ES2655941T3 - Proteína de fusión - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión caracterizada porque una proteína (X), que contiene un sitio reconocido por autoanticuerpos que son la causa de una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, está conectada con una proteína (A), que contiene un fragmento de la región constante de cadena pesada de anticuerpo que exhibe citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, y con un péptido ligador (L) consistente en uno o más aminoácidos, en la que la proteína (X), el péptido ligador (L) y la proteína (A) están conectados en este orden mediante un enlace peptídico de extremo N a extremo C,

Description

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DESCRIPCION

Proteína de fusión

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que puede prevenir y tratar eficazmente una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo tal como miastenia grave neutralizando autoanticuerpos e inhibiendo la producción de autoanticuerpos. Más particularmente, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que tiene una potente función necesaria y suficiente para la prevención y el tratamiento y que se secreta también al exterior de las células como resultado de la expresión, al mismo tiempo que mantiene su estructura estable con lo que es capaz de hacer frente incluso a la producción industrial.

Antecedentes de la técnica

El sistema inmunitario tiene inherentemente el papel de reconocer y eliminar un cuerpo extraño tal como una bacteria o virus que es diferente de los propios pero, a veces, reacciona excesivamente con las células y tejidos normales propios y los ataca debido a una anormalidad congénita o adquirida. Enfermedad autoinmunitaria es un nombre genérico para las enfermedades resultantes de tal estado. Entre ellas, una enfermedad causada por la reacción de autoanticuerpos (anticuerpos que reconocen células y tejidos propios como antígenos) con autoantígenos (las células y tejidos propios) se denomina “enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo”. Los ejemplos de enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo incluyen miastenia grave, anemia hemolítica de tipo autoinmunitario, púrpura trombocitopénica idiopática, neutropenia de tipo autoinmunitario, hipertiroidismo o enfermedad de Hashimoto causada por anticuerpo anti-TSH, encefalitis aguda de tipo autoanticuerpo y encefalitis marginal no herpética.

Como método de tratamiento para la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, se ha realizado frecuentemente la administración de agentes esteroideos o inmunosupresores. Sin embargo, cualquiera de esos fármacos no suprime específicamente los autoanticuerpos que son la causa fundamental de la enfermedad, sino que suprime en general la inmunorreacción en conjunto. Por lo tanto, los fármacos no tienen especificidad y los métodos no son un método de tratamiento suficientemente eficaz en términos de CDV (calidad de vida).

Con respecto a la miastenia grave, que es uno de los ejemplos representativos de las enfermedades autoinmunitarias de tipo autoanticuerpo, no hay agentes de tratamiento ya conocidos para el tratamiento fundamental de la misma tampoco, sino que simplemente se han usado principalmente los agentes esteroideos anteriores, los inmunosupresores anteriores, inhibidores de colinesterasa, terapia de intercambio de plasma, preparaciones de inmunoglobulina para inyección intravenosa y timectomía (véanse el documento no de patente 1 documento no de patente 2, documento no de patente 3 y documento no de patente 4).

Entre los anteriores, el uso de inhibidores de colinesterasa es difícil por su ajuste de dosis. También, a veces puede ser necesario inyectar sulfato de atropina por vía intravenosa o asegurar las vías aéreas teniendo en cuenta el caso de efectos secundarios. Además, cuando se administra una dosis alta durante un periodo largo, se rebaja su efecto y, en algunos casos, pueden suceder crisis colinérgicas que se consideran problemáticas. Este agente no se pretende para tratamiento terapéutico, sino que es un simple tratamiento sintomático. Fundamentalmente, se va a usar la dosis mínima mediante la que se consigue el efecto y se va a evitar una administración a largo plazo si fuera posible.

Con respecto a los agentes esteroideos, sus efectos secundarios se consideran problemáticos y el control de los efectos secundarios es muy importante. Además, una administración continuada de tales agentes durante un periodo largo es difícil y es necesario controlar junto con el uso de inmunosupresores no esteroideos tales como tacrolimús o ciclosporina. Sin embargo, como se menciona anteriormente, los agentes anteriores son simplemente para tratamiento sintomático y no son medios terapéuticos fundamentales.

Con respecto a la timectomía, aunque muestra cierto efecto, existen problemas de ansiedad en pacientes ante la operación de extirpación y también de costes. Existe otro problema, que no es aplicable a niños pequeños cuya función inmunitaria no está aún desarrollada y a pacientes que padecen enfermedad de inmunodeficiencia. Además, aunque exhibe algunos efectos, se requieren muchos años, hasta decenios, hasta que se confirma el efecto. Es inevitable realizar conjuntamente otros tratamientos sintomáticos hasta reconocer el efecto. Existe aún otro problema, que el efecto se confirmaba en solo menos de un 50 % de los pacientes.

Con respecto a la terapia de intercambio de plasma, se necesita un coste de no menos de un millón de yenes para un tratamiento. El subsidio para los gastos médicos de miastenia grave según el sistema de Combinación de procedimiento de diagnóstico es solo de aproximadamente 600.000 yenes, con lo que la carga en el sitio de asistencia médica es alta. Además, existe el problema de que la duración del efecto de la misma es tan corta como solo aproximadamente un mes.

Como método de tratamiento para miastenia grave, se ha confirmado en los últimos años la eficacia de las preparaciones de gammaglobulina y algunos fabricantes farmacéuticos están realizando ahora pruebas clínicas para

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ellas. Sin embargo, puesto que las preparaciones de gammaglobulina son preparaciones biológicas derivadas de plasma humano, puede existir el riesgo de infección debida a virus desconocidos, etc. Además, la dosis de las preparaciones de gammaglobulina es alta (400 mg/kg, administración continuada durante 5 días) y se espera que las cargas para pacientes y sitios de asistencia médica sean considerablemente altas. Por otro lado, se ha indicado que la duración del efecto de las mismas es el mismo que la terapia de intercambio de plasma o simplemente un poco mayor.

Para resumir, el problema en el tratamiento de la miastenia grave es que, en cuanto al tratamiento que usa fármacos de bajo peso molecular, es un simple tratamiento sintomático temporal, y en cuanto a la terapia de intercambio de plasma, preparaciones de gammaglobulina y timectomía, los problemas en términos de efecto y costes permanecen todavía también.

Podría conseguirse un reconocimiento y eliminación in vitro selectivos de linfocitos B reactivos con el receptor nicotínico de acetilcolina mediante una proteína de fusión recombinante compuesta por el dominio extracelular humano de la subunidad a1 de AChR y el dominio Fc de la cadena pesada de IgG1 humana (véase el documento no de patente 5).

En vista de los problemas anteriores, los presentes inventores pensaron que se esperaría un efecto eficaz con una dosis pequeña que no cause cargas a los pacientes si pudiera prepararse en proteína recombinante un anticuerpo que reaccione solo con autoanticuerpos anti-receptor de acetilcolina, que se cree que son la causa de la miastenia grave. Entonces, los presentes inventores prepararon la proteína de fusión de la región extracelular N-terminal de la subunidad nAChRa1 con la región constante de cadena pesada de anticuerpo como sustituto del anticuerpo antiidiotípico para neutralizar los autoanticuerpos anti-receptor de acetilcolina. Puesto que esta proteína de fusión tiene la actividad de neutralizar los autoanticuerpos y también de dañar las células de producción de autoanticuerpos, se ha juzgado que es muy eficaz para miastenia grave, que es una de las enfermedades autoinmunitarias de tipo autoanticuerpo. Sin embargo, esta proteína de fusión tenía una baja cantidad de expresión y su producción industrial estaba en situación difícil (véase el documento de patente 1).

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: patente japonesa n° 4495776.

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: “Trends of clinical test studies for myasthenia gravis”, Nippon Rinsho, vol. 66, n° 6, pág. 1155-1157.

Documento no de patente 2: “High-dose therapy by immunoglobulin”, Shinkei Chiryo, vol. 25, n° 6, pág. 689-692.

Documento no de patente 3: "Guideline for the Treatment of Myasthenia gravis (MG)", Report of 1995 by the Search and Study Team for Special Diseases and Immunological Neural Diseases, Health and Welfare Ministry.

Documento no de patente 4: "Current Status of Treatment and Prognosis of Myasthenia Gravis in Japan", Memorial Lecture at the Fourth MG Forum.

Documento no de patente 5: "Selective recognition and elimination of nicotinic acetylcholine receptor-reactive B cells by a recombinant fusion protein AChR-Fc in myasthenia gravis in vitro", Journal of Neuroimmunology 227 (2010) 3543.

Divulgación de la invención Problema que va a resolver la invención

La presente invención se ha creado en vista del estado actual de la técnica anterior como tal y es un objeto de la presente invención proporcionar una nueva proteína de fusión que pueda suprimir específicamente autoanticuerpos, que pueda prevenir o tratar eficazmente la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo y que pueda expresarse en una cantidad suficiente para la producción industrial. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para fabricar la proteína de fusión.

Medios para resolver el problema

Puede esperarse el efecto de la proteína de fusión anterior en el documento de patente 1 como agente de tratamiento para miastenia grave por dos puntos, que son la inhibición de la producción de autoanticuerpos y la neutralización de los autoanticuerpo producidos. Sin embargo, en la proteína de fusión de proteína receptora con región constante de cadena pesada de anticuerpo, son problemas la pequeña cantidad de expresión que parece causada por el impedimento estérico de la estructura, la pureza de la proteína expresada, etc.

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Bajo tales circunstancias, los presentes inventores han realizado diversas investigaciones para potenciar la cantidad expresada de proteína de fusión y la pureza de la proteína expresada y han señalado que, en la proteína de fusión del documento de patente 1, cada una de la proteína receptora y la región constante de cadena pesada de anticuerpo está en una estructura complicada con lo que, debido a su impedimento estérico, se da como resultado un enlace disulfuro incorrecto durante la expresión de la proteína de fusión y, como resultado, no se consiguen una pureza y cantidad expresada suficientes. Como medio para resolver lo anterior, los presentes inventores han ideado una proteína de fusión en la que se inserta un péptido ligador flexible entre la proteína receptora y la región constante de cadena pesada de anticuerpo. Por tanto, los presentes inventores pensaron que cada una de las estructuras de proteína receptora y región constante de cadena pesada de anticuerpo mantendría la estructura estable inherente mediante la inserción del péptido ligador flexible. Los presentes inventores pensaron entonces que, como resultado de la formación de una estructura estable en cada región, se promovería un efecto secretor al exterior de las células dando como resultado mucha más producción de proteína de fusión y, además, se potenciaría la estabilidad de la proteína de fusión misma, con lo que la proporción de producto descompuesto puede volverse significativamente pequeña y ser ahora posible una mejora de la pureza. En vista de lo anterior, los presentes inventores han preparado una proteína de fusión en que se inserta este péptido ligador flexible y han encontrado que, en esta proteína de fusión, se potencia en gran medida la cantidad expresada y la pureza de la proteína expresada mejora significativamente también en comparación con la proteína fusionada convencional que no tiene péptido ligador. Los presentes inventores han encontrado también que, en la proteína de fusión en que se inserta un péptido ligador flexible, se potencia significativamente el efecto neutralizante de autoanticuerpos y el efecto de supresión específica de las células productoras de autoanticuerpos es también fuerte en comparación con la proteína fusionada convencional que no tiene péptido ligador. Los presentes inventores han encontrado también que se consigue una más fuerte citotoxicidad celular cuando la región constante de cadena pesada de anticuerpo (A) está situada en el lado C-terminal que en el lado N-terminal. Los presentes inventores han conseguido la presente invención basándose en estos hallazgos.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína de fusión caracterizada porque se conecta una proteína (X), que contiene un sitio reconocido por autoanticuerpos que son la causa de la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, con una proteína (A), que contiene un fragmento de la región constante de cadena pesada de anticuerpo que exhibe citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, y con un péptido ligador (L), consistente en uno o más aminoácidos, en la que la proteína (X), el péptido ligador (L) y la proteína (A) están conectados en este orden mediante un enlace peptídico de extremo N a extremo C, y en la que la proteína de fusión consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID N° 10 o 15.

Además, de acuerdo con la presente invención, se proporciona también un método para fabricar la proteína de fusión anterior que se caracteriza porque se inserta el aDn que codifica la proteína de fusión anterior en un vector de expresión celular y se introduce este vector en células hospedadoras para expresar la proteína de fusión. Se proporciona además una composición para la prevención y el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo que se caracteriza por contener la proteína de fusión anterior como ingrediente eficaz.

Ventajas de la invención

La proteína de fusión de la presente invención neutraliza los autoanticuerpos existentes en el cuerpo de un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo e inhibe también la producción de autoanticuerpos, con lo que puede suprimir específicamente los autoanticuerpos. Además, la proteína de fusión de la presente invención tiene una alta cantidad de expresión y pureza y puede proporcionarse como un fármaco a escala de producción real. Por consiguiente, cuando se usa la proteína de fusión de la presente invención, es ahora posible prevenir y tratar eficazmente diversas enfermedades autoinmunitarias de tipo autoanticuerpo tales como miastenia grave.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquemático de la región para expresar una proteína de fusión a1-Fc preparada en los Ejemplos.

La Fig. 2 es un diagrama esquemático de la región para expresar una proteína de fusión a1-L-Fc preparada en los Ejemplos.

La Fig. 3 es un diagrama esquemático de la región para expresar una proteína de fusión a1-L2-Fc preparada en los Ejemplos.

La Fig. 4 es un diagrama esquemático de la región para expresar una proteína de fusión Fc-L2-a1 preparada en los Ejemplos.

La Fig. 5 muestra una imagen teñida con plata (lado izquierdo) y una imagen de transferencia Western (lado derecho) después de PAGE-SDS de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc en estado reducido purificada después de expresión transitoria.

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La Fig. 6 muestra la capacidad de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc con la proteína A y a-bungarotoxina. ♦ muestra el resultado de la proteína de fusión a1-Fc y Amuestra el resultado de la proteína de fusión a1-L-Fc.

La Fig. 7 muestra la capacidad de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc con autoanticuerpos anti-subunidad nAChRal. ♦ muestra el resultado de la proteína de fusión a1-Fc y Amuestra el resultado de la proteína de fusión a1-L-Fc.

La Fig. 8A muestra la unión de la proteína de fusión a1-Fc con células Mab35 de hibridoma. Se muestra la concentración añadida de proteína de fusión en la Fig. 8A.

La Fig. 8B muestra la unión de la proteína de fusión a1-L-Fc con células Mab35 de hibridoma. Se muestra la concentración añadida de proteína de fusión en la Fig. 8B.

La Fig. 9 muestra la actividad inhibidora de la unión de 100 pg/ml de la proteína de fusión a1-Fc (lado izquierdo) y la actividad inhibidora de la unión de la proteína de fusión a1-L-Fc a la misma concentración (lado derecho) sobre la unión de 1 pg/ml de autoanticuerpo mAb35 con células TE671.

La Fig. 10 muestra el efecto mejorador de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc sobre los síntomas de tipo miastenia grave inducidos por el autoanticuerpo mAb35. La abscisa muestra el tiempo y la ordenada muestra la puntuación de síntomas de tipo miastenia grave. • muestra un grupo administrado con solución salina fisiológica, ♦ muestra un grupo administrado con una preparación de globulina para inyección intravenosa, A y Amuestran cada uno un grupo administrado con la proteína de fusión a1-Fc y □ y ■ muestran cada uno un grupo administrado con la proteína de fusión a1-L-Fc.

Modo para llevar a cabo la invención

La proteína de fusión de la presente invención tiene una estructura en la que la proteína (X), que contiene un sitio reconocido por autoanticuerpos que son la causa de la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, está conectada con una proteína (A), que contiene un fragmento que exhibe la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de la región constante de cadena pesada de anticuerpo, y con un péptido ligador (L) consistente en uno o más aminoácidos.

La proteína (X) corresponde a un autoantígeno de autoanticuerpos o una parte del mismo y desempeña un papel como señuelo de unión a autoanticuerpos como sustituto del autoantígeno de un paciente. Por tanto, cuando se administra la proteína de fusión de la presente invención a un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, los autoanticuerpos en el cuerpo de paciente reconocen la parte de la proteína (X) en la proteína de fusión como autoantígeno y se unen a esta parte. Puesto que los autoanticuerpos unidos no pueden unirse ya al autoantígeno que está presente inherentemente en el cuerpo del paciente, pueden neutralizarse los autoanticuerpos mediante este método y puede suprimirse la generación de síntomas de la enfermedad autoinmunitaria por unión de los autoanticuerpos al autoantígeno del paciente. Aunque los autoanticuerpos no son un anticuerpo específico, sino que están compuestos por un grupo de diversos anticuerpos, cualquiera de los anticuerpos es común en el sentido de que tiene la función de reconocer el autoantígeno. Por consiguiente, cuando se usa la proteína de fusión de la presente invención, que actúa como señuelo de autoantígeno, una proteína de fusión puede neutralizar un grupo de diversos anticuerpos, y por tanto no hay necesidad de preparar separadamente cada proteína de fusión para cada uno de los diversos anticuerpos.

“Anticuerpo” definido aquí representa todos los anticuerpos de cada clase IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y cada subclase de los mismos. “Región constante de anticuerpo” representa anticuerpo de cada clase o anticuerpo de cada subclase y/o una combinación de región constante de cadena pesada de anticuerpo del mismo también. No existe una limitación particular para la estructura de cadena de azúcar que se añade a la región constante de cadena pesada de anticuerpo.

La proteína de fusión de la presente invención contiene una proteína (A) que contiene un fragmento de la región constante de cadena pesada de anticuerpo, además de una proteína (X) que actúa como señuelo para autoantígeno. Esta proteína (A) desempeña también un papel de exhibición de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (actividad ADCC). Los autoanticuerpos se producen por linfocitos B en la sangre. Existen anticuerpos de tipo presentación en superficie celular que tienen el mismo sitio de unión de antígeno que los autoanticuerpos sobre la superficie de linfocitos B como receptores de linfocitos B. Por consiguiente, cuando se administra la proteína de fusión de la presente invención a un paciente, una parte de la proteína de fusión se une a los autoanticuerpos del cuerpo del paciente como se menciona anteriormente, mientras que el resto se une a los anticuerpos sobre la superficie de linfocitos B (receptor de linfocitos B) que producen los autoanticuerpos. Cuando la proteína de fusión de la presente invención se une al receptor de linfocitos B, las células efectoras tales como linfocitos NK se unen a una proteína (A) en la proteína de fusión a través de un receptor Fc de las células efectoras, que exhibe citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (actividad ADCC), dañan la unión de linfocitos B a la proteína de fusión y suprimen la producción de autoanticuerpos. Como tal, de acuerdo con la presente invención, el resultado no es solo que los autoanticuerpos existentes en el cuerpo se neutralicen para inhibir la unión de los autoanticuerpos al

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autoantígeno, sino que también los linfocitos B específicos que son una fuente de producción de autoanticuerpos pueden dañarse selectivamente. Por consiguiente, la proteína de fusión de la presente invención puede prevenir o tratar la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo de dos modos, que son la inhibición de la producción de autoanticuerpos y la neutralización de los autoanticuerpos producidos.

La proteína de fusión de la presente invención incluye un péptido ligador flexible (L) consistente en uno o más aminoácidos. Como resultado de la inserción de tal péptido ligador, la estructura de cada una de la proteína receptora y la región constante de cadena pesada de anticuerpo se vuelve una estructura estable, con lo que la proteína de fusión se vuelve estable en conjunto.

La presente invención se caracteriza porque la proteína receptora (X), el péptido ligador (L) y la región constante de cadena pesada de anticuerpo (A) se secuencian en el orden (X)-(L)-(A) de extremo N a extremo C. Teóricamente, la región constante de cadena pesada de anticuerpo (A) está situada en cualquier lado del lado N-terminal y el lado C- terminal, pero los presentes inventores han encontrado que la región constante de cadena pesada de anticuerpo (A) debería estar situada en el lado C-terminal, en el que el impedimento estérico es bajo para unión a un receptor, con el fin de lograr eficazmente la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (actividad ADCC) de la región constante de cadena pesada de anticuerpo (A). Se supone también que, cuando la proteína receptora (X) está situada en el extremo N, puede conseguirse también un fuerte efecto como señuelo.

La proteína (X) en la proteína de fusión de la presente invención corresponde a un autoantígeno, o una parte del mismo, de autoanticuerpos que son la causa de la enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo para prevenir o tratar en el paciente. La proteína (X) se decide dependiendo de la enfermedad autoinmunitaria para prevenir o tratar en el paciente. Por ejemplo, en el caso de prevención y tratamiento de miastenia grave, puesto que la miastenia grave es una enfermedad resultante de una causa tal como la unión de anticuerpos anti-receptor nicotínico de acetilcolina (autoanticuerpos), en la unión nervio-músculo, con un receptor nicotínico de acetilcolina (autoantígeno), que es un receptor en el lado del músculo del neurotransmisor acetilcolina con el que se inhibe la transmisión nerviosa/muscular de acetilcolina, la proteína (X) puede ser un receptor nicotínico de acetilcolina que es el autoantígeno. De forma similar, en el caso de prevención y tratamiento de anemia hemolítica de tipo autoinmunitario, la proteína (X) puede ser un marcador de superficie eritrocítica; en el caso de prevención y tratamiento de púrpura trombocitopénica idiopática, la proteína (X) puede ser un marcador de superficie de plaquetas; en el caso de prevención y tratamiento de neutropenia de tipo autoinmunitario, la proteína (X) puede ser un marcador de superficie neutrofílica; en el caso de prevención y tratamiento de hipertiroidismo o hipotiroidismo primario (enfermedad de Hashimoto) causado por anticuerpo anti-TSH, la proteína (X) puede ser TSH y en el caso de prevención o tratamiento de encefalitis y encefalopatía de tipo autoanticuerpo, la proteína (X) puede ser un receptor de NMDA, receptor de AMPA, etc.

No es necesario que la proteína (X) sea el receptor completo o el marcador completo, sino que puede ser una parte del mismo siempre que esté contenido en el mismo un sitio de reconocimiento de autoanticuerpos. Por ejemplo, en el caso de miastenia grave, el receptor nicotínico de acetilcolina anterior es una proteína pentamérica consistente en cuatro clases de subunidades y, entre ellas, el sitio de reconocimiento de los autoanticuerpos existe en la región extracelular N-terminal de isoforma 1 (una isoforma expresada solo en músculo esquelético y mostrada por la SEQ ID N° 13) e isoforma 2 (una isoforma expresada en músculo esquelético, cerebro, corazón, riñón y pulmón y mostrada por la SEQ ID N° 14) de una subunidad al. Por consiguiente, en el caso de miastenia grave, la proteína (X) puede ser una subunidad al de receptor nicotínico de acetilcolina (nAChRal) o una parte de la misma. Para ser más específico, puede ser la isoforma 1 y/o isoforma 2 de la subunidad nAChRal o una parte de la misma, y para ser aún más específico, puede consistir en la secuencia aminoacídica de la región extracelular N-terminal de la isoforma 1 y/o isoforma 2 de la subunidad nAChRa1.

En las secuencias aminoacídicas como tales, pueden eliminarse uno o varios (tal como 1 a 20, preferiblemente 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 7) aminoácidos, añadirse o sustituirse siempre que no se perjudique la homología de los mismos. Con respecto al intervalo de las mismas, es un ejemplo una secuencia aminoacídica que tiene un 70 % o más, preferiblemente un 80 % o más y más preferiblemente un 90 % o más de identidad de secuencia. La homología de la secuencia aminoacídica puede calcularse usando el algoritmo de cálculo de homología NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) en condiciones tales que el valor esperado sea 0, se permita hueco, la matriz sea BLOSUM 62 y se desconecte el filtrado. Para ser más específico, la secuencia aminoacídica en la que se introducen deleción, adición y/o sustitución como tal puede prepararse fácilmente sustituyendo la correspondiente secuencia de ADN usando un kit comercialmente disponible tal como el kit de mutagénesis dirigida a sitio (fabricado por Takara Bio Inc.) o el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (fabricado por STRATAGENE). También es posible preparar directamente la secuencia aminoacídica anterior mediante una técnica de síntesis génica artificial.

La proteína (A) en la proteína de fusión de la presente invención es una proteína que contiene un fragmento de una región constante de cadena pesada de anticuerpo y puede ser, por ejemplo, una región Fc de la cadena pesada de anticuerpo, la región constante de la cadena pesada de anticuerpo o una parte de la misma. “Anticuerpo” incluye todas las clases de IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e incluye también todas las subclases de las mismas. “Región constante de cadena pesada de anticuerpo” es una parte que excluye la región variable de la cadena pesada de anticuerpo. Por ejemplo, cuando la clase es IgG, la región constante de la cadena pesada de anticuerpo comprende una

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combinación de región CH1, región de bisagra, región CH2 y región CH3. La región constante de cadena pesada de anticuerpo puede ser también una combinación de cada clase o cada subclase anterior o una región constante de cadena pesada de la misma. Por ejemplo, cuando la clase es IgG, la región Fc de la cadena pesada de anticuerpo comprende una combinación de región de bisagra, región CH2 y región CH3. En el caso de IgG1 de anticuerpo 5 humano, puede ejemplificarse específicamente la secuencia aminoacídica de SEQ ID N° 11 o SEQ ID N° 12. Tanto la SEQ iD N° 11 como la n° 12 son secuencias de la región Fc de IgG1 de anticuerpo humano. La SEQ ID N° 11 se dice que es un tipo encontrado abundantemente en personas asiáticas, mientras que la SEQ ID N° 12 se dice que es un tipo encontrado abundantemente en personas europeas y americanas.

El ligador peptídico (L) en la proteína de fusión de la presente invención consiste en uno o más aminoácidos, 10 preferiblemente 5 a 45, más preferiblemente 10 a 20, y lo más preferiblemente 16 aminoácidos. Este ligador peptídico puede contener el elemento Gly-Ser o Ser-Gly.

Los ejemplos específicos de ligador peptídico (L) incluyen que el contiene una secuencia aminoacídica representada por

la fórmula (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,

15 la fórmula Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,

la fórmula Gly-Ser(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, la fórmula (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)n o la fórmula (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)n-Ser-Pro (en las fórmulas, n es un entero de 1 a 8).

20 Entre las anteriores, se prefieren las secuencias aminoacídicas representadas por la primera y segunda fórmulas. El número de repetición (n) en las fórmulas es preferiblemente un entero de 1 a 4 y, más preferiblemente, 3.

Otros ejemplos específicos de ligador peptídico (L) incluyen los ligadores peptídicos que contienen una secuencia que tiene una estructura basada en el aminoácido Gly y/o el aminoácido Ser (tal como el que contiene una secuencia que tiene Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- 25 Gly-Gly-Gly o Glu-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly).

Aún otros ejemplos específicos de ligador peptídico (L) incluyen aquellos que tienen las siguientes secuencias aminoacídicas o que contienen secuencias aminoacídicas en las que se aplican mejoras basadas en esas secuencias.

A) Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys

30 B) Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg

Es un ejemplo específico de proteína de fusión de la presente invención una proteína consistente en la secuencia aminoacídica de SEQ ID N° 10. Esta proteína de fusión tiene una estructura en la que la proteína (X), el péptido ligador (L) y la proteína (A) están conectados en este orden mediante un enlace peptídico de extremo N a extremo C. La proteína (X) corresponde a una secuencia aminoacídica consistente en los aminoácidos en posiciones 1 a 210 35 de la secuencia aminoacídica de la región extracelular N-terminal de la isoforma 1 de la subunidad nAChRa1. El péptido ligador (L) corresponde a Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. La proteína (A) corresponde a la secuencia aminoacídica de SeQ ID N° 11.

La proteína de fusión de la presente invención puede fabricarse según técnicas de genomanipulación conocidas públicamente convencionales. Por tanto, por ejemplo, se amplifica si es necesario cada uno del ADN que codifica la 40 proteína (X), el ADN que codifica el péptido ligador (L) y el ADN que codifica la proteína (A), se unen entre sí esos ADN, se inserta el ADN resultante en un vector de expresión celular y se transfecta una célula hospedadora con el vector para expresar la proteína de fusión, con lo que puede fabricarse la proteína de fusión de la presente invención. La amplificación del ADN puede realizarse, por ejemplo, mediante un método de PCR. La unión del ADN amplificado puede realizarse, por ejemplo, mediante un método de PCR de extensión por superposición. También es 45 posible diseñar una secuencia aminoacídica de proteína de fusión para expresar de modo que se prepare directamente un gen sintético artificial. Se prefiere que el vector de expresión incluya un promotor tal como CMV o SV40 para potenciar la eficacia de expresión y una secuencia señal de secreción tal como la secuencia señal de la cadena pesada de anticuerpo o la secuencia señal de la cadena k de anticuerpo para una fácil recuperación de la proteína de fusión expresada a partir del sobrenadante de cultivo. Se prefiere también insertar la secuencia Kozak 50 en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción para potenciar la cantidad de proteína expresada. En el caso de la presente proteína de fusión, la subunidad nAChRa1, que es una proteína de membrana, existe en el lado N- terminal y, además, la presente proteína de membrana tiene una región extracelular en el lado N-terminal y, por consiguiente, la compatibilidad de la proteína expresada y la secuencia señal es buena, dando como resultado una

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buena expresión de secreción cuando se usa una secuencia señal original de la subunidad nAChRa1. En cuanto a la célula hospedadora de expresión, pueden usarse células de mamífero, levadura, células animales, células de insecto, células vegetales, células bacterianas (Escherichia coli, etc.), etc. Entre ellas, se prefieren las células animales y se prefieren particularmente células CHO, células HEK293, etc. Además, cuando se infunde una secuencia de ácido nucleico que expresa la proteína de fusión en cromosomas, es también posible la expresión como animal transgénico. La proteína de fusión expresada puede recuperarse mediante medios convencionales y puede purificarse, por ejemplo, mediante un método de columna de proteína A.

Se harán ahora ilustraciones de la composición para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias de tipo autoanticuerpo caracterizada por comprender la proteína de fusión de la presente invención como ingrediente eficaz. Los ejemplos de forma de preparación específica de tal composición son inyección y absorción mucosa. En el caso de inyección, se añaden un estabilizante tal como un sacárido, poliol, albúmina o tensioactivo, un agente isotonificante tal como sal, etc. a la proteína de fusión anteriormente preparada de la presente invención, se liofiliza el producto resultante para conservación y se administra disolviendo en agua para inyecciones para el uso. Aunque no hay una limitación particular para el contenido de la proteína de fusión de la presente invención en el producto liofilizado, es de 0,01 a 200 mg/g y preferiblemente de 0,1 a 100 mg/g, por ejemplo. Aunque no hay una limitación particular para el contenido de la proteína de fusión en la inyección disuelta, es de 0,01 a 200 mg/ml y preferiblemente de 0,1 a 100 mg/ml, por ejemplo. Los ejemplos de método de administración en el caso de inyección incluyen administración intravenosa, administración intramuscular y administración subcutánea. En el caso de absorción mucosa, se pone la proteína de fusión de la presente invención en una forma de dosificación junto con, por ejemplo, excipientes y estabilizantes, para dar una preparación de absorción mucosa de liberación mantenida, y puede administrarse a través de la mucosa oral, mucosa nasal, párpado, etc. Aunque no hay una limitación particular para el contenido de la proteína de fusión de la presente invención en la absorción mucosa, es de 0,1 a 300 mg/ml y preferiblemente de 0,5 a 100 mg/ml, por ejemplo, La dosis de la composición de la presente invención varía dependiendo del efecto terapéutico pretendido, el método de administración, el periodo terapéutico, la edad, peso corporal, etc. y es habitualmente de 10 pg/kg a 50 mg/kg al día para un adulto.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora con más detalle a continuación por los Ejemplos, pero la presente invención no está limitada a estos Ejemplos.

(1) Construcción de un vector de expresión de la proteína de fusión a1-Fc (ejemplo comparativo)

Se extrajo la secuencia de la secuencia señal y la región extracelular N-terminal de la subunidad nAChRa1 basándose en la información de la secuencia proteica de isoforma 1 (n° de acceso: P02708-2) de la subunidad a1 de receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) ya conocida. Se extrajo también la secuencia de la región Fc basándose en la información de la secuencia proteica (n° de acceso P01857) de la región constante de IgG1 de anticuerpo humano. Después de eso, se diseñó una secuencia proteica de 462 residuos en la que se fusionaban ambas secuencias.

Para realizar la expresión de la proteína fusión usando células de ovario de hámster chino (células CHO), se realizó la optimización de una secuencia de ácido nucleico adecuada para células CHO y se preparó una secuencia de ácido nucleico en la que se añadieron una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción y una secuencia Kozak al lado 5', mientras que se añadieron un codón de terminación y una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción al lado 3' mediante una técnica sintética génica artificial (SEQ ID N° 1).

Se trató el gen sintético artificial resultante con enzima de restricción y se insertó bajo el dominio del promotor hCMV-MIE de pEE12. 4, que era un vector de expresión para células animales, para construir un vector pEEI2.4- A1Fc para secreción y expresión de la proteína de fusión a1-Fc (SEQ ID N° 2), que comprende la región extracelular N-terminal de la isoforma 1 de la subunidad nAChRa1 humana y la región Fc de cadena pesada de IgG1 de anticuerpo humano. Se muestra en la Fig. 1 el esquema de la región de expresión de proteína.

(2) Construcción del vector de expresión de una proteína de fusión a1-L-Fc (ejemplo de la presente invención)

Se realizó la amplificación de ácido nucleico para la región de la subunidad nAChRa1 que contiene la secuencia Kozak de SEQ ID N° 1 mediante el método de PCR, usando el gen sintético artificial preparado en (1) como molde; usando el cebador de SEQ ID N° 3 y un cebador de SEQ ID N° 4, a los que se añadieron una secuencia de ácido nucleico que codifica un ligador flexible (L) (Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3) como conjunto de cebadores; y usando "KOD-Plus-Neo" (n° de catálogo: KOD-401) de Toyobo como ADN polimerasa, con lo cual se preparó una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N° 5.

Por otro lado, se realizó la amplificación de ácido nucleico de la región Fc de IgG1 de anticuerpo mediante el método de PCR usando el gen sintético artificial de SEQ ID N° 1 como molde; usando un cebador de SEQ ID N° 6 al que se añadió una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ligador flexible y un cebador de SEQ ID N° 7 como conjunto de cebadores; y usando KOD-Plus-Neo de Toyobo como ADN polimerasa, con lo cual se preparó

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una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N° 8.

Se realizó la amplificación de ácido nucleico mediante el método de PCR de extensión por superposición usando soluciones mixtas de SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 8 como molde, usando un cebador de SEQ ID N° 3 y un cebador de SEQ ID N° 7 como conjunto de cebadores; y usando KOD-Plus-Neo de Toyobo como ADN polimerasa, con lo cual se preparó una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N° 9.

Se trató el producto amplificado resultante de ácido nucleico con enzima de restricción y se insertó bajo el dominio del promotor hCMV-MIE de pEE12. 4, que era un vector de expresión para células animales, para construir un vector pEE12. 4-A1LFc para secreción y expresión de la proteína de fusión a1-L-Fc (SEQ ID N° 10), en la que la región extracelular N-terminal de la isoforma 1 de la subunidad nAChRal humana y la región Fc de cadena pesada de IgG1 de anticuerpo humano estaban conectadas por una secuencia de ligador flexible (L). Se muestra un esquema de la región de expresión de proteína en la Fig. 2.

(3) Confirmación de la expresión transitoria de la proteína de fusión a1-Fc y una proteína de fusión a1-L-Fc

Se transfectaron células HEK293 con los vectores de expresión de la proteína de fusión pEE12.4-A1Fc y pEE12.4- AILFc preparados en (1) y (2) usando el sistema de expresión "Free Style MAX 293 Expression System" (n° de catálogo: K9000-10) de Invitrogen para expresar la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc. Se purificaron entonces usando una columna de purificación "HiTrap Protein A HP Column" (n° de catálogo: 17-040201) de GE Health Care, dando la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc.

Se realizó la confirmación de la expresión de cada una de las proteínas de fusión mediante tinción con plata y transferencia Western después de PAGE-SDS. Para la transferencia Western, se usó un anticuerpo de IgG antihumano marcado con HRP. Se muestra el resultado en la Fig. 5. La banda mostrada por una flecha en la Fig. 5 corresponde a la proteína de fusión. A partir de este resultado, se confirmó que, cuando se insertaba un ligador flexible (L), aumentaba significativamente la cantidad expresada de proteína de fusión.

(4) Construcción del vector de expresión de la proteína de fusión a1-L2-Fc (ejemplo de la presente invención).

Se preparó un vector para expresar una proteína de fusión a1-L2-Fc (SEQ ID N° 15) en el que se modificó un ligador flexible (L) (Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3) de a1-L-Fc preparado en (2) a un ligador flexible (L2) ((Gly-Gly-Gly-Gly- Ser)3).

Se realizó la preparación de la secuencia génica que codifica la proteína de fusión (SEQ ID N° 18) mediante el mismo método de PCR, en el que se usó un gen sintético artificial (SEQ ID N° 1) como molde y se sustituyeron los cebadores de SEQ ID N° 4 y 6 de (2) por las SEQ ID N° 16 y 17.

Se trató el producto amplificado de ácido nucleico resultante con enzima de restricción y se insertó bajo el dominio del promotor hCMV-MIE de pEEI2. 4, que era un vector de expresión para células animales, para construir un vector pEEI2.4-A1L2Fc para secreción y expresión de la proteína de fusión a1-L2-Fc, en la que la región extracelular N- terminal de la isoforma 1 de la subunidad nAChRa1 humana y la región Fc de cadena pesada de IgG1 de anticuerpo humano estaban conectadas por una secuencia ligadora flexible (L2). Se muestra el esquema de la región de expresión de proteína en la Fig. 3.

(5) Construcción del vector de expresión de la proteína Fc-L2-a1 (ejemplo comparativo)

Se preparó un vector para expresar la proteína de fusión Fc-L2-a1 (SEQ ID N° 19) en el que se fusionaban la subunidad nAChRa1 de a1-L2-Fc preparada en (4) y la región constante de cadena pesada de anticuerpo en orden inverso a (4), intercalando un ligador flexible (L2).

Se realizó la preparación del vector mediante el método de PCR de la misma manera que en (2) y (4), usando el gen sintético artificial de SEQ ID N° 1 como molde.

Se trató el producto amplificado de ácido nucleico resultante con enzima de restricción y se insertó bajo el dominio del promotor hCMV-MIE de pEE12. 4, que era un vector de expresión para células animales, para construir un vector pEE12.4-FcL2A1 para secreción y expresión de la proteína de fusión Fc-L2-a1, en la que la región Fc de cadena pesada de IgG1 de anticuerpo humano y la región extracelular N-terminal de la isoforma 1 de la subunidad nAChRa1 humana estaban conectadas por una secuencia ligadora flexible (L2). Se muestra el esquema de la región de expresión de proteína en la Fig. 4.

(6) Construcción de cepas de expresión estables de las proteínas de fusión a1-Fc, a1-L-Fc, a1-L2-Fc y Fc-L-a1

Se transfirió cada uno de los vectores de expresión de proteína de fusión pEE12. 4-A1Fc, pEE12.4-A1LFc, pEE12.4- A1L2Fc y pEE12.4-FcL2A1 preparados en (1), (2), (4) y (5) a células CHO-K1 mediante un método de electroporación, se incubaron bajo selección con sulfoximina de metionina (MSX) y se clonaron para preparar un transformante. Se sometieron los transformantes resultantes (de aquí en adelante, cada uno de ellos se abreviará

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como “célula de expresión de a1-Fc", "célula de expresión de a1-L-Fc”, “célula de expresión de a1-L2-Fc” y “célula de expresión de Fc-L2-a1”) al siguiente experimento.

(7) Incubación de expresión de las proteínas de fusión a1-Fc, a1-L-Fc, a1-L2-Fc y Fc-L2-a1

Se incubó cada una de las células de expresión de a1-Fc, células de expresión de a1-L-Fc, células de expresión de a1-L2-Fc y células de expresión de Fc-L2-a1 preparadas en (6) usando 9 l de “medio CD-CHO” (n° de catálogo: 2490-025) de Invitrogen como medio incipiente para producir cada proteína. Las condiciones de incubación eran pH 7,1 a 37 °C y, durante el 5° al 9° día de incubación, se añadieron 50 ml/l/día de “CHO CD Efficient Feed B" (n° de catálogo: A1024-01) de Invitrogen y se realizó la incubación durante 10 días. Se obtuvo el líquido sobrenadante del cultivo de expresión de proteína de fusión centrifugando el cultivo a 3500XG durante 5 minutos para precipitar las células incubadas y recuperar el líquido sobrenadante de las mismas.

(8) Purificación de las proteínas de fusión a1-Fc, a1-L-Fc, a1-L2-Fc y Fc-L2-a1 y cálculo de la cantidad expresada

Para cada líquido sobrenadante del cultivo de expresión de proteína de fusión obtenido en (7), se cargó una solución después de tratamiento de filtrado con un filtro de 0,45 pm en "Mab select SuRe" (n° de catálogo: 11-0026-01) de GE Healthcare, se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS, se eluyó con 2,5 volúmenes de columna de tampón de ácido cítrico 20 mM (pH= 3,0) y se neutralizó inmediatamente el eluido con Tris-HCl 1 M (pH= 9,0) a una cantidad de 1/10 del eluido para purificar la proteína de fusión. Se concentró el eluido resultante usando "Amicon Ultra-1S, Ultracel-50K" (n° de catálogo: UFC905024) de Japan Millipore, se realizó la sustitución por PBS y se realizó un tratamiento de filtrado usando una membrana de filtro aséptica de 0,22 pm, seguido de someter al siguiente experimento.

Se midió la absorbancia a 280 nm (DO280) de la fracción de eluido resultante y se calculó la cantidad expresada de proteína de fusión por 1 l de líquido incubado para cada cepa de expresión usando el coeficiente de absorción (a1- Fc: 0,57 mg/ml/DO280, a1-L-Fc: 0,59 mg/ml/DO280, a1-L2-Fc: 0,59 mg/ml/DO280, Fc-L2-a1: 0,59 mg/ml/DO280) de cada proteína de fusión, la cantidad de eluido y la cantidad de líquido incubada.

El resultado fue que la cantidad expresada de proteína de fusión era de 72 mg/l para células de expresión de a1-Fc, 1587 mg/l para células de expresión de a1-L-Fc, 1249 mg/l para células de expresión de a1-L2-Fc y 356 mg/l para células de expresión de Fc-L2-a1, y se confirmó que la cantidad expresada se potenciaba significativamente mediante la inserción de un péptido ligador flexible en el sitio de unión de la proteína de fusión. Entre ellas, una cepa de expresión de proteína de fusión que usa Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 como ligador peptídico flexible era excelente.

(9) Confirmación de la capacidad de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc con a-BTX

Con respecto a la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc obtenidas en (8), se confirmó la capacidad de unión de las mismas a a-bungarotoxina (de aquí en adelante, se abreviará como “a-BTX”) y a proteína A con un método ELISA. La a-BTX es una sustancia que tiene la acción de inhibir la neurotransmisión al unirse al dominio a1. Por consiguiente, como resultado de la confirmación de la capacidad de unión de la proteína de fusión con a-BTX, es ahora posible confirmar si la estructura del dominio a1 de la proteína de fusión está correctamente formada. Además, la proteína A fija la proteína de fusión a una placa a través de Fc. Por consiguiente, aunque el propósito principal de este experimento es confirmar la formación de una estructura de dominio a1 de la proteína de fusión como se menciona anteriormente, también es posible en este experimento confirmar si se retiene la estructura de la proteína de fusión como una Fc.

Se inmovilizó “proteína A” (n° de catálogo: 987015) de ICN Biochemicals a la concentración de 1 pg/ml en "C8 Maxisorp Nunc-Immuno Module" (n° de catálogo: 445101) de Nalge Nunc y se realizó entonces el bloqueo usando PBS al que se añadió 1 % de BSA, se añadieron cada una de las proteínas de fusión preparadas en (8) y sometidas a una serie de dilución de 4 veces a la misma en forma de una muestra seguida de lavado posterior, se añadió entonces "a-bungarotoxina, biotina-XX” (n° de catálogo B1196) de Invitrogen a la concentración de 1 pg/ml y finalmente se realizó la reacción con "Peroxidasa-Avidina" (n° de catálogo: 191370) de ICN Biochemicals. Para la detección, se hizo reaccionar “solución TMB” (n° de catálogo N301) de Funakoshi como sustrato y se detuvo la reacción usando solución de ácido sulfúrico al 1 %. Después de eso, se midió la absorbancia a 450 nm de longitud de onda.

Se muestra el resultado en la Fig. 6. Para cualquiera de las proteínas de fusión, se señaló reacción dependiente de la concentración. A partir de este resultado, se confirmó que cada proteína de fusión se une a a-BTX y también se une a proteína A. Por tanto, se confirmó que tanto la proteína de fusión a1-Fc como la proteína de fusión a1-L-Fc retenían la región extracelular de la subunidad nAChRa1 y la estructura como Fc. Incidentalmente, cuando se compararon ambas proteínas de fusión, la curva de unión a a-BTX estaba significativamente desplazada al lado de menor concentración en la proteína de fusión a1-L-Fc, con lo que se juzgó que, cuando se inserta el péptido ligador flexible, se potencia la capacidad de unión por concentración de proteína en una medida de aproximadamente 100 veces o más. Este resultado sugiere que, cuando se inserta péptido ligador flexible, aumenta la estabilidad estructural de la proteína de fusión pretendida y la pureza se vuelve alta.

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(10) Confirmación de la capacidad de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc al autoanticuerpo anti-nAChR

Se incubó Mab35 (TIB-175) (de aquí en adelante se abreviará como “células Mab35”), que es un hibridoma de producción de autoanticuerpo anti-nAChR de rata (subunidad a1) obtenido de la ATCC en "Hybridoma-SFM" (n° de catálogo: 12045-01) de Invitrogen y se trató el líquido sobrenadante del cultivo con "HiTrap Protein G HP Column" (n° de catálogo: 17-0405-01) de GE Healthcare, con lo cual se obtuvo un anticuerpo monoclonal (de aquí en adelante, se abreviará como "mAb35"), que es un autoanticuerpo anti-nAChR.

Se inmovilizó el mAb35 resultante a la concentración de 1 pg/ml en C8 Maxisorp Nunc-Immunomodule de Nalge Nunc y se bloqueó usando PBS al que se añadió 1 % de BSA. Después de eso, se añadieron la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc preparadas en (8) y sometidas a una serie de dilución de 4 veces y, finalmente, se realizó la reacción usando anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con HRP. Para la detección, se hizo reaccionar “solución TMB” de Funakoshi como sustrato y se detuvo la reacción usando solución de ácido sulfúrico al 1 %. Después de eso, se midió la absorbancia a 450 nm de longitud de onda.

Se muestra el resultado en la Fig. 7. Tanto la proteína de fusión a1-Fc como la proteína de fusión a1-L-Fc mostraban una reacción dependiente de la concentración. Cuando se compararon ambas, la curva de unión a autoanticuerpo estaba significativamente desplazada al lado de menor concentración en la proteína de fusión a1-L- Fc, con lo que se juzgó que, cuando se inserta un péptido ligador flexible, se potencia la capacidad de unión (actividad específica) por concentración de proteína en una medida de aproximadamente 100 veces o más. Este resultado sugiere que, cuando se inserta internamente un péptido ligador flexible, no solo aumenta la cantidad expresada de la proteína de fusión pretendida, sino también la estabilidad estructural de la misma y se potencia significativamente la reactividad con autoanticuerpo.

(11) Confirmación de la capacidad de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc con células de producción de autoanticuerpo

En un cuerpo vivo, los autoanticuerpos se producen en linfocitos B. Sobre la membrana celular de la superficie celular de los linfocitos B de producción de autoanticuerpos, se presentan los mismos anticuerpos que los autoanticuerpos como receptor de linfocitos B. Por tanto, sobre la membrana celular del hibridoma Mab35 usado en (10), es probable que el hibridoma Mab35 presente también el anticuerpo mAb35 igual que en el caso de los linfocitos B.

Se hicieron reaccionar ahora 2 x 105 células Mab35 lavadas con HBSS/BSA con cada una de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc preparadas en (8) diluidas 10 veces en un intervalo de 10 ng/ml a 1 mg/ml como muestras. Después de eso, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con PE como reactivo de detección y se realizó la detección usando "Cytomice FC500" de Beckman-Coulter.

Se muestra el resultado en la Fig. 8A y la Fig. 8B. Cada una de las proteínas de fusión se desplazaba al lado derecho de manera dependiente de la concentración, con lo que se confirmó que cada una de las proteínas de fusión se une a células Mab35 de manera dependiente de la concentración. Puesto que la proteína de fusión a1-L- Fc estaba mucho más desplazada, se confirmó que, cuando se inserta un péptido ligador flexible, se potencia la capacidad de unión a células de producción de autoanticuerpo en una medida de aproximadamente 100 veces o más.

(12) Confirmación de la acción de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc como señuelo

La subunidad nAChRa1, similar a la de células de músculo humano, está presente en las células de neuroblastoma humano (TE-671) (de aquí en adelante, se abreviará como “células TE671") obtenidas de la ATCC. Por lo tanto, se confirmó la actividad inhibidora de unión de la proteína de fusión a1-Fc y la proteína de fusión a1-L-Fc preparadas en (8) en la unión del autoanticuerpo mAb35 a células TE671.

Se añadieron 100 pg/ml de la proteína de fusión a1-Fc o la proteína de fusión a1-L-Fc a 2 X 105 células TE671 lavadas con HBSS/BSA. Como control, se añadió HBSS/BSA que no contenía proteína de fusión. Después, se añadió adicionalmente 1 pg/ml de anticuerpo mAb35 al mismo, se añadió anticuerpo de IgG de rata marcado con PE como reactivo de detección y se realizó la detección usando "Cytomics FC 500".

Se muestra el resultado en la Fig. 9. Cuando se usó la proteína de fusión a1-Fc, se señaló solo cierto efecto inhibidor a la concentración de 100 pg/ml mientras que, cuando se usó la proteína de fusión a1-L-Fc, se señaló suficiente efecto inhibidor a la concentración de 100 pg/ml. A partir de este resultado, se confirmó una potenciación significativa de la actividad inhibidora por inserción interna del péptido ligador flexible.

(13) Confirmación de la actividad de ADCC de la proteína de fusión a1-Fc, la proteína de fusión a1-L-Fc y la proteína de fusión Fc-L2-a1

Se lavaron células Mab35 (2 x 105 células) con HBSS/BSA y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos en

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HBSS/BSA al que se añadió el tinte fluorescente "Calceína-AM" (n° de catálogo: C326) de Dojinsha para hacer una concentración 10 jM, con lo que se incorporaba Calceína-AM a las células. Después de eso, se diseminaron las células Mab35 en una placa de 96 pocillos para dar 10.000 células por pocillo y entonces se añadieron a los mismos la proteína de fusión a1-L-Fc preparada en (8) o un anticuerpo de control (Avastin o Enbrel) y linfocitos citolíticos naturales humanos NK92 (CRL-2407) obtenidos de la ATCC (de aquí en adelante, se abreviarán como “linfocitos NK92”) a diversas concentraciones, seguido de incubación a 37 °C durante 4 horas. Después de la incubación, se realizó la separación por centrifugación a 300 x G durante 5 minutos para precipitar las células y se midió la fluorescencia de cada líquido sobrenadante (Ex= 485 nm, Em= 540 nm). Como resultado, aunque se señaló una citotoxicidad celular muy débil (citólisis natural) de manera dependiente de los números de linfocitos NK92, incluso en un grupo en el que solo se añadieron linfocitos NK92 (sin anticuerpo, etc. añadidos), se señaló una fuerte citotoxicidad celular de aproximadamente un 73 % como máximo en el grupo en el que se administró la proteína de fusión a1-L-Fc, y se señaló una fuerte citotoxicidad celular en un grupo en el que se añadió una cantidad de 25 veces de linfocitos NK92 (es decir, las células efectoras (E)) a las células Mab35 (es decir, las células diana (T)) (datos no mostrados). A partir del resultado de los experimentos preliminares anteriores, se comparó la citotoxicidad celular entre la proteína de fusión a1-Fc, la proteína de fusión a1-L-Fc y la proteína de fusión Fc-L2-a1 en condiciones en las que la relación de E/T era de 25.

Como resultado, se señalaron valores de citotoxicidad de 51,8 %, 73,2 % y 32,9 % en la proteína de fusión a1-Fc, en la proteína de fusión a1-L-Fc y en la proteína de fusión Fc-L2-a1, respectivamente. Por otro lado, se señalaron valores de citotoxicidad celular de 17,9 %, 12,5 % y 6,9 % en un grupo en el que no se añadió anticuerpo, en un grupo añadido con Avastin y en un grupo añadido con Enbrel, respectivamente.

A partir de estos resultados, se confirmó que se exhibía la mayor citotoxicidad cuando la región constante de cadena pesada de anticuerpo no estaba situada en el lado N-terminal, sino que se situaba en el lado C-terminal. Se confirmó también que la citotoxicidad celular se potenciaba adicionalmente por la inserción interna de un péptido ligador flexible incluso en el caso en el que la región constante de cadena pesada de anticuerpo estuviera situada en el lado C-terminal.

(14) Confirmación de la prueba in vivo de miastenia grave

Para el experimento, se prepararon 36 ratas Lewis hembra de 11 semanas de edad (Nippon LSC). Como modelo animal para miastenia grave, se usó un modelo de inducción de autoanticuerpo en rata. Se administró por vía intraperitoneal mAb35, que es un autoanticuerpo de nAChR de rata producido por el hibridoma Mab35, a todas las ratas a una dosis de 1,25 mg/kg, con lo cual se indujo un estado mórbido. Se administró por vía intravenosa cada una de las siguientes sustancias después de 4, 12, 24 y 32 horas desde la administración de mAb35. Se administró a un grupo de control 1 ml de PBS cada vez (grupo de control, 6 ratas). Se administró a1-L-Fc preparada en (8) a la dosis de 2,5 mg/rata (a1-L-Fc 2,5, 6 ratas) o 10 mg/rata (a1-L-Fc 10, 6 ratas) cada vez. De forma similar, se administró a1-Fc preparada en (8) a la dosis de 2,5 mg/rata (a1-Fc 2,5, 6 ratas) o 10 mg/rata (a1-Fc 10, 6 ratas) cada vez. Además, se administró Venoglobulin IH al 5 % donada para inyección intravenosa (fabricado por Tanabe Mitsubishi), que era una preparación de inmunoglobulina humana para inyección intravenosa, a la dosis de 80 mg/rata (IVIG, 6 ratas) cada vez.

Durante el periodo de hasta 96 horas después de la inducción del estado mórbido, se evaluó la puntuación de síntomas musculares (puntuación MG). La puntuación de síntomas musculares es como sigue: 0 puntos para ninguna anormalidad, 1 punto para rebaja del agarre de los miembros delanteros; 2 puntos para desaparición del agarre de los miembros delanteros, 3 puntos para rebaja de la fuerza muscular de los miembros traseros y trastorno de la marcha, además de desaparición del agarre de los miembros delanteros, y 4 puntos por parálisis de los miembros traseros además de desaparición del agarre de los miembros delanteros. Se realizó el análisis estadístico de la puntuación de síntomas musculares de tal manera que se hizo la comparación del control con cada grupo administrado con sustancia por la prueba de Steel (SAS Preclinical Package Versión 5.00.010720, versión de Windows (marca comercial registrada), SAS System Release 8.02 TS Level 02MO (SAS Institute Japan)). Se da el resultado en términos de (valor medio) ± (error estándar) y un valor de significación de menos del 5 % (*) se juzgó como una diferencia significativa.

Se muestra el resultado en la Tabla 1 y la Fig. 10. La Fig. 10 muestra el efecto de a1-L-Fc y a1-Fc en el modelo de miastenia grave en rata inducido por mAb35. Como se muestra en la Fig. 10, se observó un cambio tal en el grupo de control que la puntuación de síntomas musculares aumentó desde 24 horas después de la inducción del estado mórbido, se volvió máxima después de 56 horas y disminuyó después de ello. Tal tendencia mostró que a1-L-Fc y a1-Fc suprimían el aumento de la puntuación de los síntomas musculares y que la supresión como tal es dependiente de la dosis. La Tabla 1 muestra una puntuación media después de 56 horas desde la inducción del estado mórbido en la que la puntuación de síntomas musculares del grupo de control se volvía máxima. Se mostró que cualquiera de a1-L-Fc y a1-Fc suprimía significativamente los síntomas musculares mediante la administración de 10 mg/rata cada vez.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de fusión caracterizada porque una proteína (X), que contiene un sitio reconocido por autoanticuerpos que son la causa de una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, está conectada con una proteína (A), que contiene un fragmento de la región constante de cadena pesada de anticuerpo que exhibe

   5 citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, y con un péptido ligador (L) consistente en uno o más aminoácidos, en la que la proteína (X), el péptido ligador (L) y la proteína (A) están conectados en este orden mediante un enlace peptídico de extremo N a extremo C,

   y en la que la proteína de fusión consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID N° 10 o 15.
2. 2. Un método para fabricar la proteína de fusión de la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN que 10 codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1 se inserta en un vector de expresión celular y este vector se

   introduce en células hospedadoras para expresar la proteína de fusión.
3. 3. Una composición para uso en la prevención y el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de tipo autoanticuerpo, caracterizada porque contiene la proteína de fusión de la reivindicación 1 como ingrediente eficaz.

   imagen1

   al humana

   humana

   ’en.n a' humana

   humana

   humana

   humana

   a i humana

   secuenc a

   Kozak

   región extracelular

   región Fe de lgG1 codon de terminación

   . W.

   sitio de reconocimiento

   sitio de reconocimiento

   de a enzima de restricción

   de la enzima de restricción

   secuencia

   ligador flexible

   Kozak

   región Fe de lgG1 codon de terminación

   región extracelular

   ' re

   sillo de reconocimiento

   sitio de reconocimiento

   de a enzima de restricción

   de a enzima de restricción

   secuencia

   ligador flexible 2

   Kozak

   región Fe de lgG1 codon de terminación

   región extracelular

   £eP* 1 o i humana

   sitio de reconocimiento

   sitio de reconocimiento

   de la enzima de restricción

   de la enzima de restricción

   ligador flexible 2

   secuencia

   Kozak

   región extracelular codon de terminación

   región Fe de lgG1

   , :.T.-

   sitio de reconocimiento

   sitio de reconocimiento

   de a enzima de restricción

   de a enzima de restricción

   A405nm

   [Fig. 5]

   Proteína A Proteína A

   imagen2

   — ligador : pEE12. 4-A1Fc + ügador pEE12. 4-AILFc

   [Fig. 6]

   imagen3

   0 100

   9000 loaoo

   concentración de proteína

   (nf/ml)

   r1 3i

   [Fíg* 7]

   imagen4

   0,1 I 10 100 1000 10000 IOOOOO

   concentración de proteína (ng/nl)

   —fll-L-Fc

   co

   00

   imagen5

   imagen6

   co

   CD

   imagen7

   .

   f

   imagen8

   imagen9

   o

   Puntuación MG

   o ho w

   imagen10

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   FL2 Loo FL2 Lag

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   número de eventos

   0 32

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   q número de eventos 34

   0 número de eventos 45

   número de eventos 0 34

   „ número de eventos