ES2657377T3

ES2657377T3 - Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento

Info

Publication number: ES2657377T3
Application number: ES13838016.7T
Authority: ES
Inventors: Tsutomu Arakawa; Douglas Farrar
Original assignee: Coherus Biosciences Inc
Current assignee: Coherus Oncology Inc
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2018-03-05
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: DOP2015000055A; SMT201800163T1; WO2014043103A1; MX2018012749A; CN110051823A; CL2015000572A1; HRP20180182T1; US20140072560A1; EP2895188B1; KR102133699B1; EA031324B1; LT2895188T; PT2895188T; SG11201501460RA; CN104902914A; IL267452A; EP2895188A4; AU2018247244A1; JP2021100929A; TW201425331A

Abstract

Un método de cromatografía en modo mixto para separar un etanercept plegado correctamente de un etanercept plegado incorrectamente, que comprende las etapas de: (a) unir una primera mezcla de proteínas que contiene etanercept que comprende conformaciones de etanercept tanto plegadas correctamente como incorrectamente plegadas a una resina de cromatografía en modo mixto que tiene restos de intercambio iónico y restos hidrófobos; (b) eluir el etanercept plegado correctamente de la resina en modo mixto poniendo en contacto la resina en modo mixto con una solución salina para obtener una segunda mezcla de proteínas que contiene etanercept que comprende una proporción mayor de etanercept plegado correctamente que la primera mezcla de etanercept.

Description

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impurezas correctamente plegadas, incorrectamente plegadas, y otras impurezas) tal como las obtenidas, por ejemplo, a partir de la expresión de CHO de etanercept, el método de la invención permite que etanercept (tanto correcta como incorrectamente plegado) se una a la resina de modo mixto. En segundo lugar, durante una posterior elución o etapa de lavado (por ejemplo, utilizando un gradiente de sal aplicado preferiblemente en un gradiente de 5 concentración creciente), la presente invención permite la liberación (es decir, elución) de la resina de una mezcla a base de etanercept en la que el etanercept contenido en la misma predominante se pliega correctamente, mientras permite substancialmente que etanercept sea plegado incorrectamente para permanecer unido o capturado en la resina de modo mixto; por lo que se puede obtener en el material eluido de la resina en una proporción muy elevada del etanercept correctamente plegado (en comparación con una menor proporción del mismo presente en la muestra 10 de proteínas que contiene etanercept inicialmente introducida y unida a la resina). En cuanto al funcionamiento físico de la cromatografía de modo mixto de la presente invención, la resina de modo mixto puede contenerse (es decir, empaquetarse) en un medio de contención rígido columnar o recipiente que puede contener la resina, y que tiene medios de entrada y salida para permitir que las soluciones fluidas entren en un extremo de la columna, fluyan en contacto con la resina, y luego salgan por un extremo opuesto del recipiente para recogerse para su posterior

15 análisis o procesamiento, o que se desechen.

La solución que contiene una mezcla de proteínas de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente utilizado en la etapa (a) de los métodos descritos anteriormente puede obtenerse de una manera conocida a partir de la expresión de la proteína etanercept en el cultivo de células de mamífero, por ejemplo, células CHO. Antes de la 20 purificación cromatográfica de modo mixto en la presente invención, la proteína recolectada de la expresión mamífera (un fluido de cultivo celular recolectado) puede someterse a una etapa de purificación inicial, tal como la purificación por afinidad de proteína A, para eliminar las impurezas. Mientras que dicha etapa puede ser deseable para la eliminación de impurezas no basadas en etanercept, esta purificación generalmente no dará como resultado una separación apreciable (es decir, resolución) del etanercept correctamente plegado del etanercept

25 incorrectamente plegado. Por consiguiente, el grupo de proteína A se somete entonces a la metodología de modo mixto de la presente invención para realizar dicha separación.

El método de la presente invención ofrece recuperaciones comercialmente útiles (rendimientos) de etanercept correctamente plegado. Por ejemplo, en casos en los que la solución de proteína a base de etanercept de 30 etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente utilizado en la etapa (a) del presente método se proporciona preferiblemente en forma de un resultado de cromatografía de proteína A obtenido purificando un producto de expresión mamífera de etanercept en una columna de proteína A, la cantidad de material recuperado en la etapa de purificación de la proteína A es preferiblemente al menos aproximadamente del 80% en peso y preferiblemente al menos aproximadamente del 85% en peso de los productos de expresión a base de etanercept 35 presentes en el cultivo celular recolectado introducido a la columna de la proteína A (donde la cantidad de proteínas a base de etanercept presentes en el cultivo celular recolectado puede determinarse mediante Fc Elisa, y la cantidad de proteínas a base de etanercept obtenidas en el grupo de elución de la proteína A puede determinarse por absorbancia UV a A280 nm). Posteriormente, cuando la cromatografía de modo mixto de la presente invención se pone en práctica usando el material purificado de proteína A mencionado anteriormente, la cantidad de material de

40 proteína a base de etanercept obtenido en la elución de la etapa (b) del presente es preferiblemente al menos aproximadamente del 60% en peso y preferiblemente al menos aproximadamente del 70% en peso de la cantidad de material a base de etanercept introducido a la resina de modo mixto en la etapa (a) de la invención.

Por consiguiente, el rendimiento total de una mezcla altamente pura de etanercept en el eluato de modo mixto de la

45 etapa (b) de la presente que está altamente enriquecido en etanercept correctamente plegado (es decir, que contiene no más del 10% en peso y preferiblemente no más de aproximadamente el 5% en peso de material plegado incorrectamente por peso del eluato) puede ser cualquiera de aproximadamente el 30 a aproximadamente el 50% en peso de la mezcla a base de etanercept originalmente presente en un fluido de cultivo celular recolectado antes de la purificación (por ejemplo, purificación de la proteína A) del mismo.

50 La purificación del fluido de cultivo celular recolectado también puede lograrse por otros medios cromatográficos, tal como cromatografía de modo mixto usando resinas de cromatografía que tienen tanto intercambio iónico como restos de interacción hidrófoba.

55 En la práctica del método de la presente invención, las etapas de filtración adicionales (por ejemplo, filtración viral y filtración de flujo tangencial) pueden realizarse de una manera conocida para procesar además eluatos producidos en la etapa (b) del método de cromatografía de modo mixto descrito anteriormente.

La presente invención proporciona un método de separación muy mejorado para la separación de conformaciones

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solución de sal, tal como a través de un gradiente. El gradiente puede lograrse por etapas, pero se prefiere que sea continuo y lineal. En una realización preferida, la solución de sal contiene cloruro sódico ("NaCl"). El gradiente lineal de NaCl puede ser de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 M.

5 En una realización alternativa, la solución de sal puede contener sulfato sódico ("Na2SO4"). La solución de Na2SO4 también se puede aplicar en un gradiente escalonado o lineal, preferiblemente de forma lineal y mucho más preferiblemente de un gradiente de concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 molar.

El etanercept se puede obtener por cultivo en células CHO.

10 En una realización preferida, la solución de sal comprende NaCl.

Se siguieron los siguientes procedimientos para la expresión, purificación de productos de expresión, y análisis de eluatos que contienen etanercept obtenidos del método de cromatografía en modo mixto de la presente invención:

15 Expresión de Etanercept. El etanercept se expresa en medios acondicionados ("CM") de células CHO recombinantes transfectadas con un gen que codifica el dominio extracelular de TNFR humano fusionado a Fc humano en el extremo C-terminal. Los ejemplos en la técnica para la expresión de etanercept en mamíferos se pueden encontrar en las siguientes patentes de Estados Unidos: RE 36755; Patente de Estados Unidos N.º

20 5.605.690; EP 464.533; EP 417.563; Patente de Estados Unidos N.º 8.063.182; y Patente de Estados Unidos N.º

7.294.481.

Cromatografía de Proteína A. El CM obtenido anteriormente se procesa utilizando una columna de Proteína A con 1 ml de columna HiTrap rProteína A (disponible en GE Healthcare) y se equilibra con una solución de fosfato 10 mM, 25 NaCl 0,1 M, pH 7,0. Después de lavar la columna con una solución de clorhidrato de arginina 1 M ("arginina"), citrato 0,1 M, pH 6,0, las proteínas unidas se eluyen por etapas con pH 4,2, 3,7 y 3,0 que contienen arginina 1 M y citrato 0,1 M. Como alternativa, la columna puede procesarse sin arginina en un pH descendente con citrato 0,1 M. En ausencia de arginina, la mayoría del etanercept se eluyó a un pH de 3,85 para proporcionar un eluato que comprendía contaminantes, así como etanercept plegado incorrectamente, fragmentos de etanercept, agregados de

30 etanercept, etc., eluyendo por debajo de este pH. Después, el eluato de Proteína A se somete a Capto MMC o Capto Adhere en una columna HiTrap (disponible en GE Healthcare) como se describe a continuación en los ejemplos.

Análisis del eluato de Proteína A. El análisis del eluato de Proteína A obtenido anteriormente se expone en las

35 figuras 2A y 2B. La figura 2A muestra el perfil de elución de Proteína A con tampones de pH bajo que contienen arginina 1 M. Se observó un gran pico de absorbancia UV a pH 6,0 (pico marcado como 6,0) y no contenía ninguna banda (figura 2B, carril 4) correspondiente al Etanercept comercial según se examinó por PAGE nativa (carril 1): se ha de apreciar que no hay Etanercept fluyendo a través de la columna de Proteína A (comparar el carril 2 y 3). Aunque no se observaron bandas de proteína a pH 6,0 (carril 4), la gran absorbancia UV observada indica la elución

40 de pigmentos. Después de alcanzar la absorbancia de referencia (figura 2A), la columna se eluyó entonces con arginina 0,1 M, citrato 0,1 M, pH 4,2, dando como resultado un pico de elución agudo (figura 2A, marcado 4,2). El análisis de PAGE nativa de este pico mostró una banda intensa de Etanercept, junto con bandas de baja movilidad de frotis (carril 5). El análisis HIC de la proteína eluida mostró 2 picos, correspondiendo el primer pico al pico principal de Etanercept comercial y correspondiendo el segundo pico a la especie menor también presente en el

45 Etanercept comercial. Aunque la naturaleza del segundo pico no está clara, parece ser una especie mal plegada de Etanercept, ya que se une a la proteína A y, por lo tanto, debería contener el dominio Fc. Las proteínas unidas restantes se eluyeron con pH 3,7 y luego 3,0, conteniendo ambas arginina 1 M. Estos disolventes de pH bajo dieron como resultado la elución de pequeños picos como se muestra en la figura 2A (3,7 y 3,0). El pico de pH 3,7 contenía una pequeña cantidad de etanercept (carril 6), mientras que el pico de pH 3,0 contenía principalmente especies de

50 baja movilidad, correspondientes a las especies mal plegadas, así como a las especies que también pueden agregarse (carril 7). Se observó un patrón de elución similar en ausencia de arginina. Se requirió un pH inferior, por ejemplo, pH 3,85 para eluir etanercept y disminuir además el pH dio como resultado la elución de especies de baja movilidad. El hecho de que estas especies de baja movilidad unidas a la Proteína-A significa que también eran proteínas de fusión Fc. Dado que estas especies se eluyeron a pH más bajo que Etanercept, se unieron a la

55 Proteína A más estrechamente. Estos análisis confirman que la expresión de etanercept en células CHO recombinantes conduce tanto a etanercept nativo (correctamente plegado), correspondiente a las especies correctamente plegadas, como a las especies de baja movilidad, correspondientes a especies incorrectamente plegadas, según se analiza mediante HIC analítica. Dado que la especie mal plegada se eluyó más tarde en HIC, debería ser más hidrófoba que el etanercept nativo. Dependiendo de los clones de CHO y las condiciones de

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La jeringa puede ir acompañada de instrucciones para la administración.

También se describe un kit o recipiente, que contiene una composición farmacéutica acuosa obtenida de acuerdo con la invención. La concentración del polipéptido en la composición farmacéutica acuosa puede variar en un amplio 5 intervalo, pero generalmente está en el intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20.000 microgramos por mililitro (μg/ml) de formulación acuosa. El kit también puede ir acompañado de instrucciones de uso.

La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que están destinados a ser solo ilustrativos, ya que muchas modificaciones y variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

10 Ejemplos 1

Purificación en modo mixto Capto MMC usando elución de NaCl

15 En este ejemplo, un eluato de Proteína A obtenido como se ha descrito anteriormente se somete a cromatografía Capto MMC. La columna Capto MMC se equilibra con una solución de citrato 5 mM, pH 4,5. Una dilución apropiada de eluato de Proteína A (por ejemplo, dilución de 3 a 6 veces dependiendo del tampón de elución de la etapa de Proteína A) con citrato 5 mM da como resultado la unión completa a la columna. Como se mostró en los análisis de SDS-PAGE, la muestra de carga (pH 4,2, eluato de Proteína A) es altamente heterogénea y no fluye

20 proteína a través de la columna Capto MMC. Las proteínas unidas luego se eluyen con una solución de NaCl 0,15 M en fosfato 10 mM, pH 7,5 que conduce a un cambio simultáneo en el pH (de 4,5 a 7,5) y concentración de NaCl (de 0 a 0,15 M). Se observa un pico de elución agudo que contiene etanercept plegado correctamente a partir del análisis del eluato. Sin embargo, la recuperación fue de aproximadamente el 40-50%. Después de la etapa de elución como se acaba de describir, la resina que contiene el material de proteína unido restante se pone en

25 contacto con NaCl 0,3 M y las soluciones de arginina 1 M en fosfato 10 mM, pH 7,5, lo que da como resultado eluciones que contienen principalmente especies plegadas incorrectamente, así como agregados unidos por disulfuro. Este ejemplo demuestra que Capto MMC es eficaz para separar las especies mal plegadas de las especies correctamente plegadas. El hecho de que las especies mal plegadas eluyan a una mayor concentración de sal (0,3 M frente a 0,1 M) significa que tienen una interacción electrostática más fuerte con la columna. Además, la

30 arginina 1 M aumenta adicionalmente la elución de proteínas mal plegadas y también agregadas, lo que indica que estas proteínas están unidas a Capto MMC no solo a través de interacción electrostática sino también por interacción hidrófoba, y que la arginina mejora la alteración tanto de las interacciones electrostáticas como hidrófobas. El análisis de las fracciones de eluato obtenidas en este ejemplo se representa en las figuras 3A y 3B.

35 Ejemplo 2

Purificación en modo mixto Canto MMC usando resina NaCl equilibrada a pH 7,5

En el ejemplo anterior, la solución de proteína que comprende etanercept correctamente plegado e incorrectamente

40 plegado se puso en contacto inicialmente con la resina CAPTO MMC a pH 4,5. En este ejemplo, se observa una elución similar a la observada en el Ejemplo 1 cuando la columna Capto MMC se equilibra primero con una solución de fosfato 10 mM, pH 7,5 y luego se eluye con NaCl seguido de arginina. Específicamente, no se eluye etanercept durante este equilibrio de pH. Este resultado es inesperado porque etanercept está cargado negativamente a pH 7,5; la pI de etanercept varía de 4,9 a 5,4 debido a una pesada glucosilación. Por lo tanto, a o

45 por debajo de pH 4,5, el etanercept está cargado positivamente y, por lo tanto, debe unirse a los ligandos de Capto MMC cargados negativamente, aunque la interacción hidrófoba puede contribuir a la unión. A un pH de 7,5, el etanercept con carga negativa debe disociarse de la Capto MMC cargada negativamente, pero se encuentra que esto no ocurre. Esto puede explicarse por la interacción hidrófoba entre etanercept y Capto MMC que supera la repulsión electrostática entre la columna con carga negativa y el etanercept. Como alternativa, Capto MMC puede

50 contener la proteína unida uniéndose a las cargas positivas locales en el resto de proteína (pI del resto de proteína es ~8,1).

Ejemplo 3

55 Purificación en modo mixto Capto MMC usando gradiente de NaCl para elución

En este ejemplo, la elución exitosa se logra usando un gradiente de concentración de NaCl. Específicamente, después de lavar la columna con la solución de fosfato 10 mM, pH 7,5, las proteínas unidas se eluyeron con

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gradiente de sal lineal de 0 a 0,5 M. La muestra de carga (eluato de proteína A pH 4,2) es extremadamente heterogénea (que contiene tanto etanercept plegado correctamente como plegado incorrectamente) como en el caso anterior, y las proteínas unidas se eluyen con una fuerza iónica creciente del gradiente de NaCl. Después de 180 minutos, el gradiente se termina y la concentración de sal se lleva entonces a 0,5 M, lo que causa una elución de 5 proteína ligeramente mejorada. Según lo determinado por los análisis posteriores, las fracciones bajas en sal contienen más del etanercept plegado correctamente y las fracciones de sal superiores se enriquecieron con especies de baja movilidad (plegadas incorrectamente y agregadas). Finalmente, las proteínas restantes se eluyen con una solución de arginina 1 M, fosfato 10 mM, pH 7,5. Esta fracción no contiene etanercept, sino especies de movilidad completamente baja (mal plegadas/agregadas). El uso de la elución en gradiente de NaCl de Capto 10 MMC en diferentes eluatos de Proteína A, combinado con un equilibrio preliminar de la resina da como resultado un eluato más puro en términos de etanercept plegado correctamente. A bajas concentraciones de NaCl en los medios de elución, las muestras eluidas se enriquecen con el etanercept plegado. Las especies mal plegadas aumentan gradualmente en el eluato a medida que el gradiente de sal descrito anteriormente se aplica a la resina. Después de que se completa el gradiente de sal, la resina se pone en contacto con la solución de arginina 1 M, y se encuentra 15 que la fracción de eluato resultante de la misma contiene especies mal plegadas (que incluyen no solo especies mal plegadas sino también agregadas) como es evidente en el posterior análisis de SDS-PAGE. Se cree que algunas de las especies de baja movilidad son etanercept plegado incorrectamente (pero no agregado) en SDS-PAGE, lo que indica que una porción de especies mal plegadas migra como homodímero de etanercept mal plegado con movilidad más lenta en PAGE nativa que el homodímero de etanercept plegado correctamente. El análisis de fracciones de

20 eluato obtenido en este ejemplo se proporciona en las figuras 4A, 4B y 4C.

Ejemplo 4

Purificación en modo mixto Capto MMC usando gradiente de Na2-SO4 para elución

25 En este ejemplo, se usa un gradiente de Na2SO4 en lugar del NaCl como el gradiente de sal para la elución de etanercept plegado correctamente a partir de la resina en modo mixto. Si bien el NaCl en general se usa exclusivamente para eluir proteínas en IEC, generalmente se sabe que diferentes sales tienen diferentes grados de efectos de precipitación salina (precipitación de proteína). El NaCl es un intermediario entre sales salinas, tal como

30 MgCl2, y sales desalinizadas, tales como Na2SO4. El NaCl puede ser eficaz para debilitar la interacción electrostática entre etanercept y Capto MMC, pero puede ser neutro en el debilitamiento de la interacción hidrófoba. En el presente documento se pensó que Na2SO4 también debería ser eficaz para debilitar la interacción electrostática, pero debería potenciar la interacción hidrófoba porque se conoce como una sal desalinizadora fuerte. Por lo tanto, si las especies de baja movilidad están unidas por la columna mediante interacción hidrófoba como se ha indicado

35 anteriormente, su elución puede suprimirse por Na2SO4. Esto se ensaya por elución de la solución de proteína que contiene etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado con un gradiente de Na2SO4 de 0 a 0,4 M, después del equilibrio del pH de la columna de resina CAPTO MMC con una solución de fosfato 10 mM, pH 7,5. Después de que se completa la elución del gradiente de Na2SO4 de las proteínas, la columna se lava con una solución de arginina 1 M, pH 7,5. La figura 5A muestra el cromatograma de elución, mientras que la figura 5B

40 muestra la SDS-PAGE y la PAGE nativa de las fracciones eluidas. Se observa una banda relativamente marcada de etanercept plegado correctamente en fracciones bajas de Na2SO4 (carriles 6 y 7, figura 5B) y la pureza de estas fracciones es mayor que la carga (carril 1). Las concentraciones más altas de Na2SO4 dan como resultado la elución de especies de baja movilidad en PAGE nativa (carriles 8 y 9, figura 5B). Una elución de arginina 1 M final a pH 7,5 da como resultado la elución de especies de baja movilidad (mal plegadas/agregadas). Parece haber algo de

45 etanercept en esta fracción (carril 10, figura 5B), lo que indica que Na2SO4 también puede suprimir la elución del etanercept nativo. Se puede concluir que Na2SO4 es igual, si no más, eficaz para separar las especies plegadas de las especies mal plegadas, aunque puede causar la retención de etanercept nativo (carril 10).

Ejemplo 5

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Purificación en modo mixto Capto MMC usando elución con gradiente de NaCl y pH

En los ejemplos anteriores, no se observa que las proteínas eluyen durante la etapa de equilibrio del pH, es decir, cambio de pH de 4,5 (citrato 5 mM) a 7,5 (fosfato 10 mM). Sin embargo, cuando la cantidad de carga de proteína 55 aumenta más de 10 mg por 1 ml de columna, éste ya no es el caso. Una elución creciente de las proteínas durante el cambio de pH se produce a mayor carga, aunque el motivo de esta observación no está claro. La pureza de esta muestra eluida es mayor que las muestras de carga, pero es mucho menor que las bajas fracciones de sal. Por ejemplo, cuando la muestra de carga (eluato de Proteína A) contiene solo el 51% de especies de etanercept plegadas correctamente, la elución que ocurre durante el equilibrio de pH es solo un 65% pura, más alta que la

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Canto Adhere; Elución con gradiente de arginina y gradiente de pH de 7,5 a 4,5

Las eluciones con gradiente de arginina también se realizan a pH 7,5 usando grupos de Capto MMC. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de fosfato 10 mM, pH 7,5 con respecto a arginina 0,6 M, fosfato 10 5 mM, pH 7,5. Los perfiles de SDS-PAGE y PAGE nativa muestran la elución de etanercept plegado correctamente en las fracciones intermedias (arginina 0,2-0,4 M) (figura 13). Se observan especies de baja movilidad como se ve en ambos geles en la fracción posterior y un lavado final de arginina 1 M a pH 7,0. En comparación, cuando se reemplaza la arginina 0,6 M por NaCl 0,5 M en la elución en gradiente a pH 7,5, la elución de etanercept se redujo en gran medida. La figura 14 muestra el perfil de elución a pH 7,5 durante el gradiente de sal con respecto a NaCl 10 0,5 M. Se observaron dos picos durante el gradiente, que contenían principalmente etanercept, pero con un bajo rendimiento. Se eluyó una gran cantidad de etanercept en el lavado final con arginina 1 M, lo que indica que la concentración de sal de NaCl 0,5 M junto con el pH 7,5 no era óptima para la separación del etanercept plegado correctamente del material mal plegado/agregado. Como se ha apreciado anteriormente, la arginina 1 M fue muy eficaz en la elución del etanercept plegado correctamente, aunque con la presencia de especies de baja movilidad. 15 Se observa que modificar el gradiente de elución de sal para aplicar un gradiente de aproximadamente 0 a aproximadamente NaCal 1 M y realizar la elución a pH 8 da como resultado una resolución excelente de etanercept plegado correctamente frente a especies de alta-baja movilidad (mal plegadas/agregadas) en productos de elución temprana de dicho gradiente como se muestra en el Ejemplo 12. Parece que la contribución hidrófoba de la unión de etanercept a Capto Adhere se reduce a pH 8,0, dando como resultado la elución eficaz de etanercept plegado

20 correctamente con NaCl en solitario.

Ejemplo 11

Capto Adhere; Elución con gradientes de arginina/NaCl a pH 7,5

25 En este ejemplo, se investiga un gradiente combinado de NaCl/arginina a pH 7,5. Se investigaron dos de dichos gradientes: El primer gradiente que se investiga para el medio de elución es uno en el que las concentraciones finales de NaCl y arginina son 0,4 y 0,2, respectivamente. Después, se investiga un segundo gradiente en el que las concentraciones finales de NaCl y arginina son NaCl 0,25 M y arginina 0,5 M, respectivamente. En ambos casos, los

30 gradientes se aplican en una solución de fosfato 10 mM, pH 7,5. El primer gradiente todavía era demasiado débil para reducir las interacciones hidrófobas y, por lo tanto, eluir etanercept. El segundo gradiente fue más eficaz, como lo indica un pico más pequeño en el lavado de arginina 1 M final. En particular, según se confirma con SDS-PAGE, la elución de etanercept se produce a lo largo del segundo gradiente ensayado hasta NaCl 0,25 M, arginina 0,5 M sin especies de alto peso molecular (baja movilidad/mal plegadas/agregadas). Esta especie de alto peso molecular

35 luego se eluye en el lavado de arginina 1 M final. En la PAGE nativa, se demuestra que la mayor parte de etanercept nativo plegado correctamente se eluye en la fracción media. Se observó una banda de frotis con el lavado de arginina 1 M. Por lo tanto, resulta evidente que una combinación de arginina y NaCl puede conducir a la elución de etanercept y la separación de especies de baja movilidad y alto peso molecular, correspondientes a las especies mal plegadas. El análisis de HIC de las fracciones de Capto Adhere para los grupos de Capto MMC (60-80% de

40 pureza) muestra que las fracciones eluidas durante el gradiente (excepto las fracciones de la cola) normalmente dieron una pureza superior al 95%. Los análisis de los materiales eluidos obtenidos en este ejemplo se representan en las figuras 15A y 15B.

Ejemplo 12 - Capto Adhere y Capto MMC

45 En este ejemplo, un eluato de Proteína A que comprende etanercept correctamente plegado y mal plegado se obtuvo por un método similar al método de Proteína A descrito anteriormente. El eluato se aplicó posteriormente a una columna Capto MMCe, y el grupo de productos se aplicó luego a una columna Capto ADHERE para proporcionar un producto de etanercept superior, tanto cuantitativa como cualitativamente.

50 ETAPA 1. Expansión celular. De una manera conocida en la técnica, la expansión celular necesaria para generar un número suficiente de células para la inoculación de un biorreactor de producción se realiza usando un clon de células CHO que expresan la proteína de fusión de etanercept. El producto de este proceso de expresión (un líquido de cultivo celular recolectado) da como resultado una mezcla de etanercept plegado correctamente, así como

55 etanercept plegado incorrectamente y/o agregado, junto con impurezas adicionales. El fluido de cultivo celular recolectado que comprende dicha mezcla de proteínas se somete a inactivación viral con detergente.

ETAPA 2. Cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad se realiza en el cultivo celular recolectado obtenido en la Etapa 1 anterior usando una columna de afinidad de Proteína A convencional de una manera bien

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