ES2662808T3 - Péptido obtenido de PSF1 - Google Patents
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Abstract
Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.
Description
- Número de aminoácido inicial
- Secuencia (9 meros) Puntuación de SYFPEITHI Número de aminoácido inicial Secuencia (10 meros) Puntuación de SYFPEITHI
- 159
- FEVDDGTSV 14 176 FLPRWKCEQL 21
<Ejemplo 3> Ensayo de inducción de CTL de ratón (ensayo ELISPOT)
Se determinó si los péptidos de PSF1 obtenidos por los Ejemplos anteriores inducían la CTL específica de péptido a 5 través del HLA-A02.
(Método)
Inmunización con péptidos y recogida de células respondedoras
10 La actividad de inducción de CTL de ratón con péptidos se determinó utilizando modelos inmunitarios de ratón. En cuanto a los ratones, CB6F1-Tg (HLA-A02 01/H2-Kb)A02 01 se adquirieron en Taconic Biosciences, Inc. Como máximo, se mezclaron cinco tipos de soluciones de péptidos disueltas en DMSO para producir una solución de PBS, y la solución de PBS se mezcló junto con la misma cantidad de MONTAN IDE ISA 51VG (SEPPIC), produciendo así
15 una solución de antígeno en emulsión. A continuación, se utilizaron 50 µl de solución de antígeno para inyección hipodérmica en cada uno de los dos sitios a ambos lados del vientre de los ratones (50 µg de péptido/ratón, N=3-4). Dos semanas después de la inyección, se extirpó el bazo y se recogieron esplenocitos de los cuales se habían eliminado los eritrocitos con una solución (BD Pharm Lyse™, Becton, Dickinson and Company) como células respondedoras para un ensayo ELISPOT.
20 Producción de células estimuladoras
Las células T2 (ATCC) de las células estimuladoras para su uso en el ensayo ELISPOT se produjeron por incubación, durante una noche, en un medio de cultivo AIM-V complementado con péptidos de ensayo inmunizados
25 (30 µg/ml) o con péptidos de control negativo (ELAGIGILTV).
Ensayo ELISPOT
El ensayo ELISPOT se llevó a cabo detectando IFN-γ producido a partir de células respondedoras. El procedimiento
30 del mismo se siguió según el documento adjunto incluido en el kit de ensayo ELISpotPLUS de IFN-γ de ratón (MABTECH). La preincubación para la producción de IFN-γ se llevó a cabo añadiendo células a una placa de 96 pocillos incluida en el kit de ensayo. Las células estimuladoras se inocularon en un pocillo doble o pocillo simple de 5×104 células/100 µl/pocillo, y después, se añadieron las células respondedoras a 2×106 células/100 µl/pocillo. Tras una noche de cocultivo, se extrajeron las células y se lavó el pocillo, y después se incluyeron los anticuerpos
35 primarios (anticuerpos anti IFN-γ de ratón biotinilados) en el kit de ensayo. Después de su reacción durante dos horas a temperatura ambiente, se lavó el pocillo, complementado con anticuerpos secundarios (estreptavidina-ALP) y se sometieron a reacción durante una hora a temperatura ambiente. Tras haber sido lavadas lo suficiente, las células se complementaron con una solución de sustrato y se dejaron durante un minuto a temperatura ambiente. Para terminar la reacción de coloración, la placa se lavó lo suficiente con agua corriente y se secó al aire.
40 Medición del número de puntos y método de medición
El número de puntos azules observado en el fondo del pocillo se midió con un analizador ImmunoSpot (R) S5 Verse Analyzer (Cellular Technology Limited). Los valores de medición de los puntos que no estaban claros debido a su
45 amplio abanico de coloración no se utilizaron. Se obtuvo un valor promedio del pocillo doble y se calculó la diferencia del control negativo para obtener el número de puntos específico de los péptidos. El valor promedio y el valor de DT se calcularon utilizando los valores de los ratones individuales, y el caso que presentaba un número positivo de diferencia entre el valor promedio y el valor de DT se determinó como positivo.
50 (Resultados)
Los puntos específicos de péptidos se observaron en los péptidos mostrados en la tabla 3, y se determinó que 10 de estos péptidos eran positivos. Dado que se indujeron CTL específicas por medio de péptidos obtenidos de PSF1, se confirmó que los péptidos se presentaron por HLA-A02 y se indujeron los péptidos obtenidos de PSF1 que reconocía
55 CTL de ratón. A pesar de que los resultados se obtuvieron de un sistema inmunitario de ratón, la reacción se produce a través de HLA-A02, que es CMH humano, por lo que de este modo se plantea que existe la posibilidad de una inducción similar de CTL en humanos.
[Tabla 3]
- Número de aminoácido inicial
- Secuencia Número de punto específico (Media±DT) Número de aminoácido inicial Secuencia Número de punto específico (Media±DT)
- 9 meros
- 10 meros
- 5
- KAMELIREL 22±13 38 ALYEQNQDSV 30±15
- 31
- QVLEEMKAL 7±7 68 SLLRNRRCTV 1±2
- 35
- EMKALYEQN 6±8 78 AYLYDRLLRI 23±21
- 69
- LIRNRRCTV 7±9 79 YLYDRLLRIR 165±17
- 79
- YLYDRLLRI 80±18 97 VLPNALRFHM 127±41
- 120
- SLATYMRSL 70±79 152 CLKDYGEFEV 53±28
- 145
- SLYIEVRCL 43±24 176 FLPRWKCEQL 31±24
- >10 meros
- 21
- LPAFNEDGLRQV 3±8
- 88
- RALRWEYGSVLPN 29±22
- 130
- GDEGLDITQDMKP 1±2
<Ejemplo 4> Ensayo de inducción de CTL humanas (ensayo ELISPOT)
5 Se determinó si los péptidos de PSF1 obtenidos en los ejemplos 1 y 2 inducían las CTL humanas específicas de péptido.
(Método)
10 Se llevó a cabo un ensayo de inducción de CTL humanas en condiciones relacionadas con un informe conocido (Harano et al., Int. J. Cancer: 123, 2616-2625, 2008).
Recogida de células mononucleares de sangre periférica
15 La sangre periférica heparinizada de voluntarios sanos que presentaban HLA-A0201 se sometió a centrifugación a 3000 rpm durante 20 minutos, eliminando así el plasma. Los sedimentos celulares se complementaron con HBSS (-) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a los que se había añadido HEPES 5 mM (SIGMA), y se suspendieron recubriendo la suspensión sobre Ficoll-paque PREMIUM (GE Healthcare, Ltd.). A continuación, Cuatrocientos g de la sustancia resultante se sometieron a centrifugación durante 40 minutos, y se extrajeron monocitos de sangre
20 periférica (PBMC, siglas del inglés, peripheral blood monocytes) separados como capa intermedia.
Preparación de células CD14-positivas y células CD8-positivas
Las PBMC se complementaron con microperlas de CD14 (Miltenyi Biotec K. K.), y se hizo que reaccionaran a 4 °C
25 durante 15 minutos. Las células se pasaron por columnas LS (Miltenyi Biotec K.K.), y las células CD14 positivas se obtuvieron utilizando un separador QuadroMACS (TM) (Miltenyi Biotec K.K.). El resto de las células se extrajeron y lavaron y después se complementaron con microperlas CD8 (Miltenyi Biotec K.K.) y se dejó que reaccionaran a 4 °C durante 15 minutos. Posteriormente, se llevó a cabo un proceso similar, obteniendo así células CD8-positivas. Las células CD14 positivas se sometieron a inducción por diferenciación de células dendríticas obtenidas de monocitos
30 (CD-Mo) y las células CD8-positivas se congelaron temporalmente para almacenarlas.
Inducción por diferenciación de CD-Mo y producción de células presentadoras de péptido
Dado que las células CD8-positivas se sometieron dos veces a estimulación antigénica, en consecuencia, se
35 produjeron dos veces células presentadoras de péptido. Las células CD14-positivas se diseminaron en dos placas RepCell (CellSeed Inc.) y se incubaron en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C con una solución de cultivo en la que se añadieron GM-CSF 100 ng/ml (R&D Systems) e IL-4 10 ng/ml (R&D Systems) a un medio de cultivo AIM-V (Invitrogen Corporation) que incluía antibiótico y suero. La primera producción de células presentadoras de péptido se inició 5-7 días después del comienzo de la
40 incubación. A una de las placas se añadió OK-432 0,1 KE/ml (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), y al día siguiente se recogieron las células y se inocularon en una placa de 96 pocillos con fondo en U. A continuación, se añadieron 20 µg/ml del péptido de ensayo de un tipo a cada mitad (48 pocillos) de la placa, y se incubaron durante un día a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %, produciendo así células presentadoras de péptido. La segunda producción se realizó de manera similar en la otra placa 12-14 días tras el inicio de la incubación.
45
Inducción de CTL mediante estimulación antigénica utilizando células presentadoras de péptido y preparación de células respondedoras
En una placa de 96 pocillos se irradiaron con rayos X (30 Gy) las células presentadoras de péptido, y las células
5 CD8-positivas congeladas almacenadas se añadieron a todos los pocillos, llevando a cabo así la primera estimulación antigénica. Como solución de cultivo, se utilizó una solución en la que se añadió IL-7 10 ng/ml (R&D Systems) a un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero. Tras su incubación durante siete días, las células incluidas en el sobrenadante se recogieron y cocultivaron con células presentadoras de péptido (tras la irradiación con rayos X), obtenidas por la segunda producción, llevando a cabo así la segunda estimulación
10 antigénica en la placa de 96 pocillos. En este momento, se añadieron 20 U/ml de IL-2 (Shionogi & Co., Ltd.) a la solución de cultivo. Tras su incubación adicional durante siete días, las células del sobrenadante que incluía CTL, se recogieron y se lavaron con un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero, para disponer de una concentración de aproximadamente 2x105 células/ml por pocillo, obteniendo así células respondedoras para un ensayo ELISPOT.
15 Producción de células estimuladoras
Para su uso en un ensayo ELISPOT, se produjeron células T2 de células estimuladoras, incubando las células durante una noche en un medio de cultivo AIM-V complementado con un péptido de ensayo (20 µg/ml). Como
20 células estimuladoras de control negativo, solo se utilizaron células T2 (sin péptidos). Las células se irradiaron con rayos X (30 Gy) y se lavaron con un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero para disponer de una concentración de 2×105 células/ml.
Ensayo ELISPOT
25 El ensayo ELISPOT se llevó a cabo detectando el IFN-γ producido a partir de las células respondedoras. El procedimiento del mismo se siguió según un documento adjunto de un kit de ensayo ELISpotPLUS de IFN-γ humano (MABTECH). Se añadieron células respondedoras en una cantidad de 100 µl/pocillo para cada 2 pocillos de una placa de 96 pocillos del kit de ensayo, y en cada pocillo se inocularon 100 µl/pocillo de células estimuladoras
30 complementadas con péptidos de ensayo o células estimuladoras (sin péptidos) de un control negativo. Tras su incubación durante una noche, los pocillos se lavaron y las células se extrajeron de los pocillos, y se añadieron los anticuerpos anti-IFN-γ de marcación de ALP incluidos en el kit de ensayo. Tras la reacción a temperatura ambiente durante dos horas, las células se lavaron lo suficiente, se complementaron con una solución de sustrato y se dejaron a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para terminar la reacción de coloración, la placa se lavó lo suficiente
35 con agua corriente y se secó al aire.
Medición del número de puntos y método de medición
El número de puntos azules observado en el fondo del pocillo se midió con un analizador ImmunoSpot (R) S5 Verse
40 Analyzer. En un pocillo que incluía las mismas células respondedoras, el número de puntos específicos de péptido se calculó restando el número de puntos generados por las células estimuladoras (sin péptidos) de un control negativo del número de puntos generados por las células estimuladoras con péptido añadido. Suponiendo que las células que mostraron una diferencia de 50 o más se definieron como positivas, los siguientes siete péptidos se determinaron como positivos en el análisis de una pluralidad de donantes.
45 (Resultados)
Se indujeron CTL humanas en las que fueron específicos los siete péptidos mostrados en la tabla 4. Dado que se indujeron CTL específicas por medio de péptidos obtenidos de PSF1, se descubrió que en los seres humanos hay
50 péptidos obtenidos de PSF1 que reconocen las CTL. Esto sugiere la posibilidad de que estos péptidos de PSF1 puedan ser una vacuna contra el cáncer.
Resultados del ensayo ELISPOT
55 [Tabla 4]
- Número de péptidos inicial
- Secuencia Número de donante positivo Número de donante Porcentaje positivo de donante
- 21
- LPAFNEDGLRQV 0 7 0 %
- 35
- EMKALYEQN 1 8 13 %
- 79
- YLYDRLLRI 6 13 46 %
- 145
- SLYIEVRCL 2 2 100 %
- 88
- RALRWEYGSVLPN 1 8 13 %
- 88
- RALRWEYGSV 3 5 60 %
- Número de péptidos inicial
- Secuencia Número de donante positivo Número de donante Porcentaje positivo de donante
- 89
- ALRWEYGSVL 2 2 100 %
- 89
- ALRWEYGSV 2 5 40 %
- 130
- GDEGLDITQDMKP 0 7 0 %
<Ejemplo 5> Ensayo de inducción de CTL humanas (ensayo de tetrámero)
Para confirmar la inducción de las CTL específicas del péptido de PSF1 con otro método, se llevó a cabo un ensayo 5 de tetrámero.
(Método)
Producción de la línea de CTL
10 Las células que se había determinado que eran positivas en el ensayo ELISPOT anteriormente descrito seguían incubadas con una solución de cultivo en la que se añadieron 100 ng/ml de IL-15 (Miltenyi Biotec K.K.) a un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero.
15 Ensayo de tetrámero
Se produjo el tetrámero (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd: MBL) para los péptidos de PSF1 (YLYDRLLR). Se recogieron células de una línea de CTL, se tiñeron con anticuerpos marcadores anti-CD8 APC H7 y tetrámero (SK-1) (Becton, Dickinson and Company: BD), y se midieron con un FACS Aria (Becton, Dickinson and Company:
20 BD). Se utilizaron dos tipos de líneas de CTL (0209-01 H2 y 0209-02 D2).
(Resultados)
Como se muestra en la Figura 1, dado que se observó una población celular que reaccionaba tanto con los
25 anticuerpos anti-CD8 como con el tetrámero en cada línea de CTL, se descubrió que se produjeron líneas de CTL que reconocían los péptidos de PSF1. La observación de células positivas a tetrámero demostró directamente la presencia de CTL humanas específicas de péptido.
<Ejemplo 6> Ensayo citotóxico de CTL humanas
30 Para analizar si una línea de CTL presenta actividad de células agresoras, se llevó a cabo un ensayo citotóxico.
Específicamente, las condiciones del ensayo se establecieron en relación con un método descrito en un informe conocido (un ensayo nuevo basado en CFSE para determinar la susceptibilidad a la lisis por medio de células T
35 citotóxicas de las células precursoras leucémicas dentro de una población de células diana heterogénea; Jedema I. et al., Blood (2004)103, 2677-2682).
Producción de células diana
40 En cuanto a las células diana para su uso en el ensayo citotóxico, se añadió 1 µM de CellTracker (TM) Green CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína) (Invitrogen Corp.) a las células T2, y se dejó que estas células reaccionaran entre sí a 37 °C durante 15 minutos. Las células T2 se marcaron con CMFDA, que es un marcador fluorescente, se lavaron con AIM-V, complementado con péptidos de ensayo (20 µg/ml), y se incubaron durante una noche. Como células diana de un control negativo, se utilizaron células T2 marcadas solo con un marcador
45 fluorescente (sin adición de péptidos). Las células se lavaron con un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero para disponer de una concentración de 5×104 células/ml.
Producción de células efectoras
50 En cuanto a las células efectoras para su uso en el ensayo citotóxico, se utilizaron tres tipos de líneas de CTL (02091 H2; YLYDRLLRI, 1004-1 P-13-1_2; RALRWEYGSVLPN, y 1004-1 P-10-9_1; ALRWEYGSVL) obtenidas por incubación después del ensayo ELISPOT anteriormente descrito. Las células se prepararon a concentraciones de 50, 15, 5×104 células/ml tras lavarlas con AIM-V. La preparación se realizó con un medio de cultivo AIM-V que incluía antibiótico y suero.
55 Ensayo citotóxico
Las células diana (T, target) complementadas con péptidos utilizados en la inducción de CTL, o las células diana (T) de un control negativo complementado sin péptidos, se mezclaron con las células efectoras (E) a una proporción
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