijeno od Sigma-Aldrich Canada Ltd.). Nakon postavljanja, neuroni su odmah tretirani pirenzepin-HCl dozama u rasponu od 0 do 10 µM. Izrastanje neurita je zatim procenjeno na 24 sata kao što su prethodno opisali Fernyhough et al. (1993) i Gardiner et al. (2005). Podaci na Sl.1 pokazuju da povećanje doza od 0,1, 0,5, 1,0 i 10,0 µM pirenzepin-HCl progresivno povećava izrastanje neurita iz pobuđenih neurona iz modela dijabetesa tipa 2.

Primer 2 : Efekti odabranih antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora na izrastanje neurita iz pobuđenih neurona normalnog pacova

[0076] Senzorni neuroni iz cervikalnog, torakalnog i lumbalnog DRG odraslog mužjaka Sprague Dawley pacova starog 3-4 meseca nedijabetičara su izolovani i usitnjeni korišćenjem postupka opisanog u Primeru 1. Izrezane i usitnjene neuronske ćelije su postavljene u poli-L-ornitin-laminin obložene plastične posude NUNC sa 48 ili 96 ležišta sa optički prozirnim staklenim dnom u F12 medijumu bez seruma i insulina u prisustvu modifikovanih aditiva N2 (koji ne sadrže insulin) na 37°C u 95% vazduh / 5% CO2vlažnom inkubatoru. Sve kulture su bile izložene sledećim dodatnim uslovima: 10 mM D-glukoze, 0,1 nM insulina, 0,3 ng/ml NGF, 1 ng/ml NT-3 i 5 ng/ml GDNF (sve dobijeno od Sigma-Aldrich Canada Ltd.). Nakon postavljanja, neuroni su bili izloženi ovim uslovima i odmah tretirani sa jednim od sledeća tri antagonista muskarinskih acetilholinskih receptora: (A) dozama pirenzepin-HCl u rasponu od 0 do 10 µM, (B) dozama telenzepin-2HCl u rasponu od 0 do 10 µM i (C) dozama atropina u rasponu od 0 do 1.0 µM. Izrastanje neurita je zatim procenjeno na 24 sata. Podaci na Sl. 2(A) pokazuju da je najniža doza pirenzepina od 0,01 µM više nego utrostručila izrastanje neurita iz pobuđenih neurona iz

2

nedijabetesnog modela, i da povećanje doze pirenzepina od 0,1, 1,0 i 10,0 µM nije dodatno povećalo brzinu rasta neurita. Podaci na Sl.2(B) pokazuju da je najniža doza telenzepina od 0,01 µM više nego udvostručila rast neurita iz pobuđenih neurona iz nedijabetesnog modela, i da su doze od 0,1 µM i 10,0 µM utrostručile stopu rasta neurita. Podaci na Sl.2(C) pokazuju da je najniža doza atropina od 0,01 µM više nego utrostručila rast neurita iz pobuđenih neurona iz nedijabetesnog modela, i da doze od 0,1 µM i 10,0 µM nisu dodatno povećale stopu rasta neurita.

Primer 3 : Efekti niskih koncentracija dva selektivna M1R antagonista na izrastanje neurita iz pobuđenih neurona kod normalnog pacova

[0077] Senzorni neuroni iz cervikalnog, torakalnog i lumbalnog DRG odraslog mužjaka Sprague Dawley pacova starog 3-4 meseca su izolovani i usitnjeni korišćenjem postupka opisanog u Primeru 1, a zatim su kultivisani 24č u F12 medijumu bez seruma i insulina u prisustvu modifikovanih aditiva N2. Nakon postavljanja, neuroni su odmah tretirani ili: (A) dozama pirenzepin-HCl u rasponu od 0 do 0,1 µM (puni dijamanti), ili (B) novim antimuskarinskim sredstvom kodnog naziva „VU255035” (puni kvadrati). VU0255035 [N-(3-okso-3-(4-(piridin-4-il)piperazin-1-il)propil)-benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4 sulfonamid] je novi M1R specifični antagonist (Sheffler et al., 2009, Molecular Pharmacology 76: 356-368). Studije ravnotežnog vezivanja radioliganda i funkcionalne studije pokazuju selektivnost veću od 75 puta VU0255035 za M1R u odnosu na M(2)-M(5). Studije molekularne farmakologije i mutageneze pokazuju da je VU0255035 kompetitivni ortosterični antagonist M1R. VU0255035 ima odličnu penetraciju krvnomoždane barijere in vivo kod miševa. Izrastanje neurita je zatim procenjeno nakon perioda kultivisanja od 24 sata.

[0078] Ukupne dužine neurita (tj. zbir dužine svih neurita proizvedenih od strane pojedinačnog neurona) su procenjene korišćenjem metode imunološkog bojenja. Greiner Bio-One µClear ploča za kulturu tkiva sa 96 ležišta (Greiner Bio-One North America Inc., Munroe, NC, SAD) sa tankom optički čistom plastičnom površinom za rast radi optimizacije uslova rasta neurita. Četiri slike su snimljene po ležištu i frekvencija repliciranog ležišta je postavljena na n=6. Neuronski marker β-tubulin III (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) je primenjen na ćelije fiksirane formalinom. Marker je označen fluorescentnim konjugatom Alexa Fluor 488 (Invitrogen Canada Ltd.). Fluorescentne slike su prikupljene korišćenjem invertnog mikroskopa Olympus IX71 sa objektivom 20X / 0.45 PH1 LUCPLANFLN koji je bio pogodan za rešavanje slika na plastičnim površinama. Ovaj sistem je opremljen ksenonskom lampom kratkog luka i Delta Ram X monohromatorom (Photon Technology International, Birmingem, NJ, SAD) da bi se obezbedila pouzdana talasna dužina pobude. Fluorescencija snimljene slike je zatim konvertovana u 8-bitnu sliku sivih tonova da bi se kvantifikovao ukupni volumen piksela. Konkretno, neobrađena TIFF slika je otvorena korišćenjem softvera za obradu slika u javnom vlasništvu NIH sponzorisanog od strane Image J. Slika je prvo invertovana da bi se kreirala crna ciljna slika na beloj pozadini, a zatim jačina pozadinskog piksela svedena na minimum podešavanjem praga. Naredne slike su standardizovane u odnosu na podešenu vrednost praga za kontinuitet. Ukupni volumen piksela ćelija specifičnih za neurone i neurita je kvantifikovana. Volumen piksela tela ćelija je uklonjen da bi se dobio neto volumen piksela pripisan neuritima. Neto volumen piksela je normalizovan u odnosu na broj neuronskih ćelija po kvantifikovanom polju. Podaci na Sl. 3 pokazuju da: (A) koncentracije pirenzepina od 0,003 µM i veće značajno povećavaju ukupni rast neurita u neuronima izolovanim od pacova sa dijabetesom, i (B) koncentracije VU255035 od 0,03 µM i veće značajno povećavaju ukupan rast neurita u neuronima pacova sa dijabetesom.

Primer 4: Odgovori kultura senzornih neurona dobijenih od M1R nokaut miševa na tretmane pirenzepinom

2

[0079] Senzorni neuroni iz cervikalnih, torakalnih i lumbalnih DRG senzornih neurona su izolovani iz (A) miševa divljeg tipa (na pozadini 129S6 x CF1) i iz (B) M1R nokaut miševa (iz Taconic, Hudson, NJ i posredovano kroz saradnju sa Laboratory of Bioorganic Chemistry, NIH-NIDDK, Bethesda, MD) generalno prateći postupak prikazan u Primeru 1. Muskarinski acetilholinski receptor M1(M1R), takođe poznat kao holinergički receptor, inaktiviran je kod M1R nokaut miševa i stoga, primena antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora koji specifično deaktiviraju M1acetilholinski receptor neće biti fiziološki efikasna kod M1R nokaut miševa. Izolovani DRG senzorni neuroni iz divljeg tipa miševa i M1R nokaut miševa su odvojeno kultivisani tokom 24 sata u rasponu koncentracija neurotrofnog faktora rasta (NT) plus 1 µM pirenzepina. Koktel niske doze (LD) faktora rasta indukovao je značajno viši nivo izrastanja neurita u kulturama M1R nokaut miševa (Sl.4(B)) u poređenju sa onim uočenim u kulturama divljih miševa (Sl.4(A)). Maksimalni nivoi izrastanja neurita izazvani visokim dozama (HD) faktora rasta bili su isti između kultura miševa divljeg tipa (Sl.4(A)) i nokaut miševa (Sl.4(B)). Tretmani pirenzepinom su povećali rast neurita 2 puta u poređenju sa kontrolom LD u kulturama divljih miševa (Sl. 4(A)). Međutim, tretmani pirenzepinom nisu poboljšali rast neurita u kulturama M1R nokaut miševa (Sl.

4(B)). Takođe, merene su količine acetilholina koje proizvode kulture DRG senzornih neurona. Slika 5 pokazuje da kulture senzornih neurona M1R knockout miševa proizvode značajno manje acetilholina u poređenju sa kulturama divljeg tipa. Ovi podaci sugerišu da, barem u uslovima akutne ćelijske kulture, senzorni neuroni samoograničavaju izrastanje aksona putem autokrinog holinergijskog puta (verovatno putem puta koji zavisi od acetilholina/M1R). Iznenađujuća sposobnost antagonista M1R ili genetsko uklanjanje M1R da ubrza rast aksona podstakla je hipotezu da su odrasli periferni neuroni pod stalnim „holinergijskim ograničenjem” koje sprečava prekomerni rast kada dođu u kontakt sa svojom metom. Što se tiče inervacije epiderme senzornim vlaknima, keratinociti luče acetilholin i komuniciraju preko neneuronske mreže holinergijskih receptora koja je važna tokom popravke rane. Prisustvo M1R na senzornim neuronima nudi intrigantnu mogućnost da sami neuroni i/ili keratinociti koriste acetilholin kao „stop” signal za sprečavanje nekontrolisanog rasta vlakana.

Primer 5 : Efekti pirenzepina na fosforilaciju ekstracelularno regulisane proteinske kinaze (ERK) u kultivisanim senzornim neuronima

[0080] Lumbalni DRG su izolovani od muških Sprague Dawley pacova iz spoljnog uzgoja generalno sledeći postupak opisan u Primeru 1, a zatim kultivisani 24č u F12 medijumu bez seruma i insulina u prisustvu modifikovanih N2 aditiva plus 10 µM pirenzepina. Uzorci su uzeti odmah (vreme 0), a zatim nakon 15 min, 30 min, 6č i 24č inkubacije. Kvantitativni Western blot je izveden kako su podučavali Chowdhury et al (2010) i Fernyhough et al. (1999, Diabetes 48: 881-889). DRG homogenati od 5-10 µg proteina su rastvoreni na 10% SDS-PAGE gelu i elektroblotirani na nitroceluloznu membranu. Mrlje su zatim blokirane u 5% nemasnom mleku koje sadrži 0,05% Tween-20, isprane u PBS (pH 7.4 ) i inkubirane sa reagensom antitela specifičnim za fosforilisanu (Thr-202/Tyr-204) ili ukupnu ekstracelularnim signalom regulisanu kinazu (P-ERK ili T-ERK; 1:4000 i 1:2000, redom; Covance, Princeton, NJ, SAD). Mrlje su isprane, inkubirane u Western blotting Luminol reagensu (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Kruz, Kalifornija, SAD) i snimljene korišćenjem BioRad Fluor-S analizatora slike (BioRad, Hercules, Kalifornija, SAD). Podaci na Sl.6(A) i 6(B) pokazuju da je pirenzepin povećao fosforilaciju ERK (P-ERK) za približno 2 puta nakon 15 minuta sa povratkom na početnu liniju nakon 24 sata (u odnosu na ukupne nivoe ERK).

Primer 6: Efekti M1R muskarinskog antagonista VU255035 na aktivnost proteinske kinaze aktivirane AMP (AMPK) u kultivisanim senzornim neuronima

[0081] Lumbalni DRG su izolovani od mužjaka drugde uzgojenih Sprague Dawley pacova generalno sledeći postupak opisan u Primeru 1, a zatim kultivisani 6č u F12 medijumu bez seruma i insulina u prisustvu modifikovanih aditiva N2 plus 10 µM VU255035. Uzorci su uzeti odmah (vreme 0), a zatim

2

nakon 15 min, 30 min, 60 min i 6 sati inkubacije. Kvantitativno Western blot je izveden prema postupku opisanom u Primeru 5. DRG homogenati od 5-10 µg proteina su rastvoreni na 10% SDS-PAGE gelu i elektroblotirani na nitroceluloznu membranu. Mrlje su zatim blokirane u 5% nemasnom mleku koje sadrži 0,05% Tween-20, isprane u PBS (pH 7,4 ) i inkubirane sa sledećim antitelima: (i) poliklonalnim antifosfo AMPK (na Thr-172, 1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD) i (ii) ekstracelularnim signalom regulisana kinaza (T-ERK; 1:2000, Covance, Princeton, NJ, SAD). Mrlje su isprane, inkubirane u Western blotting Luminol reagensu (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornija, SAD) i snimljene korišćenjem BioRad Fluor-S analizatora slike (BioRad, Hercules, Kalifornija, SAD). Podaci na Sl.7(A) i 7(B) pokazuju da je VU255035 značajno povećao fosforilaciju AMPK (P-AMPK) za 15 minuta i održao fosforilaciju na 30-60 minuta sa povratkom na početnu liniju za 6 sati (u odnosu na ukupne nivoe ERK; nije imalo uticaja na ukupne nivoe AMPK).

Primer 7 : Profilaktički efekti supkutanih injekcija pirenzepina na razvoj simetrične polineuropatije u mišjem modelu miša sa dijabetesom tipa 1

[0082] Mužjaci C57Bl6J miševa su načinjeni dijabetičarima sa 2 injekcije 90 mg/kg STZ tokom uzastopnih dana, a zatim su podeljeni u četiri grupe. Peta grupa je bila kontrolna (nedijabetičarska) grupa i sastojala se od miševa koji nisu primili STZ injekcije. Prva grupa dijabetesnih miševa nije primala nikakve tretmane pirenzepinom tokom dvomesečne studije i služila je da ilustruje neuropatiju izazvanu dijabetesom. Prva grupa STZ dijabetesnih miševa razvila je znake neuropatije, uključujući usporavanje nervne provodljivosti, termalnu hipoalgeziju i gubitak IENF u roku od 2 meseca od STZ tretmana. Druga, treća i četvrta grupa STZ dijabetesnih miševa primale su svakodnevne tretmane pirenzepinom davane supkutanom injekcijom na pregibu vrata, počevši nedelju dana nakon druge STZ injekcije. Druga grupa STZ dijabetesnih miševa primala je dnevnu dozu od 0,1 mg pirenzepina/kg telesne težine. Treća grupa STZ dijabetesnih miševa primala je dnevnu dozu od 1,0 mg pirenzepina/kg telesne težine. Četvrta grupa STZ dijabetesnih miševa primala je dnevnu dozu od 10,0 mg pirenzepina/kg telesne težine.

[0083] Dva meseca nakon druge STZ injekcije, funkcija malih senzornih neurona u svih pet grupa miševa je određena merenjem latencije termičkog odgovora zadnje šape korišćenjem modifikovanog Hargrevsovog aparata (UARD, San Diego, CA, US) sa brzinom zagrevanja od približno 1°C/sec u odnosu na polaznu osnovu od 30°C i sa rezom na 20s kako podučavaju Calcutt et al. (2004, Diabetologia 47: 718-724). Podaci na Sl. 8(A) pokazuju da je grupa STZ dijabetesnih miševa koji inače nisu bili lečeni pokazala značajno povećanje termičke latencije u poređenju sa kontrolnim (nedijabetesnim) miševima. Grupa dijabetesnih miševa koji su svakodnevno primali potkožne injekcije pirenzepina u dozi od 10 mg/kg pokazala je latenciju termičkog odgovora koja se nije značajno razlikovala od kontrolnih miševa bez dijabetesa (Sl. 8(B)). Statistička analiza je urađena korišćenjem jednosmerne ANOVA sa post-hoc poređenjem korišćenjem Tukijevog testa.

[0084] Strukturni integritet malih senzornih neurona je procenjen merenjem profila intraepidermalnih nervnih vlakana (IENF) u plantarnoj koži zadnje šape koja je potapanjem fiksirana u 4% paraformaldehida i obrađena u parafinske blokove. Sekcije (6 µm) su obojene pan-neuronskim markerom PGP9.5 (1:1000, Biogenesis Ltd., Pul, Velika Britanija) i pregledane pod svetlosnim mikroskopom da bi se omogućilo brojanje IENF i subepidermalnih nervnih profila (SNP) po jedinici dužine dermalne: epidermalne ivice korišćenjem tehnike koju podučavaju Beiswenger et al. (2008, Neurosci Lett.442, 267-272). Podaci na Sl.8 pokazuju da su STZ-dijabetični miševi koji inače nisu bili lečeni pokazali značajno smanjenje nivoa IENF u šapama u poređenju sa kontrolom (miševi bez dijabetesa). Grupa dijabetesnih miševa koji su svakodnevno primali supkutane injekcije od 10 mg/kg pirenzepina nije pokazala značajne promene u nivoima IENF na šapama u poređenju sa kontrolnim (nedijabetesnim) miševima. Statističke analize su urađene korišćenjem jednosmerne ANOVA praćene Tukijevim testom.

2

[0085] Brzina provodljivosti motornog nerva je merena pod anestezijom izofluranom, a temperatura jezgra i nerva održavana je na 37°C korišćenjem grejnog jastučića i lampi u skladu sa učenjem Jolivalt et al, (2011, Diabetes Obesity and Metabolism, 2. juna e-pub pre štampanja). Išijatični nerv je stimulisan (5V, 0,05 ms puls, kvadratni talas) igličastim elektrodama na velikom sedalnom urezu ili skočnom zglobu. Evocirani rani (M talasi) odgovori su zabeleženi iz međukoštanih mišića stopala finim igličastim elektrodama, pojačani i prikazani na osciloskopu. Razlika u latencijama odgovora M talasa nakon stimulacije na velikom sedalnom urezu i skočnom zglobu je zabeležena kao vreme potrebno za provodljivost motornog nerva između mesta stimulacije. Rastojanje između mesta stimulacije je mereno na površini potpuno ispruženog zadnjeg ekstremiteta i podeljeno sa razlikom u latencijama M talasa da bi se izračunala brzina provodljivosti išijasnog motornog nerva (MNCV). Merenja su obavljena u tri primerka i srednja vrednost je korišćena za predstavljanje MNCV za svaku životinju.

Primer 8 : Poništavanje termalne hipoalgezije i gubitka IENF kod STZ indukovanih dijabetesnih miševa sa VU255035

[0086] Swiss Webster (spoljni uzgoj) miševi su načinjeni dijabetičarima sa 2 injekcije 90 mg/kg STZ tokom uzastopnih dana. Kontrolna grupa Swiss Webster miševa odgovarajućeg uzrasta nije primila STZ injekcije. Miševi su održavani 8 nedelja nakon STZ injekcija. Dijabetesna neuropatija je bila dobro utvrđena kod miševa koji su primili STZ injekcije, o čemu svedoče znaci neuropatije (termalna hipoalgezija). Kohorta je zatim primala 10 mg/kg VU255035 dnevno i.p. injekcijom tokom 4 nedelje. Podaci na Sl.9(A) pokazuju da se termalna hipoalgezija (senzorni gubitak) razvila do 8 nedelja i tretman VU255035 je izazvao značajan preokret nazad na kontrolne nivoe toplotne osetljivosti. Slika 9(B) pokazuje da je VU255035, takođe, značajno poništio gubitak IENF i SNP.

Primer 9: Profilaktički efekti lokalne primene pirenzepina na razvoj senzorne neuropatije na mišjem modelu dijabetesa tipa 1

[0087] Mužjaci C57Bl6J miševa su načinjeni dijabetičarima sa 2 injekcije 90 mg/kg STZ tokom uzastopnih dana, a zatim su podeljeni u tri grupe. Postojale su i dve grupe kontrolnih (nedijabetesnih) miševa. Prva grupa kontrolnih (nedijabetesnih) miševa primala je dnevni lokalni tretman sa 50 µl Intrasite® hidrogela (Intrasite je registrovani žig T.J. Smith and Nephew, Hal, Engleska) na obe zadnje šape, sa kontrolisanim vremenom izlaganja od 20 minuta. Druga grupa kontrolnih (nedijabetesnih) miševa je primala dnevnu topikalnu primenu 50 µl gel kompozicije koja sadrži 10% pirenzepina u hidrogelu na jednu zadnju šapu i 50 µl samo hidrogela na drugu šapu, počevši od trenutka kada su dijabetesni miševi primili svoje lokalne tretmane. Treća grupa miševa su bili miševi sa dijabetesom koji su svakodnevno primali topikalni tretman sa 50 µl hidrogela na obe zadnje šape. Četvrta grupa se sastojala od dijabetesnih miševa koji su primali dnevnu topikalnu primenu od 50 µl hidrogela koji sadrži 2% pirenzepina na jednu zadnju šapu i 50 µl samo hidrogela na drugu zadnju šapu, tretman je počeo 7 dana nakon druge STZ injekcije. Peta grupa se sastojala od dijabetesnih miševa koji su primali dnevnu topikalnu primenu od 50 µl hidrogela koji sadrži 10% pirenzepina na jednu zadnju šapu i 50 µl samo hidrogela na drugu zadnju šapu, a tretman je počeo 7 dana nakon druge STZ injekcije. Grupa STZ dijabetesnih miševa tretiranih samo hidrogelom na obe zadnje šape razvila je znake neuropatije, uključujući usporavanje nervne provodljivosti, termalnu hipoalgeziju i gubitak IENF u roku od 2 meseca od STZ tretmana.

[0088] Dva meseca nakon druge STZ injekcije, funkcija malih senzornih neurona u svih pet grupa miševa je određena merenjem latencije termičkog odgovora zadnje šape prateći proceduru opisanu u Primeru 7. Podaci na Sl. 10(A) pokazuju da latencija toplotnog odgovora kod kontrolnih (nedijabetesnih) miševa nije bila pod uticajem dnevne lokalne primene hidrogela sa 10% pirenzepina. STZ dijabetesni miševi tretirani samo hidrogelom na obe zadnje šape pokazali su značajno povećanje

2

latencije termičkog odgovora u poređenju sa obe grupe kontrolnih (nedijabetesnih) miševa. Dve grupe dijabetesnih miševa kojima je svakodnevno nanošen lokalno pirenzepin hidrogel na jednu zadnju šapu nisu pokazale nikakve značajne promene u latenciji termičkog odgovora u toj šapi u poređenju sa kontrolnim (nedijabetesnim) miševima (statistička analiza je urađena korišćenjem jednosmerne ANOVA sa post-hoc poređenjem korišćenjem Tukijevog testa).

[0089] Strukturni integritet malih senzornih neurona je procenjen merenjem IENF profila u plantarnoj koži zadnje šape, kao što je opisano u Primeru 7. Podaci na Sl. 10(B) i 10(C) pokazuju da primena hidrogela koji sadrži 10% pirenzepina na jednu zadnju šapu kontrolnog (nedijabetesnog) miša daje brojčano, ali statistički beznačajno, povećanje IENF i SNP po mm kože uzete sa zadnje šape tretirane pirenzepinom. STZ dijabetesni miševi tretirani samo hidrogelom na obe zadnje šape pokazali su značajno smanjenje nivoa IENF i SNP po mm kože u šapama u poređenju sa kontrolnim (nedijabetesnim) miševima koji su tretirani samo hidrogelom na obe zadnje šape. Dve grupe dijabetesnih miševa kojima je svakodnevno lokalno nanošeno 50 µl hidrogela koji sadrži 2% ili 10% pirenzepina nisu pokazale značajne promene u nivoima IENF i SNP u šapi tretiranoj pirenzepinom u poređenju sa kontrolom (nedijabetesnim miševima) koji su tretirani samo hidrogelom (statistička analiza je urađena korišćenjem jednosmerne ANOVA sa post-hoc poređenjem korišćenjem Tukijevog testa).

Primer 10: Restorativni efekti supkutanih injekcija pirenzepina na termalnu hipoalgeziju i gubitak IENF kod dijabetesnih miševa

[0090] Mužjaci Swiss Webster miša (spoljni uzgoj) su načinjeni dijabetičarima sa 2 injekcije 90 mg/kg STZ tokom uzastopnih dana. Kontrolna grupa Swiss Webster miševa odgovarajućeg uzrasta nije primila STZ injekcije. Miševi su održavani 14 nedelja nakon STZ injekcija. Dijabetesna neuropatija je bila dobro uspostavljena kod miševa koji su primili STZ injekcije, o čemu svedoče znaci neuropatije, termalne hipoalgezije i gubitka IENF. Sa 14 nedelja, miševi sa dijabetesom su podeljeni u dve grupe. Prva je bila netretirana grupa miševa sa dijabetesom. Druga grupa dijabetesnih miševa primala je dnevne potkožne injekcije pirenzepina u dozi od 10 mg/kg tokom 2 meseca.

[0091] Funkcija malih senzornih neurona kod dijabetesnih i nedijabetesnih grupa miševa je procenjena 5 nedelja, 7 nedelja, 11 nedelja i 14 nedelja nakon STZ injekcija. Došlo je do značajnog povećanja termičke latencije kod miševa sa dijabetesom u poređenju sa miševima bez dijabetesa, prateći postupak opisan u Primeru 7. Hipoalgezija je primećena 11 nedelja nakon STZ injekcija i postala je još izraženija u 14. nedelji (Sl.11(A)). Mikroskopsko ispitivanje uzoraka kožnog tkiva sakupljenih od miševa sa dijabetesom u 14. nedelji pokazalo je približno 40% gubitak IENF. Međutim, svakodnevna primena pirenzepina miševima sa dijabetesom značajno je smanjila termičku latenciju u roku od 4 nedelje od početka lečenja pirenzepinom, tj.18. nedelje (Sl.11(A)) i do 21. nedelje, tj.7 nedelja nakon početka tretmana pirenzepinom, termalna latencija je bila identična kod dijabetičara i kontrolnih nedijabatesnih miševa (Sl. 11(A)). Određivanje IENF profila u tri grupe miševa posle 21 nedelje je pokazalo da primena tretmana pirenzepinom na miševe sa dijabetesom vraća IENF profile približno onima kod kontrolnih miševa bez dijabetesa (Sl.11 (B)).

Primer 11: Ponovna pojava neuropatije nakon prekida terapije pirenzepinom

[0092] C57Bl6J miševi su načinjeni dijabetičarima sa STZ kao što je prethodno opisano, a zatim su primali 10 mg/kg pirenzepina (dnevne supkutane injekcije). Posle 8 nedelja, hipoalgezija je sprečena tretmanima pirenzepinom (Sl.12). U ovom trenutku, tretmani pirenzepinom su zaustavljeni i termalne latencije su merene svake dve nedelje nakon toga (Sl.12). Samo 9 nedelja kasnije (vremenska tačka od 17 nedelja) došlo je do značajne ponovne pojave hipoalgezije kod prethodno lečenih STZ indukovanih dijabetesnih miševa (Sl.12).

Primer 12: Reverzni efekti potkožnih injekcija pirenzepina na termalnu hipoalgeziju kod dijabetesnih pacova

[0093] Jedna grupa odraslih mužjaka Sprague Dawley pacova je načinjena dijabetičarima jednom intraperitonealnom injekcijom od 75 mg/kg STZ, dok je druga grupa odraslih mužjaka pacova zadržana kao kontrola bez dijabetesa. Dve grupe pacova su praćene za početak dijabetesa tipa 1 procenom termičke latencije u intervalima od 4 nedelje. Do 12. nedelje neuropatija je bila dobro uspostavljena kod pacova tretiranih STZ (Sl.13). Pacovi dijabetičari su zatim podeljeni u dve grupe, pri čemu je jedna grupa pacova primala dnevnu potkožnu injekciju od 10 mg/kg pirenzepina. Procene termičke latencije su se nastavile u intervalima od 4 nedelje, a do 20. nedelje studije, tj.8 nedelja nakon što su započele dnevne injekcije pirenzepina, termalna latencija kod dijabetesnih pacova koji su primali injekcije je opala na približno nivoe kod kontrolnih pacova koji nisu dijabetičari (Sl.13).

Primer 13 : Efekti pirenzepina na sprečavanje razvoja bola, naznačeno taktilnom alodinijom, i usporavanje senzorne nervne provodljivosti kod dijabetesnih pacova

[0094] Dve grupe odraslih ženki Sprague Dawley pacova su obolele načinjene dijabetičarima jednom intraperitonealnom injekcijom od 55 mg/kg STZ. Jedna od dve grupe pacova kojima je ubrizgan STZ dobijala je dnevne tretmane od 10 mg/kg pirenzepina supkutanom injekcijom, dok je druga grupa primala injekcije samo vehikuluma. Treća grupa odraslih muških pacova održavana je kao kontrola bez dijabetesa. Tri grupe pacova su praćene za početak dijabetesne bolne neuropatije merenjem pragova taktilnog odgovora šape u 5. i 9. nedelji dijabetesa, kako je učio Calcutt (1996, Pain: 68:293-299). Bolna neuropatija, na šta ukazuje taktilna alodinija (50% praga odgovora ispod 5g) je dobro utvrđena do 5. nedelje kod pacova tretiranih STZ koji nisu primali tretmane pirenzepinom i koji su opstali do 9 nedelja dijabetesa. Dijabetesni pacovi tretirani pirenzepinom imali su pragove taktilnog odgovora šape koji su bili značajno viši od dijabetesnih pacova tretiranih vehikulumom posle 5 nedelja dijabetesa (Sl.14A) i nisu se razlikovali od kontrolnih pacova do 9. nedelje dijabetesa (Sl. 14A). Brzina provodljivosti senzornog nerva (SNCV) merena je u istoj kohorti pacova posle 8 nedelja dijabetesa merenjem pod anestezijom izofluranom, latencije H talasa na elektromiogramu međukoštanih mišića nakon električne stimulacije išijadičnog nerva na velikom sedalnom urezu i Ahilove tetive, a zatim merenje rastojanja između dve tačke nervne stimulacije, kako je učio Calcutt (J. Clin. Invest.111:507-514, 2003). SNCV je značajno smanjen kod dijabetesnih pacova i pirenzepin je delimično sprečio ovaj deficit (Sl.14B).

Primer 14 : Poništavanje dijabetesne senzorne neuropatije sa oralnim doziranjem pirenzepina

[0095] Mužjaci Swiss Webster miševa (spoljni uzgoj) su načinjeni dijabetičarima sa 2 injekcije 90 mg/kg STZ tokom uzastopnih dana. Kontrolna grupa Swiss Webster miševa odgovarajućeg uzrasta nije primila STZ injekcije. Miševi su održavani 8 nedelja nakon STZ injekcija. Dijabetesna neuropatija je bila dobro utvrđena kod miševa koji su primili STZ injekcije, o čemu svedoče znaci termalne hipoalgezije. Nakon 8 nedelja, dnevni tretmani pirenzepinom su davani podgrupi STZ dijabetesnih miševa oralnom gavažom tokom narednih 8 nedelja. Podaci na Sl.15(A) pokazuju da tretmani kojima se daje pirenzepin oralno reverziraju termalnu hipoalgeziju. Pored toga, oralno doziranje pirenzepina je, takođe, poništilo gubitak IENF i SNP (Sl.15(B)).

Primer 15: Procena efekata pirenzepina na ekspresiju gena AMPK i PGC1α u ganglijama dorzalnog korena (DRG) kod STZ dijabetesnih miševa

1

[0096] Neki od miševa u svakoj od tri grupe miševa (kontrolna grupa bez dijabetesa; netretirana grupa sa dijabetesom; grupa sa dijabetesom koja je primala dnevne injekcije pirenzepina od 14. nedelje nadalje) iz studije opisane u Primeru 10 održavani su tokom 22 nedelje nakon STZ injekcija. Lumbalni DRG su izolovani i isprani u ledeno hladnom rastvoru koji sadrži STE pufer (250 mmol/l saharoze, 10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7.4), a zatim homogenizovani politronskim homogenizatorom (KINEMATICA GmbH, Švajcarska) korišćenjem 3 x 7,5s impulsa za mlevenje u intervalima od 30s prema postupku koju su podučavali Chowdhury et al. (2010, Diabetes 59: 1082-1091).

[0097] Kvantitativni Western blot je izveden kao što su prethodno opisali Chowdhury et al (2010) i Fernyhough et al. (1999, Diabetes 48: 881-889). DRG homogenati od 5-10 µg proteina su rastvoreni na 10% SDS-PAGE gelu i elektroblotirani na nitroceluloznu membranu. Mrlje su zatim blokirane u 5% nemasnom mleku koje sadrži 0,05% Tween-20, isprane u PBS (pH 7.4 ) i inkubirane sa sledećim antitelima: policlonsko anti-phospho AMPK (1:1000, Cell Signaling Technology, Denvers, MA, SAD), policlonsko anti-PGC-1α (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Kruz, Kalifornija, SAD) i monoklonska anti-ATP podjedinica sintaze β (razblaživanje 1:2000, Mitosciences, Judžin, OR). Ekstracelularnim signalom regulisana kinaza (ERK; 1:2000, Covance, Prinston, NJ, SAD) ispitana je kao kontrola opterećenja (prethodne studije pokazuju da ovaj protein ne menja nivo ekspresije u DRG kod dijabetesa). Mrlje su isprane, inkubirane u Western blotting Luminol reagensu (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Kruz, Kalifornija, SAD) i snimljene korišćenjem BioRad Fluor-S analizatora slike (BioRad, Hercules, Kalifornija, SAD).

[0098] Podaci na Sl.16(A) - 16(D) pokazuju da je ekspresija gena P-AMPK, T-AMPK i PGC-1α smanjena kod miševa sa dijabetesom u poređenju sa kontrolama bez dijabetesa, i da su dnevne supkutane injekcije pirenzepina tokom 8 nedelja obnovile ekspresiju ovih gena.

Primer 16: Procena efekata pirenzepina na ekspresiju proteina mitohondrijalnog respiratornog kompleksa u ganglijama dorzalnog korena kod STZ dijabetesnih miševa

[0099] DRG uzorci su procenjeni na ekspresiju specifičnih mitohondrijalnih proteina kod dijabetesnih pacova koji su primali dnevne injekcije pirenzepina tokom 8 nedelja. Kvantitativni Western blot je izveden kao što je opisano u Primeru 15. Kvantitativni Western blot je izveden kao što su prethodno opisali Chowdhury et al (2010) i Fernyhough et al. (1999). DRG homogenati od 5-10 µg proteina su rastvoreni na 10% SDS-PAGE gelu i elektroblotirani na nitroceluloznu membranu. Mrlje su zatim blokirane u 5% nemasnom mleku koje sadrži 0,05% Tween-20, isprane u PBS (pH 7.4 ) i inkubirane sa sledećim antitelima: monoklonska anti-citohrom c oksidaza podjedinica 4 (COX IV; 1:1000, Mitosciences, Judžin, OR, US), monoklonska anti-NADH dehidrogenaza (ubihinon) gvožđe-sumpor protein 3 (NDUFS3, 1:1000, Mitosciences, Judžin, OR, SAD). Ekstracelularnim signalom regulisana kinaza (T-ERK; 1:2000, Covance, Prinston, NJ, SAD) ispitana je kao kontrola opterećenja. Mrlje su isprane, inkubirane u Western blotting Luminol reagensu (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Kruz, Kalifornija, SAD) i snimljene korišćenjem BioRad Fluor-S analizatora slike (BioRad, Hercules, Kalifornija, SAD).

[0100] Podaci na Sl. 17(A) - 17(C) pokazuju da su tretmani pirenzepinom obnovili ekspresiju mitohondrijalnih proteina NDUFS3 i COX IV.

Primer 17: Procena efekata pirenzepina na aktivnost mitohondrijalnih respiratornih kompleksa u ganglijama dorzalnog korena kod STZ dijabetesnih miševa

[0101] Uzorci lumbalnog DRG od miševa opisanih u Primeru 10 su procenjeni na obnavljanje aktivnosti mitohondrijalnih kompleksa kod dijabetesnih miševa koji su primali dnevne injekcije pirenzepina tokom 8 nedelja.

2

[0102] Sva merenja enzimskih aktivnosti u lumbalnim DRG preparatima izvedena su spektrofotometrijski korišćenjem temperaturno kontrolisanog Ultrospec 2100 UV-vidljivog spektrofotometra (Biopharmacia Biotech, Upsala, Švedska) korišćenjem postupka koji su podučavali Chowdhury et al. (2010). Aktivnost kompleksa I je merena kao aktivnost NADH osetljive na rotenon: citohrom c reduktaze. Sveže pripremljen pufer za ispitivanje (50 mmol/l K-fosfat pH 7.4, 1 mmol/l KCN, 100 µmol/l NADH) i 10 µg proteina preparata DRG homogenata su dodati u kivetu i prethodno inkubirani 3 minuta na 25°C. Posle dodavanja 100 µmol/l oksidovanog citokroma c, reakcija je bila praćena 2 minuta na 550 nm, a zatim još 2 minuta nakon dodavanja 25 µmol/l rotenona da bi se omogućilo izračunavanje aktivnosti Kompleksa I osetljivog na rotenon. Aktivnost kompleksa IV je merena na 25°C praćenjem smanjenja apsorbancije redukovanog citohroma c na 550 nm kao što su opisali Chowdhury et al. (2000, Clin. Chim. Acta 298: 157-173). Reakcija je započeta dodavanjem 40 µmo/l redukovanog citokroma c u 50 mmol/l fosfatnog pufera koji sadrži 5 µg proteina rastvorenog sa 0,02% laurilmaltozida. Aktivnost enzima Krebsovog ciklusa, citrat sintaze, određena je na 25°C u medijumu koji sadrži 150 mmol/l Tris-HCl (pH 8.2), 0,02% laurilmaltozida, 0,1 mmol/l ditionitrobenzojeve kiseline i 5 µg proteina po postupku Chowdhury et al (2007, Free Radic. Res.41: 1116-1124). Reakcija je započeta dodavanjem 100 µmol/l acetil CoA i merene su promene u apsorpciji na 412 nm tokom 1 minuta. Ova vrednost je oduzeta od brzine dobijene nakon dodavanja 0,05 mmol/l oksalosirćetne kiseline.

[0103] Podaci na Sl. 18(A) - 18(C) pokazuju da su tretmani pirenzepinom obnovili deficite u mitohondrijalnim respiratornim kompleksima I i IV, i u citrat sintazi.

Primer 18 : Procena efekata pirenzepina na aktivnost mitohondrijalnog respiratornog lanca u sveže homogenizovanim ganglijama lumbalnog dorzalnog korena kod STZ dijabetesnih pacova

[0104] Neki od pacova u svakoj od tri grupe pacova (kontrolna grupa bez dijabetesa; netretirana grupa sa dijabetesom; grupa sa dijabetesom koja je primala dnevne injekcije pirenzepina od 14. nedelje nadalje) iz studije opisane u Primeru 12 održavani su tokom 20 nedelja nakon STZ injekcija. Pacovi su potom eutanazirani, a zatim je lumbalni DRG izolovan i ispran u ledeno hladnom rastvoru koji sadrži STE pufer (250 mmol/l saharoze, 10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7.4), a zatim homogenizovan sa politronskim homogenizatorom (KINEMATICA GmbH, Švajcarska), korišćenjem 3 x 7,5s impulsa za mlevenje u intervalima od 30s prema postupku koji su podučavali Chowdhury et al. (2010).

[0105] Aktivnost mitohondrijalnog respiratornog lanca u sveže izolovanim mitohondrijama iz lumbalnog DRG kontrolnih, dijabetesnih i dijabetesnih pacova lečenih pirenzepinom je određena korišćenjem Klarkove elektrode (Oroboros Oxygraph-2K; Oroboros Instruments, Insbruck, Austrija) po postupku koji podučavaju Chowdhury et al. (2005, Biochem Biophys Res Commun.333: 1139-1145), u prisustvu specifičnih supstrata i inhibitora mitohondrijalnog respiratornog lanca (Sl. 19). Bazalna respiracija u lumbalnim DRG mitohondrijama je navedena kao respiracija u stanju 4 sa energetskim supstratima, piruvatom i malatom (P+M). Kuplovana respiracija u stanju 3 indukovana je dodavanjem ADP. Zatim je brzina razdvajanja određena dodavanjem sredstva za razdvajanje, karbonilcijanid ptrifluormetoksifenilhidrazona (FCCP). Zatim su dodati askorbat (Asc) i N,N,N',N'-tetrametil-pfenilendiamin (TMPD) da bi se odredio kapacitet citohrom c oksidaze (kompleks IV). TMPD je veštački redoks medijator koji pomaže prenosu elektrona sa askorbata na citohrom c.

[0106] Bazalne stope respiracije sa piruvatom i malatom (P M) bile su slične za kontrolne pacove bez dijabetesa, pacove sa dijabetesom i za pacove sa dijabetesom koji su svakodnevno primali supkutane injekcije pirenzepina tokom poslednjih osam nedelja studije (Sl.19). Kuplovana respiracija kod pacova sa dijabetesom posle 20 nedelja je smanjena za oko 30% u odnosu na kontrolne pacove bez dijabetesa (P M ADP). Međutim, kuplovana respiracija kod dijabetesnih pacova koji su primali svakodnevne supkutane injekcije pirenzepina nije se značajno razlikovala od kontrole bez dijabetesa. Dok se nekuplovana respiracija kod dijabetesnih pacova posle 20 nedelja smanjila za oko 40% u odnosu na kontrolne pacove bez dijabetesa (FCCP), nekuplovana respiracija kod dijabetesnih pacova koji su primali svakodnevne potkožne injekcije pirenzepina, nije se značajno razlikovala od kontrola bez dijabetesa. Kapacitet citohrom c oksidaze (kompleks IV) kod dijabetesnih pacova posle 20 nedelja je smanjen za oko 25% u odnosu na kontrolne nedijabetesne pacove (Asc TMPD). Međutim, kapacitet citohrom c oksidaze kod dijabetesnih pacova koji su primali svakodnevne supkutane injekcije pirenzepina nije se značajno razlikovao od kontrolne grupe bez dijabetesa.

Primer 19 : Priprema kompozicije pirenzepina za lokalnu primenu

[0107] Kompozicija pirenzepina za topikalnu primenu je pripremljena mešanjem 10 mg pirenzepinskog praha u 0,5 ml odgovarajućeg gela za 2% (20 mg/ml) gel. Primer pogodnog gela je Intrasite® sterilni hidrogel proizvod br. 66027313 (Smith & Nephew Inc, St. Loren, PQ, Kanada). Alternativno, 100 mg pirenzepina u prahu može se pomešati u 1,0 ml gela da bi se pripremio 10% (100 mg/ml) gel.

Referentni Primer 20 : Priprema oralne formulacije pirenzepina

[0108] Pirenzepin (bilo u svo hidrohloridnom obliku ili u svom hidratnom obliku ili drugim sličnim oblicima soli) može da bude rastvoren u fiziološkom rastvoru, destilovanoj vodi, ili u pogodnoj formulaciji tableta za oralnu isporuku. Takve formulacije mogu biti pripremljene korišćenjem opšteg znanja dostupnog o pirenzepinu ili njegovim različitim oblicima soli u literaturi i od strane prosečnog stručnjaka u tehnici. Formulacija pirenzepin hidrohlorida rastvorena u vodi i oralno davana miševima pokazala je efikasnost (Sl.15).

4

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za upotrebu u postupku lečenja dijabetesne neuropatije topikalnom ili transdermalnom primenom, a kompozicija sadrži:

efikasnu količinu antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora selektivnog za podtip M1 receptora, ili njegove soli;

jedno ili više sredstava za poboljšanje penetracije ili korastvarače; i

farmakološki prihvatljiv nosač ili ekscipijens ili njihove kombinacije.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je kompozicija za topikalnu primenu i predstavlja losion, kremu, gel, viskoznu tečnost ili transdermalni flaster.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora selektivan za podtip M1 receptora, ili njegova so, izabran iz grupe koju čine: aprofen, diciklomin, glikopironijum bromid, nitrokaramifen, spirotramin, telenzepin, trihifenidil, (‑)‑S‑ET126, N-desmetilklozapin, O-metoksi-sila-heksociklijum, p-fluortriheksifenidil, MB-OXTP, McN-A-343, MDL74019DG, MT7, PD150714, VU0255035 i njihove soli i smeše.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora čini oko 2 tež. % farmaceutske kompozicije.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora čini oko 10 tež. % farmaceutske kompozicije.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu dijabetesna neuropatija je simetrična dijabetesna polineuropatija.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu kompozicija sadrži najmanje jedno od sredstva za zgušnjavanje, sredstva za geliranje, emolijensa, antioksidansa, antimikrobnog konzervansa, emulgatora, rastvarača koji se meša sa vodom, alkohola i vode.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu sredstvo za poboljšanje penetracije je sredstvo za poboljšanje transdermalne penetracije.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu sredstvo za poboljšanje penetracije sadrži sulfoksid i/ili alkanon i/ili linearnu masnu kiselinu.

10. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu linearna masna kiselina je linolna kiselina.

11. Jedinjenje antagonista muskarinskog acetilholinskog receptora, selektivno za podtip M1 receptora, ili njegova so, za upotrebu u postupku lečenja dijabetesne neuropatije kod subjekta, pri čemu subjekt je čovek, a postupak obuhvata administriranje kompozicije koja sadrži jedinjenje injekcijom.

12. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu je antagonist muskarinskog acetilholinskog receptora selektivan za podtip M1 receptora, ili njegova so, izabran iz grupe koju čine: aprofen, diciklomin, glikopironijum bromid, nitrokaramifen, pirenzepin, siprotramin, telenzepin, triheksifenidil, (‑)‑S‑ET126, N-desmetilklozapin, O-metoksi-sila-heksociklijum, p-fluortriheksifenidil, MB-OXTP, McN-A-343, MDL74019DG, MT7, PD150714, VU0255035, i njihove soli i smeše.