JP2012219082A - 融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

【課題】自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができ、しかもその発現量が工業的に十分である新しい融合蛋白質を提供する。
【解決手段】自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが、１個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチド（Ｌ）を介して連結されている融合蛋白質であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、蛋白質（Ｘ）、リンカーペプチド（Ｌ）、蛋白質（Ａ）の順にペプチド結合により連結されていることを特徴とする融合蛋白質。
【選択図】図２

Description

本発明は、自己抗体を中和し、且つ自己抗体の産生を阻害することによって、重症筋無力症などの自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる融合蛋白質に関し、特に、予防・治療のために必要で十分な強い機能を有し、且つ安定な構造を保ったまま発現して細胞外へ分泌されることから、工業的な生産にも対応できる融合蛋白質に関する。

免疫系は、本来、最近やウイルスなどの自己と異なる異物を認識し排除するための役割を有するが、先天的あるいは後天的な異常により、自己の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し、攻撃を加えてしまうことがある。自己免疫疾患は、この様な状態によって生ずる疾患の総称であり、この中でも自己抗体（自己の細胞や組織を抗原として認識する抗体）が自己抗原（自己の細胞や組織）と反応することで生ずる疾患を「自己抗体性自己免疫疾患」と称している。自己抗体性自己免疫疾患としては、例えば、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症や橋本病、自己抗体性急性脳炎、非ヘルペス性辺縁系脳炎などが挙げられる。

自己抗体性自己免疫疾患の治療方法としては、ステロイド剤や免疫抑制剤の投与が従来多く行われている。しかし、これらの薬剤療法はいずれも、疾患の根本的原因である自己抗体を特異的に抑制するものではなく、免疫反応全体を一般的に抑制するものであるため、特異性が無く、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）的にも十分効果的な治療方法とは言えない。

自己抗体性自己免疫疾患の代表例の一つである重症筋無力症についても、それを根本から治療するための既存の治療薬はなく、上述のステロイド剤や免疫抑制剤の他、コリンエステラーゼ阻害薬、血漿交換療法、静注用免疫グロブリン製剤や胸腺摘出術が行われている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、および非特許文献４参照）。

このうち、コリンエステラーゼ阻害薬の使用についてはその容量設定が難しく、副作用が生じたときのために硫酸アトロピン静注、あるいは気道確保が必要となることもあり得る。また、大量長期投与においてはその効果が低下し、さらに、場合によってはコリン作動性クリーゼが生ずる場合もあり、問題視されている。本薬剤は、治療を目的とするものではなく日々の症状に対する対症療法であり、基本的に効果が現れる最低限の量を使用し、長期投与は極力避けるべきとされる。

ステロイド剤については、副作用が問題視されており、副作用の管理は大変重要とされる。また、この薬剤の長期連用は難しく、非ステロイド系の免疫抑制剤である、タクロリムスやサイクロスポリンなど薬剤を交えながらコントロールする必要がある。しかしながら、本薬剤においても先述したように対症療法でしかなく、根本的な治療薬ではない。

胸腺摘出術については、一定の効果を上げているものの、摘出術に対する患者の不安感や費用面の問題があり、更には、免疫機能が未発達な小児や免疫不全患者などには適応できないという問題がある。また、一定の効果を上げているものの、効果が認められるまでには十年単位の長い年月を必要とし、効果が認められるまでは、他の対症療法を併用して行うしかない。更に、効果が認められる患者は５０％に満たないという問題点もある。

血漿交換療法については、１回の処置に１００万円以上の多額な費用が発生する一方、包括医療制度により重症筋無力症の治療費として補助される金額は６０万円程度であり、医療現場での負担も大きい。しかも、その効果は、１ヶ月程度しか持続しないという問題がある。

近年、重症筋無力症の治療方法として、ガンマグロブリン製剤の有効性が確認され、一部の製薬メーカーにおいては臨床試験も行っている。しかし、ガンマグロブリン製剤はヒト血漿由来の生物学的製剤であり、未知のウイルスなどによる感染リスク等が考えられる。また、ガンマグロブリン製剤の投与量は大量投与（４００ｍｇ／ｋｇ、５日間連続投与）であり、患者や医療現場における負担は相当大きいものと予想される。一方、その効果は血漿交換療法と同程度、または若干長い程度にすぎないとされている。

以上、重症筋無力症の治療上の問題点は、低分子薬物治療については一時的な対症療法に過ぎないことであり、また、血漿交換療法、ガンマグロブリン製剤や胸腺摘出術についても効果や費用等の問題点が残っている。

上述の問題点から、重症筋無力症の原因とされる抗アセチルコリン受容体自己抗体のみに反応する抗体を組換え蛋白質において作製することができれば、患者に負担をかけない少量の投与量において、有効な効果が期待されると考えた。そこで、抗アセチルコリン受容体自己抗体を中和するためのイディオタイプ抗体に代わるものとして、本発明者らはｎＡＣｈＲα１サブユニットＮ末端側細胞外領域と抗体重鎖定常領域との融合蛋白質を作製した。この融合蛋白質は自己抗体を中和し、さらには自己抗体の産生細胞を傷害する活性があったことから、自己抗体性自己免疫疾患の一つである重症筋無力症に対して非常に有効であると判断された。しかしながら、この融合蛋白質は発現量が低く、工業的生産を行うには困難な状況にあった。（特許文献１参照）。

特許第４４９５７７６号

日本臨床 ６６巻６号 第１１５５頁〜第１１５７頁 重症筋無力症治験研究動向 神経治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．６ 第６８９頁〜第６９２頁 免疫グロブリン大量療法 厚生省特定疾患免疫性神経疾患調査研究班．平成７年報告書「重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ：ＭＧ）の治療ガイドライン」 第４回ＭＧフォーラム記念講演「日本における重症筋無力症治療と予後の現況」

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができ、しかもその発現量が工業的に十分である新しい融合蛋白質およびその製造方法を提供することである。

上述の特許文献１の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、並びに、産生された自己抗体の中和の２点において、重症筋無力症の治療薬として効果を期待できるものである。しかしながら、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域との融合蛋白質では、構造の立体的障害が原因と考えられる、発現量の少なさ、並びに発現蛋白質の純度等が問題であった。

そこで、本発明者らは、融合蛋白質の発現量、並びに発現蛋白質の純度向上のため、様々な検討を行ったところ、特許文献１の融合蛋白質では、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域の各々が複雑な構造であるため、それらの立体障害により融合蛋白質発現中に誤ったジスルフィド結合が生じ、結果として十分な純度、および発現量が得られなかったと考えられた。そして、それを解決する手段として、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域との間にフレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質を考案した。つまり、フレキシブルなリンカーペプチドを挿入することで、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域の各々の構造が安定な本来の構造を保ったものとなると考えた。そして、各領域が安定的な構造を形成することにより、細胞外への分泌効果が促進され、結果としてより多くの融合蛋白質を産生でき、また、融合蛋白質自体の安定性が増すことで、分解体の比率を著しく減少させることができ、純度の向上が可能となると考えた。そこで、本発明者らは、このフレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質を作製し、この融合蛋白質が、従来のリンカーペプチド無しの融合蛋白質と比較して、発現量が大幅に向上し、且つ発現蛋白質の純度も著しく向上することを見いだした。さらに、フレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質は、従来のリンカーペプチド無しの融合蛋白質よりも自己抗体の中和効果が著しく増強し、また自己抗体産生細胞を特異的に抑制する効果も強いことを見出した。また、抗体重鎖定常領域（Ａ）はＮ末端側よりＣ末端側に位置する方が細胞傷害活性がより強く発揮することを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明の完成に至った。

即ち、本発明によれば、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが、１個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチド（Ｌ）を介して連結されている融合蛋白質であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、蛋白質（Ｘ）、リンカーペプチド（Ｌ）、蛋白質（Ａ）の順にペプチド結合により連結されていることを特徴とする融合蛋白質が提供される。

また、本発明によれば、上記融合蛋白質をコードするＤＮＡを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする上記融合蛋白質の製造方法、及び上記融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物が提供される。

本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の患者の体内に存在する自己抗体を中和し、かつ自己抗体の産生を阻害することによって、自己抗体を特異的に抑制することができる。また、本発明の融合蛋白質は、発現量及び純度が高く、医薬として、実生産規模で提供することができる。従って、本発明の融合蛋白質を使用すれば、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる。

図１は、実施例で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃを発現させるための領域模式図である。 図２は、実施例で作製した融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを発現させるための領域模式図である。 図３は、実施例で作製した融合蛋白質α１−Ｌ２−Ｆｃを発現させるための領域模式図である。 図４は、実施例で作製した融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１を発現させるための領域模式図である。 図５は、一過性発現後に精製した融合蛋白質α１−Ｆｃ、および融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの還元状態に於けるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色像（左側）、およびウェスタンブロッティング像（右側）を示す。 図６は、融合蛋白質α１−Ｆｃ、融合蛋白質α１−Ｌ−ＦｃのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ、およびα−ブンガロトキシンに対する結合能を示す。◆が融合蛋白質α１−Ｆｃの、▲が融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結果を示す。 図７は、抗ｎＡＣｈＲα１サブユニット自己抗体に対する、融合蛋白質α１−Ｆｃ、および融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結合能を示す。◆が融合蛋白質α１−Ｆｃの、▲が融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結果を示す。 図８Ａは、ハイブリドーマＭａｂ３５細胞への融合蛋白質α１−Ｆｃの結合を示す。融合蛋白質の添加濃度は図に示す。 図８Ｂは、ハイブリドーマＭａｂ３５細胞への融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結合を示す。融合蛋白質の添加濃度は図に示す。 図９は、１μｇ／ｍＬの自己抗体ｍＡｂ３５のＴＥ６７１細胞との結合に対する、１００μｇ／ｍＬの融合蛋白質α１−Ｆｃの結合阻害活性（左側）、および同濃度に於ける融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結合阻害活性（右側）を示す。 図１０は、自己抗体ｍＡｂ３５により誘発した重症筋無力症様症状の、融合蛋白質α１−Ｆｃ、および融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃによる改善効果を示す。横軸は時間を、縦軸は重症筋無力症様症状のスコアを示す。●は生理的食塩水投与群、◆は静注用グロブリン製剤投与群、△および▲は融合蛋白質α１−Ｆｃ投与群、□および■は融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃ投与群を示す。

本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが、１個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチド（Ｌ）を介して連結された構造を有する。

蛋白質（Ｘ）は、自己抗体に対する自己抗原、またはその一部に相当し、患者の自己抗原の代わりに自己抗体と結合する囮（デコイ）としての役割を有する。即ち、本発明の融合蛋白質が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、患者の体内の自己抗体は、融合蛋白質のうち蛋白質（Ｘ）の部分を自己抗原として認識してこの部分に結合する。結合した自己抗体は、患者の体内に本来存在する自己抗原ともはや結合することができないので、この方法によって自己抗体を中和することができ、自己抗体と患者の自己抗原との結合による自己免疫疾患の症状の発生を抑制することができる。自己抗体は、特定の一つの抗体ではなく種々の抗体群から成り立っているが、いずれの抗体も自己抗原を認識する機能を有する点では共通する。従って、自己抗原の囮となる本発明の融合蛋白質を使用すれば、種々の抗体群に対して個別の融合蛋白質を作成しなくても、一つの融合蛋白質で種々の抗体群を中和することができる。

ここで定義する「抗体」とはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの各クラスの抗体、並びに各サブクラスの抗体全てを意味する。また、「抗体定常領域」とは、各クラスの抗体、または各サブクラスの抗体、または／および、それら抗体重鎖定常領域を組み合わせたものをも意味する。なお、抗体重鎖定常領域に付加する糖鎖構造は特に限定されるものではない。

本発明の融合蛋白質は、自己抗体の囮となる蛋白質（Ｘ）に加えて、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）も含む。この蛋白質（Ａ）は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮する役割を有する。自己抗体は、血中のＢ細胞で産生されるが、このＢ細胞の表面には、自己抗体と同じ抗原結合部位を持つ細胞表面提示型の抗体がＢ細胞受容体として存在している。従って、本発明の融合蛋白質が患者に投与されると、そのうちの一部は患者の体内の自己抗体と上述のように結合するが、残りは、自己抗体を産生するＢ細胞の表面の抗体（Ｂ細胞受容体）に結合する。Ｂ細胞受容体に本発明の融合蛋白質が結合すると、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞がそのＦｃ受容体を介して融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）に結合し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮し、融合蛋白質に結合したＢ細胞を傷害、自己抗体の産生を抑制する。このように、本発明によれば、体内に存在する自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を阻害するのみならず、自己抗体の産生源である特異的Ｂ細胞をも選択的に傷害することができる。従って、本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。

本発明の融合蛋白質は、１個以上のアミノ酸からなるフレキシブルなリンカーペプチド（Ｌ）を含む。かかるリンカーペプチドを挿入することにより、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域のそれぞれの構造が安定的な構造をとり、融合蛋白質全体が安定的なものとなる。

本発明では、受容体蛋白質（Ｘ）とリンカーペプチド（Ｌ）、抗体重鎖定常領域（Ａ）は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（Ｘ）−（Ｌ）−（Ａ）の順に並ぶことを特徴とする。理論的には、抗体重鎖定常領域（Ａ）はＮ末端側、またはＣ末端側のいずれかの側に位置することが考えられるが、本発明者らは、抗体重鎖定常領域（Ａ）の持つ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）をより効果的に発揮するためには、受容体との結合の際に立体的障害の少ないＣ末端側に抗体重鎖定常領域（Ａ）を配置するべきであることを見出している。また、受容体蛋白質（Ｘ）をＮ末端に位置することでデコイとしての効果も強く発揮できると想定される。

本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ｘ）は、予防または治療対象の自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体に対する自己抗原またはその一部に相当し、予防または治療対象の自己免疫疾患に応じて決まる。例えば、重症筋無力症の予防・治療の場合、重症筋無力症は、神経−筋接合部において、神経伝達物質であるアセチルコリンの筋肉側における受け皿であるニコチン性アセチルコリン受容体（自己抗原）に抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体（自己抗体）が結合してアセチルコリンの神経・筋伝達を阻害することによって生じる疾患であるので、蛋白質（Ｘ）は、自己抗原であるニコチン性アセチルコリン受容体であることができる。同様に、自己免疫性溶血性貧血の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、赤血球表面マーカーであることができ、特発性血小板減少性紫斑病の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、血小板表面マーカーであることができ、自己免疫性好中球減少症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、好中球表面マーカーであることができ、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症や原発性甲状腺機能低下症（橋本病）の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＴＳＨであることができ、自己抗体性脳炎・脳症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体などであることができる。

なお、蛋白質（Ｘ）は、これらの受容体やマーカー全体である必要はなく、自己抗体の認識部位を含んでさえいればその一部であってもよい。例えば、重症筋無力症の場合、上述のニコチン性アセチルコリン受容体は、４種類のサブユニットからなる５量体蛋白質であり、自己抗体の認識部位は、その中でもα１サブユニットのアイソフォーム１（骨格筋でのみ発現されるアイソフォームであり、配列番号１３で示される）、アイソフォーム２（骨格筋、脳、心臓、腎臓、肺臓で発現されるアイソフォームであり、配列番号１４で示される）のＮ末端細胞外領域に存在する。従って、重症筋無力症の場合、蛋白質（Ｘ）は、ニコチン性アセチルコリン受容体α１（ｎＡＣｈＲα１）サブユニットまたはその一部であることができ、より具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２、またはそれらの一部であることができ、さらに具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなることができる。

これらのアミノ酸配列には、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個）のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されていてもよい。その範囲としては、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を有するものが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）で計算することができる。具体的には、このような欠失、付加、および／または置換が導入されたアミノ酸配列は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いて対応するＤＮＡ配列を置換することにより容易に得ることができる。また、人工遺伝子合成技術によって直接作製することもできる。

本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）は、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質であり、例えば抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）、抗体重鎖ＣＨ１領域以下またはそれらの一部であることができる。「抗体」とは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ全てのクラスを含み、更には、全てのサブクラスをも含む。「抗体重鎖定常領域」とは、上記の各クラス、または各サブクラス、またはそれら重鎖定常領域の組み合わせであっても良い。抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）としては、具体的には例えばヒト抗体ＩｇＧ１の場合、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号１１、１２はいずれもヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域の配列であり、配列番号１１は、アジア人に多いタイプ、配列番号１２は、欧米人に多いタイプである。

本発明の融合蛋白質中のペプチドリンカー（Ｌ）は１個以上のアミノ酸からなり、好ましくは５〜４５個、さらに好ましくは１０〜２０個からなり、最も好ましくは１６個のアミノ酸からなる。このペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒエレメントまたはＳｅｒ−Ｇｌｙを含むことができる。

ペプチドリンカー（Ｌ）の具体例としては、
式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ，
式Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ） ｎ，
式Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ，
式（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｎ，または
式（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
（式中、ｎは、１〜８の整数である）で表わされるアミノ酸配列を含むものを挙げることができる。
これらの中でも、一番目及び二番目の式で表わされるアミノ酸配列が好ましい。また、式中の繰り返し数ｎは３であることが好ましい。

また、ペプチドリンカー（Ｌ）の別の具体例としては、アミノ酸Ｇｌｙおよび／またはアミノ酸Ｓｅｒを基本とする構造を有する配列を含むペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有する配列を含むもの）を挙げることができる。

また、ペプチドリンカー（Ｌ）のさらに別の具体例としては、以下のアミノ酸配列をとるもの、またはこの配列を基本として改良を加えたアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを挙げることができる。
Ａ）Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
Ｂ）Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ

本発明の融合蛋白質の具体例としては、例えば配列番号１０のアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。この融合蛋白質は、Ｎ末端側からＣ末端へ、蛋白質（Ｘ）、リンカーペプチド（Ｌ）、蛋白質（Ａ）の順にペプチド結合により連結された融合蛋白質であり、蛋白質（Ｘ）がｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列の第１位〜第２１０位のアミノ酸からなるアミノ酸配列、リンカーペプチド（Ｌ）がＰｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３、蛋白質（Ａ）が配列番号１１のアミノ酸配列に相当する。この融合蛋白質のアミノ酸配列も、上述の通り、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、付加、または／および置換されていてもよい。

本発明の融合蛋白質は、従来公知の遺伝子工学的手法によって製造することができ、例えば、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡ、リンカーペプチド（Ｌ）および蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを必要によりそれぞれ増幅しておき、これらのＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造することができる。ＤＮＡの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができ、増幅したＤＮＡの結合は、例えばＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって行うことができる。また、発現させようとする融合蛋白質のアミノ酸配列を設計し、人工合成遺伝子を直接作成することもできる。発現ベクターは、発現効率を向上させるためのＣＭＶやＳＶ４０等のプロモーターや、発現された融合蛋白質を培養上清より容易に回収するため、抗体重鎖シグナル配列、抗体κ鎖シグナル配列などの分泌シグナル配列を備えていることが好ましい。また、発現蛋白質量を向上させるため、転写開始コドンの上流にｋｏｚａｋ配列を挿入することが好ましい。本融合蛋白質の場合、Ｎ末端側に膜蛋白質であるｎＡＣｈＲα１サブユニットを備えており、且つ、本膜蛋白質はＮ末端側に細胞外領域が存在するため、ｎＡＣｈＲα１サブユニットのオリジナルのシグナル配列を用いることで、発現蛋白質とシグナル配列の相性が良く、良好な分泌発現がなされる。発現宿主細胞としては、例えば哺乳類細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞（大腸菌など）などを使用することができ、その中でも動物細胞、特にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが好ましい。また、融合蛋白質を発現させる核酸配列を染色体上に組み換えることで、トランスジェニック動物としての発現も可能である。発現させた融合蛋白質は、常法により採取し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等を用いて精製すればよい。

次に、本発明の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物について説明する。かかる組成物の具体的な製剤形態としては、注射剤、粘膜吸収剤等を挙げることができる。注射剤の場合は、上述のようにして得られた本発明の融合蛋白質に糖類、ポリオール、アルブミン、界面活性剤等の安定化剤、塩類等の等張化剤等を添加し、凍結乾燥して保存しておき、使用時に注射用水に溶解して投与すればよい。凍結乾燥品中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｇである。また、溶解された注射剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍＬである。注射剤の場合の投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が挙げられる。粘膜吸収剤の場合は、例えば、本発明の融合蛋白質を賦形剤や安定化剤とともに剤型化することで、徐放性の粘膜吸収剤として製剤化し、口腔粘膜、鼻粘膜、眼瞼下等より投与すればよい。粘膜吸収剤の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．１〜３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬである。本発明の組成物の投与量は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人一日当たり１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（１）α１−Ｆｃ融合蛋白質（比較例）の発現ベクターの構築
既知のニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）α１サブユニットのアイソフォーム１蛋白質配列情報（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：Ｐ０２７０８−２）をもとにｎＡＣｈＲα１サブユニットシグナル配列からＮ末端細胞外領域の配列を抽出し、また、ヒト抗体ＩｇＧ１定常領域の蛋白質配列情報（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：Ｐ０１８５７）をもとにヒンジ領域以下、即ちＦｃ領域を抽出し、両者を融合した４６２残基の蛋白質配列を設計した。

チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ細胞）を用いて融合蛋白質の発現を行うため、ＣＨＯ細胞に適した核酸配列への最適化を行った後、５’側に制限酵素認識配列とｋｏｚａｋ配列を付加し、一方、３’側には終止コドンと制限酵素認識配列を付加した核酸配列を人工遺伝子合成技術によって作製した（配列番号１）。

得られた人工合成遺伝子を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるｐＥＥ１２．４のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター支配下に挿入し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域とからなる融合蛋白質α１−Ｆｃ（配列番号２）を分泌発現させるためのベクターｐＥＥ１２．４−Ａ１Ｆｃを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図１に示す。

（２）α１−Ｌ−Ｆｃ融合蛋白質（本発明例）の発現ベクターの構築
（１）で作製した人工合成遺伝子を鋳型に、配列番号１のｋｏｚａｋ配列を含むｎＡＣｈＲα１サブユニット領域について、配列番号３のプライマーと、フレキシブルリンカー（Ｌ）（Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３）をコードする核酸配列を付加した配列番号４のプライマーを添加し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＯＹＯＢＯ社の「ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ」（カタログ番号：ＫＯＤ−４０１）を用いてＰＣＲ法によって核酸増幅を行い、配列番号５の核酸配列を得た。

一方、抗体ＩｇＧ１ Ｆｃ領域についても配列番号１の人工合成遺伝子を鋳型にフレキシブルリンカー配列をコードする核酸配列を付加した配列番号６のプライマーと、配列番号７のプライマーを添加し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを用いてＰＣＲ法によって核酸増幅を行い、配列番号８の核酸配列を得た。

配列番号５、及び、配列番号８の混合液を鋳型に、配列番号３のプライマーと配列番号７のプライマーを添加し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを用いてＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって核酸増幅を行い、配列番号９の核酸配列を得た。

得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるｐＥＥ１２．４のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター支配下に挿入し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域とをフレキシブルリンカー配列（Ｌ）によって繋ぎ合わせた融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃ（配列番号１０）を分泌発現させるためのベクターｐＥＥ１２．４−Ａ１ＬＦｃを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図２に示す。

（３）融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの一過性発現の確認
（１）および（２）で作成した融合蛋白質発現ベクターｐＥＥ１２．４−Ａ１Ｆｃ、ｐＥＥ１２．４−Ａ１ＬＦｃをインビトロジェン社の発現系「Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ＭＡＸ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」（カタログ番号：Ｋ９０００−１０）を用い、ＨＥＫ２９３細胞に導入して融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを発現させ、ＧＥヘルスケア社の精製カラム「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０２−０１）を用いて精製し、融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを得た。

各融合蛋白質の発現確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色並びにウェスタンブロッティングにより行った。ウェスタンブロッティングにはＨＲＰ標識ヒトＩｇＧ抗体を用いた。その結果を図５に示す。図５中の矢印で示すバンドが、融合蛋白質に相当する。本結果より、フレキシブルリンカー（Ｌ）を挿入することにより、融合蛋白質の発現量が著しく上昇したことが確認された。

（４）α１−Ｌ２−Ｆｃ融合蛋白質（本発明例）の発現ベクターの構築
（２）で作製したα１−Ｌ−Ｆｃのフレキシブルリンカー（Ｌ）（Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３）をフレキシブルリンカー（Ｌ２）（（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３）に変更した融合蛋白質α１−Ｌ２−Ｆｃ（配列番号１５）を発現させるためのベクターを作製した。

融合蛋白質をコードする遺伝子配列の作成は、人工合成遺伝子（配列番号１）を鋳型に、（２）の配列番号４、６のプライマーを配列番号１６、１７に置き換え、同様のＰＣＲ法により作製した（配列番号１８）。

得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるｐＥＥ１２．４のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター支配下に挿入し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域とをフレキシブルリンカー配列（Ｌ２）にて繋ぎ合わせた融合蛋白質α１−Ｌ２−Ｆｃを分泌発現させるためのベクターｐＥＥ１２．４−Ａ１Ｌ２Ｆｃを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図３に示す。

（５）Ｆｃ−Ｌ２−α１融合蛋白質（比較例）の発現ベクターの構築
（４）で作製したα１−Ｌ２−ＦｃのｎＡＣｈＲα１サブユニットと抗体重鎖定常領域をフレキシブルリンカー（Ｌ２）を挟んで（４）とは逆の順番で融合した融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１（配列番号１９）を発現させるためのベクターを作製した。

ベクターの作成は、（２）や（４）と同様に、配列番号１の人工合成遺伝子を鋳型にＰＣＲ法により行った。

得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるｐＥＥ１２．４のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター支配下に挿入し、ヒト抗体ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域とヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とをフレキシブルリンカー配列（Ｌ２）によって繋ぎ合わせた融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１を分泌発現させるためのベクターｐＥＥ１２．４−ＦｃＬ２Ａ１を構築した。蛋白質発現領域の模式図を図４に示す。

（６）融合蛋白質α１−Ｆｃ、α１−Ｌ−Ｆｃ、α１−Ｌ２−Ｆｃ、およびＦｃ−Ｌ−α１の安定発現株の構築
（１）、（２）、（４）、および（５）で作成した融合蛋白質発現ベクターｐＥＥ１２．４−Ａ１Ｆｃ、ｐＥＥ１２．４−Ａ１ＬＦｃ、ｐＥＥ１２．４−Ａ１Ｌ２Ｆｃ、およびｐＥＥ１２．４−ＦｃＬ２Ａ１の各々を、エレクトロポーレーション法によりＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、メチオニンスルフォキシミン（ＭＳＸ）選択下で培養を行い、クローン化することにより、形質転換体を取得した。得られた形質転換体（以下、各々「α１−Ｆｃ発現細胞」、「α１−Ｌ−Ｆｃ発現細胞」、「α１−Ｌ２−Ｆｃ発現細胞」、および「Ｆｃ−Ｌ２−α１発現細胞」と略称する）を、以下の実験に供した。

（７）融合蛋白質α１−Ｆｃ、α１−Ｌ−Ｆｃ、α１−Ｌ２−Ｆｃ、およびＦｃ−Ｌ２−α１の発現培養
（６）で作成したα１−Ｆｃ発現細胞、α１−Ｌ−Ｆｃ発現細胞、α１−Ｌ−２−Ｆｃ発現細胞、およびＦｃ−Ｌ２−α１発現細胞をインビトロジェン社の「ＣＤ−ＣＨＯ培地」（カタログ番号：１２４９０−０２５）９Ｌを初発培地として培養し、各々の蛋白質を生産させた。培養条件は、ｐＨ：７．１、３７℃とし、培養５日目から９日目にかけてインビトロジェン社の「ＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄＢ」（カタログ番号：Ａ１０２４−０１）を５０ｍＬ／Ｌ／Ｄａｙで添加し、１０日間培養を行った。融合蛋白質発現培養上清は３５００Ｇ、５分間の遠心により培養細胞を沈殿させ、上清を回収することで得た。

（８）融合蛋白質α１−Ｆｃ、α１−Ｌ−Ｆｃ、α１−Ｌ２−Ｆｃ、およびＦｃ−Ｌ２−α１の精製、ならびに発現量の算出
（７）で得られた各々の融合蛋白質発現培養上清について、０．４５μｍのフィルターで濾過処理した後の溶液をＧＥヘルスケア社の「Ｍａｂ ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ」（カタログ番号：１１−００２６−０１）に負荷し、１０カラム容量のＰＢＳにて洗浄した後、２．５カラム容量の２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝３．０）にて溶出させるとともに、溶出液量の１／１０の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０）にて即時中和を行うことで融合蛋白質を精製した。得られた溶出液を日本ミリポア社の「Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５，Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０Ｋ」（カタログ番号：ＵＦＣ９０５０２４）にて濃縮し、ＰＢＳへの置換を行った後、０．２２μｍの無菌濾過膜にて濾過処理を行い、以下の実験に供した。

得られた溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）を測定し、各々の融合蛋白質の吸光係数（α１−Ｆｃ：０．５７ｍｇ／ｍＬ／ＯＤ２８０、α１−Ｌ−Ｆｃ：０．５９ｍｇ／ｍＬ／ＯＤ２８０、α１−Ｌ２−Ｆｃ：０．５９ｍｇ／ｍＬ／ＯＤ２８０、Ｆｃ−Ｌ２−α１：０．５９ｍｇ／ｍＬ／ＯＤ２８０）、溶出液量、培養液量を用いて、各発現株について、培養液１Ｌ当たりの融合蛋白質の発現量を算出した。

その結果、融合蛋白質の発現量は、α１−Ｆｃ発現細胞については７２ｍｇ／Ｌ、α１−Ｌ−Ｆｃ発現細胞については１５８７ｍｇ／Ｌ、α１−Ｌ２−Ｆｃ発現細胞については１２４９ｍｇ／Ｌ、Ｆｃ−Ｌ２−α１発現細胞については３５６ｍｇ／Ｌであり、融合蛋白質の結合部位にフレキシブルリンカーペプチドを挿入することにより発現量が格段に向上されることが確認された。中でもＰｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３をフレキシブルペプチドリンカーとして用いた融合蛋白質発現株が優れていた。

（９）融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃのα−ＢＴＸに対する結合能の確認
（８）で得られた融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃについて、ＥＬＩＳＡ法を用いてα−ブンガロトキシン（以下、α−ＢＴＸ）とＰｒｏｔｅｉｎ Ａの結合能について確認を行った。α−ＢＴＸは、α１ドメインと結合し、神経伝達を阻害する作用を有する物質である。従って、融合蛋白質のα−ＢＴＸに対する結合能を確認することにより、融合蛋白質のα１ドメインの構造が正しく形成されているかどうかを確認することができる。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは、Ｆｃを介して融合蛋白質をプレートへ固定する。従って、この実験の主目的は、上述の通り融合蛋白質のα１ドメイン構造の形成の確認にあるが、この実験では、融合蛋白質のＦｃとしての構造が保持されているかどうかも確認することができる。

ナルジェヌンク社の「Ｃ８ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＥ」（カタログ番号：４４５１０１）にＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社の「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」（カタログ番号：９８７０１５）を１μｇ／ｍＬの濃度で固相化した後、１％ＢＳＡ添加のＰＢＳにてブロッキングを行い、（８）にて作成した各融合蛋白質を４倍ずつ希釈したものをサンプルとして添加し、更に洗浄後、インビトロジェン社の「α−ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ，ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ」（カタログ番号：Ｂ１１９６）を１μｇ／ｍＬで添加し、最終的にＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社の「ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ−ＡＶＩＤＩＮ」（カタログ番号：１９１３７０）で反応させた。検出にはフナコシ社の「ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（カタログ番号：Ｎ３０１）を基質として反応させ、１％硫酸溶液にて反応を停止させた。その後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

その結果を図６に示す。いずれの融合蛋白質についても濃度依存的な反応が認められた。この結果より、各融合蛋白質はα−ＢＴＸと結合し、且つ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとも結合することが確認された。即ち、融合蛋白質α１−Ｆｃ、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃともに、ｎＡＣｈＲα１サブユニット細胞外領域、及び、Ｆｃとしての構造を保持していることが確認された。なお、融合蛋白質の両者を比較すると融合蛋白質α−Ｌ−Ｆｃについて、α−ＢＴＸとの結合曲線が低濃度側へ著しくシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを挿入することにより、蛋白質濃度あたりの結合力が約１００倍以上向上されると判断された。この結果は、フレキシブルリンカーペプチドの挿入により、目的の融合蛋白質の構造的安定性が増し、純度が高くなっていることを示唆している。

（１０）融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの抗ｎＡＣｈＲ自己抗体に対する結合能の確認
ＡＴＣＣより入手したラット抗ｎＡＣｈＲ（α１サブユニット）自己抗体産生ハイブリドーマＭａｂ３５（ＴＩＢ−１７５）（以下、「Ｍａｂ３５細胞」と略称する）をインビトロジェン社の「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ」（カタログ番号：１２０４５−０１）で培養し、培養上清をＧＥヘルスケア社の「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０５−０１）で処理することにより、抗ｎＡＣｈＲ自己抗体であるモノクローナル抗体（以下、「ｍＡｂ３５」と略称する）を得た。

得られたｍＡｂ３５を１μｇ／ｍＬの濃度でナルジェヌンク社のＣ８ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＥに固相化し、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳでブロッキングした後、（８）で作成した融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを４倍希釈系列したものを添加し、最終的にＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体で反応を行った。検出にはフナコシ社のＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎを基質として反応させ、１％硫酸溶液にて反応を停止させた後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

その結果を図７に示す。融合蛋白質α１−Ｆｃ、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃともに濃度依存的な反応が認められた。また、両者を比較すると融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃについて、自己抗体との結合曲線が著しく低濃度側へシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、蛋白質濃度あたりの結合力（比活性）が約１００倍以上向上すると判断された。この結果は、フレキシブルリンカーペプチドの挿入により、目的の融合蛋白質の発現量のみならず、構造的安定性も向上し、自己抗体との反応性が著しく向上したことを示唆している。

（１１）融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの自己抗体産生細胞に対する結合能の確認
自己抗体は生体内ではＢ細胞で産生され、自己抗体産生Ｂ細胞の細胞表面には、自己抗体と同じ抗体が細胞膜上にＢ細胞受容体として提示されている。即ち、（１０）で使用したハイブリドーマＭａｂ３５細胞膜上には、Ｂ細胞と同様にｍＡｂ３５抗体が提示されていると考えられる。

そこで、ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した２×１０^５個のＭａｂ３５細胞に、（８）で作成した融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを１０ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で１０倍希釈したものをサンプルとして反応させた後、検出試薬としてＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社の「Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００」を用いて検出を行った。

その結果を図８Ａおよび図８Ｂに示す。各融合蛋白質ともに濃度依存的に右側にシフトしていることから、Ｍａｂ３５細胞と濃度依存的に結合していることが確認された。なお、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃはより大きくシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、自己抗体産生細胞に対する結合能が約１００倍以上向上することが確認された。

（１２）融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃのデコイとしての作用の確認
ＡＴＣＣより入手したヒト神経芽腫細胞（ＴＥ−６７１）（以下、「ＴＥ６７１細胞」と略称する）にはヒト筋肉細胞同様のｎＡＣｈＲα１サブユニットが存在する。そこで、ＴＥ６７１細胞に対する自己抗体ｍＡｂ３５の結合に対して、（８）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃおよび融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃの結合阻害活性についての確認を行った。

ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した２×１０^５個のＴＥ６７１細胞に、融合蛋白質α１−Ｆｃ、またはα１−Ｌ−Ｆｃを１００μｇ／ｍＬ添加した。なお、コントロールには融合蛋白質不含のＨＢＳＳ／ＢＳＡを添加した。更に、ｍＡｂ３５抗体１μｇ／ｍＬを添加した後、検出試薬としてＰＥ標識ラットＩｇＧ抗体を添加し、「Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００」を用いて検出を行った。

その結果を図９に示す。融合蛋白質α１−Ｆｃを用いた場合は１００μｇ／ｍＬの濃度において若干の阻害効果しか認められていないが、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃを用いた場合は１００μｇ／ｍＬの濃度において十分な阻害活性が認められた。この結果より、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、著しい阻害活性の向上が確認された。

（１３）融合蛋白質α１−Ｆｃ、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃ、および融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１のＡＤＣＣ活性の確認
２×１０^５個のＭａｂ３５細胞をＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した後、同仁社の蛍光色素「Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ」（カタログ番号：Ｃ３２６）を１０μＭとなるように添加したＨＢＳＳ／ＢＳＡで３７℃、３０分間インキュベーションを行い、細胞内にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを取り込ませた。次に、これらのＭａｂ３５細胞を９６穴プレートに１００００個／ウェルとなるように分注し、（８）で作成した融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃまたはコントロール抗体等（アバスチンまたはエンブレル）と、ＡＴＣＣより入手したヒトナチュラルキラー細胞ＮＫ９２（ＣＲＬ−２４０７）（以下、「ＮＫ９２細胞」と略称する）を様々な濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、×３００Ｇで５分間遠心することで細胞を沈殿させ、上清の蛍光を測定（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５４０ｎｍ）した。その結果、ＮＫ９２細胞のみを添加した群（抗体等無添加）においても極弱い濃度依存的な細胞傷害活性（ナチュラルキリング）が認められたものの、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃ投与群においては、最大で約７３％の強い細胞傷害活性が認められ、ターゲット細胞（Ｔ）であるＭａｂ３５細胞に対しエフェクター細胞（Ｅ）であるＮＫ９２細胞を２５倍添加したものにおいて強い細胞傷害活性が認められた（データは示さず）。以上の予備実験の結果より、Ｅ／Ｔ比＝２５の条件で、融合蛋白質α１−Ｆｃ、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃ、および融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１の細胞傷害活性を比較した。

その結果、融合蛋白質α１−Ｆｃで５１．８％、融合蛋白質α１−Ｌ−Ｆｃで７３．２％、融合蛋白質Ｆｃ−Ｌ２−α１で３２．９％の細胞傷害活性が認められた。一方、抗体無添加群で１７．９％、アバスチン添加群で１２．５％、エンブレル添加群で６．９％の細胞傷害活性が認められた。

これらの結果より、抗体重鎖定常領域は、Ｎ末端側に位置するよりＣ末端側に位置する方が、高い細胞傷害活性を有することが確認された。また、抗体重鎖定常領域をＣ末端側に位置したものでも、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、細胞傷害活性が更に向上することが確認された。

（４）重症筋無力症に対するｖｉｖｏの確認
実験用に１１週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット（日本エスエルシー社製）を３６匹準備した。重症筋無力症の動物モデルとして自己抗体誘発ラットモデルを使用した。全てのラットに対して、ハイブリドーマＭａｂ３５が産生するラットｎＡＣｈＲに対する自己抗体であるｍＡｂ３５を１．２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与することで病態を誘発した。以下の各物質はｍＡｂ３５投与の４、１２、２４及び３２時間後に静脈内投与した。対照群にはＰＢＳを１回あたり１ｍＬ投与した（対照群、６匹）。（８）で調製したα１−Ｌ−Ｆｃは１回あたり２．５ｍｇ／ラット（α１−Ｌ−Ｆｃ ２．５、６匹）または１０ｍｇ／ラット（α１−Ｌ−Ｆｃ １０、６匹）の用量で投与した。同様に（８）で調整したα１−Ｆｃは、１回あたり２．５ｍｇ／ラット（α１−Ｆｃ ２．５、６匹）または１０ｍｇ／ラット（α１−Ｆｃ １０、６匹）の用量で投与した。また、静注用人免疫グロブリン製剤である献血ヴェノグロブリンＩＨ５％静注（田辺三菱製薬社製）を１回あたり８０ｍｇ／ラットの用量で投与した（ＩＶＩＧ、６匹）。

病態誘発後９６時間までの期間、筋症状スコア（ＭＧ Ｓｃｏｒｅ）を評価した。筋症状スコアは、０点：異常なし、１点：前肢の握力低下、２点：前肢の握力消失、３点：前肢の握力消失に加えて、後肢の筋力低下・歩行障害、４点：前肢の握力消失に加えて、後肢の麻痺とした。筋症状スコアの統計学的解析は、対照群と各物質投与群の比較をＳｔｅｅｌ検定（ＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ ５．００．０１０７２０、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）版 ＳＡＳシステムリリース８．０２ＴＳレベル０２Ｍ０（ＳＡＳインスティチュートジャパン））で行った。結果は平均±標準誤差で示し、危険率５％未満（＊）を有意差ありと判定した。

結果を表１及び図１０に示す。図１０はｍＡｂ３５誘発ラット重症筋無力症モデルにおけるα１−Ｌ−Ｆｃ及びα１−Ｆｃの効果を示すものである。図１０に示すとおり、対照群では病態誘発２４時間後から筋症状スコアが増加し、５６時間で最大となり、その後は減少する変化が観察された。α１−Ｌ−Ｆｃ及びα１−Ｆｃは筋症状スコアの増加を抑制し、これらの抑制は用量に応じた抑制である傾向が示された。表１には対照群の筋症状スコアが最大となった病態誘発５６時間の平均スコアを示す。α１−Ｌ−Ｆｃ及びα１−Ｆｃはいずれも１回あたり１０ｍｇ／ラットの投与で筋症状を有意に抑制することが示された。

本発明によれば、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる融合蛋白質を、医薬として実生産規模で提供することができる。従って、本発明の融合蛋白質は、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療するために広く利用できる。

配列番号３，４，６，７，１６，１７は、プライマーの配列である。

Claims (11)

1. 自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが、１個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチド（Ｌ）を介して連結されている融合蛋白質であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、蛋白質（Ｘ）、リンカーペプチド（Ｌ）、蛋白質（Ａ）の順にペプチド結合により連結されていることを特徴とする融合蛋白質。
2. リンカーペプチド（Ｌ）が、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１〜８の整数である）で表わされるアミノ酸配列または式Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１〜８の整数である）で表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
3. 蛋白質（Ｘ）が、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα１サブユニット、またはその一部であることを特徴とする請求項１または２に記載の融合蛋白質。
4. 蛋白質（Ｘ）がヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットの配列番号１３のアミノ酸配列からなるアイソフォーム１および／または配列番号１４のアミノ酸配列からなるアイソフォーム２であるか、またはそれらの一部、またはこれらのアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
5. 蛋白質（Ｘ）がヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
6. 蛋白質（Ａ）が、抗体重鎖のヒンジ領域以下、抗体重鎖ＣＨ１領域以下、またはそれらの一部もしくはそれらの一部の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
7. 蛋白質（Ａ）が、ヒト抗体ＩｇＧの重鎖定常領域、またはＩｇＧサブユニットの重鎖定常領域の一部の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
8. 蛋白質（Ａ）が、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
9. 融合蛋白質が配列番号１０のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
10. 請求項に１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質の製造方法。
11. 請求項１〜９のいずれかに記載の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物。