ES2663404T3 - Ácidos nucleicos de unión a SDF-1 - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico, que se une a SDF-1, que comprende, en la dirección 5'->3', un primer tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un segundo tramo de nucleótidos, o un segundo tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un primer tramo de nucleótidos, en la que la longitud de la molécula de ácido nucleico es de 20 a 50 nucleótidos, en la que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en moléculas de ácidos nucleicos de tipo A, moléculas de ácidos nucleicos de tipo B, moléculas de ácidos nucleicos de tipo C y moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143 y SEQ ID NO:144; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central: 5' AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO:19) en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' (SEQ ID NO:44) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ ID NO:45), en la que X1 está ausente o es R, X2 es S, X3 es S, y X4 está ausente o es Y; o X1 está ausente, X2 está ausente o es S, X3 está ausente o es S, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID NO:57), y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia 25 de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' (SEQ ID NO:77) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ ID NO:78), en la que X1 está ausente o es A, X2 es G, X3 es C, y X4 está ausente o es U, o X1 está ausente, X2 está ausente o es G, X3 está ausente o es C, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central: GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO:90), en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO:120) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID NO:121), o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' (SEQ ID NO:124) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BSSSXs 3' (SEQ ID NO:125), en la que XS está ausente o es S, o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3', o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3'.

Description

Ácidos nucleicos de unión a SDF-1
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico de unión a SDF-1, empleándose dicha molécula de ácido nucleico en un método para tratar una enfermedad, empleándose dicha molécula de ácido nucleico para inhibir la angiogénesis, la neovascularización, la inflamación y la metástasis, a un composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico, al uso de la molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento, al uso de la molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medio de diagnóstico, a un complejo que comprende la molécula de ácido nucleico, al uso de la molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medio de diagnóstico, a un complejo que comprende la molécula de ácido nucleico, al uso de la molécula de ácido nucleico para la detección de SDF-1, y a un kit que comprende la molécula de ácido nucleico.
Las quimioquinas son una familia de proteínas pequeñas básicas de unión a la heparina relacionadas desde el punto de vista estructural de 8-14 kDa. Desde el punto de vista funcional pueden clasificarse como proinflamatorias, homeostáticas o de función dual (Moser, Wolf et al., 2004). Las quimioquinas inflamatorias son inducidas por patógenos, citoquinas o factores del crecimiento y reclutan leucocitos efectores hacia los sitios de infección, inflamación, lesión tisular y tumores. Estas quimioquinas regulan el reclutamiento, la activación y la proliferación de leucocitos (Schall y Bacon, 1994; Springer, 1995; Baggiolini, 1998). Las quimioquinas inducen selectivamente la quimiotaxis de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, células cebadas y células T y B. Además de su efecto quimiotáctico, pueden ejercer selectivamente otros efectos en células receptivas, tales como cambios en la forma de la célula, aumento transitorio en la concentración de iones calcio intracelulares libres, desgranulación, sobrerregulación de integrinas, formación de lípidos bioactivos (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos), o estallido respiratorio (liberación de especies de oxígeno reactivas para la destrucción de organismos patógenos o células tumorales). Así, provocando la liberación de otros mediadores proinflamatorios, de la quimiotaxis y de la extravasación de leucocitos hacia sitios de infección o inflamación, las quimioquinas activan la escalada de la respuesta inflamatoria. Por otra parte, las quimioquinas homeostáticas, se expresan predominantemente en la médula ósea y en tejidos linfoides y están implicadas en la hematopoyesis, la vigilancia inmunológica y las respuestas inmunológicas adaptativas (Godessart, 2005).
Basándose en la disposición de los dos primeros restos de cuatro restos cisteína conservados, las quimioquinas se dividen en cuatro clases: CC o β-quimioquinas (por ejemplo), en las que las cisteínas están en tándem, CXC o αquimioquinas, en las que están separadas por otro resto aminoácido, XC o γ-quimioquinas (linfotactina/XCL1 es el único representante hasta la fecha) que poseen solo un puente disulfuro, y CX3C-quimioquinas que incluyen tres restos aminoácidos entre las cisteínas (la fractalquina unida a membrana es el único miembro de esta clase (Bazan, Bacon et al., 1997)).
Las quimioquinas CXC actúan principalmente sobre neutrófilos, en particular las quimioquinas CXC que portan la secuencia de aminoácidos ELR en su amino terminal. Los ejemplos de quimioquinas CXC que son activas sobre neutrófilos son IL-8/CXCL8, GROα/CXCL1, GROβ/CXCL2, y GROγ/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA-78/CXCL5, SDF1/CXCL12 y GCP-2/CXCL6. Las quimioquinas CC actúan sobre una diversidad mayor de leucocitos, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, así como linfocitos T y B (Oppenheim, Zachariae et al., 1991; Miller y Krangel, 1992; Baggiolini, Dewald et al., 1994; Jose, Griffiths-Johnson et al., 1994; Ponath, Qin et al., 1996). Los ejemplos de estas son I-309/CCL1; MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-1α/CCL3 y MIP1β/CCL4, RANTES/CCL5, y eotaxina/CCL11.
Las quimioquinas actúan a través de receptores que pertenecen a una superfamilia de receptores acoplados a proteína G siete-transmembrana (GPCR; (Murphy, Baggiolini et al., 2000)). En términos generales, las interacciones entre quimioquinas y receptores de quimioquinas tienden a ser promiscuas ya que una quimioquina puede unirse a muchos receptores de quimioquinas y a la inversa, un único receptor de quimioquina puede interaccionar con varias quimioquinas. Algunos receptores conocidos para las quimioquinas CXC incluyen CXCR1, que se une a GROα, GCP-2, e IL-8; CXCR2, que se une a quimioquinas que incluyen GROα, GROβ, GROγ, ENA-78, e IL-8; CXCR3, que se une a quimioquinas que incluyen PF4, MIG, IP-10, and I-TAC; CXCR4 que, hasta la fecha, solo se ha descubierto que señalice en respuesta a SDF-1; y CXCR5, que se ha demostrado que señaliza en respuesta a BCA1 (Godessart, 2005).
La SDF-1 (factor 1 derivado de células estromáticas; sinónimos, CXCL12; PBSF [factor estimulante del crecimiento de células pre-B]; TPAR-1 [gen 1 reprimido por TPA]; SCYB12; TLSF [factor estimulante de células de linfoma tímico]; hIRH [intercrina humana reducida en hepatomas]) es una quimioquina CXC angiogénica que no contiene el motivo ELR típico de las quimioquinas similares a IL-8 (Salcedo, Wasserman et al., 1999; Salcedo y Oppenheim 2003) que se une y activa el receptor acoplado a proteína G CXCR4. Esta quimioquina ha sido descubierta por tres grupo independientemente, mediante la clonación de ADN que portan las secuencias señal N-terminales (Tashiro, Tada et al., 1993), por su capacidad para estimular progenitores tempranos de células B cuando se expresa en la línea celular estromática PA6 (Nagasawa, Kikutani et al., 1994), o mediante aislamiento a partir de un banco de ADNc construido a partir de fibroblastos de embrión de ratón tratados con el activador de proteína quinasa C acetato de tetradodecanoilforbol (TPA) (Jiang, Zhou et al., 1994). Como resultado de un corte y empalme alternativo, existen 2 5
dos formas de SDF-1, SDF-1α (68 AA) y SDF-1β, que porta cuatro restos adicionales en el C-terminal (Shirozu, Nakano et al., 1995). Aún no se comprende la importancia biológica de estos dos variantes de corte y empalme.
La conservación de la secuencia entre SDF-1 de diferentes especies es notable: la SDF-1α humana (SEQ ID NO:1) y la SDF-1α murina (SEQ ID NO:2) son casi idénticas. Solo aparece un único cambio conservativo de V a I en la posición 18 (Shirozu, Nakano et al., 1995). Otra característica poco habitual que distingue a SDF-1 de la mayoría de las demás quimioquinas es su selectividad. De hecho, SDF-1 y el receptor CXCR4 parecen comprende un par receptor-ligando monógamo.
Existe un modelo estructural de RMN (registro PDB, 1SDF) para SDF-1 [8-68]. Se ha descubierto que la SDF-1 es un monómero con una región N-terminal desordenada. Las diferencias con otras quimioquinas se encuentran principalmente en el empaquetamiento del núcleo hidrófobo y la distribución de la carga superficial (Crump, Gong et al., 1997).
Actividades fisiológicas de SDF-1: Puesto que el receptor CXCR4 de SDF-1 se expresa de modo generalizado sobre leucocitos, células dendríticas maduras, células endoteliales, células cerebrales y megacariocitos, las actividades de SDF-1 son pleiotrópicas. Esta quimioquina, más que cualquier otra identificada hasta la fecha, muestra la gama más amplia de funciones biológicas, en especial fuera del sistema inmunológico. Los efectos funcionales más significativos de SDF-1 son:
Conducir y unir células epiteliales a sitios neovasculares en la porción coroide de la retina. Se ha demostrado que la SDF-1 está implicada en la conducción de células epiteliales al coroide durante la neovascularización en el tejido ocular. El papel exacto de estas células aún sigue investigándose, pero la hipótesis publicada es que las células epiteliales están implicadas en la formación de vasos sanguíneos aberrantes (Sengupta, Caballero et al., 2005).
Hematopoyesis. La SDF-1 es necesaria para mantener células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) en la médula ósea del adulto. Puede emplearse AMD3100, un antagonista de CXCR4 selectivo, para movilizar las células CD34+ para el transplante de células pluripotenciales hematopoyéticas. Las células CD34+ migran in vitro e in vivo hacia un gradiente de SDF-1 producido por las células estromáticas (Aiuti, Webb et al., 1997).
Desarrollo y quimiotaxis de células B. La SDF-1 apoya la proliferación de células pre-B y aumenta el crecimiento de progenitores de células B de la médula ósea (Nagasawa, Kikutani et al., 1994); induce la migración específica de células pre-y pro-B, aunque no actúa como quimioatrayente significativo para células B maduras (D’Apuzzo, Rolink et al., 1997; Bleul, Schultze et al., 1998). Probablemente, la SDF-1 es importante para colocar las células B dentro del tejido linfoide secundario.
Quimiotaxis de células T. La SDF-1 es uno de quimioatrayentes de células T más eficaces; CXCR4 está presente en muchos subconjuntos de células T (Bleul, Farzan et al., 1996).
Desarrollo embrionario. La SDF-1 y su receptor CXCR4 son fundamentales para el desarrollo embrionario. Ratones con SDF-1 y CXCR4 inactivados mueren perinatalmente; muestran defectos en el septo ventricular cardíaco o un desarrollo cerebelar anómalo además de un número reducido de progenitores de células B y mieloides (Nagasawa, Hirota et al,. 1996; Ma, Jones et al., 1998; Zou, Kottmann et al., 1998). La SDF-1 también es necesaria para la ontogenia normal del desarrollo de la sangre durante la embriogénesis (Juárez y Bendall, 2004).
Infección por VIH. La SDF-1 es capaz de inhibir la entrada de VIH-1 T-trópica en líneas celulares que portan CXCR4, y la expresión de SDF-1 puede tener una relación importante en la patogénesis de SIDA, puesto que un polimorfismo en el gen SDF-1 humano afecta a la aparición de SIDA (Bleul, Farzan et al., 1996).
Unos niveles de expresión alterados de SDF-1 o su receptor CXCR4 o unas respuestas alteradas hacia estas moléculas están asociados con muchas enfermedades humanas, tales como retinopatía (Brooks, Caballero et al., 2004; Butler, Guthrie et al., 2005; Meleth, Agron et al., 2005); cáncer de mama (Muller, Homey et al., 2001; Cabioglu, Sahin et al., 2005), ovario (Scotton, Wilson et al., 2002), páncreas (Koshiba, Hosotani et al., 2000), tiroides (Hwang, Chung et al., 2003), nasofaringe (Wang, Wu et al., 2005); glioma (Zhou, Larsen et al., 2002); neuroblastoma (Geminder, Sagi-Assif et al., 2001); leucemia linfocítica crónica de células B (Burger, Tsukada et al., 2000); síndrome WHIM (verrugas, hipogammaglobulinemia, infecciones, mielokatexis) (Gulino, Moratto et al., 2004; Balabanian, Lagane et al., 2005; Kawai, Choi et al., 2005); síndromes de deficiencia inmunológica (Arya, Ginsberg et al., 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al., 1999; Soriano, Martínez et al., 2002); neovascularización patológica (Salvucci, Yao et al., 2002; Yamaguchi, Kusano et al., 2003; Grunewald, Avraham et al., 2006); inflamación (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al., 2001; Wang, Guan et al., 2001); esclerosis múltiple (Krumbholz, Theil et al., 2006); artritis reumatoide/osteoartritis (Buckley, Amft et al., 2000; Kanbe, Takagishi et al., 2002; Grassi, Cristino et al., 2004).
En entornos experimentales en animales, los antagonistas de SDF-1 o su receptor han demostrado ser eficaces para bloquear el crecimiento y/o la propagación metastásica de células de cánceres humanos de diferente origen, tal como páncreas (Guleng, Tateishi et al., 2005; Saur, Seidler et al., 2005), colon (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 3 5
2003; Guleng, Tateishi et al., 2005), mama (Muller, Homey et al., 2001; Lapteva, Yang et al., 2005), pulmón (Phillips, Burdick et al., 2003), glioblastoma/meduloblastoma (Rubin, Kung et al., 2003), próstata (Sun, Schneider et al., 2005), osteosarcoma (Perissinotto, Cavalloni et al., 2005), melanoma (Takenaga, Tamamura et al., 2004), estómago (Yasumoto, Koizumi et al., 2006), mieloma múltiple (Menu, Asosingh et al., 2006).
Además, la terapia con anti-SDF-1 ha resultado beneficiosa en modelos animales para evitar la neovascularización retiniana (Butler, Guthrie et al., 2005), la nefritis (Balabanian, Couderc et al., 2003) y la artritis (Matthys, Hatse et al., 2001; Tamamura, Fujisawa et al., 2004; De Klerck, Geboes et al., 2005).
La SDF-1 desempeña un papel en la patología de enfermedades de la parte posterior del ojo, tales como la retinopatía diabética (DR) (Fong, Aiello et al., 2004) y la degeneración macular relacionada con el envejecimiento (AMD) (Ambati, Anand et al., 2003). Estas dos enfermedades dañan al ojo y conducen a la pérdida gradual de visión que culmina en ceguera. Los daños aparecen debido al crecimiento inapropiado de vasos sanguíneos en la parte posterior del ojo, un proceso denominado neovascularización coroidal (CNV).
Durante la CNV, nuevos vasos sanguíneos que se originan del coroide migran a través de una rotura en la membrana de Bruch hacia el epitelio pigmentario subretiniano (sub-RPE) o espacio subretiniano. Los vasos anómalos pueden sangrar (hemorragia) o soltar fluidos bajo la retina. Esto puede dejar cicatrices y elevar la mácula, lo cual distorsiona la visión.
Se cree que la SDF-1 desempeña un papel en la CNV por medio del reclutamiento de células precursoras endoteliales (EPC) al ojo. Estas células precursoras entonces se convierten en componentes estructurales fundamentales en los vasos sanguíneos aberrantes.
La retinopatía diabética es una secuela importante de la diabetes, y aparece con frecuencia en pacientes con ambos tipos de diabetes de tipo 1 y tipo 2. Existen aproximadamente 16 millones de diabéticos en EE. UU. y casi 8 millones padecen alguna forma de retinopatía diabética. Cuando la retinopatía diabética proliferativa (PDR) permanece sin tratar, aproximadamente 60% de los pacientes adquieren ceguera en uno o ambos ojos dentro de 5 años. Con el alarmante aumento en la frecuencia de la diabetes en Norteamérica, Europa y muchos países emergentes, la población de pacientes está creciendo con rapidez. Por ejemplo, la incidencia de la ceguera es 25 veces más alta en pacientes con diabetes que en la población general. Además, la retinopatía diabética (DR) es la causa más común de ceguera en sujetos de mediana edad, y es responsable de al menos 12% de todos los casos nuevos en EE. UU. cada año. Se han puesto en marcha programas de exploración para que la visión de los pacientes diabéticos pueda controlarse y pueda administrarse un tratamiento, si está disponible, a tiempo.
Las causas directas de la retinopatía diabética no son bien entendidas, pero se cree que la enfermedad tiene sus orígenes en una combinación de fuentes: una autorregulación alterada del flujo sanguíneo retiniano; la acumulación de sorbitol dentro de las células retinianas; y la acumulación de productos finales de la glicosilación avanzada en el fluido extracelular. Todos estos factores están relacionados directa o indirectamente con la hiperglucemia, la abundancia de azúcar en la corriente sanguínea.
Los síntomas de la DR son similares a los de la AMD. Los pacientes pierden células de la retina y aparecen microaneurismas (flujos de sangre) en la membrana basal de la retina. Además, VEGF, IGF-1 y otros factores transportados por la sangre, que pueden incluir la SDF-1, atraen a nuevas células vasculares y estimulan la formación de vasos sanguíneos que provocan daños.
La degeneración macular relacionada con el envejecimiento (AMD) destruye la visión central de una persona. Las etapas tempranas de la enfermedad incluso pueden pasar desapercibidas, porque los síntomas varían entre los pacientes. A veces, un paciente se ve afectado solo en un ojo, o la visión puede deteriorarse en ambos ojos, aunque no significativamente. La enfermedad provoca distorsiones en la visión o una percepción defectuosa del color. A menudo aparece una mancha oscura en el centro del campo visual.
La etiología (desarrollo) de la enfermedad no se conoce bien. A menudo se piensa en la AMD como el envejecimiento de la capa más externa de la retina. Aparecen alteraciones físicas en el centro de la retina, también denominada mácula, que es la parte de la retina relacionada con la visión más aguda.
La AMD húmeda comienza como una secuela de la forma seca de la enfermedad. Aproximadamente 90% de los pacientes padecen la forma seca de la AMD, que provoca el adelgazamiento de los tejidos maculares y alteraciones en su pigmentación. El resto presentan la forma húmeda, que implica el sangrado descrito anteriormente.
La forma húmeda de la AMD representa un mercado ideal para nuevos productos terapéuticos: siendo ya la causa más común de ceguera en personas mayores de 55, la AMD afecta aproximadamente del 4% al 5% de la población de EE. UU. con una edad de 65-74 años y casi al 10% de personas con 75 años o mayores. Existen alrededor de 5 millones de personas solo en EE. UU. mayores de 80 años que padecen esta enfermedad y se prevé que otros 5 millones de personas la padecerán para 2020.
Los tumores no son solo masas de células cancerosas: la infiltración de los tumores por células inmunológicas es una característica del cáncer. Muchos cánceres humanos presentan una red compleja de quimioquinas que influye en el grado y fenotipo de este infiltrado, así como en el crecimiento, supervivencia y migración del tumor y en la angiogénesis. La mayoría de los tumores sólidos contienen muchas células estromáticas no malignas. En efecto, las células estromáticas a veces están en un número mayor que las células cancerígenas. Las células estromáticas predominantes que se encuentran en los cánceres son macrófagos, linfocitos, células endoteliales y fibroblastos.
Las células malignas de diferentes tipos de cánceres presentan diferentes perfiles de expresión de receptores de quimioquinas, pero el receptor CXCR4 de SDF-1 es el que se encuentra más habitualmente en ratón y ser humano: las células tumorales de al menos 23 tipos diferentes de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimático y hematopoyético expresan CXCR4 (Balkwill, 2004). La SDF-1 es el único ligando conocido para CXCR4. Aparte del tejido de médula ósea y linfoide secundario, en donde se expresa constitutivamente, la SDF-1 se encuentra en sitios de tumores primarios en el linfoma (Corcione, Ottonello et al., 2000) y tumores cerebrales de linaje neuronal y astrocítico. Además, está presente a niveles elevados en el cáncer de ovario (Scotton, Wilson et al., 2002) y pancreático (Koshiba, Hosotani et al., 2000), así como en sitios de metástasis en cáncer de mama (Muller, Homey et al., 2001) y de tiroides (Hwang, Chung et al., 2003), neuroblastoma y malignidades hematológicas (Geminder, Sagi-Assif et al., 2001). Por contraste, la expresión de CXCR4 es baja o está ausente en el epitelio normal de mama (Muller, Homey et al., 2001), ovario (Scotton, Wilson et al., 2002) y próstata (Sun, Schneider et al., 2005). Por tanto, la expresión de CXCR4 parece ser una característica general de las células epiteliales malignas y no de sus homólogos normales.
La inhibición de la señalización de quimioquina-receptor en células tumorales tiene el potencial de inducir la detención del crecimiento o la apoptosis, y evitar la invasión y la metástasis in vivo:
La inactivación de CXCR4 por ARNsi abroga el crecimiento del tumor de mama (Lapteva, Yang et al., 2005); células de hibridoma-T que fueron transfectadas con una construcción que evita la expresión en la superficie de CXCR4 ya no pueden metastatizar a órganos distantes cuando se inyectan por vía intravenosa a ratones (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2001); en experimentos similares con células de cáncer colorrectal, las metástasis de pulmón e hígado se redujeron mucho (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2003); anticuerpos anti-CXCR4 inhiben la propagación de xenoimplantes de cáncer de mama hacia los nódulos linfáticos (Muller, Homey et al., 2001); el tratamiento de células linfoblastoides con anticuerpos anti-CXCR4 o anti-SDF-1 retrasa el crecimiento tumoral en ratones (NOD)/SCID (Bertolini, Dell’Agnola et al., 2002); anticuerpos anti-SDF-1 inhiben el desarrollo de metástasis de órganos de células de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (Phillips, Burdick et al., 2003); la administración sistémica del antagonista de CXCR4 AMD3100 (AnorMED) inhibe el crecimiento de xenoinjertos de glioblastoma y meduloblastoma intracraneales y aumenta la apoptosis de células tumorales dentro de 24 horas (Rubin, Kung et al., 2003); anticuerpos anti-SDF-1 inhiben el crecimiento de células de cáncer de mama MCF-7 mezcladas con fibroblastos asociados a carcinoma (Orimo, Gupta et al., 2005); la neutralización de CXCR4 con anticuerpos bloquea la metástasis del cáncer de próstata y el crecimiento en sitios óseos (Sun, Schneider et al., 2005); el desarrollo de metástasis del pulmón después de la inyección de células de osteosarcoma se evita mediante la administración del antagonista de CXCR4 peptídico T134 (Perissinotto, Cavalloni et al., 2005).
Diferentes autores han llegado a la conclusión de que apuntar al eje SDF-1/CXCR4 puede proporcionar nuevas opciones terapéuticas para pacientes con cáncer:
Los tumores de ovario humanos expresan SDF-1 y, a menor nivel, VEGF. Ambas proteínas son activadas por la hipoxia en el tumor. Unas concentraciones patológicas de cualquiera de estas proteínas por sí solas no son suficientes para inducir la angiogénesis in vivo, pero juntas, SDF-1 y VEGF en concentraciones patológicas inducen la neovascularización de modo eficaz y sinérgico. Por tanto, la interrupción de este eje sinérgico, en lugar de solo la VEGF, puede ser una estrategia antiangiogénesis nueva y eficaz para tratar el cáncer (Kryczek, Lange et al., 2005);
Las líneas de células de cáncer de mama, cuando están equipadas con la vía de señalización de SDF1/CXCR4 autocrina, muestran un comportamiento agresivo. Este incluye un aumento de la invasividad y la migración, junto con un crecimiento más rápido. Por tanto, el eje SDF-1/CXCR4 puede proporcionar información importante para predecir la naturaleza agresiva y puede constituir una diana terapéutica importante en el cáncer de mama humano (Kang, Watkins et al., 2005);
La migración y la metástasis de células de cáncer de pulmón microcítico (SCLC), que expresan niveles elevados de CXCR4, están reguladas por SDF-1. La activación de CXCR4 estimula la adhesión a células auxiliares (tales como células estromáticas) y moléculas de la matriz extracelular dentro del microentorno tumoral. Estas interacciones adhesivas producen una mayor resistencia de las células SCLC a la quimioterapia. Así, los inhibidores del eje SDF-1/CXCR4 pueden aumentar la quimiosensibilidad de las células SCLC y conducir a nuevos caminos terapéuticos para pacientes con SCLC (Hartmann, Burger et al., 2004);
El eje SDF-1/CXCR4 emerge como un regulador crucial del tráfico de diversos tipos de células pluripotenciales en el cuerpo. Puesto que la mayoría, sino todas, las malignidades se originan en el compartimento de células pluripotenciales/progenitoras, las células pluripotenciales del cáncer también expresan CXCR4 sobre su superficie y, como resultado de esto, el eje SDF-1/CXCR4 está implicado en dirigir el tráfico/metástasis a órganos que expresan SDF-1 (por ejemplo, nódulos linfáticos, pulmones, hígado, huesos). En consecuencia, las estrategias dirigidas a modular el eje SDF-1/CXCR4 pueden tener importantes aplicaciones clínicas en la medicina regenerativa para transportar células pluripotenciales normales a los tejidos, y en la oncología clínica para inhibir la metástasis de células pluripotenciales del cáncer (Kucia, Reca et al., 2005).
La solicitud de patente internacional WO 02/101350 se refiere a un ensayo de migración celular modificado que permite la identificación de antagonistas de receptores de quimioquinas a partir de bloqueantes no específicos.
El problema que subyace a la presente invención consiste en proporcionar un antagonista específico de SDF-1. Otro aspecto del problema que subyace a la presente invención consiste en proporcionar un compuesto para el tratamiento de enfermedades y trastornos que implican a la SDF-1 y al receptor CXCR4, respectivamente.
Otro problema que subyace a la presente invención consiste en proporcionar métodos para la detección específica de SDF-1.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve mediante los aspectos de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas pueden extraerse de las reivindicaciones dependientes.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante una molécula de ácido nucleico, que se une a SDF-1, que comprende, en la dirección 5’->3’, un primer tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un segundo tramo de nucleótidos, o un segundo tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un primer tramo de nucleótidos, en la que la longitud de la molécula de ácido nucleico es de 20 a 50 nucleótidos, en la que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en moléculas de ácidos nucleicos de tipo A, moléculas de ácidos nucleicos de tipo B, moléculas de ácidos nucleicos de tipo C y moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143 y SEQ ID NO:144; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
5’ AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:19)
en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2NNBV 3’ (SEQ ID NO:44) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BNBNX3X4 3’ (SEQ ID NO:45), en la que X1 está ausente o es R, X2 es S, X3 es S, y X4 está ausente o es Y, o X1 está ausente, X2 está ausente o es S, X3 está ausente o es S, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
5’ GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (SEQ ID NO:57), y
en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2SVNS 3’ (SEQ ID NO:77) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BVBSX3X4 3’ (SEQ ID NO:78), en la que X1 está ausente o es A, X2 es G, X3 es C, y X4 está ausente o es U, o X1 está ausente, X2 está ausente o es G, X3 está ausente o es C, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO:90),
en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RKSBUSNVGR 3’ (SEQ ID NO:120) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YYNRCASSMY 3’ (SEQ ID NO:121), o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ XSSSSV 3’ (SEQ ID NO:124) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BSSSXS 3’ (SEQ ID NO:125), en la que XS está ausente o es S, o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UGAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUCA 3’, o
en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUC 3’.
5 En una realización del primer aspecto, las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprenden una secuencia de nucleótidos central seleccionada del grupo que comprende:
5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:20), 5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:21), y 10 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:22), preferiblemente la secuencia de nucleótidos central comprende 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:22).
En una realización del primer aspecto, dicho primer y dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual tras la hibridación se forma una estructura 15 bicatenaria.
En una realización del primer aspecto, la estructura bicatenaria consiste en cuatro a seis pares de bases, preferiblemente cinco pares de bases.
20 En una realización del primer aspecto, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X2BBBS 3’ (SEQ ID NO:42) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ SBBVX3 3’ (SEQ ID NO:43), en la que X2 está ausente o es S, y X3 está ausente o es S; preferiblemente, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una
25 secuencia de nucleótidos de 5’ CUGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CGCAG 3’;
o el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CGCGC 3’.
30 En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de tipo A tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:5 a 18, 25 a 41, 133, 137 y 139 a 141.
En una realización del primer aspecto, las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprenden una secuencia de 35 nucleótidos central de GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ ID NO:58).
En una realización del primer aspecto, dicho primer y dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual tras la hibridación se forma una estructura bicatenaria.
40 En una realización del primer aspecto, la estructura bicatenaria consiste en cuatro a seis pares de bases, preferiblemente cinco pares de bases.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B
45 comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X2SSBS 3’ (SEQ ID NO:73) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BVSSX3 3’ (SEQ ID NO:74), en la que X2 está ausente o es G, y X3 está ausente o es C, preferiblemente el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos
50 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UACGC 3’.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de tipo B tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:46 a 56, 61 a 72 y 132.
55 En una realización del primer aspecto, las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprenden una secuencia de nucleótidos central seleccionada del grupo que comprende:
5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:91), 5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:92), y 60 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:93), preferiblemente la secuencia de nucleótidos central comprende 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:93).
En una realización del primer aspecto, al menos una parte de dicho primer tramo y al menos una parte de dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C opcionalmente se hibridan entre sí, 65 por lo cual tras la hibridación se forma una estructura bicatenaria.
En una realización del primer aspecto, la estructura bicatenaria comprende de 4 a 10 pares de bases, preferiblemente de 4 a 6 pares de bases, más preferiblemente 5 pares de bases.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RKSBUGSVGR 3’ (SEQ ID NO:122) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YCNRCASSMY 3’ (SEQ ID NO:123).
En una realización del primer aspecto, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ SSSSR 3’ (SEQ ID NO:130) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YSBSS 3’ (SEQ ID NO:131).
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de tipo C tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:79 a 89, 94 a 119 y 134 a 136.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de tipo C tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:142 a 144.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es un antagonista de SDF-1.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es un antagonista del sistema de receptores de SDF-1, en la que preferiblemente el receptor de SDF-1 del sistema de receptores de SDF-1 es el receptor CXCR4.
En una realización del primer aspecto, la SDF-1 es la SDF-1 humana, en la que preferiblemente la SDF-1 comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:1.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, y preferiblemente la modificación se selecciona del grupo que comprende un resto HES y un resto PEG.
En una realización del primer aspecto, los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico son L-nucleótidos y preferiblemente los nucleótidos de las secuencias según cualquiera de SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92 y 93.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante la molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, para su uso en un método para tratar una enfermedad.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, y opcionalmente otro constituyente, en la que el otro constituyente se selecciona del grupo que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante el uso de una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, para la fabricación de un medicamento.
En una realización del segundo aspecto, la enfermedad es mediada por la SDF-1, y preferiblemente dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que comprende las enfermedades del fondo del ojo, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con el envejecimiento; cáncer de mama, ovarios, próstata, páncreas, tiroides, nasofaringe, colon, pulmón y estómago; osteosarcoma; melanoma; glioma; medulo-y neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiencia inmunológica; neovascularización patológica; inflamación; esclerosis múltiple; artritis reumatoide/osteoartritis y nefritis.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un quinto aspecto mediante la molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, en la que la molécula de ácido nucleico se usa para inhibir la angiogénesis, la neovascularización, la inflamación y la metástasis.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un sexto aspecto mediante el uso de una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, para la fabricación de un medio de diagnóstico.
En una realización del sexto aspecto, el medio de diagnóstico es para el diagnóstico de una enfermedad, en la que la enfermedad es mediada por la SDF-1, y preferiblemente dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende las enfermedades del fondo del ojo, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con el envejecimiento; cáncer de mama, ovarios, próstata, páncreas, tiroides, nasofaringe, colon, pulmón y 8 5
estómago; osteosarcoma; melanoma; glioma; medulo-y neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiencia inmunológica; neovascularización patológica; inflamación; esclerosis múltiple; artritis reumatoide/osteoartritis y nefritis.
En una realización del sexto aspecto, el medio de diagnóstico es para diagnosticar la angiogénesis, la neovascularización, la inflamación y/o la metástasis.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto mediante un complejo que comprende SDF-1 y una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, en el que preferiblemente el complejo es un complejo cristalino.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un octavo aspecto mediante el uso de una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones, para la detección de SDF-1.
El problema que subyace a la presente invención se resuelve en un octavo aspecto mediante un kit para la detección de SDF-1, que comprende una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, que incluye cualquiera de sus realizaciones.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2NNBV 3’ (SEQ ID NO:44) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BNBNX3X4 3’ (SEQ ID NO:45), en la que X1 está ausente o es R, X2 es S, X3 es S, y X4 está ausente o es Y; o X1 está ausente, X2 está ausente o es S, X3 está ausente o es S, y X4 está ausente.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RSHRYR 3’ (SEQ ID NO:23) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YRYDSY 3’(SEQ ID NO:24), preferiblemente el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCUGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CGCAGC 3’.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2SVNS 3’ (SEQ ID NO:77) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BVBSX3X4 3’ (SEQ ID NO:78), en la que X1 está ausente o es A, X2 es G, X3 es C, y X4 está ausente o es U, o X1 está ausente, X2 está ausente o es G, X3 está ausente o es C, y X4 está ausente.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1GCRWG 3’ (SEQ ID NO:59) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ KRYSCX4 3’(SEQ ID NO:60), en la que X1 está ausente o es A, y X4 está ausente o es U.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1GCGUG 3’ (SEQ ID NO:75) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UACGCX4 3’ (SEQ ID NO:76), en la que X1 está ausente o es A, y X4 está ausente o es U, preferiblemente, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ AGCGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UACGCU 3’.
En una realización, la longitud del primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C y la longitud del segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C es individual e independientemente de 0 a 17 nucleótidos, preferiblemente de 4 a 10 nucleótidos, y más preferiblemente de 4 a 6 nucleótidos.
En una realización, la estructura bicatenaria de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende de 4 a 10 pares de bases, preferiblemente de 4 a 6 pares de bases, y más preferiblemente 5 pares de bases.
En una realización preferida, la estructura bicatenaria de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende de 4 a 10 pares de bases consecutivas, preferiblemente de 4 a 6 pares de bases consecutivas, y más preferiblemente 5 pares de bases consecutivas.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RKSBUSNVGR 3’ (SEQ ID NO:120) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YYNRCASSMY 3’ (SEQ ID 9
NO:121).
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ XSSSSV 3’ (SEQ ID NO:124) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de 5 ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BSSSXS 3’ (SEQ ID NO:125), en la que XS está ausente o es S.
Preferiblemente, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ SGGSR 3’ (SEQ ID NO:126) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de 10 ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YSCCS 3’ (SEQ ID NO:127).
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCSGG 3’ (SEQ ID NO:128) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CCKGC 3’ (SEQ ID NO:129),
15 preferiblemente el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCCGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CCGGC 3’.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una 20 secuencia de nucleótidos de 5’ CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUCACG 3’.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UGAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos 25 nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUCA 3’.
En una realización, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUC 3’.
30 En una realización del primer aspecto, la SDF-1 es la SDF-1 humana y/o el receptor de SDF-1 es un receptor de SDF-1 humano.
En una realización del primer aspecto, la SDF-1 comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:1.
35 En una realización preferida del primer aspecto, la modificación es un resto PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, en el que el peso molecular del resto PEG es preferiblemente de aproximadamente 2 a 180 kD, más preferiblemente de aproximadamente 60 a 140 kD, y lo más preferiblemente de aproximadamente 40 kD.
40 En una realización del primer aspecto, la modificación es un resto HES, en el que preferiblemente el peso molecular del resto HES es de aproximadamente 10 a 130 kD, más preferiblemente de aproximadamente 30 a 130 kD, y lo más preferiblemente de aproximadamente 100 kD.
En una realización del cuarto aspecto, el medicamento es para inhibir la angiogénesis, la neovascularización, la 45 inflamación y la metástasis.
También se describe un método para seleccionar un antagonista de SDF-1 o un agonista de SDF-1, que comprende las siguientes etapas:
50 -proporcionar un candidato a antagonista de SDF-1 y/o un candidato a agonista de SDF-1, -proporcionar un ácido nucleico según el primer aspecto, -proporcionar un sistema de ensayo que proporciona una señal en presencia de un antagonista de SDF-1 y/o un agonista de SDF-1, y -determinar si el candidato a antagonista de SDF-1 es un antagonista de SDF-1 y/o si el candidato a agonista
55 de SDF-1 es un agonista de SDF-1.
También se describe un método para seleccionar un agonista de SDF-1 y/o un antagonista de SDF-1, que comprende las siguientes etapas:
60 -proporcionar la SDF-1 inmovilizada sobre una fase, preferiblemente una fase sólida, -proporcionar un ácido nucleico según el primer aspecto, preferiblemente un ácido nucleico según el primer aspecto que está marcado, -añadir un candidato a agonista de SDF-1 y/o un candidato a antagonista de SDF-1, y -determinar si el candidato a agonista de SDF-1 es un agonista de SDF-1 y/o si el candidato a antagonista de
65 SDF-1 es un antagonista de SDF-1.
El método puede realizarse de tal modo que se evalúa si el ácido nucleico es reemplazado por el candidato a agonista de SDF-1 o por un candidato a antagonista de SDF-1.
También se describe un antagonista de SDF-1 que puede obtenerse mediante el método según el séptimo aspecto o el octavo aspecto.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que es posible generar ácidos nucleicos que se unen de modo específico y con alta afinidad a la SDF-1.
La SDF-1 es un péptido básico que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:1. El pI calculado de SDF1 es 9,70. Tal como se emplea en la presente, el término SDF-1 se refiere a cualquier SDF-1 que incluye, pero no se limita a SDF-1 de mamífero. Preferiblemente, la SDF-1 de mamífero se selecciona del grupo que comprende SDF-1 de ratón, rata, conejo, hámster, mono y humana. Lo más preferiblemente, la SDF-1 es la SDF-1 humana (SEQ ID NO:1).
El descubrimiento de que pueden identificarse ácidos nucleicos de alta afinidad de unión a la SDF-1 es, en esta medida, sorprendente, puesto que Eaton et al. (Eaton, Gold et al., 1997) observaron que la generación de aptámeros, es decir, D-ácidos nucleicos que se unen a una molécula diana, dirigidos a una proteína básica es, en general, muy difícil, porque este tipo de diana produce una proporción de señal a ruido alta, pero no específica. Esta alta proporción de señal a ruido surge de la alta afinidad no específica que muestran los ácidos nucleicos por dianas básicas, tales como SDF-1.
Las características del ácido nucleico según la presente invención, tal como se describe en la presente, pueden lograrse en cualquier aspecto de la presente invención cuando se emplea el ácido nucleico solo o en cualquier combinación.
Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, los presentes inventores suponen que la especificidad observada de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 según la presente invención comparte características estructurales y, en particular, una de las secuencias de nucleótidos, que también se denominan en la presente secuencias centrales, que se analizará con más detalle a continuación, remitiéndose a las figuras 1 a 8 y al ejemplo
1. Sin embargo, debe entenderse que las figuras y el ejemplo 1 incorporan varias de dichas características estructurales que no necesariamente aparecen en cada uno de los ácidos nucleicos según la presente invención.
Tal como se menciona con más detalle en las reivindicaciones y el ejemplo 1, las diversas moléculas de ácidos nucleicos de unión a SDF-1 humana pueden clasificarse basándose en dichas cajas y algunas características estructurales y elementos, respectivamente. Las diversas categorías definidas de este modo también se denominan en la presente tipos y, más específicamente, tipo A, tipo B y tipo C.
En una realización preferida, el ácido nucleico según la presente invención es una única molécula de ácido nucleico. En otra realización, la única molécula de ácido nucleico está presente como una multitud de dichas únicas moléculas de ácido nucleico. Preferiblemente, las expresiones ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se emplean de modo intercambiable en la presente, si no se indica lo contrario.
Los expertos en la técnica sabrán que la molécula de ácido nucleico según la invención consiste preferiblemente en nucleótidos que están unidos covalentemente entre sí, preferiblemente a través de enlaces fosfodiéster.
Los ácidos nucleicos según la presente invención también comprenderán los ácidos nucleicos que sean fundamentalmente homólogos con las secuencias concretas descritas en la presente. La expresión sustancialmente homólogos significa que la homología es de al menos 75%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, y lo más preferiblemente mayor que 95 %, 96 %, 97%, 98 % o 99%.
El porcentaje real de nucleótidos homólogos presentes en el ácido nucleico según la presente invención dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico.
La homología puede determinarse según conocen los expertos en la técnica. De modo más específico, un algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa indicados. La secuencia de ensayo es preferiblemente la secuencia o la molécula de ácido nucleico que se dice que es homóloga, o que se va a ensayar para la homología, y si lo es, en qué grado, con otra molécula de ácido nucleico, en la que dicha otra molécula de ácido nucleico también se denomina la secuencia de referencia. En una realización, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico descrita en la presente, más preferiblemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia según cualquiera de SEQ ID NO:5 a 144. El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología loca de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970), mediante el método de búsqueda de similitudes
de Pearson y Lipman (Pearson y Lipman, 1988), mediante ejecuciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de alineamientos locales básica (en lo sucesivo "BLAST "); véase, por ejemplo, Altschul et al. (Altschul et al., 1990, y Altschul et al., 1997). El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en the National Center for Biotechnology Information (en lo sucesivo "NCBI"). Los parámetros por defecto empleados para determinar la identidad de secuencia empleando el software disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis et al. (McGinnis et al., 2004).
La expresión ácido nucleico de la invención o ácido nucleico según la presente invención también comprende los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente, o sus partes, preferiblemente hasta el punto en que dichos ácidos nucleicos o sus partes están implicados en la unión a la SDF-1. Este ácido nucleico puede derivarse de los descritos en la presente, por ejemplo, mediante truncamiento. El truncamiento puede estar relacionado con uno o ambos extremos de los ácidos nucleicos, tal como se describen en la presente. Además, el truncamiento puede estar relacionado con la secuencia interna de nucleótidos, es decir, puede estar relacionado con el nucleótido o nucleótidos entre el nucleótido terminal 5’ y el nucleótido terminal 3’, respectivamente. Además, el truncamiento comprenderá la deleción de un mínimo de un nucleótido de la secuencia de los ácidos nucleicos descritos en la presente. El truncamiento también puede estar relacionado con más de un tramo del ácido nucleico o ácidos nucleicos de la invención, y dicho tramo puede tener una longitud tan pequeña como de un nucleótido. La unión de un ácido nucleico según la presente invención puede ser determinada por los expertos en la técnica empleando experimentos habituales o usando o adoptando un método descrito en la presente, preferiblemente según se describe en la parte de los ejemplos.
Los ácidos nucleicos según la presente invención pueden ser D-ácidos nucleicos o L-ácidos nucleicos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son L-ácidos nucleicos. Además, es posible que una o varias partes del ácido nucleico estén presentes como D-ácidos nucleicos, o al menos una o varias partes de los ácidos nucleicos sean L-ácidos nucleicos. El término "parte" de los ácidos nucleicos significa una parte tan pequeña como de un nucleótido. Dichos ácidos nucleicos en general se denominan en la presente D-y L-ácidos nucleicos, respectivamente. Por tanto, en una realización particularmente preferida, los ácidos nucleicos según la presente invención consisten en L-nucleótidos y comprenden al menos un D-nucleótido. Dicho D-nucleótido está unido preferiblemente a una parte diferente de los tramos que definen los ácidos nucleicos según la presente invención, preferiblemente sus partes que están implicadas en una interacción con otras partes del ácido nucleico. Preferiblemente, dicho D-nucleótido está unido al terminal de cualquiera de los tramos y de cualquier ácido nucleico según la presente invención, respectivamente. En otra realización preferida, dichos D-nucleótidos pueden actuar como espaciador o conector, y preferiblemente unen las modificaciones, tales como PEG y HES, a los ácidos nucleicos según la presente invención.
También se incluye dentro de la presente invención el que cada una y cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente en su totalidad en términos de su secuencia o secuencias de ácidos nucleicos, estén limitadas a la secuencia o secuencias de nucleótidos concretas. En otra palabras, el término "comprende" debe interpretarse, en dicha realización, con el significado de contiene o consiste en.
También se incluye en la presente invención que los ácidos nucleicos según la presente invención sean parte de un ácido nucleico más largo, en el que este ácido nucleico más largo comprende varias partes, en el que al menos una de dichas partes es un ácido nucleico, o una de sus partes, según la presente invención. La otra parte o partes de estos ácidos nucleicos más largos pueden ser uno o varios D-ácidos nucleicos o L-ácidos nucleicos. Puede emplearse cualquier combinación en conexión con la presente invención. Esta otra u otras partes del ácido nucleico más largo pueden mostrar una función que sea diferente de la unión, preferiblemente de la unión a SDF-1. Una posible función es permitir la interacción con otras moléculas, siendo las otras moléculas preferiblemente diferentes de SDF-1, tal como, por ejemplo, para la inmovilización, el entrecruzamiento, la detección o la amplificación. En otra realización de la presente invención, los ácidos nucleicos según la invención comprenden, como restos individuales
o combinados, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. Este ácido nucleico que comprende varios de los ácidos nucleicos de la presente invención también está incluido en la expresión ácido nucleico más largo.
Los L-ácidos nucleicos, tal como se emplean en la presente, consisten en L-nucleótidos, preferiblemente consisten completamente en L-nucleótidos.
Los D-ácidos nucleicos, tal como se emplean en la presente, consisten en D-nucleótidos, preferiblemente consisten completamente en D-nucleótidos.
Las expresiones ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se emplean en la presente de modo intercambiable, si no se indica explícitamente lo contrario.
Además, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos se indica en la presente en la dirección 5’ → 3’.
Independientemente de que el ácido nucleico de la invención consista en D-nucleótidos, L-nucleótidos o una combinación de ambos, siendo dicha combinación, por ejemplo, una combinación aleatoria o una secuencia definida de tramos que consisten en al menos un L-nucleótido y al menos un D-ácido nucleico, el ácido nucleico puede consistir en uno o más desoxirribonucleótidos, uno o más ribonucleótidos o sus combinaciones.
El diseño de los ácidos nucleicos de la invención como L-ácidos nucleicos resulta ventajoso por varias razones. Los L-ácidos nucleicos son enantiómeros de los ácidos nucleicos naturales. Sin embargo, los D-ácidos nucleicos no son muy estables en disoluciones acuosas y, en particular, en sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la presencia extendida de nucleasas. Las nucleasas naturales, en particular las nucleasas de las células animales, no son capaces de degradar los L-ácidos nucleicos. Debido a esto, la semivida biológica de los L-ácidos nucleicos es significativamente mayor en estos sistemas, que incluyen el cuerpo animal y humano. Debido a la carencia de degradabilidad de los L-ácidos nucleicos no se generan productos de la degradación y, así, no surgen efectos secundarios observados a partir de ellos. Este aspecto delimita la presencia de los L-ácidos nucleicos en casi todos los demás compuestos que se emplean en la terapia de enfermedades y/o trastornos que implican la presencia de SDF-1. Los L-ácidos nucleicos que se unen específicamente a una molécula diana a través de un mecanismo diferente del apareamiento de bases de Watson y Crick, o los aptámeros que consisten parcial o completamente en L-nucleótidos, en particular que los contienen las partes de los aptámeros implicadas en la unión del aptámero a la molécula diana, también se denominan spiegelmeros.
Dentro de la presente invención se incluye que el primer y el segundo tramo de nucleótidos que flanquean a la secuencia de nucleótidos central pueden, en principio, hibridarse entre sí. Tras dicha hibridación se forma una estructura bicatenaria. Los expertos en la técnica sabrán que dicha hibridación puede o no producirse, en particular en condiciones in vitro y/o in vivo. Además, en el caso de que se produzca dicha hibridación, no tiene necesariamente que ser el caso de que la hibridación se produzca a lo largo de la longitud completa de los dos tramos en donde, al menos basándose en las reglas para el apareamiento de bases, pueda producirse dicha hibridación y, por tanto, la formación de una estructura bicatenaria. Tal como se emplea preferiblemente en la presente, una estructura bicatenaria es una parte de una molécula o una estructura formada por dos o más hebras distintas, en la que existen al menos una, preferiblemente dos o más pares de bases en las que se produce un apareamiento de bases, preferiblemente según las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. Los expertos en la técnica también sabrán que puede existir otro tipo de apareamiento de bases, tal como el apareamiento de bases de Hoogsten, u otro tipo de apareamiento de bases puede formar la estructura bicatenaria.
También se incluye en la presente invención el que los ácidos nucleicos de la invención, independientemente de que estén presentes como D-ácidos nucleicos, L-ácidos nucleicos o D,L-ácidos nucleicos, o que sean ADN o ARN, puedan estar presentes como ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios. Generalmente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos monocatenarios que muestran unas estructuras secundarias definidas debido a la secuencia primaria y, por tanto, también pueden formar estructuras terciarias. Sin embargo, los ácidos nucleicos de la invención también pueden ser dicatenarios, lo cual significa que dos hebras que son complementarias o parcialmente complementarias entre sí se hibridan entre sí. Esto confiere estabilidad al ácido nucleico que, en particular, será ventajosa si el ácido nucleico está presente en la forma D natural en lugar de la forma L.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden modificarse. Estas modificaciones pueden estar relacionadas con el único nucleótido del ácido nucleico y son muy conocidas en la técnica. Los ejemplos de estas modificaciones son descritos, entre otros, por Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al., 2003) y Kusser (Kusser, 2000). Esta modificación puede ser un átomo de H, un átomo de F o un grupo O-CH3 o grupo NH2 en la posición 2’ del nucleótido individual en el que consiste el ácido nucleico. Además, el ácido nucleico según la presente invención puede comprender al menos un nucleótido ANL. En una realización, el ácido nucleico según la presente invención consiste en nucleótidos ANL.
En una realización, los ácidos nucleicos según la presente invención pueden ser un ácido nucleico multipartito. Un ácido nucleico multipartito, tal como se emplea en la presente, es un ácido nucleico que consiste en al menos dos hebras de ácido nucleico. Estas al menos dos hebras de ácido nucleico forman una unidad funcional, siendo dicha unidad funcional un ligando con una molécula diana. Estas dichas al menos dos hebras de ácido nucleico pueden derivarse de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención rompiendo el ácido nucleico para generar dos hebras
o sintetizando un ácido nucleico que se corresponde con una primera parte del ácido nucleico de la invención, es decir, un ácido nucleico completo, y el otro ácido nucleico se corresponde con la segunda parte del ácido nucleico completo. Se entenderá que tanto la ruptura como la síntesis pueden aplicarse a la generación de un ácido nucleico multipartito cuando existen más de dos hebras, tal como se ejemplificó anteriormente. En otras palabras, dichas al menos dos hebras de ácido nucleico generalmente son diferentes de dos hebras que son complementarias y se hibridan entre sí, aunque pueda existir cierto grado de complementariedad entre las diversas partes de los ácidos nucleicos.
Por último, la presente invención también incluye la formación de una estructura totalmente cerrada, es decir,
circular, para los ácidos nucleicos según la presente invención, es decir, que los ácidos nucleicos según la presente invención estén cerrados, preferiblemente mediante un enlace covalente, y más preferiblemente dicho enlace covalente se realiza entre el extremo 5’ y el extremo 3’ de las secuencias de los ácidos nucleicos según se describen en la presente.
Los presentes inventores han descubierto que los ácidos nucleicos según la presente invención muestran un intervalo de valores de Kd muy favorable.
Una posibilidad para determinar la constante de unión es la medición de resonancia de plasmón de superficie, empleando el dispositivo denominado Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia), que también es conocido por los expertos en la técnica. La afinidad, tal como se emplea preferiblemente en la presente, también se midió utilizando el "ensayo de unión de abatimiento" ("pull-down"), según se describe en los ejemplos. Una medición apropiada para expresar la intensidad de la unión entre el ácido nucleico y la diana que, en el presente caso es la SDF-1, es el denominado valor de Kd, cuyo método de determinación también es conocido por los expertos en la técnica.
Los ácidos nucleicos según la presente invención se caracterizan por un determinado valor de Kd. Preferiblemente, el valor de Kd que muestran los ácidos nucleicos según la presente invención es menor que 1 µM. Se dice que un valor de Kd de aproximadamente 1 µM es característico de una unión no específica de un ácido nucleico a una diana. Los expertos en la técnica sabrán que el valor de Kd de un grupo de compuestos, tales como los ácidos nucleicos según la presente invención, está dentro de un intervalo concreto. La Kd mencionada anteriormente de aproximadamente 1 µM es un límite superior preferido para el valor de la Kd. El límite inferior preferido para la Kd de los ácidos nucleicos de unión a la diana puede ser de aproximadamente 10 picomolar o mayor. Dentro de la presente invención se incluye que los valores de Kd de los ácidos nucleicos individuales que se unen a la grelina estén preferiblemente dentro de este intervalo. Los intervalos preferidos pueden definirse eligiendo cualquier primer número dentro de este intervalo y cualquier segundo número dentro de este intervalo.
Los valores superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, y los valores inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pMy 10 pM.
Las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención pueden tener cualquier longitud, con la condición de que sigan siendo capaces de unirse a la molécula diana. En la técnica se comprenderá que existen longitudes preferidas de los ácidos nucleicos según la presente invención. Generalmente, la longitud es de entre 15 y 120 nucleótidos. Los expertos en la técnica saben que cualquier número entero entre 15 y 120 constituye una longitud posible para los ácidos nucleicos según la presente invención. Los intervalos más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos según la presente invención son unas longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 50 nucleótidos, y de aproximadamente 20 a 40 nucleótidos.
Se incluye en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente comprendan un resto que preferiblemente es un resto de alto peso molecular y/o que preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico con respecto, entre otras cuestiones, al tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferiblemente en el cuerpo humano. Una realización particularmente preferida de dicha modificación es la PEGilación y la HESilación de los ácidos nucleicos según la presente invención. Tal como se emplea en la presente, PEG significa poli(etilenglicol) y HES significa hidroxietil almidón. La PEGilación, tal como se emplea preferiblemente en la presente, es la modificación de un ácido nucleico según la presente invención, en la que dicha modificación consiste en un resto PEG que está unido a un ácido nucleico según la presente invención. La HESilación, tal como se emplea preferiblemente en la presente, es la modificación de un ácido nucleico según la presente invención, en la que dicha modificación consiste en un resto HES que está unido a un ácido nucleico según la presente invención. Estas modificaciones, así como el proceso de modificar un ácido nucleico empleando dichas modificaciones, se describen en la solicitud de patente europea EP 1 306 382.
Preferiblemente, el peso molecular de una modificación que consiste o que comprende un resto de peso molecular alto es de aproximadamente 2.000 a 200.000 Da, preferiblemente de 40.000 a 120.000 Da, en particular en el caso de que PEG sea dicho resto de peso molecular alto, y es preferiblemente de aproximadamente 3.000 a 180.000 Da, más preferiblemente de 60.000 a 140.000 Da, en particular en el caso de que HES sea dicho resto de peso molecular alto. El proceso de la modificación con HES se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente alemana DE 1 2004 006 249.8.
La presente invención también incluye que cualquiera de PEG y HES pueda utilizarse en forma lineal o ramificada, tal como se describe más a fondo en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950. Esta modificación puede realizarse, en principio, en las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención en cualquiera de sus posiciones. Preferiblemente, dicha modificación se realiza en el nucleótido 5’-terminal, el nucleótido 3’-terminal y/o cualquier nucleótido entre el nucleótido 5’ y el nucleótido 3’ de la molécula de ácido nucleico.
La modificación y, preferiblemente, el resto PEG y/o HES, puede unirse a la molécula de ácido nucleico de la presente invención directamente o a través de un conector. También se incluye en la presente invención que la molécula de ácido nucleico según la presente invención comprenda una o más modificaciones, preferiblemente uno
o más restos PEG y/o HES. En una realización, la molécula conectora individual une más de un resto PEG o resto HES a una molécula de ácido nucleico según la presente invención. El conector utilizado en conexión con la presente invención puede ser lineal o ramificado. Este tipo de conectores son conocidos por los expertos en la técnica y se describen más a fondo en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950.
Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, parece que mediante la modificación de los ácidos nucleicos según la presente invención con un resto de peso molecular alto, tal como un polímero, y más en concreto los polímeros descritos en la presente, que son preferiblemente fisiológicamente aceptables, se cambia la cinética de excreción. Más en concreto, parece que debido al peso molecular mayor de dichos ácidos nucleicos modificados de la invención, y debido a que los ácidos nucleicos no sufren metabolismo, en particular cuando están en la forma L, la excreción desde el cuerpo de un animal, preferiblemente desde el cuerpo de un mamífero y más preferiblemente desde el cuerpo humano, disminuye. Puesto que la excreción generalmente se produce a través de los riñones, los presentes invención suponen que la tasa de filtración glomerular del ácido nucleico modificado de esta forma se reduce significativamente, comparado con los ácidos nucleicos que no presentan este tipo de modificación de peso molecular alto, lo cual da como resultado un aumento en el tiempo de residencia en el cuerpo. Con relación a esto, resulta particularmente notable que, a pesar de dicha modificación de peso molecular alto, la especificidad del ácido nucleico según la presente invención no se ve afectada de modo perjudicial. En esta medida, los ácidos nucleicos según la presente invención tienen características sorprendentes, que no se esperan normalmente en compuestos farmacéuticamente activos, de modo que no se requiere necesariamente una formulación farmacéutica que proporcione una liberación sostenida para proporcionar, de hecho, una liberación sostenida. Por el contrario, los ácidos nucleicos según la presente invención, en su forma modificada que comprende un resto de peso molecular alto, ya pueden utilizarse como formulación de liberación sostenida. En esta medida, la modificación o modificaciones de las moléculas de ácidos nucleicos, tal como se describen en la presente, y las moléculas de ácidos nucleicos modificadas de esta manera y cualquier composición que las contenga pueden proporcionar una biodistribución y farmacocinética diferenciada y preferiblemente controlada. Esto también incluye el tiempo de residencia en la circulación y la distribución a los tejidos. Estas modificaciones se describen más a fondo en la solicitud de patente PCT/EP02/11950.
Sin embargo, también se incluye en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente no comprendan cualquier modificación y, en concreto, ninguna modificación de peso molecular alto, tal como una PEGilación o una HESilación. Dicha realización resulta particularmente preferida cuando se desee una eliminación rápida de los ácidos nucleicos del cuerpo después de la administración. Dicha eliminación rápida puede desearse en el caso de formación de imágenes in vivo o unos requisitos de dosificación terapéutica específica empleando los ácidos nucleicos o los medicamentos que los comprenden según la presente invención.
Los ácidos nucleicos de la invención, que también se denominan en la presente los ácidos nucleicos según la presente invención y/o los antagonistas según la presente invención pueden usarse para la generación o la fabricación de un medicamento. Dicho medicamento contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención, opcionalmente junto con otros compuestos farmacéuticamente activos, en el que el ácido nucleico de la invención preferiblemente actúa como el propio compuesto farmacéuticamente activo. Dichos medicamentos comprenden, en realizaciones preferidas, al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser, por ejemplo, agua, tampón, PBS, disolución de glucosa, disolución de sacarosa, disolución de manosa, preferiblemente una disolución equilibrada de sacarosa al 5%, almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia vehículo aceptable. Dichos vehículos son conocidos en general por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica sabrán que cualquier realización, uso y aspecto del medicamento o relacionado con el medicamento de la presente invención también es aplicable a la composición farmacéutica de la presente invención y viceversa.
Las indicaciones, enfermedades y trastornos para cuyo tratamiento y/o prevención se emplean los ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos según la presente invención o preparados según la presente invención, surgen de la implicación, directa o indirecta, de la SDF-1 en sus respectivos mecanismos patogenéticos.
Por supuesto, debido a que los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 según la presente invención interactúan o se unen con la SDF-1 humana o murina, los expertos en la técnica generalmente comprenderán que los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 según la presente invención pueden emplearse con facilidad para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de cualquier enfermedad, según se describe en la presente, de seres humanos y animales.
Las enfermedades y/o trastornos y/o estados de enfermedad para cuyo tratamiento y/o prevención dicho medicamento puede emplearse incluyen, pero no se limitan a enfermedades del fondo del ojo, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con el envejecimiento, de la forma húmeda y seca; cáncer; cáncer de mama, ovarios, próstata, páncreas, tiroides, nasofaringe, colon, pulmón y estómago; osteosarcoma; melanoma; glioma; medulo-y neuroblastoma; leucemia; leucemia linfocítica crónica de células B; mieloma múltiple; linfoma; síndrome WHIM; síndromes de deficiencia inmunológica; neovascularización patológica; inflamación; esclerosis
múltiple; artritis; artritis reumatoide/osteoartritis y nefritis.
En otra realización, el medicamento comprende otro agente farmacéuticamente activo. Estos otros compuestos farmacéuticamente activos pueden ser compuestos conocidos por los expertos en la técnica y se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende antagonistas de quimioquinas o citoquinas, corticosteroides, y similares. Los expertos en la técnica entenderán que debido a las diversas indicaciones que pueden ser tratadas según la presente invención mediante los ácidos nucleicos según la presente invención, dicho otro u otros agentes farmacéuticamente activos pueden ser cualquier agente que, en principio, sea adecuado para el tratamiento y/o la prevención de dichas enfermedades. Las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención, en particular si están presentes o se usan como medicamento, se combinan preferiblemente con inhibidores de VEGF, tales como Macugen (pegatanib) de Pfizer Ophthalmics, Lucentis (ranitizumab) de Novartis Ophthalmics, Avastin (bevacizumab) de Roche (uso fuera de indicación); o con una terapia fotodinámica, tal como Visudyne (verteporfina) de Novartis Ophthalmics, y un derivado de cortisona inyectable por vía intravítrea, tal como Retaane (acetato de anecortavo) de Alcon Inc.
Como alternativa, o además, este otro agente farmacéuticamente activo es otro ácido nucleico según la presente invención. Como alternativa, el medicamento comprende al menos un ácido nucleico más que se une a una molécula diana diferente de la SDF-1 o muestra una función que es diferente de la función de los ácidos nucleicos según la presente invención.
Tal como sabrán los expertos en la técnica, los ácidos nucleicos pueden emplearse objetivamente en cualquier enfermedad en la que pueda administrarse un antagonista de SDF-1 a un paciente que necesite dicho antagonista, y dicho antagonista es adecuado para eliminar la causa de la enfermedad o el trastorno o, al menos, para reducir los efectos de la enfermedad o el trastorno. Dichos efectos incluyen, pero no se limitan a la neovascularización patológica, la inflamación y la metástasis. La aplicabilidad de los ácidos nucleicos según la presente invención con respecto a estas y otras enfermedades o trastornos surge, entre otras cuestiones, de la implicación de la SDF-1, tal como se resumió en la parte introductoria de la presente memoria descriptiva, que se incorpora en la presente como referencia para evitar cualquier repetición innecesaria.
En la presente invención se incluye que el medicamento se emplee, como alternativa o además, en principio, para la prevención de cualquiera de las enfermedades descritas con respecto al uso del medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades. Por tanto, los respectivos marcadores, concretamente para las respectivas enfermedades, son conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el marcador respectivo es SDF-1. Como alternativa y/o además, el marcador respectivo se selecciona del grupo de marcadores del estrés oxidativo, que comprende la reductasa transmembrana de ferricianuro (TMR), una actividad mayor de la vía del sorbitol que incluye una acumulación posterior de sorbitol, una mayor proporción de NADH/NAD citosólica, la disminución de NADPH y la acumulación de fructosa con una producción no enzimática resultante de productos finales de la glicación avanzada (AGES) y la consiguiente activación de la proteína quinasa C, acontecimientos corriente abajo mediados por estrés nitrosativo y oxidativo, tales como activación de MAP quinasa; marcadores inflamatorios, que comprenden ICAM-1, VCAM-1, RANTES, haptoglobina, o proteína reactiva C; y marcadores proangiogénicos, tales como eritropoyetina o VEGF. A la vista de esto, dichos marcadores pueden emplearse para determinar si un sujeto o un paciente puede o no tratarse con cualquier de las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención está relacionada con dicho método, en el que se determina la presencia o la ausencia y, de modo más específico, la concentración del respectivo marcador o marcadores. Los métodos para la detección de dichos marcadores y, opcionalmente, su cuantificación, así como el intervalo en el que el respectivo marcador estará presente o ausente para decidir si el sujeto o el paciente sufre o no cualquiera de dichas enfermedades o está en riesgo de desarrollar dichas enfermedades y, por consiguiente, puede así tratarse según la presente invención, son conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización del medicamento de la presente invención, dicho medicamento es para su uso en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades descritas en la presente, en particular aquellas en las que se va a utilizar el medicamento de la presente invención.
Una "terapia de combinación" (o "coterapia") incluye la administración de un medicamento de la invención y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico previsto para proporcionar el efecto beneficioso de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y dicho segundo agente. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a la acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica que resulta de la combinación de los agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación generalmente se realiza a lo largo de un periodo de tiempo definido (habitualmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada).
La “terapia de combinación” puede incluir, pero en general no incluye la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia distintos que, de modo accidental y arbitrario, den como resultado las combinaciones de la presente invención. Una "terapia de combinación" pretende incluir la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos
de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea puede lograrse, por ejemplo, administrando al sujeto una única cápsula que contenga una proporción fijada de cada agente terapéutico o múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos.
La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede realizarse por cualquier vía adecuada que incluye, pero no se limita a las vías tópicas, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares, y la absorción directa a través de tejidos de las membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse mediante inyección, mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía tópica.
Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía tópica o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección. La secuencia en la cual se administran los agentes terapéuticos no es crítica, a menos que se indique lo contrario. Una "terapia de combinación" también puede incluir la administración de los agentes terapéuticos según se describió anteriormente en otra combinación con otros ingredientes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos puede realizarse en cualquier momento adecuado, con la condición de que se logre un efecto beneficioso por la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en los casos apropiados, el efecto beneficioso aún puede lograrse cuando el tratamiento sin fármacos se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizá durante días o incluso semanas.
Tal como se mencionó en términos generales anteriormente, el medicamento según la presente invención puede administrarse, en principio, en cualquier forma conocida por los expertos en la técnica. Una vía preferida de administración es la administración sistémica, más preferiblemente la administración parenteral, preferiblemente mediante inyección. Como alternativa, el medicamento puede administrarse de modo local. Otras vías de administración comprenden la vía intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, oral, intranasal, intratraqueal o pulmonar, prefiriéndose la vía de administración que sea menos invasiva, al mismo tiempo que se asegura su eficacia.
En general, se emplea la administración parenteral para infusiones e inyecciones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Además, una estrategia para la administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación lenta o de liberación sostenida, que asegura el mantenimiento de un nivel constante de dosificación, que en general son muy conocidos por los expertos en la técnica.
Además, los medicamento preferidos de la presente invención pueden administrarse en forma intranasal a través del uso tópico de vehículos intranasales adecuados, inhaladores, o a través de vías transdérmicas, empleando las formas de parches para la piel transdérmicos conocidos por los expertos en la técnica. Para ser administrada en forma de un sistema de administración transdérmico, la dosificación de la administración deberá ser, por supuesto, continua, en lugar de intermitente a lo largo de un régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, pulverizados en aerosol y geles, en las que la concentración del ingrediente activo generalmente varía del 0,01% al 15% en p/p o en p/v.
El medicamento de la presente invención en general comprenderá una cantidad eficaz del componente o componentes activos de la terapia que incluyen, pero no se limitan a una molécula de ácido nucleico de la presente invención, disuelta o dispersada en un medio farmacéuticamente aceptable. Los medios o vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso de la absorción e isotónicos y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es muy conocido en la técnica. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en el medicamento de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica comprende al menos uno de los ácidos nucleicos según la presente invención y preferiblemente un ligante farmacéuticamente aceptable. Dicho ligante puede ser cualquier ligante empleado y/o conocido en la técnica. Más en concreto, dicho ligante es cualquier ligante analizado en conexión con la fabricación del medicamento descrito en la presente. En otra realización, la composición farmacéutica comprende otro agente farmacéuticamente activo.
Los expertos en la técnica sabrán cómo realizar la preparación de un medicamento y una composición farmacéutica a la luz de la presente descripción. Generalmente, dichas composiciones pueden prepararse como productos inyectables, en forma de disoluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para la disolución o la suspensión en un líquido antes de la inyección; o comprimidos u otros sólidos para la administración oral; como cápsulas de liberación a lo largo del tiempo; o en cualquier otra forma que se emplee en la actualidad, que incluye colirios, cremas, lociones, bálsamos, inhalantes y similares. También puede resultar particularmente útil el uso de formulaciones estériles, tales como lavados con una base de disolución salina, por cirujanos, médicos o trabajadores sanitarios para tratar un área concreta en el campo de las operaciones. Las composiciones también pueden administrarse mediante un microdispositivo, micropartícula o esponja.
Tras su formulación, un medicamento se administrará de una manera compatible con la dosificación de la formulación, y en una cantidad que sea farmacológicamente eficaz. Las formulaciones se administran con facilidad en una diversidad de formas de dosificación, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares.
En este contexto, la cantidad de ingrediente activo y el volumen de la composición que se va a administrar depende del individuo o sujeto que se va a tratar. Las cantidades específicas de compuesto activo necesarias para la administración dependen del criterio del médico y son exclusivas para cada individuo.
Generalmente se utiliza un volumen mínimo de un medicamento necesario para dispersar los compuestos activos. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero un ejemplo típico consiste en administrar inicialmente el compuesto y controlar los resultados, y después administrar más dosis controladas en posteriores intervalos.
Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula (por ejemplo, una cápsula de gelatina), el componente de fármaco activo, es decir, una molécula de ácido nucleico de la presente invención y/o cualquier otro agente farmacéuticamente activo, también denominados en la presente agente o agentes terapéuticos
o compuesto o compuestos activos, pueden combinarse con un vehículo inerte farmacéuticamente aceptable oral no tóxico, tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desee o sea necesario, también pueden incorporarse a la mezcla ligantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados. Los ligantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodio y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales, tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes empleados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol, y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, almidones de goma de xantano, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes y similares. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.
El medicamento de la invención también puede administrarse en formas de dosificación oral, tales como comprimidos o cápsulas de liberación a lo largo del tiempo y de liberación sostenida, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Se preparan supositorios de forma ventajosa a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
La composición farmacéutica o el medicamento puede esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulgentes, estimulantes de la disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también puede contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan según métodos convencionales de mezclado, granulación o revestimiento, y generalmente contienen de aproximadamente 0,1% al 75%, preferiblemente de aproximadamente 1% al 50% del ingrediente activo.
Pueden prepararse composiciones líquidas, en particular inyectables, por ejemplo mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro, tal como, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar con ello la disolución o suspensión inyectable. Además, pueden formularse formas sólidas adecuadas para disolver en un líquido antes de la inyección.
Para las composiciones sólidas, los excipientes incluyen calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. El compuesto activo definido anteriormente también puede formularse como supositorios empleando, por ejemplo, polialquilenglicoles, por ejemplo, propilenglicol, como vehículo. En algunas realizaciones, los supositorios se preparan de modo ventajoso a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
Los medicamentos y las moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención también pueden administrarse en forma de sistemas de transporte de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolípidos que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, una película de componentes lipídicos se hidrata con una disolución acuosa del fármaco para formar una capa lipídica que encapsula al fármaco, lo cual es muy conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente pueden proporcionarse en forma de un complejo con un compuesto lipófilo
o un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico, construido empleando métodos conocidos en la técnica. Además, los liposomas pueden portar dichas moléculas de ácidos nucleicos sobre su superficie para dirigir y transportar agentes citotóxicos internamente para mediar en la muerte de células. Un ejemplo de complejos asociados a ácidos nucleicos se proporciona en la patente de EE. UU. n.º 6.011.020.
Los medicamentos y las moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención también pueden acoplarse con polímeros solubles como vehículos de fármacos de transporte dirigido. Estos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol, o poli(óxido de etileno)-polilisina sustituido con restos palmitoílo. Además, los medicamentos y las moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención también pueden acoplarse con una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli-épsilon caprolactona, poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros en bloque anfipáticos o reticulados de hidrogeles.
Si se desea, la composición farmacéutica y el medicamento, respectivamente, que se va a administrar también puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulgentes, agentes tamponantes del pH y otras sustancias, tales como, por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trietanolamina.
El régimen de dosificación que emplea las moléculas de ácidos nucleicos y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona según una diversidad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la condición médica del paciente; la gravedad del trastorno que se va tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero concreto, o su sal, empleado. Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar con facilidad y recetar la cantidad eficaz del fármaco necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el avance del trastorno.
Los niveles plasmáticos eficaces del ácido nucleico según la presente invención preferiblemente varían de 500 fM a 500 µM en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
Las moléculas de ácidos nucleicos y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención pueden administrarse preferiblemente en una única dosis diaria, cada dos o tres días, de modo semanal, cada dos semanas, en una única dosis mensual o cada tres meses.
Dentro de la presente invención se incluye que el medicamento, según se describe en la presente, constituya la composición farmacéutica descrita en la presente.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un sujeto que necesita dicho tratamiento, en el que el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos uno de los ácidos nucleicos según la presente invención. En una realización, el sujeto padece una enfermedad o está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad, en la que la enfermedad es cualquiera de las descritas en la presente, en particular cualquiera de las enfermedades descritas con respecto al uso de cualquiera de los ácidos nucleicos según la presente invención para la fabricación de un medicamento.
Tal como se emplea preferiblemente en la presente, un diagnóstico o agente de diagnóstico o medio de diagnóstico resulta adecuado para detectar, directa o indirectamente, la SDF-1, según se describe en la presente con respecto a los diversos trastornos y enfermedades descritos en la presente. El diagnóstico es adecuado para la detección y/o el seguimiento de cualquiera de los trastornos y enfermedades, respectivamente, descritos en la presente. Dicha detección es posible mediante la unión de los ácidos nucleicos según la presente invención a la SDF-1. Esta unión puede detectarse directa o indirectamente. Los respectivos métodos y medios son conocidos por los expertos en la técnica. Entre otros, los ácidos nucleicos según la presente invención pueden comprender un marcador que permita la detección de los ácidos nucleicos según la presente invención, preferiblemente el ácido nucleico unido a SDF-1. Este marcador se selecciona preferiblemente del grupo que comprende marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes. En principio, pueden adoptarse todos los ensayos conocidos desarrollados para anticuerpos para los ácidos nucleicos según la presente invención, en los que el anticuerpo de unión a la diana se sustituye por un ácido nucleico de unión a la diana. En los ensayos de anticuerpos que emplean anticuerpos de unión a la diana no marcados, la detección se realiza preferiblemente mediante un anticuerpo secundario que está modificado con marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes y que se une al anticuerpo de unión a la diana en su fragmento Fc. En el caso de un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico según la presente invención, el ácido nucleico se modifica con dicho marcador, en el que preferiblemente dicho marcador se selecciona del grupo que comprende biotina, Cy-3 y Cy-5, y dicho marcador se detecta por medio de un anticuerpo dirigido a dicho marcador, por ejemplo, un anticuerpo antibiotina, un anticuerpo anti-Cy3 o un anticuerpo anti-Cy5 o, en el caso en que el marcador ses biotina, el marcador se detecta mediante estreptavidina o avidina que se unen a la biotina de modo natural. Dicho anticuerpo, estreptavidina o avidina, a su vez, preferiblemente están modificados con un respectivo marcador, por ejemplo, un marcador radiactivo, enzimático o fluorescente (tal como un anticuerpo secundario).
En otra realización, las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención se detectan o se analizan mediante un segundo medio de detección, en el que dicho medio de detección es una baliza molecular. Los expertos en la técnica conocen la metodología de las balizas moleculares. Brevemente, sondas de ácidos nucleicos, que también se denominan balizas moleculares, son un complemento inverso de los ácidos nucleicos que se van a detectar en la muestra y, por ello, se hibridan con una parte de los ácidos nucleicos que se van a detectar en la
muestra. Tras unirse a los ácidos nucleicos de la muestra, los grupos fluorofóricos de la baliza molecular se separan, lo cual provoca un cambio en la señal de fluorescencia, preferiblemente un cambio en la intensidad. Este cambio se correlaciona con la cantidad de ácidos nucleicos presentes en la muestra.
Los expertos en la técnica entenderán que, debido a la relación resumida en la presente entre la SDF-1 y su correspondiente receptor, las enfermedades y los trastornos que pueden diagnosticarse empleando las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención son, en principio, las mismas que se han descrito en la presente con respecto al uso de dichas moléculas de ácidos nucleicos para el tratamiento y/o la prevención de dicha enfermedad.
Aparte de esto, otros usos de las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención residen en una disminución en la hematopoyesis, una disminución en la invasión o metástasis, una disminución en el desarrollo y quimiotaxis de células B, una disminución en la quimioatracción de células T y una inducción de la detención del crecimiento y la apoptosis.
Con respecto a la detección de la SDF-1, un método preferido comprende las siguientes etapas:
(a)
proporcionar una muestra que se va a ensayar para la presencia de SDF-1,
(b)
proporcionar un ácido nucleico según la presente invención,
(c)
hacer reaccionar la muestra con el ácido nucleico, preferiblemente en un recipiente de reacción, en el que la etapa (a) puede realizarse antes de la etapa (b), o la etapa (b) puede realizarse antes de la etapa (a).
En una realización preferida, se proporciona otra etapa d), que consiste en la detección de la reacción de la muestra con el ácido nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico de la etapa b) está inmovilizado sobre una superficie. La superficie puede ser la superficie de un recipiente de reacción, tal como un tubo de reacción, un pocillo de una placa,
o la superficie de un dispositivo contenido dentro de dicho recipiente de reacción, tal como, por ejemplo, una esfera. La inmovilización del ácido nucleico a la superficie puede realizarse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica que incluye, pero no se limita a enlaces covalentes o no covalentes. Preferiblemente, el enlace se establece a través de un enlace químico covalente entre la superficie y el ácido nucleico. Sin embargo, dentro la presente invención también se incluye que el ácido nucleico se inmovilice a una superficie de modo indirecto, en la que dicha inmovilización indirecta implica el uso de otro componente o de una pareja de compañeros de interacción. Este otro componente es preferiblemente un compuesto que interacciona específicamente con el ácido nucleico que se va a inmovilizar, que también se denomina compañero de interacción, y, por tanto, media en la unión del ácido nucleico a la superficie. El compañero de interacción se selecciona preferiblemente del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos. Preferiblemente, el compañero de interacción es un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Como alternativa, el compañero de interacción es un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional. Más preferiblemente, dicho ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que comprende aptámeros, spiegelmeros, y ácidos nucleicos que son al menos parcialmente complementarios con el ácido nucleico. En otra realización alternativa, la unión del ácido nucleico a la superficie es mediada por un compañero de interacción multipartito. Dicho compañero de interacción multipartito es preferiblemente una pareja de compañeros de interacción o un compañero de interacción que consiste en un primer miembro y un segundo miembro, en el que el primer miembro está compuesto por el ácido nucleico, o está unido a él, y el segundo miembro está unido a la superficie, o está compuesto por esta. El compañero de interacción multipartito se selecciona preferiblemente del grupo parejas de compañeros de interacción que comprenden biotina y avidina, biotina y estreptavidina, y biotina y neutravidina. Preferiblemente, el primer miembro de la pareja de compañeros de interacción es la biotina.
Un resultado preferido de dicho método es la formación de un complejo inmovilizado de SDF-1 y el ácido nucleico, en el que, más preferiblemente, dicho complejo se detecta. En una realización, se detecta la SDF-1 a partir del complejo.
El método para la detección de SDF-1 también comprende que la muestra se retire del recipiente de reacción que se ha empleado preferiblemente para realizar la etapa c).
El método comprende además, en otra realización, la etapa de inmovilizar un compañero de interacción de la SDF-1 sobre una superficie, preferiblemente una superficie como se definió anteriormente, en la que el compañero de interacción se define como se indica en la presente y preferiblemente como se ha indicado anteriormente con respecto al respectivo método, y más preferiblemente comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos en sus diversas realizaciones. En esta realización, un medio de detección particularmente preferido es un ácido nucleico según la presente invención, en el que dicho ácido nucleico preferiblemente puede estar marcado
o no marcado. En el caso en que dicho ácido nucleico esté marcado, este puede detectarse de modo directo o indirecto. Esta detección también puede implicar el uso de un segundo medio de detección que, preferiblemente, también se selecciona del grupo que comprende ácido nucleicos, polipéptidos, proteínas y realizaciones en las diversas realizaciones descritas en la presente. Este medio de detección es preferiblemente específico para el ácido nucleico según la presente invención. En una realización más preferida, el segundo medio de detección es una baliza molecular. El ácido nucleico o el segundo medio de detección o ambos pueden comprender, en una
realización preferida, un marcador de detección. El marcador de detección se selecciona preferiblemente del grupo que comprende biotina, un marcador de bromodesoxiuridina, un marcador de digoxigenina, un marcador de fluorescencia, un marcador de UV, un radiomarcador, y una molécula de quelante. Como alternativa, el segundo medio de detección interacciona con el marcador de detección que está preferiblemente contenido por el ácido nucleico o está formado por este o unido a este. Las combinaciones particularmente preferidas son las siguientes:
el marcador de detección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la biotina, o el marcador de detección es biotina y el segundo medio de detección es una avidina o una molécula que porta avidina, o el marcador de detección es biotina y el segundo medio de detección es una estreptavidina o una molécula que porta estreptavidina, o el marcador de detección es biotina y el segundo medio de detección es una neutravidina o una molécula que porta neutravidina, o el marcador de detección es una bromo-desoxiuridina el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la bromo-desoxiuridina, o el marcador de detección es una digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la digoxigenina, o
en donde el marcador de detección es un quelante el segundo medio de detección es un radionúclido, en el que se prefiere que dicho marcador de detección esté unido al ácido nucleico. Debe advertirse que este tipo de combinación también es aplicable a la realización en la que el ácido nucleico está unido a la superficie. En esta realización se prefiere que el marcador de detección esté unido al compañero de interacción.
Por último, también se incluye en la presente invención que el segundo medio de detección se detecte empleando un tercer medio de detección, preferiblemente el tercer medio de detección es una enzima, más preferiblemente muestra una reacción enzimática tras la detección del segundo medio de detección, o el tercer medio de detección es un medio para detectar radiación, más preferiblemente radiación emitida por un radionúclido. Preferiblemente, el tercer medio de detección detecta y/o interacciona específicamente con el segundo medio de detección.
También en la realización en que un compañero de interacción de SDF-1 está inmovilizado sobre una superficie y el ácido nucleico según la presente invención se añade preferiblemente al complejo formado entre el compañero de interacción y la SDF-1, la muestra puede retirarse de la reacción, más preferiblemente del recipiente de reacción en el que se realiza la etapa c) y/o d).
En una realización, el ácido nucleico según la presente invención comprende un resto de fluorescencia, y la fluorescencia del resto de fluorescencia es diferente tras la formación del complejo entre el ácido nucleico y SDF-1 y la SDF-1 libre.
En otra realización, el ácido nucleico es un derivado del ácido nucleico según la presente invención, en el que el derivado del ácido nucleico comprende al menos un derivado fluorescente de la adenosina que reemplaza a la adenosina. En una realización preferida, el derivado fluorescente de la adenosina es la etenoadenosina.
En otra realización, el complejo que consiste en el derivado del ácido nucleico según la presente invención, y la SDF-1 se detecta empleando la fluorescencia.
En una realización del método se crea una señal en la etapa (c) o la etapa (d), y preferiblemente la señal se correlaciona con la concentración de SDF-1 en la muestra.
En un aspecto preferido, los ensayos pueden realizarse en placas de 96 pocillos, en las que los componentes están inmovilizados en los recipientes de reacción, según se describió anteriormente, y los pocillos actúan como recipientes de reacción.
El ácido nucleico de la invención puede emplearse además como material de partida para el diseño de fármacos. Básicamente existen dos estrategias posibles. Una estrategia es la selección de bancos de compuestos, en los que dichos bancos de compuestos son preferiblemente bancos de compuestos de bajo peso molecular. En una realización, la selección es una selección de alta capacidad de procesamiento. Preferiblemente, la selección de alta capacidad de procesamiento consiste en la evaluación rápida, eficaz y basada en prueba y error de los compuestos en un ensayo basado en una diana. En el mejor de los casos, el análisis se realiza mediante una medición colorimática. Los expertos en la técnica conocen bancos empleados a este respecto.
Como alternativa, el ácido nucleico según la presente invención puede emplearse para un diseño racional de fármacos. Preferiblemente, el diseño racional de fármacos es el diseño de una estructura farmacéutica principal. Comenzando a partir de la estructura tridimensional de la diana, que generalmente se identifica mediante métodos tales como la cristalografía de rayos X o la espectroscopía de resonancia magnética nuclear, se emplean programas informáticos para la búsqueda en bases de datos que contienen estructuras de muchos compuestos químicos
diferentes. La selección se realiza por ordenador y los compuestos identificados pueden ensayarse posteriormente en el laboratorio.
El diseño racional de fármacos puede comenzar a partir de cualquiera de los ácidos nucleicos según la presente invención e implica una estructura, preferiblemente una estructura tridimensional, que es similar a la estructura de los ácidos nucleicos de la invención o idéntica a las partes que median en la unión de la estructura de los ácidos nucleicos de la invención. En cualquier caso, dicha estructura debe mostrar las mismas características de unión, o similares, que los ácidos nucleicos de la invención. En otra etapa o como etapa alternativa en el diseño racional de fármacos, preferiblemente la estructura tridimensional de las partes de los ácidos nucleicos que se unen al neurotransmisor es imitada por grupos químicos que son diferentes de nucleótidos y ácidos nucleicos. Mediante esta imitación puede diseñarse un compuesto diferente de los ácidos nucleicos. Este compuesto es preferiblemente una molécula pequeña o un péptido.
En el caso de seleccionar bancos de compuestos, tal como mediante el uso de un ensayo competitivo conocido por los expertos en la técnica, pueden encontrarse análogos de SDF-1, agonistas de SDF-1 o antagonistas de SDF-1 apropiados. Estos ensayos competitivos pueden componerse como sigue. El ácido nucleico de la invención, preferiblemente un spiegelmero que es un L-ácido nucleico de unión a la diana, se acopla a una fase sólida. Para identificar análogos de SDF-1 puede añadirse al ensayo una SDF-1 marcada. Un análogo potencial competiría con la unión de las moléculas de SDF-1 al spiegelmero, lo cual vendría acompañado de una disminución en la señal obtenida por el marcador respectivo. La selección de agonistas o antagonistas puede implicar el uso de un ensayo de cultivo celular tal como conocen los expertos en la técnica.
El kit según la presente invención puede comprender al menos uno o varios de los ácidos nucleicos de la invención. Además, el kit puede comprender al menos uno o varios controles positivos o negativos. Un control positivo puede ser, por ejemplo SDF-1, en particular la SDF-1 contra la cual se selecciona el ácido nucleico de la invención o con la que este se une, preferiblemente en forma líquida. Un control negativo puede ser, por ejemplo, un péptido que se define en términos de las propiedades biofísicas como similar a la SDF-1, pero que no es reconocido por los ácidos nucleicos de la invención. Además, dicho kit puede comprender uno o varios tampones. Los diversos ingredientes pueden estar contenidos en el kit en forma seca o liofilizada o disueltos en un líquido. El kit puede comprender uno o varios recipientes que, a su vez, pueden contener uno o varios ingredientes del kit. En otra realización, el kit comprende unas instrucciones o un folleto con instrucciones que proporciona al usuario información acerca de la forma en que se utiliza el kit y sus diversos ingredientes.
Tal como se emplea preferiblemente en la presente, el término tratamiento comprende, en una realización preferida, además o como alternativa, la prevención y/o el seguimiento.
La determinación farmacéutica y bioanalítica del ácido nucleico según la presente invención es básica para la evaluación de su perfil farmacocinético y biodinámico en varios humores, tejidos y órganos del cuerpo humano y no humano. Para este fin pueden utilizarse cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente o conocidos por los expertos en la técnica. En otro aspecto de la presente invención se proporciona un ensayo de hibridación de "sandwich" para la detección del ácido nucleico según la presente invención. Dentro del ensayo de detección se emplea una sonda de captura y una sonda de detección. La sonda de captura es complementaria con la primera parte del ácido nucleico según la presente invención y la sonda de detección es complementaria con la segunda parte del ácido nucleico según la presente invención. Ambas sondas de captura y detección pueden estar formadas por nucleótidos de ADN, nucleótidos de ADN modificados, nucleótidos de ARN modificados, nucleótidos de ARN, nucleótidos de ANL y/o nucleótidos de ANP.
Por tanto, la sonda de captura comprende un tramo de secuencia complementaria con el extremo 5’ del ácido nucleico según la presente invención, y la sonda de detección comprende un tramo de secuencia complementaria con el extremo 3’ del ácido nucleico según la presente invención. En este caso, la sonda de captura se inmoviliza sobre una superficie o matriz a través de su extremo 5’, por lo cual la sonda de captura puede inmovilizarse directamente en su extremo 5 ’o a través de un conector entre su extremo 5' y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector puede unirse a cada nucleótido de la sonda de captura. El conector puede estar formado por conectores hidrófilos conocidos por los expertos en la técnica o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-ADL, nucleótidos de ADP, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-ARL.
Como alternativa, la sonda de captura comprende un tramo de secuencia complementaria con el extremo 3’ del ácido nucleico según la presente invención, y la sonda de detección comprende un tramo de secuencia complementaria con el extremo 5’ del ácido nucleico según la presente invención. En este caso, la sonda de captura se inmoviliza sobre una superficie o matriz a través de su extremo 3’, por lo cual la sonda de captura puede inmovilizarse directamente en su extremo 3’ o a través de un conector entre su extremo 3’ y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector puede unirse a cada nucleótido del tramo de secuencia que es complementaria con el ácido nucleico según la presente invención. El conector puede estar formado por conectores hidrófilos conocidos por los expertos en la técnica o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados,
nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-ADL, nucleótidos de ADP, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-ARL.
El número de nucleótidos de la sonda de captura y de detección que pueden hibridarse con el ácido nucleico según la presente invención es variable y dependerá del número de nucleótidos de la sonda de captura y/o de detección y/o del propio ácido nucleico según la presente invención. El número total de nucleótidos de la sonda de captura y de detección que pueden hibridarse con el ácido nucleico según la presente invención debe ser el máximo número de nucleótidos que comprende el ácido nucleico según la presente invención. El número mínimo de nucleótidos (de 2 a 10 nucleótidos) de la sonda de detección y de captura debe permitir la hibridación con el extremo 5’ o el extremo 3’, respectivamente, del ácido nucleico según la presente invención. Para conocer la alta especificidad y selectividad entre el ácido nucleico según la presente invención y otros ácidos nucleicos que aparecen en muestras que se analizan, el número total de nucleótidos de la sonda de captura y de detección debe ser el máximo número de nucleótidos que comprende el ácido nucleico según la presente invención.
Además, la sonda de detección preferiblemente porta una molécula marcadora o marcador que puede detectarse como se ha descrito previamente en la presente. El marcador o molécula marcadora puede unirse, en principio, a cada nucleótido de la sonda de detección. Preferiblemente, el marcador o molécula marcadora está localizado en el extremo 5’ o el extremo 3’ de la sonda de detección, por lo cual puede insertarse un conector entre los nucleótidos dentro de la sonda de detección que son complementarios con el ácido nucleico según la presente invención y el marcador. El conector puede estar formado por conectores hidrófilos conocidos por los expertos en la técnica o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-ADL, nucleótidos de ADP, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-ARL.
La detección del ácido nucleico según la presente invención puede realizarse como sigue:
El ácido nucleico según la presente invención se hibrida a través de uno de sus extremos con la sonda de captura y a través del otro extremo con la sonda de detección. Después, la sonda de detección no unida se retira, por ejemplo, mediante una o varias etapas de lavado. La cantidad de la sonda de detección unida que preferiblemente porta un marcador o molécula marcadora después puede medirse.
Tal como se emplea preferiblemente en la presente, los términos enfermedad y trastorno se emplean de modo intercambiable, si no se indica lo contrario.
Tal como se emplea en la presente, el término comprende preferiblemente no pretende limitar el aspecto que sigue a dicho término o que es descrito por dicho término. Sin embargo, en una realización alternativa, debe entenderse que el término “comprende” significa “que contiene” y, por tanto, limita el aspecto que sigue a dicho término o que es descrito por dicho término.
Las diversas SEQ ID NO, la naturaleza química de las moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención y las moléculas diana de SDF-1, tal como se emplean en la presente, y su secuencia real y su número de referencia interno se resumen en la siguiente tabla.
Debe advertirse que los ácidos nucleicos se caracterizaron con el aptámero, es decir, al nivel de D-ácido nucleico (D-ARN) con la D-SDF-1 humana biotinilada (SEQ ID NO:4) o al nivel de spiegelmero, es decir, L-ácido nucleico (L-ARN) con la configuración natural de la SDF-1, la L-SDF-1 (SDF-1 α humana, SEQ ID NO:1). Los diferentes ácidos nucleicos comparten un nombre de referencia interna, pero una SEQ ID para la molécula de D-ARN (aptámero) y una SEQ ID para la molécula de L-ARN (spiegelmero), respectivamente.
Tabla 1(A)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
1
L-péptido SDF-1α humana/de mono/de gato, SDF-1 humana/de mono/de gato
2
L-péptido SDF-1β humana/de mono/de gato
3
L-péptido SDF-1α murina
4
D-péptido D-SDF-1 humana biotinilada
5
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001
6
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-G10
7
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCGCAGC 192-F10
8
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-B11
9
L-ARN (spiegelmero) GCUGUAAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-C9
10
L-ARN (spiegelmero) GCUGUAAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-E10
11
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-C10
12
L-ARN (spiegelmero) GCAGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-D11
13
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACUGC 192-G11
14
L-ARN (spiegelmero) GCUAUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCAUAGC 192-H11
15
L-ARN (spiegelmero) GCUGCGAAAGCGACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-D10
16
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCACAGC 192-E9
17
L-ARN (spiegelmero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-H9
Tabla 1(B)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
18
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGAAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAACCACGCU 191-A6
19
L-ARN (spiegelmero) AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC; XA = A o ausente Fórmula 1 de tipo A
20
L-ARN (spiegelmero) AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC Fórmula 2 de tipo A
21
L-ARN (spiegelmero) AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC Fórmula 3 de tipo A
22
L-ARN (spiegelmero) AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC Fórmula 4 de tipo A
23
L-RNA (SPIEGELMER RSHRYR Fórmula 5-5' de tipo A
24
L-RNA (SPIEGELMER YRYDSY Fórmula 5-3' de tipo A
25
L-ARN (spiegelmero) CUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAG 192-A10-002
26
L-ARN (spiegelmero) UGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCA 192-A10-003
27
L-ARN (spiegelmero) GUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGC 192-A10-004
28
L-ARN (spiegelmero) UGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCG 192-A10-005
29
L-ARN (spiegelmero) GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
30
L-ARN (spiegelmero) AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
31
L-ARN (spiegelmero) GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
32
L-ARN (spiegelmero) GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
33
L-ARN (spiegelmero) GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
34
L-ARN (spiegelmero) CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
35
L-ARN (spiegelmero) GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
36
L-ARN (spiegelmero) GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
Tabla 1(C)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
37
L-ARN (spiegelmero) CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
38
L-ARN (spiegelmero) GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
39
L-ARN (spiegelmero) GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
40
L-ARN (spiegelmero) GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
41
L-ARN (spiegelmero) CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
42
L-ARN (spiegelmero) X2BBBS; X2 = S o ausente Fórmula 6-5' de tipo A
43
L-ARN (spiegelmero) SBBVX3; X3 = S o ausente Fórmula 6-3' de tipo A
44
L-ARN (spiegelmero) X1X2NNBV; X1 = R o ausente, X2 = S o ausente Fórmula 7-5' de tipo A
45
L-ARN (spiegelmero) BNBNX3X4; X3 = R o ausente, X4 = Y o ausente Fórmula 7-3' de tipo A
46
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-C2-001
47
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-G2-001
48
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGCU 193-F2-001
49
L-ARN (spiegelmero) GCGAGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-G1-002
50
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-D2-002
51
L-ARN (spiegelmero) GCAUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCCC 193-A1-002
52
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGGACGC 193-D3-002
26 Tabla 1(D)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
53
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-B3-002
54
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-H3-002
55
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGUUCCUAGUCAGGUAUGC 193-E3-002
56
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUUAGGUACGC 193-D1-002
57
L-ARN (spiegelmero) GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG Fórmula 1 de tipo B
58
L-ARN (spiegelmero) GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG Fórmula 2 de tipo B
59
L-ARN (spiegelmero) X1GCRWG; X1 = A o ausente Fórmula 3-5' de tipo B
60
L-ARN (spiegelmero) KRYSCX4; X4 = U o ausente Fórmula 3-3' de tipo B
61
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-C2-002
62
L-ARN (spiegelmero) CGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACG 193-C2-003
63
L-ARN (spiegelmero) GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUAC 193-C2-004
64
L-ARN (spiegelmero) UGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUA 193-C2-005
65
L-ARN (spiegelmero) GGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGU 193-C2-006
66
L-ARN (spiegelmero) GUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGG 193-C2-007
67
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-G2-012
27 Tabla 1(E)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
68
L-ARN (spiegelmero) GCGCGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGCGCGC 193-G2-013
69
L-ARN (spiegelmero) GCGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCGC 193-G2-014
70
L-ARN (spiegelmero) GGGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCCC 193-G2-015
71
L-ARN (spiegelmero) GGCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGCC 193-G2-016
72
L-ARN (spiegelmero) GCCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGGC 193-G2-017
73
L-ARN (spiegelmero) X2SSBS; X2 = G o ausente Fórmula 4-5' de tipo B
74
L-ARN (spiegelmero) BVSSX3; X3 = C o ausente Fórmula 4-3' de tipo B
75
L-ARN (spiegelmero) X1GCGUG; X1 = A o ausente Fórmula 5-5' de tipo B
76
L-ARN (spiegelmero) UACGCX4; X4 = U o ausente Fórmula 5-3' de tipo B
77
L-ARN (spiegelmero) X1X2SVNS; X1 = A o ausente, X2 = G o ausente Fórmula 6-5' de tipo B
78
L-ARN (spiegelmero) BVBSX3X4; X3 = C o ausente, X4 = U o ausente Fórmula 6-3' de tipo B
79
L-ARN (spiegelmero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
80
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
81
L-ARN (spiegelmero) GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
82
L-ARN (spiegelmero) CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCACG 190-A3-001
83
L-ARN (spiegelmero) AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
Tabla 1(F)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
84
L-ARN (spiegelmero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGC AC 197-H3
85
L-ARN (spiegelmero) GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGC AC 197-B1
86
L-ARN (spiegelmero) GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGC AC 197-E3
87
L-ARN (spiegelmero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGC AC 197-H2
88
L-ARN (spiegelmero) GUGCUGCCGGGGUUAGGGCUAA-AGUCGGCCGACAGCAC 197-D1
89
L-ARN (spiegelmero) GUGCUGUGGGGGUCAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGC AC 197-D2
90
L-ARN (spiegelmero) GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG; XA = A o ausente Fórmula 1 de tipo C
91
L-ARN (spiegelmero) GGUYAGGGCUHRAAGUCGG Fórmula 2 de tipo C
92
L-ARN (spiegelmero) GGUYAGGGCUHRAGUCGG Fórmula 3 de tipo C
93
L-ARN (spiegelmero) GGUUAGGGCUHGAAGUCGG Fórmula 4 de tipo C
94
L-ARN (spiegelmero) UGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCA 190-A3-003
95
L-ARN (spiegelmero) GAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUC 190-A3-004
96
L-ARN (spiegelmero) GGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCU 190-A3-007
97
L-ARN (spiegelmero) GCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGC 191-D5-002
98
L-ARN (spiegelmero) CGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACG 191-D5-003
99
L-ARN (spiegelmero) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACCG 191-D5-004
100
L-ARN (spiegelmero) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCCG 191-D5-005
Tabla 1(G)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
101
L-ARN (spiegelmero) CGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCG 191-D5-006
102
L-ARN (spiegelmero) CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007
103
L-ARN (spiegelmero) GGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCC 191-D5-010
(spiegelmero)
104
L-ARN (spiegelmero) CCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGG 191-D5-017
105
L-ARN (spiegelmero) CCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGG 191-D5-029
106
L-ARN (spiegelmero) GGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCC 191-D5-024
107
L-ARN (spiegelmero) CCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGG 191-D5-017-29a
108
L-ARN (spiegelmero) GCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGC 191-D5-017-29b
109
L-ARN (spiegelmero) CCCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGGG 191-D5-019-29a
110
L-ARN (spiegelmero) CGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCG 191-D5-024-29a
111
L-ARN (spiegelmero) GGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCC 191-D5-024-29b
112
L-ARN (spiegelmero) UGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCA 197-B2-001
113
L-ARN (spiegelmero) GCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGC 197-B2-002
114
L-ARN (spiegelmero) CUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAG 197-B2-003
115
L-ARN (spiegelmero) UGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCA 197-B2-004
116
L-ARN (spiegelmero) GCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGC 197-B2-005
Tabla 1(H)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
117
L-ARN (spiegelmero) GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006
118
L-ARN (spiegelmero) GGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCC 197-B2-006-31a
119
L-ARN (spiegelmero) CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b
120
L-ARN (spiegelmero) RKSBUSNVGR Fórmula 5-5' de tipo C
121
L-ARN (spiegelmero) YYNRCASSMY Fórmula 5-3' de tipo C
122
L-ARN (spiegelmero) RKSBUGSVGR Fórmula 6-5' de tipo C
123
L-ARN (spiegelmero) YCNRCASSMY Fórmula 6-3' de tipo C
Tabla 1(I)
124
L-ARN (spiegelmero) XSSSSV; XS = S o ausente Fórmula 7-5' de tipo C
125
L-ARN (spiegelmero) BSSSXS; XS = S o ausente Fórmula 7-3' de tipo C
126
L-ARN (spiegelmero) SGGSV Fórmula 8-5' de tipo C
127
L-ARN (spiegelmero) YSCCS Fórmula 8-3' de tipo C
128
L-ARN (spiegelmero) GCSGG Fórmula 9-5' de tipo C
129
L-ARN (spiegelmero) CCKGC Fórmula 9-3' de tipo C
130
L-ARN (spiegelmero) SSSSR Fórmula 10-5' de tipo C
131
L-ARN (spiegelmero) YSBSS Fórmula 10-3' de tipo C
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
132
L-ARN (spiegelmero) 193-G2-012-5'-PEG
133
L-ARN (spiegelmero) 5'-40 kDa-PEG-GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008-5'-PEG
134
L-ARN (spiegelmero) 5'-40 kDa-PEG-CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007-5'-PEG
135
L-ARN (spiegelmero) 5'-40 kDa-PEG-GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006-5'-PEG
136
L-ARN (spiegelmero) 5'-40 kDa-PEG-CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b-5'PEG
137
L-ARN (spiegelmero) 192-A10-001-5'-PEG, 192-A10-001-5'-PEG40
138
L-ARN (spiegelmero) UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU spiegelmero control
139
L-ARN (spiegelmero) 192-A10-001-5'-PEG30
140
L-ARN (spiegelmero) 192-A10-001-5'-HES100
141
L-ARN (spiegelmero) 192-A10-001-5'-HES130
142
L-ARN (spiegelmero) CGUGGUCCGUUGUGUCAGGUCUAUUCGCCCCGGUGCAGGGCAUCCGCG 194-A2-001
143
L-ARN (spiegelmero) GCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAGGUGAG 196-B12-003
144
L-ARN (spiegelmero) CAACAGCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAG 196-B12-004
Tabla 1(J)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
145
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001
146
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-G10
147
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCGCAGC 192-F10
148
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-B11
149
D-ARN (aptámero) GCUGUAAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-C9
150
D-ARN (aptámero) GCUGUAAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-E10
151
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-C10
152
D-ARN (aptámero) GCAGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-D11
153
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACUGC 192-G11
154
D-ARN (aptámero) GCUAUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCAUAGC 192-H11
155
D-ARN (aptámero) GCUGCGAAAGCGACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-D10
156
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCACAGC 192-E9
157
D-ARN (aptámero) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-H9
158
D-ARN (aptámero) AGCGUGAAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAACCACGCU 191-A6
159
D-ARN (aptámero) CUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAG 192-A10-002
160
D-ARN (aptámero) UGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCA 192-A10-003
Tabla 1(K)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
161
D-ARN (aptámero) GUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGC 192-A10-004
162
D-ARN (aptámero) UGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCG 192-A10-005
163
D-ARN (aptámero) GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
164
D-ARN (aptámero) AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
165
D-ARN (aptámero) GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
166
D-ARN (aptámero) GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
167
D-ARN (aptámero) GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
168
D-ARN (aptámero) CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
169
D-ARN (aptámero) GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
170
D-ARN (aptámero) GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
171
D-ARN (aptámero) CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
172
D-ARN (aptámero) GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
173
D-ARN (aptámero) GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
174
D-ARN (aptámero) GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
175
D-ARN (aptámero) CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
176
D-ARN (aptámero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-C2-001
34 Tabla 1(L)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
177
D-ARN (aptámero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-G2-001
178
D-ARN (aptámero) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGCU 193-F2-001
179
D-ARN (aptámero) GCGAGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-G1-002
180
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-D2-002
181
D-ARN (aptámero) GCAUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCCC 193-A1-002
182
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGGACGC 193-D3-002
183
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-B3-002
184
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-H3-002
185
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGUUCCUAGUCAGGUAUGC 193-E3-002
186
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUUAGGUACGC 193-D1-002
187
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-C2-002
188
D-ARN (aptámero) CGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACG 193-C2-003
189
D-ARN (aptámero) GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUAC 193-C2-004
190
D-ARN (aptámero) UGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUA 193-C2-005
191
D-ARN (aptámero) GGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGU 193-C2-006
35 Tabla 1(M)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
192
D-ARN (aptámero) GUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGG 193-C2-007
193
D-ARN (aptámero) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-G2-012
194
D-ARN (aptámero) GCGCGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGCGCGC 193-G2-013
195
D-ARN (aptámero) GCGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCGC 193-G2-014
196
D-ARN (aptámero) GGGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCCC 193-G2-015
197
D-ARN (aptámero) GGCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGCC 193-G2-016
198
D-ARN (aptámero) GCCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGGC 193-G2-017
199
D-ARN (aptámero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
200
D-ARN (aptámero) AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
201
D-ARN (aptámero) GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
202
D-ARN (aptámero) CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCACG 190-A3-001
203
D-ARN (aptámero) AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
204
D-ARN (aptámero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGCAC 197-H3
205
D-ARN (aptámero) GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGCAC 197-B1
Tabla 1(N)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
206
D-ARN (aptámero) GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-E3
207
D-ARN (aptámero) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-H2
208
D-ARN (aptámero) GUGCUGCCGGGGUUAGGGCUAA-AGUCGGCCGACAGCAC 197-D1
209
D-ARN (aptámero) GUGCUGUGGGGGUCAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-D2
210
D-ARN (aptámero) UGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCA 190-A3-003
211
D-ARN (aptámero) GAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUC 190-A3-004
212
D-ARN (aptámero) GGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCU 190-A3-007
213
D-ARN (aptámero) GCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGC 191-D5-002
214
D-ARN (aptámero) CGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACG 191-D5-003
215
D-ARN (aptámero) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACCG 191-D5-004
216
D-ARN (aptámero) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCCG 191-D5-005
217
D-ARN (aptámero) CGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCG 191-D5-006
218
D-ARN (aptámero) CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007
219
D-ARN (aptámero) GGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCC 191-D5-010
220
D-ARN (aptámero) CCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGG 191-D5-017
221
D-ARN (aptámero) CCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGG 191-D5-029
222
D-ARN (aptámero) GGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCC 191-D5-024
223
D-ARN (aptámero) CCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGG 191-D5-017-29a
Tabla 1(O)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
224
D-ARN (aptámero) GCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGC 191-D5-017-29b
225
D-ARN (aptámero) CCCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGGG 191-D5-019-29a
226
D-ARN (aptámero) CGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCG 191-D5-024-29a
227
D-ARN (aptámero) GGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCC 191-D5-024-29b
228
D-ARN (aptámero) UGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCA 197-B2-001
229
D-ARN (aptámero) GCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGC 197-B2-002
230
D-ARN (aptámero) CUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAG 197-B2-003
231
D-ARN (aptámero) UGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCA 197-B2-004
232
D-ARN (aptámero) GCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGC 197-B2-005
233
D-ARN (aptámero) GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006
234
D-ARN (aptámero) GGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCC 197-B2-006-31a
235
D-ARN (aptámero) CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b
236
D-ARN (aptámero) CGUGGUCCGUUGUGUCAGGUCUAUUCGCCCCGGUGCAGGGCAUCCGCG 194-A2-001
236
D-ARN (aptámero) GCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAGGUGAG 196-B12-003
238
D-ARN (aptámero) CAACAGCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAG 196-B12-004
38 5
Tabla 1(P)
SEQ ID
ARN/péptido Secuencia Referencia interna
239
L-ARN (spiegelmero) 5'-PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU spiegelmero control PEGilado
240
L-ARN (spiegelmero) GATCACACCACGC-(C18-PEG-espaciador)-(C18-PEGespaciador)-1-NH2-3' sonda de captura 193-G2-012-5'-PEG
241
L-ARN (spiegelmero) 5'-NH2-(C18-PEG-espaciador)-(C18-PEG-espaciador)-GCGUACCUGAC sonda de detección 193-G2-012-5'-PEG
La invención se ilustra más a fondo mediante las figuras, los ejemplos y el listado de secuencias a partir de los cuales pueden obtenerse otras características, realizaciones y ventajas.
La figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados que se unen a la SDF-1 humana que indica el motivo de secuencia ("tipo A") que, en una realización preferida, es en su totalidad fundamental para la unión a la SDF-1 humana. La figura 2A muestra derivados del ligando de ARN 192-A10-001 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo A"). La figura 2B muestra derivados del ligando de ARN 192-A10-001 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo A"). La figura 3 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados que se unen a la SDF-1 humana que indica el motivo de secuencia ("tipo B") que, en una realización preferida, es en su totalidad fundamental para la unión a la SDF-1 humana. La figura 4A muestra derivados de los ligandos de ARN 193-C2-001 y 193-G2-001 (ligandos de ARN de SDF1 humana con motivo de secuencia de "tipo B"). La figura 4B muestra derivados de los ligandos de ARN 193-C2-001 y 193-G2-001 (ligandos de ARN de SDF1 humana con motivo de secuencia de "tipo B"). La figura 5 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados que se unen a la SDF-1 humana que indica el motivo de secuencia ("tipo C") que, en una realización preferida, es en su totalidad fundamental para la unión a la SDF-1 humana. La figura 6 muestra derivados del ligando de ARN 190-A3-001 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo C"). La figura 7A muestra derivados del ligando de ARN 190-D5-001 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo C"). La figura 7B muestra derivados del ligando de ARN 190-D5-001 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo C"). La figura 8 muestra derivados del ligando de ARN 197-B2 (ligando de ARN de SDF-1 humana con motivo de secuencia de "tipo C"). La figura 9 muestra otros ligandos de ARN que se unen a la SDF-1 humana. La figura 10 muestra la quimiotaxis inducida por SDF-1 humana de células de leucemia de células T humanas de Jurkat, en la que, después de 3 horas de migración de las células de leucemia de células T humanas de Jurkat hacia diversas concentraciones de SDF-1 humana, se obtiene una curva de dosis-respuesta para la SDF-1 humana, y se representa como una señal de fluorescencia frente a la concentración de SDF-1 humana. La figura 11 muestra el resultado de un análisis de unión del aptámero de unión a la SDF-1 humana 192-A10001 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, representado como la unión del aptámero frente a la concentración de D-SDF-1 humana biotinilada. La figura 12 muestra la eficacia del spiegelmero de unión a la SDF-1 humana 192-A10-001 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades del spiegelmero 192-A10-001, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración del spiegelmero 192-A10-001. La figura 13 muestra el resultado de un análisis de unión competitiva de los aptámeros de unión a la SDF-1 humana 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 y 192-H9-001 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, y se representa como la unión del aptámero marcado 192-A10-001 (empleado como referencia que es desplazado por los aptámeros no marcados) a 1 nM y 5 nM de los aptámeros no marcados 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9
001 y 192-H9-001. La figura 14 muestra el resultado de un análisis de unión del aptámero de unión a la SDF-1 humana 192-A10008 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, y se representa como la unión del aptámero frente a la concentración de D-SDF-1 humana biotinilada. La figura 15 muestra un sensograma Biacore 2000 que indica el valor de KD del spiegelmero de unión a SDF1 humana 192-A10-008 que se une a la SDF-1 humana que ha sido inmovilizada sobre un chip detector PioneerF1 mediante un procedimiento de acoplamiento de amina, y se representa como la respuesta (RU) frente al tiempo, y también se listan las constantes de asociación y de afinidad y los valores de KD de los spiegelmeros 192-A10-008 y 192-A10-001. La figura 16 muestra la eficacia del spiegelmero de unión a la SDF-1 192-A10-008 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades del spiegelmero 192-A10-008, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración del spiegelmero 192-A10-008. La figura 17 muestra un sensograma Biacore 2000 que indica el valor de KD del spiegelmero 193-G2-01 que se une a la SDF-1 humana que ha sido inmovilizada sobre un chip detector PioneerF1 mediante un procedimiento de acoplamiento de amina, y se representa como la respuesta (RU) frente al tiempo, y también se listan las constantes de asociación y de afinidad y los valores de KD de los spiegelmeros 193-G2-001 y 193-C2-001. La figura 18 muestra el resultado de un análisis de unión del aptámero de unión a la SDF-1 humana 193-G2012 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, y se representa como la unión del aptámero frente a la concentración de D-SDF-1 humana biotinilada. La figura 19 muestra el resultado de un análisis de unión competitiva de los aptámeros de unión a la SDF-1 humana 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5004, 191-D5-005, 191-D5-006 y 191-D5-007 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, y se representa como la unión del aptámero marcado 190-A3-001 o 191-D5-001 (empleado como referencia que es desplazado por los aptámeros no marcados) a 500 nM, 50 nM y 10 nM de los aptámeros no marcados 190-A3-001, 190-A3003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 y 191-D5-007. La figura 20 muestra el resultado de un análisis de unión de los aptámeros de unión a la SDF-1 humana 190A3-004 y 191-D5-007 a la D-SDF-1 humana biotinilada a 37 °C, y se representa como la unión del aptámero frente a la concentración de D-SDF-1 humana biotinilada. La figura 21 muestra un sensograma Biacore 2000 que indica el valor de KD del spiegelmero 191-D5-007 que se une a la SDF-1 humana que ha sido inmovilizada sobre un chip detector PioneerF1 mediante un procedimiento de acoplamiento de amina, y se representa como la respuesta (RU) frente al tiempo, y también se listan las constantes de asociación y de afinidad y los valores de KD de los spiegelmeros 191-D5-001, 191D5-007, 190-A3-003 y 197-B2. La figura 22 muestra la eficacia del spiegelmero de unión a la SDF-1 190-A3-004 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades del spiegelmero 190-A3-004, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración del spiegelmero 190-A3-004. La figura 23A muestra la eficacia de los spiegelmeros de unión a la SDF-1 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG y 191-A10-008-5’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de los spiegelmeros 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG y 191-A10-008-5’-PEG, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración de los spiegelmeros 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG y 191-A10-008-5’-PEG. La figura 23B muestra la eficacia de los spiegelmeros de unión a la SDF-1 197-B2-006-5’-PEG y 197-B2-006-31b-5’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de los spiegelmeros 197-B2-006-5’-PEG y 197-B2-006-31b-5’-PEG, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración de los spiegelmeros 197-B2-006-5’-PEG y 197-B2-006-31b-5’-PEG. La figura 24A muestra un sensograma Biacore 2000 que indica el valor de KD de los spiegelmeros 193-G2-012-5’-PEG, 191-A10-008-5’-PEG y 191-A10-001-5’-PEG que se unen a la SDF-1 humana que ha sido inmovilizada sobre un chip detector PioneerF1 mediante un procedimiento de acoplamiento de amina, y se representa como la respuesta (RU) frente al tiempo. La figura 24B muestra un sensograma Biacore 2000 que indica el valor de KD de los spiegelmeros 197-B2-006-5’-PEG, 197-B2-006-31b-5’-PEG y 191-D5-007-5’-PEG que se unen a la SDF-1 humana que ha sido inmovilizada sobre un chip detector PioneerF1 mediante un procedimiento de acoplamiento de amina, y se representa como la respuesta (RU) frente al tiempo. La figura 25A muestra la eficacia de los spiegelmeros de unión a la SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5’-HES130 y 192-A10-001-5’-HES100 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de los spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10001-5’-HES130 y 192-A10-001-5’-HES100, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración de los spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-HES130 y 192-A10-001-5’-HES100. La figura 25B muestra la eficacia de los spiegelmeros de unión a la SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 y 192-A10-001-5’-PEG40 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1
humana 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de los spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 y 192-A10-001-5’-PEG40, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración de los spiegelmeros192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 y 192-A10-001-5’-PEG40. La figura 26 muestra la ineficacia de un spiegelmero control en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 humana o murina 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de spiegelmero control, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración del spiegelmero control. La figura 27 muestra la quimiotaxis inducida por SDF-1 murina de células de leucemia de células T humanas de Jurkat, en la que, después de 3 horas de migración de las células de leucemia de células T humanas de Jurkat hacia diversas concentraciones de SDF-1, se obtiene una curva de dosis-respuesta para la SDF-1, y se representa como una señal de fluorescencia. La figura 28 muestra la eficacia de los spiegelmeros de unión a la SDF-1 192-A10-001 y 191-D5-007-5’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia SDF-1 murina 0,3 nM preincubada a 37 °C con diversas cantidades de los spiegelmeros 192-A10-001 y 191-D5-007-5TEG, y se representa como el porcentaje del control frente a la concentración de los spiegelmeros 192-A10-001 y 191-D5-007-5’-PEG-La figura 29 muestra la eficacia del spiegelmero de unión a la SDF-1 192-A10-001 en un ensayo de unión al receptor CXCR4 empleando [125J]-SDF-1α que había sido preincubada a 37 °C con diversas cantidades del spiegelmero 192-A10-001, y la [125J]-SDF-1α unida específicamente se representó frente a la concentración del spiegelmero 192-A10-001. La figura 30 muestra la inhibición de la estimulación de MAP-quinasa de células que expresan CXCR4 con SDF-1α humana 1 nM mediante el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 192-A10-001. La figura 31 muestra la inhibición de la germinación inducida por SDF-1 por el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG y por un spiegelmero control PEGilado en un ensayo de germinación del anillo aórtico, en el que anillos de aorta de rata se introducen en una matriz de colágeno y se incuban durante 6 días con SDF-1 con o sin spiegelmeros (a: control; b: SDF-1 10 nM; c: SDF-1 10 nM + spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG 1 µM; d: SDF-1 10 nM + spiegelmero control PEGilado 1 µM). La figura 32 muestra la inhibición de la germinación inducida por SDF-1 por el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG y por un spiegelmero control PEGilado en un ensayo de germinación del anillo aórtico, en el que los índices de germinación se muestran como promedio +/-DE para 5 anillos por condición (*: el valor de SDF-1 es significativamente diferente del control (ensayo de Mann-Whitney; p = 0,009); **: el valor para SDF-1 + spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG es significativamente diferente del valor para SDF-1 (ensayo de Mann-Whitney; p = 0,028). La figura 33 muestra el nivel plasmático del spiegelmero de unión a SDF-1 193-G2-012-5’-PEG y SDF-1 en ratas después de una inyección en embolada intravenosa del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG en comparación con el nivel plasmático de SDF-1 de una rata que no ha sido tratada con el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG, en el que el nivel plasmático del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG y la SDF-1 se determinó a lo largo de un periodo de 96 horas.
Ejemplo 1: Ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 humana Empleando la D-SDF-1 humana biotinilada como diana, pueden generarse varios ácidos nucleicos que se unen a la SDF-1 humana, cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en las figuras 1 a 9. Los ácidos nucleicos se caracterizaron con el aptámero, es decir, al nivel de D-ácido nucleico con la D-SDF-1 humana biotinilada o al nivel de spiegelmero, es decir, el L-ácido nucleico con la configuración natural de la SDF-1 (L-SDF-1).
Los aptámeros se analizaron con la D-SDF-1 humana biotinilada empleando ensayos de unión de abatimiento ("pulldown") directos o competitivos con D-SDF-1 humana biotinilada (ejemplo 4). Los spiegelmeros se ensayaron con la configuración natural de la SDF-1 (L-SDF-1) mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento Biacore 2000 (ejemplo 6) y un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (ejemplo 5).
Las moléculas de ácidos nucleicos generadas de este modo muestran diferentes motivos de secuencia y se definen tres tipos principales en las figuras 1, 2A y 2B (tipo A), figuras 3, 4A y 4B (tipo B), figuras 5, 6, 7A, 7B y 8 (tipo C). Para la definición de los motivos de secuencias de nucleótidos se emplearon las abreviaturas de la IUPAC para nucleótidos ambiguos:
S
fuerte G o C
W
débil A o U
R
purina G o A
Y
pirimidina C o U
K
ceto G o U
M
imino A o C
B
no A C o U o G
D
no C A o G o U
H
no G A o C o U
V
no U A o C o G
N
todos A o G o C o U
Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia de tramos y cajas, respectivamente, se indica en la dirección 5’ → 3’.
1.1 Ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A
Tal como se muestra en la figura 1, todas las secuencias de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A comprenden una secuencia de nucleótidos central que está flanqueada por tramos 5’-y 3’-terminales que pueden hibridarse entre sí. Sin embargo, esta hibridación no se produce necesariamente en la molécula.
Los ácidos nucleicos se caracterizaron al nivel del aptámero empleando ensayos de abatimiento competitivos y directos con D-SDF-1 humana biotinilada para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como spiegelmeros (ejemplo 3) y se ensayaron empleando la configuración natural de la SDF-1 (L-SDF) en un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (ejemplo 5) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento Biacore 2000 (ejemplo 6).
Las secuencias de las cajas o tramos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A, lo cual influye en la afinidad de unión con la SDF-1. Basándose en el análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos de unión a SDF-1, resumidos como ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A, la secuencia de nucleótidos central y sus secuencias de nucleótidos, tal como se describen a continuación, son individual y más preferiblemente fundamentales en su totalidad para la unión a SDF-1:
La secuencia de nucleótidos central de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A comparten la secuencia AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC (fórmula 1 de tipo A), en la que XA está ausente o es ’A’. Si ’A’ está ausente, la secuencia de nucleótidos central puede resumirse como fórmula 2 de tipo A (AAAGYRACAHGMAAUGAAAGGUARC). El ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 191-A6 (secuencia de nucleótidos central: AAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAAC) que porta el nucleótido adicional ’A’ dentro de la secuencia de nucleótidos central y que sigue uniéndose a la SDF-1 permite considerar una secuencia de nucleótidos central alternativa (AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC, fórmula 3 de tipo A). Como ejemplo de todos los demás ácidos nucleicos de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A, se caracterizó el ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001 por su afinidad de unión a la SDF-1 humana. La constante de unión en equilibrio KD se determinó empleando el ensayo de unión de abatimiento (KD = 1,5 nM, figura 11) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 1,0 nM, figura 15). Se midió una CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,12 nM para 192-A10-001 empleando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (figura 12). Por consiguiente, todos los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A, según se muestra en la figura 1, se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a 192-A10-001 (figura 13; no todos los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A ensayados se muestran en la figura 13). Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A 192-B11 y 192-C10 muestran unas afinidades de unión iguales a la de 192-A10-001 en estos experimentos de competición. Se determinó una afinidad de unión más débil para los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 y 191-A6. Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A 192-D10, 192-E9 y 192-H9 tienen una afinidad de unión mucho más débil que 192-A10-001 (figura 13).
Tal como se mencionó anteriormente, los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A 192-B11 y 192-C10 muestran una afinidad de unión a la SDF-1 igual que la de 192-A10-001. Sin embargo, muestran ligeras diferencias en la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos central. Por tanto, la secuencia consenso de las tres moléculas de unión a SDF-1 con casi la misma afinidad alta puede resumirse mediante la secuencia de nucleótidos:
en la que la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos central de 192-A10-001 (secuencia de nucleótidos:
representa la secuencia de nucleótidos con la mejor afinidad de unión de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A.
Cinco o seis de los seis nucleótidos del tramo 5’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A pueden hibridarse con los respectivos cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos del tramo 3’-terminal de los ácidos
nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A para formar una hélice terminal. Aunque estos nucleótidos son variables en varias posiciones, los diferentes nucleótidos permiten la hibridación de cinco o seis de los seis nucleótidos de cada uno de los tramos 5’-y 3’-terminales. Los tramos 5’-terminal y 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A, tal como se muestran en la figura 1, pueden resumirse con una fórmula genérica para el tramo 5’-terminal (’RSHRYR’, fórmula 5-5’ de tipo A) y para el tramo 3’-terminal (’YRYDSY’, fórmula 5-3’ de tipo A). Los derivados truncados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001 se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a la molécula original 192-A10-001 y 192-A10-008 (figuras 2A y 2B). Estos experimentos demuestran que una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5’: GCUGUG; extremo 3’: CGCAGC) de 192-A10-001 a cinco nucleótidos (extremo 5’: CUGUG; extremo 3’: CGCAG) del derivado 192-A10002 pueden realizarse sin que se produzca una reducción de la afinidad de unión. Sin embargo, el truncamiento a cuatro nucleótidos terminales (extremo 5’: UGUG; extremo 3’: CGCA; 192-A10-003) o menos (192-A10-004/ -005/ 006/ -007), conduce a una afinidad de unión por SDF-1 reducida (figura 2A). Los tramos terminales 5’-terminal y 3’terminal determinados con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001, tal como se muestran en las figuras 2A y B, pueden describirse con una fórmula genérica para el tramo 5’-terminal (’X2BBBS’, fórmula 6-5’ de tipo A) y para el tramo 3’-terminal (’SBBVX3’; fórmula 63’ de tipo A), en la que X2 está ausente o es ’S’, y X3 está ausente o es ’S’.
La secuencia de nucleótidos de los tramos 5’-y 3’-terminales influye en la afinidad de unión de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A. Esto no solo lo demuestran los ácidos nucleicos 192-F10 y 192-E10, sino también los derivados de 192-A10-001 (figura 2B). Las secuencias de nucleótidos centrales de 192-F10 y 192-E10 son idénticas a 192-B11 y 192-C10, pero comprenden ligeras diferencias en el extremo 3’ del tramo 5’-terminal y en el extremo 5’ del tramo 3’-terminal que producen una afinidad de unión reducida.
La sustitución de los nucleótidos 5’-y 3’-terminales ’CUGUG’ y ’CGCAG’ del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-002 por ’GCGCG’ y ’CGCGC’ (192-A10-015) produjo una afinidad de unión reducida, mientras que las sustituciones por ’GCGUG’ y ’CGCGC’ (192-A10-008) produjeron la misma afinidad de unión que muestra 192-A10002 (figura 2B, figura 15, figura 12, figura 16). Además, nueve derivados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001 (192-A10-014/ -015/ -016/ -017/ -018/ -019/ -020/ -021/ -022/ -023) que portan cuatro nucleótidos 5’y 3’-terminales, respectivamente, se ensayaron como aptámeros para su afinidad de unión frente a 192-A10-001 o a su derivado 192-A10-008 (ambos tienen idéntica afinidad de unión con SDF-1). Todos los clones mostraron una afinidad de unión más débil, mucho más débil o muchísimo más débil por SDF-1 que 192-A10-001 (seis nucleótidos que forman una hélice terminal) o que 192-A10-008 con cinco nucleótidos terminales, respectivamente (figura 2B). Por consiguiente, la secuencia y el número de nucleótidos de los tramos 5’-y 3’-terminales son fundamentales para una unión eficaz con la SDF-1. Tal como se demuestra para los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A 192A10-002 y 192-A10-08, la combinación preferida de tramos 5’-y 3’-terminales es ’CUGUG’ y ’CGCAG’ (tramos 5’-y 3’-terminales del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-002) y ’GCGUG’ y ’CGCGC’ (tramos 5’-y 3’terminales del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-008).
Sin embargo, combinando los tramos 5’-y 3’-terminales de todos los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A ensayados, la fórmula genérica para el tramo 5’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A es ’X1X2NNBV’ (fórmula 7-5’ de tipo A) y la fórmula genérica para el tramo 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo A es ’BNBNX3X4’ (fórmula 7-3’ de tipo A), en las que
X1 es ’R’ o está ausente, X2 es ’S’, X3 es ’S’, y X4 es ’Y’ o está ausente;
o
X1 está ausente, X2 es ’S’ o está ausente, X3 es ’S’ o está ausente, y X4 está ausente.
1.2 Ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B Tal como se muestra en la figura 3, todas las secuencias de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B comprenden una secuencia de nucleótidos central que está flanqueada por tramos 5’-y 3’-terminales que pueden hibridarse entre sí. Sin embargo, esta hibridación no se produce necesariamente en la molécula.
Los ácidos nucleicos se caracterizaron al nivel del aptámero empleando ensayos de abatimiento competitivos y directos con D-SDF-1 humana biotinilada para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como spiegelmeros (ejemplo 3) y se ensayaron empleando la configuración natural de la SDF-1 (L-SDF) en un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (ejemplo 5) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento Biacore 2000 (ejemplo 6).
Las secuencias de las cajas o tramos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B, lo cual influye en la afinidad de unión con la SDF-1. Basándose en el análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos de unión a SDF-1, resumidos como ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B, la secuencia de nucleótidos central y sus secuencias de nucleótidos, tal como se describen a continuación, son individual y más preferiblemente fundamentales en su totalidad para la unión a SDF-1:
La secuencia de nucleótidos central de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B comparten la secuencia:
(Fórmula 1 de tip B)
Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2-001, que se diferencian en una posición en la secuencia de nucleótidos central, se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente al ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001 (KD de 1,5 nM determinada en un ensayo de unión de abatimiento [figura 11], KD de 1,0 nM determinado mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie [figura 15], CI50 de 0,12 nM; [figura 12]). Cada uno de los tres ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B ensayados muestra una mejor unión a la SDF-1 humana en comparación con el ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001, siendo la afinidad de unión de 193-G2-001 tan buena como la de 193-C2-001 y 193-F2-001 (figura 3). Los datos sugieren que la diferencia en la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos central de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2-001 no influye en la afinidad de unión con SDF-1. Como ejemplo, el ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001 se caracterizó para su afinidad de unión a la SDF-1 humana. La constante de unión en equilibrio KD se determinó empleando el ensayo de unión de abatimiento (KD = 0,3 nM) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0,5 nM, figura 17). Se midió una CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,08 nM para 193-G2-001 empleando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. Por contraste, los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 y 193-D1-002, que se diferencian en la secuencia de la secuencia de nucleótidos central, muestran peores propiedades de unión (figura 3). Como resultado, los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B con una mejor afinidad de unión con SDF-1 comparten una secuencia de nucleótidos central con la secuencia:
Cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos del tramo 5’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B pueden hibridarse con los respectivos cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos del tramo 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B para formar una hélice terminal. Aunque estos nucleótidos son variables en varias posiciones, los diferentes nucleótidos permiten la hibridación de cuatro, cinco o seis de los seis nucleótidos de cada uno de los tramos 5’-y 3’-terminales. Los tramos 5’-terminal y 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B, tal como se muestran en la figura 3, pueden resumirse con una fórmula genérica para el tramo 5’-terminal (fórmula 3-5’ de tipo B; ’X1GCRWG’, en la que X1 es ’A’ o está ausente) y para el tramo 3’-terminal (fórmula 3-3’ de tipo B; ’KRYSCX4’, en la que X4 es ’U’ o está ausente). Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 y 193-D3-002 presentan unas afinidades de unión más débiles por SDF-1, aunque comparten una secuencia de nucleótidos central idéntica (fórmula 2 de tipo B) con 193-C2-001, 193-G2-001 y 193-F2-001 (figura 3). Las propiedades de unión desfavorables de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 y 193-D3-002 pueden ser debidas al número de nucleótidos y la secuencia de los tramos 5’-y 3’-terminales.
Los derivados truncados de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001 y 193-C2-001 se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a 193-G2-001 y 193-G2-012, respectivamente (figuras 4A y 4B). Estos experimentos demuestran que una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5’: AGCGUG; extremo 3’: UACGCU) de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001 y 193-C2-001 a cinco nucleótidos (extremo 5’: GCGUG; extremo 3’: UACGC) conducen a moléculas con una afinidad de unión similar (193-C2-002 y 193-G2-012). La constante de unión en equilibrio KD se determinó empleando el ensayo de unión de abatimiento (KD = 0,3, figura 18). Un truncamiento a cuatro (extremo 5’: CGUG; extremo 3’: UACG; 193-C2003) o menos nucleótidos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-C2-006, 193-C2-007) produce una afinidad de unión por SDF-1 reducida, que se mide empleando el ensayo de unión de abatimiento de competición (figura 4A). La secuencia de nucleótidos de los cinco nucleótidos terminales en el extremo 5’-y 3’, respectivamente, influye en la afinidad de unión de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B. La sustitución de los nucleótidos 5’-y 3’terminales ’GCGUG’ y ’UACGC’ (193-C2-002, 193-G2-12) por ’GCGCG’ y ’CGCGC’ (193-G2-013) produjo una afinidad de unión reducida. Además, se ensayaron los cuatro derivados diferentes del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001 con una hélice terminal y con una longitud de cuatro nucleótidos con apareamiento de bases (193-G2-014/ -015/ -016/ -017). Todos mostraron una afinidad de unión reducida por la SDF-1 (figura 4B). Por tanto, la secuencia y la longitud de los nucleótidos 5’-y 3’-terminales son fundamentales para una unión eficaz con la SDF-1. Los tramos terminales 5’-terminal y 3’-terminal con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-C2-003 y 193-G2-012, tal como se muestran en las figuras 4A y 4B, pueden describirse con una fórmula genérica para el tramo 5’-terminal (’X2SSBS’, fórmula 4-5’
de tipo B), en la que X2 está ausente o es ’G’, y para el tramo 3’-terminal (’BVSSX3’, fórmula 4-3’ de tipo B), en la que X3 está ausente o es ’C’. Tal como se demuestra para los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B 193-G2-001 y 193-C2-01 y sus derivados 193-G2-012 y 193-C2-002, la combinación preferida de tramos 5’-y 3’-terminales es ’X1GCGUG’ (tramo 5’-terminal; fórmula 5-5’ de tipo B) y ’UACGCX4’ (tramo 3’-terminal; fórmula 5-3’ de tipo B), en las
5 que X1 es ’A’ o está ausente, y X4 es ’U’ o está ausente.
Sin embargo, combinando los tramos 5’-y 3’-terminales de todos los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B ensayados, la fórmula genérica para el tramo 5’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo B es ’X1X2SVNS’ (fórmula 6-5’ de tipo B) y la fórmula genérica para el tramo 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a
10 SDF-1 de tipo B es ’BVBSX3X4’ (fórmula 6-3’ de tipo B), en las que
X1 es ’A’ o está ausente, X2 es ’G’, X3 es ’C’, y X4 es ’U’ o está ausente; o X1 está ausente, X2 es ’G’ o está ausente, X3 es ’C’ o está ausente, y X4 está ausente.
15 1.3 Ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C Tal como se muestra en la figura 5, todas las secuencias de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C comprenden una secuencia de nucleótidos central que está flanqueada por tramos 5’-y 3’-terminales que pueden hibridarse entre sí. Sin embargo, esta hibridación no se produce necesariamente en la molécula.
20 Los ácidos nucleicos se caracterizaron al nivel del aptámero empleando ensayos de abatimiento competitivos y directos con D-SDF-1 humana biotinilada para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como spiegelmeros (ejemplo 3) y se ensayaron empleando la configuración natural de la SDF-1 (L-SDF) en un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (ejemplo 5) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento Biacore 2000 (ejemplo
25 6).
Las secuencias de las cajas o tramos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C, lo cual influye en la afinidad de unión con la SDF-1. Basándose en el análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos de unión a SDF-1, resumidos como ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C, la secuencia de
30 nucleótidos central y sus secuencias de nucleótidos, tal como se describen a continuación, son individual y más preferiblemente fundamentales en su totalidad para la unión a SDF-1:
La secuencia de nucleótidos central de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C comparten la secuencia
en la que XA está ausente o es ’A’. Con la excepción del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 197-D1, la secuencia de nucleótidos central de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de 40 tipo C comparten la secuencia de nucleótidos
El ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 197-D1 (secuencia de nucleótidos central:
), que carece de un nucleótido ’A’ dentro de la secuencia de nucleótidos central y que sigue uniéndose a SDF-1, permite considerar una secuencia de nucleótidos central alternativa (
fórmula 3 de tipo C). Inicialmente, todos los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C, tal como se muestran en la figura 5, se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente al ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo A 192-A10-001 (KD = 1,5 nM determinada en un ensayo de unión de abatimiento y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie; CI50 = 0,12 nM). Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-001, 5 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 y 197-E3 mostraron unas afinidades unión más débiles que 192-A10-001 en experimentos de competición. Se determinó una afinidad de unión mucho más débil para 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 y 197-D2 (figura 5). Las moléculas, o sus derivados, se caracterizaron más a fondo mediante otros ensayos de unión de abatimiento, mediciones de resonancia de plasmón y un ensayo de quimiotaxis in vitro. El ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-001 se caracterizó para su afinidad de unión a la SDF-1 humana, mientras que 10 se determinó la constante de unión en equilibrio KD mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0,8 nM, figura 21). Se midió una CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,2 nM para 191-D5-001 empleando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. La afinidad de unión del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2 por la SDF-1 humana se determinó mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0,9 nM), y su CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,2 nM se analizó en un ensayo de 15 quimiotaxis de cultivo celular in vitro. Estos datos indican que los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 191
D5-001 y 197-B2 tienen una afinidad de unión similar por SDF-1 (figuras 5 y 8).
El ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 190-A3-001 (48 nt) comprende un tramo 5’-terminal de 17 nucleótidos y
un tramo 3’-terminal de 12 nucleótidos, en los que, por una parte los cuatro nucleótidos del extremo 5’ del tramo 5’20 terminal y los cuatro nucleótidos del extremo 3’ del tramo 3’-terminal pueden hibridarse entre sí para formar una
hélice terminal. Como alternativa, los nucleótidos ’UGAGA’ en el tramo 5’-terminal pueden hibridarse con los
nucleótidos ’UCUCA’ en el tramo 3’-terminal para formar una hélice terminal. Una reducción a ocho nucleótidos del
tramo 5’-terminal (’GAGAUAGG’) y a nueve nucleótidos del tramo 3’-terminal (’CUGAUUCUC’) de la molécula 190
A3-001 (con lo cual, seis de los ocho/nueve nucleótidos del tramo 5’-y 3’-terminal pueden hibridarse entre sí) no 25 influye en la afinidad de unión con SDF-1 (190-A3-004; figura 6 figura 19). La constante de unión en equilibrio KD de
190-A3-004 se determinó empleando el ensayo de unión de abatimiento (KD = 4,6 nM, figura 20) y mediante una
medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 4,7 nM). Se midió una CI50 (concentración inhibidora del
50%) de 0,1 nM para 190-A3-004 empleando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro (figura 22). Sin
embargo, el truncamiento a dos nucleótidos en el tramo 5’-terminal conduce a una reducción muy fuerte en la 30 afinidad de unión (190-A3-007; figura 6 y figura 19).
Los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-001, 197-B2 y 197-H1 (secuencia de nucleótidos central:
), 197-H3/191-A5 (secuencia de nucleótidos central:
40 ) y 197-E3/197-B1 (secuencia de nucleótidos central:
) comparten una secuencia de nucleótidos central casi idéntica (fórmula 4 de tipo C; secuencia de nucleótidos:
). 191-D5-001, 197-B2 y 197-H1 no comparten un tramo 5’-y 3’-terminal similar (197-H3 y 197-E3 tienen un tramo 5’-y 3’-terminal idéntico a 197-B2). Sin embargo, los respectivos diez (197-B2, 197-E3, 197-H3) o nuevo de los diez 50 (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos del tramo 5’-terminal pueden hibridarse con los respectivos diez (197-B2, 197-E3,
197-H3) o nuevo de los diez (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos del tramo 3’-terminal (figura 5). Así, el tramo 5’terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3, tal como se mencionó anteriormente, más 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 y 197-D2 comprenden una secuencia de nucleótidos genérica común de ’RKSBUSNVGR’ (fórmula 5-5’ de tipo C). El tramo 3’-terminal de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3, y 197-H3, tal como se mencionó anteriormente, más 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 y 197-D2 comprenden una secuencia de nucleótidos genérica común de ’YYNRCASSMY’ (fórmula 5-3’ de tipo C), prefiriéndose los tramos 5’-y 3’-terminales de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3. Estos tramos 5’-y 3’-terminales preferidos de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3 pueden resumirse con la fórmula genérica ’RKSBUGSVGR’ (fórmula 6-5’ de tipo C; tramo 5’-terminal) y ’YCNRCASSMY’ (fórmula 6-3’ de tipo C; tramo 3’-terminal).
Se construyeron los derivados truncados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-001 y se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a la molécula original 191-D5-001 (figura 7A, figura 7B y figura 19). Al principio, la longitud de los tramos 5’-y 3’-terminales se acortó desde diez nucleótidos (191-D5-001) en cada uno a siete nucleótidos en cada uno (191-D5-004), tal como se muestra en la figura 7A, con lo cual nueve de los diez (191-D5-001) o seis de los siete nucleótidos (191-D5-004) del tramo 5’-terminal y del tramo 3’-terminal, respectivamente, pueden hibridarse entre sí. La reducción a siete nucleótidos del tramo 5’-y 3’-terminal, respectivamente (en los que seis de los siete nucleótidos pueden hibridarse entre sí), conduce a una afinidad de unión reducida con la SDF-1 (191-D5-004). Los tramos terminales del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-004 se modificaron, por lo cual el nucleótido sin apareamiento ’A’ dentro del tramo 3’-terminal de 191-D5-004 fue sustituido por una ’C’ (191-D5-005). Esta modificación condujo a una mejora en la unión. Este derivado, el ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-005, muestra una unión a la SDF-1 similar al 191-D5-001. Otro truncamiento del tramo 5’-y 3’-terminal a cinco nucleótidos, respectivamente, condujo a una molécula con una longitud total de 29 nucleótidos (191-D5-007). Debido a las similitudes de 191-D5-001 y los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 y 197-D2, y debido a los datos extraídos de 191-D5-007, puede suponerse que el tramo 5’-y 3’-terminal en principio puede truncarse hasta cinco nucleótidos, por lo cual la secuencia de nucleótidos ’CGGGA’ para el tramo 5’-terminal y ’UCCCG’ para el tramo 3’-terminal se ensayó con éxito (ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-007). De modo sorprendente, el ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-007 se une algo mejor a SDF-1 que 191D5-001 (determinado al nivel de aptámero empleando el ensayo de unión competitiva). La constante de unión en equilibrio KD se determinó empleando el ensayo de unión de abatimiento (KD = 2,2 nM, figura 20) y mediante una medición de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0,8 nM, figura 21). Se midió una CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,1 nM para 191-D5-007 empleando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. Se realizó otro truncamiento en ambos tramos terminales a cuatro nucleótidos (191-D5-010, figura 7A).
Otros derivados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5-001 (191-D5-017/ -024/ -029) que portan tramos 5’-y 3’-terminales de cuatro nucleótidos cada uno también mostraron una afinidad de unión reducida por SDF-1 en el ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a 191-D5-007 (figura 7B). También se ensayan unos tramos 5’-y 3’-terminal alternativos con una longitud respectiva de cinco nucleótidos (191-D5-017-29a, 191-D5-01729b, 191-D5-019-29a, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b). La fórmula genérica de estos derivados para el tramo 5’terminal es ’XSSSSV’ (fórmula 7-5’ de tipo C) y para el tramo 3’-terminal es ’BSSSXS’ (fórmula 7-3’ de tipo C), en las que XS está ausente o es 'S'. Dos de los cinco variantes ensayados mostraron una afinidad de unión con SDF-1 idéntica a 191-D5-007 (191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b; figura 7B). Las secuencias de los tramos 5’-terminal y 3’terminal de los derivados de 191-D5-001 que muestran la mejor afinidad de unión con SDF-1 y que comprenden un tramo 5’-terminal y 3’-terminal de cinco nucleótidos cada uno (191-D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b) pueden resumirse con una fórmula genérica (tramo 5’-terminal: ’SGGSR’, fórmula 8-5’ de tipo C; tramo 3’-terminal: 'YSCCS’, fórmula 8-3’ de tipo C).
Los derivados truncados del ácido nucleico de unión a SDF-1 de tipo C 197-B2 se analizaron en un ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a la molécula original 197-B2 y 191-D5-007 (figura. 8). Empleando el ensayo de unión de abatimiento competitivo frente a 191-D5-007 se demostró que 197-B2 presenta la misma afinidad de unión con SDF-1 que 191-D5-007. Los tramos 5’-y 3’-terminal se acortaron sin pérdida de afinidad de unión desde diez nucleótidos (197-B2) cada uno a cinco nucleótidos cada uno (197-B2-005), con lo que los nucleótidos del tramo 5’terminal y del tramo 3’-terminal pueden hibridarse completamente entre sí. Si el tramo 5’-terminal (’GCGGG’) y 3’terminal (’CCUGC’) de 197-B2-005 se sustituye por ’GCCGG’ (tramo 5’-terminal) y por ’CCGGC’ (tramo 3’-terminal) de 197-B2-006, la afinidad de unión con SDF-1 persiste totalmente. Debido a que 197-B2 y 191-D5-001 (y sus derivados) comparten la secuencia de nucleótidos central idéntica (
) y se habían ensayado varios derivados de 191-D5 con tramos 5’-y 3’-terminal con una longitud de cuatro 5
nucleótidos cada uno, se omitió otro truncamiento más del tramo 5’-y 3’-terminal. Se diseñaron dos derivados más que comprenden seis nucleótidos en el extremo 5’ y 3’ (tramos 5’-y 3’-terminales), respectivamente. La afinidad de unión con SDF-1 de ambas moléculas (197-B2-006-31a y 197-B2-006-31b) es la misma que la de 191-D5-007 y 197-B2-006 (figura 8). Las secuencias de los tramos 5’-terminal y 3’-terminal del derivado de 197-B2 que muestran la mejor afinidad de unión con SDF-1 y que comprenden un tramo 5’-terminal y 3’-terminal de cinco nucleótidos cada uno pueden resumirse con una fórmula genérica (tramo 5’-terminal: ’GCSGG’, fórmula 9-5’ de tipo C; tramo 3’terminal: 'CCKGC’, fórmula 9-3’ de tipo C).
Combinando los tramos 5’-y 3’-terminales preferidos de los ácidos nucleicos de unión a SDF-1 de tipo C 191-D5001 (tramo 5’-terminal: ’SGGSR’, fórmula 8-5’ de tipo C; tramo 3’-terminal: 'YSCCS’, fórmula 8-3’ de tipo C) y 197-B2 (tramo 5’-terminal: ’GCSGG’, fórmula 9-5’ de tipo C; tramo 3’-terminal: 'CCKGC’, fórmula 9-3’ de tipo C), la fórmula genérica preferida común para el tramo 5’-terminal y 3’-terminal es ’SSSSR’ (tramo 5’-terminal, fórmula 10-5’ de tipo C) y ’YSBSS’ (tramo 3’-terminal: fórmula 10-3’ de tipo C).
1.4 Otros ácidos nucleicos de unión a SDF-1
Además, se identificaron tres ácidos nucleicos de unión a SDF-1 más que no comparten los motivos de unión a SDF-1 de ’tipo A’, ’tipo B’ y ’tipo C’. Se analizaron como aptámeros empleando el ensayo de unión de abatimiento (figura 9).
Debe entenderse que cualquier de las secuencias mostradas en las figuras 1 a 9 son ácido nucleicos según la presente invención, que incluyen sus formas truncadas, pero que también incluyen sus formas extendidas, con la condición de que las moléculas de ácidos nucleicos así truncadas y extendidas, respectivamente, aún sean capaces de unirse a la diana.
Ejemplo 2: Modificación de PEG de 40 kDa y otras modificaciones de los spiegelmeros de unión a SDF Para prolongar el tiempo de residencia plasmático in vivo de los spiegelmeros, los spiegelmeros 193-G2-012, 192A10-008, 191-D5-007, 197-B2-006 y 197-B2-006-31b se acoplaron covalentemente con un resto polietilenglicol (PEG) de 40 kDa en el extremo 5’, según se describe en el capítulo 3 (clones PEGilados: 193-G2-012-5’-PEG, 192-A10-008-5’PEG, 191-DS-007-5’PEG, 197-B2-006-5’PEG y 197-B2-006-31b-5’PEG).
Las moléculas de spiegelmeros PEGilados se analizaron en un ensayo TAX de cultivo celular in vitro (capítulo 5) y mediante mediciones de resonancia de plasmón empleando un instrumento Biacore (capítulo 6). Todos los spiegelmeros modificados con PEG de 40 kDa siguen siendo capaces de inhibir la quimiotaxis inducida por SDF-1 y de unirse a SDF-1 en un estrecho intervalo nanomolar (figuras 23A, 23B, 24A y figura 24B).
Además, el spiegelmero de unión a SDF 192-A10-001 se modificó con PEG de 40 kDa, PEG de 30 kDa, HES de 100 kDa o HES de 130 kDa (clones PEGilados: 192-A10-001-5’PEG40, 192-A10-001-5’PEG30, 192-A10-001-5’HES100, 192-A10-001-5’HES130; procedimiento de acoplamiento en el capítulo 3). Tal como se muestra en la figura 25A y la figura 25B ni el resto PEG ni el resto HES influyen en la potencia de los spiegelmeros para inhibir la quimiotaxis inducida por SDF-1.
Ejemplo 3: Síntesis y derivatización de aptámeros y spiegelmeros
3.1 SÍNTESIS A PEQUEÑA ESCALA
Se produjeron aptámeros y spiegelmeros mediante una síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) empleando la química de 2’TBDMS y fosforamidita (Damha y Ogilvie, 1993). Las rA(NBz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, y rU-fosforamiditas en la configuración D y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. Los aptámeros y los spiegelmeros se purificaron mediante electroforesis en gel.
3.2 SÍNTESIS A GRAN ESCALA MÁS MODIFICACIÓN
Se produjeron los spiegelmeros mediante una síntesis en fase sólida con un sintetizador ÄktaPilot100 (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Friburgo) empleando la química de 2’TBDMS y fosforamidita (Damha y Ogilvie, 1993). Las L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, and L-rU-fosforamiditas se adquirieron en ChemGenes (Wilmington, MA, EE. UU.). El modificador de 5’-amino se adquirió en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EE. UU.). La síntesis de los spiegelmeros comenzó con CPG L-riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU respectivamente modificados con tamaño de poro 1000 Å (Link Technology, Glasgow, Reino Unido). Para el acoplamiento (15 min por ciclo), se empleó benciltiotetrazol 0,3 M (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, EE. UU.) en acetonitrilo, y 3,5 equivalentes de la respectiva disolución de fosforamidita 0,2 M en acetonitrilo. Se empleó un ciclo de cierre de la oxidación. Otros reactivos y disolventes convencionales para la síntesis de oligonucleótidos se adquirieron en (Valkenswaard, Países Bajos). Los spiegelmeros se sintetizaron con DMT-ON; después de la desprotección se purificaron mediante RP-HPLC preparativa (Wincott F. et al., 1995) empleando el medio Source15RPC (Amersham). El grupo 5’DMT se retiró con ácido acético al 80% (90 min a temperatura ambiente). Después se añadió una disolución acuosa de NaOAc 2 M y el spiegelmero se desaló mediante una filtración con flujo tangencial empleando una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).
3.3 PEGILACIÓN Para prolongar el tiempo de residencia plasmático in vivo de los spiegelmeros, los spiegelmeros se acoplaron covalentemente con un resto polietilenglicol (PEG) de 40 kDa en el extremo 5’.
Para la PEGilación (para obtener datos técnicos del método para la PEGilación, véase la solicitud de patente europea EP 1 306 382), el spiegelmero modificado en el 5’-amino purificado se disolvió en una mezcla de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), y tampón A (5 ml; preparado mezclando ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], y NaOH 1 M [343 ml] y añadiendo agua hasta un volumen final de 1 l; pH = 8,4 que se ajustó con HCl 1 M).
El pH de la disolución del spiegelmero se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Después se añadió PEG-NHS éster 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) a 37 °C cada 30 min en seis porciones de 0,25 equivalentes hasta alcanzar un rendimiento máximo del 75 al 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8-8,5 con NaOH 1 M durante la adición del PEG-NHS éster.
La mezcla de reacción se mezcló con 4 ml de una disolución de urea (8 M), y 4 ml de tampón B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H2O) y se calentó hasta 95 °C durante 15 min. El spiegelmero PEGilado después se purificó mediante RP-HPLC con medio Source 15RPC (Amersham) empleando un gradiente de acetonitrilo (tampón B; tampón C: acetato de trietilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluye a tampón C al 5%, y el spiegelmero PEGilado a tampón C al 10-15%. Las fracciones del producto con una pureza >95% (evaluada mediante HPLC) se reunieron y se mezclaron con 40 ml de NaOAc 3 M. El spiegelmero PEGilado se desaló mediante una filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford, MA).
3.4 HESilación Para prolongar el tiempo de residencia plasmático in vivo de los spiegelmeros, los spiegelmeros se acoplaron covalentemente con hidroxiletil almidón (HES) de diversos pesos moleculares >130 kDa y grado de sustitución >0,5. El extremo 5’ del spiegelmero es el sitio preferido para la conjugación.
Para la HESilación (para obtener detalles técnicos del método para la hesilación de ácidos nucleicos, véase Offenlegungsschrift alemana DE 101 12 825 A1, y para los D/L-ácidos nucleicos el documento PCT WO 02/080979 A2), el spiegelmero modificado en el 5’-amino purificado se disolvió en bicarbonato de sodio (0,3 M, 1 ml) y el pH se ajustó a 8,5.
Con respecto al spiegelmero, se añadió un exceso en 5 veces de ácido HES libre (3,3 mmol, Supramol, Rosbach, Alemania) y carbonato de di(N-succinimidilo) (3,3 mmol) a N,N-dimetilformamida (1 ml) para producir una disolución del N-hidroxisuccimida éster de HES activado. Para disolver todos los reactantes, la mezcla se agitó brevemente a 60 °C, se enfrió hasta 25 °C y después se agitó durante 1,5 h a 25 °C. La disolución del spiegelmero se añadió a la disolución del HES activado y la mezcla resultante se agitó a 25 °C y pH 8,5. La reacción se controló mediante IEX-HPLC analítica. Generalmente, la conjugación se desarrolla hasta >75 % dentro de 1 hr.
Para la purificación con IEX-HPLC a través del medio Source 15Q (GE, Friburgo, Alemania), la mezcla de reacción se mezcló con una cantidad en 10 veces de tampón A (EDTA 1 mM, Tris 25 mM, NaClO4 10 mM en agua/acetonitrilo 9:1, pH 4). El exceso de HES eluye a tampón A al 5% (EDTA 1 mM, Tris 25 mM, NaClO4 500 mM en agua/acetonitrilo 9:1, pH 4), mientras que el conjugado de HES-spiegelmero eluye a tampón B al 20-30%. Las fracciones del producto con una pureza >95% (evaluada mediante HPLC) se reunieron y se desalaron mediante una filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).
Ejemplo 4: Determinación de las constantes de unión (ensayo de unión de abatimiento ("pull-down"))
4.1 Ensayo de unión de abatimiento directo
Se midió la afinidad de los aptámeros por la D-SDF-1 humana biotinilada en un formato de ensayo de unión de abatimiento a 37 °C. Los aptámeros se marcaron en 5’-fosfato con una T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) empleando ATP marcado con [γ-32P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania). La radiactividad específica de los aptámeros marcados era de 200.000-800.000 cpm/pmol. Los aptámeros se incubaron después de una desnaturalización y una renaturalización a una concentración de 10, 20, 30 o 40 pM a 37 °C en tampón de selección (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; NaCl 137 mM; KCl 5 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; Tween-20 al 0,1% [en p/vol]), junto con cantidades variables de D-SDF-1 humana biotinilada durante 4-12 horas para alcanzar el equilibrio a bajas concentraciones. El tampón de selección se suplementó con albúmina de suero humana 10 µg/ml (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y ARN de levadura 10 µg/ml (Ambion, Austin, EE. UU.) para evitar la adsorción de los compañeros de unión a la superficie del equipo de plástico empleado o la matriz de inmovilización. El intervalo de concentración de la D-SDF-1 humana biotinilada se ajustó de 8 pM a 100 nM; el volumen total de reacción era de 1 ml. El péptido y los complejos de péptido-aptámero se inmovilizaron sobre 1,5 µl de partículas Streptavidin Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EE. UU.) que habían sido preequilibradas con tampón de selección y resuspendidas en un volumen total de 6 µl. Las partículas se mantuvieron en suspensión durante 30 min a la respectiva temperatura en un termomezclador. La radiactividad inmovilizada se cuantificó en un contador de
centelleo después de retirar el sobrenadante y de un lavado apropiado. El porcentaje de unión se representó gráficamente frente a la concentración de la D-SDF-1 humana biotinilada y se obtuvieron las constantes de disociación empleando algoritmos informáticos (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey, Reino Unido) suponiendo una estequiometría 1:1.
4.2 Ensayo de unión de abatimiento competitivo
Con el fin de comparar los diferentes aptámeros de unión a D-SDF-1 se realizó un ensayo de clasificación competitivo. Para este objetivo, el aptámero más afín disponible se marcó de modo radiactivo (véase anteriormente) y actúa como referencia. Después de una desnaturalización y una renaturalización se incubó a 37 °C con D-SDF-1 humana biotinilada en 1 ml de tampón de selección bajo unas condiciones que producen una unión de aproximadamente 5-10% del péptido después de una inmovilización y un lavado sobre agarosa NeutrAvidin o estreptavidina Ultralink Plus (ambas de Pierce) sin competición. Se añadió un exceso de variantes de aptámeros de D-ARN no marcados desnaturalizados y renaturalizados a diferentes concentraciones (por ejemplo, 2, 10 y 50 nM) al aptámero de referencia marcado para realizar reacciones de unión en paralelo. Los aptámeros que se van a ensayar compiten con el aptámero de referencia por la unión a la diana, disminuyendo así la señal de unión dependiendo de sus características de unión. El aptámero que resultó más activo en este ensayo después puede servir como nueva referencia para análisis comparativos de otros variantes de aptámeros.
Ejemplo 5: Análisis de la inhibición de la quimiotaxis inducida por SDF-1 por los spiegelmeros de unión a SDF-1 Se cultivaron células de leucemia de células T humanas de Jurkat (obtenidas en DSMZ, Braunschweig) 37 °C y CO2 al 5% en medio RPMI 1640 con Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contiene suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 mg/ml (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Un día antes del experimento, las células se sembraron en un nuevo matraz a una densidad de 0,3 x 106/ml (9 x 106/30 ml) en medio convencional (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).
Para el experimento, las células se centrifugaron (5 min a 300 g), se resuspendieron, se contaron y se lavaron una vez con 15 ml de HBH (disolución salina equilibrada de Hank que contiene albúmina de suero bovina 1 mg/ml y HEPES 20 mM; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Después las células se resuspendieron a 3 x 106/ml o 1,33 x 106/ml, dependiendo del tipo de placa de filtro usada. Después se dejó que las células migrasen a través de las membranas porosas de las placas de filtro durante varias horas hacia una disolución que contiene SDF-1 y diversas cantidades de spiegelmero. Se emplearon placas Transwell e inserciones con membrana de policarbonato poroso, tamaño de poro de 5 µm (Corning; 3421) o placas MultiScreen MIC (Millipore, MAMIC5S10).
5.1 Protocolo para las placas Transwell
Las disoluciones de estimulación (SDF-1 + diversas concentraciones de spiegelmero) se constituyeron con 600 µl de HBH en los compartimentos inferiores de las placas Transwell y se incubaron durante 20-30 min. Todas las condiciones se constituyeron al menos dos veces. Las inserciones se trasladaron a los pocillos que contenían las disoluciones de estimulación y se añadieron 100 µl de una suspensión de células de 3 x 106/ml a las inserciones (3 x 105 células/pocillo). Después se dejó que las células migrasen durante 3 h a 37 °C.
Después se retiraron las inserciones y se añadieron 60 µl de una disolución de trabajo de resazurina (Sigma, Deisenhofen, Alemania) (440 µM en PBS; Biochrom, Berlín, Alemania) a los pocillos (también a los pocillos de calibración). Las placas entonces se incubaron a 37 °C durante 2,5 a 3 h. Después de la incubación se trasladaron 200 µl de cada pocillo a una placa negra de 96 pocillos. La medición de las señales de fluorescencia se realizó a 544 nm (excitación) y 590 nm (emisión) en un lector de placas de multidetección Fluostar Optima (BMG, Offenburg, Alemania).
5.2 Protocolo para las placas Millipore MultiScreen
Se constituyeron las disoluciones de estimulación (SDF-1 + diversas concentraciones de spiegelmero) como disoluciones 10X en una placa de 96 tubos de perfil bajo de 0,2 ml. Se pipetearon 135 µl de HBH en los compartimentos inferiores de la placa MultiScreen y se añadieron 15 µl de las disoluciones de estimulación. Todas las condiciones se constituyeron por triplicado. Después de 20 a 30 min, la placa de filtro se insertó en la placa que contenía las disoluciones de estimulación y se añadieron 75 µl de una suspensión de células de 1,33 x 106/ml a los pocillos de la placa de filtro (1 x 105 células/pocillo). Después se dejó que las células migrasen durante 3 h a 37 °C.
Después se retiró la placa de inserción y se añadieron 20 µl de una disolución de trabajo de resazurina (440 µM en PBS) a los pocillos inferiores. Después las placas se incubaron a 37 °C durante 2,5 a 3 h. Después de la incubación se trasladaron 100 µl de cada pocillo a una placa negra de 96 pocillos. La medición de las señales de fluorescencia se realizó como se describió anteriormente.
5.3 Evaluación
Para la evaluación, los valores de fluorescencia se corrigieron para la fluorescencia de fonda (pocillo sin células). Después se calculó la diferencia entre las condiciones experimentales con y sin SDF-1. Se consideró que el valor para la muestra sin spiegelmero (solo SDF-1) era 100%, y los valores para las muestras con spiegelmero se calcularon como porcentaje de esto. Para la curva de dosis-respuesta, los valores de porcentaje se representaron
gráficamente frente a la concentración de spiegelmero y se determinó el valor de CI50 (concentración de spiegelmero a la cual está presente 50% de la actividad sin spiegelmero) gráficamente a partir de la curva resultante.
5.4 Resultados
5.4.1 Estimulación dependiente de la dosis de células Jurkat por la SDF-1 humana Se descubrió que la SDF-1 humana estimula la migración de células Jurkat de una manera dependiente de la dosis, estando la estimulación semimáxima a aproximadamente 0,3 nM (figura 11).
5.4.2 Inhibición dependiente de la dosis de la quimiotaxis inducida por SDF-1 humana por los spiegelmeros de unión a SDF-1 Cuando se deja que las células migren hacia una disolución que contiene SDF-1 humana más concentraciones crecientes de spiegelmeros de unión a SDF-1, se observa una inhibición dependiente de la dosis. Las respectivas CI50 de los spiegelmeros ensayados se especifican en el ejemplo 1. Cuando se emplea un spiegelmero control no específico en lugar de los spiegelmeros de unión a SDF-1 no se observa efecto inhibidor hasta 1 µM (figura 26).
5.4.3 Inhibición dependiente de la dosis de la quimiotaxis inducida por SDF-1 de ratón por los spiegelmeros de unión a SDF-1 La SDF-1 se conserva bien a través de las especies: la SDF-1 de ratón se diferencia de la SDF-1α humana en un aminoácido (isoleucina en la posición 18 en lugar de valina). La SDF-1 murina puede estimular la quimiotaxis de células Jurkat (figura 27) y se ha descubierto que esta acción es inhibida por los spiegelmeros 192-A10-001 y 191-D5-007-5’-PEG con la misma potencia que en el caso de la SDF-1 humana (figura 28).
Ejemplo 6: Análisis de unión mediante medición de resonancia de plasmón de superficie Se empleó el instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para analizar la unión de los spiegelmeros a la SDF-1α humana. Cuando se intenta conseguir el acoplamiento de la SDF-1α a través de grupos amina, la SDF-1α se dializa contra agua durante 1-2 h (ésteres de celulosa mixtos Millipore VSWP; tamaño de poro, 0,025 µm) para eliminar las aminas de interferencia. Se activaron chips detectores CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) antes del acoplamiento de la proteína mediante una inyección de 35 µl de una dilución 1:1 de NHS 0,4 M y EDC 0,1 M con un flujo de 5 µl/min. Después se inyectó la quimioquina a unas concentraciones de 0,1-1,5 µg/ml con un flujo de 2 µl/min hasta que la respuesta del instrumento alcanzó un intervalo de 1000-2000 UR (unidades relativas). Los NHS ésteres sin reaccionar se desactivaron mediante una inyección de 35 µl de una disolución de clorhidrato de etanolamina (pH 8,5) con un flujo de 5 µl/min. El chip detector se cebó dos veces con tampón de unión y se equilibró a 10 µl/min durante 1-2 horas hasta que la línea de base se estabilizó. Para todas las proteínas se evaluaron los parámetros cinéticos y las constantes de disociación mediante una serie de inyecciones del spiegelmero a unas concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 y 0 nM en tampón de selección (Tris-HCl 20 mM; NaCl 137 mM; KCl 5 mM; CaCl2 1 mM; MgCl2 1 mM; Tween-20 al 0,1% [en p/v]; pH 7,4). En todos los experimentos, el análisis se realizó a 37 °C empleando el comando Kinject que define un tiempo de asociación de 180 y un tiempo de disociación de 360 segundos a un flujo de 10 µl/min. El análisis de los datos y el cálculo de las constantes de disociación (KD) se realizó con el software BIAevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suecia) empleando el algoritmo de ajuste estequiométrico 1:1 Langmuir.
Ejemplo 7: Inhibición de la unión de [125J]-DF-1 a células que expresan CXCR4 por los spiegelmeros de unión a SDF-1
7.1 Método
Se adquirió un clon de ADNc que codifica el receptor CXCR4 humano (NM_003467.2) en OriGene Technologies (Rockville, MD) y se clonó en el vector pCR3.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). El vecto resultante se transfectó en células CHO-K1 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) empleando Lipofectamin 2000 (Invitrogen) y se seleccionaron las líneas celulares de expresión estable mediante un tratamiento con geneticina. La expresión de los receptores se verificó mediante RT-PCR.
Para los ensayos de unión, las células que expresan CXCR4 se sembraron en placas de 24 pocillos revestidas con polilisina a una densidad celular de 1 x 105 células/pocillo y se cultivaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5% en medio CHO-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica) que contenía penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 µg/ml y geneticina 0,5 mg/ml.
Para el experimento de unión, el medio se retiró y las células se lavaron una vez con disolución salina equilibrada de Hank que contenía además HEPES 20 mM, albúmina de suero bovina 1 mg/ml, bacitracina 0,1 mg/ml (HBB). Después las células se incubaron en 0,2 ml de HBB durante 1 h a temperatura ambiente junto con [125J]-SDF-1 50 pM (PerkinElmer, Rodgau, Alemania) y diversas concentraciones del spiegelmero.
Se determinó la unión no específica añadiendo SDF-1 humana no marcada (R & D Systems, Wiesbaden, Alemania) a una concentración final de 0,5 uM a varios pocillos.
Después del periodo de incubación, el sobrenadante se retiró y los pocillos se lavaron 3 veces con HBB enfriado en hielo. Después las células se lisaron con 0,1 ml de NaOH 0,1 M. Los lisados se trasladaron a viales de centelleo y, después de la adición de 4 ml de cóctel de centelleo líquido Unisafe 1 (Zinsser, Frankfurt, Alemania), se contaron en un contador de centelleo Beckman LS6500.
Puesto que los valores para la unión no específica (unión en presencia de una alta cantidad de SDF-1 no unido) son algo mayor que los valores para la unión total en presencia de altas concentraciones (500 pM) del spiegelmero, se empleó la diferencia entre la unión máxima ("max") y la unión en presencia de spiegelmero 500 pM para el cálculo de los valores de CI50.
7.2 Resultados
La representación gráfica de [125J]-SDF-1 unida frente a la concentración del spiegelmero reveló que la unión de SDF-1 puede ser bloqueada por el spiegelmero 192-A10-001 con una CI50 de aproximadamente 60 pM (figura 29).
Ejemplo 8: Inhibición de la activación de MAP-quinasa inducida por SDF-1 por los los spiegelmeros de unión a SDF1
8.1 Método
Células CHO que expresan CXCR4 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5 x 106 células/pocillos y se cultivaron durante aproximadamente tres horas a 37 °C y CO2 al 5% en medio CHO-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica) que contenía penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 µg/ml y geneticina 0,5 mg/ml. Después de la unión de las células el medio se retiró y se sustituyó por medio F12 de Ham que contenía penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 µg/ml. Después las células se incubaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5%. Tres horas antes de la estimulación, el medio se sustituyó una vez más por medio F12 de Ham fresco. Las células se estimularon con SDF-1 humana 1 nM y diversas cantidades del spiegelmero durante 5 o 10 minutos. Después el medio se retiró y las células se lavaron rápidamente una vez con 1 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada en hielo, seguido de una lisis con tampón de muestra-SDS buffer (Tris/HCI, pH 6,8, 62,5 mM; glicerol al 10%; SDS al 2%; azul de bromofenol al 0,01%; beta-mercaptoetanol al 5%). Se añadió 1 µl de benzonasa 0,5 u/µl (Merck, Darmstadt, Alemania) a cada pocillo y, después de una incubación durante 5 a 10 min a temperatura ambiente, los lisados se trasladaron a tubos Eppendorf, se incubaron a 95 °C durante 5 min y se conservaron a -20 °C hasta su posterior análisis.
Se separaron 25 µl de los lisados en geles de SDS-poliacrilamida desnaturalizante al 10%. Después las proteínas se trasladaron mediante electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa HybondECL (Amersham/GE Healthcare, Munich, Alemania). Después de la transferencia, las membranas se tiñeron con rojo Ponceau (al 0,2% en ácido tricloroacético al 3%) para el control de la carga y transferencia de proteínas, y después se bloquearon mediante una incubación en TBS-T (disolución salina tamponada con Tris (Tris/HCl 20 mM, pH 7,6, NaCl 137 mM) con Tween 20 al 0,1%) que contenía leche en polvo desnatada al 10% a 2-8 °C durante la noche. La membrana entonces se incubó con anticuerpo anti-fosfo-MAP-quinasa de conejo (1:1000 en leche al 10% en TBS-T) durante 2 h a la temperatura ambiente. Después de lavar tres veces durante 5 min con TBS-T, la membrana se incubó con conjugado de anti-IgG de conejo-HRP (1:2000 en leche al 10% en TBS-T) durante 1 h a la temperatura ambiente. Después la membrana se volvió a lavar tres veces durante 5 min con TBS-T, seguido de una incubación durante 1 min en reactivo quimioluminiscente LumiGloR. La luminiscencia se detectó mediante una exposición a películas de quimioluminiscencia Hyperfilm ™ECL (Amersham/GE Healthcare) durante 30 segundos a 2 minutos. Los anticuerpos y el reactivo de detección de luminiscencia son componentes del kit de anticuerpos de MAP quinasa (Thr202/Tyr204) PhosphoPlus p44/42 de Cell Signaling Technology (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemania)
8.2 Resultados
La estimulación de células que expresan CXCR4 con SDF-1 human 1 nM durante 5 min conduce a una estimulación profunda de la MAP-quinasa, indicada por un aumento en la intensidad de la banda que refleja la MAP-quinasa activada. Esta activación de la MAP-quinasa puede ser inhibida, de una manera dependiente de la dosis, por el spiegelmero 191-A10-001 (figura 30).
Ejemplo 9: Análisis funcional del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG en un ensayo de germinación del anillo aórtico Para ensayar si el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG también es funcional en un ensayo de cultivos de órganos de angiogénesis convencional, se realizaron ensayos de germinación del anillo aórtico. Este ensayo, en el que se evalúan la longitud y la abundancia de extensiones similares a vasos desde los explantes, se ha convertido en el modelo de cultivo de órganos más ampliamente empleado para la angiogénesis (Auerbach et al., 2003). Ya se ha demostrado que la SDF-1 induce la germinación en este tipo de ensayo (Salcedo et al., 1999).
Se cortaron aortas de rata en anillos, se introdujeron en una matriz de colágeno y se incubaron con SDF-1 y con SDF-1 más el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG o con SDF más un spiegelmero control PEGilado no funcional que no se une a SDF-1. Después de 6 a 7 días se analizó la germinación (es decir, el crecimiento y extensión de células endoteliales) tomando fotografías y determinando un índice de germinación.
Método
Las aortas de ratas machos se obtuvieron en Bagheri Life Sciences (Berlín, Alemania). Las aortas se prepararon frescas y se trasladaron en hielo en medio MCDB 131 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contenía penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 µg/ml (ambas de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y fungizona 2,5 µg/ml (Cambrex, EE. UU.).
Para un experimento, una única aorta se trasladó a una placa de cultivo celular junto con el medio y se retiró el tejido conectivo residual. Después la aorta se cortó con un escalpelo en anillos con una longitud de aproximadamente 1 a 2 mm. Los anillos se lavaron a fondo (al menos cinco veces) en medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se colocaron en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenían 450 µl de disolución de colágeno por pocillo. Esta disolución de colágeno se preparó mezclando 9 ml de colágeno de cola de rata (3 mg/ml en ácido acético al 0,1%; Sigma, Deisenhofen, Alemania) con 1,12 ml de 10X medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), 1,12 ml de 10X tampón de colágeno (NaOH 0,05 N, HEPES 200 mM, NaHCO3 260 mM) y 0,6 ml de glutamina 200 mM. Los anillos se orientaron de tal forma que los bordes recortados se encontraban perpendiculares al fondo del pocillo. Se dejó que el colágeno solidificase incubando las placas durante al menos una hora a 37 °C. Después se añadió 1 ml de medio MCDB131 con adiciones (SDF-1 y spiegelmeros) por pocillo. Los anillos después se incubaron a 37 °C durante seis a siete días. Como control de la germinación, los experimentos también se realizaron con VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).
La germinación se documentó tomando fotografías con una cámara digital. En algunos casos, los anillos se fijaron mediante la adición de 1 ml de paraformaldehído al 10% y se conservaron a 2-8 °C para su posterior documentación. Las fotografías se analizaron con el software de procesamiento de imágenes Scion Image. Después de una calibración con la ayuda de una fotografía tomada con un micrómetro portaobjetos, se trazó una línea a una distancia de 0,33 mm desde el borde de un anillo. El software generó un histograma a lo largo de esta línea, los histogramas se imprimieron y se contaron los picos (que representan germinaciones que cruzan la línea). Este número se consideró el índice de germinación. Se evaluaron de 4 a 5 anillos por condición. El análisis estadístico se realizó con WinSTAT para Excel.
Resultados
Pudo demostrarse que la SDF-1 induce la germinación y que este efecto puede ser bloqueado por el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG. No se observó bloqueo de la germinación inducida por SDF-1 con el spiegelmero control PEGilado no funcional (figuras 31 y 32).
Ejemplo 10: Nivel plasmático de SDF-1 y del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG administrados a ratas como una única inyección en embolada intravenosa del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG Para ensayar si el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG es funcional in vivo, el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG se administró a ratas como una inyección en embolada intravenosa y se determinó el nivel plasmático del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG y de la SDF-1. Como control, se determinaron los niveles plasmáticos de SDF-1 de ratas no tratadas.
Animales, administración y recolección de la muestra
El spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG se disolvió en PBS hasta una concentración final de 0,5 mg/ml y se esterilizó mediante filtración. Ratas macho Sprague Dawley (con un peso de aproximadamente 300 g) recibieron el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG 1,0 mg/kg como una única inyección en embolada intravenosa. Se recolectaron muestras de sangre en varios momentos (tal como se muestra en la figura 33) para permitir el eliminación plasmática del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG.
Ensayo de hibridación de "sandwich" para la cuantificación del spiegelmero
Se cuantificó la cantidad del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG en las muestras mediante un ensayo de hibridación de "sandwich". El principio del ensayo de hibridación de "sandwich" es bastante similar a un ELISA (ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas), que se emplea habitualmente: la inmovilización y la detección del spiegelmero. La detección se basa en la hibridación de una sonda de detección biotinilada a un extremo del spiegelmero. El otro extremo monocatenario del spiegelmero media en la inmovilización del complejo tras la hibridación a una sonda de captura inmovilizada. Después de retirar los complejos no unidos, la sonda de detección hibridada con el spiegelmero finalmente es detectada mediante un conjugado de estreptavidina/fosfatasa alcalina que convierte un sustrato quimioluminiscente. Este ensayo hibridación de "sandwich" también se aplica a la detección y la cuantificación de un aptámero de ARN, según se describe en Drolet et al. (Drolet et al., 2000).
Preparación de las placas de hibridación La sonda de captura 193-G2-012 (SEQ ID NO:240) se inmovilizó sobre placas de 96 pocillos DNA-BIND (Corning Costar, Wiesbaden, Alemania) a 100 nM en fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 8,5 a lo largo de la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron dos veces y se bloquearon con BSA al 0,5% en p/v en fosfato de sodio 0,25 M, EDTA 0,5 mM, pH 8,5 durante 2 h a 25 °C, se volvieron a lavar y se conservaron a temperatura ambiente hasta su uso. Antes
de la hibridación se lava dos veces con tampón de lavado (3x SSC, sarcosinato de dodecilo sodio al 0,5% [en p/v], pH 7,0; antes se había preparado 20x disolución madre [NaCl 3 M, Na3-citrato 0,3 M]) sin lauroilsarcosina sodio y diluido en consecuencia).
Preparación de las muestras Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Las muestras plasmáticas se descongelaron en hielo, se agitaron en vórtice y se centrifugaron brevemente en una centrífuga de mesa enfriada. Los homogeneizados de tejidos se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 5 min a la velocidad máxima y temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron con tampón de hibridación (sonda de detección 193-G2-012 40 nM [SEQ ID NO:241] en tampón de lavado) a temperatura ambiente según el siguiente esquema:
10 µl de muestra + 90 µl de tampón de hibridación 1:10 20 µl de 1:10 + 180 µl de tampón de hibridación 1:100
Se ensayaron todas las diluciones de las muestras. El patrón de spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG se diluyó en serie según una curva de calibración de 12 puntos que abarca el intervalo de 0,001-40 nM. El patrón de calibración es idéntico al de las muestras del estudio.
Hibridación y detección Las muestras se calentaron durante 5 min a 95 °C y se enfriaron hasta la temperatura ambiente. Los complejos de spiegelmero/sonda de detección se reasociaron para las sondas de captura inmovilizadas durante 45 min a 25 °C a 500 rpm en un agitador. Los spiegelmeros no unidos se retiraron lavando dos veces con tampón de lavado y 1X TBST (Tris-Cl 20 mM, NaCl 137 mM, Tween-20 al 0,1%, pH 7,5), respectivamente. Los complejos hibridados se detectaron mediante estreptavidina-fosfatasa alcalina diluidas 1:5000 en 1X TBST durante 1 h a 25 °C a 500 rpm en un agitador. Para retirar el conjugado no unido, los pocillos se lavaron de nuevo con 1X TBST. Los pocillos finalmente se rellenaron con 100 ml de sustrato CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) y se incubaron durante 45 min a 25 °C. La quimioluminiscencia se midió en un lector de microplacas FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania).
Análisis de los datos Se emplearon las siguientes diluciones de las muestras ensayadas para el análisis de datos cuantitativo:
EDTA plasma de rata 1:100
Los datos obtenidos del grupo con vehículo (no se administró spiegelmero) se restaron como señal de fondo.
ELISA para la cuantificación del spiegelmero
Se cuantificó la cantidad de SDF-1 presente en las muestras de plasma con un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas in vitro que emplea un anticuerpo específico para la SDF-1α humana revestido sobre una placa de 96 pocillos (kit de ELISA SDF-1α humana; RayBiotech, Norcross GA, EE. UU.). El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante.
Resultados
Tal como se muestra en la figura 33, el nivel plasmático normal de SDF-1 en las ratas no tratadas se encuentra en el intervalo picomolar bajo (aproximadamente 50 pM). Por contraste, el nivel plasmático de ratas tratadas con el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG parece diferente: dentro de las primeras ocho horas después de la administración del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG, el nivel plasmático de SDF-1 aumenta hasta aproximadamente 700 pM. Entre 12 y 72 horas, el nivel plasmático de SDF-1 disminuye de nuevo hasta aproximadamente 50 pM. Este desarrollo en el tiempo del nivel plasmático de SDF-1 puede correlacionarse directamente con el nivel plasmático del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG. Debido a la eliminación renal del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG, el nivel plasmático del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG disminuye desde aproximadamente 1100 nM a por debajo de 50 nM dentro de 72 horas. Sin embargo, el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG (PM de aproximadamente 54000 Da) no se eliminó del cuerpo dentro de una hora, tal como puede observarse para los spiegelmeros no PEGilados (aproximadamente 15000 Da) u otras moléculas con una masa molecular por debajo del límite de filtración del riñón, tales como SDF-1. La SDF-1 endógena fue unida por el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG, formando complejos de SDF-1-spiegelmero, por lo que la eliminación y/o la degradación de la SDF-1 se retrasa y esto provoca unos niveles plasmáticos elevados de la SDF-1 dentro de las primeras ocho horas. Debido al desarrollo de la eliminación del spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG a lo largo del tiempo, por el cual la tasa de eliminación es mucho más lenta que la de moléculas mucho más pequeñas, tales como SDF-1, el nivel plasmático de los complejos formados por el spiegelmero de unión a SDF-1 humana 193-G2-012-5’-PEG y SDF-1 disminuye (figura 33).
Referencias bibliográficas Los datos bibliográficos completos de los documentos citados en la presente son, si no se indica lo contrario, los
siguientes.
Aiuti, A., I. J. Webb, et al. (1997), "The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood",
J. Exp. Med., 185(1):111-120.
Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990), Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3):403-410. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997), Gapped BLAST and
PSIBLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res., 25(17):3389-3402.
Ambati, J., A. Anand, et al. (2003), An animal model of age-related macular degeneration in senescent Ccl-2-or Ccr2-deficient mice, Nat Med., 9:1390-1397. Arya, S. K., C. C. Ginsberg, et al. (1999), "In vitro phenotype of SDF1 gene mutant that delays the onset of human
immunodeficiency virus disease in vivo", J. Hum. Virol., 2(3):133-138. Auerbach et al. (2003), Angiogenesis assays: a critical overview, Clin. Chem., 49:32-40. Baggiolini, M. (1998), "Chemokines and leukocyte traffic", Nature, 392(6676):565-568. Baggiolini, M., B. Dewald, et al. (1994), "Interleukin-8 and related chemotactic cytokines-CXC and CC chemokines",
Adv. Immunol., 55:97-179.
Balabanian, K., B. Lagane, et al. (2005), "WHIM syndromes with different genetic anomalies are accounted for by impaired CXCR4 desensitization to CXCL12", Blood, 105(6):2449-2457. Balabanian, K., J. Couderc, et al. (2003), "Role of the chemokine stromal cell-derived factor 1 in autoantibody
production and nephritis in murine lupus", J. Immunol., 170(6):3392-3400. Balkwill, F. (2004), "Cancer and the chemokine network", Nat. Rev. Cancer, 4(7):540-550. Bazan, J. F., K. B. Bacon, et al. (1997), "A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif", Nature,
385(6617):640-644.
Bertolini, F., C. Dell’Agnola, et al. (2002), "CXCR4 neutralization, a novel therapeutic approach for non-Hodgkin’s lymphoma", Cancer Res., 62(11):3106-3112. Bleul, C. C., J. L. Schultze, et al. (1998), "B lymphocyte chemotaxis regulated in association with microanatomic
localization, differentiation state, and B cell receptor engagement", J. Exp. Med., 187(5):753-762.
Bleul, C. C., M. Farzan, et al. (1996), "The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry", Nature, 382(6594):829-833. Brooks, H. L., Jr., S. Caballero, Jr., et al. (2004), "Vitreous levels of vascular endothelial growth factor and
stromalderived factor 1 in patients with diabetic retinopathy and cystoid macular edema before and after intraocular
injection of triamcinolone", Arch. Ophthalmol., 122(12):1801-1807. Buckley, C. D., N. Amft, et al. (2000), "Persistent induction of the chemokine receptor CXCR4 by TGF-beta 1 on synovial T cells contributes to their accumulation within the rheumatoid synovium", J. Immunol. 165(6):3423-3429.
Burger, J. A., N. Tsukada, et al. (2000), "Blood-derived nurse-like cells protect chronic lymphocytic leukemia B cells
from spontaneous apoptosis through stromal cell-derived factor-1", Blood, 96(8):2655-2663. Butler, J. M., S. M. Guthrie, et al. (2005), "SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy", J. Clin. Invest., 115(1):86-93.
Cabioglu, N., A. Sahin, et al. (2005), "Chemokine receptor CXCR4 expression in breast cancer as a potential
predictive marker of isolated tumor cells in bone marrow", Clin. Exp. Metastasis, 22(1):39-46. Corcione, A., L. Ottonello, et al. (2000), "Stromal cell-derived factor-1 as a chemoattractant for follicular center lymphoma B cells", J. Natl. Cancer Inst., 92(8):628-635.
Crump, M. P., J. H. Gong, et al. (1997), "Solution structure and basis for functional activity of stromal cell-derived factor-1; dissociation of CXCR4 activation from binding and inhibition of HIV-1", Embo J., 16(23):6996-7007. 55
D’Apuzzo, M., A. Rolink, et al. (1997), "The chemokine SDF-1, stromal cell-derived factor 1, attracts early stage B cell precursors via the chemokine receptor CXCR4", Eur. J. Immunol., 27(7):1788-1793.
De Klerck, B., L. Geboes, et al. (2005), "Pro-inflammatory properties of stromal cell-derived factor-1 (CXCL12) in collagen-induced arthritis", Arthritis Res. Ther., 7(6):R1208-1220.
Drolet D.W., Nelson J., Tucker C.E., Zack P.M., Nixon K., Bolin R., Judkins M.B., Farmer J.A., Wolf J.L., Gill S.C., Bendele R.A. (2000), Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys, Pharm. Res., 17:1503.
Eaton, B. E., L. Gold, et al. (1997), "Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers", Bioorg. Med. Chem., 5(6):1087-1096.
Fedyk, E. R., D. Jones, et al. (2001), "Expression of stromal-derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF and in dermal wound healing", J. Immunol., 166(9):5749-5754.
Fong, D. S., L. P. Aiello, et al. (2004), "Diabetic retinopathy", Diabetes Care, 27(10):2540-2553.
Geminder, H., O. Sagi-Assif, et al. (2001), "A possible role for CXCR4 and its ligand, the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1, in the development of bone marrow metastases in neuroblastoma", J. Immunol., 167(8):47474757.
Godessart, N. (2005), "Chemokine receptors: attractive targets for drug discovery", Ann. N. Y. Acad. Sci., 1051:647
657.
Grassi, F., S. Cristino, et al. (2004), "CXCL12 chemokine up-regulates bone resorption and MMP-9 release by human osteoclasts: CXCL12 levels are increased in synovial and bone tissue of rheumatoid arthritis patients", J. Cell Physiol., 199(2):244-251.
Grunewald, M., I. Avraham, et al. (2006), "VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells", Cell, 124(1):175-189.
Guleng, B., K. Tateishi, et al. (2005), "Blockade of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 axis attenuates in vivo tumor growth by inhibiting angiogenesis in a vascular endothelial growth factor-independent manner", Cancer Res., 65(13):5864-5871.
Gulino, A. V., D. Moratto, et al. (2004), "Altered leukocyte response to CXCL12 in patients with warts hypogammaglobulinemia, infections, myelokathexis (WHIM) syndrome", Blood, 104(2):444-452.
Hartmann, T. N., M. Burger, et al. (2004), "The role of adhesion molecules and chemokine receptor CXCR4 (CD184) in small cell lung cancer", J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 18(2):126-130.
Hwang, J. H., H. K. Chung, et al. (2003), "CXC chemokine receptor 4 expression and function in human anaplastic thyroid cancer cells", J. Clin. Endocrinol. Metab., 88(1):408-416.
Jiang, W., P. Zhou, et al. (1994), "Molecular cloning of TPAR1, a gene whose expression is repressed by the tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)", Exp. Cell. Res., 215(2):284-293.
Jose, P. J., D. A. Griffiths-Johnson, et al. (1994), "Eotaxin: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation", J. Exp. Med., 179(3):881-887.
Juarez, J. y L. Bendall (2004), "SDF-1 and CXCR4 in normal and malignant hematopoiesis", Histol. Histopathol., 19(1):299-309.
Kanbe, K., K. Takagishi, et al. (2002), "Stimulation of matrix metalloprotease 3 release from human chondrocytes by the interaction of stromal cell-derived factor 1 and CXC chemokine receptor 4", Arthritis Rheum., 46(1):130-137.
Kang, H., G. Watkins, et al. (2005), "Stromal cell derived factor-1: its influence on invasiveness and migration of breast cancer cells in vitro, and its association with prognosis and survival in human breast cancer", Breast Cancer Res., 7(4):R402-410.
Kawai, T., U. Choi, et al. (2005), "Enhanced function with decreased internalization of carboxy-terminus truncated CXCR4 responsible for WHIM syndrome", Exp. Hematol., 33(4):460-468.
Koshiba, T., R. Hosotani, et al. (2000), "Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor
system in pancreatic cancer: a possible role for tumor progression", Clin. Cancer Res., 6(9):3530-3535.
Krumbholz, M., D. Theil, et al. (2006), "Chemokines in multiple sclerosis: CXCL12 and CXCL13 up-regulation is differentially linked to CNS immune cell recruitment", Brain, 129:200-211.
Kryczek, I., A. Lange, et al. (2005), "CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers", Cancer Res., 65(2):465-472.
Kucia, M., R. Reca, et al. (2005), "Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis", Stem Cells, 23(7):879-894.
Kusser, W. (2000), "Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution", J. Biotechnol., 74(1):27-38.
Lapteva, N., A. G. Yang, et al. (2005), "CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo", Cancer Gene Ther., 12(1):84-89.
M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, vol. 20, Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, pp. 81-114, Humana Press Inc., 1993.
Ma, Q., D. Jones, et al. (1998), "Impaired B-lymphopoiesis, myelopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4-and SDF-1-deficient mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(16):9448-9453.
Marechal, V., F. Arenzana-Seisdedos, et al. (1999), "Opposite effects of SDF-1 on human immunodeficiency virus type 1 replication", J. Virol., 73(5):3608-3615.
Matthys, P., S. Hatse, et al. (2001), "AMD3100, a potent and specific antagonist of the stromal cell-derived factor-1 chemokine receptor CXCR4, inhibits autoimmune joint inflammation in IFN-gamma receptor-deficient mice", J. Immunol., 167(8):4686-4692.
McGinnis S., Madden T.L. (2004), BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools, Nucleic Acids Res., 32 (edición del servidor web):W20-25.
Meleth, A. D., E. Agron, et al. (2005), "Serum inflammatory markers in diabetic retinopathy", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 46(11):4295-4301.
Menu, E., K. Asosingh, et al. (2006), "The involvement of stromal derived factor 1alpha in homing and progression of multiple myeloma in the 5TMM model", Haematologica.
Miller, M. D. y M. S. Krangel (1992). "Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines", Crit. Rev. Immunol., 12(1-2):17-46.
Moser, B., M. Wolf, et al. (2004), "Chemokines: multiple levels of leukocyte migration control", Trends Immunol., 25(2):75-84.
Muller, A., B. Homey, et al. (2001), "Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis", Nature, 410(6824):50-56.
Murdoch, C. (2000), "CXCR4: chemokine receptor extraordinaire", Immunol. Rev., 177:175-184.
Murphy, P. M., M. Baggiolini, et al. (2000), "International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors", Pharmacol. Rev., 52(1):145-176.
Nagasawa, T., H. Kikutani, et al. (1994), "Molecular cloning and structure of a pre-B-cell growth-stimulating factor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(6):2305-2309.
Nagasawa, T., S. Hirota, et al. (1996), "Defects of B-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1", Nature, 382(6592):635-638.
Needleman y Wunsch (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol., 48(3):443-453.
Oppenheim, J. J., C. O. Zachariae, et al. (1991), "Properties of the novel proinflammatory supergene "intercrine" cytokine family", Annu. Rev. Immunol., 9:617-648.
Orimo, A., P. B. Gupta, et al. (2005), "Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote
tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion", Cell, 121(3):335-348.
Pearson y Lipman (1988), Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 85:2444.
Perissinotto, E., G. Cavalloni, et al. (2005), "Involvement of chemokine receptor 4/stromal cell-derived factor 1 system during osteosarcoma tumor progression", Clin. Cancer. Res., 11(2 pt 1):490-497.
Phillips, R. J., M. D. Burdick, et al. (2003), "The stromal derived factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases", Am. J. Respir. Crit. Care Med., 167(12):1676-1686.
Ponath, P. D., S. Qin, et al. (1996), "Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils", J. Clin. Invest., 97(3):604-612.
Rubin, J. B., A. L. Kung, et al. (2003), "A small-molecule antagonist of CXCR4 inhibits intracranial growth of primary brain tumors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(23):13513-13518.
Salcedo et al. (1999), Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells. In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1a, Am. J. Pathol., 154:1125-1135.
Salcedo, R. y J. J. Oppenheim (2003), "Role of chemokines in angiogenesis: CXCL12/SDF-1 and CXCR4 interaction, a key regulator of endothelial cell responses", Microcirculation, 10(3-4):359-370.
Salcedo, R., K. Wasserman, et al. (1999), "Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells: In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1alpha", Am. J. Pathol., 154(4):1125-1135.
Salvucci, O., L. Yao, et al. (2002), "Regulation of endothelial cell branching morphogenesis by endogenous chemokine stromal-derived factor-1", Blood, 99(8):2703-2711.
Saur, D., B. Seidler, et al. (2005), "CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer", Gastroenterology, 129(4):1237-1250.
Schall, T. J. y K. B. Bacon (1994), "Chemokines, leukocyte trafficking, and inflammation", Curr. Opin. Immunol., 6(6):865-873.
Scotton, C. J., J. L. Wilson, et al. (2002), "Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer", Cancer Res., 62(20):5930-5938.
Sengupta, N., S. Caballero, et al. (2005), "Preventing stem cell incorporation into choroidal neovascularization by targeting homing and attachment factors", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 46(1):343-348.
Shirozu, M., T. Nakano, et al. (1995), "Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1 (SDF1) gene", Genomics, 28(3):495-500.
Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Math., 2:482
Soriano, A., C. Martínez, et al. (2002), "Plasma stromal cell-derived factor (SDF)-1 levels, SDF1-3’A genotype, and expression of CXCR4 on T lymphocytes: their impact on resistance to human immunodeficiency virus type 1 infection and its progression", J. Infect. Dis., 186(7):922-931.
Springer, T. A. (1995), "Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration", Annu. Rev. Physiol., 57:827-872.
Sun, Y. X., A. Schneider, et al. (2005), "Skeletal localization and neutralization of the SDF-1(CXCL12)/CXCR4 axis blocks prostate cancer metastasis and growth in osseous sites in vivo", J. Bone Miner. Res., 20(2):318-329.
Takenaga, M., H. Tamamura, et al. (2004), "A single treatment with microcapsules containing a CXCR4 antagonist suppresses pulmonary metastasis of murine melanoma", Biochem. Biophys. Res. Commun., 320(1):226-232.
Tamamura, H., M. Fujisawa, et al. (2004), "Identification of a CXCR4 antagonist, a T140 analog, as an antirheumatoid arthritis agent", FEBS Lett., 569(1-3):99-104.
Tashiro, K., H. Tada, et al. (1993). "Signal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins", Science, 261(5121):600-603.
Venkatesan, N., S. J. Kim, et al. (2003), "Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides", Curr. Med. Chem., 10(19):1973-1991.
5 Wang, J., E. Guan, et al. (2001), "Role of tyrosine phosphorylation in ligand-independent sequestration of CXCR4 in human primary monocytes-macrophages", J. Biol. Chem., 276(52):49236-49243.
Wang, N., Q. L. Wu, et al. (2005), "Expression of chemokine receptor CXCR4 in nasopharyngeal carcinoma: pattern of expression and correlation with clinical outcome", J. Transl. Med., 3:26. 10 Wincott F., DiRenzo A., Shaffer C., Grimm S., Tracz D., Workman C., Sweedler D., González C., Scaringe S., Usman
N. (1995), Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes, Nucleic Acids Res., 23(14):26772684.
15 Yamaguchi, J., K. F. Kusano, et al. (2003), "Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization", Circulation, 107(9):1322-1328.
Yasumoto, K., K. Koizumi, et al. (2006), "Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer", Cancer Res., 66(4):2181-2187.
20 Zeelenberg, I. S., L. Ruuls-Van Stalle, et al. (2001), "Retention of CXCR4 in the endoplasmic reticulum blocks dissemination of a T cell hybridoma", J. Clin. Invest., 108(2):269-277.
Zeelenberg, I. S., L. Ruuls-Van Stalle, et al. (2003), "The chemokine receptor CXCR4 is required for outgrowth of 25 colon carcinoma micrometastases", Cancer Res., 63(13):3833-3839.
Zhou, Y., P. H. Larsen, et al. (2002), "CXCR4 is a major chemokine receptor on glioma cells and mediates their survival", J. Biol. Chem., 277(51):49481-49487.
30 Zou, Y. R., A. H. Kottmann, et al. (1998), "Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development", Nature, 393(6685):595-599.

Claims (35)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de ácido nucleico, que se une a SDF-1, que comprende, en la dirección 5’->3’, un primer tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un segundo tramo de nucleótidos, o un segundo tramo de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos central y un primer tramo de nucleótidos, en la que la longitud de la molécula de ácido nucleico es de 20 a 50 nucleótidos, en la que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en moléculas de ácidos nucleicos de tipo A, moléculas de ácidos nucleicos de tipo B, moléculas de ácidos nucleicos de tipo C y moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143 y SEQ ID NO:144; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
    5’ AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:19)
    en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2NNBV 3’ (SEQ ID NO:44) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BNBNX3X4 3’ (SEQ ID NO:45), en la que X1 está ausente o es R, X2 es S, X3 es S, y X4 está ausente o es Y; o X1 está ausente, X2 está ausente o es S, X3 está ausente o es S, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
    5’ GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (SEQ ID NO:57), y
    en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X1X2SVNS 3’ (SEQ ID NO:77) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BVBSX3X4 3’ (SEQ ID NO:78), en la que X1 está ausente o es A, X2 es G, X3 es C, y X4 está ausente o es U, o X1 está ausente, X2 está ausente o es G, X3 está ausente o es C, y X4 está ausente; en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos central:
    GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO:90),
    en la que XA está ausente o es A, y en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RKSBUSNVGR 3’ (SEQ ID NO:120) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YYNRCASSMY 3’ (SEQ ID NO:121), o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ XsSSSV 3’ (SEQ ID NO:124) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BSSSXs 3’ (SEQ ID NO:125), en la que XS está ausente o es S, o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UGAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUCA 3’, o en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GAGAUAGG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGAUUCUC 3’.
  2. 2.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprenden una secuencia de nucleótidos central seleccionada del grupo que comprende:
    5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:20), 5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:21), y 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:22), preferiblemente la secuencia de nucleótidos central comprende 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO:22).
  3. 3.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicho primer y dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual tras la hibridación se forma una estructura bicatenaria.
  4. 4.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en la que la estructura bicatenaria consiste en cuatro a seis pares de bases, preferiblemente cinco pares de bases.
  5. 5.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X2BBBS 3’ (SEQ ID NO:42) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende
    una secuencia de nucleótidos de 5’ SBBVX3 3’ (SEQ ID NO:43), en la que X2 está ausente o es S, y X3 está ausente o es S; preferiblemente, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CUGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CGCAG 3’;
    o el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ CGCGC 3’.
  6. 6.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la molécula de ácido nucleico de tipo A tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:5 a 18, 25 a 41, 133, 137 y 139 a 141.
  7. 7.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprenden una secuencia de nucleótidos central de GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ ID NO:58).
  8. 8.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7, en la que dicho primer y dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual tras la hibridación se forma una estructura bicatenaria.
  9. 9.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, en la que la estructura bicatenaria consiste en cuatro a seis pares de bases, preferiblemente cinco pares de bases.
  10. 10.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7 a 9, en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ X2SSBS 3’ (SEQ ID NO:73) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ BVSSX3 3’ (SEQ ID NO:74), en la que X2 está ausente o es G, y X3 está ausente o es C, preferiblemente, el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ GCGUG 3’ y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ UACGC 3’.
  11. 11.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7 a 10, en la que la molécula de ácido nucleico de tipo B tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:46 a 56, 61 a 72 y
  12. 132.
  13. 12.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprenden una secuencia de nucleótidos central seleccionada del grupo que comprende:
    5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:91), 5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:92), y 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:93), preferiblemente la secuencia de nucleótidos central comprende 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO:93).
  14. 13.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12, en la que al menos una parte de dicho primer tramo y al menos una parte de dicho segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual tras la hibridación se forma una estructura bicatenaria.
  15. 14.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en la que la estructura bicatenaria comprende de 4 a 10 pares de bases, preferiblemente de 4 a 6 pares de bases, más preferiblemente 5 pares de bases.
  16. 15.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 14, en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ RKSBUGSVGR 3’ (SEQ ID NO:122) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YCNRCASSMY 3’ (SEQ ID NO:123).
  17. 16.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 14, en la que el primer tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ SSSSR 3’ (SEQ ID NO:130) y el segundo tramo de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5’ YSBSS 3’ (SEQ ID NO:131).
  18. 17.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 16, en la que la molécula de ácido nucleico de tipo C tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:79 a 89, 94 a 119 y 134 a 136.
  19. 18.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de SEQ ID NO:142 a 144.
  20. 19.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que la molécula de ácido nucleico es un antagonista de SDF-1.
  21. 20.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que la molécula de ácido nucleico es un antagonista del sistema de receptores de SDF-1, en la que preferiblemente el receptor de SDF-1 del sistema de receptores de SDF-1 es el receptor CXCR4.
  22. 21.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la SDF-1 es la SDF-1 humana, en la que preferiblemente la SDF-1 comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:1.
  23. 22.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, y preferiblemente la modificación se selecciona del grupo que comprende un resto HES y un resto PEG.
  24. 23.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico son L-nucleótidos, y preferiblemente los nucleótidos de las secuencias según cualquiera de SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92 y 93.
  25. 24.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para su uso en un método para tratar una enfermedad.
  26. 25.
    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y opcionalmente otro constituyente, en la que el otro constituyente se selecciona del grupo que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.
  27. 26.
    El uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la fabricación de un medicamento.
  28. 27.
    La molécula de ácido nucleico para el uso de la reivindicación 24, en la que la enfermedad es mediada por la SDF-1, y preferiblemente dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que comprende las enfermedades del fondo del ojo, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con el envejecimiento; cáncer de mama, ovarios, próstata, páncreas, tiroides, nasofaringe, colon, pulmón y estómago; osteosarcoma; melanoma; glioma; medulo-y neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiencia inmunológica; neovascularización patológica; inflamación; esclerosis múltiple; artritis reumatoide/osteoartritis y nefritis.
  29. 28.
    La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la molécula de ácido nucleico se usa para inhibir la angiogénesis, la neovascularización, la inflamación y la metástasis.
  30. 29.
    El uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la fabricación de un medio de diagnóstico.
  31. 30.
    El uso según la reivindicación 29, en el que el medio de diagnóstico es para el diagnóstico de una enfermedad, en el que la enfermedad es mediada por la SDF-1, y preferiblemente dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende las enfermedades del fondo del ojo, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con el envejecimiento; cáncer de mama, ovarios, próstata, páncreas, tiroides, nasofaringe, colon, pulmón y estómago; osteosarcoma; melanoma; glioma; medulo-y neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiencia inmunológica; neovascularización patológica; inflamación; esclerosis múltiple; artritis reumatoide/osteoartritis y nefritis.
  32. 31.
    El uso según la reivindicación 29, en el que el medio de diagnóstico es para diagnosticar la angiogénesis, la neovascularización, la inflamación y/o la metástasis.
  33. 32.
    Un complejo que comprende SDF-1 y una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que preferiblemente el complejo es un complejo cristalino.
  34. 33.
    El uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la detección de SDF-1.
  35. 34.
    Un kit para la detección de SDF-1, que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
    129 130
    132 133 134 135 136 137 138 139
    143 144 145
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2590709C2 (ru) 2006-07-18 2016-07-10 Ноксон Фарма Аг Sdf-1-связывающие нуклеиновые кислоты
KR101589442B1 (ko) * 2007-08-06 2016-02-01 녹손 파르마 아게 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도
JP5463621B2 (ja) 2008-02-27 2014-04-09 ソニー株式会社 標的物質の定量方法
WO2009149921A2 (en) * 2008-06-11 2009-12-17 Bionucleon S.R.L. Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
TWI578992B (zh) 2009-04-30 2017-04-21 諾克森製藥股份有限公司 與鐵調節激素（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）結合之核酸類
WO2012025251A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids for treatment of chronic complications of diabetes
US20130310442A1 (en) 2010-09-09 2013-11-21 Noxxon Pharma Ag SDF-1 Binding Nucleic Acids and the use Thereof in Cancer Treatment
WO2012055573A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Noxxon Pharma Ag Use of hepcidin binding nucleic acids for depletion of hepcidin from the body
JP6453212B2 (ja) 2012-07-13 2019-01-16 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． キラル制御
US10647766B2 (en) * 2014-12-17 2020-05-12 Cancer Research Technology Limited Anti-CXCL12 antibody molecules and their uses
WO2017178119A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Noxxon Pharma Ag Method of modulating the number and the distribution of tumor-infiltrating leukocytes in tumors
US11221270B2 (en) * 2018-02-27 2022-01-11 Kevan M Evans Method and apparatus for detecting slow leaks
WO2021178923A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Drinksavvy, Inc. Devices and methods for detecting a target analyte of interest
EP4173639A4 (en) 2020-06-26 2024-03-13 RaQualia Pharma Inc. METHOD FOR SELECTING A CANCER PATIENT FOR WHICH COMBINATION THERAPY OF A RETINOID AND A CANCER TREATMENT AGENT WILL BE EFFECTIVE, AND COMBINATION DRUG OF A RETINOID AND A CANCER TREATMENT AGENT
WO2023154452A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Waypoint Bio, Inc. Cellular staining probes for analyte detection
TW202430127A (zh) * 2023-01-19 2024-08-01 國立陽明交通大學 可用於遞送內質網壓力誘導劑或免疫療法的複合奈米粒及其用途

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
CA2104698A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
EP1745797A3 (en) 1998-03-24 2007-07-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Vascularization inhibitors
US6670149B1 (en) * 1999-03-01 2003-12-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TWIK-5 potassium channel nucleic acids and uses therefor
US6949243B1 (en) 1999-11-24 2005-09-27 Schering Corporation Methods of inhibiting metastasis
EP1133988A1 (en) * 2000-03-11 2001-09-19 Biognostik Gesellschaft für biomolekulare Diagnostik mbH Mixture comprising an inhibitor or suppressor of a gene and a molecule binding to an expression product of that gene
US7468253B2 (en) 2001-06-07 2008-12-23 Chemocentryx, Inc. Method for multiple chemokine receptor screening for antagonists using RAM assay
JP4233092B2 (ja) 2001-06-07 2009-03-04 ケモセントリックス， インコーポレイテッド 細胞移動アッセイ
GB0225833D0 (en) 2002-11-06 2002-12-11 Univ Leeds Nucleic acid ligands and uses therefor
ES2729826T3 (es) 2004-09-23 2019-11-06 Arc Medical Devices Inc Composiciones farmacéuticas y métodos relacionados para inhibir adherencias fibrosas o enfermedad inflamatoria usando fucanos con bajo contenido de sulfato
EP1817414B1 (de) * 2004-11-29 2010-07-14 Noxxon Pharma AG Vasopressin bindende l-nukleinsäure
EP2397148A3 (en) 2006-02-02 2012-04-25 Allergan, Inc. Compositions and methods for the treatment of ophthalmic disease
RU2590709C2 (ru) 2006-07-18 2016-07-10 Ноксон Фарма Аг Sdf-1-связывающие нуклеиновые кислоты
KR101722261B1 (ko) 2006-10-02 2017-04-03 메다렉스, 엘.엘.시. Ｃｘｃｒ4에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
AU2007325029B2 (en) 2006-11-30 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Methods for treating and diagnosing fibrotic and fibroproliferative diseases
KR101589442B1 (ko) 2007-08-06 2016-02-01 녹손 파르마 아게 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도
US20090274687A1 (en) 2008-05-02 2009-11-05 University Of Miami Attenuation of hypoxia induced cardiovascular disorders

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